CN113646636A - 基于新型荧光染料的用于自动高性能鉴别碳水化合物和碳水化合物混合物组成模式的先进方法和系统以及用于校准多波长荧光检测系统的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及改进的(简化的/更容易的、更稳定的和更可再现的)方法，以用于鉴别碳水化合物组成(例如从复杂的碳水化合物混合物中)以及测定碳水化合物混合物组成模式(例如糖基化模式)，并基于先进的内部标准品以使用新型荧光染料结合高效分离技术来测定精确的和高度可再现的迁移和保留时间指数，所述高效分离技术例如具有高度灵敏检测(如(激光诱导的)荧光检测)的毛细管(凝胶)电泳(C(G(E)或(超)高效液相色谱(U)高效液相色谱)。在第一方面，本发明涉及用于自动测定和/鉴别碳水化合物和/或碳水化合物混合物组成模式分析的方法，以及用于自动化碳水化合物混合物组成模式分析的方法，所述方法基于使用至少第一和第二荧光标记物用于分别标记迁移/保留时间对齐标准品和样品或不同样品，其中至少一种荧光染料是如本文定义的化合物。此外，本发明涉及用于校准多波长荧光检测系统的方法，以及校准系统或校准标准品，以及所描述适用于校准的新化合物。本发明进一步涉及用于测定或鉴别碳水化合物混合物组成模式的试剂盒或系统以及用于测定和/或鉴别碳水化合物混合物组成模式的试剂盒或系统。进一步，提供了用于根据本发明的方法的包含如本文所定义的染料的碳水化合物染料缀合物。用于形成该碳水化合物染料缀合物的染料具有以下式A或B：

Description

基于新型荧光染料的用于自动高性能鉴别碳水化合物和碳水 化合物混合物组成模式的先进方法和系统以及用于校准多波 长荧光检测系统的方法

技术领域

本发明涉及用于鉴别碳水化合物组成(例如从复杂的碳水化合物混合物中)，以及测定碳水化合物混合物组成模式(例如：糖基化模式)的改进的(即，简化的/更容易的、更稳定的和更可再现的)的方法，所述方法基于先进的内部标准品以使用新型荧光染料结合高效分离技术来测定精确的和高度可再现的迁移和保留时间指数，所述高效分离技术例如具有高度灵敏检测(如(激光诱导的)荧光检测)的毛细管(凝胶)电泳(C(G)E或(超)高效液相色谱(U)HPLC。

在第一方面，本发明涉及用于自动测定和/或鉴别碳水化合物和/或碳水化合物混合物组成模式分析的方法，以及用于自动化的碳水化合物混合物组成模式分析的方法，所述方法基于使用至少第一和第二荧光标记分别标记迁移/保留时间对齐(retention timealignment)标准品(standard)和样品或不同样品，其中至少一种荧光染料是本文定义的化合物。

此外，本发明涉及多波长荧光检测系统用于校准的方法，以及校准系统或校准标准品(calibration standards)，并描述了适用于校准的新化合物。

本发明进一步涉及用于测定或鉴别碳水化合物混合物组成模式的试剂盒或系统，以及用于测定和/或鉴别碳水化合物混合物组成模式的试剂盒或系统。此外，提供了用于本发明的方法的碳水化合物染料缀合物，其包含本文定义的染料。

背景技术

糖基化在许多生物过程中的重要性已被普遍接受，在数十年的文献中有过讨论。糖基化是真核细胞中常见且高度多样化的蛋白质翻译后修饰。已经描述了各种细胞过程，包括蛋白质表面的碳水化合物。聚糖在蛋白质稳定性、蛋白质折叠和蛋白酶抗性方面的重要性已在文献中得到证实。此外，聚糖在细胞信号传导、调节和发育过程中的作用已在本领域得到证实。

碳水化合物是单糖，如木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、岩藻糖、N-乙酰葡萄糖胺、唾液酸；(同源或异源)二糖，如乳糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖；(同源或异源)寡糖，如聚糖(如N-聚糖和O-聚糖)、低聚半乳糖(GOS)、低聚果糖(FOS)、乳寡糖(MOS)或甚至糖脂的糖基；和多糖，如直链淀粉、淀粉样蛋白、纤维素、糖原、糖胺聚糖或几丁质的总称。寡糖和多糖可以是直链或(多)支链的。

糖缀合物是其中碳水化合物(糖基)与非碳水化合物部分(苷元)相连的化合物。典型地，苷元是蛋白质或脂质，因此，糖缀合物分别被称为糖蛋白或糖脂。在更一般的意义上，糖缀合物是指与任何其他化学实体(包括蛋白质、肽、脂质甚至糖类)共价连接的碳水化合物。

糖缀合物代表自然界中结构和功能最多样的分子。从由一个核苷酸和一个单糖部分组成的简单糖缀合物开始，到非常复杂和多重糖基化的蛋白质。糖缀合物中最常见的碳水化合物部分集中在少数单糖(包括N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、半乳糖、岩藻糖、葡萄糖以及木糖和唾液酸)及其修饰物(包括磷酸化或硫酸化的修饰物)上，结构多样性可能比蛋白质或DNA大得多。

这种多样性的原因是异头物的存在以及单糖分支和建立不同糖基键的能力。因此，链长相对较小的寡糖可能具有大量的结构异构体。与基于RNA作为模板的蛋白质生物合成相反，从基因组到糖组的信息流动是复杂的，而且，不是模板驱动的过程。例如聚糖生物合成中蛋白质的共翻译和翻译后修饰是基于酶促反应。由于聚糖生物合成，聚糖的复杂性和结构多样性急剧增加。值得注意的是，术语“聚糖”与术语“糖基”用作同义词，都指糖缀合物的碳水化合物部分。

进一步地，术语聚糖、寡糖和多糖用作同义词，指“具有(中等或大)数目的以糖苷键连接的单糖的一部分的化合物”。在蛋白质中，寡糖主要通过N-(通过Asn)或O-(通过Ser或Thr)糖苷键连接到蛋白质骨架上，而N-糖基化代表糖蛋白中更常见的类型。糖基化位点占用率(宏观异质性)的变化，以及这些连接到一个糖基化位点的复杂糖残基的变化(微观异质性)导致一组不同的蛋白质糖型。它们具有不同的物理和生物化学性质，导致糖蛋白的额外功能多样性。例如，在哺乳动物细胞培养物中生产治疗性蛋白质时，已显示宏观和微观异质性会影响蛋白质的性质。例如，糖基化谱与单克隆抗体治疗谱的相关性已有文献记载。值得注意的是，聚糖结构，特别是N-聚糖结构也取决于生产过程中的各种因素，如底物水平和其他培养条件。因此，糖蛋白的制造不仅依赖于宿主细胞的糖基化机制，还依赖于外部参数，如培养条件和细胞外环境。在培养物生产中影响糖基化的其他参数包括温度、pH、通气、底物供应或副产物如氨和乳酸的积累。例如，在制药领域中，糖基化谱是特别令人感兴趣的，因为由于监管原因，必须测定药物的糖基化谱。

同样在食品和制药工业中，不同类型的糖缀合物的有益效果，即具有营养和/或生物效果，正引起越来越多的关注。如今，通过合成或从天然来源如植物或人奶或动物奶中获得的复合可溶性但也是低聚和/或聚合的碳水化合物混合物被用作营养添加剂或药物。唾液酸或唾液酸衍生物的出现以及在那些复杂的天然碳水化合物中具有磷酸基、硫酸基或羧基的单糖的出现更加增加了它们的复杂性。由于这种复杂性，那些益生元寡糖或多糖，如中性或酸性低聚半乳糖、长链低聚果糖或(人)乳寡糖((H)MOS)，其可具有营养和/或生物效果，正引起食品和制药工业越来越多的兴趣。

为了阐明在特定条件下产生的糖组(其指细胞中整套游离碳水化合物和糖缀合物)的结构特征，并理解其功能以及其与DNA和蛋白质机制的相反关系，必须拥有快速、稳健和高分辨率的分析技术。

已经建立了用于分析糖缀合物(包括糖蛋白、糖肽和释放的N-聚糖或O-聚糖)的广泛策略和分析技术。例如，含有多种不同寡糖的复杂样品可以通过色谱或动电学技术进行分离。这些技术包括色谱技术，如尺寸排阻色谱(SEC)、亲水相互作用色谱(HILIC)、反相液相色谱(RPLC)和反相离子对色谱(RPIPC)，以及多孔石墨化碳色谱(PGC)。此外，包括来源于糖缀合物的包括碳水化合物在内的复杂分子的结构数据要么通过质谱分析法(MS)分析，要么通过核磁共振波谱法(NMR)分析，这通常是对于样品制备和数据解释费力且耗时的技术。例如，通常使用几种技术的组合，如液相色谱(LC)与NMR或MS的组合或毛细管电泳(CE)与MS或NMR的组合。通常地，获得糖基化模式，也鉴别为碳水化合物混合物组成模式，用于鉴别所述糖基的特征性质，例如保留或迁移时间。通过将从未知样品获得的数据与测定的参数进行比较，可以进行未知样品的快速筛选和评价。

这些技术各有优缺点。为一个给定的问题分别选择一套这样的方法会成为一项费时费力的任务。比如NMR提供了详细的结构信息，但是是一种相对不灵敏的方法(nmol)，其不能作为高通量的方法。使用MS比NMR更灵敏(fmol)。然而，定量可能是困难的，并且在没有解决单体糖化合物的连接的情况下，只能获得非特异性的结构信息。这两种技术都需要大量的样品制备和复杂聚糖混合物的分离，然后才能进行相应光谱的分析。此外，还需要一批技术熟练的科学家来确保这两种技术能够正常运行。

基于动电学和色谱分离的分析方法更容易、更便宜，因此也更常见。最常见和掺入次级品的是色谱糖分析技术，如荧光检测亲水相互作用色谱(HILIC-FLR)、荧光检测反相液相色谱(RPLC-FLR)。它们可以作为高效液相色谱或超高效液相色谱(HPLC或UHPLC)来操作，但是到目前为止只使用外标物(即：不像使用内部标准品一样与样品一起在同一跑道和分离柱中)来进行保留时间对齐，因此只有有限的(长期)再现性(Kobata A，等人，MethodsEnzymology 1987，138，84-94.Tomiya N，等人，Analytical Biochemistry 1988，171，73-90.Guile GR，等人，Analytical Biochemistry 1996，240，210-226)。

虽然基于毛细管电泳原理的分离技术，如毛细管凝胶电泳，以前在本领域被认为是用于复杂的碳水化合物分离，例如，Callewaert，N.等人，Glycobiology 2001，11，275-281，WO 01/92890，Callewaert，N.等人，Nat.Med.2004，10，429-434，Hennig R，等人，Biochimica et Biophysica Acta-General Subjects 2016，1860，1728-1738，Ruhaak LR，等人，Journal of Proteome Research 2010，9，6655-6664，EP2112506 A1，但仍然存在对允许自动化高通量碳水化合物分析的可靠和快速系统的持续需求。

动电学分离技术的例子有毛细管电泳(CE)和毛细管凝胶电泳(CGE)。这些技术允许高分辨率、快速分离和定量。例如，激光诱导荧光检测的多重毛细管凝胶电泳(xCGE-LIF)已被证明是一个用于糖分析的特别强大的工具。多重毛细管阵列设置的一个优点是，由于分离的并行化，有可能实现非常高的通量分析。使用xCGE-LIF的另一个原因是由于LIF检测具有非常高的灵敏度。CGE被定义为“毛细管筛分电泳的一个特例，其中毛细管填充有交联凝胶(聚合物)”。

化合物的电泳迁移率取决于质荷比，并且当使用例如CGE时，由于凝胶筛分效应，它还取决于分子形状。通常，天然碳水化合物不能通过它们的质荷比来分离，因为除了那些含有电荷残基的碳水化合物，如唾液酸、葡萄糖醛酸、硫酸化或磷酸化部分，它们大多是电中性的。然而，CE的一个问题是迁移时间的(长期)再现性，例如在CGE中，由于存在于毛细管中的凝胶的老化。因此，到目前为止，它的可用性有一些限制，即使当使用迁移时间对齐的内部标准品时(如带有荧光标签的DNA碱基对(bp)阶梯(ladder)发射的波长与碳水化合物样品的染料(如APTS)不同)，因为尽管有可比的质荷比(m/z)，但对于bp对齐标准品(bpalignment standard)和碳水化合物样品，m和z都非常不同，参见EP2112506 A1。因此，基质(如盐、溶剂、凝胶等的含量和组成)还有温度和时间(其也引起基质的变化，例如由于凝胶老化)也降低了再现性，并因此降低了可用性。

自从Sanger在1977年发现了用于DNA测序的链终止方法以来，在提高测序通量方面取得了很大进展。第一次改进是在80年代中期，用荧光染料标记代替了DNA片段的放射性标记。通过用单独的荧光染料(包括不同的激发和发射波长)标记每个DNA碱基，所有四种反应混合物可以被上载到平板凝胶的一个泳道中并同时进行分析。一个带有滤光器的激光扫描系统，能够分别对所有四种染料(分别为所有种类的DNA碱基)的荧光发射进行波长分辨检测。转换成数字信号为自动化DNA序列的发展铺平了道路，如ABI PRISM 377遗传分析仪。

在传统的平板凝胶电泳系统中，多个样品在一个具有多条单独泳道的薄凝胶中分离。不幸的是，因为分离速度受到场强的限制，场强由于在凝胶中产生热量而不能增加，很难增加通量。此外，检测速度被限制为每个数据点一到几秒。

为了克服这个问题，毛细管电泳(CE)系统被开发成具有几个直径仅为10-50μm的平行毛细管(毛细管阵列)。由于其大的表面积/体积，实现了更好的传热，允许处于更高的场强和更快的分离。这些多重毛细管CE系统内的优化光学器件，具有与平行毛细管横向对齐的激光束，允许同时激发所有毛细管内的所有荧光标记分析物。这些激光诱导荧光(LIF)检测提供了最低的检测限。在检测期间，发射的荧光用虚拟滤光器组(观察窗)过滤，随后用CCD相机从定义的单个通道(多波长检测)捕获荧光信号。

图32：带有多波长检测的多毛细管CE系统的检测模式。

由于荧光染料发射光谱总是相当宽且重叠(如方案1所示)，需要校准虚拟滤光器。因此，目的不是收集最大的发射，而是最小化CCD阵列上发射轮廓的重叠。然而，光谱重叠仍然在一定程度上发生，并且总是存在一定的串扰，如方案1中针对中间荧光染料所示。

对于DNA测序，四种核苷酸中的每一种都用一种荧光染料标记。在测序过程中，总是挑选颜色通道中最显著的峰并限定核苷酸。光谱串扰的问题对于DNA测序来说并不太重要，因为无需考虑来自相邻染料通道的较小的串扰信号。

对于通过多重/多路复用CE(xCE)系统进行寡糖分析，需要满足完全不同的要求。一般来说，用一种荧光染料标记的未知样品与用另一种荧光染料标记的对齐标准品共同注射和共同分离。该内部标准品随后用于对齐未知样品的迁移时间。通过这种对齐，样品成分的自动测定和/或鉴别是可能的。

为了进行正确的分析，两个染料通道之间(未知样品与对齐标准品之间)没有光谱串扰是必要的。例如，未知样品(复合寡糖混合物)的电泳图包含强度在几个数量级内变化的峰。从对齐标准品通道“泄漏”的信号会产生额外的峰，改变未知样品的成分，从而加重分析负担。为了消除染料通道之间的串扰，重新校准多路多元CE系统至关重要。

天然碳水化合物很难通过光谱方法检测出来。只有波长低于200nm的UV光(紫外光)才允许检测。为了克服这一缺点，释放的N-聚糖在(色谱或动电学)分离前用荧光标签标记，以使它们能被UV、VIS、FLR和LIF检测器很好地检测到。

图1显示了基于聚糖分析的分离的主要步骤。该程序可分为以下步骤样品制备、带有荧光检测的色谱或动电学分离和数据评价。聚糖的标记和标记产物的检测在本领域中有所描述。用于碳水化合物荧光标记的还原胺化的主要反应机理如方案2所示。

下面的方案2显示了碳水化合物还原胺化的主要反应顺序(参见N.Volpi，Capillary electrophoresis of carbohydrates.From monosaccharides to complexpolysaccharides，Humana Press，New York，2011，1-51页)。

方案2

还原胺化的第一步包括亲核加成反应，其中胺氮的孤电子对攻击开链形式(1b)中的碳水化合物残基的亲电醛碳原子。从中间体2中酸催化除去水得到亚胺(3a)。由于亚胺的形成是可逆的，亚胺必须通过用氢化物源(方案2中的还原剂)进行的不可逆酸催化还原转化为仲胺(4)。还原剂的性质很重要，因为只有亚胺离子3b需要被还原，而碳水化合物R²CHO(1b)必须对还原保持不反应(它们只与代表荧光标记的胺R³NH₂反应)。

方案2中描述的反应顺序基于特殊还原剂(硼烷)的可获得性和足够的反应性，该还原剂不与醛反应(或非常缓慢地还原它们)，但是在酸性条件下容易还原亚胺离子(3b)。弱酸或中强酸，如乙酸(pKa＝4.76)、丙二酸(pK1a＝2.83)或柠檬酸(pK1a＝3.13)经常在pH3-6下使用，以实现不可逆和快速的还原反应(K.R.Anumula，Anal.Biochem.2006，350，1-23).

因此，所用的胺(R³NH₂)必须是弱碱(因为在方案2中，只有非质子化的胺能与醛1b反应)。根据方案2，在蛋白质中，赖氨酸的脂族氨基、组氨酸和精氨酸残基中的亲核氮原子在pH 3-6时被质子化，并且不与碳水化合物反应。因此，仅需要pKa＝3-5值(这些是共轭酸的值)相对低的芳族胺，并将其广泛用作天然聚糖还原胺化的分析试剂。下面显示了3种商业上可获得的芳族胺，它们适用于通过还原胺化来标记聚糖，缀合物的色谱或动电学分离以及通过荧光的灵敏检测。

方案3

3-氨基芘-1，6，8-三磺酸(APTS)、2-氨基苯甲酰胺(2-AB)和2-氨基苯甲酸(2-AA)是目前用于CE(APTS)和LC(2-AB和2-AA)碱基分析的碳水化合物标记的最广泛使用的试剂。特别是，其具有三个强酸性残基(磺酸基)的APTS在非常宽的pH范围内(pH>2时)引入三个负电荷，以实现灵活和稳健的分析。

方案4

烷氧基氨基(方案4a)和酰肼(方案4b)基团也为标记碳水化合物提供了方便的化学选择性方法。酰肼基团与游离碳水化合物的还原端反应、形成主要为环状β-异头物形式的产物(参见方案4b)。反应条件在高温下从酸性、过中性到碱性pH的范围。例如荧光黄的典型酰肼标记反应(参见方案3)可以在70℃、pH 7下进行1小时。

方案5

此外，反应性氨基甲酸酯化学物可用于碳水化合物的标记，如方案5所示。对于这种标记反应，碳水化合物需要以其糖基胺的形式存在(释放的碳水化合物形成糖缀合物，例如由肽N-糖苷酶F(PNGase F)酶促释放后的N-聚糖)。这种反应是非特异性的，因为反应性氨基甲酸酯可以与其他可用的胺，例如蛋白质(氨基酸赖氨酸)反应。N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)碳酸酯与糖基胺的典型反应在室温下只需几分钟。

由于碳水化合物的还原胺化是非常特异和完全的，因此该反应是目前最广泛使用的碳水化合物标记方法。

经过兼性纯化(以去除蛋白质、过量电解质、过量染料、标记试剂等)，将标记样品分别注入色谱柱、动电学毛细管，进行分离(参见图1)。由于它们的不同性质(如疏水性、质量/电荷、形状等)不同的碳水化合物分别根据它们的特征保留时间、迁移时间到达检测器(参见图2-22)。

当标记的碳水化合物到达荧光检测器时，共价连接的荧光染料被激发并检测发射信号。

如今，在用例如2-AB或2-AA标记(参见方案3)后，在具有荧光检测器的商品化(U)HPLC系统上进行聚糖分析，但是标记聚糖的“真正”高通量分析只能在商品化多重CGE系统上进行。这些xCGE-LIF仪器包含一个用于分离带电分析物(如APTS-标记的聚糖)的多重毛细管凝胶电泳单元、一个激光器和一个荧光检测器。

方案6：APTS及其N-烷基化衍生物在水性缓冲液中的光谱性质(根据Z.Sharrett，等人，Org.Biomol.Chem.2009，7，1461-1470和R.A.Evangelista，M-S.Liu，F-T.A.Chem，Anal.Chem.1995，67，2239-2245)。

除APTS以外的其他染料可用作基于分离的碳水化合物及其衍生物分析的荧光标记(例如，染料2-AB、2-AA和荧光黄，参见方案3和N.V.Shilova及N.V.Bovin，Russ.J.Bioorg.Chem.2003，29(4)，339-355的综述。进一步的例子是WO 2002/099424 A3和WO 2009/112791 A2中描述的吖啶酮染料，但不能是7-氨基吖啶酮-2-磺酰胺。WO 2012/027717 A1描述了包含功能性取代的1，6，8-三磺酰胺基-3-氨基芘(APTS衍生物)、分析物反应基团、可裂解锚以及多孔固相的系统。WO 2010/116142 A2描述了多种荧光团和荧光感应化合物，其也包含氨基芘基染料。然而，与APTS相比，这些染料中没有一种显示或暗示出具有优异的光谱和电泳性能，特别是作为与碳水化合物的缀合物。

本领域已经描述了碳水化合物的分离技术和分析以及糖基化模式分析。例如，Callewaert N等人，Glycobiology 2001，11，275-281、WO 01/92890、Callewaert N等人，Nat.Med.，2004，10，429-439或Khandurina等人，Electrophoresis，2004，25，3122-2127确认了用于碳水化合物分析的方法。Domann等人，Practical Proteomics，2007，7，70-76确认了2DHPLC分析、质谱测定法和凝集素亲和色谱法。

本发明人在EP 2112506 A1和US 2009/0288951 A1中描述了进一步的发展。其中描述的技术已成功应用。

然而，评价聚糖谱的一个主要缺点是合适染料的可获得性有限。也就是说，目前已知的染料中没有一种被认为具有优异的光谱或电泳性能，特别是作为与碳水化合物的缀合物，但是目前的标准是使用APTS。

因此，需要具有改进性能的荧光染料，例如与APTS相比具有更高的电泳迁移率和/或更高的亮度。对于用于使用荧光检测分离的、分别基于动电学和色谱分离的碳水化合物分析的荧光标签，对这些特性提出了更高的要求，从而获得更高的性能。此外，需要能够与包括APTS在内的已知染料结合使用的荧光染料，从而允许在同一运行中检测两种不同的颜色，并因此分别对迁移、保留时间进行内部对齐。

发明内容

本发明的目的是提供新的用于测定和/或鉴别碳水化合物和/或碳水化合物混合物组成模式分析(pattern profiling)的方法，该方法基于保留/迁移时间与内部标准品的对齐，并使用至少两种不同的荧光染料，允许通过随后的荧光检测或激光诱导荧光检测的高度可再现的动电学/色谱分离。碳水化合物样品和碳水化合物标准品用至少两种发射不同波长的合适荧光染料标记，对于这种内部迁移/保留时间对齐是必不可少的，能够实现高的长期再现性和基质/样品独立性，如下所述。

在第一方面，一种用于自动测定和/或鉴别碳水化合物和/或碳水化合物混合物组成模式分析的方法，包括以下步骤：

a)获得含有至少一种碳水化合物的样品；

b)用第一荧光标记物标记所述碳水化合物；

c)提供用第二荧光标记物标记的已知组成的标准品；

d)使用动电学/色谱分离技术结合荧光或激光诱导荧光检测来测定所述碳水化合物和已知组成的标准品的迁移/保留时间；

e)基于该标准品的给定标准迁移/保留时间指数，将迁移/保留时间与迁移/保留时间指数进行对齐；

f)将碳水化合物的这些迁移/保留时间指数与来自数据库的标准迁移/保留时间指数进行比较；

g)鉴别或测定碳水化合物和/或碳水化合物混合物组成模式，

其中将标准品组合物加入到含有未知碳水化合物和/或碳水化合物混合物组成的样品中，第一荧光标记和第二荧光标记是不同的，并且其中第一荧光标记或第二荧光标记是具有多个可电离和/或带负电荷基团的荧光染料，所述荧光染料选自以下通式A和B的化合物：

其中，

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵彼此独立并且可以代表：

H，CH₃，C₂H₅，直链或支链的C₃-C₁₂、优选C₃-C₆，烷基或全氟烷基，磷酸化的烷基(CH₂)_mP(O)(OH)₂，其中m＝1-12、优选m＝2-6，具有直链或支链的烷基链，(CH₂)_nCOOH，其中n＝1-12、优选n＝1-5，或(CH₂)_nCOOR⁶，其中n＝1-12、优选n＝1-5，并且R⁶可以是烷基，特别是C₁-C₆烷基、CH₂CN、苄基、芴-9-基、多卤代烷基、多卤代苯基，例如，四或五氟苯基、五氯苯基、2-和4-硝基苯基、N-琥珀酰亚胺基(N-succinimidyl)、磺基-N-琥珀酰亚胺基(sulfo-N-succinimidyl)、1-氧基苯并三唑(1-oxybenzotriazolyl)或其他潜在的亲核反应性离去基团，烷基磺酸基((CH₂)_nSO₃H)或烷基硫酸基((CH₂)_nOSO₃H)，其中n＝1-12、优选n＝1-5，并且任何(CH₂)_n中的烷基链可以是直链或支链的；

羟烷基(CH₂)_mOH或硫代烷基(CH₂)_mSH，其中m＝1-12、优选m＝2-6，具有直链或支链烷基链，磷酸化羟烷基(CH₂)_mOP(O)(OH)₂，其中m＝1-12、优选m＝2-6，具有直链或支链烷基链；R¹或R²基团的其中一个可以是碳酸酯或氨基甲酸酯衍生物(CH₂)_mOCOOR⁷或COOR⁷，其中m＝1-12且R⁷＝甲基、乙基、叔丁基、苄基、芴-9-基、CH₂CN、N-琥珀酰亚胺基、磺基-N-琥珀酰亚胺基、1-氧基苯并三唑、苯基、取代苯基，例如2-或4-硝基苯基、五氯苯基、五氟苯基、2，3，5，6-四氟苯基、2-吡啶基、4-吡啶基、嘧啶-4-基；

(CH₂)_mNR^aR^b，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链；R^a、R^b彼此独立并且代表氢和/或C₁-C₄烷基，羟烷基(CH₂)_mOH，其中m＝2-6，具有直链或支链烷基链，磷酸化羟烷基(CH₂)_mOP(O)(OH)₂，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链；烷基叠氮化物(CH₂)_mN₃，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链；

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵可以含有末端烷氧基氨基(CH₂)_mONH₂，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链；

(CH₂)_nCONHR⁸，其中n＝1-12、优选1-5；R⁸＝H，C₁-C₆烷基，(CH₂)_mN₃，或(CH₂)_m-N-马来酰亚胺基((CH₂)_m-N-maleimido)，(CH₂)_m-NH-COCH₂X(X＝Br或I)，其中m＝1-12、优选2-6，并且在(CH₂)_n、(CH₂)_m和R⁶中具有直链或支链烷基链；

基团R¹、R²、R³、R⁴、R⁵，优选R¹、R²、R³可以由形成芳基肼Ar-NHNH₂的伯氨基表示，其中Ar表示式A的染料残基，包括芳基氨基和接头；

羟基，优选R²或R³，其是形成芳基羟胺Ar-NH₂OH的羟基，其中Ar表示式A的染料残基，包括芳基氨基和接头；

进一步，残基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵的其中一个可以代表CH₂-C₆H₄-NH₂、COC₆H₄-NH₂、CONHC₆H₄-NH₂或CSNHC₆H₄-NH₂，其中C₆H₄是1，2-、1，3-或1，4-亚苯基，COC₅H₃N-NH₂，或CH₂-C₅H₃N-NH₂，其中C₅H₃N是吡啶-2，4-二基、吡啶-2，5-二基、吡啶-2，6-二基或吡啶-3，5-二基；

此外，R²---R³和/或(R⁴---R⁵)可以形成四元、五元、六元或七元环，或具有或不具有连接到该环中一个碳原子上的伯氨基NH₂、仲氨基NHR^a，其中R^a＝C₁-C₆烷基、羟基OH或磷酸化羟基-OP(O)(OH)₂的四元、五元、六元或七元环；

任选地，R²---R³和/或(R⁴---R⁵)可以形成四元、五元、六元或七元杂环，该杂环中还包含1-3个杂原子，例如O、N或S；

进一步，R¹可以代表未取代的苯基、具有一个或数个选自OH、SH、NH₂、NHR^a、NR^aR^b、R^aO、R^aS的组的电子供体取代基的苯基，其中R^a和R^b彼此独立并且可以是具有直链或支链碳链的C₁-C₆烷基，具有一个或数个选自NO₂、CN、COH、COOH、CH＝CHCN、CH＝C(CN)₂、SO₂R^a、COR^a、COOR^a、CH＝CHCOR^a、CH＝CHCOOR^a、CONHR^a、SO₂NR^aR^b、CONR^aR^b的组的电子受体的苯基，其中R^a和R^b彼此独立并且可以是H或具有直链或支链碳链的C₁-C₆烷基；或者R¹可以代表杂芳族基团。

式A的化合物可以作为盐、溶剂化物和水合物存在并且可以作为盐、溶剂化物和水合物使用，优选作为具有碱金属阳离子包括Na⁺、Li⁺、K⁺和有机铵的盐；

但条件是在上述式A的所有化合物中，在碱性条件下，即7<pH<14，存在至少两个，优选至少3、4、5或6个带负电荷的基团，并且这些带负电荷的基团代表至少部分去质子化的可离子化基团的残基，所述可离子化基团选自：SH，COOH，磺酸残基SO₃H，伯磷酸基团OP(O)(OH)₂，仲磷酸基团OP(O)(OH)R^a、其中R^a＝C₁-C₄烷基或取代的C₁-C₄烷基，伯膦酸基团P(O)(OH)₂，仲膦酸基团OP(O)(OH)R^a、其中R^a＝C₁-C₄烷基或取代的C₁-C₄烷基；

其中R¹和/或R²彼此独立并且可以代表：

H，CH₃，C₂H₅，直链或支链C₃-C₁₂烷基或全氟烷基，或取代的C₂-C₁₂烷基；特别地，(CH₂)_nCOOR³，其中n＝1-12、优选1-5，R³可以是H，烷基、特别是C₁-C₆，CH₂CN，苄基，2-和4-硝基苯基，芴-9-基，多卤代烷基，多卤代苯基，例如四或五氟苯基、五氯苯基、N-琥珀酰亚胺基、磺基-N-琥珀酰亚胺基、1-氧基苯并三唑基或其他潜在的亲核反应性离去基团，并且(CH₂)_n中的烷基链可以是直链或支链的；和

R₁---R₂可以形成四元、五元、六元或七元非芳族碳环，该碳环带有连接到该环的一个碳原子上的附加的伯氨基NH₂、仲氨基NHR^a，其中R^a＝C₁-C₆烷基，或羟基OH；任选地，R₁---R₂可以形成四元、五元、六元或七元非芳族杂环，在该杂环中包含附加的杂原子，例如O、N或S；

羟烷基(CH₂)_mOH，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链；R¹或R²基团的其中一个可以是碳酸酯或氨基甲酸酯衍生物(CH₂)_mOCOO R⁴或COOR⁴，其中m＝1-12且R⁴＝甲基、乙基、2-氯-乙基、N-琥珀酰亚胺基，磺基-N-琥珀酰亚胺基、1-氧基苯并三唑基、苯基或取代苯基，例如2-或4-硝基苯基、五氯苯基、五氟苯基、2，3，5，6-四氟-苯基、2-吡啶基或4-吡啶基；

(CH₂)_mNR^aR^b，其中m＝1-12，优选2-6，具有直链或支链烷基链；R^a、R^b彼此独立，并且可以是H，或任选取代的C₁-C₄烷基，特别地，R¹或R²基团的其中一个可以是叠氮化物基团(CH₂)_mN₃其中m＝2-6、且具有直链或支链烷基链的烷基；R¹或R²的其中一个可以是n＝1-12的(CH₂)_nSO₂NR⁵NH₂，而取代基R⁵可以由H、烷基、羟烷基或全氟烷基基团C₁-C₁₂表示；

R¹或R²基团的其中一个可以是伯氨基，以形成芳基肼Ar-NR⁶NH₂，其中Ar是在式B中的整个芘残基，并且R⁶＝H或烷基；R¹或R²基团的其中一个可以是羟基以形成芳基羟胺Ar-NR⁷OH，其中Ar是式B中的整个芘残基，并且R⁷＝H或烷基；

R¹或R²基团的其中一个可以含有n＝1-12的末端烷氧基氨基(CH₂)_nONH₂，其可以通过m＝0-12的所有可能组合中的一个或多个烷基氨(CH₂)_mNH或烷基酰胺(CH₂)_mCONH基团连接；

R¹或R²基团的其中一个可以是CO(CH₂)_nCOOR⁸，其中n＝1-5，具有直链或支链烷基链(CH₂)_n，并且R⁸选自H、直链或支链C₁-C₆烷基、CH₂CN、2-和4-硝基苯基、2，3，5，6-四氟苯基、五氯苯基、五氟苯基、N-琥珀酰亚胺基；

进一步，R¹或R²的其中一个可以是(CH₂)_nCONHR⁹，其中n＝1-5且R⁹＝H、C₁-C₆烷基、(CH₂)_mN₃、(CH₂)_m-N-马来酰亚胺基、(CH₂)_m-NHCOCH₂X(X＝Br或I)，其中m＝2-6并且在(CH₂)_n和R⁹中具有直链或支链烷基链；

或者R¹或R²的其中一个可以代表CH₂-C₆H₄-NH₂、COC₆H₄-NH₂、CONHC₆H₄-NH₂或CSNHC₆H₄-NH₂，其中C₆H₄是1，2-、1，3-或1，4-亚苯基，COC₅H₃N-NH₂或CH₂-C₅H₃N-NH₂，其中C₅H₃N是吡啶-2，4-二基、吡啶-2，5-二基、吡啶-2，6-二基或吡啶-3，5-二基；或者R¹或R²的其中一个可以是烷基叠氮化物(CH)N₃或炔烃，特别是炔丙基；

接头L包含至少一个碳原子，并且可以包含烷基，杂烷基，特别是烷氧基如CH₂OCH₂、CH₂CH₂O、CH₂CH₂OCH₂，烷氨基或二烷氨基，特别是二乙醇胺或N-甲基(烷基)一乙醇胺部分如N(CH₃)CH₂CH₂O-和N(CH₂CH₂O-)₂，全氟烷基如单或多二氟甲基(CF₂)，烯烃或炔烃部分，以任何组合，在任何情况下，直链或支链的，长度范围从C₁至C₁₂；

接头还可以包括羰基(CH₂CO、CF₂CO)部分；

X表示增溶和/或可离子化的阴离子提供部分，特别是由选自以下的组(group)的部分(moiety)组成或包括选自以下的组(group)的部分(moiety)，所述组(group)包括羟烷基(CH₂)_nOH、硫代烷基((CH₂)_nSH)、羧烷基((CH₂)_nCO₂H)、烷基磺酸基((CH₂)_nSO₃H)、烷基硫酸基((CH₂)_nOSO₃H)、烷基磷酸基((CH₂)_nOP(O)(OH)₂)或膦酸基((CH₂)_nP(O)(OH)₂)，其中n是0至12的整数，或其类似物，其中一个或多个CH₂基团被CF₂取代，

进一步，阴离子提供部分(anion-providing moieties)可以通过非芳族的含O、N和S的杂环连接，例如哌嗪类、哌可啉类(pipecloines)，或者，可替换地，基团X的其中一个可以承载上面为基团R¹和R²列出的任何部分，也可以带有为基团L列出的任何类型的键，并且独立于其他取代基；

式B的化合物可以作为盐、溶剂化物和水合物存在，并且可以作为盐、溶剂化物和水合物使用，优选作为具有碱金属阳离子包括Na⁺、Li⁺、K⁺，NH₄ ⁺和有机铵或有机鏻阳离子的盐。

在更具体的实施方案中，根据本发明的荧光染料盐可以包含带负电荷的酸基团，特别是磺酸基和/或磷酸基，和反离子(counterions)选自无机或有机阳离子、优选碱金属阳离子、铵阳离子或有机铵或鏻化合物的阳离子(例如三烷基铵阳离子)的平衡离子，和/或可以包含带正电荷的基团或在通式A-D染料的氮位点N(R1)R2形成的电荷转移络合物，以及平衡离子，特别是选自强矿物酸、有机酸或路易斯酸的阴离子。

但条件是在由式B表示的所有化合物中，在碱性条件下，即7<pH<14，在式B的残基X中存在三个或六个带负电荷的基团，并且这些带负电荷的基团代表至少部分去质子化的可离子化基团的残基，所述可离子化基团选自：SH，COOH，SO₃H，OP(O)(OH)₂，OP(O)(OH)R^a、其中R^a＝C₁-C₄烷基或取代的C₁-C₄烷基，P(O)(OH)₂，P(O)(OH)R^a、其中R^a＝C₁-C₄烷基或取代的C₁-C₄烷基。

在另一方面，一种用于自动化碳水化合物混合物组成模式分析的方法，包括以下步骤：

a)提供含有第一未知碳水化合物混合物组成的第一样品；

b)用第一荧光标记物标记所述碳水化合物混合物组成；

c)提供含有用第二荧光标记物标记的第二碳水化合物混合物组成的第二样品，该第二荧光标记物可以任选地添加到所述第一样品中；

d)使用动电学/色谱分离技术结合荧光或激光诱导荧光检测，生成所述样品组合物的碳水化合物混合物组成的电泳图/色谱图；

e)分析第一和第二样品的碳水化合物混合物组成模式分析之间的同一性和/或差异，

其中所述第一样品的第一荧光标记不同于所述第二样品的第二荧光标记，并且其中所述第一荧光标记和所述第二荧光标记中的至少一个是如上定义的通式A或B的荧光染料，类似于如下定义的通式C或D。

在进一步的方面，一种用于自动化碳水化合物混合物组成模式分析的方法，包括以下步骤：

a)提供含有第一碳水化合物混合物组成的样品；

b)用第一荧光标记物标记所述碳水化合物混合物组成；

c)提供用第二荧光标记物的第二样品，其含有待比较的第二碳水化合物混合物组成；

d)使用动电学/色谱分离技术结合荧光或激光诱导荧光检测，生成第一和第二样品组合物的碳水化合物混合物组成的电泳图/色谱图；

e)比较由获得的该第一样品和第二样品的电泳图/色谱图计算的标准迁移/保留时间指数；

f)分析该第一和第二样品的碳水化合物混合物组成模式分析之间的同一性和/或差异，其中样品中存在的碳水化合物的标准迁移/保留时间是基于用第三荧光标记物标记的已知组成的内部标准品计算出的，并且

其中所述第一和第二荧光标记的其中一个是如上定义的荧光染料，其具有通式A或B的结构，类似于如下定义的通式C或D。

在用于自动化碳水化合物混合物组成模式分析的上述方法的一个实施方案中，第二碳水化合物混合物组成是具有已知模式图谱的已知碳水化合物混合物组成。

本发明旨在提供允许碳水化合物的测定和/或鉴别的方法，其中将含有至少一种碳水化合物的待分析的标记样品与添加到所述未知碳水化合物混合物中的标准品组合物结合。含有未知碳水化合物(混合物)和标准品组合物两者的样品用第一荧光标记和第二荧光标记进行标记。所述荧光标记中的至少一种是新的荧光染料，如本文所述的通式A或B，类似于如下定义的通式C或D。

在本发明的一个实施方案中，单一样品可以含有至少两种不同的待分析探针，即除标准品组合物之外的两种不同标记的碳水化合物或碳水化合物混合物组成。也就是说，本文所述的新荧光染料允许在一次运行中测定或分析或鉴别单个样品中的不同碳水化合物。特别地，当首先应用根据本发明的多波长荧光检测系统的校准方法时，可以使用至少三种或更多种，如至少四种不同的荧光染料是合理的(参见表2和3)。

新型荧光染料具有多个带负电荷的残基和连接到荧光团上的芳族氨基或酰肼基团，该荧光团可以用例如离子化(去质子化)形式的氩离子激光激发。

也就是说，根据本发明的染料允许增加的通量和灵敏度。使用本文所述的新型染料的实施方案包括：一个实施方案，其中待分析的样品含有两种不同的待分析探针，一种探针用例如APTS标记，而另一种探针用新型染料标记。此外，提供了用新型染料标记的标准品，例如碳水化合物标准品或碱基对标准品。另一个实施方案包括含有三种不同探针的样品，所述探针与用根据本发明的新型染料标记的标准品一起被检测。样品中存在的三种探针包括一种APTS标记的探针，和两种用根据本发明的染料标记的探针，其中所述染料以它们在发射谱中不相互干扰的方式被选择。另一个实施方案涉及含有三种探针的样品，一种探针用APTS标记，另外的探针用两种不同的新型染料标记，这两种染料在发射光谱上不同，以及标准品，其也是用新型染料标记的对齐标准品。另一个实施方案包括含有四种待测探针的样品，即，一种探针被APTS标记，而其他三种探针用不同的新型染料标记，以及标准品(如碱基对标准品)。

染料的选择应尽量减少波长间的串扰。合适的组合描述如下。

使用如本文所述的染料标记样品中待分析的探针中存在的碳水化合物可提高灵敏度。本文所述的染料对于仪器的光谱校准以及增加一个样品中存在的待分析化合物或探针是有利的。所述样品可以用一个毛细管进行分析。因此，可以减少毛细管的数量以及提高灵敏度和对齐特性。

此外，通过将激发波长移动到更大的波长(红移)，可以增加用所述染料标记的样品的灵敏度。此外，与APTS相比，如本文所述的染料具有更好的量子产率，因此进一步提高了灵敏度。

此外，由于灵敏度的提高和波长间串扰的降低，该方法更稳定、更具可再现性，在长期也是，更精确、更独立于运行参数、样品、样品基质、仪器、操作员、实验室和地点以及时间点。特别是对于毛细管和凝胶的老化。短期或中期以及长期运行之间的差异可以通过所描述的内部标准品进行补偿。此外，基于本文描述的校准方法并结合新型染料，更精确的对齐是可能的。因此，毛细管和色谱柱可以使用更长时间，克服老化问题，老化通常会改变样品的迁移/保留时间。此外，毛细管/柱本身可以被改变(例如缩短，因此分析时间也可以缩短)，而不改变对齐的迁移/保留时间。

此外，可以使用不同的仪器以及在不同的运行参数条件下，如温度、电压等在毛细管上运行样品。这在下面的示例中有所展示。综上所述，新染料提高了通量和灵敏度，还可以用于内部对齐迁移和保留时间。本文描述的基于动电学和/或色谱分离的糖分析方法允许使用通用的(基于碳水化合物的)对齐标准品，能够得到对齐的迁移/保留时间，而不受环境因素如系统、操作员、基质等的影响。

特别地，本文定义的染料代表发射最大值明显偏离APTS标记类似物的光的染料。因此，同时检测两种荧光染料或者甚至三种不同的荧光染料，而分别没有所述染料彼此之间的最小干扰是可能的。本文所述的荧光染料通常是多重净负电荷的染料，其在负电荷为-4和-6的磷酸化衍生物中特别高，当其与糖缀合物缀合时，提供了相比于APTS糖缀合物更高的染料电泳迁移率。

在本发明中，术语“碳水化合物”是指单糖，如木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、岩藻糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸；(同聚或异聚)二糖，如乳糖、蔗糖、麦芽糖、纤维二糖；(同聚或异聚)寡糖，如聚糖(如N-和O-聚糖)、低聚半乳糖(GOS)、低聚果糖(FOS)、乳寡糖(MOS)或甚至糖脂的糖基；和(同聚或异聚)多糖，如直链淀粉、支链淀粉、纤维素、糖原、糖胺聚糖(GAG)或几丁质。低聚糖和多糖可以是直链的或支链的。

本文使用的术语“糖缀合物”是指含有碳水化合物部分的化合物，糖缀合物的例子是糖蛋白、糖肽、蛋白聚糖、肽聚糖、糖脂、GPI-锚、脂多糖。

本文使用的术语“碳水化合物混合物组成模式分析”是指建立一种特定用所检测的碳水化合物混合物组成的模式，其基于混合物中存在的不同碳水化合物的数量、混合物中存在的所述碳水化合物的相对量和混合物中存在的碳水化合物的类型，并例如以图表(diagram)或图形(graphic)来分析所述模式，例如分别作为电泳图、色谱图。因此，获得了例如以对齐的电泳图/色谱图、图形或图表形式示出的指纹图谱。例如，基于指纹图谱的糖基化模式分析属于所述术语的范围。在这方面，本文所用的术语“指纹图谱”是指特定于碳水化合物或碳水化合物混合物的对齐的电泳图和/或色谱图、图表或图形。

术语“定量测定”或“定量分析”是指碳水化合物的相对和/或绝对定量。相对定量可以通过每种化合物的单独峰高直接地完成，峰高与其浓度成线性关系(在FLR和/或LIF检测器的线性动态范围内)。相对定量概述了存在于组合物或标准品中的每种碳水化合物与另一种或另外的碳水化合物的比率。此外，绝对(半)定量分析是可能的。

已知组成的内部碳水化合物标准品，例如，可以是一组单、二、三、四和/或五聚体，直链和/或支链多达40聚体(或更高)，在待分析的碳水化合物样品指纹图谱的整个范围内洗脱/迁移，但是在另一个波长迹线/通道中被检测到，因为它们用不同于在另一个波长发射的碳水化合物样品的另一种标签进行荧光标记，因此不会出现在样品迹线/通道中。实例为：

a.基于碳水化合物的均聚物，包含长度为n＝1至40(或更高)的戊糖(如木糖或阿拉伯糖)、己糖(如葡萄糖、半乳糖或甘露糖)和己糖胺(如氨基葡萄糖、氨基半乳糖、N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰氨基半乳糖)，以及α1-2(甘露糖寡糖)、α1-4(如麦芽糖、淀粉)、α1-5(阿拉伯寡糖)、α1-6(如葡聚糖、普鲁兰多糖(pullutan)、淀粉)、α1-3(如葡聚糖、普鲁兰多糖(pullutan))、β1-3(如纤维二糖基葡萄糖)、β1-4(如纤维素、甘露聚糖、低聚木糖、壳聚糖)和β1-6中的糖苷键

b.杂寡聚合物，如半纤维素、阿拉伯木聚糖、阿拉伯半乳聚糖、果聚糖

c.N-聚糖

d.O-聚糖

e.糖脂

f.乳寡糖(MOS)

本发明代表了在EP 2112506 A1、US 2009/0288951 A1及其对应文献中描述的方法的进一步发展。特别地，使用本文所述的新型染料，可以使用与样品相同或相似的(内部)标准品，因为两者现在都是碳水化合物，分别是具有相同或相似性质(例如尺寸、质量、电荷、亲水性、疏水性等)的碳水化合物混合物，并因此随着环境的变化分别表现出相同、相似的行为，如不同的基质(例如盐、溶剂、凝胶等的含量和组成)、但也包括温度和时间(这也引起基质的变化，例如由于凝胶老化)。因此，高度可再现和精确对齐的迁移/保留时间允许通过迁移/保留时间匹配经由各自的数据库高度可靠地鉴别碳水化合物，所述数据库包含碳水化合物和它们各自对齐的迁移/保留时间。

这允许以更高的灵敏度和特异性鉴别未知的碳水化合物和未知的糖基化模式分析。特别是对于复杂的碳水化合物制剂和糖基化模式来说也是正确的。

本文使用的术语“取代的”通常指存在一个或多个取代基，特别是选自包含如下取代基的组的取代基：直链或支链烷基，特别是C₁-C₄烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基；异烷基，例如异丙基、异丁基(2-甲丙基)；仲烷基，例如仲丁基(丁-2-基)；叔烷基，例如叔丁基(2-甲丙基)。此外，术语“取代的”在这里可以指具有至少一个氘-、氟-、氯-或溴代替氢原子的烷基，或甲氧基、乙氧基、2-(烷氧基)乙氧基(AlkOCH₂CH₂O)，以及在更通常的情况下，现有技术的Alk(OCH₂CH₂)_nOCH₂CH₂-的寡(乙二醇)残基，其中Alk＝CH₃，C₂H₅，C₃H₇，C₄H₁₀，并且n＝1-23。

本文使用的术语“芳族杂环基团”或“杂芳族基团”通常指具有5至10个环原子的未取代或取代的环状芳族基团(radical)(残基(residue))，其中至少一个环原子选自硫、氧和氮；该基团(radical)通过任何一个环原子与分子的其余部分相连。代表性但非限制性的实例是呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯基、咪唑基、噻唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、噁二唑基、喹啉基和异喹啉基。

上述通式A的化合物是吖啶酮染料，上述通式B的化合物是芘染料。

更具体地说，根据IUPAC规则，通式A的化合物是7-氨基吖啶-2-磺酰胺，而通式B的化合物是1-氨基芘染料，在3，6，8位具有功能性取代的磺酰基，即(功能性取代的)1，6，8-三磺酰基-3-氨基芘，如下面方案中的基本结构式通式A和B所示。

本发明的新型荧光染料表现出许多有利的特征：

·芳族氨基(NH2)、肼(NRNH2)、酰肼(CONRNH2)、羟胺(NROH)、反应性氨基甲酸酯(NHCOOR)或烷氧氨基(RONH2)，用于在例如pH～2-5进行高效和清洁的还原胺化或与碳水化合物直接缩合；优选地，芳族氨基是伯氨基，但它也可以是仲氨基；结构参见上图

·缀合物中的大量净电荷--在-3至-12的范围内，pH为至少7至14

·在很宽的pH范围内，在水性介质中有很好的溶解性；

·高亮度(这是荧光量子产率和消光的总体结果)

·染料核心的卓越稳定性，例如，抵抗硼烷基试剂的还原

·能够以488和514nm发射的氩离子激光激发，具有完美的光谱匹配和高荧光量子产率。

·最小发射在约520nm

·染料可以纯化高达99％。

本发明的新型荧光标签甚至允许检测具有很长迁移时间的“重”聚糖。由于这些很长的迁移时间和峰加宽，这种“重”聚糖很难通过动电学检测；尤其是如果APTS被用作荧光标签。

在下文中，描述了本发明的更具体的实施方案。

在上式A中，NR¹和/或N(R²)R³优选包含羰基或亲核反应性基团。R¹、R²和R³可以由氢、直链或支链烷基、羟烷基或全氟烷基表示。取代基R³、R⁴和R⁵优选包含增溶和/或提供阴离子的基团，特别是羟烷基((CH₂)_nOH)、硫代烷基((CH₂)_nSH)、羧烷基((CH₂)_n CO₂H)、烷基磺酸基((CH₂)_nSO₃H)、烷基硫酸基((CH₂)_nOSO₃H)、烷基磷酸基((CH₂)_nOP(O)(OH)₂)或烷基膦酸基((CH₂)_nP(O)(OH)₂)，其中n是1至12的整数。

或者，取代基R¹、R²的R³、R⁴和R⁵可以由羧酸残基(CH₂)_nCOOH表示，其中n＝1-12，并且它们的反应性酯(CH₂)_nCOOR⁶作为亲核反应性基团。R⁶可以是氢、烷基、(包括叔丁基)、苄基、芴-9-基、多卤代烷基、CH₂CN、多卤代苯基(例如，四或五氟苯基、五氯苯基)、2-和4-硝基苯基、N-琥珀酰亚胺基、磺基-N-琥珀酰亚胺基、1-氧代苯并三唑基或其他潜在的亲核反应性离去基团。烷基链(或主链)(CH₂)_n可以是直链或支链的。

此外，式A中的芳基氨基(NR¹和NR²R³)可以通过(多)亚甲基，

羰基，含氮或含硫的直链或支链接头，特别是(CH₂)_mCON(R⁷)、CO(CH₂)_mN(R⁷)、CO(CH₂)_mS(CH₂)_n、(CH₂)_mS(CH₂)_nCO、CO(CH₂)_mSO₂(CH₂)_n、(CH₂)_mSO₂(CH₂)_nCO、它们的组合连接到分析物反应性基团上，或作为不含氮的非芳香族杂环化合物(例如，哌嗪、哌可啉、噁唑啉)一部分连接；m和n是0-12或1-12的整数。取代基R⁷可以由上面为R¹、R²、R³、R⁴和R⁵列出的任何官能团表示。

式A中的取代基R¹、R²和R³也可以由伯氨基表示，因此包括羰基反应性芳基肼，(R²＝H、R¹或R³＝NH₂或R¹＝NH₂，R²、R³＝烷基、全氟烷基或烷基)，与增溶和/或阴离子提供部分共轭或被其取代，列出R⁴和R⁵的可能候选物，特别是：羟烷基(CH₂)_nOH、硫代烷基((CH₂)_nSH)、羧烷基((CH₂)_nCO₂H)、烷基磺酸基((CH₂)_nSO₃H)、烷基硫酸基((CH₂)_nOSO₃H)、烷基磷酸基((CH₂)_nOP(O)(OH)₂)或烷基膦酸基((CH₂)_nP(O)(OH)₂)，其中n为0-12或1-12的整数。或者，肼衍生物可以由磺酰肼表示，其中R⁴＝NH₂，R⁵是烷基、全氟烷基或用上述类型的增溶和/或阴离子提供基团修饰的烷基。

或者，式A中的芳氨基(NR¹和/或NR²R³)可以通过接头间接连接到酰基肼或烷基肼部分，从而分别包含酰肼(ZCONHNH₂)或肼(ZNHNH₂)。此处Z表示式A的染料残基，包括芳基氨基和接头。特别地，R¹和R²可以用下列表示：(CH₂)_mCON(R⁷)、CO(CH₂)_mN(R⁷)、CO(CH₂)_mS(CH₂)_n、(CH₂)_mS(CH₂)_nCO、CO(CH₂)_mSO₂(CH₂)_n、(CH₂)_mSO₂(CH₂)_nCO及其组合；m和n是从0到12的整数。取代基R⁷可以由R¹、R²、R³、R⁴和R⁵的任何官能团表示，这些官能团在上面被列为R¹-R⁵官能团的候选，特别是：羟烷基(CH₂)_nOH、硫代烷基((CH₂)_nSH)、羧烷基((CH₂)_nCO₂H)、烷基磺酸基((CH₂)_nSO₃H)、烷基硫酸基((CH₂)_nOSO₃H)、烷基磷酸基((CH₂)_nOP(O)(OH)₂)或烷基膦酸基((CH₂)_nP(O)(OH)₂)，其中n是范围从0至12或1至12的整数。接头也可以由非芳香族的含O、N和S的杂环(例如哌嗪、哌可啉)来表示。

此外，R¹、R²和R³可以由CH₂-C₆H₄-NH₂、COC₆H₄-NH₂、CONHC₆H₄-NH₂或CSNHC₆H₄-NH₂表示，其中C₆H₄是1，2-、1，3-或1，4-亚苯基、COC₅H₃N-NH₂或CH₂-C₅H₃N-NH₂，其中C₅H₃N是吡啶-2，4-二基、吡啶-2，5-二基、吡啶-2，6-二基、吡啶-3，5-二基。

在可变位置R¹、R²、R³、R⁴和R⁵的分析物反应性基团可以由芳族或杂环胺、羧酸、羧酸的酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺基或另一种氨基反应性酯)表示；或者由烷基叠氮化物(CH₂)_nN₃、炔烃(炔丙基)、氨基-烷氧基(CH₂)_nONH₂、马来酰亚胺基(具有亲核反应性双键的C₄H₃NO₂)或卤代酮基官能团(COCH₂X；X＝Cl，Br和I)，以及卤代酰胺基(NRCOCH₂X，R＝H，C₁-C₆-烷基，X＝Cl，Br，I)表示，通过列为肼衍生物的含羰基、酰胺基、氮、氧或硫的接头直接或间接连接，其中n＝1-12。

根据本发明的一些更优选的实施方案，上式A中的取代基R¹定义如下：

式A中的R¹代表氢，低级烷基(C₁-C₄)，未取代的苯基，具有一个或多个选自以下的组的电子给体取代基的苯基：OH、SH、NH₂、NHR^a、NR^aR^b、R^aO、R^aS、OP(O)(OR^a)(OR^b)，其中R^a和R^b彼此独立并且可以是具有直链或支链的C₁-C₁₂、优选C₁-C₆烷基，具有一个或多个选自以下的组的电子受体的苯基：NO₂、CN、COH、COOH、CH＝CHCN、CH＝C(CN)₂、SO₂R^a、SO₃R^a、COR^a、COOR^a、CH＝CHCOR^a、CH＝CHCOOR^a、CONHR^a、SO₂NR^aR^b、CONR^aR^b、P(O)(OR^a)(OR^b)，其中R^a和R^b彼此独立并且可以是H、或具有直链或支链碳链的C1-C6烷基；或者，R¹可以代表芳族杂环基团，特别是2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-噻吩基、3-噻吩基、嘧啶-4-基、嘧啶-2-基、嘧啶-5-基，或衍生自芳族杂环的其他电子受体基团，例如4-吡啶基-N-氧化物、N-烷基吡啶盐或甜菜碱，特别是N-(ω-磺基烷基)-4-吡啶鎓、N-(ω-磺基烷基)-2-吡啶鎓，N-(1-羟基-4，4，5，5-四氟-环戊-1-烯-3-酮-2-基)-4-吡啶鎓(N-(1-hydroxy-4,4,5,5-tetrafluoro-cyclopent-1-en-3-on-2-yl)-4-pyridinium)，N-(1-羟基-4，4，5，5-四氟环戊-1-烯-3-酮-2-基)-2-吡啶鎓(N-(1-hydroxy-4,4,5,5-tetrafluorocyclopent-1-en-3-on-2-yl)-2-pyridinium)。

特别地，R¹可以代表带正电荷的杂环基团，其衍生自2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基前体，具有7-氨基吖啶-2-磺酰胺骨架和烷基化试剂(例如烷基卤化物、烷基磺酸盐、烷基三氟甲磺酰基、1，3-丙磺酸内酯、1，4-丁磺酸内酯)或亲电试剂(例如全氟环戊烯)。

特别优选的是具有下式之一的具有上述结构式A的含氨基吖啶酮的化合物：

在式B中，L是二价接头，它将染料核心与增溶和/或可离子化部分连接起来，并调节光谱特性。

通常，与APTS染料标签相比，它的存在会导致相当大的荧光红移(bathofloricshift)和色谱红移(bathochromic shift)，同时与488nm商品化激光器更好地匹配，其中片段L不存在，基团X是羟基。

接头L包含至少一个碳原子或由至少一个碳原子组成，并且可以代表烷基、杂烷基(例如，烷氧基：CH₂OCH₂、CH₂CH₂O、CH₂CH₂OCH₂)、二氟甲基(CF₂)、烯烃或炔烃部分的任何组合，在任何情况下，直链或支链，长度为C1至C12。接头还可以包括羰基(CH₂CO、CF₂CO)，并且当L是烷基氨基或二烷基氨基时，实例是磺酰胺，特别是二乙醇胺或N-甲基(烷基)单乙醇胺部分(即，N(CH₃)CH₂CH₂O-和N(CH₂CH₂O-)₂)，这允许进一步连接到增溶和/或可离子化部分X。本发明的某些实施方案代表根据式(CH₂)₃OP(O)(OH)₂和N(CH₃)(CH₂)₂OP(O)(OH)₂的部分L和X的组合。因此，这种类型的磺酰胺具有通式SO₂NR³R⁴，其中R³和R⁴彼此独立，并且可以代表氢、烷基、杂烷基(例如，烷氧基：CH₂OCH₂、CH₂CH₂O、CH₂CH₂OCH₂)、二氟甲基(CF₂)的任何组合，直链或支链，长度为C1至C12，并带有末端OH基团。

式B中的N(R¹)R²优选包含羰基或亲核反应性基团。取代基R¹和R²彼此独立，并且都可以由氢表示。那些中的一个可以是直链或支链烷基(全氟烷基)C₁-C₁₂。同时，R¹和R²的其中一个可以由羧酸残基(CH₂)_nCOOH和它们的常规或反应性酯(CH₂)_nCOR⁵表示，其中n是1-12的整数。残基R⁵是H、烷基、(包括丁基)、苄基、芴-9-基、多卤代烷基、CH₂CN、多卤代苯基(例如，四氟或五氟苯基、五氯苯基)、2-和4-硝基苯基、N-磺酰亚胺基、磺基-N-磺酰亚胺基或其他潜在的亲核反应性离去基团。烷基链(或主链)(CH₂)_n可以是直链或支链的。特别地，该式可以描述为Z-NR¹(CH₂)_nCOR⁵，其中Z是式B中还包括基团L和X的其余分子。

此外，亲核反应性基团COR⁵可以通过以下连接到芳基氨基基团N(R¹)R²：(聚)亚甲基、氧亚甲基(CH₂OCH₂、CH₂CH₂OCH₂、PEG)羰基、碳酸酯、氨基甲酸乙酯、含氮或含硫的支链或直链接头(间隔基)，特别是(CH₂)_mCON(R⁶)、CONH(CH₂)_n、(CH₂)_mOCONH(CH₂)_n、CO(CH₂)_n、CO(O)NR⁶、(CH₂)_mSO_2mN(R⁶)、CO(CH₂)_mS(CH₂)_n、(CH₂)_mS(CH₂)_nCO、CO(CH₂)_mSO₂(CH₂)_n、(CH₂)_mSO₂NR⁶及其组合；m和n是从0至12的整数。反应性基团R⁵可以通过非芳族的含O、N和S的杂环(例如，哌嗪、哌啶、噁唑啉)连接。取代基R⁶可以由H、烷基、羟烷基或全氟烷基C₁-C₁₂表示。

式B中的取代基R¹和R²的其中一个可以由伯氨基表示，从而包含羰基反应性芳基肼(R¹＝NH₂，R²＝烷基、全氟烷基)或由羟基表示，以形成芳基肟(ArNHOH)。或者，式B中的烷基肼或肟反应性部分可以通过上面列出的反应性基团R⁴的接头连接到芳基氨基基团N(R¹)R²。当具有n＝1-12的R¹或R²＝(CH₂)_nSO₂NR⁶NH₂时，磺酰肼构成一种特殊情况，而取代基R⁶可以由H、烷基、羟烷基或全氟烷基C₁-C₁₂表示。磺酰胺(sulfonylamide)(磺胺(sulfonamide)，硫酰胺(sulfamide))基团也可以通过上面列出的各种接头与反应性基团R³、R⁴和R⁵连接。

此外，R¹和R²可以由CH₂-C₆H₄-NH₂、COC₆H₄-NH₂、CONHC₆H₄-NH₂或CSNHC₆H₄-NH₂表示，其中C₆H₄是1，2-、1，3-或1，4-亚苯基、COC₅H₃N-NH2或CH₂-C₅H₃N-NH₂，其中C₅H₃N是吡啶-2，4-二基、吡啶-2，5-二基、吡啶-2，6-二基、吡啶-3，5-二基。

取代基R¹和R²也可以由烷基叠氮化物(CH₂)_nN₃、炔(炔丙基)、马来酰亚胺基(具有亲核反应性双键的C₄H₃NO₂)或卤代酮官能团(COCH₂X；X＝Cl、Br和I)表示，直接连接或通过列为肼衍生物的含羰基、酰氨基、氮或硫的接头连接；n＝1-12。

式B中的X基团表示增溶和/或可电离的阴离子提供物质，特别是提供增强的电泳迁移率的物质。基团X可以包括羟烷基(CH₂)_nOH、硫代烷基((CH₂)_nSH)、羧烷基((CH₂)_nCO₂H)、烷基磺酸基((CH₂)_nSO₃H)、烷基硫酸基((CH₂)_nOSO₃H)、烷基磷酸基((CH₂)_nOP(O)(OH)₂)或膦酸基((CH₂)_nP(O)(OH)₂)，其中n是0至12的整数。或者，CH₂基团可以被CF₂取代。阴离子提供部分也可以通过非芳族的含O、N和S的杂环(例如哌嗪类、哌可啉类)连接。或者，基团X的其中一个可以带有为基团R¹和R²列出的任何羰基或亲核活性部分，也可以带有为基团L列出的任何类型的键，并且独立于其他取代基。式B的化合物可以以盐的形式存在和应用，盐包括所有可能类型的阳离子，优选Na⁺、K⁺、Li⁺或三烷基铵。

式B的荧光染料可以以盐、溶剂化物或水合物的形式存在，特别是具有阳离子包括Na⁺、K⁺、Li⁺、NH₄ ⁺和有机铵或有机鏻阳离子的盐。

根据本发明的一个具体实施方案，提供阴离子的基团X在式B中每次出现时可以代表一至四个连接到接头基团L上的基团SO₃H，如权利要求3的式B中的术语(SO₃H)_n(n＝1-4)所示。

根据本发明的一个具体实施方案，上述结构式B的化合物是式C的烷基磺酰基衍生物

其中

R¹和/或R²相互独立，并且可以代表：

H，CH₃，C₂H₅，直链或支链C₃-C₁₂、优选C₃-C₆烷基，或取代的C₂-C₁₂、优选C₂-C₆烷基；特别地，(CH₂)_nCOOR³，其中n＝1-12、优选1-5，R³可以是H，CH₂CN，2-和4-硝基苯基，2，3，5，6-四氟苯基，五氯苯基，五氟苯基，N-琥珀酰亚胺基，磺基-N-琥珀酰亚胺基，1-氧基苯并三唑基，并且(CH₂)_n中的烷基链可以是直链或支链的；和

R¹---R²可以形成四元、五元、六元或七元非芳族碳环，该碳环带有连接到该环的一个碳原子上的附加的伯氨基NH₂，仲氨基NHR^a，其中R^a＝C₁-C₆烷基、或羟基OH；任选地，R¹---R²可以形成四元、五元、六元或七元非芳族杂环，额外的杂原子如O、N或S包括在该杂环中；羟烷基(CH₂)_mOH，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链；R¹或R²基团的其中一个可以是碳酸酯或氨基甲酸酯衍生物，其中R¹或R²基团的其中一个是(CH₂)_mOCOOR⁴或COOR⁴，其中m＝1-12和R⁴＝甲基、乙基、2-氯乙基、N-琥珀酰亚胺基、磺基-N-琥珀酰亚胺基、1-氧基苯并三唑或取代的苯基，例如2-和4-硝基苯基、五氯苯基、五氟苯基、2，3，5，6-四氟-苯基、2-吡啶基或4-吡啶基；(CH₂)_mNR^aR^b，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链的烷基链；R^a、R^b彼此独立，并且可以是H、或任选取代的C₁-C₄烷基，特别地，R¹或R²基团的其中一个可以是烷基叠氮化物基团(CH₂)_mN₃，其中m＝2-6、并具有直链或支链的烷基链；

R¹或R²基团的其中一个可以是(CH₂)_nCOOR⁵，其中n＝1-5、具有直链或支链的烷基链(CH₂)_n、并且R⁵选自H、直链或支链C₁-C₆烷基、CH₂CN、2-和4-硝基苯基、2，3，5，6-四氟苯基、五氯苯基、五氟苯基、磺基-N-琥珀酰亚胺基、N-琥珀酰亚胺基、1-氧基苯并三唑基；

进一步，R¹或R²的其中一个可以是(CH₂)_nCONHR⁶，其中n＝1-12、优选1-5，和R⁶＝H、C₁-C₆烷基、(CH₂)_mN₃、(CH₂)_m-N-马来酰亚胺基、(CH₂)_m-NHCOCH₂X(X＝Br或I)，其中m＝2-6并且在(CH₂)_n和R⁶中具有直链或支链烷基链；或者R¹或R²中的一个可以代表CH₂-C₆H₄-NH₂、COC₆H₄-NH₂、CONHC₆H₄-NH₂或CSNHC₆H₄-NH₂，其中C₆H₄是1，2-、1，3-或1，4-亚苯基、COC₅H₃N-NH₂或CH₂-C₅H₃N-NH₂，其中C₅H₃N是吡啶-2，4-二基、吡啶-2，5-二基、吡啶-2，6-二基或吡啶-3，5-二基；式B中在SO₂片段和的残基X之间、n＝1-5的(CH₂)_n-CH₂接头可以代表具有2-6个碳原子的直链、支链或环状基团；

X＝SH，COOH，SO₃H，OP(O)(OH)₂，OP(O)(OH)R^a、其中

R^a＝任选取代的C₁-C₄烷基，P(O)(OH)₂，P(O)(OH)R^a、其中R^a＝任选取代的C₁-C₄烷基；

但条件是在所有由式C表示的化合物中，在碱性条件下、即7<pH<14，在式B的残基X中存在三个或六个负电荷基团，并且这些负电荷基团代表至少部分去质子化的可离子化基团的残基，所述可离子化基团选自：SH、COOH、SO₃H、OP(O)(OH)₂、OP(O)(OH)R^a，其中R^a＝C₁-C₄烷基或取代的C₁-C₄烷基、P(O)(OH)₂、P(O)(OH)R^a，其中R^a＝C₁-C₄烷基或取代的C₁-C₄。

根据本发明的一个更具体的实施方案，本发明的荧光染料由式C或其盐表示，其中X在每次出现时是SO₃H，并且n是1-12、优选1-6。

根据本发明的另一个具体实施方案，上述式B的化合物是式D的磺酰胺衍生物

其中

R¹和/或R²彼此独立，并且可以代表H，CH₃，C₂H₅，或直链或支链、任选取代的C₃-C₁₂、优选C₃-C₆烷基；特别地，(CH₂)_nCOOR⁴，其中n＝1-12、优选1-5，R⁴可以是H、CH₂CN、2-和4-硝基苯基、2，3，5，6-四氟苯基、五氯苯基、五氟苯基、N-琥珀酰亚胺基、磺基-N-琥珀酰亚胺基、1-氧基苯并三唑基，并且(CH₂)_n中的烷基链可以是直链或支链的；和

R¹---R²可以形成四元、五元、六元或七元非芳族碳环，该碳环具有连接到该环中一个碳原子上的附加的伯氨基NH₂，仲氨基NHR^a、其中R^a＝任选取代的C₁-C₆烷基、或羟基OH；或者任选地，R¹---R²可以形成四元、五元、六元或七元非芳族杂环，杂原子如O、N或S包括在该杂环中；

R¹和/或R²还可以代表：

羟烷基(CH₂)_mOH，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链的、任选取代的烷基链；R¹或R²基团的其中一个可以是碳酸酯或氨基甲酸酯衍生物(CH₂)_mOCOOR⁵或COOR⁵，其中m＝1-12且R⁵＝甲基、乙基、2-氯乙基、CH₂CN、N-琥珀酰亚胺基、磺基-N-琥珀酰亚胺基、1-氧基苯并三唑基、苯基或取代苯基，例如2-和4-硝基苯基、五氯苯基、五氟苯基、2，3，5，6-四氟苯基、2-吡啶基、4-吡啶基；

(CH₂)_mNR^aR^b，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链；R^a、R^b彼此独立，并且代表氢和/或任选取代的C₁-C₄烷基；

(CH₂)_mN₃，m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链；

(CH₂)_nCONHR⁶，其中n＝1-12、优选1-5，R⁶＝H、取代或未取代的C₁-C₆烷基，(CH₂)_mN₃、(CH₂)_m-N-马来酰亚胺基、(CH₂)_m-NHCOCH₂Y(Y＝Br，I)，其中m＝1-12、优选2-6，在(CH₂)_n和R⁶中具有直链或支链烷基链；

R¹或R²基团中的一个可以是伯氨基以形成芳基肼Ar-NR⁷NH₂，其中在式D中，Ar是整个芘残基，R⁷＝H或烷基；

R¹或R²基团中的一个可以是羟基以形成芳基羟胺Ar-NR⁸OH，其中在式D中，Ar是整个芘残基，R⁸＝H或烷基；

R¹或R²基团中的一个可以含有n＝1-12的末端烷氧基氨基(CH₂)_nONH₂，其可以通过m＝0-12的一个或多个烷基氨基(CH₂)_mNH、烷基酰胺基(CH₂)_mCONH、烷基醚或烷基酯基团的所有可能组合连接；

进一步，R¹或R²可以代表CH₂-C₆H₄-NH₂、COC₆H₄-NH₂、CONHC₆H₄-NH₂或CSNHC₆H₄-NH₂，其中C₆H₄是1，2-、1，3-或1，4-亚苯基、COC₅H₃N-NH₂或CH₂-C₅H₃N-NH₂，其中C₅H₃N是吡啶-2，4-二基、吡啶-2，5-二基、吡啶-2，6-二基或吡啶-3，5-二基；

R³＝H，(CH₂)_qCH₂X，C₂H₅，直链或支链C₃-C₆烷基，C_mH_2mOR，其中m＝2-6，具有直链或支链烷-二基(alkan-diyl)链C_mH_2m，并且R＝H、CH₃、C₂H₅、C₃H₇、CH₃(CH₂CH₂O)_kCH₂CH₂；其中k＝1-12；而(CH₂)_qCH₂接头可以代表具有2-6个碳原子的直链、支链或环状基团；

在式D中，在磺酰胺片段SO₂N和残基X之间的n＝1-12、优选1-5的(CH₂)_n-CH₂接头可以代表具有2-6个碳原子的直链、支链或环状基团；

X＝SH，COOH，SO₃H，OP(O)(OH)₂，OP(O)(OH)R^a、其中

R^a＝取代或未取代的C₁-C₄烷基，P(O)(OH)₂，P(O)(OH)R^a、其中R^a＝取代或未取代的C₁-C₄烷基；

但条件是在由式D表示的所有化合物中，在碱性条件下、即7<pH<14，在式C的残基X中存在三个、六个、九个或十二个负电荷基团，并且这些负电荷基团代表至少部分去质子化的可离子化基团的残基，所述可离子化基团选自：SH，COOH，SO₃H，OP(O)(OH)₂，OP(O)(OH)R^a、其中R^a＝C₁-C₄烷基或取代的C₁-C₄烷基，P(O)(OH)₂，P(O)(OH)R^a、其中R^a＝C₁-C₄或取代的C₁-C₄烷基。

根据本发明的优选实施方案，上述式B、C和D中的取代基R¹和R²定义如下：

式B中的R¹和/或R²代表H、CH₃、(CH₂)_nCOOR³，其中n＝1-4，R³可以是H、CH₂CN、2-或4-硝基苯基、2，3，5，6-四氟苯基、N-琥珀酰亚胺基、磺基-N-琥珀酰亚胺基、1-氧代苯并三唑，同时(CH₂)_n中的烷基链是直的；n＝1-12。

式C和D的化合物可以以盐的形式存在和应用，所述盐包括所有可能类型的阳离子，优选Na⁺、K⁺或三烷基铵阳离子。

特别优选的上述结构通式B、C和D的含氨基芘的化合物具有以下通式之一：

本发明的一个优选实施方案涉及上述式A-B或A-D的化合物，其中负电荷由几个伯磷酸基团提供，特别是双O-磷酸化的7-氨基吖啶-2-磺酰胺(两个磷酸基团)、三O-磷酸化的1，6，8-三[(ω-羟烷基)磺酰基]-芘-3-胺(三个磷酸基团)和1，6，8-三[ω-(羟烷基)磺酰胺基]芘-3-胺。与APTS相比，这些化合物具有更高的亮度和更好的电泳迁移率，并成功地应用于标记多糖和通过毛细管凝胶电泳(CGE)(其通过激光诱导荧光(LIF)检测)分析缀合物。

本发明的另一个优选实施方案涉及式B、C或D的化合物，其中R¹和/或R²代表：H，氘，烷基或氘取代的烷基，特别是具有1-12个C原子、优选1-6个C原子的烷基或氘取代的烷基，其中烷基的一个、数个或所有H原子可以被氘原子取代，4，6-二卤代-1，3，5-三嗪基(C₃N₃X₂)、其中卤素X优选氯，2-、3-或4-氨基苯甲酰基(COC₆H₄NH₂)，N-[(2-，N-[(3-或N-[(4-氨基苯基)脲基基团(NHCONHC₆H₄NH₂)，N-[(2-，N-[(3-或N-[(4-氨基苯基)硫代脲基基团(NHCSNHC₆H₄NH₂)或连接的羧酸残基和它们的通式反应性酯，通式为(CH₂)_m1COOR³、(CH₂)_m1OCOOR³、(CH₂)_n1COOR³或(CO)_m1(CH₂)_m2(CO)_n1(NH)_n2(CO)_n3(CH₂)_n4COOR³，其中整数m1、m2和n1、n2、n3、n4分别独立地为1至12和0至12，其中链(CH₂)_m/n是直链、支链、饱和、不饱和、部分或完全氘化的，和/或包括在含N、O或S的碳环或杂环中，而R³是H、D或亲核反应性离去基团，优选包括但不限于N-琥珀酰亚胺基、磺基-N-琥珀酰亚胺基、1-氧基苯并三唑、氰甲基、多卤代烷基、多卤代苯基，例如四或五氟苯基、2-或4-硝基苯基。

本发明的新化合物具有小分子尺寸，并且在优选实施方案中，提供了急剧增加的高负净电荷(z)(例如，对于磷酸化吖啶酮，至少z＝-4，对于磷酸化芘染料，至少z＝-6)。这两个要求分别相当于低流体动力半径和低质荷比(m/z)。因此，在对这些化合物和相应的标记碳水化合物进行电动测量时，可以获得高速度和高分析分辨率的快速分离。

负电荷是由酸性基团提供的，酸性基团可以在碱性甚至中性介质中去质子化。为此，优选磷酸基团，因为伯烷基磷酸基(R-OPO₃H₂)的第一和第二酸性质子的pK_a值分别在1-2和6-7的范围内。因此，在碱性条件下，一个单一的磷酸基团可以在缓冲溶液中引入两个负电荷(例如，在pH8以上，存在R-OPO₃ ^2-)。为了获得-4的负电荷，两个磷酸基团的连接是必要的，等等。然而，其它酸性基团，特别是选自上述通式A-B定义的基团X的酸性基团也是合适的。

一般而言，上述式A-B的化合物适合并有利地用作氨基酸、肽、蛋白质(包括初级和次级抗体、单结构域抗体、多西他赛、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白及其修饰物)、适配子、核苷酸、核酸、毒素、脂质、碳水化合物(包括2-脱氧-2-氨基葡萄糖和其他2-脱氧-2-氨基-氨基吡喃糖苷、聚糖、葡聚糖)、生物素和其他小分子(例如肌动蛋白聚合诱导剂(jasplakinolide)及其修饰物)的荧光标记。

化合物7-R(R＝H，Me)，13a，13b，16和18(见下面的方案7)具有游离羟基，适合作为前体用于获得通式B的磷酸化芘染料。特别地，化合物7-R(R＝H，Me)被磷酸化并得到染料8-R(R＝H，Me)。化合物13a、b和18被类似地磷酸化。因此，例如前体染料13a和13b都产生(在反应混合物的基本处理之后)化合物15。化合物16有一个游离羧基，可用作生物缀合物的反应中心。因此，化合物16代表氨基酸、肽、蛋白质(包括初级和次级抗体、单结构域抗体、多西他赛、抗生物素蛋白、链霉亲和素及其修饰物)、适配子、修饰的核苷酸、含有氨基的修饰的核酸、毒素、脂质、碳水化合物(包括2-脱氧-2-氨基葡萄糖和其他的2-脱氧-2-氨基氨基吡喃糖苷、修饰的生物素(例如，生物胞素)和其他小分子的荧光标记。

方案7

本发明示例性的含氨基芘化合物及其前体

因此，本发明的一个密切相关的方面涉及结构通式A-D的化合物作为荧光试剂用于与广泛范围的分析物缀合的用途，其中所述缀合包括与化学实体或物质形成至少一个共价化学键或至少一个分子复合物，例如胺、羧酸、醛、醇、芳族化合物、杂环、染料、氨基酸、氨基酸残基与任何化学实体、肽、蛋白质、碳水化合物、核酸、毒素和脂质偶联。

要求保护的化合物适用于并可用于荧光标记和检测目标分子的方法。典型地，这种方法意味着使根据以上式A-D中任一个的化合物与靶分子反应，所述靶分子选自包含以下的组：氨基酸、肽、蛋白质(包括初级和次级抗体)、单结构域抗体、多西他赛、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白及其修饰物、适配子、(修饰的)核苷酸、(修饰的)核酸、毒素、脂质、碳水化合物(包括2-脱氧-2-氨基葡萄糖和其他2-脱氧-2-氨基氨基吡喃糖苷、聚糖、葡聚糖)、(修饰的)生物素(例如，生物胞素)和其他小分子(例如肌动蛋白聚合诱导剂(jasplakinolide)及其修饰物)。标记后，通过色谱和/或动电学技术分离、检测、定量和/或分离标记的荧光衍生物。

本发明人发现，色谱分离技术(如反相或亲水相互作用(U)HPLC)，在所有可能的规模上(从纳米到分析规模和更大)和动电学分离技术(电泳、凝胶电泳、毛细管电泳、毛细管凝胶电泳或毛细管电色谱)-所有这些都具有荧光或激光诱导荧光检测-非常适合于所描述的改进的用于碳水化合物和碳水化合物混合物的自动化高性能分析、鉴别和/或测定的方法。特别地，使用具有激光诱导荧光检测(xCGE-LIF)的多重毛细管凝胶电泳允许对碳水化合物和/或碳水化合物混合物组成模式(例如：糖蛋白的糖基化模式)进行快速但稳健且可靠的分析和鉴别。用于糖蛋白分析的根据本发明的方法允许可视化碳水化合物混合物组成(例如糖蛋白的聚糖池(glycan-pool))，包括碳水化合物的结构分析，同时省略了非常昂贵和复杂的设备，如质谱仪或NMR仪(核磁共振仪)。由于与其它分离技术相比，毛细管电泳技术、特别是毛细管凝胶电泳具有优越的分离性能和效率，以前曾被考虑用于复杂的碳水化合物分离，但所述技术在本领域中不被推荐，因为据称使用该方法时会有缺点，参见例如Domann等人或W02006/114663。然而，当应用根据本发明的方法时，xCGE-LIF技术允许以高性能灵敏和可靠地测定和鉴别碳水化合物结构。特别是毛细管DNA测序仪的使用，(例如4-毛细管测序仪：3100-Avant遗传分析仪、3130遗传分析仪、SeqStudio和Spectrum Compact；16-毛细管测序仪：3100遗传分析仪和3130xl遗传分析仪；48-毛细管测序仪：3730DNA分析仪；96-毛细管测序仪：来自Applied Biosystems的3730×l DNA分析仪，8-毛细管测序仪：3500遗传分析仪；24-毛细管测序仪：3500×l遗传分析仪和Promega Spectrum)允许根据本发明的方法的高性能。本发明的先进/改进的方法能够更容易和更精确地表征复杂组成的天然或合成碳水化合物混合物中的变化，并且在将样品与已知碳水化合物混合物组成进行比较的情况下，直接通过碳水化合物“指纹图谱”比对来表征碳水化合物混合物组成模式(例如，蛋白质糖基化模式)。

根据本发明的方法是一种进一步简化和更稳健但仍然高度灵敏和可再现的糖分析方法，具有高分离性能。

特别是具有多达96个平行毛细管的上述仪器与本发明中包含的软件/数据库工具的组合，能够实现自动化的真正高通量分析。

该方面的进一步具体的实施方案涉及用式A-D的染料荧光标记碳水化合物的方法，该方法至少包括以下步骤：

a)在0.5-4M的有机酸性水溶液中制备1-400mM的染料溶液，特别是如权利要求5所示的式6-H、6-Me、8-H、15、23或23b的染料；

b)在DMSO、水、甲醇、乙醇、二甘醇二甲醚、四氢呋喃或这些溶剂的混合物中制备0.05-3M的硼烷溶液；

c)在反应容器中将上述步骤a)和b)制备的溶液和含碳水化合物的分析物溶液混合；

d)反应混合物在10-90℃孵育0.1-48h；

e)向反应混合物中加入水和可与水混溶的有机溶剂的混合物，有机溶剂：水的比例为1：10至10：1，并搅拌反应容器的内容物，以停止步骤d)中的反应，溶解反应产物；

f)可选地使步骤e)产生的混合物产生涡流；和

g)可选地使步骤f)产生的混合物进行电泳。

更具体地，有机溶剂选自包含以下的组：乙腈、乙醇、甲醇、异丙醇、四氢呋喃、乙酸、二噁烷、环丁砜、二甲亚砜、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、硝基甲烷、六甲基磷酰三胺(hexamethylphosphortriamide)、二甘醇二甲醚、甲基溶纤剂(methyl cellosolve)，优选的有机溶剂为乙腈。

此外，本发明还包括碳水化合物-染料缀合物，其包括根据上述式A-B或A-D所述的荧光染料。

更具体地，所述缀合物、特别是碳水化合物缀合物中的染料，选自式6-H、6-Me、8-H、15、23、23b的化合物，如下方案8所示。

由于它们的反应性基团(芳香族氨基(NH₂)、肼(NRNH₂)、酰肼(CONRNH₂)、羟胺(NROH)、反应性氨基甲酸酯(NHCOOR)或烷氧基氨基(RONH₂)，上述式A至D的化合物适用于且有利地用于与具有游离形式或受保护形式(例如作为半缩醛)的醛基团或氨基的合适碳水化合物进行还原胺化或直接缩合反应(如方案2-6和8所示)。

因此，本发明密切相关的方面涉及这种用途和用于还原胺化或直接缩合的方法，其包括将上述式A-D的化合物与具有游离形式或作为半缩醛的醛基或氨基的合适碳水化合物反应，有足够的时间对标记的荧光衍生物选择性地进行还原胺化和色谱或动电学分离，然后通过光学光谱方法(包括荧光检测和/或质谱检测)检测分析物。方案8给出了染料-缀合物结构的示例。

式A-D的化合物和包含该化合物的碳水化合物-染料缀合物特别适合和有利地用于荧光检测器的光谱校准，特别是用于检测激光诱导荧光(LIF)的检测器，因为它们通常用于C(G)E系统。

方案8

新染料的光谱性质

下表1中给出了染料的光谱性质。

表1.磷酸化氨基吖啶酮6-H和6-Me、磺酰氨基芘8-R(R＝H，Me)、烷基磺酰基修饰的芘染料15、16、18、23及其前体和相关化合物：19、20和染料APTS(结构见方案7-13)的光谱性质。

a-荧光量子产率的绝对值(如果没有另外说明)；b-TEAB为Et₃N*H₂CO₃缓冲液水溶液，pH＝8-8.5；c-375nm激发；d-相对值，以罗丹明6G作为参考染料，Φ_fl＝0.9；e-对于单N-烷基化APTS衍生物，吸收(abs.)和激发(emiss.)最大值分别为457和516nm(ε～19000M^-1cm^-1)；f-在PBS缓冲液水溶液中、在515nm激发；g-用荧光素作为参考染料获得，在0.1M NaOH中，在496nm激发下，Φ_fl＝0.9；h-当从PBS(pH 7.4)转换为TEAB缓冲液(pH 8-8.5)时，包括APTS在内的氨基芘染料均未显示显著变化。

方案13.磷酸化荧光染料19、20、磺化染料23、23b和APTS作为参考化合物，具有不同的负电荷和不同的光谱性质。

表1的结构特征和数据表明，双磷酸化氨基吖啶酮6-H和6-Me，三磷酸化芘染料8-H，8-Me和15符合上述定义荧光标记的标准。此外，还需要证明它们是否可以用于多糖的还原胺化，以及它们的缀合物的发射是否会干扰用APTS标记的多糖的发射(结构和光谱数据见方案7-12和表1。例如，化合物6-R(R＝H，Me)的m/z比率分别为134和138(APTS的m/z＝151)。它们有几个吸收最大值并发射橙色光(两个发射最大值分别在485nm和585nm，相对强度为约1：2；见图22A)。虽然它们在488nm处的吸收相对较低，但红发射是一个显著的特征，其相应的斯托克斯位移为约160nm。化合物6-R的荧光量子产率的绝对值为5-6％。因此，尽管相对较低的亮度，但是甚至红色发射染料6-R(芘染料8-R和15更亮)代表了新的标签，其可以用于标记聚糖，包括“重”和“外来”聚糖(由于APTS的净电荷相对较低(-3)，以及修饰有APTS标签的“重”碳水化合物的迁移率较低造成的限制，这些聚糖还不能被检测到)。事实上，由于存在四种负电荷和极低的m/z比，本文所介绍的磷酸化染料能够提供更好的偶联物的电泳迁移率，减少它们的迁移时间，从而显示和突出大体积和大质量的碳水化合物。

表1中列出的所有芘染料都具有高荧光性。非磷酸化的芘7-R(R＝H，Me)，13b，16和18允许以更高的精确度估计消光系数。最长波长波段的消光系数在18000～23000之间，最大波长的位置在465至507nm之间。因此，氩离子激光在488nm处很容易产生荧光。在535～563nm范围内发现了最大发射值，荧光量子产率一直很高(71～97％)。因此，磺化1-氨基芘表示比2-磺酰胺-7氨基吖啶酮更亮的染料。亮度正比于消光系数(在488nm)和荧光量子产率的乘积。我们可以假设，对于吖啶酮染料，这个值为约1500×0.06＝90，对于芘-20000×0.9＝18000。这个粗略的估计意味着三磺化的1-氨基芘比2-磺酰胺-7-氨基吖啶酮的染料要亮约200倍。这种性质使得本发明的芘染料比2-磺酰胺-7氨基吖啶酮和APTS更优越。如果我们假设APTS在最大(457nm)处的消光系数为19000(方案6)，在488nm处的吸收通常为457nm处最大吸收的约35％，那么我们得到的相对亮度为6000(假设相同的荧光量产率)。因此，本发明的染料比APTS(与聚糖缀合时)要亮约3倍。本发明的芘染料，尤其是化合物8-H，15，23和23b代表了新的标签，其可以用于标记聚糖，包括“重”和“外来”聚糖(由于APTS的净电荷相对较低(-3)，以及更低的亮度造成的限制，这些聚糖还不能被检测到)。

为了将发射带移至红色光谱区，制备了N-甲基化衍生物8-Me。该染料具有一个N-甲基氨基，因此，它代表的荧光团非常类似于由聚糖和母染料8-H形成的还原胺化产物(与方案9中的化合物6相比)。吸收最大值已移至红色(+37nm；8-H→8-Me)，但发射最大值经历了“仅”19nm的氟偏移(见表1)。因此，斯托克斯位移从79nm减小至61nm。

还有另一种工具用于增加芳香荧光染料系列的荧光红移(bathofloric shift)和色谱红移(bathochromic shift)，条件是它们具有电子给体和电子受体基团，它们之间具有所谓的“推拉”电子相互作用(直接极性缀合物)。在1-氨基芘染料的实例中，给电子基团是固定的(不能增强其给电子性质)，但3、6和8位吸电子基团可能是不同的。特别是，烷基砜基(R-SO₂，存在于化合物13b，15，16，18，23和23b中)被证明是比磺酰胺基(存在于化合物7-H，7-Me，8-H，8-Me；见方案7)更强的接受体。然而，制备化合物8-H和15并比较其在水溶液中的光谱性质(表1)后，确定其红移与预期一致为12nm，但发射最大值的位置和波段形态没有变化。最简单的解释是基于这样的假设，单氨基(作为给体)“已达到极限”，并且其无法为由三个非常强的受体基团(无论它们有多强)修饰的π-体系提供更多的电子密度。幸运的是，在氮原子的还原烷基化过程中(见方案2)，发生了进一步的(荧光红移(bathofloricshift)和色谱红移(bathochromic shift))(与上文讨论的化合物8-H和8-Me的光谱数据相比)，化合物15与聚糖的缀合物具有明亮的光，与APTS检测通道没有串扰。

本发明基于分离和检测所述碳水化合物混合物(例如：聚糖池)，利用xCGE-LIF技术(例如使用毛细管DNA测序仪)，可生成碳水化合物组成模式指纹图谱，通过数据库匹配测试样品混合物中每个单一化合物的内部归一化CGE-迁移时间，实现分离的碳水化合物的自动结构分析。本文要求保护的方法允许合成或天然来源的碳水化合物混合物组成分析，如糖蛋白的糖基化模式分析。碳水化合物迁移时间与迁移时间指数的先进的内部归一化是基于使用一系列与样品相似但用一种或多种新型荧光染料标记的内部碳水化合物标准品，其发射波长与样品的一种或多种标签的波长不同。已知成分的内部碳水化合物标准品(例如，可以是一组单、二、三、四和/或五聚体，直链和/或支链、多达100聚体(或更多))，在待分析碳水化合物样品的整个指纹图谱范围内洗脱/迁移，但在另一个迹线/通道中检测，因为它们被与碳水化合物样品不同的标签荧光标记，因此另一个波长发射，不显示在样品的迹线。该先进的内部碳水化合物标准品。这种先进的内部碳水化合物标准品，其在待分析的碳水化合物样品指纹图谱的整个迁移/保留时间范围内洗脱/迁移、但在另一个波长迹线中检测，可用于非常精确和可再现的“先进的”内部归一化迁移/保留时间。它们用于生成校准曲线，在曲率/形状、y轴截距和斜率方面非常精确。

这种改进的迁移时间指数的测定允许对碳水化合物进行非常精确和绝对的可再现分析，独立于样品类型和来源、分析时间点、实验室、仪器和操作人员。

所述方法与系统相结合的使用还可以允许定量地分析所述碳水化合物混合物组成。因此，根据本发明的方法和系统代表了一种强大的工具，用于监测碳水化合物混合物组成的变化，如蛋白质的糖基化模式，而不需要复杂的结构调查。对于荧光标记的碳水化合物，LIF检测允许检测低至十的负十八次方摩尔(attomolar)的检测限。

每次运行所需用于对齐标准品可能存在于一个单独的样品中，也可能包含在待分析的碳水化合物样品中。

用于标记碳水化合物的荧光标记的其中一个可以是例如荧光标记8-氨基-1，3，6-芘三磺酸也被称为9-氨基芘-1，4，6-三磺酸(APTS)或其他优选的多电荷荧光染料，而另一个荧光标记是通式A或B的染料中的一个。

在标准品存在的基础上，可以进行定性和定量分析。相对定量可以很容易地通过每个化合物的单个峰高来完成，其与浓度是线性(在LIF检测器的线性动态范围内)的关系。

本发明解决了其他已知方法如色谱法、质谱法、NMR等在碳水化合物分析中的缺点。NMR和质谱法代表了耗时费力的技术的方法。此外，实施所述方法需要昂贵的仪器。此外，大多数所述方法如NMR技术无法扩大到高通量的方法。使用质谱法可以获得高灵敏度。然而，构型可能是困难的，只有通过定位单体糖化合物的键才能获得非特定的结构信息。HPLC根据检测器的不同也相当灵敏，并允许定量。但如上所述，真正的高通量分析只有大量使用昂贵的高效液相色谱系统和溶剂才能实现。

本领域其他已知的技术是基于酶处理的，酶处理非常敏感，可以得到详细的结构信息，但需要与其他方法相结合，如HPLC(高效液相色谱)、MS(质谱)和NMR(核磁共振)。本领域已知的技术进一步涉及凝集素或单克隆抗体亲和力，其仅提供初步数据，不提供明确的结构信息。

根据本发明的方法允许对具有未知组成的碳水化合物混合物进行高通量鉴定，或对碳水化合物混合物组成模式(例如：糖蛋白的糖基化模式)进行高通量鉴别或分析。特别地，本发明允许定量地测定碳水化合物混合物组成的成分。

本发明的方法甚至能够快速可靠地测量复杂的混合物组成，因此能够测定和/或鉴别碳水化合物和/或碳水化合物混合物组成模式(例如：糖基化模式)，其与所使用的仪器无关，只与对齐迁移时间(迁移时间指数)有关。

本发明允许应用于多种领域。例如，该方法可用于分析哺乳动物细胞培养物衍生分子(如重组蛋白，抗体或病毒或病毒成分、如甲型流感病毒糖蛋白)的糖基化。有关所述化合物糖基化模式的信息对食品和药品特别重要。从用1D/2D凝胶电泳分离复杂的蛋白质混合物开始，本发明的方法也可用于任何其他糖缀合物的聚糖分析。此外，例如通过色谱或亲和捕获的预纯化的糖蛋白也可以根据本发明的方法处理，用溶液中去糖基化取代凝胶分离和凝胶中去糖基化步骤，在蛋白质和酶沉淀后继续进行。最后，可以分析合成或从自然来源获得的复杂可溶性低聚糖和/或聚合糖混合物，它们是当今重要的营养添加剂/替代品，或用于药物或作为药物。

因此，可以对碳水化合物混合物进行两种分析。一方面，可以进行碳水化合物混合组成模式分析如糖基化模式分析，另一方面，基于碳水化合物迁移时间指数与数据库的数据相匹配的碳水化合物鉴别是可能的。

因此，给出了根据本发明的方法的广泛的潜在应用，从生产和/或质量控制到早期诊断正在产生、正在引起糖基化模式变化的疾病或由糖蛋白的引起的疾病。

特别是，在医学诊断(如慢性炎症识别或早期癌症诊断)中，其中蛋白质糖基化模式的变化是疾病的有力指标，可以应用该方法。糖基化模式的变化可以简单地通过比较得到的有关峰数、高度和迁移时间的指纹图谱来确定。因此，疾病标记物可以被鉴别，因为它被描述在相似的蛋白质组学方法。也就是说，类似于比较个体在连续时间点的蛋白质组，可以分析个体的糖组作为疾病或鉴别风险患者的指标。

在一个实施方案中，根据本发明的方法是一种方法，其中所述荧光染料是具有下式C的染料

在另一个实施方案中，所述荧光染料为具有式D的式的染料

在优选实施方案中，式A至D的化合物选自

或7-R(R＝H，Me)，13a，13b，16和18的化合物

在另一方面，本发明涉及一种用于校准多波长荧光检测系统、特别是毛细管凝胶电泳系统的方法，具有基于吖啶酮和/或芘的荧光染料，其可选择性地作为与底物部分(包括碳酸化合物)的缀合物存在，从而该方法包括检测至少一种根据权利要求1中定义的式A或B的化合物(包括化合物C或D)，以及允许在不同波长下的额外的荧光染料，优选包括至少一种化合物APTS、化合物19或化合物20，如下所示

如实施例中所证明的，用所述染料校准多波长荧光检测系统提高了仪器的灵敏度，并允许更独立于操作者、仪器等实施根据本发明的方法。

特别是，如在进一步的实施例中所讨论的，系统或仪器的校准增加了灵敏度，从而提高了所述方法的适用性和可用性。

在根据本发明的校准方法的实施方案中，用于光谱校准的吖啶酮和/或芘基染料及其组合分别如实施例2和实施例3中的表2和表3所示。

此外，还公开了一种包含根据本发明的荧光染料的碳水化合物染料缀合物，用于根据本发明的方法。在一个实施方案中，根据本发明的染料缀合物是选自下式的化合物的染料

在进一步的方面，提供了校准标准品。即，例如在如本文所述的校准方法中有效的校准标准品是碳水化合物标准品，其包括荧光染料，所述荧光染料包括根据式A、B、C或D的荧光染料中的至少一种，其可以与碳水化合物缀合，任选地进一步包含至少一种化合物19或20。

描述了与波长校准方法有关的校准标准品的典型实例。

在另一方面，本发明涉及由用根据式A或B的荧光染料、特别是式C或D的荧光染料，或式A至D的不同染料标记的化合物组成的标准品组合物。在一个实施方案中，标准品组合物由用所述染料标记的碳水化合物组成，可替代地，该化合物是DNA碱基对梯形标记(ladder)或类似的核酸碱基标准品。此外，该染料优选为6-H、6-Me、8-R、15、13a、13b、16、18、23和23b中的至少一种。所述标准品组合物可用于根据本发明的方法，特别是待测定的碳水化合物的迁移/保留时间的比对。

此外，还公开了通式20的化合物。

在进一步的方面，本发明涉及一种用于测定和/或鉴别碳水化合物混合物组成模式的试剂盒或系统，该试剂盒或系统包括具有非瞬态存储器的数据处理单元，所述存储器含有数据库，该数据库含有碳水化合物的对齐迁移/保留时间和/或对齐迁移/保留时间指数，所述迁移/保留时间和/或迁移/保留时间指数通过碳水化合物的自动测定和/或鉴别、和/或碳水化合物和/或碳水化合物混合物组成模式分析的鉴别获得，包括以下步骤：

a)获得含有至少一种碳水化合物的样品；

b)用第一荧光标记物标记所述碳水化合物；

c)提供标记有第二荧光标记的已知组成的标准品；

d)测定所述碳水化合物和如本文所述已知组成的标准品的迁移/保留时间，例如使用毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光；

e)根据标准品的给定标准迁移/保留时间指数，将迁移/保留时间与迁移/保留时间指数进行对齐；

f)将这些碳水化合物的迁移/保留时间指数与数据库中的标准迁移/保留时间指数进行比较；

g)鉴别或测定碳水化合物和/或碳水化合物混合物组成模式，

其中，将标准品组合物添加到含有未知碳水化合物混合物组成的样品中，第一荧光标记和第二荧光标记是不同的，其中第一荧光标记或第二荧光标记是具有多个可离子化和/或负电荷基团的荧光染料，这些基团选自由通式A至D的化合物组成的组。

在另一方面，本发明涉及一种用于测定和/或鉴别碳水化合物混合组成模式分析的试剂盒或系统，该试剂盒或系统包括具有非瞬态存储器的数据处理单元，所述存储器包含数据库，该数据库含有碳水化合物的对齐迁移/保留时间和/或对齐迁移/保留时间指数，所述迁移/保留时间和/或迁移/保留时间指数通过碳水化合物的自动测定和/或鉴别、和/或碳水化合物和/或碳水化合物混合物组成模式分析的鉴别获得，包括以下步骤：

a)提供含有碳水化合物混合物组成的样品；

b)用第一荧光标记物标记所述碳水化合物混合物组成；

c)提供标记有荧光标记物的第二样品，该第二样品具有待与之比较的已知碳水化合物混合物组成模式；

d)如本文公开的方法中所述，生成第一和第二样品的碳水化合物混合物组成的电泳图/色谱图，例如使用毛细管(凝胶)电泳-激光诱导荧光或色谱法；

e)比较由获得的第一样品和第二样品的电泳图/色谱图计算出的标准品迁移/保留时间指数；

f)分析第一和第二样品的碳水化合物混合物组成模式分析的一致和/或差异，其中样品中存在的碳水化合物的标准迁移/保留时间指数是基于标记有第二荧光标记的已知成分的内部标准品计算的，并且其中第一或第二荧光标记中的一个是根据本发明通式A或B的荧光染料。

此外，本发明在进一步的方面涉及一种用于自动化碳水化合物混合物组成模式分析的试剂盒或系统，该试剂盒或系统包括具有非瞬态存储器的数据处理单元，所述存储器含有数据库，所述数据库含有碳水化合物的校准对齐迁移/保留时间和/或对齐迁移/保留时间指数，所述迁移时间和/或迁移/保留时间指数通过碳水化合物的自动测定和/或鉴别、和/或碳水化合物和/或碳水化合物混合物组成模式分析的鉴别获得，包括以下步骤：

a)提供含有未知碳水化合物混合物组成的第一样品；

b)用第一荧光标记物标记所述碳水化合物混合物组成；

c)向所述第一样品中加入用第二荧光标记物标记的具有已知碳水化合物混合物组成模式的第二样品；

d)使用毛细管(凝胶)电泳-激光诱导荧光或色谱法生成所述样品的碳水化合物混合物组成的电泳图/色谱图；

e)分析该第一和第二样品的碳水化合物混合物组成模式分析的同一性和/或差异；

其中该第一样品的第一荧光标记物不同于该第二样品的第二荧光标记物，并且其中该第一荧光标记和该第二荧光标记中的至少一个是根据本发明的通式A或B的荧光染料。

在一个实施方案中，根据本发明的试剂盒或系统进一步包括毛细管(凝胶)电泳-激光诱导荧光装置。例如，该装置可以是本领域已知的毛细管DNA测序仪。

在进一步的方面，公开了一种碳水化合物染料缀合物，其包括与本文所述的碳水化合物缀合的本文所定义的荧光染料，用于根据本发明的方法。

一个实施方案，该碳水化合物染料缀合物是其中染料选自下式的化合物的缀合物：

在上述特定化合物的某些实施例中，染料作为碳水化合物染料缀合物存在，据此鉴别与染料结合的碳水化合物。

本发明将通过实施例进一步描述，更详细地说明本发明，但不限于此。

附图说明

图1-提供了根据本发明的碳水化合物分析的工作流程。

图2-在xCGE-LIF仪器对这四种染料的特定校准混合物进行光谱校准之前(A)和之后(B)的19(I)、20(II)、6-H标记的麦芽三糖(6-H^a；III)和APTS标记的麦芽四糖(APTS^a；IV)的光谱校准混合物。

图3-在xCGE-LIF仪器对19、20、6-H^a和APTS^a进行光谱校准之前(A)和之后(B)的6-H标记的麦芽糖阶梯(ladder)。测量前，将B中的VB9163标记麦芽糖阶梯以1：2的比例稀释于水中。描述的峰是13.2分钟的麦芽糖、15.3分钟的麦芽三糖、17.2分钟的麦芽四糖、19分钟的麦芽五糖、20.8分钟的麦芽六糖、22.2分钟的麦芽七糖、23.9分钟的麦芽八糖等。

图4-在xCGE-LIF仪器对五种染料的特定校准混合物进行光谱校准之前(A)和之后(B)的15-标记的麦芽三糖(15^a；I)、19(I)、20(IV)、6-Me标记的麦芽三糖(6-Me^a；V)和APTS标记的麦芽四糖(APTS^a)的光谱校准混合物。

图5-在xCGE-LIF仪器对15^a、19、20、6-Me^a和APTS^a进行光谱校准之前(A)和之后(B)的APTS标记的葡聚糖阶梯(APTS^b)。描述的峰是14.1分钟的葡聚糖三聚体，16.2分钟的四聚体，18.3分钟的五聚体，20.9分钟的六聚体，23分钟的七聚体等。

图6-在xCGE-LIF仪器对15^a、19、20、6-Me^a和APTS^a进行光谱校准之前(A)和之后(B)的15-标记的葡聚糖阶梯(15^b)。描述的峰是9.8分钟的葡聚糖三聚体，11分钟的四聚体，12分钟的五聚体，13.1分钟的六聚体，14.2分钟的七聚体等。

图7-在xCGE-LIF仪器对15^a、19、20、6-Me^a和APTS^a光谱校准之前(A)和之后(B)的6-Me标记的葡聚糖阶梯(6-Me^b)。描述的峰是14.9分钟的葡聚糖三聚体，16.3分钟的四聚体，18.2分钟的五聚体，20.1分钟的六聚体，22分钟的七聚体等。

图8-在xCGE-LIF仪器对15^a、19、20、6-Me^a和APTS^a进行光谱校准后，APTS标记的柠檬酸盐血浆衍生的N-聚糖(522nm迹线)、15标记的碳水化合物标准品(554nm迹线)和6-Me标记的碳水化合物标准品(575nm迹线)重叠(参见图7)。522nm、554nm和575nm通道现在显示与其他通道的光谱串扰，证明光谱校准成功。

图9-不同对齐标准品的电泳图。A-GeneScan 500LIZ尺寸标准品。B-基于吖啶酮的荧光染料(6-Me)标记的碳水化合物标准品。标记的峰用于计算对齐程序的多项式拟合(参见图11)。

图10-在与碱基对大小标准品(A)或由正交碳水化合物标准品精制的碱基对大小标准品(B)对齐后的人柠檬酸盐血浆衍生的N-聚糖指纹图谱。相对峰高比例(PHP)是指纹图谱的信号强度相对于15个选取峰的总和进行归一化。聚合物1和2的生产日期/批次不同。第1-9天计算聚合物在室温下的天数。

图11-在与碱基对大小标准品(A)或吖啶酮荧光染料标记的碳水化合物标准品(6-Me^b)(B)对齐后的人柠檬酸盐血浆衍生的N-聚糖指纹图谱。相对峰高比例(PHP)是指纹图谱的信号强度相对于15个选取峰的总和进行归一化。聚合物1和2是不同生产日期的POP7聚合物。第1-9天计算POP7聚合物在室温下的天数。

图12-不同对齐程序的内部标准品的多项式拟合。A-适用于与碱基对大小标准品对齐的二阶多项式拟合。选取13个峰，如图9A所示。B-适用于与碱基对大小标准品对齐的二阶多项式拟合，通过第二个对齐步骤进行调整，使用四个内部寡糖峰。C-适用于与基于吖啶酮的荧光染料(6-Me)标记的碳水化合物标准品对齐的二阶多项式拟合。选取了16个峰，如图9B所示。

图13-不同对齐标准品的电泳图。A-碱基对大小标准品。B-基于芘的荧光染料(15)标记的碳水化合物标准品。标记的峰用于计算对齐程序的多项式拟合(参见图16)。

图14-在与碱基对大小标准品(A)、碱基对大小标准品+芘荧光染料标记的碳水化合物标准品(B)或芘荧光染料(15)标记的碳水化合物标准品(15^b)(C)对齐后的人柠檬酸盐血浆衍生的N-聚糖指纹图谱。相对峰高比例(PHP)是指纹图谱的信号强度相对于15个选取峰的总和进行归一化。聚合物1和2是不同生产日期的POP7聚合物。第1-9天计算室温下POP7聚合物的天数。

图15-在xCGE-LIF仪器对15^a、19、20、6-Me^a和APTS^a进行光谱校准后，APTS标记的柠檬酸盐血浆衍生的N-聚糖(522nm迹线)、标记的碳水化合物标准品(554nm迹线)和碱基对标准品(655nm迹线)重叠(参见图7)。522nm和554nm通道现在显示了与其他通道的光谱串扰，证明了成功的光谱校准。在含有655nm通道碱基对大小标准品中，可以观察到与595nm和575nm通道的小的光谱串扰，因为655nm通道没有针对bp染料进行光谱校准。

图16-不同对齐程序的内部标准品的多项式拟合。A-适用于与碱基对大小标准品的对齐的二阶多项式拟合。选取13个峰，如图13A所示。B-适用于与基于芘的荧光染料(15)标记的碳水化合物标准品比齐的二阶多项式拟合。选取了22个峰，如图13B所示

图17-用不同的仪器测量，并与碱基对大小标准品(A)、碱基对大小标准品+寡糖再对齐(B)、碱基对大小标准品+芘荧光染料(23)标记的碳水化合物标准品再对齐(C)或芘荧光染料(23)标记的碳水化合物标准品(D)对齐的APTS标记的柠檬酸盐血浆衍生物的N-聚糖指纹图谱重叠。用3130_1–第一ABI DNA遗传分析仪3130(序号：21363-yyy)配有50cm四毛细管阵列，3130_2–第二ABI DNA遗传分析仪3130(序号：1521-yyy)配有50cm四毛细管阵列，3130xl_1–第一ABI DNA遗传分析仪3130x1(序号：19248-yyy)配有50cm 16-毛细管阵列，3130xl_2–第二ABI DNA遗传分析仪3130x1(序号：1208-yyy)配有50cm 16-毛细管阵列，3500-Thermo Scientific DNA分析仪3500(序列号：21106-yyy)配有50cm八毛细管阵列，3730-ABI DNA遗传分析仪3730(序列号：18124-yyy)配有50cm 48-毛细管阵列。所有测量都是用POP7进行的。

图18-用不同的电场强度测量，并与碱基对大小标准品(A)或芘荧光染料(23)标记的碳水化合物标准品(B)对齐的APTS标记的柠檬酸盐血浆衍生物的N-聚糖指纹图谱重叠。测量是用配备有填充glyXpop_fast的50cm毛细管阵列的ABI DNA遗传分析仪进行的，其场强为300V/cm(“…”曲线，15kV)、200V/cm(“---”曲线，10kV)或100V/cm(“–”曲线，5kV)。

图19-在不同运行温度下测量，并与碱基对大小标准品(A)或芘荧光染料(23)标记的碳水化合物标准品(B)对齐的APTS标记的柠檬酸盐血浆衍生物的N-聚糖指纹图谱重叠。测量是用配备有POP7填充的50cm毛细管阵列的ABI DNA遗传分析仪进行的，运行温度为45℃(“…”曲线)、30℃(“---”曲线)或18℃(“–”曲线)。

图20-用不同的毛细管阵列长度测量，并与碱基对大小标准品(A)或芘荧光染料(23)标记的碳水化合物标准品(B)对齐的APTS标记的柠檬酸盐血浆衍生物的N-聚糖指纹图谱重叠。测量是用配备有POP7填充的50cm毛细管阵列(“…”曲线)、36cm毛细管阵列“---”曲线)、或22cm毛细管阵列(“–”曲线)的ABI DNA遗传分析仪进行的。

图21-用不同的分离聚合物测量的APTS标记的柠檬酸盐血浆衍生物的N-聚糖指纹图谱重叠。未比对的电泳图以分钟表示(A)，与碱基对大小标准品对齐的指纹图谱以碱基对表示(B)，与芘荧光染料(23)标记的碳水化合物标准品对齐的指纹图谱以寡糖单位表示(C)。测量是用ABI DNA遗传分析仪进行的，该分析仪配备有50cm的毛细管阵列，并填充有POP7(Thermo Scientific；黑色曲线)、nanoPOP7(MCLAB；灰色曲线)，nimaPOP7(Nimagen；浅灰色曲线)，POP6((Thermo Scientific；黑色“---”曲线)，或glyXpop_fast(glyXera GmbH的实验聚合物；黑色“…”曲线)。

图22-与芘荧光染料(23)标记的碳水化合物标准品对齐的APTS标记的人IgG衍生的N-聚糖指纹图谱的重叠。测量是用配备有50cm毛细管阵列并填充有POP7聚合物的ABIDNA遗传分析仪进行的。测量是用时长D1-D52(计算POP7聚合物在室温下、在仪器内的天数)的聚合物通过再注射相同的样品来进行的。

图23DNA测序中使用的染料的发射光谱(显示了几个可能的组中的一个)，以及相应的虚拟滤光器组。5-FAM：5’-羧基荧光素；JOE：2，7二甲氧基-3，4-二氯荧光素6’-羧基异构体；NED是比TMR(结构未知)更亮的染料；它分别在546nm和575nm处具有吸收和发射最大值。ROX是具有两个久洛尼定片段并入呫吨荧光团中(和5’-或6’-羧基)的罗丹明。在荧光测序过程中，这些(或类似的)染料提供了四种颜色的迹线；例如，蓝色代表胞嘧啶，绿色代表腺嘌呤，红色代表胸腺嘧啶，黄色代表鸟嘌呤。

图24A显示了磷酸化氨基吖啶酮染料6-H和6-Me在三乙胺-碳酸氢盐缓冲液水溶液(pH 8)中的归一化吸收和发射光谱。

图24B显示了三磷酸化氨基芘染料8-H和15在三乙胺-碳酸氢盐缓冲液水溶液(pH8)中的归一化吸收和发射光谱。

图25示出了两种染料的电泳图的概述：三磷酸化氨基芘8-H和APTS，具有APTS标记的麦芽糖阶梯(背景)。虽然8-H的m/z比(144)低于APTS(151)，但8-H的保留时间高于APTS的保留时间。在APTS中，带电基团(磺酸残基)直接附着在荧光团上。在8-H中N-甲基-N-(2-羟乙基)接头的存在增加了染料的流体动力学比率，这解释了游离染料8-H具有更高保留时间。

图26显示了8-H和APTS的放大的峰。该图是通过标准DNA测序仪的颜色校准获得的。“传统”滤光器组有五种颜色通道：522nm(荧光素、APTS)、554nm(如VIC染料或罗丹明6G)、575nm(如NED染料或TMR)、595nm(如PET染料或ROX)和650nm(LIZ染料作为附加的“第五种”颜色)。由于与APTS颜色通道的强串扰(如图上部所示)，染料8-H(可能是其与聚糖的缀合物)不能与APTS一起用于任何分析测定。三磷酸化芘染料15也是如此(比较图24B所示的8-H和15的发射光谱)。因此，需要对DNA测序仪进行新的颜色校准，以减少或尽可能完全消除APTS与三磷酸化芘染料8-H和15引起的发射通道之间的串扰。

图27显示了光谱校准前从麦芽三糖和染料15(15^a)获得的还原胺化产物的电泳图。

图28显示了光谱校准后从麦芽三糖和染料15获得的还原胺化产物的相同电泳图(图27)。

图29A和B显示了从碳水化合物“葡聚糖1000”(29A)和“葡聚糖5000阶梯”(29B)与染料15的混合物获得的缀合物的电泳图；“1000”和“5000”对应于葡聚糖低聚物的平均分子量。峰之间的时间差为约1分钟。在APTS的情况中，峰之间的时间差为约2.3分钟(参见图25“---”曲线)；葡萄糖单位的添加导致与麦芽糖单位大致相同的迁移时间的增加)。峰之间的时间差越小越有利(线性对齐曲线拟合的支撑点越多)。

图30A和B显示了光谱校准前从麦芽三糖与染料6-H和6-Me获得的缀合物(还原胺化产物)的电泳图。对于6-H和6-Me这两种染料，APTS通道(522nm)和“595nm通道”(也适用于6-H和6-Me)之间的串扰相当小；小于染料15的情况(图27)。对于染料6-H，串扰为约7.8％，对于染料6-Me为约3.4％。然而，即使是标准品通道和观察通道之间的小串扰也是禁止的，因为它可能导致(不存在的分析物的)假阳性鉴别。

图31A和B显示了光谱校准后从“葡聚糖1000”和“葡聚糖5000”阶梯与染料6-Me获得的缀合物的电泳图。光谱校准基于使用与麦芽三糖缀合的6-H和6-Me染料(分别参见图2和图4)。它们的光谱性质和它们的缀合物的性质非常相似。APTS颜色通道(522nm)和“新型”575nm通道之间没有任何串扰。

具体实施方式

一般材料和方法

碳水化合物的还原胺化

对于使用本发明化合物的碳水化合物的还原胺化，例如，使用Hennig R，Rapp E等人在2015年的Methods Molecular Biology中公布的用8-氨基芘-1，3，6-三磺酸三钠盐(APTS)和还原剂荧光标记N-聚糖的现有技术方案，并在使用中进行了小的修改。

最初的方案需要中等强酸(如柠檬酸一水合物；CA)和溶剂——二甲基亚砜(DMSO)、乙腈(ACN)和水(H₂O)。主要步骤包括在1.2-3.6M的CA水溶液中制备10-80mM的染料溶液(溶液A)和在DMSO中制备硼烷基还原剂溶液(溶液B)。然后，需要混合三种等体积(1-4μL)的溶液A、B和样品(游离碳水化合物或释放后的糖缀合物的碳水化合物部分)，并在37℃孵育3-16h。还原胺化完成后，加入ACN-水混合物(80：20，v/v)。例如，如果使用2μL溶液A、2μL溶液B和2μL分析物样品，则加入50μL ACN水溶液并混合。该操作提供了澄清的溶液，其可以进行基于动电学和/或色谱分离的糖分析。

酰肼标记

使用本发明的化合物，酰肼标记在60℃-80℃、pH 6-8下进行1-6小时。将10-80mM染料溶液与样品等体积混合(1-4μL)。反应完成后，加入50微升ACN-水混合物(80∶20，v/v)。标记混合物的稀释物进行基于动电学和/或色谱分离的糖分析。

反应性氨基甲酸酯化学

用本发明的化合物在室温下在微碱性pH下进行二琥珀酰亚胺碳酸酯或NHS酯辅助的糖基胺标记10-60min。样品通过Hennig R，Rapp E等人在2015公布的HILIC-SPE纯化。纯化的样品进行基于动电学和/或色谱分离的糖分析。

实施例1-选择的具有大量负净电荷和所需光谱特性的荧光染料(还可参见方案13和表1)

具有结构20的多个可离子化基团的发射红光的罗丹明染料通过相应的羟基取代的罗丹明前体的磷酸化获得，并类似于化合物19(另一种磷酸化的罗丹明染料，参见上面的方案6和11)分离，该化合物先前由K.Kolmakov等人在Chem Eur.J.2012，18，12986-12998中描述(参见其中化合物7-H的性质和磷酸化细节)。化合物20的羟基取代的前体是根据K.Kolmakov等人(Chem Eur.Journal.2013，20，146-157；参见其中的化合物Et-14)合成的。磷酸化后，通过常规程序皂化乙酯基团，如上所述。

化合物20的纯度和同一性由以下分析数据证实：¹H NMR(400MHz DMSO-d₆)：δ＝1.23(s，6H，CH₃)，1.28(s，6H，CH₃)，2.62(s，6H，NCH₃)，4.21(m，4H，2CH₂)，5.70(s，2H)，6.76(s，2H)，7.16-7.30(br.m，4H)，8.55(m，1H)，8.36(m，1H)ppm。¹³C NMR(101MHz，DMSO-d₆)：δ＝29.1(CH₃)，34.2(CH₃)，95.8(CH₂)，118.2(CH)，121.7(C)122.6(C)，125.5(CH)，127.3(CH)，127.4(CH)，128.0(CH)，129.8(CH)，133.9(C)，136，8(C)，155.0(CO)，157.0(CO)ppm。

¹H NMR(400MHz，CD₃OD，20为Et₃N-盐)：δ＝1.12(t，J＝7Hz，9H，CH₃ CH₂)，1，25(t，J＝7Hz，27H，CH₃ CH₂)，1.52(s，6H，CH₃)，1.53(s，6H，CH₃)，3.11，3.31(m，24H，CH₃ CH₂ )，3.18(s，6H，NCH₃)，3.61(m，2H，CH₂)，4.45(m，2H，CH₂)，6.03(s，2H)，6.8(s，2H)，6.9(s，2H)，7.28(d，J＝8Hz，1H)，8.16(d，J＝8Hz，1H)，8.66(m，1H)ppm。³¹P NMR(161.9MHz)：δ＝-0，2(DMSO-d₆)和0，63(CD₃OD)ppm(s，OP(O)(OH)₂))。

HPLC：t_R＝3.9min(Kinetex EVO C-18柱，0，02M aq.Et3N(A)及3％MeCN(B)，等度流速0.5mL/min，检测波长254nm)。TLC：R_f＝0，25(硅胶板，MeCN/H₂O 5：1+0.2％Et₃N)。HR-MS(ESI)：C₃₅H₃₅N₂O₁₃P₂ ^-([M-H]^-)计算值753.1614，真实值(found)753.1672。UV-VIS(PBS缓冲液，pH＝7.4)λ_max.abs.＝582nm,λ_max.fl.＝609nm。

实施例2-多波长荧光检测系统对本文所述的一组四种基于吖啶酮和芘的荧光染料的光谱校准

对于当前的示例，该程序示例性地示出了改良的商品化DNA遗传分析仪310、3100、3130(xl)、3730(xl)和3500(均由Applied Biosystems制造，现为Thermo Scientific)。但是，根据检测模式，这里介绍的再校准对于其他制造商的仪器也是可能的。使用的商品化遗传分析仪包含一个带有激光诱导荧光检测(LIF)的多重毛细管凝胶电泳(xCGE)单元，该单元可以(根据仪器和操作软件)在不同的染料通道中同时检测多达六种不同的荧光信号。

根据制造商的说法，仪器的虚拟滤光器可以按照各种预定义的染料组进行校准，如F、D(两者都有：四个检测窗口)或G5(五个检测窗口)。作为寡糖分析的默认光谱校准，使用预定义的染料组G5[EP 2112506 B1，Ruhaak 2010，Reusch 2015，Feng 2017]。G5按照包含染料6-Fam^TM(在522nm染料迹线内记录)、

(554nm)、NED^TM(575nm)、

(595nm)和

(655nm)的DS-33基质标准品进行校准。通过这种校准，APTS标记的寡糖在6-Fam^TM染料迹线(522nm)内记录，而比对标准品GeneScan 500LIZ^TM在

染料迹线(655nm)内记录。不幸的是，使用G5光谱校准，APTS在所有其他染料迹线中都产生信号，如图2A所示，16.3min时APTS标记的麦芽四糖。这种大的串扰是由APTS和6-Fam^TM的不同光谱特性引起的。为了能够在不影响来自APTS的串扰信号的情况下执行迁移时间比对，使用了GeneScan 500LIZ^TM(LIZ500)，因为LIZ在尽可能远离APTS通道发射光的染料迹线内记录。

为了能够使用不同于LIZ500的对齐标准品并减少光谱串扰，xCGE-LIF仪器被示例性地用于校准一组四种染料，包括APTS和本发明的三种新染料。在光谱校准之前，所有的荧光染料(分别是它们的寡糖衍生物)在多个染料迹线/通道中显示出荧光信号(图2A)。特别是，6-H标记的碳水化合物显示出与所有染料通道的大光谱串扰，如图2A中的麦芽三糖和图3A中的麦芽糖阶梯所示。因此，由于内部对齐标准品的使用要求APTS通道(522nm)内完全没有来自其他染料的荧光信号，因此，如果没有仪器的先前光谱校准，使用例如6-H标记的麦芽糖阶梯作为内部对齐标准品是不可能的。xCGE-LIF仪器对19，20，6-H标记的麦芽三糖(6-H^a)和APTS标记的麦芽四糖(APTS^a)的光谱校准可以完全消除光谱串扰(参见图2B&3B)。

在xCGE-LIF仪器的光谱校准之后，6-H标记的麦芽糖阶梯可以用于APTS标记的碳水化合物的内部对齐。因此，6-H标记的麦芽糖梯与APTS标记的碳水化合物共同注射，检测与APTS标记的碳水化合物相同的样品背景。作为副作用，更好的拟合光谱校准导致6-H标记阶梯的信号强度增加(图3)。6-H麦芽糖峰在13.2分钟的信号强度增加了1.5倍(从约2000RFU至约3000RFU)。在16.3分钟时，在图2的峰IV中可以观察到对APTS^a的相同影响。

如表2所示，多波长系统对一组四种荧光染料的光谱校准可能会使本发明的染料有很大的变化。

表2：多波长系统对一组四种染料的光谱校准。

示例性地示出了3100、3130、3130xL、3730、3730xL、3500和3500xL仪器用于四种染料光谱校准的可能性。对于光谱校准，每条迹线需要使用一种荧光染料，无需加倍。例如，为了分析APTS标记的样品，将522nm的光谱迹线用于校准一种APTS标记的碳水化合物(APTS^z)。同时将560nm的光谱迹线用于校准下列染料的其中一个：6-H、6-Me、6-H^z、6-Me^z、8-H、8-H^z、15、15^z、23、23^z；光谱迹线575nm用于20，6-H，6-Me，6-H^z或6-Me^z，光谱迹线607nm用于19或20。一种可能的光谱校准是APTS^z，15^z，6-Me^z和19。这些光谱校准能够分析多达三个样品(APTS-、15-和6-Me-标记的，在光谱迹线522nm、560nm和575nm)以及基于碱基对的内部比对标准品(在光谱迹线607nm)。

指数z＝荧光染料-碳水化合物衍生物→例如APTS^z可以是APTS标记的麦芽四糖(参见图2)，或者15^z可以是15标记的麦芽三糖(用于图4)。但^z可以是任何其他碳水化合物，如O-聚糖、N-聚糖、乳寡糖、由戊糖和/或己糖构建的均聚物(如麦芽糖、淀粉、纤维素、葡聚糖)或杂聚物(如半纤维素、阿拉伯木聚糖、糖胺聚糖)。

实施例3-多波长荧光检测系统对本文所述的一组五种基于吖啶酮和芘的荧光染料的光谱校准

对于当前的示例，该过程示例性地示出了改良的商品化DNA遗传分析仪310、3100、3130(x1)、3730(x1)和3500(均由Applied Biosystems制造，现为Thermo Scientific)。但是，根据检测模式，这里介绍的再校准对于其他制造商的仪器也是可能的。使用的商品化遗传分析仪包含一个带有激光诱导荧光检测(LIF)的多重毛细管凝胶电泳(xCGE)单元，该单元可以(根据仪器和操作软件)在不同的染料通道中同时检测多达六种不同的荧光信号。

这些仪器的虚拟滤光器可以按照各种预定义的染料组进行校准，如E5、G5或D。因此，染料组E5和G5为五种不同的荧光染料定义了五个检测窗口，而染料组D为四种不同的荧光染料定义了四个检测窗口。对于寡糖的分析，使用预定义的染料组G5，按照包含染料6-Fam^TM(在522nm染料轨迹内记录)、

(在554nm)、NED^TM(在575nm)、

(在595nm)和

(在655nm)的DS-33基质标准品进行校准[EP 2112506 B1，Ruhaak 2010，Reusch2015，Feng 2017]，随后，由APTS标记的寡糖发出的光在522nm的染料迹线(Fam^TM染料迹线)内记录，由对齐标准品GeneScan 500LIZ^TM(LIZ 500)发出的光在655nm的染料迹线内记录。由于该仪器没有针对APTS染料进行专门校准，APTS标记的寡糖发射的光进入几个染料迹线，如图4A所示，在16.3min的峰V为APTS标记的麦芽四糖。由于两种染料迹线之间没有光谱串扰对于正确分析至关重要，因此需要降低这种大的串扰。此外，为了使用标记有本发明荧光染料如15、6-H、6-Me、8-H或23的基于寡糖的对齐标准品，需要针对这些染料定制光谱校准。

示例性地，对一组五种染料进行了xCGE-LIF仪器的光谱校准，如图4所示。在光谱再校准之前(对APTS和本发明的四种新染料，分别是它们的寡糖衍生物)，对于所有使用的荧光染料，可以观察到多个染料迹线/通道中的大串扰(图4A)。特别是，15标记的碳水化合物(峰I)以及6-Me标记的碳水化合物(峰IV)在所有其他染料迹线中显示出很大的光谱串扰，如图4A、6A和7A所示。由于内部对齐标准品的使用要求在APTS通道(522nm)内完全没有其荧光信号，因此有必要对仪器进行光谱校准。在对19、15-标记的麦芽三糖(15^a)、20、6-Me标记的麦芽三糖(6-Me^a)和APTS标记的麦芽四糖(APTS^a)进行光谱校准后，光谱串扰可以完全消除，如图4B、5B、6B和7B所示。

此外，对染料衍生物15^a和6-Me^a的光谱校准使得能够同时使用两种不同的基于碳水化合物的标准品来比较对齐性能，如图8所示。迹线522nm(APTS)、554nm(15)和575nm迹线(6-Me)之间的串扰完全不存在。

如表3所示，多波长系统对一组五种荧光染料的光谱校准可能导致本发明染料的大的变化。

表3：多波长系统对一组五种染料的光谱校准。

示例性地示出了3100、3130、3130xL、3730、3730xL、3500和3500xL仪器用于五种染料光谱校准的可能性。对于光谱校准，每条迹线需要使用一种荧光染料，无需加倍。例如，为了分析APTS标记的样品，将522nm的光谱轨迹用于校准APTS标记的碳水化合物(APTS^z)。同时将554nm的光谱迹线用于校准下列染料的其中一个：8-H、8-H^z、15、15^z、23或23^z；光谱迹线575nm用于6-H、6-Me、6-H^z或6-Me^z，光谱迹线595nm用于20，光谱迹线655nm用于19。例如，对APTS^z、23^z，6-Me^z、20和19进行光谱校准，可以分析两个样品(APTS-和23-标记的，在光谱迹线522nm和554nm)以及基于碳水化合物的比对标准品(6-Me-标记的，在光谱迹线575nm)和/或基于碱基对的内部对齐标准品(在光谱迹线655nm)。

指数z＝荧光染料-碳水化合物衍生物→例如APTS^z可以是APTS标记的麦芽四糖(参见图2)，或者15^z可以是15标记的麦芽三糖(参见图4)。但^z可以是任何其他碳水化合物，如O-聚糖、N-聚糖、乳寡糖、由戊糖和/或己糖构建的均聚物(如麦芽糖、淀粉、纤维素、葡聚糖)或杂聚物(如半纤维素、阿拉伯木聚糖、糖胺聚糖)。

实施例4-利用根据本发明的吖啶酮荧光染料衍生物进行内部迁移时间对齐

当前的示例包括使用改良的商品化DNA遗传分析仪310、3100、3130(xl)、3730(xl)和3500(均由Applied Biosystems制造，现为Thermo Scientific)。然而，本文提出的基于碳水化合物的校准对齐标准品也可以与其他制造商的(单一或多重毛细管)CE/CGE仪器或(U)HPLC仪器结合使用。一般来说，DNA片段大小的迁移时间对齐(如在基因组学中用于短串联重复序列(STR)或限制性片段长度多态性(RFLP)分析)以及CE/CGE和xCGE中碳水化合物的迁移时间对齐目前是通过使用碱基对大小标准品来实现的，如图9A中示例性示出的(EP2112506 A1)。为此，未知样品的迁移时间与共注射的碱基对大小标准品比对。对于寡核苷酸(DNA/RNA)，这种与共注射碱基对标准品的内部迁移时间对齐的特点是可再现性高，因为样品背景以同样的方式影响未知样品和标准品的迁移时间。样品和标准品用不同的荧光染料进行标记，从而实现两者的波长分辨同时检测。

虽然未知DNA片段与基于DNA的碱基对大小标准品的长期比对质量非常好，但寡糖与碱基对大小标准品的长期比对质量却没有那么好。碳水化合物与碱基对大小标准品的对齐迁移时间显示了不同聚合物批次在较长时间内的一些波动(参见图10A)。为了提高对齐质量，引入了额外的(第二)正交对步骤，使用增加的交叉(bracketing)碳水化合物标准品(US2009/028895A1)，如图10B所示。

然而，第二个(正交)比对步骤也对碳水化合物的这种长期波动进行了补偿，但不完全。长期对齐能力较差的原因是碱基对标准品和标记碳水化合物的物理化学性质不同。例如，一个360个碱基对长的片段(图9A中的峰10)包含360个带360个负电荷的核苷酸(脱氧核糖+磷酸+含氮碱基)，一个具有相似迁移时间的荧光标记的碳水化合物峰(图10A中360个碱基对处的峰)仅包含10个带大约三个负电荷的(单)糖。因此，相对低电荷的小分子是与高电荷的大分子比对。由于它们相似的质荷比，对齐是可能的。但是改变测量条件会对两种分子产生不同的影响。因此，在碱基对对齐后碳水化合物的迁移时间在长期内是可变的，如图10A所示。

本发明能够使用基于碳水化合物的标准品混合物来对齐碳水化合物的迁移时间。开发了一整套新型荧光染料来标记寡糖样品和/或这些碳水化合物标准品/混合物。新开发的荧光染料与用于标记未知样品的荧光染料具有不同的光谱特性。这使得荧光标记的样品与荧光标记的碳水化合物对齐标准品能够共同注射，并同时检测不同染料/波长迹线中的两种分析物，如图8所示。与碱基对大小标准品相比，新的基于碳水化合物的标准品包含与样品接近/一致的物理化学性质。除了相似的质荷比之外，基于碳水化合物的大小标准品与样品中的碳水化合物相比，具有相似的绝对电荷和质量。与图11B相比，如图11A所示的，这极大地提高了迁移时间对齐的长期可再现性。

对于此处给出的示例，如Hennig等人2016中所述，使用本文描述的染料通过xCGE-LIF分析人柠檬酸盐血浆N-聚糖。简而言之，柠檬酸盐血浆蛋白被变性和线性化。N-聚糖由肽N-糖苷酶F(PNGase F)促释放，并用8-氨基芘-1，3，6-三磺酸(APTS)标记。HILIC-SPE纯化后，使用Applied

遗传分析仪，通过带有激光诱导荧光检测的多重毛细管凝胶电泳(xCGE-LIF)分析APTS标记的N-聚糖。关于内部迁移时间比对，APTS标记的样品与6-Me标记的基于碳水化合物的对齐标准品(6-Me^b)共同注射，见图11A，或与GeneScan^TM500LIZ^TM染料大小标准品(LIZ500)共同注射，见图11B。

如实施例3所述，仪器对15^a、19、20、6-Me^a和APTS^a进行光谱校准。APTS样品在522nm染料迹线处记录，6-Me^b在575nm染料迹线处记录，LIZ500在655nm迹线处记录。对于LIZ500的迁移时间对齐，选取了13个标准峰，如图9A所示。迁移时间对齐使用了二阶校准曲线，如图12A所示(EP 2112506 A1)。为了改善迁移时间对齐(US 2009/028895 A1)，选取了四个额外的增加的(spiked-in)交叉(bracketing)碳水化合物标准品峰，并调整了二阶校准曲线，如图12B所示。对于仅与6-Me^b的迁移时间比对，选取了16个标准品峰，如图9B所示。二阶校准曲线计算如图12C所示进行计算，并用于对齐。

如US 8，293，084所述，通过对LIZ500对齐进行正交调整，可以改善迁移时间对qi(见图12B)。这种改善可以通过仅使用基于碳水化合物的大小标准品6-Me^b进一步增强，如图12C所示。其优异的长期再现性如图11所示。虽然根据聚合物批次和测量日期，与LIZ500对齐的柠檬酸盐血浆N-聚糖显示出不同的迁移时间，但与6-Me^b的对齐仅显示出几乎完美的重叠。为了更详细地评价这一点，选取了对齐电泳图的15个最大峰(如图10B和11B所示)，并计算了它们的均方根误差(RMSE)，如表4所示。而正交第二对齐(正交双对齐)可以将RMSE降低4倍(3.151％至0.727％)，仅与6-Me^b对齐可将RMSE降低近10倍(3.151％至0.359％)。这意味着仅使用6-Me^b进行迁移时间对齐，变化减少了10倍，精密度提高了10倍。对于单电荷的N-聚糖，可以得到最小的RMSE，为0.236％。并且，双电荷和中性N-聚糖分别显示出0.391％和0.357％的RMSD，与单电荷聚糖非常接近。因此，基于(仅)吖啶酮染料标记的碳水化合物的对齐标准品，如6-Me^b，用于中性和低电荷寡糖(它们可以在例如5种人类蛋白质(如IgG)或重组产生的单克隆抗体(mAb)上找到[Reusch 2015])的可再现性最好，但它们也适用于高电荷寡糖。由于迁移时间的这种高精密度和稳健性，独立于聚合物的使用时间(age)和批次，根据本发明的方法被显著改进，更广泛地适用，并且通过迁移时间匹配建立和使用相应的峰注释的数据库是可能的，而不需要如专利US 2009/028895 A1所述的额外的正交对齐步骤。

表4：比较对齐精密度，以用于N-聚糖与碱基对阶梯LIZ500对齐、与通过额外的交叉(bracketing)碳水化合物再对齐改进的LIZ500碱基对阶梯对齐、以及与仅吖啶酮染料标记的碳水化合物标准品(6-Me^b)对齐。对于图10所示的样品，计算柠檬酸盐血浆N-聚糖的均方根误差(RMSD)。图10B中描绘了15个挑选出的峰。N-聚糖基团包含峰：10-15表示中性，9-7表示单电荷，2-6表示双电荷，峰1表示三电荷(关于聚糖峰的详细注释，见Hennig等人，2016)。在用于LIZ 500对齐的碱基对中，用于LIZ500+交叉碳水化合物(寡糖)再对齐的迁移时间单元中以及仅6-Me^b对齐以碳水化合物(寡糖)单元中，给出绝对RMSD。

实施例5-利用根据本发明的芘荧光染料衍生物进行内部迁移时间对齐

目前，通过使用碱基对大小标准品(EP 2112506 A1)，实现了在CE/CGE和xCGE中DNA片段大小以及碳水化合物的迁移时间对齐，如图13A中示例性所示。为此，将未知样品的迁移时间与共同注射的碱基对大小标准品进行对齐。对于寡核苷酸(DNA/RNA)，这种与共注射碱基对标准品的迁移时间对齐的特点是可再现性高，因为相同样品背景以相同的方式影响样品和标准品的迁移时间。样品和标准品用不同的荧光染料进行标记，从而实现两者的波长分辨同时检测。

虽然未知DNA片段与基于DNA的碱基对大小标准品的长期比对质量非常好，但碳水化合物与碱基对大小标准品的长期比对质量却没有那么好。寡糖与碱基对大小标准品的比对迁移时间显示了不同聚合物批次在几天内的一些波动(见图14A)。为了提高对齐质量，需要基于碳水化合物的对齐标准品。因此，开发了一整套用于碳水化合物标记的新型荧光染料。这些新开发的荧光染料包含不同于APTS(用于样品标记)和LIZ(ROX标记碱基对大小标准品)的光谱特性。仪器对15^a、19、20、6-Me^a和APTS^a的光谱校准(如实施例3所述)允许同时检测共同注射的标记碳水化合物样品、15标记的基于碳水化合物的对齐标准品(15^b)和LIZ500碱基对标准品，如图15所示。当APTS标记的样品在522nm记录时，15-标记的碳水化合物标准品和LIZ500碱基对标准品分别在554nm和655nm同时记录。因此，内部标准品LIZ500和15^b均可用于迁移时间对齐，并可直接相互比较。为了与LIZ500的对齐，选取了13个标准品峰，如图13A所示。为了与15^b的迁移时间对齐，选取了22个峰(见图13B)，覆盖了作为LIZ500标准品的相似的迁移时间范围。如图16所示，对选取的峰进行第二阶多项式拟合。通过使用15标记的碳水化合物标准品，迁移时间对齐显著改善，如图14B&C所示。与基于碱基对的大小标准品相比，新型基于碳水化合物的大小标准品包含与样品相同的物理化学性质。除了相似的质荷比之外，基于碳水化合物的大小标准品具有相似的绝对电荷和相似的绝对质量。因此，使用基于碳水化合物的标准品(如15^b)使得碳水化合物(如N-聚糖、O-聚糖、糖脂、人乳寡糖、糖胺聚糖和具有还原性末端和/或糖基胺末端的其他寡糖)的迁移时间对齐更加精确和可再现。

在与基于碳水化合物的大小标准品15^b对齐后，可获得改善的长期再现性，如图14C所示。当与基于碱基对的LIZ500标准品的对齐(图14A)时显示了所有峰不同的迁移时间，根据聚合物批次和测量日期，与基于碱基对的LIZ500标准品+15^b的对齐显示出改善的对齐(图14B)。最佳结果可以通过与15^b对齐来达到，显示出几乎完美的重叠(图14C)。为了进行更详细的评价，在所有样品中选取了15个最大的峰，如图14C所示。在所有测量中，这15个峰的均方根误差(RMSE)的计算如表5所示。比较两种对齐，15^b对齐的RMSE值(平均值的百分比)为0.627％，比LIZ500对齐后的3.151％的RMSE值小五倍。三电荷的N-聚糖的最小RMSE值为0.236％，表明15^b对齐对高电荷寡糖(它们可以在例如人类或重组产生的促红细胞生成素(rhEPO)上找到(Meininger，2016))产生最高的再现性，但它们也适用于低电荷和/或中性寡糖。因此，通过15^b对齐提高了迁移时间的精密度和稳健性，与聚合物的使用时间(age)和批次无关，允许通过迁移时间匹配建立和使用寡糖数据库用于峰注释，而不需要如US 2009/028895 A1中所进行的额外对齐。

因此，根据本发明的方法具有高精密度和稳健性的迁移时间，可以明显更广泛地适用，与聚合物使用时间(age)无关。

这种改进的对齐程序也可以通过使用其他5种寡糖阶梯，如几丁质、纤维素、麦芽糖、支链淀粉、糖胺聚糖，以及通过使用复杂的碳水化合物，如糖脂、O-聚糖、N-聚糖和乳寡糖(例如乳糖、乳-N-四糖、乳-N-六糖及其岩藻糖和/或乳糖延伸物)来进行。

表5：N-聚糖与碱基对阶梯LIZ500对齐(LIZ 500对比)、与通过额外碳水化合物再对齐改善的碱基对阶梯(LIZ 500+15^b比对)、和与仅芘染料(15)标记的碳水化合物标准品(15^b)比对的比对精密度比较。对于图12所示的样品，计算柠檬酸盐血浆N-聚糖的均方根误差(RMSD)。图12C描绘了15个挑选出的峰。N-聚糖基团包含峰：10-15表示中性，9-7表示单电荷，2-6表示双电荷，峰1表示三电荷(聚糖峰的详细注释见Hennig等人，2016)。给出了绝对RMSD，对于LIZ 500比对以碱基对形式，或者对于LIZ500+15^b和仅15^b对齐，以碳水化合物(寡糖)为单位。

对于本实施例，如Hennig等人2016中所述，使用本文所述的染料通过xCGE-LIF分析人柠檬酸盐血浆N-聚糖。简而言之，柠檬酸盐血浆蛋白被变性和线性化。N-聚糖由肽N-糖苷酶F(PNGase F)促释放，并用8-氨基芘-1，3，6-三磺酸(APTS)标记。HILIC-SPE纯化后，使用Applied

遗传分析仪，通过带有激光诱导荧光检测的多重毛细管凝胶电泳(xCGE-LIF)分析APTS标记的N-聚糖。如实施例3所述，仪器对15^a、19、20、6-Me^a和APTS^a进行光谱校准。

实施例6-芘和/或吖啶酮标记碳水化合物作为通用对齐标准品

当前的实施例包括使用改良的商品化DNA遗传分析仪310、3100、3130(xl)、3730(xl)和3500(均由Applied Biosystems制造，现为Thermo Scientific)。然而，这里提出的基于碳水化合物的对齐标准品也可以与其他制造商的CE/CGE和(U)HPLC(单毛细管或多毛细管)结合使用。

一般来说，DNA片段和碳水化合物在(x)CE/(x)CGE中的迁移时间对齐目前是通过使用碱基对大小标准品来实现的(EP 2112506 A1)。为此，未知样品的迁移时间与共注射碱基对大小标准品对齐。当基于碱基对大小标准品的对齐时显示了出良好的结果，但碳水化合物样品的对齐显示出很大的差异，如实施例2和3所示。当使用不同的，这种变化更加明显：

·仪器(图17和表6)

·实验设置，如场强(图18)或运行温度(图19)

·仪器参数，如毛细管长度(图20)、聚合物类型(图21)、聚合物使用时间(图22和表6)和聚合物批次(表6)

在这个压力测试中，这些参数被修改，并比较对齐程序(碱基对与碳水化合物标准品)。对于所有的例子，碳水化合物对齐程序显示出优异的性能。对于大多数变化，可以达到稳定的迁移时间，如在不同毛细管长度的示例中所示。这意味着通过使用碳水化合物对齐程序，可以使用全面的碳水化合物数据库，即使实验设置、仪器参数或仪器是改变的也是如此。这对于基于碱基对的对齐标准品是不可能的。

表6：比较对齐精密度，以为N-聚糖与碱基对阶梯LIZ500对齐(LIZ500对齐)、与通过额外的交叉(b)碳水化合物(寡糖(OS))再对齐改进的LIZ500碱基对阶梯对齐(LIZ500+bOS(＝交叉寡糖)对齐)、以及与通过额外的吖啶酮染料(23)标记的碳水化合物标准品(23^c)改进的LIZ500碱基对阶梯对齐(LIZ500+23^c对齐)和仅吖啶酮染料(23)标记的碳水化合物标准品(23^c)对齐(仅23^c对齐)的。如图12C所示，计算了15个挑选出的峰的柠檬酸盐血浆N-聚糖的均方根误差(RMSD)。N-聚糖基团包含峰：10-15表示中性，9-7表示单电荷，2-6表示双电荷，峰1表示三电荷(关于聚糖峰的详细注释，见Hennig等人，2016)。在用于LIZ500对齐的碱基对中、在用于LIZ500+交叉碳水化合物再对齐的迁移时间单元中、在用于LIZ500+23^c和仅23^c唯一对齐的碳水化合物单元中、给出绝对RMSD。为了进行仪器对比，使用了图15的数据(6种不同的仪器)。为了进行聚合物批次对齐，在3130×l 1内使用四个不同的POP7聚合物批次(批次：1612560、1701565、1703117和1705571)测量柠檬酸盐血浆N-聚糖。为了进行聚合物老化对比，在3130xl_1内用新鲜聚合物(批号：1708574)、新鲜打开的一年旧聚合物(批号：1411512)、打开一年的旧聚合物(批号：1411512)和打开五年的聚合物(批号：1208456)测量柠檬酸盐血浆N-聚糖。根据所有比较案例，可以将RMSD值减少5倍(10.697至2.172)，最多减少7倍(2.246至0.334)。

实施例7-使用根据本发明的新型荧光吖啶酮和芘染料组对DNA测序仪进行再校准

商品化毛细管电泳系统可能有一个多波长检测器，因此有几个颜色通道。

在这些系统中有所谓的“虚拟滤光器”，其中软件定义了特定的波长区域，用于收集来自不同染料的荧光发射。

这些区域称为虚拟滤光器。它们中的每一个都与仅由一种染料发射的相对窄的可见光范围相关联(图23)。来自DNA测序仪的主要数据集有4种颜色迹线(图23)，对应于4种核苷酸。事实上，可以有任何数量的虚拟滤光器，因为滤光器只是一个简单的CCD阵列上软件指定的位置。由于染料的发射谱总是相当宽，它的一部分由虚拟滤光器记录，而不是由准备收集其最大发射的滤光器记录。每组中的染料以它们具有宽间隔的发射最大值的方式选择，以将CCD阵列上发射谱的重叠最小化。然而，光谱重叠仍然在一定程度上发生，并且总是存在一定的串扰。另一方面，DNA序列的每个位置只有四种核苷酸中的一种，在测序过程中，每种核苷酸都在其“自己的”颜色通道中被检测到。因此，串扰的问题对于DNA测序来说远不如对于聚糖分析重要，因为DNA测序的四个泳道包含强度相似的峰，并且只有一个颜色迹线在某个位置具有突出的峰。

重要的是，APTS染料及其与聚糖的缀合物的发射总是出现在波长最短的通道中，并且与参考通道没有串扰，这是至关重要的。用APTS标记后，复合聚糖混合物的电泳图包含强度在数量级上变化的峰。因此，APTS通道中的荧光信号必须完全没有来自参考通道的发射“泄漏”的影响。参考样品包含用另一种荧光染料标记的混合物，并与分析样品同时注射。观察通道(APTS染料或其替代物)和参考通道之间“完全”没有串扰的要求似乎很容易满足，但事实并非如此，因为两种染料必须用相同的光源激发，并且让它们的发射光谱重叠。到目前为止，在655nm的观察通道中，LIZ染料(附着在“DNA阶梯”上，用作聚糖分析中的内部对齐标准品)被用作额外的颜色。为了检测LIZ染料，在ABI 3100DNA测序仪(ABI用户手册)中使用了虚拟滤光器组G5(包括6-Fam^TM、

NED^TM、

和

)。这种染料由供体染料和受体染料的FRET对组成。这种组合(类似于斯托克斯位移非常大的染料)提供了无串扰，因为供体染料被绿光有效激发，将能量转移到受体，而后者仅发射红光。然而，具有完全能量转移、多个负电荷和一个芳香氨基的FRET对太复杂，因此很难合成获得。因此，本发明提供了具有扩大的斯托克斯位移的荧光染料。作为内部比对标准品的替代物，这些染料在APTS(观察)通道中没有发射。

为了消除与APTS通道的串扰，有必要使用其他荧光染料组再校准商品化DNA测序仪(由Applied Biosystems制造)。根据制造商的说法，可以有任意数量的(各种)虚拟滤光器(观察窗)。因此，可以指定新的检测通道。例如，5种任意荧光染料的发射最大值定义了5个(新的)检测窗口(滤光器)。为了最小化串扰，新参考染料的最大吸收必须在500nm至655nm的范围内或多或少地均匀分布。CCD阵列上发射颜色之间的“串扰”(重叠)由软件中的矩阵文件校正。这个过程是众所周知的，被称为“线性解混(linear unmixing)”(T.Zimmermann，等人，Methods Mol.Biol.2014，1075，129-148)。

矩阵文件由单独的“矩阵”运行生成，其中参考染料或其衍生物经过毛细管电泳，分离成单个峰，其发射光谱在整个光谱范围内记录。矩阵文件包含关于单个染料输入到落在特定滤光器(在特定观察窗内检测)上的发射光中的信息。对于每个滤波器(检测窗口)，一种染料的输入是最大的，但是也有来自其他染料的成分“污染”通过特定滤波器的整个信号。

在图25中，示出了染料8-H(三磷酸化氨基芘)和APTS(三硫酸化氨基芘)的比较。添加(spiked-in)的APTS标记的麦芽糖阶梯(对于两个样品)提供了一个时间方向。虽然8-H(144)的m/z比低于APTS(151)，但8-H的保留时间高于APTS的保留时间。在APTS中，带电基团(磺酸残基)直接附着在荧光团上。8-H中N-甲基-N-(2-羟乙基)接头的存在增加了染料的流体动力学比率，这解释了游离染料8-H的更高保留时间

图26显示了8-H和APTS峰的放大图。该图是在光谱校准之前获得的。由于8-H与APTS彩色通道(522nm；图26A中的黑色)的强串扰，在任何分析测定中，染料8-H不能与APTS一起使用。如图27所示的三磷酸化芘染料15与如图30所示的二磷酸化吖啶酮染料6-Me和6-H也是如此。因此，有必要对DNA测序仪进行新的颜色校准，以减少或尽可能完全消除由APTS与三磷酸化芘染料6-H、6-Me或8-H和15引起的发射通道之间的串扰。

为此，选择带负电荷的荧光染料19、20、6-R和15(见下文)，并与APTS一起用于集成在DNA测序装置中的电泳单元的光谱校准的新组合中。使用这些染料，可以生成一个新的矩阵文件，并用于校正光谱重叠。

表7显示了荧光染料(包括罗丹明19和20(见K.Kolmakov，等人，Chem.Eur.J.2012，18，12986-12998和K.Kolmakov，等人，Chem.Eur.Journal，2013，20，146-157.)、6-R和15)及其与由麦芽糖单元组成的寡糖的缀合物的性质。值得注意的是，染料8-H与麦芽糖缀合物的保留时间(13.1分钟)比从麦芽四糖获得的APTS衍生物的保留时间(16.5分钟)短得多。尽管染料8-H和15的流体动力学比率大于APTS，但是这些染料中六个负电荷的存在(相对于APTS的三个)强烈增加了它们在电场中的电泳迁移率。

表7.用于集成到DNA测序装置中的荧光检测单元的光谱校准的与APTS一起用于新组合中的荧光染料6-R、15、19、20和23的性质。

a--与碳水化合物缀合和/或氨基取代的N-烷基化染料将吸收和发射带移动约20nm至红色光谱区(见表1)。b--在其中染料具有最大发射的附加颜色通道中的保留(迁移)时间，如在凝胶中于pH＝8测量的。c--染料8-H的缀合物在522和544nm通道之间具有大的串扰。

事实上，一方面，如果比较图24中颜色通道和表7中的颜色通道的发射最大值，可以得出这些非常相似的结论。只有“575nm通道”的发射最大值存在微小差异，而“595nm通道”的差异更小。用于定义“575nm通道”(图27和28)的新发射带非常宽。“新的595nm通道”的发射最大值略微红移(从595nm至约607nm)。然而，这些微小的差异能够完全消除任何串扰。

为了获得图29中描绘的颜色迹线，在DNA测序仪中设置了五个新的虚拟滤光器(表3)。最短的波长通道对应于所有的APTS缀合物(522nm)，下一个对应于芘15-麦芽三糖共轭物的发射最大值(554nm；适用于染料15的所有缀合物)，“绿色”对应于吖啶酮染料6-H和6-Me与还原糖的所有缀合物(575nm)，另一个对应于游离染料20的发射最大值(595nm，图4)，以及，最后，根据染料19的发射选择“红色”通道(655nm；图4)。通过这种选择，消除了APTS通道(522nm)和554nm通道之间以及APTS通道(522nm)和575nm(绿色)通道之间的任何串扰(见图29和31)。

图29A和B显示了从碳水化合物混合物(“葡聚糖1000”(A)和“葡聚糖5000(B)阶梯”)和染料15获得的缀合物的电泳图；“1000”和“5000”对应于葡聚糖低聚物的平均分子量。峰之间的时间差为约1分钟。在APTS的情况中，峰之间的时间差为约2.3分钟(见图25；葡萄糖单位的添加导致与麦芽糖单位大致相同的迁移时间的增加)。如果荧光染料用于生成新的内部标准品混合物，则峰之间的时间差越小越有利。

图30A和B显示了颜色校准前从麦芽三糖和染料6-H(A)和6-Me(B)获得的缀合物(还原胺化产物)的电泳图。对于6-H和6-Me这两种染料，APTS通道(522nm)和“595nm通道”(也适用于6-H和6-Me)之间的串扰相当小；小于染料15的情况(图27)。对于染料6-H，串扰为约7.8％，对于染料6-Me—为约3.4％。然而，即使标准通道和观察通道之间的小串扰也是禁止的，因为它可能导致(不存在的分析物的)假阳性鉴别。

图31A和B显示了光谱校准后从“葡聚糖1000”(A)和“葡聚糖5000”(B)阶梯和染料6-Me获得的缀合物的电泳图(见实施例3)。新的颜色校准是基于使用染料6-H和6-Me与麦芽三糖的缀合物。它们的光谱性质和它们的缀合物的性质非常相似。APTS通道(522nm)和新的“575nm”通道之间没有任何串扰。

对于染料6-Me(和6-H)，峰间时间差为约1.5分钟，这对应于染料残基上的四个负电荷。图31的右侧显示了迁移时间高达60分钟或更长的峰；这些表明染料6-Me(和6-H；数据是相似的，因此没有显示)可能比APTS好(图25)。

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Claims (28)

1.一种用于自动测定和/或鉴别碳水化合物和/或碳水化合物混合物组成模式分析的方法，包括以下步骤：

a)获得含有至少一种碳水化合物的样品；

b)用第一荧光标记物标记所述碳水化合物；

c)提供用第二荧光标记物标记的已知组成的标准品；

d)使用动电学/色谱分离技术结合荧光或激光诱导荧光检测来测定所述碳水化合物和已知组成的标准品的迁移/保留时间；

e)基于该标准品的给定标准迁移/保留时间指数，将迁移/保留时间与迁移/保留时间指数进行对齐；

f)将碳水化合物的这些迁移/保留时间指数与来自数据库的标准迁移/保留时间指数进行比较；

g)鉴别或测定碳水化合物和/或碳水化合物混合物组成模式，

其中将该标准品组合物加入到含有未知碳水化合物和/或碳水化合物混合物组成的样品中，该第一荧光标记和该第二荧光标记是不同的，并且其中该第一荧光标记或该第二荧光标记是荧光染料，优选具有多个可离子化的和/或带负电荷的基团，所述荧光染料选自由下述通式A和B的化合物组成的组：

其中

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵彼此独立并且可以代表：

H，CH₃，C₂H₅，直链或支链的C₃-C₁₂、优选C₃-C₆，烷基或全氟烷基，磷酸化的烷基(CH₂)_mP(O)(OH)₂，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链的烷基链，(CH₂)_nCOOH，其中n＝1-12、优选1-5，或(CH₂)_nCOOR⁶，其中n＝1-12、优选1-5，并且R⁶可以是烷基，特别是C₁-C₆烷基、CH₂CN、苄基，芴-9-基、多卤代烷基、多卤代苯基，例如，四或五氟苯基、五氯苯基、2-和4-硝基苯基、N-琥珀酰亚胺基(N-succinimidyl)、磺基-N-琥珀酰亚胺基(sulfo-N-succinimidyl)、1-氧基苯并三唑(1-oxybenzotriazolyl)或其他潜在的亲核反应性离去基团，烷基磺酸盐((CH₂)_nSO₃H)或烷基硫酸盐((CH₂)_nOSO₃H)，其中n＝1-12、优选1-5，并且任何(CH₂)_n中的烷基链可以是直链或支链的；

羟烷基(CH₂)_mOH或硫代烷基(CH₂)_mSH，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链，磷酸化羟烷基(CH₂)_mOP(O)(OH)₂，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链；R¹或R²基团的其中一个可以是碳酸酯或氨基甲酸酯衍生物(CH₂)_mOCOOR⁷或COOR⁷，其中m＝1-12且R⁷＝甲基、乙基、叔丁基、苄基、芴-9-基、CH₂CN、N-琥珀酰亚胺基、磺基-N-琥珀酰亚胺基、1-氧基苯并三唑、苯基、取代苯基，例如2-或4-硝基苯基、五氯苯基、五氟苯基、2，3，5，6-四氟苯基、2-吡啶基、4-吡啶基、嘧啶-4-基；

(CH₂)_mNR^aR^b，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链；R^a、R^b彼此独立并且代表氢和/或C₁-C₄烷基，羟烷基(CH₂)_mOH，其中m＝2-6，具有直链或支链烷基链，磷酸化羟烷基(CH₂)_mOP(O)(OH)₂，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链；

烷基叠氮化物(CH₂)_mN₃，其中m＝1-12，优选2-6，具有直链或支链烷基链；

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵可以含有末端烷氧基氨基(CH₂)_mONH₂，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链，其可以包括在m＝0-12的所有可能的组合中的一个或多个烷基氨基(CH₂)_mNH或烷基酰胺基(CH₂)_mCONH；

(CH₂)_nCONHR⁸，其中n＝1-12、优选1-5；R⁸＝H，C₁-C₆烷基，(CH₂)_mN₃，或(CH₂)_m-N-马来酰亚胺基((CH₂)_m-N-maleimido)，(CH₂)_m-NH-COCH₂X(X＝Br或I)，其中m＝1-12、优选2-6，并且在(CH₂)_n、(CH₂)_m和R⁸中具有直链或支链烷基链；

伯氨基，优选为R¹、R²或R³，其形成芳基肼；

羟基，优选为R²或R³，其形成芳基羟胺；

进一步，残基R¹、R²、R³、R⁴、R⁵的其中一个可以代表CH₂-C₆H₄-NH₂、COC₆H₄-NH₂、CONHC₆H₄-NH₂或CSNHC₆H₄-NH₂，其中C₆H₄是1，2-、1，3-或1，4-亚苯基、COC₅H₃N-NH₂或CH₂-C₅H₃N-NH₂，其中C₅H₃N是吡啶-2，4-二基、吡啶-2，5-二基、吡啶-2，6-二基或吡啶-3，5-二基；

此外，R²---R³和/或(R⁴---R⁵)可以形成四元、五元、六元或七元环，或具有或不具有连接到该环中一个碳原子上的伯氨基NH₂、仲氨基NHR^a的四元、五元、六元或七元环，其中R^a＝C₁-C₆烷基、羟基OH或磷酸化羟基-OP(O)(OH)₂；

任选地，R²---R³(R⁴---R⁵)可以形成四元、五元、六元或七元杂环，该杂环中还包含1-3个杂原子，例如O、N或S；

进一步，R¹可以代表未取代的苯基、具有一个或数个选自OH、SH、NH₂、NHR^a、NR^aR^b、R^aO、R^aS的组的电子给体取代基的苯基，其中R^a和R^b彼此独立并且可以是具有直链或支链碳链的C₁-C₆烷基，具有一个或数个选自NO₂、CN、COH、COOH、CH＝CHCN、CH＝C(CN)₂、SO₂R^a、COR^a、COOR^a、CH＝CHCOR^a、CH＝CHCOOR^a、CONHR^a、SO₂NR^aR^b、CONR^aR^b的组的电子受体的苯基，其中R^a和R^b彼此独立并且可以是H或具有直链或支链碳链的C₁-C₆烷基；

或者R¹可以代表杂芳族基团；

但条件是在上述式A的所有化合物中，在碱性条件下，即7<pH<14，存在至少两个，优选至少3、4、5或6个带负电荷的基团，并且这些带负电荷的基团代表至少部分去质子化的可离子化基团的残基，所述可离子化基团选自：SH，COOH，磺酸残基SO₃H，伯磷酸基团OP(O)(OH)₂，仲磷酸基团OP(O)(OH)R^a、其中R^a＝C₁-C₄烷基或取代的C₁-C₄烷基，伯膦酸基团P(O)(OH)₂，仲膦酸基团OP(O)(OH)R^a、其中R^a＝C₁-C₄烷基或取代的C₁-C₄烷基；

并且式A的化合物可以作为盐、溶剂化物和水合物存在并且可以作为盐、溶剂化物和水合物使用，优选作为具有碱金属阳离子包括Na⁺、Li⁺、K⁺和有机铵或有机鏻阳离子的盐；

其中R¹和/或R²彼此独立并且可以代表：

H，CH₃，C₂H₅，直链或支链C₃-C₁₂烷基或全氟烷基，或取代的C₂-C₁₂烷基；特别地，(CH₂)_nCOOR³，其中n＝1-12、优选1-5，R³可以是H，烷基、特别是C₁-C₆，CH₂CN，苄基，芴-9基，多卤代烷基，多卤代苯基，例如四或五氟苯基、五氯苯基、2-和4-硝基苯基、N-琥珀酰亚胺基、磺基-N-琥珀酰亚胺基、1-氧基苯并三唑基或其他潜在的亲核反应性离去基团，并且(CH₂)_n中的烷基链可以是直链或支链的；和

R₁---R₂可以形成四元、五元、六元或七元非芳族碳环，该碳环带有连接到该环的一个碳原子上的附加的伯氨基NH₂、仲氨基NHR^a，其中R^a＝C₁-C₆烷基、或羟基OH；任选地，R₁---R₂可以形成四元、五元、六元或七元非芳族杂环，在该杂环中包含附加的杂原子，例如O、N或S；

羟烷基(CH₂)_mOH，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链；R¹或R²基团的其中一个可以是碳酸酯或氨基甲酸酯衍生物(CH₂)_mOCOOR⁴或COOR⁴，其中m＝1-12且R⁴＝甲基、乙基、2-氯-乙基、N-琥珀酰亚胺基，磺基-N-琥珀酰亚胺基、1-氧基苯并三唑基、苯基或取代苯基，例如2-或4-硝基苯基、五氯苯基、五氟苯基、2，3，5，6-四氟-苯基、2-吡啶基或4-吡啶基；

(CH₂)_mNR^aR^b，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链；R^a、R^b彼此独立，并且可以是H，或任选取代的C₁-C₄烷基，特别地，R¹或R²基团的其中一个可以是其中m＝2-6、且具有直链或支链烷基链的烷基叠氮化物基团(CH₂)_mN₃；R¹或R²的其中一个可以是n＝1-12的(CH₂)_nSO₂NR⁵NH₂，而取代基R⁵可以由H、烷基、羟烷基或全氟烷基基团C₁-C₁₂表示；

R¹或R²基团的其中一个可以是伯氨基，以形成芳基肼Ar-NR⁶NH₂，其中Ar是在式B中的整个芘残基，并且R⁶＝H或烷基；R¹或R²基团的其中一个可以是羟基以形成芳基羟胺Ar-NR⁷OH，其中Ar是式B中的整个芘残基，并且R⁷＝H或烷基；

R¹或R²基团的其中一个可以含有n＝1-12的末端烷氧基氨基(CH₂)_nONH₂，其可以通过m＝0-12所有可能组合中的一个或多个烷基氨基(CH₂)_mNH或烷基酰胺基(CH₂)_mCONH、烷基醚或烷基酯基团而被连接；

R¹或R²基团的其中一个可以是CO(CH₂)NCOOR⁸，其中n＝1-5，具有直链或支链烷基链(CH₂)_n，并且R⁸选自H、直链或支链C₁-C₆烷基、CH₂CN、2-和4-硝基苯基、2，3，5，6-四氟苯基、五氯苯基、五氟苯基、N-琥珀酰亚胺基、磺基-N-琥珀酰亚胺基、1-氧基苯并三唑基；

进一步，R¹或R²的其中一个可以是(CH₂)_nCONHR⁹，其中n＝1-5且R⁹＝H、C₁-C₆烷基、(CH₂)_mN₃、(CH₂)_m-N-马来酰亚胺基、(CH₂)_m-NHCOCH₂X(X＝Br或I)，其中m＝2-6并且在(CH₂)_n和R⁹中具有直链或支链烷基链；

或者R¹或R²的其中一个可以代表CH₂-C₆H₄-NH₂、COC₆H₄-NH₂、CONHC₆H₄-NH₂或CSNHC₆H₄-NH₂，其中C₆H₄是1，2-、1，3-或1，4-亚苯基，COC₅H₃N-NH₂或CH₂-C₅H₃N-NH₂，其中C₅H₃N是吡啶-2，4-二基、吡啶-2，5-二基、吡啶-2，6-二基或吡啶-3，5-二基；或者R¹或R²的其中一个可以是烷基叠氮(CH)N₃或炔烃，特别是炔丙基；

接头L包含至少一个碳原子，并且可以包含烷基，杂烷基，特别是烷氧基如CH₂OCH₂、CH₂CH₂O、CH₂CH₂OCH₂，烷氨基或二烷氨基，特别是二乙醇胺或N-甲基(烷基)一乙醇胺部分如N(CH₃)CH₂CH₂O-和N(CH₂CH₂O-)₂，全氟烷基如单或多二氟甲基(CF₂)，烯烃或炔烃部分，以任何组合，在任何情况下，直链或支链的，长度范围从C₁至C₁₂；

接头L还可以包括羰基(CH₂CO，CF₂CO)部分，还可以作为酰胺基的一部分；

接头L还可以包含或含有1，3，5-三嗪的残基，从而为X基团提供两个附着点；

X表示增溶和/或可离子化的阴离子提供部分，特别是由选自以下的组的部分组成或包括选自以下的组的部分，所述组包括：羟烷基(CH₂)_nOH、硫代烷基((CH₂)_nSH)、羧烷基((CH₂)_nCO₂H)、烷基磺酸基((CH₂)_nSO₃H)、烷基硫酸基((CH₂)_nOSO₃H)、烷基磷酸基((CH₂)_nOP(O)(OH)₂)或膦酸基((CH₂)_nP(O)(OH)₂)，其中n是0至12的整数，或其类似物，其中一个或多个CH₂基团被CF₂取代，

进一步，阴离子提供部分可以通过非芳族的含O、N和S的杂环连接，例如哌嗪类、哌可啉类(pipecloines)，或者，可替换地，基团X的其中一个可以承载上面为基团R¹和R²列出的任何部分，也可以带有为基团L列出的任何类型的连接，并且独立于其他取代基；

式B的化合物可以作为盐、溶剂化物和水合物存在，并且可以作为盐、溶剂化物和水合物使用，优选作为具有碱金属阳离子包括Na⁺、Li⁺、K⁺或有机铵。

但条件是在由式B表示的所有化合物中，在碱性条件下，即7<pH<14，在式B的残基X中存在三个或六个带负电荷的基团，并且这些带负电荷的基团代表至少部分去质子化的可离子化基团的残基，所述可离子化基团选自：SH，COOH，SO₃H，OP(O)(OH)₂，OP(O)(OH)R^a、其中R^a＝C₁-C₄烷基或取代的C₁-C₄烷基，P(O)(OH)₂，P(O)(OH)R^a、其中R^a＝C₁-C₄烷基或取代的C₁-C₄烷基；

并且式B的化合物可以作为盐、溶剂化物和水合物存在，并且可以作为盐、溶剂化物和水合物使用，优选作为具有碱金属阳离子包括Na+、Li+、K+和有机铵或有机鏻阳离子的盐；

2.根据权利要求1的方法，其中已知组成的标准品是标准碱基对阶梯和/或已知的碳水化合物混合物组成。

3.一种自动化碳水化合物混合物组成模式分析的方法，包括以下步骤：

a)提供含有第一碳水化合物混合物组成的第一样品；

b)用第一荧光标记物标记所述碳水化合物混合物组成；

c)提供含有第二碳水化合物混合物组成的第二样品，该第二荧光标记物可以任选地添加到所述第一样品中；

d)使用动电学/色谱分离技术结合荧光或激光诱导荧光检测生成所述样品的碳水化合物混合物组成的电泳图/色谱图；

e)分析该第一和第二样品的碳水化合物混合物组成模式分析之间的同一性和/或差异；

其中该第一样品的第一荧光标记与该第二样品的第二荧光标记不同，并且其中该第一荧光标记和该第二荧光标记种的至少一个是如权利要求1中定义的荧光染料。

4.一种根据权利要求3的自动化碳水化合物混合物组成模式分析的方法，包括以下步骤：

a)提供含有第一碳水化合物组成的样品；

b)用第一荧光标记物标记所述碳水化合物混合物组成；

c)提供用第二荧光标记物标记的第二样品，其含有待比较的第二碳水化合物混合物组成；

d)使用动电学/色谱分离技术结合荧光或激光诱导荧光检测生成该第一和第二样品的碳水化合物混合物组成的电泳图/色谱图；

e)比较由获得的该第一样品和第二样品的电泳图/色谱图计算出的标准迁移/保留时间指数；

f)分析该第一和第二样品的碳水化合物混合物组成模式图谱之间的同一性和/或差异，其中该样品中存在的碳水化合物的标准迁移/保留时间指数是基于用第三荧光标记物标记的已知组成的内部标准品计算出的，并且其中该第一或第二荧光标记物的其中一个是如权利要求1中定义的荧光染料。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将至少两个正交标准品添加到所述样品中，并且基于所述至少两个正交标准品的给定标准迁移/保留时间指数进行正交交叉对齐。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品含有碳水化合物的混合物。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品是聚糖的提取物，并且所述方法允许鉴别糖基化模式图谱。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中鉴别了糖蛋白的糖基化模式。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述碳水化合物混合物的成分被定量地测定。

10.一种校准多波长荧光检测系统、特别是毛细管-凝胶电泳系统的方法，该系统使用基于吖啶酮和/或芘的荧光染料，这些染料可选择性地作为与包括碳水化合物的底物部分的缀合物存在，

其中，所述方法包括检测根据权利要求1定义的式A或B的化合物的至少一种，以及发出不同波长的额外荧光染料及它们的碳水化合物缀合物，优选地包括化合物：APTS，6-R，8-H，15，19，20，23或23b的至少一种，如下方案所示：

11.根据权利要求10所述的方法，其中基于吖啶酮和/或芘的染料，其可选择性地作为与包括碳水化合物的底物部分的缀合物存在，包括以下组合：APTS、6-H、19和20，或APTS、6-Me、19和20，或15、6-Me、19和20，或APTS、15、19和20，或APTS、15、6-Me和20，或APTS、8-H、6-Me和19，或APTS、8-H、6-Me和20，或APTS、8-H、19和20，或APTS、23、19和20，或APTS、15、6-Me和19，或APTS、23、6-Me和19，或APTS、23、6-Me和20，或23、6-Me、19和20，或APTS、8-H、6-Me、20和19，或APTS、15、6-Me、20和19，或APTS、23、6-Me、20和19，或APTS、8-H、6-H、20和19，或APTS、15、6-H、20和19，或APTS、23、6-H、20和19。

12.根据前述权利要求中任何一项所述的方法，其中式B的荧光染料是具有下式C、其中n＝0-12的染料

其中

R¹和/或R²彼此独立，并且可以表示为：

H，CH₃，C₂H₅，直链或支链C₃-C₁₂、优选C₃-C₆烷基，或取代的C₂-C₁₂、优选C₂-C₆烷基；特别地，(CH₂)_nCOOR³，其中n＝1-12、优选1-5，R³可以是H，CH₂CN，2-和4-硝基苯基，2，3，5，6-四氟苯基，五氯苯基，五氟苯基，N-琥珀酰亚胺基，磺基-N-琥珀酰亚胺基，1-氧基苯并三唑基，并且(CH₂)_n中的烷基链可以是直链或支链的；和

R¹---R²可以形成四元、五元、六元或七元非芳族碳环，该碳环带有连接到该环的一个碳原子上的附加的伯氨基NH₂，仲氨基NHR^a，其中R^a＝C₁-C₆烷基、或羟基OH；任选地，R¹---R²可以形成四元、五元、六元或七元非芳族杂环，额外的杂原子如O、N或S包括在该杂环中；羟烷基(CH₂)_mOH，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链；R¹或R²基团的其中一个可以是碳酸酯或氨基甲酸酯衍生物(CH₂)_mOCOOR⁴或COOR⁴，其中m＝1-12和R⁴＝甲基、乙基、2-氯乙基、N-琥珀酰亚胺基、磺基-N-琥珀酰亚胺基、1-氧基苯并三唑或取代的苯基，例如2-和4-硝基苯基、五氯苯基、五氟苯基、2，3，5，6-四氟-苯基、2-吡啶基或4-吡啶基；

(CH₂)_mNR^aR^b，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链的烷基链；R^a、R^b彼此独立，并且可以是H、或任选取代的C₁-C₄烷基，特别地，R¹或R²基团的其中一个可以是烷基叠氮化物基团(CH₂)_mN₃，其中m＝2-6、并具有直链或支链的烷基链；

R¹或R²基团的其中一个可以是(CH₂)_nCOOR⁵，其中n＝1-5、具有直链或支链的烷基链(CH₂)_n，并且R⁵选自H、直链或支链C₁-C₆烷基、CH₂CN、2-和4-硝基苯基、2，3，5，6-四氟苯基、五氯苯基、五氟苯基、磺基-N-琥珀酰亚胺基、N-琥珀酰亚胺基、1-氧基苯并三唑基；

进一步，R¹或R²的其中一个可以是(CH₂)_nCONHR⁶，其中n＝1-12、优选1-5，和R⁶＝H、C₁-C₆烷基、(CH₂)_mN₃、(CH₂)_m-N-马来酰亚胺基、(CH₂)_m-NHCOCH₂X(X＝Br或I)，其中m＝2-6并且在(CH₂)_n和R⁶中具有直链或支链烷基链；或者R¹或R²中的一个可以代表CH₂-C₆H₄-NH₂、COC₆H₄-NH₂、CONHC₆H₄-NH₂或CSNHC₆H₄-NH₂，其中C₆H₄是1，2-、1，3-或1，4-亚苯基、COC₅H₃N-NH₂或CH₂-C₅H₃N-NH₂，其中C₅H₃N是吡啶-2，4-二基、吡啶-2，5-二基、吡啶-2，6-二基或吡啶-3，5-二基；

R¹或R²基团的其中一个可以是伯氨基以形成芳基肼Ar-NR⁶NH₂，其中Ar是式C中的整个芘残基，R⁷＝H或烷基；

R¹或R²基团的其中一个可以是羟基以形成芳基羟胺Ar-NR⁸OH，其中Ar是式C中的整个芘残基，R⁷＝H或烷基；

R¹或R²基团的其中一个可能含有n＝1-12的末端烷氧基氨基(CH₂)_nONH₂，其可以通过m＝0-12的所有可能组合中的一个或多个的烷基氨基(CH₂)_mNH、烷基酰胺基(CH₂)_mCONH、烷基醚或烷基酯基团而被相连；

在式B中的SO₂片段和的残基X之间的n＝1-5的(CH₂)_n-CH₂接头可以代表具有2-6个碳原子的直链、支链或环状基团；

X＝SH，COOH，SO₃H，OP(O)(OH)₂，OP(O)(OH)R^a、其中R^a＝任选取代的C₁-C₄烷基，P(O)(OH)₂，P(O)(OH)R^a、其中R^a＝任选取代的C₁-C₄烷基；

但条件是在所有由式C表示的化合物中，在碱性条件下，即7<pH<14，在式B的残基X中存在三个或六个负电荷基团，并且这些负电荷基团代表至少部分去质子化的可离子化基团的残基，所述可离子化基团选自：SH、COOH、SO₃H、OP(O)(OH)₂、OP(O)(OH)R^a、其中R^a＝C₁-C₄烷基或取代的C₁-C₄烷基，P(O)(OH)₂，P(O)(OH)R^a、其中R^a＝C₁-C₄烷基或取代的C₁-C₄；

并且式C的化合物可以作为盐、溶剂化物和水合物存在，并且可以作为盐、溶剂化物和水合物使用，优选作为具有碱金属阳离子包括Na⁺、Li⁺、K⁺和有机铵或有机鏻阳离子的盐；

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中式B的荧光染料是具有下式D的染料

其中

R¹和/或R²彼此独立，并且可以代表H，CH₃，C₂H₅或直链或支链、任选取代的C₃-C₁₂、优选C₃-C₆烷基；特别地，(CH₂)_nCOOR⁴，其中n＝1-12、优选1-5，R⁴可以是H、CH₂CN、2-和4-硝基苯基、2，3，5，6-四氟苯基、五氯苯基、五氟苯基、N-琥珀酰亚胺基、磺基-N-琥珀酰亚胺基、1-氧基苯并三唑基，并且(CH₂)_n中的烷基链可以是直链或支链的；和

R¹---R²可以形成四元、五元、六元或七元非芳族碳环，该碳环具有连接到该环中一个碳原子上的附加的伯氨基NH₂，仲氨基NHR^a、其中R^a＝任选取代的C₁-C₆烷基、或羟基OH；或者任选地，R¹---R²可以形成四元、五元、六元或七元非芳族杂环，杂原子如O、N或S包括在该杂环中；

R¹和/或R²可进一步代表：

羟烷基(CH₂)_mOH，其中m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链的、任选取代的烷基链；R¹或R²基团的其中一个可以是碳酸酯或氨基甲酸酯衍生物(CH₂)_mOCOOR⁵或COOR⁵，其中m＝1-12且R⁵＝甲基、乙基、2-氯乙基、CH₂CN、N-琥珀酰亚胺基、磺基-N-琥珀酰亚胺基、1-氧基苯并三唑基、苯基或取代苯基，例如2-和4-硝基苯基、五氯苯基、五氟苯基、2，3，5，6-四氟苯基、2-吡啶基、4-吡啶基；

(CH₂)_mN₃，m＝1-12、优选2-6，具有直链或支链烷基链；

(CH₂)_nCONHR⁶，其中n＝1-12、优选1-5，R⁶＝H，取代或未取代的C₁-C₆烷基，(CH₂)_mN₃、(CH₂)_m-N-马来酰亚胺基、(CH₂)_m-NHCOCH₂Y(Y＝Br，I)，其中m＝1-12、优选2-6，在(CH₂)_n和R⁶中具有直链或支链烷基链；

R¹或R²基团中的一个可以是伯氨基以形成芳基肼Ar-NR⁷NH₂，其中在式D中，Ar是整个芘残基，R⁷＝H或烷基；

R¹或R²基团中的一个可以是羟基以形成芳基羟胺Ar-NR⁸OH，其中在式D中，Ar是整个芘残基，R⁸＝H或烷基；

R¹或R²基团中的一个可以含有n＝1-12的末端烷氧基氨基(CH₂)_nONH₂，其可以通过m＝0-12的一个或多个烷基氨基(CH₂)_mNH、烷基酰胺基(CH₂)_mCONH、烷基醚或烷基酯基团的所有可能组合连接；

进一步，R¹或R²可以代表CH₂-C₆H₄-NH₂、COC₆H₄-NH₂、CONHC₆H₄-NH₂或CSNHC₆H₄-NH₂，其中C₆H₄是1，2-、1，3-或1，4-亚苯基、COC₅H₃N-NH₂或CH₂-C₅H₃N-NH₂，其中C₅H₃N是吡啶-2，4-二基、吡啶-2，5-二基、吡啶-2，6-二基或吡啶-3，5-二基；

R³＝H，(CH₂)_qCH₂X，C₂H₅，直链或支链C₃-C₆烷基，C_mH_2mOR，其中m＝2-6，具有直链或支链烷-二基(alkan-diyl)链C_mH_2m，并且R＝H、CH₃、C₂H₅、C₃H₇、CH₃(CH₂CH₂O)_kCH₂CH₂；其中k＝1-12；而(CH₂)_qCH₂接头可以代表具有2-6个碳原子的直链、支链或环状基团；

在式D中，在磺酰胺片段SO₂N和残基X之间的n＝1-12、优选1-5的(CH₂)_n-CH₂接头可以代表具有2-6个碳原子的直链、支链或环状基团；

X＝SH，COOH，SO₃H，OP(O)(OH)₂，OP(O)(OH)Ra、其中Ra＝取代或未取代的C₁-C₄烷基，P(O)(OH)₂，P(O)(OH)Ra、其中Ra＝取代或未取代的C₁-C₄烷基；

但条件是在由式D表示的所有化合物中，在碱性条件下，即7<pH<14，在式C的残基X中存在三个、六个、九个或十二个负电荷基团，并且这些负电荷基团代表至少部分去质子化的可离子化基团的残基，所述可离子化基团选自：SH，COOH，SO₃H，OP(O)(OH)₂，OP(O)(OH)R^a、其中R^a＝C₁-C₄烷基或取代的C₁-C₄烷基，P(O)(OH)₂，P(O)(OH)R^a、其中R^a＝C₁-C₄或取代的C₁-C₄烷基；

以及式D的化合物可以作为盐、溶剂化物和水合物存在并且可以作为盐、溶剂化物和水合物使用，优选作为具有碱金属阳离子包括Na⁺、Li⁺、K⁺和有机铵或有机鏻阳离子的盐。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中式B或D中的R¹和/或R²代表：H、氘、烷基或氘取代的烷基，其中烷基的一个、数个或所有H原子可以被氘原子取代，特别是具有1-12个C原子，优选1-6个C原子的烷基或氘取代的烷基，4，6-二卤代1，3，5-三嗪基(C₃N₃X₂)、其中卤素X优选氯，2-、3-或4-氨基苯甲酰基(COC₆H₄NH₂)，N-[(2-，N-[(3-或N-[(4-氨基苯基)脲基基团(NHCONHC₆H₄NH₂)，N-[(2-，N-[(3-或N-[(4-氨基苯基)硫代脲基基团(NHCSNHC₆H₄NH₂)或连接的羧酸残基和它们的通式反应性酯，通式为(CH₂)_m1COOR³、(CH₂)_m1OCOOR³、(CH₂)_n1COOR³或(CO)_m1(CH₂)_m2(CO)_n1(NH)_n2(CO)_n3(CH₂)_n4COOR³，其中整数m1、m2和n1、n2、n3、n4分别独立地为1至12和0至12，其中链(CH₂)m/n是直链、支链、饱和、不饱和、部分或完全氘化的，和/或包括在含N、O或S的碳或杂环中，而R³是H、D或亲核反应性离去基团，优选包括但不限于N-琥珀酰亚胺基、磺基-N-琥珀酰亚胺基、1-氧基苯并三唑、氰甲基、多卤代烷基、多卤代苯基，例如四或五氟苯基、2-或4-硝基苯基。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中式A至D的化合物选自：

或7-R(R＝H，Me)、13a、13b、16、18、23和23b的化合物

或其盐。

16.一种用于测定和/或鉴别碳水化合物混合物组成模式的试剂盒或系统，其包括具有非瞬态存储器的数据处理单元，所述存储器含有数据库，所述数据库含有碳水化合物的对齐迁移/保留时间和/或对齐迁移/保留时间指数，所述迁移/保留时间和/或迁移/保留时间指数通过碳水化合物的自动测定和/或鉴别、和/或碳水化合物和/或碳水化合物混合物组成模式分析的鉴别获得，包括以下步骤：

a)获得含有至少一种碳水化合物的样品；

b)用第一荧光标记物标记所述碳水化合物；

c)提供标记有第二荧光标记的已知组成的标准品；

d)使用动电学/色谱分离技术结合荧光或激光诱导荧光检测测定所述碳水化合物和已知组成的标准品的的迁移/保留时间；

e)根据标准品的给定标准迁移/保留时间指数，将迁移/保留时间与迁移/保留时间指数进行对齐；

f)将这些碳水化合物的迁移/保留时间指数与数据库中的标准迁移/保留时间指数进行比较；

g)鉴别或测定碳水化合物和/或碳水化合物混合物组成模式，

其中，将标准品组合物添加到含有未知碳水化合物混合物组成的样品中，第一荧光标记和第二荧光标记不同，其中该第一荧光标记或该第二荧光标记为荧光染料，优选所述荧光染料具有多个可离子化和/或带负电荷的基团，所述基团选自权利要求1和12-15中任一项所定义的通式A至D的化合物组成的组；以及如权利要求1和12-15中任一项所定义的荧光染料。

17.一种用于自动化碳水化合物混合物组成模式分析的试剂盒或系统，包括具有非瞬态存储器的数据处理单元，所述存储器含有数据库，所述数据库含有碳水化合物的对齐迁移/保留时间和/或对齐迁移/保留时间指数，所述迁移/保留时间和/或迁移/保留时间指数通过碳水化合物的自动测定和/或鉴别、和/或碳水化合物和/或碳水化合物混合物组成模式分析的鉴别而获得，包括以下步骤：

a)提供含有未知碳水化合物混合物组成的第一样品；

b)用第一荧光标记对所述碳水化合物混合物组成进行标记；

c)向所述第一样品中加入用第二荧光标记标记的具有已知碳水化合物混合物组成模式的第二样品；

d)使用动电学/色谱分离技术结合荧光或激光诱导荧光检测，如毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光，生成所述样品的碳水化合物混合物组成的电泳图/色谱图；

e)分析该第一和第二样品的碳水化合物混合物组成模式分析的同一性和/或差异；

其中该第一样品的第一荧光标记不同于该第二样品的第二荧光标记，并且其中该第一荧光标记和该第二荧光标记中的至少一个是如权利要求1和12至15中任一项所定义的荧光染料；和如权利要求1和12至15中任一项所定义的荧光染料。

18.根据权利要求16或17中的任一项所述的试剂盒或系统，其进一步包括毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光装置，特别地，其中该毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光装置是毛细管DNA测序仪。

19.一种包含权利要求1、12至15中任一项所定义的荧光染料的碳水化合物染料缀合物，用于根据权利要求1至15中的任一项所述的方法。

20.根据权利要求19所述的碳水化合物染料缀合物，其中所述染料选自下式的化合物：

21.一种用于根据权利要求1至15中任一项的方法的试剂盒或组合物，包括权利要求1、12至15中定义的一种或多种染料或权利要求19-20的碳水化合物染料缀合物中的一种或多种。

22.一种校准标准品、如低聚糖标准品，包括与碳水化合物缀合的、根据式A、B、C或D的荧光染料，可任选地进一步包含化合物19，20中的至少一种。

23.一种试剂盒，含有根据权利要求22的校准标准品和任选的使用说明书。

24.一种具有式20的化合物

25.一种标准品组合物，其由标记有根据式A或B的荧光染料、特别是式C或D的荧光染料，或式A至D的不同种染料的化合物组成。

26.根据权利要求25所述的标准品组合物，其由标记有根据式A或B的荧光染料、特别是式C或D的荧光染料，或式A至D的不同种染料标记的碳水化合物组成。

27.根据权利要求25-26所述的标准品组合物，其中所述荧光染料选自6-H、6-Me、8-R、15、13a、13b、16、18、23和23b中的至少一种染料。

28.一种试剂盒，其含有根据权利要求25至27中任一项的标准品组合物、特别是用于根据权利要求1至15中任一项的方法，以及任选的使用说明书。

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