CN113616792B - 提高smurf1蛋白表达量的试剂在制备防治钙化性主动脉瓣疾病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及提高smurf1蛋白表达量的试剂在制备防治钙化性主动脉瓣疾病的药物中的应用。本发明经研究发现提高smurf1蛋白表达量可以有效下调瓣膜间质细胞中成骨分化标志基因RUNX2和Osterix的表达，抑制瓣膜间质细胞成骨分化，从而延缓或者抑制瓣膜钙化。进而提出了一种通过上调smurf1的表达水平以防治主动脉瓣钙化的方法，为钙化性主动脉瓣疾病的预防和治疗提供了新的非手术治疗方案。

Description

提高smurf1蛋白表达量的试剂在制备防治钙化性主动脉瓣疾 病的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及提高smurf1蛋白表达量的试剂在制备防治钙化性主动脉瓣疾病的药物中的应用。

背景技术

钙化主动脉瓣疾病(calcific aortic valve disease，CAVD)是一种高发病率和高死亡率的老年性进行性疾病，主要病理生理改变为主动脉瓣瓣叶纤维增生钙化从而导致瓣膜变硬并引起血流动力学改变，从而影响心脏功能。以往观点均认为CAVD是一种与年龄相关的退行性病变，是随着年龄增长，瓣膜组织的退化硬化过程。然而近年来的基础研究表明，CAVD是一种涉及内皮损伤，炎症细胞浸润、细胞外基质重塑以及瓣膜间质细胞成骨样分化等复杂病理改变的主动进展过程。瓣膜组织中的细胞主要包括瓣膜内皮细胞(Valvularendothelial cells,VEC)、瓣膜间质细胞(Valvular interstitial cells,VICs)、瓣膜前体细胞等，已有研究证实瓣膜间质细胞成骨样分化所导致的钙盐增多可能是瓣膜钙化发生的重要始动因素。目前，CAVD缺乏有效的临床可用药物治疗方案，其主要治疗手段为主动脉瓣置换手术。然而，接受外科手术的患者必然会承担较高的医疗手术风险及经济负担。因此，探究CAVD具体发病机制，采用非手术方法有效预防和/或治疗钙化性主动脉瓣疾病是目前临床治疗CAVD的迫切需求。

SMAD特异性E3泛素蛋白连接酶1(smurf1),是介导泛素化修饰的E3泛素蛋白连接酶家族的一员，目前对该蛋白的研究主要集中于其对成骨细胞活性，骨稳态，间充质干细胞成骨分化的影响及肿瘤领域。

研究发现，smurf1可与成骨细胞活性负相关(Yamashita M,Ying SX,Zhang GM,LiC,Cheng SY,Deng CX,Zhang YE.Ubiquitin ligase Smurf1 controls osteoblastactivity and bone homeostasis by targeting MEKK2 for degradation.Cell 2005；121(1):101-13.)。smurf1通过减少成骨细胞中Runx2的积累来抑制成骨细胞分化(ShimazuJ,Wei J,Karsenty G.Smurf1 Inhibits Osteoblast Differentiation,Bone Formation,and Glucose Homeostasis through Serine 148.Cell Rep 2016；15(1):27-35)。这些研究提示smurf1在瓣膜间质细胞成骨分化表型转变及主动脉瓣钙化中可能扮演重要角色，而提高smurf1蛋白表达量的试剂在制备预防或治疗钙化性主动脉瓣疾病药物中具有潜在临床价值。

发明内容

(一)解决的技术问题

针对上述背景，本发明通过研究发现提高smurf1蛋白表达量可以有效下调瓣膜间质细胞中成骨分化标志基因RUNX2和Osterix的表达，抑制瓣膜间质细胞成骨分化，从而延缓或者抑制瓣膜钙化，提出了提高smurf1蛋白表达量的试剂在制备防治钙化性主动脉瓣疾病的药物中的应用，进而为钙化性主动脉瓣疾病的预防和治疗提供了新的非手术治疗方案。

(二)技术方案

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了提高smurf1蛋白表达量的试剂在制备防治钙化性主动脉瓣疾病的药物中的应用。

进一步地，所述提高smurf1蛋白表达量的试剂包括以下任一：

smurf1蛋白；

含有smurf1蛋白编码基因的重组载体；

含有smurf1蛋白编码基因的重组病毒；

smurf1类似物。

进一步地，所述含有smurf1蛋白编码基因的重组病毒为含有蛋白编码基因的重组慢病毒、重组腺病毒。

进一步地，所述smurf1类似物为重组smurf1多肽。

所述提高smurf1蛋白表达量的试剂通过介导成骨分化相关基因RUNX2泛素化降解来抑制瓣膜间质细胞成骨分化的作用，从而延缓瓣膜钙化。

进一步地，所述防治钙化性主动脉瓣疾病的药物是由提高smurf1蛋白表达量的试剂与常规药用载体制成的药物组合物。

进一步地，所述药物组合物是胶囊剂、颗粒剂、注射剂、缓释片、口含片或粉针剂。

进一步地，所述防治钙化性主动脉瓣疾病的药物为提高主动脉瓣组织中smurf1表达水平的药物。

本发明还提供了一种防治主动脉瓣钙化的方法，所述方法包括上调治疗对象体内smurf1的表达水平，以防治主动脉瓣钙化。

(三)有益效果

本发明产生的有益效果是：本发明提供了提高smurf1蛋白表达量试剂在制备防治钙化性主动脉瓣疾病的药物中的应用，通过研究发现提高smurf1蛋白表达量可以有效下调瓣膜间质细胞中成骨分化标志基因RUNX2的表达，抑制瓣膜间质细胞成骨分化，从而延缓或者抑制瓣膜钙化，进而提出了一种通过上调smurf1的表达水平以防治主动脉瓣钙化的方法，为钙化性主动脉瓣疾病治疗提供了新的方案。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1：钙化主动脉瓣与正常主动脉瓣组织中smurf1的定量分析；

其中图1A为适时荧光定量PCR显示与正常主动脉瓣组织相比，smurf1在钙化主动脉瓣膜组织中表达显著降低；图1B为Western blot检测正常与钙化主动脉瓣组织中的smurf1表达，结果显示smurf1蛋白水平在钙化主动脉瓣组织中显著降低；

图2：成骨诱导培养基诱导人主动脉瓣间质细胞成骨分化中smurf1定量分析；

其中图2A为适时荧光定量PCR显示与对照组相比，smurf1在经过成骨诱导培养基诱导0天，1天，3天，5天，7天和14天的人瓣膜间质细胞中表达呈时间依赖性显著降低；图2B为Western blot检测与对照组相比，smurf1蛋白水平在经过成骨诱导培养基诱导0天，1天，3天，5天，7天和14天的人瓣膜间质细胞中表达呈时间依赖性显著降低；

图3：过表达smurf1改善人瓣膜间质细胞在体外成骨分化表型转化图。

其中图3A为茜素红显示与对照组相比，过表达smurf1组人主动脉瓣膜间质细胞钙盐结节明显减少；图3B为钙定量分析显示过表达smurf1后，人主动脉瓣膜间质细胞钙盐沉积明显减少；图3C为碱性磷酸酶活性检测显示，与对照组相比，过表达smurf1组人主动脉瓣膜间质细胞碱性磷酸酶活性明显降低；

图4：敲低smurf1促进人主动脉瓣膜间质细胞成骨分化。

其中图4A为茜素红显示与对照组相比，敲低smurf1组人主动脉瓣膜间质细胞钙盐结节明显增多；图4B为钙定量分析显示敲低smurf1后，人主动脉瓣膜间质细胞钙盐沉积明显增加；图4C为碱性磷酸酶活性检测显示，与对照组相比，敲低smurf1组人主动脉瓣膜间质细胞碱性磷酸酶活性明显增高；

图5：smurf1通过抑制成骨分化标志蛋白Runx2表达发挥抑制人主动脉瓣间质细胞成骨分化的作用。

其中图5A为western blot检测过表达smurf1后Runx2表达变化，结果显示过表达smurf1后，Runx2表达明显下降；图5B为western blot检测敲低smurf1后Runx2表达变化，结果显示敲低smurf1后，Runx2表达明显升高；

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例1、smurf1组织水平表达检测。

本实施例通过收集主动脉瓣钙化患者主动脉瓣组织(轻度钙化组和重度钙化组)及心脏移植患者主动脉瓣组织(对照组)，利用实时荧光定量PCR及western blot方法分别检测主动脉瓣组织中smurf1的mRNA及蛋白表达水平变化，结果显示smurf1的mRNA(图1A)及蛋白(图1B)表达水平在钙化主动脉瓣组织中均显著降低。

实施例2、钙化诱导培养基诱导人瓣膜间质细胞细胞成骨分化细胞模型的构建。

取培养密度70％左右的人瓣膜间质细胞，用含2％胎牛血清的DMEM高糖培养基饥饿过夜，第二日以新配置成骨诱导培养基(50mg/mL维生素C，5mmol/L β-甘油磷酸,100nmol/L地塞米松，溶剂为含2％胎牛血清的高糖DMEM培养基)对人瓣膜间质细胞进行成骨分化诱导。诱导14天后考察不同处理对瓣膜间质细胞成骨分化的影响。

实施例3、成骨诱导培养基诱导抑制人瓣膜间质细胞细胞中smurf1表达。

本实施例通过采用实施例2中方案，分0天，1天，3天，5天，7天，14天不同时间点诱导人瓣膜间质细胞成骨分化后，利用实时荧光定量PCR及western blot方法分别检测不同时间点成骨分化诱导细胞中smurf1的mRNA及蛋白表达水平变化，结果显示smurf1的mRNA(图2A)及蛋白(图2B)表达水平在成骨诱导培养组中均呈时间依赖性显著降低。

实施例4、过表达smurf1可抑制人瓣膜间质细胞成骨分化。

本实施例分离培养了瓣膜间质细胞,构建了smurf1过表达腺病毒。利用过表达腺病毒转染瓣膜间质细胞72小时后,利用成骨分化诱导培养基诱导瓣膜间质细胞天构建体外成骨分化模型。利用茜素红染色、钙定量分析以及碱性磷酸酶活性评估瓣膜间质细胞钙化程度。茜素红染色及钙定量分析显示与对照组相比,过表达smurf1可显著抑制成骨诱导培养基诱导的瓣膜间质细胞钙盐结节(图3A)及钙盐沉积(图3B)增多效应(P＜0.05)。碱性磷酸酶活性检测发现与对照组相比,过表达smurf1可显著抑制成骨诱导培养基诱导的瓣膜间质碱性磷酸酶活性增高效应(图3C)。

实施例5、敲低smurf1可促进人瓣膜间质细胞成骨分化。

本实施例分离培养了瓣膜间质细胞,利用smurf1小干扰RNA(si-smurf1)转染瓣膜间质细胞敲低smurf1后,利用成骨分化诱导培养基诱导瓣膜间质细胞14天构建体外成骨分化模型。利用茜素红染色、钙定量分析以及碱性磷酸酶活性评估瓣膜间质细胞钙化程度。茜素红染色及钙定量分析显示与对照组相比,敲低smurf1可显著促进成骨诱导培养基诱导的瓣膜间质细胞钙盐结节(图4A)及钙盐沉积(图4B)增多效应(P＜0.05)。碱性磷酸酶活性检测发现与对照组相比,敲低smurf1可显著促进成骨诱导培养基诱导的瓣膜间质细胞碱性磷酸酶活性增高(图4C)。

实施例6、smurf1通过抑制Runx2表达抑制人瓣膜间质细胞成骨分化。

本实施例分离培养了瓣膜间质细胞,通过构建smurf1过表达腺病毒，利用过表达腺病毒转染瓣膜间质细胞72小时后,利用成骨分化诱导培养基诱导瓣膜间质细胞14天构建体外成骨分化模型。然后检测成骨分化标志蛋白Runx2表达变化，western blot结果显示过表达smurf1后，Runx2表达明显下降(图5A)。然后利用smurf1小干扰RNA(si-smurf1)转染瓣膜间质细胞敲低smurf1后,利用成骨分化诱导培养基诱导瓣膜间质细胞14天构建体外成骨分化模型。然后检测成骨分化标志蛋白Runx2表达变化，western blot结果显示敲低smurf1后，Runx2表达明显升高(图5B)。

以上结果证实，smurf1能有效抑制人瓣膜间质细胞成骨分化，并通过抑制Runx2表达来发挥抑制瓣膜间质细胞成骨分化作用。

最后需要说明的是，以上实施例仅用于说明本发明而非限制本发明的保护范围。另外，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改或变型，所有的这些等价形式同样属于本申请所要求限定的保护范围之内。

Claims (4)

1.提高smurf1蛋白表达量的试剂在制备防治钙化性主动脉瓣疾病的药物中的应用，其特征在于，所述提高smurf1蛋白表达量的试剂包括以下任一：含有smurf1蛋白编码基因的重组载体；含有smurf1蛋白编码基因的重组病毒；所述提高smurf1蛋白表达量的试剂通过介导成骨分化相关基因RUNX2泛素化降解来抑制瓣膜间质细胞成骨分化的作用，从而延缓瓣膜钙化。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述提高smurf1蛋白表达量的试剂中含有smurf1蛋白编码基因的重组病毒为含有蛋白编码基因的重组慢病毒、重组腺病毒。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述防治钙化性主动脉瓣疾病的药物是由提高smurf1蛋白表达量的试剂与常规药用载体制成的药物组合物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物组合物是胶囊剂、颗粒剂、注射剂、缓释片、口含片或粉针剂。