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CN113604399A - 具有园林植物促生功能的鞘脂菌及其用途 - Google Patents

具有园林植物促生功能的鞘脂菌及其用途 Download PDF

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CN113604399A CN202110985913.3A CN202110985913A CN113604399A CN 113604399 A CN113604399 A CN 113604399A CN 202110985913 A CN202110985913 A CN 202110985913A CN 113604399 A CN113604399 A CN 113604399A
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Abstract

本发明公开了具有园林植物促生功能的鞘脂菌及其用途。该鞘脂菌为江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.21506。江南鞘脂菌3R8的的单位IAA含量为458.66mg/L发酵液，在无机磷平板上溶磷圈与菌落直径比为1.34±0.14。与未接种的阴性对照组相比，能显著提高万寿菊种子发芽率及水稻幼苗的生长，使万寿菊种子发芽率提高了2倍。这表明江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8能够分泌植物生长素IAA，且具有溶磷功能，可作为微生物有机肥，用以改善土壤肥力。

Description

具有园林植物促生功能的鞘脂菌及其用途
技术领域
本发明涉及具有园林植物促生功能的鞘脂菌及其用途。
背景技术
植物根际蕴藏着各种各样的微生物群落，它们在植物的生长和繁殖中起着关键作用。有些根际微生物能通过调控氮循环和植物激素(如生长素等)调控植物的生长和植物的开花时间；具有降解有机污染物，富集重金属，降低土壤中重金属毒性，改善土壤孔隙状况、提高土壤肥力、改善土壤生物学性状的功能，能对病原菌进行生物防治，提高园林植物在盐碱、贫瘠土壤环境和城市特殊空间的生长适应性。微生物资源的开发和利用能够促进园林植物生长，提升城市绿地土壤健康质量，具有广阔的发展前景。
鞘脂杆菌科(Sphingobacteriaceae)已经从土壤，淡水，地下水，海洋，植物表面，根际，甚至极端环境，如污染区，北极和南极土壤，深埋的沉积物以及干旱地区的土壤表面等各种环境分离。在以前的研究中，鞘脂菌属(Sphingobium)的成员据报道能够降解多种天然和人工合成芳香族化合物，例如多环芳烃(PAHs)，木质素衍生的芳香族化合物，杂环芳烃、氯代芳烃磺化芳烃、偶氮化合物和杀虫剂和除草剂等。而鞘脂菌属促生功能方面的研究较少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何促进植物生长和/或促进植物种子萌发。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种鞘脂菌。
本发明所提供的一种鞘脂菌为江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)。
本发明所提供的江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)具体可为江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.21506，下文简称江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8。
江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8为革兰阴性细菌、呈杆状、无芽孢形成。江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8具有序列表中序列1所示的16S rRNA基因。
为解决上述技术问题，本发明还提供了鞘脂菌的培养物。
本发明所提供的鞘脂菌的培养物，是将江南鞘脂菌(Sphingobiumjiangnanensis)3R8在微生物培养基中培养得到的物质(即发酵产物，如含有江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8和分泌到液体培养基内的物质即发酵液，或如含有江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8和分泌到固体培养基内的物质即固体发酵物)。
为解决上述技术问题，本发明还提供了菌剂。
本发明所提供的菌剂含有江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8或/和江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8的代谢物或/和上述培养物。
上述菌剂中，所述菌剂具有下述至少一种功能：
M1)促进植物生长；
M2)促进植物种子萌发；
M3)产生生长素IAA；
M4)溶解磷。
本文中，所述江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8的代谢物可从江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8的发酵液中获得。所述江南鞘脂菌(Sphingobiumjiangnanensis)3R8的代谢物可为江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8的无菌代谢物或江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8的含菌代谢物。江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8的无菌代谢物(无菌发酵滤液)具体可按照如下方法制备，在液体培养基中培养江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8，过滤除去液体培养物(发酵液)中的江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8即得到江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8的无菌代谢物。江南鞘脂菌(Sphingobiumjiangnanensis)3R8的含菌代谢物具体可按照如下方法制备，在液体发酵培养基中培养江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8，收集发酵液(含有江南鞘脂菌(Sphingobiumjiangnanensis)3R8和分泌到液体培养基内的物质)，该发酵液即为江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8的含菌代谢物。
上述菌剂的活性成分可为江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8或/和江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8的代谢物或/和上述培养物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂的效果确定。
上述菌剂中，所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。
所述固体载体可为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料可为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水；所述菌剂中，江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8或/和江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8的代谢物可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。
为解决上述技术问题，本发明还提供了微生态制剂或生物肥料。
本发明所提供的微生态制剂或生物肥料含有所述鞘脂菌、所述培养物或/和所述菌剂上文中，所述产品可为菌剂、微生态制剂或生物肥料。
所述鞘脂菌、所述培养物或所述菌剂或所述生物肥料的下述任一种应用也属于本发明的保护范围：
N1、在促进植物种子萌发中的应用；
N2、在制备促进植物种子萌发的产品中的应用；
N3、在促进植物生长中的应用；
N4、在制备促进植物生长的产品中的应用；
N5、在生产生长素IAA中的应用；
N6、在制备生产生长素IAA的产品中的应用；
N7、在溶解磷中的应用；
N8、在制备溶解磷的产品中的应用。
本文中，所述植物可为下述任一种植物：
P1)双子叶植物或单子叶植物，
P2)菊亚纲植物，
P3)菊目植物或莎草目植物，
P4)菊科植物或禾本科植物，
P5)禾亚科植物，
P6)万寿菊属植物或稻属植物，
P7)万寿菊或水稻。
本发明还提供了制备所述菌剂的方法。
本发明所提供的制备所述菌剂的方法，包括将江南鞘脂菌(Sphingobiumjiangnanensis)3R8或/和江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8的代谢物或/和上述培养物作为菌剂的成分，得到所述菌剂的步骤。
本文中，所述溶解磷可为溶解无机磷。所述促进植物生长可为促进水稻幼苗生长和/或促进万寿菊幼苗的生长。所述促进植物种子萌发可为提高万寿菊种子发芽率。
经分泌IAA试验，溶磷试验及种子发芽试验发现，江南鞘脂菌(Sphingobiumjiangnanensis)3R8的单位IAA含量为458.66mg/L发酵液，在无机磷平板上溶磷圈与菌落直径比为1.34±0.14。与未接种的阴性对照组相比，能显著提高万寿菊种子发芽率及水稻幼苗的生长，使万寿菊种子发芽率提高了2倍。这表明江南鞘脂菌(Sphingobiumjiangnanensis)3R8能够分泌植物生长素IAA，且具有溶磷功能，可作为微生物有机肥，用以改善土壤肥力。
保藏说明
菌种名称：江南鞘脂菌
拉丁名：Sphingobium jiangnanensis
菌株编号：3R8
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2020年12月18日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.21506
附图说明
图1为江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8在R2A平板上培养2d后菌落图片。
图2为根据16S rRNA基因序列构建的江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8与相关模式菌的系统进化树。其中，3R8为江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8。
图3为江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8与Sphingobium属相关模式菌株基因组构建的系统发育进化树。其中，3R8为江南鞘脂菌(Sphingobiumjiangnanensis)3R8。
图4为江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8分泌生长素的定性检测照片。图中，第一行为阳性对照，第二行为阴性对照，第三行为江南鞘脂菌(Sphingobiumjiangnanensis)3R8处理。
图5为江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8在无机磷检测平板(无机磷培养基)上生长3d产生溶磷圈的照片。
图6为水稻幼苗移栽后一个月的照片。左侧花盆为对照组，右侧花盆为试验组。
图7为万寿菊幼苗移栽30d后的照片。左侧花盆为试验组，右侧花盆为对照组。
具体实施方式
本研究采用多相分类方法确定百子莲根际细菌3R8的分类地位，对其分泌IAA、溶磷功能进行研究，并通过种子发芽试验检测其促生功能，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用的培养基配置方法如下：
1/50R2A固体培养基:酵母浸出粉0.01g，蛋白胨0.01g，酪蛋白水解物0.01g，葡萄糖0.01g，可溶性淀粉0.01g，磷酸二氢钾0.0006g，七水硫酸镁0.00048g，丙酮酸钠0.006g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1000mL，调节pH 7.2±0.2，121℃灭菌15min。
R2A液体培养基：酵母浸出粉0.5g，蛋白胨0.5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸二氢钾0.3g，七水硫酸镁0.024g，丙酮酸钠0.3g，用蒸馏水定容至1000mL，调节pH 7.2±0.2，121℃灭菌15min。
产IAA液体发酵培养基：酵母浸出粉0.5g，蛋白胨0.5g，酪蛋白水解物0.5g，葡萄糖0.5g，可溶性淀粉0.5g，磷酸二氢钾0.3g，七水硫酸镁0.024g，丙酮酸钠0.3g，L-色氨酸0.2g，用蒸馏水定容至1000mL，调节pH 7.2±0.2，121℃灭菌15min。
无机磷培养基：氯化钠0.3g，葡萄糖10g，氯化钾0.3g，磷酸三钙5g，硫酸铵0.5g，七水合硫酸镁0.3g，硫酸锰0.03g，七水合硫酸亚铁0.03g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1 000mL，调节pH 7.0-7.2，121℃灭菌30min。
实施例1、菌株3R8的分离与鉴定
1、菌株3R8的分离
在上海市园林科学规划研究院邬桥基地(30°58'N，121°25'E)采集百子莲根际土壤样品，带回实验室4℃保存。抖落附着于植物根上的土壤，仅保留紧密粘附在根表面的根际土，称取2g带有根际土的植物根至于无菌研钵研磨，充分研磨后转至装有玻璃珠和50ml无菌水的150ml锥形瓶中，室温150r/min振荡30min，取1mL稀释液用无菌水进行系列稀释，取100μL系列稀释液涂布于1/50R2A平板，30℃倒置培养1周，根据生理形态特点，用竹签将挑取单菌落，接在平板上纯化，确定为纯菌后，转入斜面4℃短期保存，转入25％甘油管，-80℃长期保存。将其中一株分离纯化菌株命名为菌株3R8。
2、菌株3R8的鉴定
2.1菌株形态学鉴定
将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化得到的菌株3R8进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、菌落表面状态、菌落边缘状态。根据制造商的说明使用索莱宝公司革兰氏染色试剂盒对菌株3R8进行涂片革兰氏染色，采用光学显微镜观察菌体的形态。
结果表明在R2A平板培养48小时后，菌株3R8的菌落为黄色，直径2-3mm，凸起，圆形且光滑，边缘完整(图1)；菌株3R8细胞革兰氏阴性，呈杆状，无芽孢形成。
2.2分子鉴定
按说明书方法操作，用天根公司TIANamp细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，使用细菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行16S rRNA基因扩增。25μL PCR扩增体系：2×Taq PCR Mix12.5μL，27F(10μmol/L)1μL，1492R(10μmol/L)1μL，ddH2O 8.5μL，2μL DNA模板。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸90s，30个循环；72℃终延伸10min。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段为1400bp左右，电泳验证后，将阳性结果PCR产物送往北京擎科生物科技有限公司进行测序。测序得到的序列上传到Ezbiocloud(www.ezbiocloud.net/eztaxon)进行序列比对。
菌株3R8的16S rRNA基因的测序长度为1,387bp，与EzBioCloud的序列比对结果显示菌株3R8是Sphingobium属的成员，和Sphingobium limneticum DSM25076(T)(97.84％)，Sphingobium vermicomposti DSM 21299(T)(97.04％)的序列具有高度相似性，与Sphingobium属的其他物种的模式菌序列相似性＜97％。可初步确定菌株3R8为Sphingobium属中的新种。从EzBioCloud服务器检索了那些密切相关的16S rRNA基因序列，并使用clustal W程序进行了比对。使用MEGA 7软件通过邻近法(Neighbour-Joining)构建系统发育树。使用Kimura two-parameter模型计算NJ法的进化距离，Bootstrap值为1000次时，形成的发育树如附图2所示。菌株3R8与Sphingobium limneticum聚在同一个分支。
2.3基因组分析
基因组DNA送至安诺优达基因科技有限公司，使用Illumina NovaSeq 6000测序系统对菌株3R8基因组草图测序。使用Unicycler v0.4.7进行组装，得到81个重叠群，覆盖率约为232×，N50长度为157538bp。基因组4.73Mb，G+C含量为64.0mol％，在http://jspecies.ribohost.com/jspeciesws/#analyse网站上计算平均核苷酸同一性(ANI)。使用基因组到基因组距离计算器(GGDC)2.0服务器(http://ggdc.dsmz.de/distcalc.php)通过基因组与基因组的序列比较计算菌株3R8与参考菌株之间的数字DNA-DNA杂交(dDDH)值。基于菌株3R8的16S rRNA基因序列的相似性和系统发育分析，Sphingobium limneticumDSM25076(T)和Sphingobium vermicomposti DSM 21299(T)被选定为参考菌株对生理测试和化学分类分析。
与其他具有公开基因组序列的Sphingobium属物种的菌株相比，ANI的值为77.08-88.79％，低于95-96％的先前为物种划界提出的临界值，3R8及其模式菌株的dDDH值在21.3-41.1％之间，远低于70％的物种划分阈值。ANI和dDDH的结果都支持菌株3R8为Sphingobium属的一个新种。
表1.菌株3R8与其近缘菌株ANI及dDDH值
3R8 ANI(％) dDDH(％)
Sphingobium cupriresistens 88.79 41.1
Sphingobium paulinellae 83.51 28.9
Sphingobium limneticum 83.51 28.9
Sphingobium algicola 83.50 28.9
Sphingobium terrigena 80.74 24.9
Sphingobium xenophagum 80.01 24.3
Sphingobium hydrophobicum 79.97 24.2
Sphingobium yanoikuyae 79.69 24.2
Sphingobium amiense 79.34 24.1
Sphingobium indicum 78.72 23.3
Sphingobium francense 78.54 23.3
Sphingobium chlorophenolicum 78.27 23.1
Sphingobium aromaticivastans 78.15 22.4
Sphingobium vermicomposti 77.08 21.3
为了进一步探讨菌株3R8与Sphingobium属相关种的关系，利用最新的细菌核心基因集(UBCG)管道重建系统发育树。根据92个细菌核心基因序列的系统发育树显示3R8在Sphingobium属中形成了一个独特的系统发育谱系(图3)，这表明菌株3R8应归属于Sphingobium属的一个新物种。
2.4生理学和化学分类鉴定
氧化酶和过氧化氢酶活性分别通过法国梅里埃(API)氧化酶测定试剂盒和在3％(v/v)的H2O2溶液中产生气泡来确定。使用法国梅里埃公司API 20NE和API ZYM试剂盒(bioMérieux)确定菌株3R8和相关模式菌株的生理特性。美国BIOLOG公司的GEN IIIMicroPlates用于确定碳源的氧化和对抑制性化合物的敏感性。
结果表明菌株3R8过氧化氢酶阴性、氧化酶阳性。20NE试验结果显示菌株3R8的硝酸盐还原反应呈阴性，不能产生吲哚，能水解七叶灵，半乳糖苷酶阳性，葡萄糖、阿拉伯糖、麦芽糖、苹果酸和柠檬酸同化反应阳性，葡萄糖发酵阴性，精氨酸双水解酶阴性，不能水解脲素和明胶，甘露糖、甘露醇、N-乙酰-葡萄糖胺、葡萄糖酸钠、癸酸、己二酸和苯乙酸同化反应阴性，ZYM酶活鉴定试验中，类脂酶(C4)、类脂酶(C8)、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、胰凝乳蛋白酶、β-半乳糖甙酶、β-糖醛酸甙酶、酸性和碱性磷酸酶、萘酚-AS-BI磷酸水解酶、α-葡萄糖甙酶和β-葡萄糖甙酶阳性，类脂酶(C14)、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、α-半乳糖甙酶、α-甘露糖甙酶和β-岩藻糖甙酶阴性。可以利用葡聚糖、D-纤维二糖、D-松二糖、β-甲酰-D葡萄糖苷、D-水杨甙、α-D-葡萄糖、D-半乳糖、D-海藻糖、L-海藻糖、L-鼠李糖、D-山梨醇、D-葡萄糖-6-磷酸、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-半乳糖酸、葡萄糖醛酸、奎尼酸、α-酮-戊二酸、L-羟基丁二酸、溴-琥珀酸、β-羟基-D,L-丁酸、乙酰乙酸、醋酸和甲酸作为碳源，可以在1％乳酸钠、利福霉素SV、洁霉素、四唑蓝、萘啶酮酸、亚碲酸钾和氨曲南存在条件下生长。菌株3R8与相关模式菌种的差异特征见表2。
结果表明菌株3R8和模式菌株Sphingobium vermicomposti DSM 21299在如下33项生理生化特征方面存在明显差别：
1)菌株3R8能同化阿拉伯糖、麦芽糖、苹果酸和柠檬酸，模式菌株Sphingobiumvermicomposti DSM 21299不能；
2)菌株3R8胞外酶谱中含胰凝乳蛋白酶、β-糖醛酸甙酶和α-葡萄糖甙酶，不含胰蛋白酶，模式菌株Sphingobium vermicomposti DSM 21299胞外酶谱中不含胰凝乳蛋白酶、β-糖醛酸甙酶和α-葡萄糖甙酶，含胰蛋白酶；
3)菌株3R8能利用葡聚糖、D-纤维二糖、D-葡萄糖-6-磷酸、氨基乙酰-L-脯氨酸、L-天冬氨酸、奎尼酸、β-甲酰-D葡萄糖苷、D-水杨甙、D-山梨醇、α-酮-戊二酸、L-半乳糖酸、L-羟基丁二酸、甲酸作为碳源，模式菌株Sphingobium vermicomposti DSM21299不能利用这些物质，菌株3R8不能利用α-D-乳糖、L-焦谷氨酸、D-果糖、3-甲酰-葡萄糖、D-果糖-6-磷酸、半乳糖醛酸和葡糖醛酰胺作为碳源，模式菌株Sphingobium vermicomposti DSM 21299能利用；
4)在1％乳酸钠、四唑蓝、氨曲南和亚碲酸钾存在条件下，菌株3R8能生长，而模式菌株Sphingobium vermicomposti DSM 21299不能生长，四唑紫能抑制菌株3R8生长，不能抑制模式菌株Sphingobium vermicomposti DSM 21299生长。
菌株3R8和模式菌株Sphingobium limneticum DSM25076(T)在如下21项生理生化特征方面存在明显差别：
1)菌株3R8能同化柠檬酸和麦芽糖，模式菌株Sphingobium limneticum DSM25076(T)不能同化柠檬酸和麦芽糖；
2)菌株3R8胞外酶谱中含胰凝乳蛋白酶、β-糖醛酸甙酶和β-半乳糖甙酶，不含胰蛋白酶，模式菌株Sphingobium limneticum DSM25076(T)胞外酶谱中含胰蛋白酶，不含胰凝乳蛋白酶、β-糖醛酸甙酶或β-半乳糖甙酶；
3)菌株3R8不能利用龙胆二糖、D-海藻糖、D-蜜二糖、L-丝氨酸、L-丙氨酸、半乳糖醛酸和葡糖醛酰胺作为碳源，模式菌株Sphingobium limneticum DSM25076(T)能利用这些物质，菌株3R8能利用D-山梨醇和α-酮-戊二酸作为碳源，而模式菌株Sphingobiumlimneticum DSM25076(T)不能利用；
4)在利福霉素SV和亚碲酸钾存在条件下，菌株3R8能生长，而模式菌株Sphingobium limneticum DSM25076(T)不能生长，醋竹桃霉素、二甲胺四环素、D-丝氨酸和四唑紫能抑制菌株3R8生长，不能抑制模式菌株Sphingobium limneticum DSM25076(T)生长。
表2.菌株3R8与相关模式菌种的差异特征
Figure BDA0003226612800000091
注：+，阳性或可利用；-，阴性或不可利用；w，弱阳性。
使用在30℃的R2A琼脂上生长2天的细胞测定菌株3R8及2个近缘菌的脂肪酸谱，使用Sherlock微生物鉴定系统(MIDI)分析了从在30℃下在R2A上生长2天的细胞中获得的脂肪酸甲酯。MIDI分析结果见表3，菌株3R8的主要脂肪酸(>5％)是第8特征类型(C18:1ω6c和/或C18:1ω7c)、第3特征类型(C16:1ω6c和/或C16:1ω7c)、C16:0、C17:1ω6c和C14:0 2OH，结果表明菌株3R8和近缘菌Sphingobium limneticum DSM25076(T)和Sphingobium vermicompostiDSM21299(T)脂肪酸组成成分基本相同，但含量存在较大差异。
表3.菌株3R8以及其类型菌株的细胞脂肪酸组成
Figure BDA0003226612800000101
注：所示数值为总脂肪酸的百分比。tr，痕量(<1％)。特征类型是由MIDI系统无法通过GLC分离的两种或三种脂肪酸组成的混合物，第3特征类型包括C16:1ω6c和/或C16:1ω7c，第8特征类型包括C18:1ω6c和/或C18:1ω7c。
综上所述，菌株3R8与Sphingobium limneticum 301(T)的16S rRNA相似性为97.84％，与Sphingobium vermicomposti VC-230(T)的16S rRNA相似性为97.04％，与Sphingobium属的其他物种的模式菌16S rRNA序列相似性＜97％；菌株3R8与Sphingobium属物种的菌株相比，ANI的值为77.08-88.79％，低于95-96％先前为物种划界提出的临界值，菌株3R8及其模式菌株的dDDH值在21.3-41.1％之间，远低于70％的物种划分阈值；并且生理生化特征及脂肪酸含量差别较大，因此可以确定菌株3R8为Sphingobium属的新种，命名为Sphingobium jiangnanensis，其中文名称为江南鞘脂菌。该江南鞘脂菌(Sphingobiumjiangnanensis)3R8已于2020年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.21506。以下简称为江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8。
实施例2、江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8的分泌生长素的定性检测和定量分析
1、定性检测
江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8活化后接种于产IAA液体发酵培养基中，35℃、180r/min震荡培养2d，12 000r/min离心10min后取100μL上清液滴在在白瓷板上，加入等体积Salkowski比色液进行显色反应。以100μL IAA水溶液(100mg/L)和不加菌的产IAA液体发酵培养基分别作为阳性对照和阴性对照。白瓷板于室温下，避光条件下放置30min后观察，若出现粉红色则为阳性，说明该菌株能够分泌IAA。实验设三次重复。
定性检测结果显示，在江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8发酵液的上清液中滴加Salkowski比色液后，混合液颜色变红色(图4)，表明江南鞘脂菌(Sphingobiumjiangnanensis)3R8能够分泌植物生长激素IAA。
2、定量分析
标准曲线的制作：取适量IAA加少量乙醇溶解后，用蒸馏水稀释，配置浓度为0、25、50、100、200、250mg/L的IAA标准溶液，并按体积比1∶1与Salkowski比色液混合，室温避光放置30min，然后分别测定各浓度的OD530nm(以蒸馏水与Salkowski比色液的1∶1混合溶液为空白对照)。最后以IAA浓度为横坐标，OD530 nm为纵坐标作图，即得到IAA标准曲线。
菌液中IAA浓度的测定：江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8活化后在产IAA液体发酵培养基中35℃、180r/min震荡培养72h后测定发酵液的OD600值，并将发酵液12 000rpm离心10min，取上清液与等体积的Salkowski比色液混合。室温下避光放置30min，测定其OD530 nm值(以未接菌的产IAA液体发酵培养基与等体积Salkowski比色液的混合溶液为对照)。通过IAA浓度与OD530 nm的标准关系曲线计算相应的IAA浓度。并根据OD600 nm值，按照公式计算单位IAA产量:
单位IAA产量(mg/L)＝发酵液中IAA含量/发酵液OD600 nm值。
经检测IAA含量标准曲线回归方程为:y＝0.013x+0.0672，相关系数R2＝0.9934，培养72h后江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8的OD600 nm值为0.46，其上清液与Salkowski比色液混合OD530 nm为2.81，江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8菌悬液的单位IAA含量为458.66mg/L。
实施例3、江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8的溶磷特性
溶磷特性测定：将江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8接种于无机磷培养基上，30℃培养4-6d，观察有无溶磷圈产生，测量溶磷圈直径(d2)和菌落直径(d1)，计算溶磷圈与菌落直径比(d2/d1)。比值越大，表示溶磷能力越强。结果表明在无机磷检测平板(无机磷培养基)上生长3d，江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8的溶磷圈与菌落直径比为1.34±0.14(图5)。表明江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8可以溶解无机磷。
实施例4、江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8促进植物生长
1、促进万寿菊种子萌发
挑取江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8单菌落接种于含100mL R2A液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃，150rpm摇床中培养48h。10000r/min离心5min，收集菌体，用无菌水制成OD600nm＝0.1的菌悬液(以无菌水作为空白对照)。挑选长势相对一致的万寿菊种子置于底部铺置滤纸的9cm的平板中，每个平板放10粒种子，加10ml菌悬液(试验组)，阴性对照加10ml无菌水，将其置于30℃恒温培养箱。每组三次重复，每次重复3个平板。跟踪观察万寿菊发芽情况，记录发芽数，分析江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8对万寿菊种子发芽的促进效果。
发芽率％＝(指定天数的发芽种子数/供试种子数)×100％。
结果表明培养7d后，阴性对照种子发芽率为20％，试验组种子发芽率为60％，表明江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8能显著提高万寿菊种子发芽率，使万寿菊种子发芽率提高了2倍。
2、促进水稻及万寿菊幼苗生长
挑取江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)3R8单菌落接种于含100mL R2A液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃，150rpm摇床中培养48h。10000r/min离心5min，收集菌体，用无菌水制成OD600nm＝0.1的菌悬液(以无菌水作为空白对照)。
挑选长势相近的水稻及万寿菊幼苗，移栽于花盆中，每盆4-5株。设置试验组及对照组CK各3盆。进行菌悬液灌根处理，每周每盆浇灌菌悬液(试验组)或无菌水25mL(对照组)1次。植物生长期间每2-3d浇水一次。实验在智能温室中进行。日夜温度分别为25℃/20℃，日照时间为14h。移栽30d后，观测植株长势。
水稻幼苗盆栽结果如表4和图6所示，实验组根茎鲜重、根长、根和茎干重与对照组相比分别增长了125.0％、25.7％、66.6％、77.8％和38.3％,显著优于对照组，试验结果表明3R8对水稻幼苗具有明显促生作用。
表4.水稻幼苗盆栽实验测定结果
组别 根重 茎重 根长 茎长 根干重 茎干重
实验组1 0.57 1.03 24.3 33.4 0.34 0.55
实验组2 0.78 1.57 25.2 33.9 0.29 0.72
实验组3 0.66 1.52 28 33.5 0.31 0.69
实验组4 0.54 1.16 30 32.9 0.33 0.64
实验组 0.63±0.11a 1.32±0.27a 26.88±2.61a 33.42±0.41a 0.32±0.02a 0.65±0.07a
对照组1 0.27 0.94 17.2 27 0.19 0.47
对照组2 0.27 1.32 16.1 30.3 0.17 0.45
对照组3 0.24 0.78 15.6 29.5 0.17 0.45
对照组4 0.35 1.16 15.6 31.8 0.17 0.52
平均值 0.28±0.05b 1.05±0.24b 16.13±0.75b 29.65±2.01a 0.18±0.01b 0.47±0.03b
注：P＜0.05，同列小写数字不同表示差异显著。
万寿菊幼苗盆栽结果如表5和图7所示，除根长外，试验组其他指标显著优于对照组。试验结果表明3R8对万寿菊幼苗具有明显促生作用。
表5.万寿菊幼苗盆栽实验测定结果
组别 根重/g 茎重/g 根长/cm 茎长/cm 根干重/g 茎干重/g
试验组1 0.74 1.47 17.43 16.00 0.35 0.92
试验组2 1.47 1.45 15.63 16.50 0.46 1.03
试验组3 1.07 1.50 22.00 18.55 0.44 1.16
试验组 1.09±0.36a 1.47±0.02a 18.35±3.29a 17.02±1.35a 0.42±0.06a 1.04±0.12a
对照组1 0.49 0.88 20.75 13.25 0.26 0.65
对照组2 0.37 0.70 22.00 11.50 0.21 0.47
对照组3 0.30 0.69 23.50 12.88 0.14 0.52
对照组 0.38±0.09b 0.76±0.11b 22.08±1.38a 12.54±0.92b 0.2±0.06b 0.55±0.09b
注：P＜0.05，同列小写数字不同表示差异显著。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 上海市园林科学规划研究院；中国农业科学院农业资源与农业区划研究所
<120> 具有园林植物促生功能的的鞘脂菌及其用途
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1387
<212> DNA
<213> 江南鞘脂菌（Sphingobium jiangnanensis）
<400> 1
aacggggggg acgctatact gcagtcgaac gagaccttcg ggtctagtgg cgcacgggtg 60
cgtaacgcgt gggaatctac ccttgggttc ggaataacgt cgggaaactg acgctaatac 120
cggatgatga cgaaagtcca aagatttatc gcccagggat gagcccgcgt aggattagct 180
agttggtggg gtaaaggctc accaaggcta cgatccttag ctggtctgag aggatgatca 240
gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatattg 300
gacaatgggg gcaaccctga tccagcaatg ccgcgtgagt gatgaaggcc ttagggttgt 360
aaagctcttt tacccgagat gataatgaca gtatcgggag aataagctcc ggctaactcc 420
gtgccagcag ccgcggtaat acggagggag ctagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa 480
gcgcacgtag gcggcgattt aagtcagagg tgaaagcccg gggctcaacc ccggaactgc 540
ctttgagact ggattgctag aatcttggag aggcgggtgg aattccgagt gtagaggtga 600
aattcgtaga tattcggaag aacaccagtg gcgaaggcgg cccgctggac aagtattgac 660
gctgaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta 720
aacgatgata actagctgct ggggcacatg gtgtttcagt ggcgcagcta acgcattaag 780
ttatccgcct ggggagtacg gtcgcaagat taaaactcaa aggaattgac gggggcctgc 840
acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcgc agaaccttac caacgtttga 900
catccctatc gcggatcgtg gagacacttt ccttcagttc ggctggatag gtgacaggtg 960
ctgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca 1020
accctcgcct ttagttgcca tcatttagtt gggtactcta aaggaaccgc cggtgataag 1080
ccggaggaag gtggggatga cgtcaagtcc tcatggccct tacgcgttgg gctacacacg 1140
tgctacaatg gcgactacag tgggcagcca ctccgcgagg aggagctaat ctccaaaagt 1200
cgtctcagtt cggatcgttc tctgcaactc gagagcgtga aggcggaatc gctagtaatc 1260
gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccaggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1320
atgggagttg gattcactcg aaggcgttga gctaaccgca aggaggcagg cgaccacagg 1380
catggcg 1387

Claims (10)

1.鞘脂菌，其特征在于：所述鞘脂菌为江南鞘脂菌(Sphingobium jiangnanensis)。
2.根据权利要求1所述的鞘脂菌，其特征在于：所述鞘脂菌为江南鞘脂菌(Sphingobiumjiangnanensis)3R8，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.21506。
3.权利要求1或2所述的鞘脂菌的培养物，是将权利要求1所述的鞘脂菌在微生物培养基中培养得到的物质。
4.菌剂，其特征在于：所述菌剂含有权利要求1或2所述的鞘脂菌或/和权利要求1或2所述鞘脂菌的代谢物或/和权利要求3所述的培养物。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于：所述菌剂具有下述至少一种功能：
M1)促进植物生长；
M2)促进植物种子萌发；
M3)产生生长素IAA；
M4)溶解磷。
6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于：所述植物为下述任一种植物：
P1)双子叶植物或单子叶植物，
P2)菊亚纲植物，
P3)菊目植物或莎草目植物，
P4)菊科植物或禾本科植物，
P5)禾亚科植物，
P6)万寿菊属植物或稻属植物，
P7)万寿菊或水稻。
7.微生态制剂或生物肥料，其特征在于：所述微生态制剂或生物肥料含有权利要求1或2所述的鞘脂菌、权利要求3所述的培养物或/和权利要求4、5或6所述的菌剂。
8.权利要求1或2所述的鞘脂菌、权利要求3所述的培养物或权利要求4、5或6所述的菌剂或权利要求7所述的生物肥料的下述任一种应用：
N1、权利要求1或2所述的鞘脂菌、权利要求3所述的培养物或权利要求4、5或6所述的菌剂或权利要求7所述的生物肥料在促进植物种子萌发中的应用；
N2、权利要求1或2所述的鞘脂菌、权利要求3所述的培养物或权利要求4、5或6所述的菌剂或权利要求7所述的生物肥料在制备促进植物种子萌发的产品中的应用；
N3、权利要求1或2所述的鞘脂菌、权利要求3所述的培养物或权利要求4、5或6所述的菌剂或权利要求7所述的生物肥料在促进植物生长中的应用；
N4、权利要求1或2所述的鞘脂菌、权利要求3所述的培养物或权利要求4、5或6所述的菌剂或权利要求7所述的生物肥料在制备促进植物生长的产品中的应用；
N5、权利要求1或2所述的鞘脂菌、权利要求3所述的培养物或权利要求4、5或6所述的菌剂或权利要求7所述的生物肥料在生产生长素IAA中的应用；
N6、权利要求1或2所述的鞘脂菌、权利要求3所述的培养物或权利要求4、5或6所述的菌剂或权利要求7所述的生物肥料在制备生产生长素IAA的产品中的应用；
N7、权利要求1或2所述的鞘脂菌、权利要求3所述的培养物或权利要求4、5或6所述的菌剂或权利要求7所述的生物肥料在溶解磷中的应用；
N8、权利要求1或2所述的鞘脂菌、权利要求3所述的培养物或权利要求4、5或6所述的菌剂或权利要求7所述的生物肥料在制备溶解磷的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述植物为下述任一种植物：
P1)双子叶植物或单子叶植物，
P2)菊亚纲植物，
P3)菊目植物或莎草目植物，
P4)菊科植物或禾本科植物，
P5)禾亚科植物，
P6)万寿菊属植物或稻属植物，
P7)万寿菊或水稻。
10.制备权利要求4、5或6所述的菌剂的方法，包括将权利要求1或2所述的鞘脂菌或/和权利要求1或2所述鞘脂菌的代谢物或/和权利要求3所述的培养物作为菌剂的成分，得到所述菌剂的步骤。
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