CN113599505A - 胶原蛋白在制备治疗/预防中高度近视的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了胶原蛋白在制备治疗/预防中高度近视的药物中的应用，所述药物靶向Collagen alpha‑1(XII)chain蛋白。从生物力学角度探究人眼不同近视度数人群角膜蛋白差异，找出高度、中度与低度近视人群中，和生物力学相关的角膜差异蛋白，发现中、高度近视人员与低度近视人员的角膜基质中的胶原蛋白Collagen alpha‑1(XII)chain蛋白的表达水平具有明显差异，为胶原蛋白Collagen alpha‑1(XII)chain蛋白作为治疗/预防中高度近视的药物靶点提供了重要理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域。更具体地说，本发明涉及一种胶原蛋白在制备治疗/预防中高度近视的药物中的应用。
背景技术
近视是一种全球性高发疾病，高度近视是引起我国青少年人群低视力的主要原因之一。高度近视，又称进行性近视，是与单纯性近视完全不同的另外一种眼病，随着年龄的增长，眼睛前后轴不断加长，眼球后部扩大，伴有眼底脉络视网膜的退行性变化，戴眼镜以后视力也难以矫正到正常，视力逐惭减退，以至会发生严重障碍的危害。
目前近视发生发展的机制尚不明了，以致至今尚无有效的预防和从机理上入手治疗中高度近视的手段。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种胶原蛋白作为靶点在制备治疗/预防中高度近视的药物中的应用。
本发明的还有一个目的是提供一种治疗/预防中高度近视的药物。
本发明的还有一个目的是提供一种治疗/预防中高度近视的药物组合物。
本发明的还有一个目的是提供一种胶原蛋白在制备中高度近视的检测试剂中的应用。
为了实现根据本发明的目的和其它优点，提供了一种胶原蛋白在制备治疗/预防中高度近视的药物中的应用，所述药物靶向Collagen alpha-1(XII)chain蛋白。
优选的是，所述的胶原蛋白在制备治疗/预防中高度近视的药物中的应用，所述药物靶向角膜基质中的Collagen alpha-1(XII)chain蛋白。
优选的是，所述的胶原蛋白在制备治疗/预防中高度近视的药物中的应用，所述药物能够调节Collagen alpha-1(XII)chain蛋白的表达量。
优选的是，所述的胶原蛋白在制备治疗/预防中高度近视的药物中的应用，所述药物能够提高Collagen alpha-1(XII)chain蛋白的表达量。
优选的是，所述的胶原蛋白在制备治疗/预防中高度近视的药物中的应用，所述药物能够提高角膜基质中Collagen alpha-1(XII)chain蛋白的表达量。
本发明还提供一种治疗/预防中高度近视的药物，所述药物能够提高Collagenalpha-1(XII)chain蛋白的表达量。
本发明还提供一种治疗/预防中高度近视的药物组合物，包括Collagen alpha-1(XII)chain蛋白促进剂以及靶向剂，所述Collagen alpha-1(XII)chain蛋白促进剂负载于所述靶向剂上，所述靶向剂靶向Collagen alpha-1(XII)chain蛋白。
本发明还提供一种胶原蛋白在制备中高度近视的检测试剂中的应用，所述检测试剂以Collagen alpha-1(XII)chain蛋白作为中高度近视的生物标记物。。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明从生物力学角度探究人眼不同近视度数人群角膜蛋白差异，找出高度、中度与低度近视人群中，和生物力学相关的角膜差异蛋白，发现中、高度近视人员与低度近视人员的角膜基质中的胶原蛋白Collagen alpha-1(XII)chain蛋白的表达水平具有明显差异，低度近视人员的Collagen alpha-1(XII)chain蛋白的相对表达量要显著高于中度近视人员和高度近视人员；结果表明Collagen alpha-1(XII)chain蛋白可作为治疗/预防中高度近视的重要靶点，Collagen alpha-1(XII)chain胶原蛋白可改善近视患者的角膜生物力学特性，调整Collagen alpha-1(XII)chain蛋白含量，改善患者屈光状况、改善角膜生物力学性质，进而达到治疗/预防中高度近视的效果(延缓近视进展)，以上发现对医学界中近视药物开发具有重要的意义；本发明为往后中高度近视的早期诊断、预后判断和早期干预治疗提供了重要的参考依据，具有较大的实际临床价值。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明中TMT分析Collagen alpha-1(XII)chain蛋白含量在三组近视人群中的差异图；
图2为本发明中PRM验证Collagen alpha-1(XII)chain蛋白含量在三组近视人群中的差异图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
<实验例1>
应用TMT标记技术筛选差异表达蛋白
(1)蛋白质提取和肽段酶解：选取天津市眼科医院2019年4月到2019年7月年行SMILE手术的高度、中度、低度近视患者各9例(得到天津市眼科医院伦理委员会的批准)，收集SMILE手术中取出的角膜基质，采用SDT(4％(w/v)SDS，100mM Tris/HCl pH7.6，0.1MDTT)裂解法提取每例角膜基质样品中的蛋白质，然后采用BCA法进行蛋白质定量，每个样品取量蛋白质采用Filter aided proteome preparation(FASP)方法进行胰蛋白酶酶解，肽段定量(OD2800)。
(2)TMT标记：各样品分别去100μg肽段，按照Thermo公司TMT标记试剂盒说明书进行标记。
(3)肽段分级：将每组(高度近视组、中度近视组、低度近视组)标记后的肽段等量混合，采用High pH Reversed-Phase Peptide Fractionation kit进行分级。首先采用乙腈和0.1％三氟乙酸(TFA)进行柱平衡，然后将混合的标记肽段样品上样，加入纯水后低速离心进行脱盐处理，最后采用浓度依次增加的高pH乙腈溶液对柱结合肽段进行梯度洗脱，每份洗脱的肽段样品真空干燥后用12μL 0.1％FA复溶冻干样品，OD280测定肽段浓度。
(4)数据采集：每份肽段分级样品采用纳升流速的HPLC液相系统Eacy nLC进行分离。缓冲液A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱以95％的A液平衡，样品由自动进样器上样到上样柱(Thermo Scientific AcclaimPepMap100，100μm*2cm，nanoViperC18)，经过分析柱(Thermo scientific EASY column，10cm，ID75μm，3μm，C18-A2)分离，流速为300nL/min。
样品经色谱分离后用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析，检测方式为正离子、母离子扫描范围300-1800m/z，一级质谱分辨率为70,000at 200m/z，AGC(Automatic gaincontrol)target为1e6，Maximum IT为50ms，动态排除时间(Dynamic exclusion)为60.0s。多肽和多肽碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描(full scan)后采集20个碎片图谱(MS2 scan)，MS2 Activation Type为HCD，lsolation window为2m/z，二级质朴分辨率17500at 200m/z(TMT 6-plex)或者35,000at 200m/z(TMT 10-plex)，NormalizedColision Energy为30ev，Underfill为0.1％。
(5)蛋白质鉴定和定量分析：质谱分析原始数据为RAW文件，用软件Mascot2.2和Proteome Discoverer1.4进行查库鉴定及定量分析。相关参数和说明如表1所示：
表1
(6)差异蛋白筛选：采用Perseus软件进行单因素方差分析，以组间蛋白差异倍数大于1.2倍且p<0.05的筛选标准，筛选出差异表达蛋白质，具体的：按照上述筛选标准，筛选高度近视组与低度近视组的差异表达蛋白集合1，以及中度近视组与低度近视组的差异表达蛋白集合2，然后筛选出差异表达蛋白集合1与差异表达蛋白集合2的并集，即为目标差异表达蛋白；对所鉴定的差异表达蛋白进行生物信息学分析，筛选有潜在研究前景的候选差异表达蛋白。
TMT试验结果表明，(如图1所示)，Collagen alpha-1(XII)chain蛋白在低度近视组表达均值为1.12，中度近视组为1.01，高度近视组为0.89；中度度近视/低度近视组＝1.01/1.12＝0.90，p＝0.046，高度近视/低度近视＝0.89/1.12＝0.79，p＝0.003，即Collagen alpha-1(XII)chain蛋白在高度近视人群、中度近视人群中的表达与低度近视人群中的表达具有明显差异，低度近视组人群中Collagen alpha-1(XII)chain蛋白的表达显著高于中度近视组和高度近视组，因此，可选择Collagen alpha-1(XII)chain蛋白作为潜在的差异蛋白。
使用平行反应监测(Parallel reaction monitoring，PRM)技术靶向验证候选蛋白在不同度数近视眼角膜中的表达差异。所有研究对象均无其他角膜疾病，不影响角膜基质蛋白结果分析。本研究通过天津市眼科医院伦理委员会审核批准。筛选高度近视人群、中度近视人群和低度近视人群的眼角膜基质中差异表达的蛋白。
<实施例2>
应用PRM相对定量计算验证上述筛选的潜在的差异蛋白(Collagen alpha-1(XII)chain蛋白)
(1)选取天津市眼科医院2019年4月到2019年7月年行SMILE手术的高度、中度、低度近视患者各9例(得到天津市眼科医院伦理委员会的批准)，收集SMILE手术中取出的角膜基质，并对每例的角膜基质进行蛋白提取、胰蛋白酶酶解成肽段；
(2)每组随机选取一例，分别取适量酶解后肽段，等量混合成一个Pool样品，去1μgPool混合肽段，采用HPLC系统进行色谱分离，缓冲液:A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)，色谱柱以95％的A液平衡，样品经过色谱分析柱进行梯度分离，液相分离梯度如下：0分钟---2分钟，B液线性梯度从5％到10％，2分钟---45分钟，B液线性梯度从10％到30％；45分钟---55分钟，B液线性梯度从30％到100％；55分钟----60分钟，B液线性梯度维持100％；
(3)Pool样品经高效液相色谱分离后用Q-Exactive HF质谱仪(ThermoScientific)进行质谱分析。分析时长：60min，检测方式：正离子,母离子扫描范围：300-1800m/z，一级质谱分辨率：60,000atm/z 200，AGC target：3e6，一级Maximum IT：50ms。肽段二级质谱分析按照下列方法采集:每次全扫描(full scan)后触发采集20个二级质谱图谱(MS2 scan)，二级质谱分辨率：15,000at m/z200，AGC target：1e5，二级Maximum IT：50ms，MS2Activation Type：HCD,Isolation window:1.6Th,Normalized collisionenergy：27。LC-MS/MS采取靶向shotgun扫描模式，对目标蛋白的候选肽段进行MS2扫描；
(4)根据蛋白定性分析结果，对鉴定到的目标肽段进行筛选，保留可信肽段，将这些适合PRM分析的可信肽段导入质谱分析软件Xcalibur中进行PRM方法设置。每次进样10ug混合肽段，采用HPLC系统进行色谱分离。缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱以95％的A液平衡。样品经过色谱分析柱进行梯度分离，流速为5ul/min。液相分离梯度如下0分钟---2分钟，B液线性梯度从5％到10％，2分钟---45分钟，B液线性梯度从10％到30％；45分钟---55分钟，B液线性梯度从30％到100％；55分钟----60分钟，B液线性梯度维持100％；
(5)高效液相色谱分离后的肽段使用Q-Exactive HF质谱仪(Thermo Scientific)进行PRM质谱分析。分析时长：60min，检测模式：正离子。一级质谱扫描范围：300-1800m/z，质谱分辨率：60,000(m/z 200)，AGC target：3e6，Maximum IT：200ms。每次一级MS扫描(full MS scan)后根据Inclusion list采集20个PRM扫描(MS2 scans)，Isolationwindow：1.6Th，质谱分辨率：30,000(m/z 200)，AGC target：3e6，Maximum IT：120ms，MS2Activation Type：HCD,Normalizedcollision energy：27；
(6)对Pool混合样品进行三次重复PRM检测，最终采用软件Skyline 3.7.0对PRM原始文件进行数据分析，并对目标蛋白和目标肽段进行定量。
PRM验证结果表明：如图2所示，Collagen alpha-1(XII)chain蛋白在低度近视组表达均值为2.32，中度近视组为1.19，高度近视组为1.36，中度近视/低度近视＝0.514，p＝0.003，高度近视/低度近视＝0.586，p＝0.038，高度近视/中度近视＝1.139，p＝0.603。
PRM结果与TMT结果相比较，可见PRM验证结果与TMT相对定量结果趋势一致。高度近视组和中度近视组Collagen alpha-1(XII)chain蛋白表达明显少于低度近视组。
上述实验证明Collagen alpha-1(XII)chain可作为靶点在制备治疗/预防中高度近视的药物中的应用。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (8)
1.胶原蛋白在制备治疗/预防中高度近视的药物中的应用，其特征在于，所述药物靶向Collagen alpha-1(XII)chain蛋白。
2.如权利要求1所述的胶原蛋白在制备治疗/预防中高度近视的药物中的应用，其特征在于，所述药物靶向角膜基质中的Collagen alpha-1(XII)chain蛋白。
3.如权利要求1所述的胶原蛋白在制备治疗/预防中高度近视的药物中的应用，其特征在于，所述药物能够调节Collagen alpha-1(XII)chain蛋白的表达量。
4.如权利要求1所述的胶原蛋白在制备治疗/预防中高度近视的药物中的应用，其特征在于，所述药物能够提高Collagen alpha-1(XII)chain蛋白的表达量。
5.如权利要求1所述的胶原蛋白在制备治疗/预防中高度近视的药物中的应用，其特征在于，所述药物能够提高角膜基质中Collagen alpha-1(XII)chain蛋白的表达量。
6.治疗/预防中高度近视的药物，其特征在于，所述药物能够提高Collagen alpha-1(XII)chain蛋白的表达量。
7.治疗/预防中高度近视的药物组合物，其特征在于，包括Collagen alpha-1(XII)chain蛋白促进剂以及靶向剂，所述Collagen alpha-1(XII)chain蛋白促进剂负载于所述靶向剂上，所述靶向剂靶向Collagen alpha-1(XII)chain蛋白。
8.胶原蛋白在制备中高度近视的检测试剂中的应用，其特征在于，所述检测试剂以Collagen alpha-1(XII)chain蛋白作为中高度近视的生物标记物。
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