CN113567658A

CN113567658A - 一种基于发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN113567658A
Application number: CN202110849307.9A
Authority: CN
Inventors: 金茂俊; 王源上; 王静; 邵华; 曹振; 王珊珊; 郑鹭飞; 佘永新; 金芬; 王淼
Original assignee: Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of Henan Academy of Agricultural Science
Current assignee: Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro Products of Henan Academy of Agricultural Science
Priority date: 2021-07-27
Filing date: 2021-07-27
Publication date: 2021-10-29
Anticipated expiration: 2041-07-27
Also published as: CN113567658B

Abstract

本发明提供了一种基于发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫检测试剂盒及其应用，属于农药残留检测技术领域。所述检测试剂盒包括以下组分：包被有机磷半抗原‑卵清蛋白的黑色反应板、修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子、发卡结构DNA H、标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H、二硫苏糖醇和有机磷标准液。本发明将生物条形码免疫分析与催化发夹自组装技术相结合开发一种简便快速、高灵敏、农药痕量检测方法，满足农药现场快速检测和食品安全监管的需要具有重要意义，故针对三唑磷、对硫磷、毒死蜱三种有机磷农药，建立了基于发夹自组装的多残留生物条形码免疫分析方法，具有较高的灵敏度和准确性。

Description

一种基于发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于农药残留检测技术领域，具体涉及一种基于发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫检测试剂盒及其应用。

背景技术

有机磷农药作为我国使用最广泛的农药之一，其中对硫磷属于高毒农药，已在2008年全面禁止使用，三唑磷和毒死蜱在2016年也相继禁止在蔬菜中使用，但违法使用仍时有发生。有机磷农药的毒性问题以及由其残留引发的食品安全等问题日益受到人们的广泛关注。因此，开发一种简便快速、高灵敏、农药痕量检测方法，满足农药现场快速检测和食品安全监管的需要具有重要意义。

传统确证检测手段如：气相色谱-质谱联用技术(GC-MS/MS)、液相色谱-质谱联用技术等(LC-MS/MS)，由于色谱、质谱等方法需要专业的设备和人员，样品前处理操作较复杂，检测周期长，成本高，难以满足快速高效检测的要求。

随着免疫分析、分子生物、纳米材料等学科领域的兴起，免疫分析方法具有快速简便，不需要专门的技术人员，价格成本低等优点，其主要包括荧光免疫分析、酶联免疫分析、化学发光免疫分析和生物条形码免疫分析。其中生物条形码免疫分析技术03年由ChadMirkind最早提出并成功应用于前列腺特异性抗原的检测。近年来，生物条形码技术通过不断改进并与多种技术联用，在蛋白质、核酸、农兽药、生物毒素等物质的定量检测中显示出了其高灵敏度和高特异性。

核酸等温扩增技术是基于核酸自身的扩增能力通过不同设计方式对其进行信号放大，是生物检测、医学诊断等领域增强检测信号的一种常用技术。催化杂交自组装技术(catalytic hairpin self-assembly，CHA)作为核酸等温扩增技术之一，是在2008年Pierce课题组提出杂交链式反应(HCR)的基础上提出的，在恒温下，在目标链的激活下依次与两条发夹结构发生互补杂交，目标链在整个反应中起到“催化剂”作用，可产生多次信号放大且不需要酶扩增作用，实现高效快速的扩增反应，具有简便快捷、高灵敏度、低成本等优势，在医学诊断、环境监测、食品安全等方面的应用具有一定的潜力。

然而目前还没有关于将催化杂交自组装技术应用于农药检测中的报道。对于现有农药残留确证检测技术如：LC-MS、GC-MS等技术，但由于色谱、质谱方法需要专业的设备和人员，样品前处理操作较复杂，检测周期长，成本高，难以满足快速高效检测的要求，随着酶联免疫吸附技术、酶抑制技术等以现代生物技术为依托的快速检测技术的兴起，具有快速、简便、成本低的特点，但同时也会出现假阳性、灵敏度不能满足农药的痕量检测等问题。因此，开发一种简便快速、高灵敏、农药痕量检测方法，满足农药现场快速检测和食品安全监管的需要具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫检测试剂盒及其应用，具有较高的灵敏度和准确性。

本发明提供了一种基于发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫检测试剂盒，包括以下组分：包被有机磷半抗原-卵清蛋白的黑色反应板、修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子、发卡结构DNA H、标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H、二硫苏糖醇和有机磷标准液；

所述生物条形码的核苷酸序列与发卡结构DNA H的核苷酸序列存在互补配对的序列；所述发卡结构DNA H的核苷酸序列与荧光基团标记的发卡结构DNA H的核苷酸序列存在互补配对的序列。

优选的，所述有机磷包括以下物质中的一种或几种：三唑磷、对硫磷和毒死蜱。

优选的，当试剂盒同时检测2或3种有机磷时，包括2套或3套试剂；

每套试剂中，所述修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子中的生物条形码的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:3中的一种，且2套或3 套试剂中修饰的生物条形码不相同；

所述标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H中荧光基团为 6-FAM、Cy3和Texas red中的一种，且2套或3套试剂中标记的荧光基团不相同。

优选的，所述修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子，由以下方法制备得到，将金纳米粒子溶液与有机磷抗体溶液混合标记，再将标记有抗体的金纳米粒子与活化的生物条形码溶液混合，依次加入质量百分含量1％ PEG 20000、终浓度为0.01mol/L PBS液，静置标记，封闭，离心，沉淀物重悬得到；

所述金纳米粒子的溶液与有机磷抗体溶液的体积比为500:(3～6)；所述有机磷抗体溶液的浓度为1.4～10.6mg/mL；

所述金纳米粒子的溶液的浓度为9～10nmol/L，pH值为8.5～9；

所述活化的生物条形码溶液的浓度为2.5～4.5μmol/L。

优选的，所述有机磷为三唑磷时，所述包被有机磷半抗原-卵清蛋白的黑色反应板中有机磷半抗原-卵清蛋白的稀释倍数为4000～8000；所述修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子的稀释倍数为10～40；

所述有机磷为对硫磷时，所述包被有机磷半抗原-卵清蛋白的黑色反应板中有机磷半抗原-卵清蛋白的稀释倍数为4000；所述修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子的稀释倍数为10～40；

所述有机磷为毒死蜱时，所述包被有机磷半抗原-卵清蛋白的黑色反应板中有机磷半抗原-卵清蛋白的稀释倍数为4000～8000；所述修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子的稀释倍数为10～20。

优选的，所述二硫苏糖醇的工作浓度为10～14mmol/L；

所述有机磷标准液的溶剂为含体积百分含量4％～8％甲醇的0.01mol/L PBS溶液。

优选的，所述发卡结构DNA H和/或标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H用催化发夹反应体系缓冲液溶解；

所述催化发夹反应体系缓冲液为含7～10mmol/L镁离子的pH值为8～10 的35～45mmol/L的Tris-HCl溶液。

本发明提供了所述基于发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫检测试剂盒在检测有机磷农药多残留中的应用。

本发明提供了一种采用所述基于发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫检测试剂盒进行作物有机磷农药多残留分析方法，包括以下步骤：

1)向包被有机磷半抗原-卵清蛋白的黑色反应板中添加待测样品液和修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子的悬浮液，充分混合，孵育，洗板，得到洗涤的酶标板；

2)向所述去除游离有机磷的的酶标板中依次添加二硫苏糖醇和经预处理的发卡结构DNA H以及标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H，经震荡反应后，测定酶标板的荧光值，将所述荧光值带入有机磷的检测标准曲线方程中，计算得到作物中有机磷农药的含量。

优选的，所述包被有机磷半抗原-卵清蛋白的黑色反应板中有机磷半抗原-卵清蛋白的溶液与待测样品液、修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子的悬浮液、二硫苏糖醇和经预处理的发卡结构DNA H以及标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H的体积比为20：20：10：20：1：3。

本发明提供了一种基于发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫检测试剂盒，包括以下组分：包被有机磷半抗原-卵清蛋白的黑色反应板、修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子、发卡结构DNA H、标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H、二硫苏糖醇和有机磷标准液；所述生物条形码的核苷酸序列与发卡结构DNA H的核苷酸序列存在互补配对的序列；所述发卡结构DNA H的核苷酸序列与荧光基团标记的发卡结构DNA H的核苷酸序列存在互补配对的序列。本发明通过在黑色反应板中反应孔内壁包被的有机磷农药抗原与样品中农药分子竞争结合结合金纳米粒子所修饰的抗体来建立有机磷农药免疫竞争反应体系，随后将未结合的游离物质洗去后，在反应板上加入二硫苏糖醇、发夹结构H和标记荧光基团和猝灭基团的发夹结构H，二硫苏糖醇将结合在反应孔中的抗原抗体复合物上、修饰金纳米粒子的生物条形码解离下来，释放生物条形码，生物条形码与发夹结构DNA H和标记荧光基团和猝灭基团的发夹结构DNA H杂交催化扩增反应，在自由能驱动下，生物条形码作为目标链引发发夹结构DNA H打开与其互补配对，标记荧光基团和猝灭基团的发夹结构DNA H再与生物条形码和发卡结构DNA H形成的中间产物互补配对，置换出生物条形码后，形成的互补配对链呈稳定线性双链结构，依次继续循环发生催化杂交反应以放大信号。由于标记荧光基团和猝灭基团的发夹结构DNA H标记有荧光基质，形成稳定的线性双链结构使其发卡结构被打开，产生荧光信号，根据所测得的荧光信号可定量检测农药残留。本发明提供的试剂盒是一种简便快速、高灵敏、农药痕量检测试剂盒，满足农药现场快速检测和食品安全监管的需要具有重要意义，故针对三唑磷、对硫磷、毒死蜱等多种有机磷农药单独或混合检测均适用，本发明基于所述试剂盒还建立了基于发夹自组装的多残留生物条形码免疫分析方法。实验结果表明，在0.01～50ng/mL的线性范围，三唑磷、对硫磷、毒死蜱的LOD值(IC₁₀)分别为0.012ng/mL，0.0057ng/mL和0.0074ng/mL，具有较高的灵敏度和准确性。

附图说明

图1为基于CHA的有机磷农药多残留生物条形码免疫分析方法的原理图；

图2为标记胶体金前后的紫外光谱图；

图3为采用生物条形码和有机磷抗体修饰金纳米粒子前后的透射电镜表征图结果；

图4为采用生物条形码和有机磷抗体修饰金纳米前后的能谱图谱；

图5为胶体金修饰单克隆抗体不同加入量的优化结果；

图6为磷酸盐溶液中不同含量甲醇的优化结果；

图7为二硫苏糖醇浓度的优化结果；

图8为催化发夹反应体系缓冲液的浓度优化结果；

图9为催化发夹反应体系缓冲液中Mg²⁺浓度的优化结果；

图10为催化发夹反应体系缓冲液中pH值的优化结果；

图11为发夹结构DNA H和标记荧光基团和猝灭基团的发夹结构DNA H 的比例优化结果；

图12为检测过程自组装过程中反应时间的优化结果；

图13为反应温度的优化结果；

图14为对硫磷、毒死蜱胶体金探针抗体加入量的优化结果；

图15为三种荧光基团的荧光强度及交叉反应的结果。

具体实施方式

在本发明中，所述有机磷优选包括以下物质中的一种或几种：三唑磷、对硫磷和毒死蜱，其中包括一种、两种或三种。

在本发明中，所述试剂盒包括修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子。所述修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子，由以下方法制备得到，将金纳米粒子溶液与有机磷抗体溶液混合标记，再将标记有抗体的金纳米粒子与活化的生物条形码溶液混合，依次加入质量百分含量1％PEG 20000、终浓度为0.01mol/L PBS液，静置标记，封闭，离心，沉淀物重悬得到。所述金纳米粒子的溶液与有机磷抗体溶液的体积比优选为500:(3～6)。所述有机磷抗体溶液的浓度为1.4～10.6mg/mL；所述金纳米粒子的溶液的浓度为9～10nmol/L，调整pH值至8.5～9。所述金纳米粒子的溶液优选采用 0.22μm滤膜过滤。不同种类有机磷抗体制备修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子时，抗体添加体积不同：所述生物条形码修饰的金纳米粒子与三唑磷抗体溶液的体积比为500：6；所述三唑磷抗体溶液的浓度为1.4 mg/mL。所述生物条形码修饰的金纳米粒子与三唑磷抗体溶液的体积比为 500:3；对硫磷抗体的浓度为7.57mg/mL。所述生物条形码修饰的金纳米粒子与三唑磷抗体溶液的体积比为125:1；所述毒死蜱抗体的浓度为10.6 mg/mL。该比例制备的修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子溶液呈现紫红色，表明金纳米粒子未发生团聚，并且具有较高的荧光信号。所述生物条形码的浓度优选2.5～4.5μmol/L，更优选为2.9～4.3μmol/L。所述生物条形码活化的方法优选将三种农药对应的生物条形码在4000rpm/min下离心1 min，用TE缓冲液溶解后，加入20mmol/L TCEP溶液，使TCEP与DNA 的体积比为200：1，震荡2～3h，得到活化的生物条形码。所述封闭优选采用终浓度为1％BSA溶液进行。所述封闭的时间优选为40～60min。所述离心的转速优选为12000rpm/min。所述离心的时间优选为15min。所述重悬用溶剂优选为含质量百分含量1％PEG 20000和质量百分含量1％BSA的0.01 mol/L PBS溶液。所述重悬优选至原金纳米粒子溶液的体积的0.4倍。

在本发明中，所述有机磷优选包括以下物质中的一种或几种：三唑磷、对硫磷和毒死蜱。当试剂盒同时检测2或3种有机磷时，包括2套或3套试剂。所述修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子中的生物条形码的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:3中的一种，且2套或3套试剂中修饰的生物条形码不相同；根据检测对象不同，发卡结构DNAH、标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H根据生物条形码的核苷酸序列不同而进行适应性调整。在本发明实施例中，检测三唑磷时，发卡结构DNA H对应的试剂命名为发卡结构DNA H1(SEQ ID NO:4)；标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H的试剂命名为标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H2(SEQ ID NO:5)；检测对硫磷时，发卡结构DNA H对应的试剂命名为发卡结构DNA H3(SEQ ID NO:6)；标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H的试剂命名为标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H4(SEQ ID NO:7)；检测毒死蜱时，发卡结构DNA H对应的试剂命名为发卡结构DNA H5(SEQ ID NO:8)；标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构 DNA H的试剂命名为标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H6(SEQ ID NO:9)。所述发卡结构DNA H和标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构 DNA H的体积比为优选为1:3～1:4，更优选为1:3。所述发卡结构DNA H的工作浓度优选为0.5μM～2.5μM，更优选为2μM。所述标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H的工作浓度优选为0.5μM～2.5μM，更优选为2 μM。所述标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H中荧光基团优选为 6-FAM、Cy3和Texas red中的一种，且2套或3套试剂中标记的荧光基团不相同。实验表明，三种荧光基团分别在激发/发射波长489/521nm、532/568 nm、592/622nm时，具有较高荧光强度的同时其荧光激发/发射波段影响较小，未被干扰，可以修饰在发夹结构DNA链，用于有机磷农药的多残留荧光测定。

在本发明中，所述检测试剂盒包括包被有机磷半抗原-卵清蛋白的黑色反应板。所述包被有机磷半抗原-卵清蛋白的黑色反应板的制备方法，优选包括以下步骤：将所述有机磷半抗原-卵清蛋白的包被液添加到黑色反应板的反应孔中，4℃过夜，洗板后封闭，洗板得到包被有机磷半抗原-卵清蛋白的黑色反应板。所述有机磷半抗原-卵清蛋白的包被液的添加量为100μL/孔。所述黑色反应板优选为96孔黑色酶标板。所述有机磷半抗原-卵清蛋白的包被液的溶剂为0.05mol/L碳酸盐缓冲液(CBS，pH＝9.6)。所述有机磷半抗原-卵清蛋白的制备方法为称取有机磷半抗原溶解于DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中，然后在上述混合液中加入NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，室温条件下搅拌反应15min。在上述反应液中逐滴加入DCC(N,N-二环已基碳二亚胺)。在室温避光条件下搅拌反应4h后，4000rpm/min离心15min，取上清液，将其逐滴加入到含有卵清蛋白的碳酸盐缓冲液(0.01mol/L，pH 9.6)中。搅拌反应4h后，将上述反应液装入透析袋中进行透析，用0.01mol/L PBS透析，透析三天，将透析后的有机磷半抗原-卵清蛋白偶联物混匀，分装，-20℃ 保存。当检测不同种类有机磷时，所述有机磷半抗原替换为相应种类的有机磷半抗原。所述有机磷为三唑磷时，所述包被有机磷半抗原-卵清蛋白的黑色反应板中有机磷半抗原-卵清蛋白的稀释倍数为4000～8000；所述修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子的稀释倍数为10～40。所述有机磷为对硫磷时，所述包被有机磷半抗原-卵清蛋白的黑色反应板中有机磷半抗原-卵清蛋白的稀释倍数为4000；所述修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子的稀释倍数为10～40。所述有机磷为毒死蜱时，所述包被有机磷半抗原- 卵清蛋白的黑色反应板中有机磷半抗原-卵清蛋白的稀释倍数为4000～8000；所述修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子的稀释倍数为10～20。

在本发明中，所述检测试剂盒包括二硫苏糖醇。所述二硫苏糖醇用于使生物条形码从修饰的金纳米粒子上中解离出来。所述二硫苏糖醇的工作浓度优选为10～14mmol/L，更优选为11～13mmol/L，最优选为12.5mmol/L。

在本发明中，所述发夹结构DNA H或修饰有荧光基团和猝灭基团的发夹结构DNAH的溶剂优选为催化发夹反应体系缓冲液。所述催化发夹反应体系缓冲液为含7～10mmol/L镁离子的pH值为8～10的35～45mmol/L的 Tris-HCl溶液。

在本发明中，所述检测试剂盒包括有机磷标准液。所述有机磷标准液的溶剂优选为含体积百分含量4％～8％甲醇的0.01mol/L PBS溶液。所述甲醇的浓度优选为5％。所述有机磷标准液用于制备有机磷标准曲线。本发明试剂盒检测三唑磷的标准曲线如下：y＝10.334x+29.773，R²＝0.974；试剂盒检测对硫磷的标准曲线如下；y＝12.527x+38.145，R²＝0.975；试剂盒检测毒死蜱的标准曲线如下：y＝11.694x+34.94，R²＝0.966，其中y表示荧光强度，x 表示农药的浓度。

本发明提供了所述基于发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫检测试剂盒在检测有机磷农药多残留中的应用。所述有机磷优选包括以下物质中的一种或几种：三唑磷、对硫磷和毒死蜱。

本发明提供了一种采用上述方案所述试剂盒进行作物有机磷农药多残留分析方法，见图1，包括以下步骤：

2)向所述洗涤的酶标板中依次添加二硫苏糖醇和经预处理的发卡结构 DNA H以及标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H，经震荡反应后，测定酶标板的荧光值，将所述荧光值代入有机磷的检测标准曲线方程中，计算得到作物中有机磷农药的含量。

在本发明中，所述充分混合优选在微量震荡仪上轻微震荡混合，所述充分混合的时间优选为1min。所述孵育的温度优选为37℃，所述孵育的时间优选为1h。所述震荡反应的时间优选为90min，所述震荡反应的温度优选为37℃。所述酶标板的荧光值根据三种不同的荧光基团进行测定。

在本发明中，所述包被有机磷半抗原-卵清蛋白的黑色反应板中有机磷半抗原-卵清蛋白的溶液与待测样品液、修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子的悬浮液、二硫苏糖醇和经预处理的发卡结构DNA H以及标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNAH的体积比优选为20：20：10：20： 1：3。

本发明开发的分析方法具有简便快速、高灵敏、农药痕量检测的特点，满足农药现场快速检测和食品安全监管的需要具有重要意义，故针对三唑磷、对硫磷、毒死蜱三种有机磷农药，建立了基于发夹自组装的多残留生物条形码免疫分析方法。线性范围在0.01～50ng/mL，三唑磷、对硫磷、毒死蜱的LOD值(IC₁₀)分别为0.012ng/mL，0.0057ng/mL和0.0074ng/mL，具有较高的灵敏度和准确性。

下面结合实施例对本发明提供的一种基于发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫检测试剂盒及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种基于发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫检测试剂盒

1)包被有机磷半抗原-卵清蛋白的黑色反应板，制备方法如下：

在黑色酶标板中，每孔加入100μL分别稀释一定倍数的、震荡均匀的三唑磷、对硫磷、毒死蜱完全抗原(OVA偶联)，4℃包被过夜，洗板后用 300μL 1％BSA 37℃封闭1h，洗板，得到包被有机磷半抗原-卵清蛋白的黑色反应板；

2)修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子，制备方法如下：

A.胶体金的合成

将100mL 1mmol/L的HAuCl₄水溶液加入圆底烧瓶中，连接冷凝管并开始回流。在磁力搅拌下加热至沸腾，迅速加入10mL新制备的38.8mmol/L 的柠檬酸三钠溶液，随着搅拌和加热的进行，溶液的颜色由黄色先变黑后逐渐变为深红色，反应15min后，在室温条件下自然冷却至室温，4℃储存备用；

B.胶体金探针的制备方法

(1)生物条形码DNA链的活化：分别将三种农药对应的生物条形码按照说明书在4000rpm/min下离心1min，用TE缓冲液溶解后，加入TCEP (20mmol/L)溶液，使TCEP与DNA的比例为200：1，室温下震荡2～3h；

三种农药对应的生物条形码的具体核苷酸序列如下：

SEQ ID NO:1:-SH-(CH₂)₆-AAAAAAAAAACGACATCTAACCTAGCT CACTGAC；

SEQ ID NO:2：-SH-(CH₂)₆-AAAAAAAAAACTGATAAGCTA；

SEQ ID NO:3：-SH-(CH₂)₆-AAAAAAAAAAAATTACGATTA。

(2)抗体的标记：胶体金溶液过0.22μm孔径的滤膜后，分别取一定体积的胶体金溶液，用0.2mol/L K₂CO₃调节pH值至9.0左右。将一定体积的三唑磷单克隆抗体、对硫磷单克隆抗体、毒死蜱单克隆抗体加入到调节好 pH值的胶体金溶液中，充分吹打混匀，室温孵育1h；其中三唑磷单克隆抗体、对硫磷单克隆抗体、毒死蜱单克隆抗体及其抗原由浙江大学农药与环境毒理学课题组提供。三唑磷单克隆抗体、对硫磷单克隆抗体、毒死蜱单克隆抗体及其抗原的来源参见现有技术报道([1]张秀苑.基于DNA/RNA杂交的农产品中有机磷农药残留生物条形码免疫分析方法研究[D].烟台大学,2020.； [2]Zhang,Chan,ZejunJiang,Maojun Jin,Pengfei Du,Ge Chen,Xueyan Cui, Yudan Zhang,Guoxin Qin,FeiyanYan,A.M.Abd El-Aty,Ahmet

and Jing Wang.2020.'Fluorescenceimmunoassay for multiplex detection of organophosphate pesticides in agro-products based on signal amplification of gold nanoparticles andoligonucleotides',Food Chemistry,326:126813. [3]Chen,Ge,Guangyang Liu,HuiyanJia,Xueyan Cui,Yuanshang Wang, Dongyang Li,Weijia Zheng,Yongxin She,DonghuiXu,Xiaodong Huang,A.M. Abd El-Aty,Jianchun Sun,Haijin Liu,Yuting Zou,JingWang,Maojun Jin,and Bruce D.Hammock.2021.'A sensitive bio-barcode immunoassaybased on bimetallic Au@Pt nanozyme for detection of organophosphatepesticides in various agro-products',Food Chemistry,362:130118.)。

(3)生物条形码的标记：将活化的三种生物条形码分别加入到对应的上述混合液中，充分混匀；加入30％的PEG 20000至终浓度为1％，充分混匀后一次性加入0.1mol/L的PBS至终浓度为0.01mol/L；静置1h；

(4)封闭与离心：加入10％的BSA至终浓度为1％，继续静置40min 以上，12000rpm/min离心15min，弃去上清液，得到的红色沉淀加400μL 探针重悬液，用移液器轻轻吹打，使沉淀重悬浮混匀，得到同时修饰生物条形码和有机磷单克隆抗体的金纳米粒子在4℃保存备用；

3)发卡结构DNA H，其中检测三唑磷时，发卡结构DNA H对应的试剂命名为发卡结构DNA H1(SEQ ID NO:4)；检测对硫磷时，发卡结构DNA H对应的试剂命名为发卡结构DNAH3(SEQ ID NO:6)；检测毒死蜱时，发卡结构DNA H对应的试剂命名为发卡结构DNA H5(SEQID NO:8)；

发卡结构DNA H的具体核苷酸序列如下：

SEQ ID NO:4：GTCAGTGAGCTAGGTTAGATGTCGCCATGTGTAGACGACATCTAACCTAGCCCTTGTCATAGAGCAC；

SEQ I D NO:6：TAGCTTATCAGCCATGTGTAGACTGATA

SEQ ID NO:8：TTATTGCTAATCCATGTGTAGAATTAGC。

4)标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H，其中检测三唑磷时，标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H的试剂命名为标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H2(SEQ ID NO:5)；检测对硫磷时，标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H的试剂命名为标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H4(SEQ ID NO:7)；检测毒死蜱时，标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H的试剂命名为标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H6(SEQ ID NO:9)；

标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H的具体核苷酸序列如下：SEQ IDNO:5：AGATGTCG/i6FAMdT/CTACACATGGCGACATCTAAC CTAGCCCATGTGTAGA-BHQ-1；

SEQ ID NO:7：CAGTCA/iCy3dT/CACATGGCTGATACCATGTGTAGA -BHQ-1；

SEQ ID NO:9：AATTCA/iTexRddT/CACATGGATTAGCCCATGTGTAGA -BHQ-2。

5)二硫苏糖醇；

6)有机磷标准液；其中包括三唑磷标准液、对硫磷标准液，毒死蜱标准液；所用溶剂为含甲醇的PBS溶液；其中对硫磷、毒死蜱、三唑磷标准溶液购买于德国Dr.Ehrenstorfer公司；

7)催化发夹反应体系缓冲液，含Mg²⁺的Tris-HCl溶液。

实施例2

实施例1制备的检测试剂盒在检测农作物中三唑磷、对硫磷以及毒死蜱农药多残留的方法，包括以下步骤：

1)间接竞争免疫反应：先后加入50μL三种农药混合标准溶液或者待测样品、50μL分别稀释10倍的三种胶体金探针混合液，在微量震荡仪上轻微震荡1min混合后，37℃孵育1h。在此过程中，三种农药标准品或样品中的待测农药分别与包被抗原竞争结合相应胶体金探针上的抗体。通过洗板，特异性结合到微孔板底部的三种探针被保留，其余成分被去除。

2)催化发夹自组装反应：每孔加入100μL一定浓度的DTT，随后加入 2μM发夹结构H1、H3、H5 5μL和H2、H4、H6 15μL，轻微震荡2min 后，在37℃恒温恒湿箱中震荡反应90min。DTT通过配体交换将胶体金表面的三种ssDNA解离下来，在目标链DNA的催化作用下与发夹探针溶液互补打开后依次进行自组装反应，并将目标DNA链置换出来，生成稳定的线性双链结构，并释放荧光信号。

3)信号检测：在激发/发射波长分别为489nm/521nm、532nm/568nm、 592nm/622nm条件下测定荧光值(Infinite M200 PRO，TECAN，多功能酶标仪)。标准溶液或者样品中待测农药浓度越大，测得的荧光值越低。

实施例3

将实施例1制备的修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子和胶体金溶液进行紫外扫描、透射电镜表征和能谱分析。

从图2看出，未标记的胶体金溶液紫外扫描显示其在520nm波长下有最大吸收峰，标记有三唑磷单克隆抗体和巯基DNA链的胶体金复合探针紫外扫描显示其在528nm波长下有最大吸收峰，修饰后的胶体金探针最大吸收波长从520nm移至528nm，发生了红移，颜色由酒红色变为紫红色。表明抗体、生物条形码巯基DNA链已经修饰到胶体金表面上。

从图3可以看出，修饰前后的胶体金其粒径在13nm，粒径均一，分散性较好，皆没有出现胶体金聚集的现象。标记抗体和生物条形码巯基DNA 链后的胶体金溶液透射电镜图显示：由于胶体金粒子表面修饰了抗体和生物条形码DNA链，可观察到胶体金表面有一层白色光圈。抗体中含有蛋白质 P元素，生物条形码巯基DNA链中含有S元素。

图4为标记前后胶体金(左)及其复合探针(右)EDS能谱扫描图谱，可以观察到标记后的胶体金复合探针扫描到含有S、P两个特征性元素，也证明了抗体和生物条形码DNA链已经成功修饰在胶体金探针表面。

实施例4

修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子中抗体的包被量优化实验

由于在胶体金表面修饰了抗体，其会形成双电子层覆盖在胶体金探针表面，若抗体添加量不足，胶体金溶液中的盐离子将破坏电子平衡，若添加抗体量适度或稍稍过量，则会避免胶体金复合探针团聚。

通过比色观察法以及紫外分光光度法对其进行判定，确定三唑磷农药最优加入量。具体按照实施例2的方法对体系进行检测。

在1mL胶体金中，加入30μL 0.2mol/L K₂CO₃调节其pH至8.5～9.0静置10～15min，加入抗体的体积分别为2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、12 μL、14μL和16μL。混匀后加入100μL10％NaCl，静置1h后观察变化，并用酶标仪在400～600nm处扫描其最大吸光度。

图5显示，加入抗体量2～10μL的胶体金溶液由于抗体量加入不足，导致胶体金的团聚现象，溶液呈现蓝色。加入抗体量12～16μL的胶体金溶液未团聚，溶液呈现紫红色。观察到恰好未变色即加入12μL抗体是稳定1mL 胶体金溶液最小抗体浓度，三唑磷农药单克隆抗体浓度为1.4mg/mL，在实际实验中最适抗体用量需为稳定1mL胶体金溶液最小抗体体积的120％，故确定抗体最佳使用蛋白的量为20.16mg。

实施例5

有机磷标准液的溶剂中甲醇浓度的优化实验

为对免疫反应中农药标准浓度缓冲液中甲醇的含量进行优化，分别配制了0％、2.5％、5％、10％、20％、40％的0.01mol/L PBS缓冲溶液，三唑磷农药浓度为5ng/mL，按照实施例2的方法测定反应后的荧光值。

结果如图6所示，当农药标准浓度缓冲液中含有5％甲醇的0.01mol/L PBS时，所测得荧光值最高，随着甲醇浓度的不断增高，其荧光值逐渐降低，说明适量的甲醇会促进反应的进行，过量的甲醇则会阻碍反应的进行，所以选择5％甲醇作为农药标准缓冲液最适添加浓度。

实施例6

二硫苏糖醇(DTT)的浓度优化实验

实验研究了不同浓度的DTT对解离DNA链的程度对催化发夹自组装反应的影响。以三唑磷农药为例，按照实施例2的方法对体系进行检测。

如图7所示，随着DTT的浓度增高，荧光值也随之增加并趋于平稳，当DTT浓度为12.5mmol/L时信号达到最高值，故选择本实验中检测探针最适浓度为12.5mmol/L。

实施例7

催化发夹反应体系缓冲液的浓度、pH和Mg²⁺含量的优化实验为了验证催化发夹反应体系缓冲液的浓度、pH和Mg²⁺含量等因素是否会对催化杂交反应具有一定的影响，以三唑磷农药检测体系为例，对各因素设置梯度参数，并按照实施例2的方法对体系进行检测的荧光值。

本实施例选择了发夹工作缓冲液浓度为10mmol/L、20mmol/L、30 mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、60mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)进行反应后测定，结果如图8，随着Tris-HCl(pH7.5)的浓度的增加，荧光值先上升后下降，当Tris-HCl(pH 7.5)的浓度为40mmol/L时，荧光值最高，故选择杂交反应缓冲体系最适浓度为40mmol/L。

确定最适浓度后，配制了发夹工作缓冲液pH为3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、 8.5、9.5，浓度为40mmol/L Tris-HCl进行反应后测定，在图9中，随着Tris-HCl pH的增加，荧光值先上升后下降，当Tris-HCl pH为8.5时，荧光值最高，故选择杂交反应缓冲体系最适pH为8.5。

Mg²⁺作为金属离子，在DNA催化杂交反应中是重要的辅助因子，对发夹工作缓冲液含Mg²⁺分别为0mmol/L、2mmol/L、4mmol/L、6mmol/L、8 mmol/L、10mmol/L，进行荧光测定，图10中，在Mg²⁺浓度为8mmol/L时，荧光达到最大值，所以选择Mg²⁺浓度为8mmol/L以促进反应的进行。

实施例8

发夹结构H1、H2的体积比优化实验

发夹结构H1、H2的用量作为本方法的关键因素，两者用量比例决定了反应的饱和程度和扩增效率。本实施例优化了发夹结构H1、H2(H1和H2 各自浓度依次为2μmol/L5μL和2μmol/L5μL)加入量的比例，设置了7 个发夹结构加入比例，分别为1：1、1：2、1：3、1：4、2：1、3：1：4：1。

如图11，当发夹结构H1、H2加入比例为1：3时，其荧光值最高，即反应效率最高。故将1：3作为发夹结构H1和H2最优加入比例。

实施例9

催化发夹反应体系反应时间的优化实验

通过探索目标链与发夹结构H1、H2的反应时间，从而得到最优的检测荧光值。在催化发夹自组装反应过程中，在10min、30min、60min、90min、 120min等五个时间段在酶标仪上分别测定荧光值。

如图12结果表明，在90min下，荧光达到最大值，所以选择反应温度为90min。

实施例10

催化发夹反应体系反应温度的优化实验

温度因素对催化杂交自组装反应中DNA链的稳定性和杂交反应具有关键影响，温度的高低直接影响发夹结构与目标链的打开与杂交。若温度较低可能会阻碍熵自由能的自发催化反应，影响反应效率，若温度较高可能会破坏其稳定性，将已打开的茎环结构重新闭合。通过探索目标链与发夹结构 H1、H2的反应温度所测定的荧光值，从而得到最优的反应温度。

设计4℃、24℃(室温)、37℃、48℃等四个反应温度，进行催化反应荧光测定。

结果如图13所示。随着温度的不断升高，荧光值先上升后略有下降，在37℃下，荧光达到最大值。过低的孵育温度，发夹结构与目标链无法自发使自由能完全反应，效率较低，荧光值较低；当孵育温度过高，发夹结构与目标链DNA链稳定性下降，荧光值下降，所以选择反应温度为37℃为最适反应温度。

实施例11

对硫磷、毒死蜱探针的抗体的添加量进行优化实验

按照实施例3的方法对对硫磷、毒死蜱探针的抗体的添加量进行优化，具体在胶体金溶液中加入对硫磷抗体(7.57mg/mL)或毒死蜱抗体 (10.6mg/mL)4μL、6μL、8μL、10μL、12μL，并进行荧光测定。

结果如图14，经过优化，制备对硫磷、毒死蜱胶体金探针最优抗体加入量为6μL和8μL。

实施例12

修饰有荧光基团6-FAM的发夹结构DNA链H2、修饰有Cy3的发夹结构DNA H4和修饰有Texas red的发夹结构DNA H6在同一体系中互相干扰情况的实验

修饰有荧光基团6-FAM的发夹结构DNA链H2、修饰有Cy3的发夹结构DNA H4和修饰有Texas red的发夹结构DNA H6用无菌水溶解至100μM，后使用催化杂交缓冲溶液稀释到工作浓度，其中：每组发夹结构均做五个平行实验，进行荧光测定。根据测定结果图15，三种荧光物质均能够被最大程度的激发，6-FAM、Cy3、Texas red的荧光值逐渐降低，激发/发射波长相距范围适中，未发生互相激发干扰等交叉反应。所以本实验所选择的三种荧光基团6-FAM、Cy3、Texas red，这三种荧光基团分别在激发/发射波长489/521 nm、532/568nm、592/622nm时，具有较高荧光强度的同时其荧光激发/发射波段影响较小，未被干扰，可以修饰在发夹结构DNA链，用于有机磷农药的多残留荧光测定。

实施例13

三种有机磷农药的标准曲线绘制方法

将三种农药的标准溶液用含有5％甲醇的0.01mol/L PBS缓冲溶液稀释为0.01～1000ng/mL一系列浓度梯度，在优化多残留反应体系各项实验条件后，建立三唑磷、对硫磷、毒死蜱三种有机磷农药的免疫分析方法。结果见表1。

表1三唑磷、对硫磷、毒死蜱农药标准曲线

实施例14

在上述实验的优化条件基础上，将三唑磷、对硫磷、毒死蜱的OVA-半抗原分别稀释8000倍、4000倍和8000倍，三种胶体金纳米探针分别各稀释 10倍，皆添加浓度为5ng/mL农药进行反应。

对三种农药设计特异性实验，每种农药有八种实验组合方式，见表2：分别是单一OVA半抗原-单一AuNPs-单一发夹结构；单一OVA 半抗原-单一AuNPs-混合发夹结构；单一OVA半抗原-混合AuNPs- 单一发夹结构；单一OVA半抗原-混合AuNPs-混合发夹结构；混合OVA半抗原-单一AuNPs-单一发夹结构；混合OVA半抗原-单一 AuNPs-混合发夹结构；混合OVA半抗原-混合AuNPs-单一发夹结构；混合OVA半抗原-混合AuNPs-混合发夹结构，共24小组，实施例1-8 为三唑磷在免疫竞争体系中的特异性优化，实验组9-16为对硫磷在免疫竞争体系中的特异性优化，实验组17-24组为毒死蜱在免疫竞争体系中的特异性优化每组做5个平行实验。具体见表2。

表2 24组实验设置情况

实验结果表明：总体对比三种农药，八组实验的荧光检测值大体一致，三唑磷农药反应荧光值在3600～4000上下浮动、对硫磷反应荧光值在2000～2500上下浮动、毒死蜱反应荧光值在1500～2000上下浮动。三种农药的多残留免疫分析荧光值均稍稍偏高于单残留免疫分析，可能发生了轻微交叉反应，但交叉反应率较低，在可接受范围内。证明了该实验在免疫竞争和催化发夹反应中的可行性。

表3 OVA半抗原和胶体金探针工作浓度的优化

实施例15

为进一步验证所建立的基于催化发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫分析方法的准确性和精确度，选择苹果、黄瓜、卷心菜、大米四种代表性基质，加入10μg/kg、50μg/kg和100μg/kg三种农药添加水平，模拟被污染的果蔬粮食样品，测定实际样品中三唑磷、对硫磷农药的浓度，其中：每类样品每个添加浓度做5个平行实验，以减少实验的误差，并将本实验所建立的方法与LC-MS/MS的检测结果进行比较。

实验所需的实验样品：苹果、卷心菜、黄瓜、大米均购买自北京当地超市，实验用水来自实验室自来水。本实验所采用的前处理方法步骤如下：

将实验室自来水加入甲醇配制的三唑磷农药标准溶液至最终浓度为10 μg/kg，50μg/kg，100μg/kg，混合均匀后静置4h以上，取1mL用于LC-MS 法上机检测。另取100μL氮气吹干，用5％甲醇-PBS复溶至2mL，并通过本方法进行检测。

将苹果、卷心菜、黄瓜样品预先打碎，称量10g打碎后的样品至50mL 离心管中，为模拟被农药污染的样品，在离心管中加入甲醇配制的三唑磷农药标准溶液至最终浓度为10μg/kg，50μg/kg，100μg/kg，静置4h以上，加入10mL乙腈，震荡提取5min后加入4g无水MgSO₄和1gNaCl，震荡涡旋5min，在4℃、5000rpm条件下，离心5min。

取2mL上清液转移到含有100mgPSA和100mgC₁₈的5mL离心管中震荡5min，在4℃、5000rpm条件下，离心5min。将上清液过滤膜后收集，取1mL用于LC-MS法上机检测。另取100μL氮气吹干，用5％甲醇-PBS 复溶至2mL，并通过本方法进行检测。

结果见表4，使用该方法测得的苹果、黄瓜、卷心菜、大米等4种样品中的添加回收率为82.8-110.6％之间，CV值为5.5～18.5％。使用LC-MS/MS 所测得样品的回收率在81.6～110.4％之间，CV值为1.3～15.7％。表明该免疫竞争方法在苹果、黄瓜、卷心菜、大米等农产品中的检测精密度和准确度较好，具有良好的适用性和相关性。

表4生物条形码免疫分析法与LC-MS/MS仪器方法的回收率和变异系数 (n＝5)

表5不同免疫分析分析方法之间的比较

注：a侧流免疫层析法；b仿生免疫分析；c酶联免疫分析；d化学发光酶免疫分析；e基于CHA的生物条形码免疫分析。

由表5结果可知，与其他检测方法相比，本申请提供的分析方法从检测范围以及检测灵敏度和准确性方面均具有明显的优势。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所

<120> 一种基于发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫检测试剂盒及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaaaaaaaaa cgacatctaa cctagctcac tgac 34

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaaaaaaaaa ctgataagct a 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaaaaaaaaa aattacgatt a 21

<210> 4

<211> 67

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtcagtgagc taggttagat gtcgccatgt gtagacgaca tctaacctag cccttgtcat 60

agagcac 67

<210> 5

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n=修饰有i6FAM的dT

<400> 5

agatgtcgnc tacacatggc gacatctaac ctagcccatg tgtaga 46

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tagcttatca gccatgtgta gactgata 28

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n=修饰有iCy3的dT

<400> 7

cagtcancac atggctgata ccatgtgtag a 31

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttattgctaa tccatgtgta gaattagc 28

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n=修饰有iTexRd的dT

<400> 9

aattcancac atggattagc ccatgtgtag a 31

Claims

1.一种基于发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：包被有机磷半抗原-卵清蛋白的黑色反应板、修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子、发卡结构DNA H、标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNAH、二硫苏糖醇和有机磷标准液；

所述生物条形码的核苷酸序列与发卡结构DNA H的核苷酸序列存在互补配对的序列；所述发卡结构DNA H的核苷酸序列与荧光基团标记的发卡结构DNAH的核苷酸序列存在互补配对的序列。

2.根据权利要求1所述基于发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫检测试剂盒，其特征在于，所述有机磷包括以下物质中的一种或几种：三唑磷、对硫磷和毒死蜱。

3.根据权利要求2所述基于发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫检测试剂盒，其特征在于，当试剂盒同时检测2或3种有机磷时，包括2套或3套试剂；

每套试剂中，所述修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子中的生物条形码的核苷酸序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:3中的一种，且2套或3套试剂中修饰的生物条形码不相同；

所述标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H中荧光基团为6-FAM、Cy3和Texasred中的一种，且2套或3套试剂中标记的荧光基团不相同。

4.根据权利要求1或3所述基于发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫检测试剂盒，其特征在于，所述修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子，由以下方法制备得到，将金纳米粒子溶液与有机磷抗体溶液混合标记，再将标记有抗体的金纳米粒子与活化的生物条形码溶液混合，依次加入质量百分含量1％PEG 20000、终浓度为0.01mol/LPBS液，静置标记，封闭，离心，沉淀物重悬得到；

所述金纳米粒子的溶液的浓度为9～10nmol/L，pH值为8.5～9；

所述活化的生物条形码溶液的浓度为2.5～4.5μmol/L。

5.根据权利要求4所述基于发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫检测试剂盒，其特征在于，所述有机磷为三唑磷时，所述包被有机磷半抗原-卵清蛋白的黑色反应板中有机磷半抗原-卵清蛋白的稀释倍数为4000～8000；所述修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子的稀释倍数为10～40；

6.根据权利要求1所述基于发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫检测试剂盒，其特征在于，所述二硫苏糖醇的工作浓度为10～14mmol/L；

7.根据权利要求1～6任意一项基于发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫检测试剂盒，其特征在于，所述发卡结构DNAH或标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNAH用催化发夹反应体系缓冲液溶解；

所述催化发夹反应体系缓冲液为含7～10mmol/L镁离子的pH值为8～10的35～45mmol/L的Tris-HCl溶液。

8.权利要求1～7任意一项所述基于发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫检测试剂盒在检测有机磷农药多残留中的应用。

9.一种采用权利要求1～7任意一项所述基于发夹自组装的有机磷农药多残留生物条形码免疫检测试剂盒进行作物有机磷农药多残留分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)向所述洗涤的酶标板中依次添加二硫苏糖醇和经预处理的发卡结构DNA H以及标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H，经震荡反应后，测定酶标板的荧光值，将所述荧光值代入有机磷的检测标准曲线方程中，计算得到作物中有机磷农药的含量。

10.根据权利要求9所述分析方法，其特征在于，所述包被有机磷半抗原-卵清蛋白的黑色反应板中有机磷半抗原-卵清蛋白的溶液与待测样品液、修饰有生物条形码和有机磷抗体的金纳米粒子的悬浮液、二硫苏糖醇和经预处理的发卡结构DNAH以及标记有荧光基团和猝灭基团的发卡结构DNA H的体积比为20：20：10：20：1：3。