CN113543799A - 靶向dll3的嵌合抗原受体和结合剂 - Google Patents

Abstract

本文提供了DLL3结合剂和包含与DLL3特异性结合的DLL3结合分子的嵌合抗原受体(CAR)；以及包含这些DLL3特异性CAR的免疫细胞，例如CAR‑T细胞。还提供了制造和使用DLL3特异性CAR的方法，以及包含DLL3特异性CAR的免疫细胞。

Description

靶向DLL3的嵌合抗原受体和结合剂

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年3月1日提交的美国临时申请号62/812,585以及2020年2月4日提交的美国临时申请号62/969,976的优先权权益，所有这些的内容特此通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开涉及包含与DLL3结合的抗原结合分子的DLL3结合剂和嵌合抗原受体(CAR)；编码其的多核苷酸；以及使用其治疗患者的癌症的方法。

序列表

本申请正在通过EFS-Web电子提交，并且包括以.txt格式电子提交的序列表。.txt档包含序列表，标题为“AT-019_03US_SL”，创建于2020年2月4日，大小为1,026,798字节。该.txt档中包含的序列表是说明书的一部分，通过引用整体并入本文。

背景技术

小细胞肺癌(SCLC)是肺癌的一种侵袭性形式，其预后较差且治疗选择有限。SCLC占所有新诊断的肺癌的约10-15％。美国癌症协会估计，2018年将诊断出约234,000例肺癌新病例。SCLC的5年相对存活率估计为31％(对于I期)，19％(对于II期)，8％(对于III期)和2％(对于IV期)。几十年来，SCLC的存活率一直很低，这在很大程度上是由于缺乏对抗这种形式的肺癌的新疗法。癌症的常规治疗性治疗方法包括化疗和放疗。患者典型地对包括依托泊苷(etoposide)和顺铂(cisplatin)在内的当前的一线疗法反应良好，但总是会迅速复发化学耐药性疾病。复发性难治疾病的预后极差，并且疾病进展迅速，中位生存期短，小于六个月。因此，仍然非常需要开发针对增生性病症的更有靶向性且更有效的疗法。

经遗传修饰以识别恶性肿瘤相关抗原的免疫细胞的过继转移显示出有希望作为治疗癌症的新方法(参见例如Brenner等,《免疫学新见(Current Opinion inImmunology)》,22(2):251-257(2010)；Rosenberg等,《自然评论：癌症(Nature ReviewsCancer)》,8(4):299-308(2008))。可以对免疫细胞进行遗传修饰，以表达嵌合抗原受体(CAR)，即包含DLL3抗原识别部分和T细胞激活结构域的融合蛋白(参见例如Eshhar等，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,90(2):720-724(1993)；和Sadelain等，《免疫学新见(Curr.Opin.Immunol)》,21(2):215-223(2009))。含有CAR的免疫细胞，例如CAR-T细胞(CAR-T)，被工程化以赋予其抗原特异性，同时保留或增强其识别和杀死靶细胞的能力。

DLL3是非规范的Notch配体，其以细胞自主方式起作用以抑制Notch信号传导，从而阻断细胞与细胞的相互作用以及Notch在靶细胞中的内化。δ样配体3(DLL3)是SCLC肿瘤标志物，并且已发现其与癌症干细胞有关。涉及DLL3的其它适应症包括黑色素瘤、低级别神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、甲状腺髓样癌、类癌、胰腺中的弥散性神经内分泌肿瘤、膀胱和前列腺癌、睾丸癌和具有神经内分泌特征的肺腺癌。需要用于癌症且特别是涉及DLL3异常表达的恶性肿瘤的治疗。本文提供了解决这一需求的方法和组合物。

发明内容

本文提供了包含与DLL3特异性结合的DLL3抗原结合结构域的嵌合抗原受体(CAR)；以及包含这些DLL3特异性CAR的免疫细胞，例如CAR-T细胞。还提供了制造和使用这些DLL3特异性CAR以及包含这些DLL3特异性CAR的免疫细胞的方法。本文所述的靶向DLL-3的CAR T细胞表现出良好的转导效率、体外表型以及强效的体外和体内抗肿瘤活性。

在一个方面，本公开提供一种嵌合抗原受体，其包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述胞外结构域包含与DLL3特异性结合的DLL3抗原结合结构域，并且其中所述抗原结合结构域包含以下中的至少一种：(a)可变重链CDR1，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO 1、10、19、28、37、46、55、64、73、82、91、100、109、118、127、136、145、154、163、172、181、190、199、208、217、226、235、244、253、262、271、280、289、298、307、316、325、334、343、352、361、370、379、388、397、406、415、424、433、442、451和460；(b)可变重链CDR2，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、11、20、38、47、56、65、74、83、92、101、110、119、128、137、146、155、164、173、182、191、200、209、218、227、236、245、254、263、272、281、290、299、308、317、326、335、344、353、362、371、380、389、398、407、416、425、434、443、452、461和695；(c)可变重链CDR3，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO 3、12、21、30、39、48、57、66、75、84、93、102、111、120、129、138、147、156、165、174、183、192、201、210、219、228、237、246、255、264、273、282、291、300、309、318、327、336、345、354、363、372、381、390、399、408、417、426、435、444、453和462；(d)可变轻链CDR1，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、13、22、31、40、49、58、67、85、94、103、112、121、130、139、148、157、166、175、184、193、202、211、220、229、238、247、256、265、274、283、292、301、310、319、328、337、346、355、364、373、382、391、400、409、418、427、436、445、454、463和696；(e)可变轻链CDR2，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、14、23、32、41、50、59、68、77、86、95、104、113、122、131、140、149、158、167、176、185、194、203、212、221、230、239、248、257、266、275、284、293、302、311、320、329、338、347、356、365、374、383、392、401、410、419、428、437、446、455和464；以及(f)可变轻链CDR3，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、15、24、33、42、51、60、69、78、87、96、105、114、123、132、141、150、159、168、177、186、195、204、213、222、231、240、249、258、267、276、285、294、303、312、321、330、339、348、357、366、375、384、393、402、411、420、429、438、447、456和465。

在另一方面，本公开提供一种嵌合抗原受体，其包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述胞外结构域包含与DLL3特异性结合的DLL3抗原结合结构域，并且其中所述抗原结合结构域包含：(a)可变重链CDR1，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、10、19、28、37、46、55、64、73、82、91、100、109、118、127、136、145、154、163、172、181、190、199、208、217、226、235、244、253、262、271、280、289、298、307、316、325、334、343、352、361、370、379、388、397、406、415、424、433、442、451和460；(b)可变重链CDR2，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ NO:2、11、20、38、47、56、65、74、83、92、101、110、119、128、137、146、155、164、173、182、191、200、209、218、227、236、245、254、263、272、281、290、299、308、317、326、335、344、353、362、371、380、389、398、407、416、425、434、443、452、和695461；以及(c)可变重链CDR3，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、12、21、30、39、48、57、66、75、84、93、102、111、120、129、138、147、156、165、174、183、192、201、210、219、228、237、246、255、264、273、282、291、300、309、318、327、336、345、354、363、372、381、390、399、408、417、426、435、444、453和462。

在一个方面，本公开提供一种嵌合抗原受体，其包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述胞外结构域包含与DLL3特异性结合的DLL3抗原结合结构域，并且其中所述抗原结合结构域包含：(a)可变轻链CDR1，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、13、22、31、40、49、58、67、85、94、103、112、121、130、139、148、157、166、175、184、193、202、211、220、229、238、247、256、265、274、283、292、301、310、319、328、337、346、355、364、373、382、391、400、409、418、427、436、445、454、463和696；(b)可变轻链CDR2，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ NO:5、14、23、32、41、50、59、68、77、86、95、104、113、122、131、140、149、158、167、176、185、194、203、212、221、230、239、248、257、266、275、284、293、302、311、320、329、338、347、356、365、374、383、392、401、410、419、428、437、446、455和464；以及(c)可变轻链CDR3，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、15、24、33、42、51、60、69、78、87、96、105、114、123、132、141、150、159、168、177、186、195、204、213、222、231、240、249、258、267、276、285、294、303、312、321、330、339、348、357、366、375、384、393、402、411、420、429、438、447、456和465。

在另一方面，本公开提供一种嵌合抗原受体，其包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述胞外结构域包含与DLL3特异性结合的DLL3抗原结合结构域，并且其中所述抗原结合结构域包含以下中的至少一种：(a)可变重链，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、16、25、34、43、52、61、70、79、88、97、106、115、124、133、142、151、160、169、178、187、196、205、214、223、232、241、250、259、268、277、286、295、304、313、322、331、340、349、358、367、376、385、394、403、412、421、430、439、448、457、466；和(b)可变轻链，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ NO:8、17、26、35、44、53、62、71、80、89、98、107、116、125、134、143、152、161、170、179、188、197、206、215、224、233、242、251、260、269、278、287、296、305、314、323、332、341、350、359、368、377、386、395、404、413、422、431、440、449、458和467，其中可变重链和可变轻链通过至少一个接头连接。

在又一方面，本公开提供一种嵌合抗原受体，其包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述胞外结构域包含与DLL3特异性结合的DLL3抗原结合结构域，并且其中所述抗原结合结构域包含：(a)可变重链，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQID NO:7、16、25、34、43、52、61、70、79、88、97、106、115、124、133、142、151、160、169、178、187、196、205、214、223、232、241、250、259、268、277、286、295、304、313、322、331、340、349、358、367、376、385、394、403、412、421、430、439、448、457和466；以及(b)可变轻链，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ NO:8、17、26、35、44、53、62、71、80、89、98、107、116、125、134、143、152、161、170、179、188、197、206、215、224、233、242、251、260、269、278、287、296、305、314、323、332、341、350、359、368、377、386、395、404、413、422、431、440、449、458和467，其中可变重链和可变轻链通过至少一个接头连接。

在一个方面，本公开提供一种嵌合抗原受体，其包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述胞外结构域包含与DLL3特异性结合的DLL3抗原结合结构域，并且其中所述抗原结合结构域包含选自由表1d中列出的那些scFv组成的组的序列。

在另一方面，本公开提供了与DLL3特异性结合的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:482至533和SEQ ID NO:632-683中任一个具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:482至533和632-683中任一个的氨基酸序列。

在一些实施例中，本公开提供了与DLL3特异性结合的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:482至533和SEQ ID NO:632-683中任一个具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且带有或不带有信号序列。在一些实施例中，嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:482至533和632-683中任一个的氨基酸序列，并且带有或不带有信号序列。

在一些实施例中，嵌合抗原受体的胞内结构域包含至少一个共刺激结构域。

在一些实施例中，所述共刺激结构域是以下物质的信号传导区：CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡因子-1(PD-1)、诱导型T细胞共刺激因子(ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1(CD1 1a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受体、I类MHC分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α.、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 1a、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD1 1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAMI(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、与CD83特异性结合的配体或其任何组合。

在一些实施例中，共刺激结构域包含CD28的信号传导区。

在一些实施例中，CD28共刺激结构域包含SEQ ID NO:550。

在一些实施例中，共刺激结构域包含4-1BB/CD137的信号传导区。

在一些实施例中，4-1BB/CD137共刺激结构域包含SEQ ID NO:480。

在一些实施例中，胞内结构域包含至少一个激活结构域。

在一些实施例中，激活结构域包含CD3。

在一些实施例中，CD3包含CD3ζ。

在一些实施例中，CD3ζ包含SEQ ID NO:481。

在一些实施例中，嵌合抗原受体由SEQ ID NO:571-621和631中任一个的多核苷酸序列编码。

在一些实施例中，嵌合抗原受体还包含安全开关。

在一些实施例中，安全开关包含CD20模拟表位或QBEND-10表位。

在一些实施例中，安全开关包含一个或多个CD20模拟表位或一个或多个QBEND-10表位，或其组合。

在一些实施例中，嵌合抗原受体包含一个或多个呈QR3、SR2、RSR或R2S形式的安全开关。

在一些实施例中，嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:622-628、474-476、565和684-694中任一个具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

在一些实施例中，嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:622-628、474-476、565和684-694中任一个具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且带有或不带有信号序列

在一些方面，本公开提供一种分离的多核苷酸，其编码本文所述的嵌合抗原受体中的任一种。

在另一方面，本公开提供一种载体，其包含编码本文所述的嵌合抗原受体中的任一种的多核苷酸。

在一些实施例中，载体是逆转录病毒载体、DNA载体、质粒、RNA载体、腺病毒载体、腺病毒相关载体、慢病毒载体或其任何组合。

在另一方面，本公开提供一种工程化的免疫细胞，其表达本文所述的嵌合抗原受体。

在一些方面，本公开提供一种工程化的免疫细胞，其表达编码本文所述的嵌合抗原受体中的任一种的多核苷酸或载体。

在一些实施例中，工程化的免疫细胞是T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、NK细胞、表达TCR的细胞、树突状细胞或NK-T细胞。

在一些实施例中，工程化的免疫细胞是自体T细胞。

在一些实施例中，工程化的免疫细胞是同种异体T细胞。

在一些实施例中，工程化的免疫细胞是敲除TCR(例如TCRα、TCRβ)的。

在一个方面，本公开提供一种药物组合物，其包含表达本文所述的嵌合抗原受体的工程化的免疫细胞。

在一些方面，本公开提供一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用表达本文所述的嵌合抗原受体的工程化的免疫细胞或包含所述工程化的免疫细胞的药物组合物。

在一些实施例中，疾病或病症是癌症。

在一些实施例中，疾病或病症是小细胞肺癌。

在一些方面，本公开提供一种制品，其包含表达本文所述的嵌合抗原受体的工程化的免疫细胞或包含所述工程化的免疫细胞的药物组合物。

在一些方面，本公开提供本文所述的抗DLL3结合剂。

在一些实施例中，抗DLL3结合剂是抗体、抗体缀合物或其抗原结合片段，任选地，F(ab')₂片段、Fab'片段、Fab片段、Fv片段、scFv片段、dsFv片段或dAb片段。

在一些实施例中，结合剂是包含IgG恒定区的单克隆抗体。

在一些实施例中，抗DLL3结合剂包含与表1b中提供的可变重链(VH)序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的VH序列。

在一些实施例中，抗DLL3结合剂包含与表1c中提供的可变轻链(VL)序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的VL序列。

在一些实施例中，抗DLL3结合剂包含与表1d中列出的scFv序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的序列。

在一些实施例中，抗DLL3结合剂是包含与Fc恒定区融合的scFv片段的融合蛋白。

在一些方面，本公开提供一种药物组合物，其包含本文所述的抗DLL3结合剂和药学上可接受的赋形剂。

在一些方面，本公开提供一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的抗DLL3结合剂或包含抗DLL3结合剂的药物组合物。

在一些实施例中，疾病或病症是癌症。

在一些实施例中，疾病或病症是小细胞肺癌。

附图说明

图1A-1B是一系列曲线图，显示本文所述的纯化的抗DLL3抗体与三种表达DLL3的小细胞肺癌细胞系(SHP-77、DMS 273和DMS 454)结合。实线和虚线分别表示用抗DLL3抗体或小鼠IgG2A同型对照抗体进行的染色。

图2A-2D显示表位定位实验的结果。图2A是用于表位定位的在CHO细胞上表达的全长和截短的人DLL3蛋白的示意图，并且所有蛋白质在N末端与HA标签融合以便于检测。图2B和2C显示图2A所示的全长和截短的人DLL3蛋白的氨基酸序列。图2D是一系列曲线图，显示抗DLL3抗体的表位定位的结果，以及分别识别DSL、EGF1和EGF3结构域的抗DLL3抗体的实例；x轴描绘来自PE通道的信号，并且y轴表示计数。

图3A-3C是一系列图和表格，显示来自两个不同供体的细胞的结构、转导效率以及抗DLL3 CAR的细胞毒性活性。图3A是编码抗DLL3 CAR的构建体的示意图，该构建体从N末端到C末端包含：抗DLL3 scFv、来自人CD8α的铰链和跨膜区、来自人41BB的胞质区和来自人CD3ζ的胞质区。图3B描绘了实验数据，显示抗DLL3 CAR在原代T细胞的表面上表达并且可以识别重组DLL3；所述图对活CD3+细胞进行门控，并且图上的数字是表达每种抗DLL3 CAR的细胞的百分比。图3C和3D显示包含本文所述的scFv序列的抗DLL3 CAR的转导效率。

图4A-4C是一系列曲线图，显示一些抗DLL3 CAR的杀死数据。图4A描绘了实验数据，显示抗DLL3 CAR-T细胞在3天的细胞毒性测定中以指定的效应子:靶(E:T)比率特异性杀死表达人DLL3的HEK-293T细胞，而不杀死亲本HEK-293T细胞。不表达抗DLL3 CAR的T细胞(标记为“空载体”)用作阴性对照。图4B描绘了实验数据，显示抗DLL3 CAR-T细胞在3天的细胞毒性测定中以指定的效应子:靶比率杀死表达内源性DLL3的SHP-77和WM266.4细胞。.图4C描绘了实验数据，显示抗DLL3 CAR-T细胞在3天细胞毒性测定中以指定的效应子:靶比率杀死表达内源性DLL3的DMS 454和DMS 273小细胞肺癌细胞。对于图4A-4C中的所有曲线图，使用One-glo测定系统来评估靶细胞的活力，n＝3。

图5是一系列条形图，显示当将抗DLL3 CAR-T细胞和表达DLL3的SHP-77细胞以1:1或1:9的效应子:靶比率培育24小时的时候，所述CAR-T细胞在与SHP-77细胞系共培育后释放细胞因子。收集上清液，并使用来自MSD的促炎性9重试剂盒测量IFN-γ、IL-2和TNF-α水平，n＝3。

图6A-6B是显示在将抗DLL3 CAR-T细胞反复暴露于DLL3+细胞系之后的连续杀死测定的实验数据的曲线图。图6A描绘了抗DLL3 CAR-T细胞对DLL3+WM266.4细胞的连续杀死情况。在测定的第12天，一些克隆保持活性。图6B描绘了抗DLL3 CAR-T细胞对DMS454和WM266.4细胞的连续杀死情况。图6C描绘了抗DLL3 CAR-T对DMS 273小细胞肺癌系的连续杀死情况。对于图6A-6C中的所有曲线图，使用one-glo测定或CellTiter-glo系统来评估靶细胞活力，n＝3-5。

图7A-7B是展示抗DLL3 CAR-T细胞以剂量依赖性方式消除在小鼠中建立的SHP-77小细胞肺癌皮下肿瘤的曲线图。

图8是展示10G1-K抗DLL3 CAR-T细胞以剂量依赖性方式抑制已建立的IV注射的SHP-77小细胞肺癌肿瘤的生长的曲线图。利用重复测量，使用ANOVA进行统计分析(Dunnett多重比较)，第14天至第28天，n＝4-5。*，p<0.05。**，p<0.01。

图9A-9C描绘了原代T细胞的结构、转导效率和具有安全开关的抗DLL3 CAR的细胞毒性活性。图9A是显示具有4种不同的安全开关(QR3、SR2、RSR和R2S)的CAR设计的结构的示意图。图9B显示流式细胞术图，展示了具有图9A中所示的安全开关的抗DLL3 CAR在原代T细胞的表面上表达并且可以识别重组DLL3。这些图对活CD3+细胞进行门控，并且图上的数字指示表达每种抗DLL3 CAR的细胞的百分比。图9C描绘了实验数据，显示具有安全开关的抗DLL3 CAR在连续杀死测定中具有活性。

图10A描绘的曲线图显示两位小细胞肺癌患者来源的异种移植物(PDX)模型在细胞表面上表达DLL3。实线和虚线分别表示用抗DLL3抗体或荧光扣除对照(fluorescenceminus one,FMO)进行的染色。图10B显示实验数据，显示抗DLL3 CAR-T示出针对所述两个PDX模型的细胞毒性活性。

图11A-11B示出安全开关允许利用利妥昔单抗(rituximab)检测和消耗DLL3 CAR-T细胞。图11A显示了在扩增后14天，用重组DLL3和PE缀合的利妥昔单抗对8E11-SR2和26C8-R2S抗DLL3 CAR-T细胞染色，并使用流式细胞术进行分析。象限中的数字表示总T细胞的百分比。图11B显示利妥昔单抗介导的8E11-SR2和26C8-R2S抗DLL3 CAR-T细胞的补体依赖性细胞毒性(CDC)。将CAR-T细胞与25％幼兔补体和利妥昔单抗一起培育3小时，并使用流式细胞术评估细胞毒性。

图12A-12B描绘的曲线图展示具有安全开关的抗DLL3 CAR-T细胞抑制皮下或静脉内注射的小细胞肺癌肿瘤的生长。图12A显示具有安全开关的DLL3 CAR-T细胞消除了小鼠中建立的SHP-77小细胞肺癌皮下肿瘤。图12B是展示抗DLL3 CAR-T细胞抑制IV注射的DMS273-DLL3小细胞肺癌肿瘤的生长的曲线图。

图13A显示在NSG小鼠脑中的小鼠DLL3 RNA表达的代表性图像。圆圈表示小鼠DLL3RNA的簇。图13B显示给与未转导的T细胞、10G1-K DLL3 CAR-T细胞或2G1 DLL3 CAR-T细胞的动物的脾、垂体和脑样品的抗人CD3染色情况。箭头指示脾中的CD3阳性细胞。

图14A-14F显示了使用皮下LN229-mDLL3肿瘤模型进行的小鼠安全性研究的实验设计和结果。图14A显示研究组和实验设计。图14B显示接受未转导的T细胞或DLL3 CAR-T细胞的动物的组织收获时机和肿瘤体积。图14C是显示脑和垂体样品的人CD3染色评分的表。图14D是显示所收获的脑和垂体样品的组织学分析的表。图14E显示用抗血管加压素抗体染色的垂体样品的图像。图14F显示用抗催产素抗体染色的垂体样品的图像。

图15A-15D显示使用颅内LN229-mDLL3肿瘤模型进行的小鼠安全性研究的实验设计和结果。图15A显示研究组和实验设计。图15B显示了接受未转导的T细胞、DLL3 CAR-T细胞或EGFRvIII CAR-T细胞的动物的组织收获时机和肿瘤体积。图15C是显示脑、垂体和脾样品的人CD45染色评分的表。图15D是显示脑和垂体样品的组织学分析的表。

图16A-16C显示解离的小鼠垂体细胞的体外细胞毒性的实验数据。图16A显示在与DLL3CAR-T细胞共培养3天后靶细胞的细胞毒性读数，这展示DLL3 CART在体外对小鼠垂体细胞没有细胞毒性。图16B显示针对与靶共培养的T细胞的激活标志物CD25和41BB进行的表面染色的流式细胞术分析，这展示小鼠垂体细胞在体外不激活DLL3 CAR-T。图16C显示通过MSD分析的在细胞培养基中分泌的细胞因子，这展示在DLL3 CAR-T细胞与小鼠垂体细胞在体外共培养3天后，没有分泌细胞因子。

具体实施方式

本文提供DLL3特异性抗体和嵌合抗原受体(CAR)。本文所述的DLL-3特异性CAR包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中胞外结构域包含与DLL3特异性结合的DLL3抗原结合结构域，以及编码这些CAR的多核苷酸。还提供了包含这些DLL3特异性CAR的免疫细胞，例如CAR-T细胞，以及包含这些免疫细胞的药物组合物。还公开了制造和使用这些DLL3特异性CAR和包含这些DLL3特异性CAR的免疫细胞的方法，例如用于治疗癌症。

I.DLL-3结合剂

本公开提供了DLL-3结合剂(例如包含DLL3抗原结合结构域的分子、DLL-3抗体或其片段)，其与DLL-3特异性结合。如本文所用，术语“抗体”是指这样一种多肽，该多肽包括足以赋予与特定靶抗原(例如DLL-3)的特异性结合的规范性免疫球蛋白序列元件。如本领域中已知的，天然产生的完整抗体是约150kD的四聚体试剂，其包含两个相同的重链多肽(各为约50kD)和两个相同的轻链多肽(各为约25kD)，它们彼此缔合成通常称为“Y形”结构的结构。每条重链均包含至少四个结构域(各自为约110个氨基酸长)，即氨基末端可变(VH)结构域(位于Y结构的尖端)，然后是三个恒定结构域：CHI、CH2和羧基末端CH3(位于Y茎的基部)。一个称为“开关”的短区域连接重链可变区和恒定区。“铰链”将CH2和CH3结构域连接至抗体的其余部分。这一铰链区中的两个二硫键在完整抗体中将两个重链多肽彼此连接。每条轻链包含两个结构域，即氨基末端可变(VL)结构域，然后是羧基末端恒定(CL)结构域，通过另一个“开关”彼此隔开。本领域技术人员熟知抗体的结构和序列元件，识别所提供序列中的“可变”和“恒定”区，并理解在界定这些结构域之间的“边界”方面可能有一定的灵活性，由此使相同抗体链序列的不同表示可以例如指示这种边界在相对于相同抗体链序列的不同表示移位一个或几个残基的位置处。

典型地，根据以下编号方案指定框架、CDR和可变结构域的氨基酸：Kabat编号(参见例如Kabat等.《免疫相关蛋白质的序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)》,第5版,NIH Publication 91-3242,马里兰州贝塞斯达(Bethesda Md.)1991)；Chothia编号(参见例如Chothia和Lesk,(1987),《分子生物学杂志(J Mol Biol)》196:901-917；Al-Lazikani等，(1997)《分子生物学杂志》273:927-948；Chothia等，(1992)《分子生物学杂志》227:799-817；Tramontano等，(1990)《分子生物学杂志》215(1):175-82；和美国专利号7,709,226)；contact编号；或AbM方案(Antibody Modeling program,OxfordMolecular)。

因此，在一些实施例中，本文提出的DLL3结合剂的CDR是根据Kabat编号方案编号。在其它实施例中，本文提出的DLL3结合剂的CDR是根据Chothia编号方案编号。在其它实施例中，本文提出的DLL3结合剂的CDR是根据contact编号方案编号。在其它实施例中，本文提出的DLL3结合剂的CDR是根据AbM编号方案编号。

完整的抗体四聚体包含两个重链-轻链二聚体，其中重链和轻链通过单个二硫键相互连接；另外两个二硫键将重链铰链区彼此连接，从而使二聚体彼此连接并形成四聚体。天然产生的抗体也被糖基化，典型地在CH2结构域上。天然抗体中的每个结构域具有以“免疫球蛋白折叠”为特征的结构，该“免疫球蛋白折叠”由两个β折叠(例如3、4或5条折叠)在压缩的反向平行β桶中彼此堆积形成。每个可变结构域都含有三个被称为“互补决定区”(CDR1、CDR2和CDR3)的高变环和四个几乎不变的“框架”区(FR1、FR2、FR3和FR4)。当天然抗体折叠时，FR区形成β折叠以提供结构域的结构框架，并且来自重链和轻链的CDR环区域都在三维空间中聚集在一起，从而它们形成位于Y形结构的尖端的单个高变抗原结合位点。天然存在的抗体的Fc区与补体系统的元件结合，并且还与包括例如介导细胞毒性的效应细胞在内的效应细胞上的受体结合。如本领域中已知的，可以通过糖基化或其它修饰来调节Fc区对Fc受体的亲和力和/或其它结合属性。在一些实施例中，根据本发明产生和/或利用的抗体包括糖基化的Fc结构域，包括具有修饰或工程化的此类糖基化的Fc结构域。

为了本发明的目的，在某些实施例中，包括在天然抗体中发现的足够免疫球蛋白结构域序列的任何多肽或多肽复合物都可以被称为和/或用作“抗体”，无论所述多肽是天然产生的(例如由生物体与抗原反应产生)，还是通过重组工程化、化学合成或其它人工系统或方法产生的。在一些实施例中，抗体是多克隆的；在一些实施例中，抗体是单克隆的。在一些实施例中，抗体具有恒定区序列，这些序列是小鼠、兔、灵长类动物或人抗体特有的。在一些实施例中，如本领域已知的，抗体序列元件是人源化的、灵长类化的、嵌合的等。

此外，本文所用的术语“抗体”在适当的实施例中可以指(除非另有说明或从上下文中清楚看出)用于在替代表示中利用抗体的结构和功能特征的任何本领域已知或开发的构建体或形式。例如，在一些实施例中，根据本发明使用的抗体具有选自但不限于下述的形式：完整的IgA、IgG、IgE或IgM抗体；双特异性或多特异性抗体(例如

等)；抗体片段，例如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd'片段、Fd片段和分离的CDR或其集合；单链Fv；多肽-Fc融合体；单结构域抗体(例如鲨鱼单结构域抗体，例如IgNAR或其片段)；骆驼抗体；掩蔽抗体(例如

)；小型模块化免疫药物(Small ModularImmunoPharmaceuticals，SMIPs^TM)；单链或串联双功能抗体

VHH；

微型抗体；

锚蛋白重复蛋白或

DART；TCR样抗体；

MicroProteins；

和

s。在一些实施例中，抗体可能缺乏在天然产生的情况下其将具有的共价修饰(例如附接聚糖)。在一些实施例中，抗体可以含有共价修饰(例如附接聚糖、有效负载(例如可检测部分、治疗性部分、催化性部分等)或其它侧基(例如聚乙二醇等)。

抗体包括抗体片段。抗体还包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合dAb(结构域抗体)、单链、F_ab、F_a、F_(ab)2片段、scFv和F _ab表达文库。抗体可以是完整抗体，或免疫球蛋白，或抗体片段。

如上所述，完整抗体由两对“轻链”(LC)和“重链”(HC)组成(此类轻链(LC)/重链对在本文中简称为LC/HC)。此类抗体的轻链和重链是由几个结构域组成的多肽。在完整抗体中，每条重链均包含重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含重链恒定结构域CHI、CH2和CH3(抗体类别IgA、IgD和IgG)和任选的重链恒定结构域CH4(抗体类别IgE和IgM)。每条轻链包含轻链可变结构域VL和轻链恒定结构域CL。可变结构域VH和VL可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着更为保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(Janeway,C.A.,Jr等(2001).《免疫学(Immunobiology.)》,第5版,Garland Publishing；和Woof,J.,Burton,D.,《自然评论：免疫学(Nat Rev Immunol)》4(2004)89-99)。这两对重链和轻链(HC/LC)能够特异性结合同一抗原。因此，所述完整抗体是二价单特异性抗体。此类“抗体”包括例如小鼠抗体、人抗体、嵌合抗体、人源化抗体和遗传工程化的抗体(变异或突变抗体)，只要保持其特有性质即可。在一些实施例中，抗体或结合剂是人源化抗体，特别是作为重组人或人源化抗体。

在一些实施例中，抗体或结合剂可以是“对称”的。“对称”的是指抗体或结合剂具有相同种类的Fv区(例如抗体具有两个Fab区)。在一些实施例中，抗体或结合剂可以是“不对称”的。“不对称”的是指抗体或结合剂具有至少两种不同种类的Fv区(例如抗体具有：Fab和scFv区，Fab和scFv2区或Fab-VHH区)。各种不对称抗体或结合剂结构在本领域中是已知的(Brinkman和Kontermann等.2017Mabs(9)(2):182-212)。

如本文所用，术语“抗体试剂”是指与特定抗原特异性结合的试剂。在一些实施例中，该术语涵盖包括足以赋予特异性结合的免疫球蛋白结构元件的任何多肽或多肽复合物。示例性抗体试剂包括但不限于单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施例中，抗体试剂可以包括一个或多个小鼠、兔、灵长类动物或人抗体特有的恒定区序列。在一些实施例中，如本领域已知的，抗体试剂可包括一个或多个人源化、灵长类化、嵌合等的序列元件。在许多实施例中，术语“抗体试剂”用于指用于在替代表示中利用抗体的结构和功能特征的一种或多种本领域已知或开发的构建体或形式。例如，根据本发明使用的抗体试剂是选自但不限于下述的形式：完整的IgA、IgG、IgE或IgM抗体；双或多特异性抗体(例如

等)；抗体片段，例如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd'片段、Fd片段和分离的CDR或其集合；单链Fv；多肽-Fc融合体；单结构域抗体(例如鲨鱼单结构域抗体，例如IgNAR或其片段)；骆驼抗体；掩蔽抗体(例如

)；小型模块化免疫药物(SMIPs^TM)；单链或串联双功能抗体

VHH；

微型抗体；

锚蛋白重复蛋白或

DART；TCR样抗体；

MicroProteins；

和

在一些实施例中，抗体可能缺乏在天然产生的情况下其将具有的共价修饰(例如附接聚糖)。在一些实施例中，抗体可含有共价修饰(例如附接聚糖、有效负载[例如可检测部分、治疗性部分、催化性部分等]或其它侧基[例如聚乙二醇等]。在许多实施例中，抗体试剂是多肽或包含多肽，所述多肽的氨基酸序列包括一个或多个本领域技术人员公认为互补决定区(CDR)的结构元件；在一些实施例中，抗体试剂是多肽或包含多肽，所述多肽的氨基酸序列包括至少一个与参考抗体中发现的氨基酸序列基本上相同的CDR(例如至少一个重链CDR和/或至少一个轻链CDR)。在一些实施例中，抗体试剂是多肽或具有多肽，所述多肽的氨基酸序列包括本领域技术人员公认为免疫球蛋白可变结构域的结构元件。在一些实施例中，抗体试剂是多肽蛋白，其具有与免疫球蛋白结合结构域同源或大体上同源的结合结构域。

本发明的编码的抗体或抗原结合分子可以是单链或双链的。在一些实施例中，抗体或抗原结合分子是单链的。在某些实施例中，抗原结合分子选自由scFv、Fab、Fab'、Fv、F(ab')₂、dAb及其任何组合组成的组。

在一些实施例中，抗DLL-3抗体试剂是分离的。在一些实施例中，抗体试剂可以纯化至大于95％或99％的纯度，纯度是通过例如电泳(例如SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱法(例如离子交换或反相HPLC)确定(参见例如Flatman等，《色谱法杂志B(J.Chromatogr.,B)》848:79-87(2007))。在一些方面，本公开提供了一种组合物，该组合物包含DLL-3结合剂(例如DLL3特异性抗体)和药学上可接受的载体。

在一些实施例中，抗DLL-3抗体试剂包含Fc。Fc结构域可与细胞表面受体相互作用，这能够使抗体激活免疫系统。在IgG、IgA和IgD抗体同型中，Fc区由两个相同的蛋白质片段构成，所述两个蛋白质片段源自抗体两条重链的第二和第三恒定结构域；IgM和IgE Fc区在每个多肽链中均含有三个重链恒定结构域(C_H结构域2-4)。IgG的Fc区可能带有高度保守的N-糖基化位点(N297)。Fc片段的糖基化对于Fc受体介导的活性可能是必不可少的。附接于这一位点的N-聚糖可以主要是复杂类型的核心-岩藻糖基化双触角结构。

虽然轻链和重链的恒定区可以不直接参与抗体与抗原的结合，但是恒定区可以影响可变区的取向。恒定区还可以表现出各种效应子功能，例如通过与效应分子和细胞相互作用而参与抗体依赖性补体介导的溶解或抗体依赖性细胞毒性。

公开的抗DLL-3抗体试剂可以是任何同型的抗体，包括同型IgA、同型IgD、同型IgE、同型IgG或同型IgM。在一些实施例中，抗DLL-3抗体含有IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定结构域。

本文提供了可以与DLL3靶的各种区域或结构域结合的DLL3结合剂(例如抗体)。表位可以是例如DLL3靶的连续氨基酸(线性或连续表位)或来自DLL3靶的在一起的两个或更多个连续区(构象、非线性、不连续或非连续表位)。DLL3抗原结合结构域所结合的表位可以通过各种测定法确定，例如NMR光谱、X射线衍射晶体学研究、ELISA测定、氢/氘交换联合质谱法(例如液相色谱电喷雾质谱法)、基于阵列的寡肽扫描测定、流式细胞术和/或诱变定位(例如定点诱变定位)。

代表性的DLL3区或结构域显示在图2中。本文描述的示例性DLL3抗体与表1a中提供的DLL3结构域结合。

表1a：提供的克隆所结合的DLL3结构域

克隆名称	与DLL3结构域结合(图2A)
		2D3	EGF3
5E12	DSL
		26C8	EGF3
2A6.C5	EGF3
		6D8	EGF1
7F9	N-ter
		8E11	EGF3
9D3	EGF3
		11H7	DSL
16H7	EGF2
		2C3	EGF2
4F9	N末端
		4G9	N末端
2G1	EGF5
		3F2	N末端
17A2	EGF1
		6F8	EGF5
9H12-K	EGF4
		4H8	EGF4
10G1-K	EGF5
		11A3	EGF3
4E6	EGF3

在一些实施例中，DLL3结合剂包含可变重链(VH)，其中VH的氨基酸序列选自表1b中列出的VH序列。在一些实施例中，抗DLL-3结合剂包含与表1b中列出的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的免疫球蛋白重链。

表1b：重链可变区(VH)

在一些实施例中，DLL3结合剂包含可变轻链(VL)，其中VL的氨基酸序列选自表1c中列出的VL序列。在一些实施例中，抗DLL-3结合剂包含与表1c中列出的氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)序列同一性的免疫球蛋白轻链。

表1c：轻链可变区

本文提供了DLL3结合剂(例如抗体)，其中DLL3抗原结合结构域包含可变重链(VH)和可变轻链，其中VH的氨基酸序列选自表1b中列出的VH序列；并且VL的氨基酸序列选自表1c中列出的VL序列。

在一些实施例中，DLL-3结合剂包含重链CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施例中，重链CDR1、CDR2和CDR3序列选自表1e中列出的重链CDR。

表1e：重链CDR

在一些实施例中，DLL-3结合剂包含轻链CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施例中，轻链CDR1、CDR2和CDR3序列选自表1f中列出的轻链CDR。

表1f：轻链CDR

克隆	CDR1 VL序列	SEQ ID NO:
			3B9	RASQSVSRRYLA	SEQ ID NO:364
3F9-L	SGSSSNIGSNTAN	SEQ ID NO:373
			3E10	SGSSSNIGSNYVY	SEQ ID NO:382
3C3	RASQGINNFLA	SEQ ID NO:391
			11F4	RASQSVSRSYLA	SEQ ID NO:400
10E12	SGSSSNIGNNYVS	SEQ ID NO:409
			4E1	TGTSSDVGSYNLVS	SEQ ID NO:418
2404.6H1	RASQSVSRTYLA	SEQ ID NO:427
			2A8-K	KSSQSVLDSSNNNNYFA	SEQ ID NO:436
3B1	SGSSSNIGSNTVN	SEQ ID NO:445
			9B5	RGSQGISNYLA	SEQ ID NO:454
11A5	GLSSGSVSTSYYPS	SEQ ID NO:463

克隆	CDR2 VL序列	SEQ ID NO:
			2D3	GASTRAT	SEQ ID NO:5
5A2	GASSRAT	SEQ ID NO:14
			7F9	AASTLQS	SEQ ID NO:23
9D3	GASSRAT	SEQ ID NO:32
			26C8	GASSRAT	SEQ ID NO:41
2A6.C5	GASSRAT	SEQ ID NO:50
			5E12	LGSNRAS	SEQ ID NO:59
6D8	DAFYRAT	SEQ ID NO:68
			8E11	GASSRAT	SEQ ID NO:77
5C1.A4	LGSNRAS	SEQ ID NO:86
			9F7	AASSLQS	SEQ ID NO:95
2C3	KASSLES	SEQ ID NO:104
			2G1	AASSLQS	SEQ ID NO:113
3E4	AASSLQS	SEQ ID NO:122
			3F2	KASSLES	SEQ ID NO:131
4F9	AASSLQS	SEQ ID NO:140
			4G9	AASSLQS	SEQ ID NO:149
11H7	AASSLQS	SEQ ID NO:158
			16H7	KASSLES	SEQ ID NO:167
17A2	WASTRES	SEQ ID NO:176
			6H1	AASSLQS	SEQ ID NO:185
6H5	AASSLQS	SEQ ID NO:194
			10D1	AASSLQS	SEQ ID NO:203
11F6	KASTLES	SEQ ID NO:212
			6F8	DNKRPS	SEQ ID NO:221
3G6-L1	DNKRPS	SEQ ID NO:230
			4C6	GASSRAT	SEQ ID NO:239
4E6	GASSRAA	SEQ ID NO:248
			4H8	SNNQRPS	SEQ ID NO:257
9H12-K	TASSLQG	SEQ ID NO:266

克隆	CDR2 VL序列	SEQ ID NO:
			10G1-K	AASSLQS	SEQ ID NO:275
11A3	GASSRAT	SEQ ID NO:284
			3B11	TNNQRPS	SEQ ID NO:293
5G2	SNNQRPS	SEQ ID NO:302
			11E4	GASSRAT	SEQ ID NO:311
2404.8E11	SNNQRPS	SEQ ID NO:320
			10A2	SNNQRPS	SEQ ID NO:329
11A8	SNNQRPS	SEQ ID NO:338
			4H5	KASSLES	SEQ ID NO:347
3G6-L2	SNNQRPS	SEQ ID NO:356
			3B9	GASSRAT	SEQ ID NO:365
3F9-L	RNNQRPS	SEQ ID NO:374
			3E10	SNNQRPS	SEQ ID NO:383
3C3	AASSLQS	SEQ ID NO:392
			11F4	GASSRAT	SEQ ID NO:401
10E12	DNKRPS	SEQ ID NO:410
			4E1	EGSKRPS	SEQ ID NO:419
2404.6H1	GASSRAT	SEQ ID NO:428
			2A8-K	WASSRES	SEQ ID NO:437
3B1	TNNQRPS	SEQ ID NO:446
			9B5	AASSLES	SEQ ID NO:455
11A5	STDTRSS	SEQ ID NO:464

克隆	CDR3 VL序列	SEQ ID NO:
			2D3	CQQYNNWPLTF	SEQ ID NO:6
5A2	CQQYGTSPLTF	SEQ ID NO:15
			7F9	CQKYNSVPLTF	SEQ ID NO:24
9D3	CQQYGTSPLTF	SEQ ID NO:33
			26C8	CQQYGTSPLTF	SEQ ID NO:42
2A6.C5	CQQYGWSPITF	SEQ ID NO:51
			5E12	CMQALEIPLTF	SEQ ID NO:60
6D8	CQHRSNWPITF	SEQ ID NO:69
			8E11	CQQYDTSPLTF	SEQ ID NO:78
5C1.A4	CMQALQTPLTF	SEQ ID NO:87
			9F7	CLQDYNYPYTF	SEQ ID NO:96
2C3	CQQYNSYSTF	SEQ ID NO:105
			2G1	CLQDYNYPLTF	SEQ ID NO:114
3E4	CLQDYDYPLTF	SEQ ID NO:123
			3F2	CQQYNSYSTF	SEQ ID NO:132
4F9	CLQDYDYPLTF	SEQ ID NO:141
			4G9	CLQDYDYPLTF	SEQ ID NO:150
11H7	QQADSFPFTF	SEQ ID NO:159
			16H7	CQQYNSYSTF	SEQ ID NO:168
17A2	QQYYGTSWTF	SEQ ID NO:177

克隆	CDR3 VL序列	SEQ ID NO:
			6H1	CHQANSFFTF	SEQ ID NO:186
6H5	CLQHNSYPRTF	SEQ ID NO:195
			10D1	CLQYNSYPRTF	SEQ ID NO:204
11F6	CQQYNGYSTF	SEQ ID NO:213
			6F8	CGTWDSSLSAVVF	SEQ ID NO:222
3G6-L1	CGTWDSSLSAVVF	SEQ ID NO:231
			4C6	CQQYGTSPLTF	SEQ ID NO:240
4E6	CQQYGISPLTF	SEQ ID NO:249
			4H8	CSAWDDSLNGYVF	SEQ ID NO:258
9H12-K	CQQANVFPYTF	SEQ ID NO:267
			10G1-K	CLQHDSFPLTF	SEQ ID NO:276
11A3	CQQYDTSPLTF	SEQ ID NO:285
			3B11	CAWDDSLNGHVF	SEQ ID NO:294
5G2	CAWDDSLNGHVF	SEQ ID NO:303
			11E4	CQQYGTSPITF	SEQ ID NO:312
2404.8E11	CAAWDDSLNGYVF	SEQ ID NO:321
			10A2	CAAWDDSLNGYVF	SEQ ID NO:330
11A8	CSAWDDWLNGYVF	SEQ ID NO:339
			4H5	CQQYNSYSRTF	SEQ ID NO:348
3G6-L2	CAAWDDSLSGWVF	SEQ ID NO:357
			3B9	CQQFGTSPITF	SEQ ID NO:366
3F9-L	CAAWDDSLNGYVF	SEQ ID NO:375
			3E10	CAPWDDSLSGRVF	SEQ ID NO:384
3C3	CQHYNSYPITF	SEQ ID NO:393
			11F4	QQYYSISPLTF	SEQ ID NO:402
10E12	CETWDSSLSAVVF	SEQ ID NO:411
			4E1	CCSYAGSSTWVF	SEQ ID NO:420
2404.6H1	CQQYGTSPITF	SEQ ID NO:429
			2A8-K	CQQYYSTPYTF	SEQ ID NO:438
3B1	CSTWDDSLNGPVF	SEQ ID NO:447
			9B5	CQQYYNYPITF	SEQ ID NO:456
11A5	CVLYMGSGISVF	SEQ ID NO:465

本公开包括对包含表1b至1e中所示序列的DLL3抗体试剂的修饰，包括具有不会显著影响其性质的修饰的功能上等效的DLL3抗体试剂，以及具有增强或降低的活性和/或亲和力的变体。例如，可以对氨基酸序列进行突变以获得对DLL3具有期望的结合亲和力的DLL3抗原结合剂。多肽的修饰是本领域的常规实践，且本文无需详细描述。修饰的多肽的实例包括下述多肽，其具有保守氨基酸残基取代、一个或多个不显著有害地改变功能活性或使多肽对其配体的亲和力成熟(增强)的氨基酸的缺失或添加，或者使用化学类似物。

氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基末端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体或与表位标签融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括酶或多肽与抗体N-或C末端融合，这将增加抗体在血液循环中的半衰期。

取代变体去除了抗原结合结构域中的至少一个氨基酸残基，并且在其位置插入不同的残基。在一些实施例中，用于取代诱变的感兴趣位点包括高变区/CDR，但是也可以考虑FR改变。保守性取代显示于表2中“保守性取代”标题下。如果这种取代引起生物活性的改变，则可以引入更实质性的改变，在表2中命名为“示例性取代”，或者如以下参考氨基酸类别进一步描述的取代，并筛选产物。

表2：氨基酸取代

i.抗体片段

在一个方面，根据任何上述实施例的抗DLL-3抗体试剂可以是抗体片段。抗体片段包含完整抗体的一部分，例如完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段包括但不限于Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂、Fv、双功能抗体、线性抗体、由抗体片段抗体形成的多特异性和scFv片段，以及以下描述的其它片段。在一些实施例中，抗体是全长抗体，例如完整的IgG1抗体或本文所述的其它抗体类别或同型。(参见例如Hudson等，《自然-医学(Nat.Med.)》,9:129-134(2003)；Pluckthun,《单克隆抗体的药理学(The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies)》,第113卷,第269-315页(1994)；Hollinger等，《美国国家科学院院刊》,90:6444-6448(1993)；WO93/01161；和美国专利号5,571,894、5,869,046、6,248,516和5,587,458)。全长抗体、完整抗体或全抗体是具有与天然抗体结构基本上相似的结构或具有含有本文定义的Fc区的重链的抗体。如本领域已知的，抗体片段可以通过多种技术制造，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)产生。

Fv抗体片段包含完整的抗原识别和抗原结合位点。这一片段可以包含紧密、非共价缔合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体。由这两个结构域的折叠产生六个高变环(来自H和L链各三个环)，这些高变环为抗原结合贡献氨基酸残基，并对抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使单个可变区(或Fv的一半，其仅包含对抗原具有特异性的三个CDR)也具有识别和结合抗原的能力，但亲和力仍低于整个结合位点。

双功能抗体是通过用在V_H和V_L结构域之间的短接头(例如约5-10个残基)构建sFv片段而制备的小抗体片段，从而实现V结构域的链间配对而不是链内配对，产生二价片段。双特异性双功能抗体是两个交叉sFv片段的异二聚体，其中两个抗体的V_H和V_L结构域存在于不同的多肽链上(参见例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等,《美国国家科学院院刊》,90:6444-6448(1993))。

可以呈完全人形式产生的结构域抗体(dAb)是抗体的已知最小的抗原结合片段，范围从约11kDa至约15kDa。DAb是免疫球蛋白重链和轻链的稳健可变区(分别为V_H和V_L)。它们在微生物细胞培养物中高水平表达，显示出有利的生物物理学性质，包括例如但不限于溶解度和温度稳定性，并且非常适合通过体外选择系统，例如通过噬菌体展示进行选择和亲和力成熟。dAb作为单体具有生物活性，并且由于其大小较小和固有的稳定性，可以被制成较大的分子，从而产生具有延长的血清半衰期或其它药理活性的药物(参见例如W09425591和US20030130496)。

Fv和scFv是具有缺乏恒定区的完整结合位点的物质。因此，它们可能适合于在体内使用期间减少非特异性结合。单链Fv(sFv或scFv)是一种抗体片段，其包含连接到一条多肽链中的V_H和V_L抗体结构域。sFv多肽可进一步在V_H与V_L结构域之间包含多肽接头，该接头能够使sFv形成抗原结合所需的结构(参见例如Pluckthun,《单克隆抗体的药理学》,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,纽约(New York),第269-315页(1994)；Borrebaeck 1995,下文。可以构建scFv融合蛋白，以在sFv的氨基或羧基末端产生效应蛋白的融合。抗体片段也可以是“线性抗体(参见例如美国专利号5,641,870)。此类线性抗体片段可以是单特异性或双特异性的。在表1d中提供了示例性DLL3特异性scFv。

表1d：示例性DLL3特异性scFv

在一些实施例中，DLL3抗原结合结构域包含scFv，其包含通过柔性接头接合的DLL3特异性单克隆抗体的轻链可变(V_L)区和重链可变(V_H)区。可以通过使用连接肽连接轻链可变区和/或重链可变区来制备单链可变区片段。连接肽的实例是具有氨基酸序列(GGGGS)_x的GS接头，其中x是1、2、3、4或5(SEQ ID NO:470)。在一些实施例中，x是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或小于约20的任何整数。在一些实施例中，接头是(GGGGS)₄(SEQ IDNO:478)。通常，接头可以是短的柔性多肽，在一些实施例中，所述接头包含约20个或更少氨基酸残基。接头又可以被修饰以获得其它功能，例如附接药物或附接到固体载体。单链变体可以是重组或合成产生的。对于合成产生scFv，可以使用自动合成仪。对于重组产生scFv，可以将含有编码scFv的多核苷酸的合适质粒引入合适的宿主细胞，所述宿主细胞是真核宿主细胞，例如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞；或原核宿主细胞，例如大肠杆菌。编码感兴趣scFv的多核苷酸可以通过常规操作，例如连接多核苷酸来制备。所得的scFv可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离。

在示例性实施例中，本文提供了DLL3抗原结合结构域，其包含：包含表1b中所示的VH序列的VH CDR1、VH CDR2和VH CDR3的VH区和/或包含表1c中所示的VL序列的VL CDR1、VLCDR2和VL CDR3的VL区。在一些实施例中，VH和VL通过接头连接在一起。在一些实施例中，接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:478)。在一些实施例中，接头可以由包含GGCGGTGGAGGCTCCGGAGGGGGGGGCTCTGGCGGAGGGGGCTCC(SEQ ID NO:564)的DNA序列编码。在一些实施例中，接头可以由包含ggcggcggcggctctggaggaggaggcagcggcggaggaggctccggaggcggcggctct(SEQ ID NO:630)的DNA序列编码。在一些实施例中，接头包含氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:534)。在一些实施例中，接头是scFv Whitlow接头，其可以包含氨基酸序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:535)。scFv Whitlow接头可以由包含GGGTCTACATCCGGCTCCGGGAAGCCCGGAAGTGGCGAAGGTAGTACAAAGGGG(SEQ ID NO:566)的DNA序列编码。在一些实施例中，所公开的scFv的VH和VL序列可以被定向为VH序列位于scFv的N末端，然后是接头，接着是VL序列，而在其它实施例中，scFv可以被定向为VL序列在N末端，然后是接头，接着是VH序列。

ii.嵌合和人源化抗体

在一些实施例中，抗DLL-3抗体试剂是单克隆抗体或包含单克隆抗体，包括嵌合、人源化或人抗体。

在一些实施例中，本文提供的抗DLL-3抗体试剂可以是嵌合抗体(参见例如美国专利号4,816,567；和Morrison等，《美国国家科学院院刊》,81:6851-6855(1984))。嵌合抗体可以是重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同来源或物种的抗体。在一个实例中，嵌合抗体可以包含非人可变区(例如源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或例如猴之类非人灵长类动物的可变区)和人恒定区。在另一个实例中，嵌合抗体可以是“类别转换的”抗体，其中类别或亚类已经从亲本抗体的类别或亚类发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。

在一些实施例中，嵌合抗体可以是人源化抗体(参见例如Almagro和Fransson,《生物科学前沿(Front.Biosci.)》,13:1619-1633(2008)；Riechmann等，《自然(Nature)》,332:323-329(1988)；Queen等，《美国国家科学院院刊》86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等，《方法(Methods)》36:25-34(2005)；Padlan,《分子免疫学(Mol.Immunol)》,28:489-498(1991)；Dall'Acqua等，Methods,36:43-60(2005)；Osbourn等，《方法》,36:61-68(2005)；以及Klimka等，《英国癌症杂志(Br.J.Cancer)》,83:252-260(2000))。人源化抗体是一种嵌合抗体，其包含来自非人高变区的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施例中，人源化抗体将包含至少一个并且典型地是两个可变结构域的基本上全部，其中所有或基本上所有的高变区(例如CDR)都对应于非人抗体的那些，并且所有或基本上所有的FR都对应于人抗体的那些。人源化抗体可任选地包含源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。

非人抗体可以被人源化以降低对人类的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。人源化抗体可包含一个或多个可变结构域，其包含源自非人抗体的一个或多个CDR或其部分。人源化抗体可包含一个或多个可变结构域，其包含源自人抗体序列的一个或多个FR或其部分。人源化抗体可以任选地包含人恒定区的至少一部分。在一些实施例中，人源化抗体中的一个或多个FR残基被来自非人抗体(例如作为CDR残基来源的抗体)的相应残基取代，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。

可用于人源化的人类框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区；源自轻链或重链可变区特定亚组的人抗体的共有序列的框架区；人成熟(体细胞突变)框架区或人生殖系框架区；以及由筛选FR文库得到的框架区(参见例如Sims等，《免疫学杂志(J.Immunol)》,151:2296(1993)；Carter等，《美国国家科学院院刊》,89:4285(1992)；Presta等，《免疫学杂志》,151:2623(1993)；Baca等，《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》,272:10678-10684(1997)；和Rosok等，《生物化学杂志》,271:22611-22618(1996))。

iii.人抗体

在一些实施例中，本文提供的抗DLL-3抗体是人抗体。可以使用本领域已知的各种技术来产生人抗体(参见例如van Dijk和van de Winkel,《药理学新见(Curr.Opin.Pharmacol)》,5:368-74(2001)；和Lonberg,《免疫学新见》,20:450-459(2008))。人抗体可以是具有下述氨基酸序列的抗体，该氨基酸序列对应于由人或人体细胞产生的或源自利用人抗体谱系或其它人抗体编码序列的非人来源的抗体的氨基酸序列。人抗体的这一定义特别地排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。可以通过向转基因动物施用免疫原(例如DLL-3蛋白)来制备人抗体，该转基因动物已被修饰成响应抗原性激发而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体(参见例如Lonberg,《自然-生物技术(Nat.Biotech.)》,23:1117-1125(2005)；美国专利号6,075,181、6,150,584、5,770,429和7,041,870；以及美国专利申请公开号US2007/0061900)。来自由这类动物产生的完整抗体的人可变区可以被进一步修饰，例如通过与不同的人恒定区组合而进一步修饰。

人抗体也可以通过基于杂交瘤的方法制备。例如，人抗体可以使用人B细胞杂交瘤技术和其它方法从人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系产生(参见例如Kozbor,《免疫学杂志》,133:3001(1984)；Brodeur等，《单克隆抗体产生技术和应用(Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications)》,pp.51-63(1987)；Boerner等，《免疫学杂志》,147:86(1991)；Li等，《美国国家科学院院刊》,103:3557-3562(2006)；美国专利号7,189,826；Ni,Xiandai Mianyixue,26(4):265-268(2006)；Vollmers和Brandlein,《组织学与组织病理学(Histology and Histopathology)》,20(3):927-937(2005)；以及Vollmers和Brandlein,《实验和临床病理学方法和发现(Methods and Findings in Experimentaland Clinical Pharmacology)》,27(3):185-91(2005))。人抗体也可以通过分离选自人源噬菌体展示文库的Fv克隆可变结构域序列来产生。然后，可以将此类可变结构域序列与所需的人恒定区组合。

可以对抗体中的寡糖进行修饰，例如以产生具有某些改善的性质的抗体变体。例如，抗体糖基化变体可以具有改善的CDC功能。在一些实施例中，本公开可以考虑具有一些但非全部效应子功能的抗体变体，这使其成为抗体的体内半衰期很重要但某些效应子功能(例如补体)是不必要的或有害的应用的理想候选物。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定，以确认CDC活性的降低/消耗。

iv.抗体衍生物

在一些实施例中，本文提供的抗体试剂可以被进一步修饰成含有本领域已知并且容易获得的另外的非蛋白质部分。适用于抗体衍生化的部分可以包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例可以包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-l,3-二氧戊环、聚-l,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛由于在水中具有稳定性而在制造中可能具有优势。

聚合物可以具有任何分子量，并且可以是支化或非支化的。附接至抗体的聚合物的数量可以变化，并且如果附接两个或更多个聚合物，则它们可以是相同或不同的分子。

在一些实施例中，提供了可以通过暴露于辐射而选择性加热的抗体和非蛋白质部分的缀合物。在一些实施例中，非蛋白质部分可以是碳纳米管(参见例如Kam等，《美国国家科学院院刊》,102:11600-11605(2005))。辐射可以具有任何波长，并且可以包括但不限于，不损害普通细胞，但是将非蛋白质部分加热至杀死邻近抗体-非蛋白质部分的细胞的温度的波长。

当解离常数(Kd)是约1nM时，认为DLL3结合剂(例如包含抗原结合结构域的分子)“特异性结合”其靶抗原(例如人、食蟹猴或小鼠DLL3)。当Kd是1-5nM时，抗原结合结构域以“高亲和力”特异性结合抗原，而当Kd是0.1-0.5nM时，抗原结合结构域以“极高亲和力”结合抗原。在一个实施例中，抗原结合结构域的Kd是约1nM。在一个实施例中，解离速率<1×10^-5。在其它实施例中，抗原结合结构域与人DLL3结合的Kd在约1×10^-7M与1×10^-12M之间，而在又一个实施例中，抗原结合结构域结合的Kd在约1×10^-5M与1×10^-12M之间。

如本文提供的，本公开的抗原结合结构域特异性结合哺乳动物DLL3(例如人DLL3、食蟹猴DLL3或小鼠DLL3)。在某些实施例中，本公开的DLL3抗原结合结构域以小于1×10^-6M、小于1×10^-7M、小于1×10^-8M或小于1×10^-9M的Kd结合哺乳动物DLL3。在一个具体实施例中，DLL3抗原结合结构域以小于1×10^-7M的Kd结合哺乳动物DLL3(例如人DLL3、食蟹猴DLL3或小鼠DLL3)。在另一实施例中，DLL3抗原结合结构域以小于1×10^-8M的Kd结合哺乳动物DLL3(例如人DLL3、食蟹猴DLL3或小鼠DLL3)。在一些实施例中，DLL3抗原结合结构域与哺乳动物DLL3(例如人DLL3、食蟹猴DLL3)结合的Kd是约1×10^-7M、约2×10^-7M、约3×10^-7M、约4×10^{- 7}M、约5×10^-7M、约6×10^-7M、约7×10^-7M、约8×10^-7M、约9×10^-7M、约1x10^-8 M、约2×10^-8M、约3×10^-8M、约4×10^-8M、约5×10^-8M、约6×10^-8M、约7×10^-8M、约8×10^-8M、约9×10^-8M、约1×10^-9M、约2×10^-9M、约3×10^-9M、约4×10^-9M、约5×10^-9M、约6×10^-9M、约7×10^-9M、约8×10^{- 9}M、约9×10^-9M、约1×10^-10M或约5×10^-10M。在某些实施例中，Kd是以K_off/K_on的商计算，并且K_on和K_off是使用单价抗体，例如Fab片段确定，这是通过例如

表面等离子体共振技术测量。在其它实施例中，Kd是以K_off/K_on的商计算，并且K_on和K_off是使用二价抗体，例如Fab片段确定，这是通过例如

表面等离子体共振技术测量。

在一些实施例中，DLL3抗原结合结构域结合哺乳动物DLL3(例如人DLL3、食蟹猴DLL3或小鼠DLL3)的缔合速率(k_on)小于1×10^-4M^-1s-¹，小于2×10^-4M^-1s-¹，小于3×10^-4M^-1s-¹，小于4×10^-4M^-1s-¹，小于5×10^-4M^-1s-¹，小于7×10^-4M^-1s-¹，小于8×10^-4M^-1s-¹，小于9×10^-4M^-1s-¹，小于1×10^-5M^-1s-¹，小于2×10^-5M^-1s-¹，小于3×10^-5M^-1s-¹，小于4×10^-5M^-1s-¹，小于5×10^-5M^-1s-¹，小于6×10^-5M^-1s-¹，小于7×10^-5M^-1s-¹，小于8×10^-5M^-1s-¹，小于9×10^-5M^{- 1}s-¹，小于1×10^-6M^-1s-¹，小于2×10^-6M^-1s-¹，小于3×10^-6M^-1s-¹，小于4×10^-6M^-1s-¹，小于5×10^-6M^-1s-¹，小于6×10^-6M^-1s-¹，小于7×10^-6M^-1s-¹，小于8×10^-6M^-1s-¹，小于9×10^-6M^-1s-¹或小于1×10^-7M^-1s-¹。在某些实施例中，k_on是使用单价抗体，例如Fab片段确定，这是通过例如

表面等离子体共振技术测量。在其它实施例中，K_on是使用二价抗体确定，这是通过例如

表面等离子体共振技术测量。

在一些实施例中，DLL3抗原结合结构域结合哺乳动物DLL3(例如人DLL3、食蟹猴DLL3或小鼠DLL3)的解离速率(k_off)小于1×10^-2s^-1，小于2×10^-2s^-1，小于3×10^-2s^-1，小于4×10^-2s^-1，小于5×10^-2s^-1，小于6×10^-2s^-1，小于7×10^-2s^-1，小于8×10^-2s^-1，小于9×10^-2s^-1，小于1×10^-3s^-1，小于2×10^-3s^-1，小于3×10^-3s^-1，小于4×10^-3s^-1，小于5×10^-3s^-1，小于6×10^-3s^-1，小于7×10^-3s^-1，小于8×10^-3s^-1，小于9×10^-3s^-1，小于1×10^-4s^-1，小于2×10^-4s^-1，小于3×10^-4s^-1，小于4×10^-4s^-1，小于5×10^-4s^-1，小于6×10^-4s^-1，小于7×10^-4s^-1，小于8×10^{- 4}s^-1，小于9×10^-4s^-1，小于1×10^-5s^-1或小于5×10^-4s^-1。在某些实施例中，k_off是使用单价抗体，例如Fab片段确定，这是通过例如

表面等离子体共振技术测量。在其它实施例中，k_off是使用二价抗体确定，这是通过例如

表面等离子体共振技术测量。

II.嵌合抗原受体

如本文所用，嵌合抗原受体(CAR)是特异性识别靶抗原(例如癌细胞上的靶抗原)的蛋白质。当与靶抗原结合时，CAR可以激活免疫细胞以攻击并破坏带有该抗原的细胞(例如癌细胞)。CAR还可以并入共刺激或信号传导结构域，以增加其效力。参见Krause等，《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》,第188卷,第4期,1998(619–626)；Finney等，《免疫学杂志(Journal of Immunology)》,1998,161:2791–2797；Song等，《血液(Blood)》119:696-706(2012)；Kalos等，《科学转化医学(Sci.Transl.Med.)》3:95(2011)；Porter等，《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》365:725-33(2011)；和Gross等，《药理学与毒理学年评(Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.)》56:59–83(2016)；美国专利号7,741,465,和6,319,494。

本文所述的嵌合抗原受体包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中胞外结构域包含与DLL3特异性结合的DLL3抗原结合结构域。在一些实施例中，DLL-3特异性CAR从5'至3'包含以下元件：信号序列，DLL3抗原结合结构域(例如抗DLL3 scFv)、铰链和跨膜区，以及一个或多个连续的信号传导结构域。在某些实施例中，DLL-3特异性CAR从5'至3'包含以下元件：CD8α信号序列、包含本文所述的DLL3可变重链和/或可变轻链的DLL3 scFv、CD8α铰链和跨膜区、41BB胞质信号传导结构域和CD3ζ胞质信号传导结构域。(图4，表7)。

在一些实施例中，DLL-3特异性CAR还包含安全开关和/或单克隆抗体特异性表位。

a.抗原结合结构域

如上所述，本文所述的DLL3 CAR包含抗原结合结构域。如本文所用，“抗原结合结构域”是指结合指定靶抗原的任何多肽，例如指定靶抗原可以是DLL3(DLL-3)蛋白或其片段(在本文中可互换地称为“DLL3抗原”、“DLL3靶抗原”或“DLL3靶”)。在一些实施例中，抗原结合结构域与肿瘤细胞上的DLL3抗原结合。在一些实施例中，抗原结合结构域与涉及过度增殖性疾病的细胞上的DLL3抗原结合。

在一些实施例中，抗原结合结构域包含本文所述的可变重链、可变轻链和/或一个或多个CDR。在一些实施例中，抗原结合结构域是单链可变片段(scFv)，其包含轻链CDRCDR1、CDR2和CDR3以及重链CDR CDR1、CDR2和CDR3。

在一些实施例中，DLL-3特异性CAR包含表1b中所示的VH。在一些实施例中，DLL-3特异性CAR包含表1c所示的VL。在一些实施例中，DLL-3特异性CAR包含表1e中所示的重链CDR1、CDR2、CDR3。在一些实施例中，DLL-3特异性CAR包含表1f中所示的轻链CDR1、CDR2、CDR3。

抗原结合结构域的变体(例如CDR、VH和/或VL的变体)也在本公开的范围内，例如各自与本文所述的抗原结合结构域序列的氨基酸序列具有至少70-80％、80-85％、85-90％、90-95％、95-97％、97-99％或高于99％同一性的可变轻链和/或可变重链。在一些情况下，此类分子包括至少一个重链和一个轻链，而在其它情况下，变体形式含有两个可变轻链和两个可变重链(或其子部分)。本领域技术人员将能够使用公知的技术来确定本文所述的抗原结合结构域的合适变体。在某些实施例中，本领域技术人员可以通过靶向认为对活性不重要的区域来鉴定可以改变而不会破坏活性的分子的合适区域。

在某些实施例中，抗原结合结构域的多肽结构是基于抗体，包括但不限于单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(本文有时称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合体(本文有时称为“抗体缀合物”)及其对应的片段。在一些实施例中，抗原结合结构域包含高亲合性多聚体(avimer)或由其组成。

当DLL3抗原结合结构域与一个靶的结合比与另一个靶的结合更紧密时，它被认为具有“选择性”。

在一些实施例中，DLL3抗原结合结构域是scFv。在一些实施例中，DLL3特异性CAR包含表1d中提供的scFv。

在一些实施例中，DLL3特异性CAR包含前导肽或信号肽；在一些实施例中，前导肽包含与氨基酸序列MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO:477)具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，前导肽包含SEQ ID NO:477的氨基酸序列。在一些实施例中，前导肽由包含以下的核酸序列编码：ATGGCACTCCCCGTAACTGCTCTGCTGCTGCCGTTGGCATTGCTCCTGCACGCCGCACGC CCG(SEQ ID NO:555)。

在其它实施例中，本公开涉及分离的多核苷酸，其编码本文所述的DLL3抗原结合结构域中的任一个。在一些实施例中，本公开涉及分离的多核苷酸，其编码表10中描述的DLL3CAR。本文还提供了包含所述多核苷酸的载体及其制造方法。

表10.示例性靶向DIL3的CAR的多核苷酸序列

b.安全开关和单克隆抗体特异性表位

安全开关

应当理解，可以通过用自杀基因转导免疫细胞(含有一个或多个CAR)来使不良事件最少。还可能需要将诱导型“打开(on)”或“促进子(accelerator)”开关并入免疫细胞中。合适的技术包括在用本公开的CAR构建体转导细胞之前、之后或同时使用诱导型半胱天冬酶9(美国申请2011/0286980)或胸苷激酶。引入自杀基因和/或“打开”开关的其它方法包括TALENS、锌指、RNAi、siRNA、shRNA、反义技术和本领域已知的其它技术。

根据本公开，可以在本文中引入另外的开关或其它类型的控制开关技术。这些技术可以使用二聚化结构域和此类结构域二聚化的任选激活剂。这些技术包括例如Wu等，《科学(Science)》2014 350(6258)描述的那些技术，这些技术在某些细胞中利用FKBP/Rapalog二聚化系统，该文献的内容通过引用整体并入本文。另外的二聚化技术描述于例如Fegan等，《化学综述(Chem.Rev.)》2010,110,3315-3336，以及美国专利号5,830,462、5,834,266、5,869,337和6,165,787，其内容也通过引用整体并入本文。另外的二聚化对可以包括环孢素-A/亲环素受体、雌激素/雌激素受体(任选地使用他莫昔芬(tamoxifen))、糖皮质激素/糖皮质激素受体、四环素/四环素受体、维生素D/维生素D受体。二聚化技术的其它实例可以见于例如WO 2014/127261、WO 2015/090229、US 2014/0286987、US2015/0266973、US2016/0046700、美国专利号8,486,693、US 2014/0171649和US 2012/0130076，其内容通过引用整体并入本文。

在一些实施例中，本公开的CAR-免疫细胞(例如CAR-T细胞)包含编码例如RQR8之类自杀多肽的多核苷酸。参见例如WO2013153391A，其通过引用整体并入本文。在包含所述多核苷酸的CAR-免疫细胞(例如CAR-T细胞)细胞中，自杀多肽在CAR-免疫细胞(例如CAR-T细胞)的表面表达。在一些实施例中，自杀多肽包含SEQ ID NO:552中所示的氨基酸序列：

CPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV(SEQ IDNO:552)。

自杀多肽还可以在氨基末端包含信号肽，例如MGTSLLCWMALCLLGADHADA(SEQ IDNO:553)。在一些实施例中，自杀多肽包含SEQ ID NO:554中所示的氨基酸序列，其包括SEQID NO:553的信号序列：

MGTSLLCWMALCLLGADHADACPYSNPSLCSGGGGSELPTQGTFSNVSTNVSPAKPTTTACPYSNPSLCSGGGGSPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNRRRVCKCPRPVV(SEQ ID NO:554)。

当自杀多肽在CAR-免疫细胞(例如CAR-T细胞)的表面表达时，利妥昔单抗结合至该多肽的R表位而引起细胞溶解。在细胞表面表达的每个多肽可以结合多于一个利妥昔单抗分子。多肽的每个R表位可以结合单独的利妥昔单抗分子。DLL3特异性CAR-免疫细胞(例如CAR-T细胞)的缺失可在体内发生，例如通过向患者施用利妥昔单抗进行。缺失转移的细胞的决定可能源于在患者体内检测到的归因于转移的细胞的不希望的影响，例如当检测到不可接受的毒性水平时。

在一些实施例中，自杀多肽在细胞表面上表达。在一些实施例中，自杀多肽被包括在CAR构建体中。在一些实施例中，自杀多肽不是DLL3 CAR构建体的一部分。

在一些实施例中，本文公开的任一个DLL3特异性CAR的胞外结构域可以包含对单克隆抗体具有特异性(即，被单克隆抗体特异性识别)的一个或多个表位。这些表位在本文中也称为mAb特异性表位。示例性mAb特异性表位在国际专利公开号WO 2016/120216中公开，其全部内容均并入本文。在这些实施例中，CAR的胞外结构域包含与DLL3特异性结合的抗原结合结构域和与一种或多种单克隆抗体(mAb)结合的一个或多个表位。包含mAb特异性表位的CAR可以是单链或多链的。

在本文描述的CAR的胞外结构域中包括对单克隆抗体具有特异性的表位，允许分选和消耗(depletion)表达CAR的工程化的免疫细胞。在一些实施例中，这一特征还促进内源性DLL3表达细胞的恢复，所述内源性DLL3表达细胞因施用表达CAR的工程化的免疫细胞而被消耗。在一些实施例中，在例如对受试者施用时具有有害作用的情况下，允许消耗将提供安全开关。

因此，在一些实施例中，本公开涉及一种用于分选和/或消耗工程化的免疫细胞的方法，所述工程化的免疫细胞具有包含mAb特异性表位的CAR；以及一种用于促进内源性DLL3表达细胞恢复的方法。

可使用数个表位-单克隆抗体对产生包含单克隆抗体特异性表位的CAR；具体而言，已经批准用于医学用途的那些，例如作为非限制性实例的CD20表位/利妥昔单抗。

本公开还包括用于对具有DLL3特异性CAR的工程化的免疫细胞进行分选的方法，所述DLL3特异性CAR表达一个或多个mAb特异性表位；和治疗方法，在所述治疗方法中，通过使用靶向所述CAR的外部配体结合结构域的抗体消耗细胞，来调节具有这些CAR的工程化的免疫细胞的激活。表4提供了可插入本公开任一种CAR的胞外结构域中的示例性模拟表位序列。

表4：示例性模拟表位序列

在一些实施例中，CAR的胞外结合结构域包含以下序列：

-V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位1-(L)_x-；

-V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位1-(L)_x-表位2-(L)_x-；

-V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位1-(L)_x-表位2-(L)_x-表位3-(L)_x-；

-(L)_x-表位1-(L)_x-V₁-L₁-V₂；

-(L)_x-表位1-(L)_x-表位2-(L)_x-V₁-L₁-V₂；

-表位1-(L)_x-表位2-(L)_x-表位3-(L)_x-V₁-L₁-V₂；

-(L)_x-表位1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位2-(L)_x；

-(L)_x-表位1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位2-(L)_x-表位3-(L)_x-；

-(L)_x-表位1-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位2-(L)_x-表位3-(L)_x-表位4-(L)_x-；

-(L)_x-表位1-(L)_x-表位2-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位3-(L)_x-；

-(L)_x-表位1-(L)_x-表位2-(L)_x-V₁-L₁-V₂-(L)_x-表位3-(L)_x-表位4-(L)_x-；

-V₁-(L)_x-表位1-(L)_x-V₂；

-V₁-(L)_x-表位1-(L)_x-V₂-(L)_x-表位2-(L)_x；

-V₁-(L)_x-表位1-(L)_x-V₂-(L)_x-表位2-(L)_x-表位3-(L)_x；

-V₁-(L)_x-表位1-(L)_x-V₂-(L)_x-表位2-(L)_x-表位3-(L)_x-表位4-(L)_x；

-(L)_x-表位1-(L)_x-V₁-(L)_x-表位2-(L)_x-V₂；或

-(L)_x-表位1-(L)_x-V₁-(L)_x-表位2-(L)_x-V₂-(L)_x-表位3-(L)_x；

-其中，

-V₁是V_L且V₂是V_H，或者V₁是V_H且V₂是V_L；

-L₁是适合于将V_H链连接到V_L链的接头；

-表位1、表位2、表位3和表位4是mAb特异性表位，并且可以相同或

c.铰链结构域

本公开的CAR的胞外结构域可包含“铰链”结构域(或铰链区)。该术语通常指用于将CAR中的跨膜结构域连接至CAR中的胞外抗原结合结构域的任何多肽。确切地说，可使用铰链结构域为胞外抗原结合结构域提供更多的灵活性和可及性。

铰链结构域可以包含至多300个氨基酸，在一些实施例中包含10至100个氨基酸，或在一些实施例中包含25至50个氨基酸。铰链结构域可以源自天然存在的分子的全部或一部分，例如源自CD8、CD4、CD28、4-1BB或IgG的全部或部分胞外区(特别是IgG的铰链区；应当理解，铰链区可以含有免疫球蛋白家族的一些或全部成员，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、IgM或其片段)，或源自抗体重链恒定区的全部或一部分。替代地，A结构域可以是对应于天然存在的A序列的合成序列，或者可以是完全合成的A序列。在一些实施例中，所述A结构域是人CD8α链(例如NP_001139345.1)的一部分。在另一个特定的实施例中，所述铰链和跨膜结构域包含人CD8α链的一部分。在一些实施例中，本文所述的CAR的铰链结构域包含CD8α、CD28、IgG1、IgG4、PD-1或FcγRIIIα的子序列，特别是CD8α、CD28、IgG1、IgG4、PD-1或FcγRIIIα中任一个的铰链区。在一些实施例中，铰链结构域包含人CD8α铰链、人IgG1铰链、人IgG4、人PD-1或人FcγRIIIα铰链。在一些实施例中，本文公开的CAR包含scFv、CD8α人铰链和跨膜结构域、CD3ζ信号传导结构域和4-1BB信号传导结构域。表5提供了本文提供的示例性铰链的氨基酸序列。

表5：示例性铰链

在某些实施例中，铰链区包含与本文在表5中所示的胞外结构域氨基酸序列具有至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的氨基酸序列。

d.跨膜结构域

本公开的CAR被设计为具有与CAR的胞外结构域融合的跨膜结构域。可以通过类似方式将其与CAR的胞内结构域融合。在一些情况下，可以通过氨基酸取代来选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使其与受体复合物其它成员的相互作用最小化。在一些实施例中，短接头可以在CAR的胞外、跨膜和胞内结构域中的任一个或一些之间形成连接。

本文公开的CAR的合适跨膜结构域具有以下能力：(a)在表面免疫细胞表达，该免疫细胞例如但不限于淋巴细胞，例如T辅助(T_h)细胞，细胞毒性T(T_c)细胞、T调节(T_reg)细胞或自然杀手(NK)细胞，和/或(b)与胞外抗原结合结构域和胞内信号传导结构域相互作用，以引导免疫细胞对靶细胞的细胞应答。

跨膜结构域可以源自天然或合成来源。如果来源是天然的，则该结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。

在本公开中特别使用的跨膜区可以源自(包含或对应于)CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡因子1(PD-1)、诱导型T细胞共刺激物(ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1、CD1-1a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受体、1类MHC分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1 1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 1a、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD1 1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、与CD83特异性结合的配体或其任何组合。

作为非限制性实例，跨膜区可以源自或为T细胞受体，例如α、β、γ或δ的一部分；构成CD3复合物的多肽；IL-2受体p55(a链)；p75(β链)或γ链；Fc受体的亚基链，特别是Fcγ受体III；或CD蛋白。替代地，跨膜结构域可以是合成的，并且可以主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些实施例中，所述跨膜结构域源自人CD8α链(例如NP_001139345.1)。

在一些实施例中，本公开的CAR中的跨膜结构域是CD8α跨膜结构域。在一些实施例中，本公开的CAR中的跨膜结构域是包含氨基酸序列IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT(SEQ ID NO:549)的CD8α跨膜结构域。在一些实施例中，CD8α跨膜结构域包含编码SEQ ID NO:549的跨膜氨基酸序列的核酸序列。在一些实施例中，本公开的CAR中的铰链和跨膜结构域是包含SEQID NO:479的氨基酸序列的CD8α铰链和跨膜结构域。

在一些实施例中，本公开的CAR中的跨膜结构域是CD28跨膜结构域。在一些实施例中，本公开的CAR中的跨膜结构域是包含氨基酸序列FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQID NO:550)的CD28跨膜结构域。在一些实施例中，CD28跨膜结构域包含编码SEQ ID NO:550的跨膜氨基酸序列的核酸序列。

e.胞内结构域

本公开的CAR的胞内(胞质)结构域可以激活包含CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能，例如信号1/激活和/或信号2/共刺激。例如，T细胞的效应子功能可以指细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。

在一些实施例中，用于CAR的激活胞内信号传导结构域可以是例如但不限于协同作用以在抗原受体接合后起始信号转导的T细胞受体和辅助受体的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体，和具有相同功能能力的任何合成序列。

应当理解，合适(例如激活)的胞内结构域包括但不限于源自(或对应于)下述的信号传导结构域：CD3ζ、CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡因子1(PD-1)、诱导型T细胞共刺激物(ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1,CD1-1a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受体、1类MHC分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1 1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 1a、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD1 1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、与CD83特异性结合的配体或其任何组合。

本公开的CAR的胞内结构域除并入上述激活结构域之外，还可并入共刺激信号传导结构域(本文可互换地称为共刺激分子)以增加其效力。除由本文所述的激活分子提供的主要信号外，共刺激结构域也可以提供信号。

应当理解，在本公开的范围内的合适共刺激结构域可以源自(或对应于)例如CD28、OX40、4-1BB/CD137、CD2、CD3(α、β、δ、ε、γ、ζ)、CD4、CD5、CD7、CD9、CD16、CD22、CD27、CD30、CD 33、CD37、CD40、CD 45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1(CD1 1a/CD18)、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT(肿瘤坏死因子超家族成员14；TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受体、I类MHC分子、TNFR、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子、BTLA、Toll配体受体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1-1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1-1a、LFA-1、ITGAM、CD1-1b、ITGAX、CD1-1c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、CD83配体或其片段或组合。应当理解，以上未列出的其它共刺激分子或其片段也在本公开的范围内。

在一些实施例中，可以将CAR的胞内/胞质结构域设计成自身包含41BB/CD137结构域，或者将其与在本公开的CAR的背景下有用的任何其它期望的胞内结构域组合。41BB/CD137的完整天然氨基酸序列描述于NCBB参考序列：NP_001552.2中。完整的天然41BB/CD137核酸序列描述于NCBI参考序列：NM_001561.5中。

在一些实施例中，可以将CAR的胞内/胞质结构域设计成自身包含CD28结构域，或者将其与在本公开的CAR的背景下有用的任何其它期望的胞内结构域组合。CD28的完整天然氨基酸序列描述于NCBI参考序列NP_006130.1中。完整的天然CD28核酸序列描述于NCBI参考序列：NM_006139.1中。

在一些实施例中，可以将CAR的胞内/胞质结构域设计成自身包含CD3ζ结构域，或者将其与在本公开的CAR的背景下有用的任何其它期望的胞内结构域组合。在一些实施例中，CAR的胞内信号传导结构域可以包含CD3ζ信号传导结构域，其与表7中的SEQ ID NO:481中所示的氨基酸序列具有至少约70％、至少约80％、至少约90％、95％、97％或99％序列同一性的氨基酸序列。例如，CAR的胞内结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导分子的一部分。在本公开的CAR的胞内信号传导部分内的胞内信号传导序列可以按随机或指定顺序彼此连接。在一些实施例中，将胞内结构域设计成包含CD3ζ的激活结构域和CD28的信号传导结构域。在一些实施例中，将胞内结构域设计成包含CD3ζ的激活结构域和4-1BB的共刺激/信号传导结构域。

在一些实施例中，4-1BB(胞内结构域)包含氨基酸序列

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID NO:480)。在一些实施例中，4-1BB(胞内结构域)由下述核酸序列编码：

AAGCGCGGCAGGAAGAAGCTCCTCTACATTTTTAAGCAGCCTTTTATGAGGCCCGTACAGACAACACAGGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCAGATTTCCCGAGGAGGAGGAAGGTGGGTGCGAGCTG(SEQ ID NO:568)。

在一些实施例中，将CAR中的胞内结构域设计成包含CD28和CD3ζ的一部分，其中胞内CD28包含SEQ ID NO:567中所示的核酸序列。

AGATCCAAAAGAAGCCGCCTGCTCCATAGCGATTACATGAATATGACTCCACGCCGCCCTGGCCCCACAAGGAAACACTACCAGCCTTACGCACCACCTAGAGATTTCGCTGCCTATCGGAGC(SEQ ID NO:567)。

在一些实施例中，将CAR中的胞内结构域设计成包含氨基酸序列RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:551)。CD3ζ氨基酸序列可包含SEQ ID NO:481或469，并且核酸序列可包含SEQ ID NO:569：

AGGGTGAAGTTTTCCAGATCTGCAGATGCACCAGCGTATCAGCAGGGCCAGAACCAACTGTATAACGAGCTCAACCTGGGACGCAGGGAAGAGTATGACGTTTTGGACAAGCGCAGAGGACGGGACCCTGAGATGGGTGGCAAACCAAGACGAAAAAACCCCCAGGAGGGTCTCTATAATGAGCTGCAGAAGGATAAGATGGCTGAAGCCTATTCTGAAATAGGCATGAAAGGAGAGCGGAGAAGGGGAAAAGGGCACGACGGTTTGTACCAGGGACTCAGCACTGCTACGAAGGATACTTATGACGCTCTCCACATGCAAGCCCTGCCACCTAGG(SEQ ID NO:569)。

在一些实施例中，本公开的CAR的胞内信号传导结构域包含共刺激分子的结构域。在一些实施例中，本公开的CAR的胞内信号传导结构域包含选自由4-1BB(GenBank:AAA53133.)和CD28(NP_006130.1)的片段组成的组的共刺激分子的一部分。在一些实施例中，本公开的CAR的胞内信号传导结构域包含与SEQ ID NO:480和SEQ ID NO:551中所示的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、95％、97％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本公开的CAR的胞内信号传导结构域包含与SEQ ID NO:480中所示的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、95％、97％或99％序列同一性和/或与SEQID NO:551中所示的氨基酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、95％、97％或99％序列同一性的氨基酸序列。

在示例性实施例中，本公开的CAR从N末端至C末端包含：(可切割的)CD8α信号序列、DLL3 scFv、CD8α铰链和跨膜区、4-1BB胞质(共刺激)信号传导结构域和CD3ζ胞质(刺激性)信号传导结构域。

III.包含CAR的免疫细胞

a.免疫细胞

本文提供了表达本公开的CAR的工程化的免疫细胞(例如CAR-T细胞)。

在一些实施例中，工程化的免疫细胞包含CAR群，每种CAR包含不同的胞外抗原结合结构域。在一些实施例中，免疫细胞包含CAR群，每种CAR包含相同的胞外抗原结合结构域。

工程化的免疫细胞可以是同种异体的或自体的。

在一些实施例中，工程化的免疫细胞是T细胞(例如炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞(Treg)、辅助性T淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL))、自然杀手T细胞(NKT)、表达TCR的细胞、树突状细胞、杀手树突状细胞、肥大细胞或B细胞。在一些实施例中，细胞可以源自由CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞组成的组。在一些示例性实施例中，工程化的免疫细胞是T细胞。在一些示例性实施例中，工程化的免疫细胞是γδT细胞。在一些示例性实施例中，工程化的免疫细胞是巨噬细胞。在一些示例性实施例中，工程化的免疫细胞是自然杀手(NK)细胞。

在一些实施例中，工程化的免疫细胞可以源自例如但不限于干细胞。干细胞可以是成体干细胞、非人胚胎干细胞、更特别地是非人干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导型多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。

在一些实施例中，细胞是从外周血获得或制备的。在一些实施例中，所述细胞是从外周血单核细胞(PBMC)获得或制备的。在一些实施例中，细胞是从骨髓获得或制备的。在一些实施例中，细胞是从脐带血获得或制备的。在一些实施例中，细胞是人细胞。

在一些实施例中，使用选自由电穿孔、声穿孔、生物轰击(例如基因枪)、脂质转染、聚合物转染、纳米颗粒、病毒转染(例如逆转录病毒、慢病毒、AAV)或多链体组成的组的方法，通过核酸载体转染或转导细胞。

在一些实施例中，在细胞表面膜上表达本公开的DLL3特异性CAR的工程化的免疫细胞包含的干细胞记忆和中央记忆细胞的百分比大于10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些实施例中，在细胞表面膜上表达本公开的DLL3特异性CAR的工程化的免疫细胞包含的干细胞记忆和中央记忆细胞的百分比是约10％至约100％，约10％至约90％，约10％至约80％，约10％至约70％，约10％至约60％，约10％至约50％，约10％至约40％，约10％至约30％，约10％至约20％，约15％至约100％，约15％至约90％，约15％至约80％，约15％至约70％，约15％至约60％，约15％至约50％，约15％至约40％，约15％至约30％，约20％至约100％，约20％至约90％，约20％至约80％，约20％至约70％，约20％至约60％，约20％至约50％，约20％至约40％，约20％至约30％，约30％至约100％，约30％至约90％，约30％至约80％，约30％至约70％，约30％至约60％，约30％至约50％，约30％至约40％，约40％至约100％，约40％至约90％，约40％至约80％，约40％至约70％，约40％至约60％，约40％至约50％，约50％至约100％，约50％至约90％，约50％至约80％，约50％至约70％，约50％至约60％，约60％至约100％，约60％至约90％，约60％至约80％，约60％至约70％，约70％至约90％，约70％至约80％，约80％至约100％，约80％至约90％，约90％至约100％，约25％至约50％，约75％至约100％或约50％至约75％。

在一些实施例中，免疫细胞是表达本文所述的任一种CAR的炎性T淋巴细胞。在一些实施例中，免疫细胞是表达本文所述的任一种CAR的细胞毒性T淋巴细胞。在一些实施例中，免疫细胞是表达本文所述的任一种CAR的调节性T淋巴细胞。在一些实施例中，免疫细胞是表达本文所述的任一种CAR的辅助性T淋巴细胞。

在扩增和遗传修饰之前，可以通过多种非限制性方法从受试者获得细胞来源。细胞可以获自许多非限制性来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些实施例中，可以使用本领域技术人员可获得和已知的任何数量的T细胞系。在一些实施例中，细胞可以源自健康供体、源自诊断患有癌症的患者或源自诊断患有感染的患者。在一些实施例中，细胞可以是呈现不同表型特征的混合细胞群的一部分。

本文还提供根据任何上述方法从转化的免疫细胞(例如T细胞)获得的细胞系。本文还提供对免疫抑制性治疗具有抗性的修饰的细胞。在一些实施例中，根据本公开的分离的细胞包含编码CAR的多核苷酸。

可以在对免疫细胞进行遗传修饰之前或之后，使用公知的方法激活和扩增本公开的免疫细胞。通常，本公开的工程化的免疫细胞可以例如通过与刺激CD3 TCR复合物的试剂和在T细胞表面上的共刺激分子接触以产生T细胞的激活信号而扩增。例如，可以使用例如钙离子载体A23187、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)或如植物血凝素(PHA)之类促有丝分裂凝集素等化学物质来产生T细胞的激活信号。

在一些实施例中，可以通过例如与固定在表面上的抗CD3抗体，例如OKT3抗体或其抗原结合片段，或者抗CD2抗体接触，或通过与钙离子载体结合的蛋白激酶C激活剂(例如苔藓抑素)接触，在体外刺激T细胞群。为了共刺激在T细胞表面上的辅助分子，使用结合所述辅助分子的配体。例如，可以在适于刺激T细胞增殖的条件下，使T细胞群与抗CD3抗体(例如OKT3抗体)和抗CD28抗体接触。可以将抗CD3抗体和抗CD28抗体安置于珠粒，例如塑料珠或磁珠上，或板或其它基材上。适用于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如基本必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 15(Lonza))，其可含有增殖和活力所需的因子，包括血清(例如胎牛或人血清)、白细胞介素2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-2、IL-15、TGFβ和TNF，或任何其它本领域技术人员已知的用于细胞生长的添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和还原剂，例如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、Optimizer，其中添加有氨基酸、丙酮酸钠和维生素，不含血清或补充有适量的血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或足以使T细胞生长和扩增的量的细胞因子(例如IL-7和/或IL-15)。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅包括在实验培养物中，而不包括在打算输注给受试者的细胞的培养物中。靶细胞被保持在支持生长所必需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和气氛(例如空气加5％CO₂)。暴露于不同刺激时间的T细胞可能表现出不同的特征。在一些实施例中，可以通过与组织或细胞共培养来扩增本公开的细胞。在将细胞施用于受试者后，细胞还可以在体内，例如在受试者的血液中扩增。

在一些实施例中，根据本公开的工程化的免疫细胞可以包含一个或多个破坏或失活的基因。在一些实施例中，根据本公开的工程化的免疫细胞包含选自由CD52、DLL3、GR、PD-1、CTLA-4、LAG3、TIM3、BTLA、BY55、TIGIT、B7H5、LAIR1、SIGLEC10、2B4、HLA、TCRα和TCRβ组成的组的一个破坏或失活的基因；和/或表达CAR、多链CAR和/或pTα转基因。在一些实施例中，分离的细胞包含编码含多链CAR的多肽的多核苷酸。在一些实施例中，根据本公开的分离的细胞包含选自由下述组成的组的两个破坏或失活的基因：CD52和GR、CD52和TCRα、CDR52和TCRβ、DLL3和CD52、DLL3和TCRα、DLL3和TCRβ、GR和TCRα、GR和TCRβ、TCRα和TCRβ、PD-1和TCRα、PD-1和TCRβ、CTLA-4和TCRα、CTLA-4和TCRβ、LAG3和TCRα、LAG3和TCRβ、TIM3和TCRα、Tim3和TCRβ、BTLA和TCRα、BTLA和TCRβ、BY55和TCRα、BY55和TCRβ、TIGIT和TCRα、TIGIT和TCRβ、B7H5和TCRα、B7H5和TCRβ、LAIR1和TCRα、LAIR1和TCRβ、SIGLEC10和TCRα、SIGLEC10和TCRβ、2B4和TCRα、2B4和TCRβ；和/或表达CAR、多链CAR和/或pTα转基因。在一些实施例中，所述方法包括通过将核酸内切酶引入细胞中来使一个或多个基因破坏或失活，所述核酸内切酶能够通过选择性DNA切割来使基因选择性失活。在一些实施例中，核酸内切酶可以是例如锌指核酸酶(ZFN)、megaTAL核酸酶、大范围核酸酶(meganuclease)、转录激活物样效应核酸酶(TALE-核酸酶/TALEN)或CRISPR(例如Cas9)核酸内切酶。

在一些实施例中，通过使TCRα基因和/或TCRβ基因破坏或失活，来使TCR在根据本公开的细胞中不起作用。在一些实施例中，提供一种获得源自个体的修饰的细胞的方法，其中所述细胞可以独立于主要组织相容性复合物(MHC)信号传导途径而增殖。易于通过这一方法获得的能够独立于MHC信号传导途径增殖的修饰的细胞包括在本公开的范围内。本文公开的修饰的细胞可以用于治疗有需要的患者的宿主抗移植物(HvG)排斥和移植物抗宿主病(GvHD)；因此，在本公开的范围内是一种治疗有需要的患者的宿主抗移植物(HvG)排斥和移植物抗宿主病(GvHD)的方法，该方法包括通过向所述患者施用有效量的修饰的细胞来治疗所述患者，所述细胞包含破坏或失活的TCRα和/或TCRβ基因。

在一些实施例中，将免疫细胞工程化成对一种或多种化疗药物具有抗性。所述化疗药物可以是例如嘌呤核苷酸类似物(PNA)，从而使免疫细胞适合于组合了过继免疫疗法和化疗的癌症治疗。示例性PNA包括例如单独或组合使用的氯法拉滨(clofarabine)、氟达拉滨(fludarabine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)和阿糖胞苷(cytarabine)。PNA在去氧胞苷激酶(dCK)作用下代谢为单磷酸、二磷酸和三磷酸PNA。其三磷酸形式与ATP竞争DNA合成，充当促细胞凋亡剂，并且是参与三核苷酸生产的核糖核苷酸还原酶(RNR)的有效抑制剂。本文提供了包含破坏或失活的dCK基因的DLL3特异性CAR-T细胞。在一些实施例中，通过利用例如mRNA的电穿孔，使用编码针对dCK基因的特异性TAL-核酸酶的多核苷酸转染T细胞来制备dCK敲除细胞。dCK敲除的DLL3特异性CAR-T细胞对包括例如氯洛法滨和/或氟达拉滨在内的PNA具有抗性，并保持T细胞对DLL3表达细胞的细胞毒性活性。

在一些实施例中，本公开的分离的细胞或细胞系可包含pTα或其功能变体。在一些实施例中，可以通过使TCRα基因破坏或失活，对分离的细胞或细胞系进行进一步遗传修饰。

本公开还提供了工程化的免疫细胞，其包含本文所述的任何CAR多核苷酸。在一些实施例中，可以通过质粒载体将CAR作为转基因引入免疫细胞。在一些实施例中，质粒载体还可以含有例如选择标志物，其用于鉴定和/或选择接受载体的细胞。

在将编码CAR多肽的多核苷酸引入细胞后，可以在细胞中原位合成CAR多肽。替代地，可以在细胞外产生CAR多肽，然后将其引入细胞。将多核苷酸构建体引入细胞的方法是本领域已知的。在一些实施例中，可以使用稳定的转化方法(例如使用慢病毒载体)将多核苷酸构建体整合到细胞的基因组中。在其它实施例中，可以使用短暂转化方法短暂地表达多核苷酸构建体，并且该多核苷酸构建体不整合到细胞的基因组中。在其它实施例中，可以使用病毒介导的方法。可以通过任何合适的方式，例如重组病毒载体(例如逆转录病毒、腺病毒)、脂质体等，将多核苷酸引入细胞。短暂转化方法包括例如但不限于显微注射、电穿孔或颗粒轰击。多核苷酸可以包含在载体，例如质粒载体或病毒载体中。

在一些实施例中，提供了分离的核酸，其包含与编码DLL3抗原结合结构域的第一多核苷酸可操作地连接的启动子、至少一个共刺激分子和激活结构域。在一些实施例中，核酸构建体被包含在病毒载体内。在一些实施例中，病毒载体选自由以下组成的组：逆转录病毒载体、鼠类白血病病毒载体、SFG载体、腺病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体和痘苗病毒载体。在一些实施例中，核酸被包含在质粒内。

b.制造方法

本文提供了制造本公开的CAR和含CAR的免疫细胞的方法。

可以使用各种已知技术来制造根据本公开的多核苷酸、多肽、载体、抗原结合结构域、免疫细胞、组合物等。

在进行本文描述的免疫细胞的体外操作或遗传修饰之前，可以从受试者获得细胞。表达DLL3 CAR的细胞可以源自同种异体或自体方法。

i.源材料

在一些实施例中，免疫细胞包含T细胞。T细胞可获自多种来源，包括外周血单核细胞(PBMC)、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在某些实施例中，可以使用本领域技术人员已知的多种技术，例如FICOLL^TM分离，由从受试者收集的一单位血液中获得T细胞。

细胞可以通过单采血液成分术从个体的循环血液获得。单采血液成分术产品典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和血小板。在某些实施例中，通过单采血液成分术收集的细胞可以经历洗涤以除去血浆级分，并放置在适当的缓冲液或培养基中以用于后续处理。

在某些实施例中，例如使用PERCOLL^TM梯度离心，通过溶解红细胞并消耗单核细胞而从PBMC中分离T细胞。T细胞特定亚群(例如CD28+、CD4+、CDS+、CD45RA-、CD45RO+、CDS+、CD62-、CD95-、CD95+、IL2Rβ+、IL2Rβ-、CCR7+、CCR7-、CDL-、CD62L+及其组合)可以通过本领域已知的阳性或阴性选择技术进一步分离。在一个实例中，T细胞亚群是CD45RA+、CD95-、IL-2Rβ-、CCR7+、CD62L+。在一个实例中，T细胞亚群是CD45RA+、CD95+、IL-2Rβ+、CCR7+、CD62L+。在一个实例中，T细胞亚群是CD45RO+、CD95+、IL-2Rβ+、CCR7+、CD62L+。在一个实例中，T细胞亚群是CD45RO+、CD95+、IL-2Rβ+、CCR7-、CD62L-。在一个实例中，T细胞亚群是CD45RA+、CD95+、IL-2Rβ+、CCR7-、CD62L-。例如，通过阴性选择富集T细胞群可以利用针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体组合来完成。本文使用的一种方法是通过负磁性免疫粘附或流式细胞术进行的细胞分选和/或选择，该方法使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物典型地包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。流式细胞术和细胞分选也可以用于分离感兴趣的细胞群以用于本公开。

使用本文所述的方法，PBMC可与免疫细胞(例如CAR或TCR)一起直接用于遗传修饰。在某些实施例中，在分离PBMC之后，可以进一步分离T淋巴细胞，并且在遗传修饰和/或扩增之前或之后，可以将细胞毒性和辅助性T淋巴细胞分选为天然、记忆和效应T细胞亚群。

在一些实施例中，通过鉴定与这些类型的CD8+细胞中的每一种相关的特征性细胞表面抗原，将CD8+细胞进一步分选为天然、干细胞记忆、中枢记忆和效应细胞。在一些实施例中，中央记忆T细胞表达的表型标志物包括CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和CD127，并且对颗粒酶B呈阴性。在一些实施例中，干细胞记忆T细胞是CD45RO-、CD62L+、CD8+T细胞。在一些实施例中，中央记忆T细胞是CD45RO+、CD62L+、CD8+T细胞。在一些实施例中，效应T细胞对于CD62L、CCR7、CD28和CD127呈阴性，而对于颗粒酶B和穿孔素则是呈阳性的。

在某些实施例中，将CD4+T细胞进一步分选为亚群。例如，通过鉴定具有特征性细胞表面抗原的细胞群，可以将CD4+T辅助细胞分选为天然、中央记忆和效应细胞。

iii.干细胞源性免疫细胞

在一些实施例中，免疫细胞可以源自干细胞，例如祖细胞、骨髓干细胞、诱导型多能干细胞、iPSC、造血干细胞和间充质干细胞。iPS细胞和其它类型的干细胞可以是培养的永生细胞系，或直接从患者分离。用于分离、产生和/或培养干细胞的各种方法在本领域中是已知的，并且可以用于实施本发明。

在一些实施例中，免疫细胞是源自重编程T细胞的诱导型多能干细胞(iPSC)。在一些实施例中，源材料可以是源自T细胞或非T细胞的诱导型多能干细胞(iPSC)。替代地，源材料可以是B细胞，或来自外周血单核细胞分离物、造血祖细胞、造血干细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞或任何其它体细胞类型的任何其它细胞。

ii.分离的细胞的遗传修饰

免疫细胞，例如T细胞，可以在使用已知方法分离后进行遗传修饰，或者可以在进行遗传修饰之前在体外激活和扩增免疫细胞(或在祖细胞的情况下进行分化)。在一些实施例中，对分离的免疫细胞进行遗传修饰以减少或消除内源性TCRα和/或CD52的表达。在一些实施例中，使用基因编辑技术(例如CRISPR/Cas9、CRISPR/CAS12、锌指核酸酶(ZFN)、TALEN、MegaTAL、大范围核酸酶)对细胞进行遗传修饰以减少或消除内源性蛋白(例如TCRα和/或CD52)的表达。在另一个实施例中，免疫细胞，例如T细胞，任选地用本文所述的嵌合抗原受体进一步遗传修饰(例如用包含一个或多个编码CAR的核苷酸序列的病毒载体转导)，然后在体外激活和/或扩增。

激活和扩增T细胞的方法是本领域已知的，并且描述于例如美国专利号6,905,874；美国专利号6,867,041；美国专利号6,797,514；和PCT WO2012/079000，其内容通过引用整体并入本文。通常，此类方法包括在具有例如IL-2之类适当细胞因子的培养基中，使PBMC或分离的T细胞与刺激分子和共刺激分子，例如抗CD3和抗CD28抗体接触，该分子通常附接至塑料珠或磁珠或其它表面上。附接至同一珠粒上的抗CD3和抗CD28抗体充当“替代性”抗原呈递细胞(APC)。一个实例是

系统，该系统是用于生理上激活人T细胞的CD3/CD28激活剂/刺激剂系统。在其它实施例中，可以使用例如美国专利号6,040,177、美国专利号5,827,642和WO2012129514中所述的方法，用饲养细胞以及合适的抗体和细胞因子激活和刺激T细胞增殖，所述专利的内容通过引用整体并入本文。

用于制造本公开的构建体和工程化的免疫细胞的某些方法描述于PCT申请PCT/US15/14520中，其内容通过引用整体并入本文。

应当理解，PBMC可以进一步包括其它细胞毒性淋巴细胞，例如NK细胞或NKT细胞。可以将带有本文公开的嵌合受体的编码序列的表达载体引入人供体T细胞、NK细胞或NKT细胞的群体。可以使用流式细胞术对成功转导的带有表达载体的T细胞进行分选，以分离CD3阳性T细胞，然后除了使用抗CD3抗体和IL-2或本文其它地方所述的本领域已知的其它方法进行细胞激活外，进一步使其繁殖以增加这些表达CAR的T细胞的数量。使用标准程序对表达CAR的T细胞进行冷冻保存，以用于储存和/或制备而用于人类受试者。在一个实施例中，在不存在非人动物来源的产物，例如小牛血清和胎牛血清的情况下进行T细胞的体外转导、培养和/或扩增。在一个实施例中，冷冻保存可包含在合适的培养基，例如

CS10、

CS2或

CS5(BioLife Solutions)中冷冻。

为了克隆多核苷酸，可以将载体引入宿主细胞(分离的宿主细胞)中以允许载体自身的复制，并由此扩增其中包含的多核苷酸的拷贝。克隆载体可以含有序列成分，通常包括但不限于复制起点、启动子序列、转录起始序列、增强子序列和选择标志物。这些元件可以由本领域普通技术人员适当地选择。例如，可以选择复制起点以促进载体在宿主细胞中的自主复制。

在某些实施例中，本公开提供了含本文提供的载体的分离的宿主细胞。含载体的宿主细胞可用于表达或克隆包含在载体中的多核苷酸。合适的宿主细胞可包括但不限于原核细胞、真菌细胞、酵母细胞或更高等的真核细胞，例如哺乳动物细胞，更具体地是人细胞。

可使用本领域已知的任何合适方法将载体引入宿主细胞，包括但不限于DEAE-葡聚糖介导的递送、磷酸钙沉淀法、阳离子脂质介导的递送、脂质体介导的转染、电穿孔、微粒轰击、受体介导的基因递送、由聚赖氨酸、组蛋白、壳聚糖和肽介导的递送。用于表达感兴趣载体的细胞的病毒转染和转化的标准方法是本领域公知的。在又一个实施例中，可以将不同表达载体的混合物用于遗传修饰免疫效应细胞的供体群体，其中每种载体编码本文公开的不同CAR。所得到的转导的免疫效应细胞形成工程化细胞的混合群体，其中一部分工程化细胞表达多于一种的不同CAR。

在一个实施例中，本公开提供了一种储存遗传工程化的细胞的方法，所述细胞表达靶向DLL3蛋白的CAR。在一个实施例中，这涉及冷冻保存免疫细胞，使得细胞在解冻后保持活力。在一个实施例中，冷冻保存可包含在合适的培养基，例如

CS10、

CS2或

CS5(BioLife Solutions)中冷冻。可以通过本领域已知的方法将表达CAR的免疫细胞的一部分冷冻保存，从而提供此类细胞的持久来源，以用于将来治疗患有恶性肿瘤的患者。需要时，可以将冷冻保存的转化的免疫细胞解冻、生长和扩增，以获得更多此类细胞。

在一些实施例中，细胞是通过以下方式配制：首先从其培养基中收获细胞，然后洗涤并在适合施用的介质和容器系统(“药学上可接受的”载体)中以治疗有效量浓缩细胞。合适的输注介质可以是任何等渗介质配制物，典型地是生理盐水、Normosol^TMR(Abbott)或Plasma-Lyte^TMA(Baxter)，但也可以使用5％右旋糖水溶液或林格氏乳酸盐。输注介质可以补充有人血清白蛋白。

iv.同种异体CAR T细胞

简言之，用于制造同种异体CAR T疗法，或AlloCARs^TM的方法涉及从健康供体收获健康的、经过选择、筛选和测试的T细胞。对同种异体T细胞进行基因编辑，以降低移植物抗宿主病(GvHD)的风险并防止同种异体排斥。敲除选定的T细胞受体基因(例如TCRα、TCRβ)以避免GvHD。还可以敲除CD52基因，以使CAR T产品对抗CD52抗体治疗具有抗性。因此，抗CD52抗体治疗可用于使宿主免疫系统去除淋巴细胞，并使CAR T细胞保持移植状态，以实现完全的治疗效果。接下来，对T细胞工程化以表达CAR，CAR识别在血液或实体瘤中表达的某些细胞表面蛋白(例如DLL-3)。然后，工程化的T细胞经过纯化步骤，并最终冷冻保存在小瓶中，以向患者递送。

v.自体CAR T细胞

自体嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法涉及收集患者自身的细胞(例如包括T细胞在内的白细胞)，并对T细胞进行遗传工程化以使其表达CAR，所述CAR识别在一种或多种特定癌细胞的细胞表面上表达的靶抗原并杀死癌细胞。然后，将工程化细胞冷冻保存，随后施用于取出细胞以进行工程化的患者。

IV.治疗方法

本公开包括用于治疗或预防患者的与不期望的和/或升高的DLL3水平相关的病症的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的至少一种本文公开的CAR或包含CAR的免疫细胞。

提供了用于治疗包括癌症在内的疾病或病症的方法。在一些实施例中，本公开涉及在受试者中产生T细胞介导的免疫应答，其包括向受试者施用有效量的本申请的工程化的免疫细胞。在一些实施例中，T细胞介导的免疫应答是针对靶细胞或细胞。在一些实施例中，工程化的免疫细胞包含嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，靶细胞是肿瘤细胞。在一些方面，本公开包含一种用于治疗或预防恶性肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的至少一个本文所述的分离的抗原结合结构域。在一些方面，本公开包含一种用于治疗或预防恶性肿瘤的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的至少一种免疫细胞，其中所述免疫细胞包含至少一种本文所述的嵌合抗原受体，和/或分离的抗原结合结构域。本公开的含CAR的免疫细胞可以用于治疗涉及DLL3异常表达的恶性肿瘤。在一些实施例中，本公开的含CAR的免疫细胞可以用于治疗恶性肿瘤，例如小细胞肺癌、黑色素瘤、低级别神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、甲状腺髓样癌、类癌、胰腺中的弥散性神经内分泌肿瘤、膀胱和前列腺癌、睾丸癌和具有神经内分泌特征的肺腺癌。在示例性实施例中，含CAR的免疫细胞，例如本公开的抗DLL3 CAR-T细胞，被用于治疗小细胞肺癌。

还提供了用于减少受试者中肿瘤大小的方法，所述方法包括向受试者施用本公开的工程化细胞到受试者，其中所述细胞包括含DLL3抗原结合结构域的嵌合抗原受体，并与肿瘤上的DLL3抗原结合。

在一些实施例中，所述受试者患有实体瘤或血液恶性肿瘤，例如淋巴瘤或白血病。在一些实施例中，将工程化细胞递送至肿瘤床，例如在小细胞肺癌中发现的肿瘤床。在一些实施例中，癌症存在于受试者的骨髓中。在一些实施例中，工程化细胞是自体免疫细胞，例如自体T细胞。在一些实施例中，工程化细胞是同种异体免疫细胞，例如同种异体T细胞。在一些实施例中，工程化细胞是异源免疫细胞，例如异源T细胞。在一些实施例中，将工程化细胞离体转染或转导。如本文所用，术语“体外细胞”是指离体培养的任何细胞。

治疗剂，例如工程化的CAR T细胞的“治疗有效量”、“有效剂量”、“有效量”或“治疗有效剂量”是当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时，保护受试者免于疾病发作或促进疾病消退的任何量，所述疾病消退表现为疾病症状的严重性降低、无疾病症状期的频率和持续时间增加，或预防由疾病痛苦引起的损害或残疾。可以使用熟练的从业者(例如医师或临床医生)已知的多种方法，例如在临床试验期间的人类受试者中，在预测于人类中的功效的动物模型系统中，或通过在体外测定中测定治疗剂的活性，来评估治疗剂促进疾病消退的能力。

术语“患者”和“受试者”可互换使用，并且包括人类和非人动物受试者以及具有正式诊断的病症的受试者、没有正式识别的病症的受试者、接受医疗护理的受试者、有发展病症的风险的受试者等等。

术语“治疗”和“疗法”包括治疗性治疗、预防性治疗以及降低受试者发展疾病的风险或其它风险因素的应用。治疗不需要完全治愈疾病，并且涵盖减轻症状或减少潜在风险因素的实施例。术语“预防”并不要求100％消除事件的可能性。相反，它表示在化合物或方法的存在下事件发生的可能性已经降低。

组合物中所需的细胞治疗总量包含至少2个细胞(例如至少一个CD8+T细胞和至少一个CD4+T细胞，或两个CD8+T细胞，或两个CD4+T细胞)，或者更典型地大于10²个细胞且至多10⁶个细胞，至多且包括10⁸或10⁹个细胞，并且可以是10¹⁰或10¹²个或更多个细胞。细胞的数量将取决于组合物预期的用途以及其中所包括的细胞的类型。所需细胞的密度典型地大于10⁶个细胞/毫升，且通常大于10⁷个细胞/毫升，通常为10⁸个细胞/毫升或更多。临床相关数量的免疫细胞可以分配为多次输注，这些输注累计等于或超过10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹或10¹²个细胞。在本公开的一些方面，特别是由于所有输注的细胞将被重定向至特定的靶抗原(例如DLL3)，故可以施用在10⁶个/千克(每位患者10⁶-10¹¹)范围内的较少数量的细胞。可以多次施用在这些范围内的剂量的CAR治疗。所述细胞对于正在接受疗法的患者而言可以是自体的、同种异体的或异源的。

在一些实施例中，CAR T细胞的治疗有效量是约1×10⁵个细胞/千克、约2×10⁵个细胞/千克、约3×10⁵个细胞/千克、约4×10⁵个细胞/千克、约5×10⁵个细胞/千克、约6×10⁵个细胞/千克、约7×10⁵个细胞/千克、约8×10⁵个细胞/千克、约9×10⁵个细胞/千克、2×10⁶个细胞/千克、约3×10⁶个细胞/千克、约4×10⁶个细胞/千克、约5×10⁶个细胞/千克、约6×10⁶个细胞/千克、约7×10⁶个细胞/千克、约8×10⁶个细胞/千克、约9×10⁶个细胞/千克、约1×10⁷个细胞/千克、约2×10⁷个细胞/千克、约3×10⁷个细胞/千克、约4×10⁷个细胞/千克、约5×10⁷个细胞/千克、约6×10⁷个细胞/千克、约7×10⁷个细胞/千克、约8×10⁷个细胞/千克或约9×10⁷个细胞/千克。

在一些实施例中，CAR+/CAR-T+细胞的靶剂量在约1×10⁶至约1×10¹⁰个细胞/千克范围内，例如是约1×10⁶个细胞/千克、约1×10⁷个细胞/千克、约1×10⁸个细胞/千克、约1×10⁹个细胞/千克或约1×10¹⁰个细胞/千克。应当理解，高于和低于这一范围的剂量对于某些受试者可能是适当的，并且由健康护理提供者可根据需要确定适当的剂量水平。另外，可以根据本公开提供细胞的多个剂量。

在一些方面，本公开包含一种药物组合物，其包含至少一个本文所述的抗原结合结构域和药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药物组合物还包含另外的活性剂。

本公开的表达CAR的细胞群可以单独施用，或与稀释剂和/或与其它成分例如IL-2或其它细胞因子或细胞群组合以药物组合物形式施用。本公开的药物组合物可以包含与一种或多种药学上或生理上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合的本文所述的表达CAR的细胞群，例如T细胞。此类组合物可以包含缓冲剂，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；和防腐剂。本公开的组合物优选被配制用于静脉内施用。

药物组合物(溶液、悬浮液等)可以包括以下中的一种或多种：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液，优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠；非挥发性油，例如可以用作溶剂或悬浮介质的合成甘油单酯或甘油二酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，例如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可以被封入由玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。对于治疗应用，可注射药物组合物优选是无菌的。

在一些实施例中，在施用于患者时，在细胞表面表达本文所述的任一种DLL3特异性CAR的工程化免疫细胞可以减少、杀死或溶解患者的内源性的DLL3表达细胞。在一个实施例中，表达本文所述的任一种DLL3特异性CAR的工程化免疫细胞，将表达DLL3的内源性细胞或表达DLL3的细胞系的细胞减少或溶解的百分比是至少约或大于10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在一个实施例中，表达本文所述的任一种DLL3特异性CAR的工程化免疫细胞，将表达DLL3的内源性细胞或表达DLL3的细胞系的细胞减少或溶解的百分比是约5％至约95％，约10％至约95％，约10％至约90％，约10％至约80％，约10％至约70％，约10％至约60％，约10％至约50％，约10％至约40％，约20％至约90％，约20％至约80％，约20％至约70％，约20％至约60％，约20％至约50％，约25％至约75％或约25％至约60％。在一个实施例中，内源性DLL3表达细胞是表达DLL3的内源性骨髓细胞。

在一个实施例中，可以使用本文公开的测定法测量在细胞表面膜上表达本公开的DLL3特异性CAR的工程化免疫细胞将靶细胞，例如表达DLL3的细胞的减少或溶解的百分比。

所述方法可以进一步包括在施用本文提供的工程化细胞之前，向患者施用一种或多种化疗剂。在某些实施例中，化疗剂是淋巴细胞清除(预调理)化疗剂。例如，调理需要T细胞疗法的患者的方法包括向该患者施用指定的有益剂量的环磷酰胺(在每天200mg/m²与每天2000mg/m²之间，在每天约100mg/m²与每天约2000mg/m²之间；例如每天约100mg/m²、每天约200mg/m²、每天约300mg/m²、每天约400mg/m²、每天约500mg/m²、每天约600mg/m²、每天约700mg/m²、每天约800mg/m²、每天约900mg/m²、每天约1000mg/m²、每天约1500mg/m²或每天约2000mg/m²)和指定剂量的氟达拉滨(在每天20mg/m²与每天900mg/m²之间，在每天约10mg/m²/天与每天约900mg/m²之间；例如每天约10mg/m²、每天约20mg/m²、每天约30mg/m²、每天约40mg/m²、每天约40mg/m²、每天约50mg/m²、每天约60mg/m²、每天约70mg/m²、每天约80mg/m²、每天约90mg/m²、每天约100mg/m²、每天约500mg/m²或每天约900mg/m²)。示例性给药方案涉及治疗患者，包括在向患者施用治疗有效量的工程化T细胞之前，在施用每天约30mg/m²氟达拉滨的同时、之前或之后，每天向患者施用每天约300mg/m²的环磷酰胺三天。

在一些实施例中，特别是在对本文提供的工程化细胞进行基因编辑以消除或最大限度减少CD52的表面表达的情况下，淋巴细胞清除进一步包括施用抗CD52抗体，例如阿仑单抗(alemtuzumab)。在一些实施例中，以每天约1-20mg的IV剂量，例如以每天约13mg的IV剂量施用CD52抗体，持续1、2、3天或更多天。所述抗体可以在施用淋巴细胞清除方案的其它成分(例如环磷酰胺和/或氟达拉滨)的同时、之前或之后施用。

在其它实施例中，抗原结合结构域、转导的(或以其它方式工程化的)细胞和化疗剂分别以有效治疗受试者的疾病或病症的量施用。

在某些实施例中，可以将本文公开的包含表达CAR的免疫效应细胞的组合物与任何数量的化疗剂联合施用。化疗剂的实例包括烷化剂类(alkylating agents)，例如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)(CYTOXAN^TM)；磺酸烷基酯类(alkylsulfonates)，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和派泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，例如苯并多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美多巴(meturedopa)和乌多巴(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine resume)；氮芥类(nitrogen mustards)，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，例如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，例如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、安曲霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、加利车霉素(calicheamicin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素类，例如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；曲布赛(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫呱达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；

雷佐生(razoxane)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；派泊溴烷(pipobroman)；加西托辛(gacytosine)；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)(TAXOL^TM，Bristol-Myers Squibb)和多西他塞(doxetaxel)(

Rhone-Poulenc Rorer)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，例如顺铂和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱；长春瑞滨；诺维本(navelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊本膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂R FS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维A酸(retinoic acid)衍生物，例如Targretin^TM(贝沙罗汀(bexarotene))、Panretin^TM、(阿利维A酸(alitretinoin))；ONTAK^TM(地尼白介素(denileukin diftitox))；埃斯培拉霉素(esperamicin)；卡培他滨(capecitabine)；和上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。这一定义中还包括抗激素药，其作用是调节或抑制对肿瘤的激素作用，例如抗雌激素，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制性4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、奇沃昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；以及抗雄激素，例如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；和上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在适当的情况下，也施用化疗剂的组合，包括但不限于CHOP，即环磷酰胺

多柔比星(羟基多柔比星)、长春新碱

和泼尼松。

在一些实施例中，化疗剂是在施用工程化细胞、多肽或核酸的同时或之后一周内施用。在其它实施例中，化疗剂是在施用工程化细胞、多肽或核酸后约1-7天、约1至约4周、或约1周至约1个月、约1周至约2个月、约1周至约3个月、约1周至约6个月、约1周至约9个月、或约1周至约12个月施用。在一些实施例中，化疗剂是在施用细胞、多肽或核酸之前至少1个月施用。在一些实施例中，所述方法进一步包括施用两种或更多种化疗剂。

多种另外的治疗剂可以与本文所述的组合物联合使用。例如，可能有用的另外的治疗剂包括PD-1抑制剂，例如纳武单抗(nivolumab)

派姆单抗(pembrolizumab)

派姆单抗、匹地利珠单抗(pidilizumab)和阿特珠单抗(atezolizumab)。

适合于与本公开组合使用的另外的治疗剂包括但不限于：伊布替尼(ibrutinib)

奥法木单抗(ofatumumab)

利妥昔单抗(rituximab)

贝伐单抗(bevacizumab)

曲妥珠单抗(trastuzumab)

恩星曲妥珠单抗(trastuzumab emtansine)

伊马替尼(imatinib)

西妥昔单抗(cetuximab)

帕尼单抗(panitumumab)

卡妥索单抗(catumaxomab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、奥法木单抗、托西莫单抗(tositumomab)、本妥昔单抗(brentuximab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、凡德他尼(vandetanib)、阿法替尼(afatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、来那替尼(neratinib)、阿昔替尼(axitinib)、马赛替尼(masitinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、托西尼布(toceranib)、来他替尼(lestaurtinib)、阿昔替尼(axitinib)、西地尼布(cediranib)、乐伐替尼(lenvatinib)、尼达尼布(nintedanib)、帕唑帕尼(pazopanib)、瑞格非尼(regorafenib)、司马沙尼(semaxanib)、索拉非尼、舒尼替尼、替瓦沙尼(tivozanib)、托西尼布、凡德他尼、恩曲替尼(entrectinib)、卡博替尼(cabozantinib)、伊马替尼、达沙替尼(dasatinib)、尼洛替尼(nilotinib)、帕纳替尼(ponatinib)、雷多替尼(radotinib)、博舒替尼(bosutinib)、来他替尼、卢梭替尼(ruxolitinib)、帕利替尼(pacritinib)、考比替尼(cobimetinib)、司美替尼(selumetinib)、曲美替尼(trametinib)、必尼美替尼(binimetinib)、阿雷替尼(alectinib)、色瑞替尼(ceritinib)、克唑替尼(crizotinib)、阿柏西普(aflibercept)、阿迪波太(adipotide)、地尼白介素(denileukin diftitox)、mTOR抑制剂如依维莫司(Everolimus)和西罗莫司(Temsirolimus)、刺猬(hedgehog)抑制剂如索尼得吉(sonidegib)和维莫得告(vismodegib)、CDK抑制剂如CDK抑制剂(帕博西尼(palbociclib))。

在一些实施例中，可以将包括含CAR的免疫细胞的组合物与治疗方案一起施用，以预防或减少细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性。预防细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性的治疗方案可以包括：仑兹鲁单抗(lenzilumab)、托西珠单抗(tocilizumab)、心房利钠肽(ANP)、阿那白滞素(anakinra)、iNOS抑制剂(例如L-NIL或1400W)。在另外的实施例中，可以将包括含CAR的免疫细胞的组合物与抗炎剂一起施用。抗炎剂或药物包括但不限于：类固醇和糖皮质激素(包括倍他米松(betamethasone)、布地奈德(budesonide)、地塞米松(dexamethasone)、乙酸氢化可的松、氢化可的松、氢化可的松、甲泼尼龙(methylprednisolone)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)和曲安西龙(triamcinolone))、非类固醇类消炎药(NSAIDS)，包括阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、来氟米特(leflunomide)、抗TNF药物、环磷酰胺和麦考酚酯(mycophenolate)。示例性NSAID包括布洛芬、萘普生、萘普生钠、Cox-2抑制剂和唾液酸化物(sialylate)。示例性镇痛剂包括乙酰氨基酚(acetaminophen)、羟考酮(oxycodone)和盐酸丙氧芬的曲马多(tramadol ofproporxyphene hydrochloride)。示例性糖皮质激素包括可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙或泼尼松。示例性生物反应调节剂包括针对细胞表面标志物(例如CD4、CD5等)的分子、细胞因子抑制剂如TNF拮抗剂(例如依那西普(etanercept)

阿达木单抗(adalimumab)

和英夫利昔单抗(infliximab)

趋化因子抑制剂和粘附分子抑制剂。生物反应调节剂包括单克隆抗体以及重组形式的分子。示例性DMARD包括硫唑嘌呤(azathioprine)、环磷酰胺、环孢菌素、甲氨蝶呤、青霉胺、来氟米特、柳氮磺胺吡啶、羟氯喹、Gold(口服(金诺芬(auranofin))和肌内)和米诺环素(minocycline)。

在某些实施例中，将本文所述的组合物与细胞因子联合施用。细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，如人生长激素，N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝生长因子(HGF)；成纤维细胞生长因子(FGF)；催乳素；胎盘催乳激素；缪勒管抑制物质(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子(NGF)如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素如干扰素-α、β和-γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15、IL-21，肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。如本文所用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物活性等效物。

V.分选和消耗的方法

在一些实施例中，提供了用于体外分选免疫细胞群的方法，其中所述免疫细胞群的子集包含工程化免疫细胞，其表达包含对单克隆抗体具有特异性的表位(例如示例性模拟表位序列)的DLL3特异性CAR中的任一种。所述方法包括使免疫细胞群与对表位具有特异性的单克隆抗体接触，并选择与单克隆抗体结合的免疫细胞，以获得富含表达DLL3特异性CAR的工程化免疫细胞的细胞群。

在一些实施例中，对所述表位具有特异性的所述单克隆抗体任选地与荧光团缀合。在这一实施例中，选择与单克隆抗体结合的细胞的步骤可以通过荧光激活细胞分选(FACS)来完成。

在一些实施例中，对所述表位具有特异性的所述单克隆抗体任选地与磁性颗粒缀合。在这一实施例中，选择与单克隆抗体结合的细胞的步骤可以通过磁激活细胞分选(MACS)来完成。

在一些实施例中，用于分选表达CAR的免疫细胞的方法中的mAb选自：阿仑单抗、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、莫洛单抗-CD3(muromonab-CD3)、托西莫单抗(tositumomab)、阿昔单抗(abciximab)、巴厘昔单抗(basiliximab)、本妥昔单抗(brentuximab vedotin)、西妥昔单抗、英夫利西单抗(infliximab)、利妥昔单抗、贝伐单抗(bevacizumab)、赛托珠单抗(certolizumab pegol)、达克珠单抗(daclizumab)、依库珠单抗(eculizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、吉妥单抗(gemtuzumab)、那他珠单抗(natalizumab)、帕利珠单抗、雷尼珠单抗(ranibizumab)、托西珠单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、维多珠单抗(vedolizumab)、阿达木单抗(adalimumab)、贝利木单抗(belimumab)、卡那单抗(canakinumab)、地诺单抗(denosumab)、戈利木单抗(golimumab)、伊匹木单抗(ipilimumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、帕尼单抗(panitumumab)、QBEND-10和/或乌司奴单抗(ustekinumab)。在一些实施例中，所述mAb是利妥昔单抗。在另一实施例中，所述mAb是QBEND-10。

在一些实施例中，在使用上述体外分选表达CAR的免疫细胞的方法时获得的表达CAR的免疫细胞群体包含至少70％、75％、80％、85％、90％、95％的表达CAR的免疫细胞。在一些实施例中，在使用体外分选表达CAR的免疫细胞的方法时获得的表达CAR的免疫细胞群体包含至少85％的表达CAR的免疫细胞。

在一些实施例中，与初始(未分选的)细胞群相比，在使用上述体外分选表达CAR的免疫细胞的方法时获得的表达CAR的免疫细胞群体显示出增加的体外细胞毒性活性。在一些实施例中，所述体外细胞毒性活性增加了10％、20％、30％或50％。在一些实施例中，免疫细胞是T细胞。

在一些实施例中，mAb预先结合至载体或表面上。固体载体的非限制性实例可包括珠粒、琼脂糖珠、塑料珠、磁珠、塑料孔板、玻璃孔板、陶瓷孔板、柱或细胞培养袋。

待施用至接受者的表达CAR的免疫细胞可以在体外从源群体中富集。扩增源群体的方法可包括使用密度离心、免疫磁珠纯化、亲和色谱和荧光激活细胞分选的组合，选择表达抗原，例如表达CD34抗原的细胞。

流式细胞术可用于定量细胞群内的特定细胞类型。通常，流式细胞术是主要通过光学手段定量细胞成分或结构特征的方法。由于可以通过定量结构特征来区分不同的细胞类型，故流式细胞术和细胞分选可用于对混合物中不同表型的细胞进行计数和分选。

流式细胞术分析涉及两个主要步骤：1)用一种或多种标记的标志物标记选择的细胞类型，以及T)相对于群体中的细胞总数确定标记的细胞数。在一些实施例中，标记细胞类型的方法包括使标记的抗体与由特定细胞类型表达的标志物结合。抗体可以直接用荧光化合物标记，或可以使用例如识别第一抗体的荧光标记第二抗体间接标记。

在一些实施例中，用于分选表达CAR的T细胞的方法是磁激活细胞分选(MACS)。磁激活细胞分选(MACS)是一种通过使用超顺磁性纳米颗粒和柱，根据细胞群体的表面抗原(CD分子)来分离各种细胞群体的方法。MACS可用于获得纯细胞群。单细胞悬液中的细胞可以用微珠进行磁性标记。样品被施加到由铁磁性球体构成的柱上，所述铁磁性球体覆盖有对细胞友好的涂层，允许快速且温和地分开细胞。未标记的细胞通过柱，而磁性标记的细胞被保留在柱内。可以收集流通物作为未标记的细胞级分。洗涤步骤后，将柱从分离器中移出，并将磁性标记的细胞从柱中洗脱。

纯化特定细胞群，例如T细胞的详细方案可见于Basu S等.(2010)。(Basu S,Campbell HM,Dittel BN,Ray A.,通过荧光激活细胞分选(FACS)纯化特定细胞群(Purification of specific cell population by fluorescence activated cellsorting(FACS).),《视频实验杂志(J Vis Exp.)》(41):1546)。

在一些方面，本公开提供了一种通过体内消耗来消耗表达DLL3特异性CAR的免疫细胞的方法。体内消耗可包括向哺乳动物生物体施用治疗(例如结合CAR上的表位的分子)，旨在通过抑制或消除来停止表达CAR的免疫细胞的增殖。

本发明的一个方面涉及一种用于体内消耗表达包含mAb特异性表位的DLL3 CAR的工程化免疫细胞的方法，该方法包括使所述工程化免疫细胞或所述表达CAR的免疫细胞与至少一种表位特异性mAb接触。本发明的另一方面涉及一种通过使所述工程化免疫细胞与表位特异性抗体接触，在体内消耗表达CAR的免疫细胞的方法，所述表达CAR的免疫细胞包含嵌合scFv(例如通过插入mAb特异性表位而形成)。在一些实施例中，免疫细胞是T细胞和/或抗体是单克隆的。

根据一个实施例，免疫工程化细胞的体内消耗是在先前使用本发明的体外方法分选的工程化免疫细胞上进行的。在这种情况下，可以使用相同的输注mAb。在一些实施例中，mAb特异性抗原是CD20抗原，而表位特异性mAb是利妥昔单抗。在一些实施例中，本发明涉及一种在患者中体内消耗表达包含mAb特异性表位的CAR的工程化免疫细胞(表达CAR的免疫细胞)的方法，该方法包括使所述表达CAR的免疫细胞与至少一种表位特异性mAb接触。

在一些实施例中，使所述工程化免疫细胞或所述表达CAR的免疫细胞与至少一种表位特异性mAb接触的步骤包括向患者输注表位特异性mAb(例如利妥昔单抗)。在一些实施例中，向患者施用的表位特异性mAb的量足以消除患者体内至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的表达CAR的免疫细胞。

在一些实施例中，使所述工程化免疫细胞或所述表达CAR的免疫细胞与至少一种表位特异性mAb接触的步骤包括向患者输注约375mg/m²的利妥昔单抗一次或多次。在一些实施例中，mAb(例如利妥昔单抗)是每周施用一次。

在一些实施例中，当在补体依赖性细胞毒性(CDC)测定中使用表位特异性mAb消耗表达包含mAb特异性表位的CAR的免疫细胞(表达CAR的免疫细胞)时，有活力的表达CAR的免疫细胞的量减少。在一些实施例中，有活力的表达CAR的免疫细胞的量减少至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施例中，所述mAb特异性表位是CD20表位或模拟表位和/或所述表位特异性mAb是利妥昔单抗。

在某些实施例中，通过输注双特异性抗体来进行CAR工程化免疫细胞的体内消耗。根据定义，双特异性单克隆抗体(BsAb)是一种人工蛋白质，其由两种不同的单克隆抗体的片段构成，且因此与两种不同类型的抗原结合。这些BsAb及其在免疫疗法中的用途已在Muller D和Kontermann R.E.(2010),用于癌症免疫疗法的双特异性抗体(BispecificAntibodies for Cancer Immunotherapy),《生物药物(BioDrugs)》24(2):89-98中进行了综述。

根据另一特定的实施例，输注的双特异性mAb能够结合在表达嵌合scFv的工程化免疫细胞上带有的mAb特异性表位，并结合效应细胞和细胞毒性细胞(例如免疫细胞，例如淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀手细胞(NK细胞)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL))上的表面抗原。这样，由BsAb触发的工程化免疫细胞的消耗可以通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)发生。(Deo Y M,Sundarapandiyan K,Keler T,Wallace PK和Graziano RF,(2000),《免疫学杂志》,165(10):5954-5961])。

在一些实施例中，将细胞毒性药物与表位特异性mAb偶联，其可用于消耗表达CAR的免疫细胞。与单独使用药物相比，通过将单克隆抗体的靶向能力与细胞毒性药物的抗癌能力相结合，抗体-药物缀合物(ADC)允许敏感地区分健康组织和患病组织。数个ADC获得了市场批准；其制备技术，特别是关于接头的技术描述于(Payne,G.(2003)《癌细胞(CancerCell)》3:207-212；Trail等(2003)《癌症免疫学与免疫治疗(CancerImmunol.Immunother.)》52:328-337；Syrigos和Epenetos(1999)《抗癌研究(AnticancerResearch)》19:605-614；Niculescu-Duvaz和Springer(1997)《先进药物输送评论(Adv.Drug Del.Rev.)》26:151-172；美国专利号4,975,278)中。

在一些实施例中，待输注的表位特异性mAb预先与能够促进补体依赖性细胞毒性(CDC)的分子缀合。因此，补体系统有助于或补充抗体从生物体清除病原体的能力。当被刺激时，激活级联被触发，如此大规模放大杀死细胞的膜攻击复合体的应答和激活。可以使用不同的分子来缀合mAb，例如聚糖(Courtois,A,Gac-Breton,S.,Berthou,C,Guezennec,J.,Bordron,A.和Boisset,C.(2012)，治疗性抗体片段的补体依赖性细胞毒性活性可通过免疫原性聚糖偶联获得，《生物技术的电子期刊(Electronic Journal of Biotechnology)》ISSN:0717-3458；http://www.ejbiotechnology.info DOI:10.2225/voll5-issue5)。

VI.试剂盒和制品

本申请提供了包含本文所述的任一种含有CAR的DLL3或含有DLL3 CAR的免疫细胞的试剂盒，以及其药物组合物。在试剂盒的一个实施例中，将工程化CAR细胞冷冻在合适的培养基，例如

CS10、

CS2或

CS5(BioLife Solutions)中。

在一些示例性实施例中，本公开的试剂盒包括含有DLL3 CAR的同种异体T细胞和用于向受试者施用淋巴细胞清除方案和CAR-T方案的CD52抗体。

本申请还提供了包含本文所述的任一种治疗组合物或试剂盒的制品。制品的实例包括小瓶(例如密封小瓶)。

实例

实例1：DLL3靶向抗体的产生和测试

根据本发明使用的单克隆抗体可以通过首先由Kohler和Milstein，《自然》256:495,1975描述的杂交瘤方法来制备，或者可以通过例如美国专利号4,816,567中描述的重组DNA方法来制备。首先在Flag-DLL3(adipogen)ELISA中筛选抗DLL3抗体，然后在FACS中筛选以确定与具有或不具有人DLL3表达的HEK-293T细胞的结合。

为了测试DLL3特异性抗体是否可以识别表达内源性DLL3的细胞，将DMS 273(Sigma，目录号95062830)、DMS 454(Sigma，目录号95062832)和SHP-77(ATCC，目录号CRL-2195)细胞用在补充有1％BSA的PBS中的2μg/ml纯化的具有小鼠IgG2A主链(mIgG2a)的DLL3抗体或对照mIgG2a抗体染色。用PE标记的抗小鼠IgG抗体(Biolegend，目录号405307)检测结合的DLL3抗体。通过流式细胞术分析样品。图1中包括了显示DLL3抗体与DMS 273、DMS454和SHP-77细胞结合的代表性图像。

实例2：抗DLL3抗体针对DLL3的动力学和亲和力的确定

本实例确定了在37℃下针对人、食蟹猴(cyno)和小鼠DLL3的呈全长单克隆抗体(IgG)和scFv形式的各种抗DLL3抗体的结合动力学和亲和力。对于scFv，克隆源自对应杂交瘤的抗DLL3抗体的可变区，其侧接(GGGGS)₃(SEQ ID NO:472)或(GGGGS)₄(SEQ ID NO:478)，然后是来自修饰的人IgG2序列的铰链和Fc，产生scFv-Fc融合体，其使用Expi293表达。将来自人、食蟹猴和小鼠DLL3的胞外结构域(ECD)与C末端8×His表位标签(SEQ ID NO:473)和Avi标签融合，使用Expi293表达，然后依序通过固定化金属亲和色谱(IMAC)和尺寸排阻色谱(SEC)进行纯化。

通过表面等离子体共振(BiacoreTM表面等离子体共振(SPR)系统，宾夕法尼亚州匹兹堡(Pittsburg PA)的GE Healthcare Bio-Sciences)确定抗体结合动力学。将在HBS-T+操作缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.05％v/v Tween20、1mg/mL BSA)中稀释的抗体捕获于固定有对抗DLL3抗体恒定结构域具有特异性的抗体的CM4芯片上。将纯化的DLL3连续稀释到HBS-T+中，以30μL/min注射2分钟，解离时间为10分钟，然后在注射之间用10mM甘氨酸盐酸盐(pH 1.7)或磷酸使表面再生。通过使用BIAevaluation程序将数据全局拟合于1:1Langmuir结合模型，同时获得动力学缔合速率(kon)和解离速率(koff)(Karlsson,R.Roos,H.Fagerstam,L.Petersson,B.(1994).《酶学方法(MethodsEnzymology)》6.99-110)。平衡解离常数(K_d)值是以k_off/k_on计算。

表8中显示所测试的抗DLL3抗体的动力学和亲和力参数。具体地说，表8显示抗DLL3抗体(呈IgG或scFv-Fc融合体形式)对人、食蟹猴和小鼠DLL3的亲和力。最后一列显示每种抗DLL3抗体识别的人DLL3的胞外结构域。

表8：抗DLL3抗体的亲和力

N-ter＝N末端

ND＝未确定

NB＝无结合

实例3：表达全长和截短的DLL3的CHO细胞的产生

使用一组表达全长和多种截短的人DLL3的CHO细胞来确定每个DLL3靶向抗体识别的结构域。人DLL3的胞外结构域可以细分为不同的亚结构域，这些亚结构域由以下氨基酸位置界定：信号肽：1-26；N末端(N-ter)：27-175；DSL：176-215；EGF1：215-249；EGF2：274-310；EGF3：312-351；EGF4：353-389；EGF5：391-427；和EGF6：429-465。

为了产生用于表位定位的截短的DLL3蛋白，从N末端开始，从抗原逐个缺失人DLL3的相应8个胞外结构域(信号肽加N末端、DSL、EGF1、EGF2、EGF3、EGF4、EGF5和EGF6)的序列。表6显示了所产生的截短的DLL3蛋白(也参见图2A-2D)。

表6：截短的DLL3蛋白

为了建立表达具有N末端HA标签的全长和截短的人DLL3的CHO细胞，将全长人DLL3的编码序列(SEQ ID NO:556；GeneBank记录NM_016941)和7个带有HA标签的截短的人DLL3(SEQ ID NO:557至563)克隆到pLVX-SFFV-Puro-P2A-TetO3G载体(Clontech)中。通过用pLVX-SFFV-Puro-P2A-TetO3G载体以及psPAX2和pMD2G载体共转染293T细胞，产生编码全长或截短的人DLL3的慢病毒。转染两天后，收集含有病毒颗粒的上清液，并使用其与5μg/ml的聚凝胺一起转导CHO细胞。

在FACS测定中，使用PE缀合的抗HA抗体(Biolegend，目录号901518)验证全长和截短的DLL3的表达。作为阴性对照，将细胞与同型匹配和PE标记的抗体(Biolegend，目录号400111)代替抗HA抗体进行培育。图2A的底部图显示全长和截短的DLL3在CHO细胞上的表达。

实例4：DLL3靶向抗体的表位定位

用杂交瘤上清液或在PBS+1％BSA中的纯化的DLL3抗体对表达全长和截短的DLL3的CHO细胞染色。用PE标记的抗小鼠IgG抗体(Biolegend，目录号405307)检测结合的DLL3抗体。通过流式细胞术分析样品。使用实例2中所述的表达全长或截短的DLL3的CHO组确定每个克隆的结合结构域。流式细胞术分析表明，例如，如果克隆结合至包括EGF3的所有截短的蛋白质，但不结合至任何不具有EGF3的截短的蛋白质，则此类克隆识别EGF3。如图2D中的代表性图像中所示，抗DLL3抗体分别识别DSL、EGF1和EGF3结构域。来自PE通道的信号显示在x轴上，且计数显示在y轴上。

实例5：DLL3特异性CAR-T细胞的产生

本实例描述了抗DLL3嵌合抗原受体(CAR)的构建。

将表1a中列出的抗DLL3抗体重新格式化为CAR。使用这些抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列(表1b和表1c)来设计具有以下一般结构的单链可变片段(scFv)(表1d)：重链可变区--接头--轻链可变区。接头具有以下氨基酸序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:478)。

编码嵌合抗原受体的蛋白质序列被设计为从5'至3'含有以下元件(图3A，表7)：CD8α信号序列(SEQ ID NO:477)、抗DLL3 scFv、人CD8α分子的铰链和跨膜区(SEQ ID NO:479)、41BB分子的胞质部分(SEQ ID NO:291)和CD3ζ分子的胞质部分(SEQ ID NO:292)。

表7：CAR氨基酸序列

CAR结构的示意图在图3A中给出。从抗DLL3克隆重新格式化的代表性CAR序列包括在SEQ ID NO 482至533中。合成密码子优化的DLL3 CAR序列，并使用XmaI(5')和MluI(3')限制位点将其亚克隆到以下慢病毒载体pLVX-EF1a-DLL3 CAR(Clontech)中。

为了产生DLL3 CAR-T细胞，首先使用Ficoll梯度密度介质(Ficoll Paque PLUS/GE Healthcare Life Sciences)从血沉棕黄层样品中纯化出PBMC。使用市售的T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec，目录号130-096-535)从PBMC中纯化T细胞。替代地，可以从LeukoPak(StemCell Technologies)直接纯化原代人T细胞。

为了制造编码DLL3 CAR的慢病毒，在第0天将HEK-293T细胞以每毫升40万个细胞接种于6孔板的每孔补充有10％FBS(Hyclone或JR Scientific)的2mL DMEM(Gibco)中。在第1天，通过在6孔板的每个孔中，将慢病毒包装载体1.5μg psPAX2、0.5μg pMD2G和0.5μg的适当转移CAR载体混合在250μL Opti-MEM(Gibco)(“DNA混合物”)中，来制备慢病毒。将在250μL Opti-MEM中的10μL Lipofectamine 2000(Invitrogen)在室温下培育5分钟，然后加入到DNA混合物中。将混合物在室温下培育20分钟，并将500μL的总体积缓慢加入含有HEK-293T的孔的侧面。在补充了100IU/mL人IL-2(Miltenyi Biotec)、10％FBS(Hyclone)和人TTransact(Miltenyi Biotec，目录号130-111-160，1:100稀释度)的X-Vivo-15培养基(Lonza)中激活纯化的T细胞。在第2天，将6孔板每孔的培养基用每孔2mL的T细胞转导培养基，即补充有10％FBS的X-Vivo-15替换。在第3天，将T细胞以50万个细胞/毫升再悬浮于Grex-24板(Wilson Wolf，目录号80192M)的每孔1mL T细胞转导培养基中。收获来自HEK293T细胞的慢病毒上清液，并使其通过0.45微米过滤器(EMD Millipore)以去除细胞碎片，然后将其与100IU/mL人IL-2一起添加至T细胞中。在第5天，将4.5mL的T细胞扩增培养基，即补充有5％人AB血清(Gemini Bio)的X-Vivo-15，添加到Grex-24板的每个孔中。在第9天和第13天，通过使用流式细胞术检测识别重组DLL3(Adipogen)的T细胞的百分比来确定转导效率。根据需要，在较大的烧瓶或G-Rex容器(Wilson Wolf)中，使用T细胞扩增培养基扩增细胞。在第14天，将DLL3 CAR-T细胞冷冻保存。在即将冷冻保存前，将所有克隆的重组DLL3染色的细胞的百分比归一化。

为了确定用DLL3 CAR成功地转导的T细胞的百分比，首先将T细胞与在PBS+1％BSA中的1μg/ml带有Flag标签的重组DLL3(Adipogen)一起在4℃下培育20分钟。然后，用PBS+1％BSA洗涤细胞，用PE标记的抗Flag抗体(Biolegend，目录号637310)染色，并使用流式细胞术进行分析。

DLL3 CAR-T细胞的实例在图3B中示出。图3B显示了实验数据，显示抗DLL3 CAR在原代T细胞的表面上表达并且可以识别重组DLL3。这些图针对活CD3+细胞进行门控。图上的数字是表达每种抗DLL3 CAR的细胞的百分比。

实例6：体外表征

本实例描述了用于确定CAR对DLL3的特异性和体外活性的实验。

SHP-77、WM266.4、DMS 454和DMS 273是购自ATCC或Sigma的DLL3+细胞系。HEK-293T是DLL3阴性细胞系。为了在HEK-293T中表达人DLL3，使用编码全长人DLL3的慢病毒来转导HEK-293T细胞。

为了测试DLL3特异性杀死情况，然后将具有或不具有人DLL3表达的表达萤火虫荧光素酶的HEK-293T细胞以每孔5,000个细胞的接种密度接种在96孔测定板(Costar)中。将DLL3 CAR-T细胞解冻，并在T细胞扩增培养基，即补充有5％人AB血清(Gemini Bio)的X-Vivo-15中，将其以范围从1:9至9:1的效应子:靶(E:T)比率添加至所涂铺的具有或不具有人DLL3表达的HEK-293T细胞中。72小时后，使用one-glo测定试剂盒(Promega)测量细胞活力。代表性DLL3 CAR-T细胞展示出对HEK-293T-DLL3细胞的有效杀死，但在HEK-293T亲本细胞中未显示可检测的活性(图4A)。

为了测试DLL3 CAR-T细胞对表达内源性DLL3的细胞系的细胞毒性活性，在T细胞扩增培养基，即补充有5％人AB血清(Gemini Bio)的X-Vivo-15中，将DLL3 CAR-T细胞与萤火虫荧光素酶标记的DLL3+SHP-77、WM266.4、DMS 454或DMS 273细胞以范围从1:9至9:1的效应子:靶(E:T)比率一起培育。72小时后，使用one-glo测定试剂盒(Promega)测量细胞活力。每种条件进行3次重复测定。绘制出活细胞的平均百分比和标准差(图4B和图4C)。

图4A显示了实验数据，显示抗DLL3 CAR-T细胞在3天的细胞毒性测定中以指定的效应子:靶比率特异性杀死表达人DLL3的HEK-293T细胞，而不杀死亲本HEK-293T细胞。不表达抗DLL3 CAR的T细胞(标记为空载体)用作阴性对照。

图4B显示了实验数据，显示抗DLL3 CAR-T细胞在3天的细胞毒性测定中以指定的效应子:靶比率杀死表达内源性DLL3的SHP-77和WM266.4细胞。

图4C显示了实验数据，显示抗DLL3 CAR-T细胞在3天的细胞毒性测定中以指定的效应子:靶比率杀死表达内源性DLL3的DMS 454和DMS 273小细胞肺癌细胞。对于图4C中的所有曲线图，使用One-glo测定系统来评估靶细胞活力，n＝3。

为了测量从DLL3 CAR-T细胞分泌的细胞因子，在T细胞扩增培养基，即补充有5％人AB血清(Gemini Bio)的X-Vivo-15中，将DLL3 CAR-T细胞与DLL3+SHP-77细胞以1:1至1:9的效应子:靶(E:T)比率一起培育。24小时后，收集组织培养物上清液，并使用人促炎性组织培养液9重测定(MSD)，按照制造商的方案，测量上清液中3种细胞因子[干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-2]的水平。图5显示在与表达DLL3的SHP-77细胞系共培育后，抗DLL3 CAR-T细胞释放细胞因子。将CAR-T细胞和SHP-77细胞以1:1或1:9的效应子:靶比率培育24小时，n＝3。

实例7：连续杀死测定

连续杀死测定涉及将CAR-T细胞反复暴露于其靶，使CAR-T细胞经历增殖，并且在某些情况下，经历分化和耗竭。使用这一测定选择在数轮暴露于靶细胞后具有高靶细胞溶解和增殖能力的最佳克隆。

在测定的第一天，将已知表达DLL3的5,000个萤火虫荧光素酶标记的WM266.4、DMS454或DMS 273细胞接种到96孔板中具有5％人血清的100μl X-Vivo-15培养基中，所述孔板具有白色的壁和平坦的透明底部。将靶细胞附着到板的底部后，将DLL3 CAR-T细胞解冻，并以1:1的效应子:靶(E:T)比率添加至在具有5％人血清的X-VIVO培养基中涂铺的靶细胞中。此后每2天，将100μl含有DLL3 CAR-T细胞的培养基转移到新涂铺的靶细胞中，并使用one-glo测定系统或CellTiter-glo系统(Promega)确定先前涂铺的靶细胞的溶解百分比。每种条件进行3到6次重复测定。绘制平均溶解百分比和标准差(图6A-6C)。最佳克隆是在第12天的整个测定过程中靶细胞溶解最高的克隆。这些数据显示了连续杀死测定的实验数据，显示出在将抗DLL3 CAR-T细胞反复暴露于DLL3+WM266.4细胞后，一些克隆保持活性。在每个指示的时间点使用One-glo测定系统或CellTiter-glo来评估靶细胞活力，n＝3-6。

实例8：体内活性

为了测试DLL3 CAR-T细胞的抗肿瘤活性，使用带有SHP-77肿瘤的NSG小鼠。从冷冻原液小瓶中获得SHP-77细胞，将其解冻并根据标准程序计数。在完全生长培养基(RPMI+10％FBS)中将细胞稀释至50×10⁶个活细胞/毫升。将细胞悬浮液保持在冰上直至植入。在即将植入之前，将细胞与BD Matrigel Matrix(目录号354234)以1:1混合，并且每只小鼠皮下注射200μL含有5×10⁶个SHP-77细胞的细胞/基质胶悬浮液。从植入后第5天开始，通过使用数字卡尺进行卡尺测量来监测肿瘤的生长。使用公式肿瘤体积＝(宽度^2×长度/2)计算肿瘤大小。植入后约两周，基于肿瘤体积将小鼠随机分为5组。每组的平均肿瘤体积为314mm³或更小。在小鼠随机分组后一天，将未转导的T细胞和DLL3 CAR-T细胞解冻并根据标准程序计数。将细胞再悬浮于RPMI+10％FBS中，并通过尾静脉IV注射以每只小鼠200μL的体积注射2000000或5000000个CAR+细胞/小鼠的剂量。持续每3-4天监测肿瘤，直到研究结束。26C8和10G1-K DLL3 CAR-T细胞以剂量依赖性方式诱导肿瘤抑制(图7A-7B)。图7A-7B显示了实验数据，显示抗DLL3 CAR-T细胞可以通过剂量依赖性方式消除小鼠中已建立的小细胞肺癌肿瘤。

为了在显示出类似于人类疾病的转移的模型中测试DLL3 CAR-T细胞的抗肿瘤活性，通过尾静脉注射建立SHP-77肿瘤。在肺、肝、脑、肾和脾中观察到肿瘤。具体而言，将SHP-77细胞解冻，并在完全生长培养基(RPMI+10％FBS)中稀释至40×10⁶个活细胞/毫升。将细胞悬浮液保持在冰上直至植入，并通过尾静脉IV向每只小鼠注射200μL细胞悬浮液。植入后第7天，注射200μL荧光素(15mg/mL)，并通过IVIS成像监测肿瘤生长。基于植入后第11天的总通量，将小鼠随机分为5组。在植入后第12天，将CAR-T解冻并根据标准程序计数。将细胞再悬浮于RPMI+10％FBS中，并通过尾静脉IV注射以每只小鼠200μL的体积注射每只小鼠2000000或7000000个CAR+细胞。持续每3-4天监测肿瘤，直到研究结束。如图8中所示，10G1-K抗DLL3 CAR-T细胞可以通过剂量依赖性方式抑制小鼠中已建立的小细胞肺癌肿瘤。

实例9：具有安全开关的抗DLL3 CAR构建体

本实例描述了具有安全开关的抗DLL3 CAR的构建、表达和细胞毒性活性。将表6中的抗-DLL3 CAR重新格式化，以包括下面列出的不同安全开关结构(表8)。

表8：安全开关的结构

编码包括安全开关的抗DLL3 CAR构建体的蛋白质序列显示于表9中。示例性安全开关构建体可以包含CD8α信号序列(SEQ ID NO:477)、本文所述的抗DLL3 scFv、CD20模拟表位(SEQ ID NO:536)，QBEND-10表位(SEQ ID NO:544)、人CD8α分子的铰链和跨膜区(SEQID NO:479)、4-1BB分子的胞质部分(SEQ ID NO:291)和CD3ζ分子的胞质部分(SEQ ID NO:292)。

表9：CAR和安全开关的氨基酸序列

使用实例5中所述的方法产生CAR-T，并使用实例7中所述的方法检查其细胞毒性活性。图9A是示出四个不同的安全开关的结构的图。图9B描绘了实验性流式细胞术数据，显示具有安全开关的抗DLL3 CAR 2G1、4H8和10G1-K在原代T细胞的表面上表达并且可以识别重组DLL3。这些图针对活CD3+细胞进行门控，并且图上的数字是表达每种抗DLL3 CAR的细胞的百分比。图9C描绘了实验数据，显示具有安全开关的抗DLL3 CAR在DLL3+WM266.4细胞系的连续杀死测定中具有活性。

实例10：针对小细胞肺癌PDX模型的细胞毒性

小细胞肺癌PDX模型购自Crown Bioscience。为了检查细胞表面的DLL3表达，将PDX模型的冷冻小瓶解冻，并且将200,000个细胞用于每个染色样品。在FACS测定中，使用PE缀合的抗DLL3抗体验证DLL3的表达。将亮紫色421缀合的抗人CD45和抗小鼠CD45抗体添加到同一染色样品中，以排除人和小鼠淋巴细胞。

图10A描绘了实验数据，显示DLL3在两个小细胞肺癌PDX模型的表面上表达。图10B显示了实验数据，显示抗DLL3 CAR-T细胞在3天的细胞毒性测定中以指定的效应子:靶比率杀死相同的两个小细胞肺PDX模型。不表达抗DLL3 CAR的T细胞(标记为空载体)用作阴性对照。

实例11：使用基于利妥昔单抗的安全开关在体外检测和消耗DLL3 CAR-T细胞

为了在不需要的活性的情况下消耗或关闭CAR T细胞，如实例9中所述，通过在CAR的胞外区不同位置插入利妥昔单抗模拟表位来开发利妥昔单抗关闭开关。使用补体依赖性细胞毒性测定来评估DLL3 CAR-T细胞的利妥昔单抗依赖性体外消耗。在这一测定中，将冷冻的CAR-T细胞解冻，并将1×10⁵个细胞在96孔板中补充有10％FBS的RPMI 1640培养基中培育。在不存在或存在25％幼兔补体(Cedarlane，CL3441-S)和利妥昔单抗抗体(内部产生；100mg/mL)的情况下，将细胞培育3小时。用重组DLL3(Adipogen)对细胞染色，并通过流式细胞术分析细胞毒性。图11A描绘了实验数据，显示可以通过重组DLL3和利妥昔单抗染色两者检测抗DLL3 CAR-T细胞。图11B描绘了实验数据，显示DLL3 CAR-T细胞在体外以利妥昔单抗依赖性和补体依赖性方式消耗。

实例12：具有安全开关的抗DLL3 CAR-T细胞的体内活性

为了测试具有安全开关的DLL3 CAR-T细胞的抗肿瘤活性，使用带有SHP-77肿瘤的NSG小鼠。将冷冻小瓶中的SHP-77细胞解冻，计数并稀释。对每只小鼠皮下注射在RPMI培养基/基质胶悬浮液中的50×10⁶个活细胞/毫升。从植入后第5天开始，通过使用数字卡尺进行卡尺测量来监测肿瘤的生长。使用公式肿瘤体积＝(宽度^2×长度/2)计算肿瘤大小。植入后约14天，基于肿瘤体积将小鼠随机分为8组。每组平均肿瘤体积为178mm³。在将小鼠随机分组的同一天，将未转导的T细胞和DLL3 CAR-T细胞解冻并根据标准程序计数。将细胞以5×10⁶个CAR+细胞/小鼠再悬浮于RPMI中，每只小鼠尾静脉IV注射200μL的体积。持续每3-4天监测肿瘤，直到研究结束。到第50天，具有安全开关的DLL3 CAR-T细胞的所有组都诱导可检测肿瘤的显著肿瘤抑制以及完全或接近完全消除(图12A)。

为了在显示出类似于人类疾病的转移的模型中测试DLL3 CAR-T细胞的抗肿瘤活性，通过尾静脉注射建立表达外源性DLL3的DMS 273小细胞肺肿瘤(DMS 273-DLL3)。具体而言，将DMS 273-DLL3细胞解冻，并在RPMI培养基中稀释至5×10⁵个活细胞/毫升。通过尾静脉IV向每只小鼠注射200μL细胞悬浮液。植入后第3天，将小鼠随机分为9组。同一天，将DLL3CAR-T解冻，计数并以每只小鼠5×10⁶个CAR+细胞的浓度再悬浮于RPMI培养基中，每只小鼠尾静脉IV注射200μL的体积。使用IVIS成像系统继续每3-4天监测肿瘤，直到研究结束。如图12B中所示，具有基于利妥昔单抗的不同安全开关的多个不同DLL3 CAR对转移性肿瘤有效。

实例13：使用非荷瘤动物进行的小鼠安全性研究

已经在人脑和垂体中报导了DLL3 RNA(GTex)。类似地，在垂体中也报导了小鼠DLL3RNA(Bio-GPS)。为了获悉在小鼠脑中DLL3 RNA的表达，将来自三只NSG小鼠的脑固定在10％中性缓冲福马林(neutral buffered formalin，NBF)中，包埋，以4–6微米连续切片，并在

LSRed ISH测定(ACDBio)中进行分析。在NSG小鼠的脑样品中检测到低水平的DLL3 RNA。图13A显示在这一测定中观察到的小鼠DLL3 RNA染色的代表性图像。

为了获悉在脑和垂体中DLL3 RNA表达的潜在毒性倾向，将未转导的T细胞、8×10⁶个10G1-K DLL3 CAR-T细胞或8×10⁶个2G1 DLL3 CAR-T细胞IV注射到NSG小鼠中。注射后七天，收获脾、脑和垂体，固定在10％NBF中，包埋，以4-6微米连续切片，并用抗人CD3抗体(Abcam，ab52959，1:500稀释液)染色以通过免疫组织化学检测人T细胞。尽管在来自所有动物的脾中检测到T细胞，但在脑或垂体样品中未检测到它们(图13B)。因此，尽管在非荷瘤NSG小鼠中检测到低水平的DLL3 RNA，但是在这些小鼠的脑或垂体样品中未检测到DLL3CAR-T细胞。

实例14：使用带有皮下肿瘤的动物进行的小鼠安全性研究

为了进一步评估潜在的脑和垂体毒性倾向，将DLL3 CAR-T细胞注射到带有表达外源性小鼠DLL3的皮下LN229肿瘤(LN229-mDLL3)的NSG小鼠中。在这一模型中，肿瘤细胞对CAR-T的激活可以导致针对潜在的表达DLL3的正常组织的敏感性和活性增加。.实验设计示于图14A中。在肿瘤植入前三天(第-3天)，通过尾静脉注射编码IL-7和IL-15的腺相关病毒(AAV)(Vigene Biosciences)以支持CAR-T细胞扩增和存留。然后，将冷冻小瓶中的LN229-mDLL3细胞解冻，并在完全生长培养基(RPMI+10％FBS)中稀释至4.25×10⁷个细胞/毫升。将细胞悬浮液保持在冰上直至植入。在即将植入前，将细胞与BD Matrigel Matrix(目录号354234)以1:1混合，并对每只小鼠皮下注射200μL含有4.25×10⁶个LN229-mDLL3细胞的细胞/基质胶悬浮液。从植入后第8天开始，通过使用数字卡尺进行卡尺测量来监测肿瘤生长。使用公式肿瘤体积＝(宽度^2×长度/2)计算肿瘤大小。在植入后第22天，基于肿瘤体积以及IL-7和IL-15的血清浓度，将小鼠随机分为5组。在同一天(第22天)，将未转导的T细胞和小鼠交叉反应性10G1-K DLL3 CAR-T细胞解冻，并使其再悬浮于RPMI+10％FBS中，并且通过尾静脉IV注射以每只小鼠200μL的体积注射1×10⁷个CAR+细胞/小鼠。持续每3-4天监测肿瘤，直到研究结束，并且观察到用DLL3 CAR T治疗的稳健抗肿瘤活性(图14B)。

在第49天，当接受DLL3 CAR-T细胞的动物无肿瘤时，将来自动物的脑组织固定在10％NBF中并包埋以露出包括侧脑室、第三脑室和第四脑室在内的脑室系统，以便将这三个部分放入单个块中，以4-6微米连续切片，并用苏木精和曙红(H&E)染色或通过免疫组织化学染色以检测人特异性CD3(hCD3)。将垂体腺固定在10％NBF中，处理并用H&E染色或免疫组织化学染色以展示hCD3。用显微镜检查H&E载玻片，并且病理学家使用标准系统对组织病理学发现进行评分。施用DLL3 CAR-T细胞在垂体中间部和神经部中产生大量的hCD3染色的T细胞，而在远侧部中具有相对较少的T细胞(图14C且数据未显示)。在脑神经纤维网和脉管系统(作为循环T细胞)中存在T细胞的稀疏至中等偏低或中等至中等偏高的hCD3染色(图14C且数据未显示)。不存在其它垂体或脑发现(图14C-D)。为了获悉T细胞浸润的功能性结果，使用免疫组织化学对垂体神经部中释放的两种激素，即血管加压素和催产素进行染色。对于血管加压素检测，在室温下用抗血管加压素抗体(ImmunoStar，20069)以1/7,000稀释度对样品染色1小时，然后在室温下用兔结合啮齿动物HRP-聚合物(Biocare Medical)染色30分钟。对于催产素检测，在室温下用抗催产素抗体(ImmunoStar，20068)以1/10,000稀释度对样品染色15分钟，然后在室温下用兔结合啮齿动物HRP-聚合物(Biocare Medical)染色30分钟。在接受未转导的T细胞或DLL3 CAR-T细胞的动物的垂体神经部中可以检测到两种激素，表明在这一区域中产生激素的神经元保持功能(图14E-F)。因此，基于病理学评估和激素染色，在样品中没有看到组织损伤。

实例15：使用带有颅内肿瘤的动物进行的小鼠安全性研究

为了促进T细胞向脑的浸润并进一步获悉潜在的脑毒性，使用带有表达外源性小鼠DLL3和人EGFRvIII的颅内LN229肿瘤(LN229-mDLL3-vIII)的NSG小鼠。实验设计示于图15A中。将冷冻小瓶中的LN229-mDLL3细胞解冻，并在RPMI中稀释至1×10⁷个活细胞/毫升。然后，对每只小鼠颅内注射3μL含有3×10⁴个LN229-mDLL3细胞的细胞悬浮液。通过IVIS成像系统监测肿瘤的生长。植入后第17天，基于肿瘤体积将小鼠随机分为10组。在同一天(第17天)，将敲除TCR的未转导T细胞、10G1-K DLL3 CAR-T细胞和EGFRvIII CAR-T细胞解冻并再悬浮于RPMI中，并以每只小鼠200μL的体积通过尾静脉IV注射1×10⁷个CAR+细胞/小鼠。包括EGFRvIII CAR-T细胞作为对照，以评估脑中由肿瘤溶解引起的潜在炎症。为了支持CAR-T细胞扩增和存留，在第17天开始，每周两次向每只动物给予0.5μg IL-15(PeprotechAF-200-15)和3μg IL-15Ra Fc融合蛋白(R&D Systems 7194-IR)，直到研究结束。继续每3-4天监测肿瘤，直到研究结束，并且观察到明显的抗肿瘤活性(图15B)。在第22天和第38天，对来自所有动物的脑组织进行修剪、处理和包埋，以露出包括侧脑室、第三脑室和第四脑室在内的脑室系统，以便将这三个部分放入单个块中，以4–6微米连续切片，并用H&E染色或通过免疫组织化学染色以检测人特异性CD45(hCD45)。对垂体腺组织进行处理，使其包括垂体神经部、中间部和远侧部，并用H&E染色或免疫组织化学染色以检测作为人T细胞的标志物的hCD45。

在第22天，接受未转导的T细胞或10G1-K DLL3 CAR-T细胞的动物在脑或垂体腺中具有极少/稀疏的hCD45染色T细胞(数据未显示)。另一方面，对于用EGFRvIII CAR-T细胞治疗的动物，在浸润/神经胶质增生或神经胶质瘤区域中hCD45+染色范围从极少/稀疏至中等偏低或中等至中等偏高，与这一组的抗肿瘤活性一致(数据未显示)。在第38天，接受未转导T细胞或EGFRvIII CAR-T细胞的动物在脑和垂体腺中具有极少/稀疏的hCD45+染色。接受10G1-K DLL3 CAR-T细胞的动物在垂体腺中，主要在垂体中间部和神经部中具有极低或轻度的单核细胞浸润(图15C-D)。此外，与脑中其它区域(脑部脉管系统、脉络丛和脑膜)中极少/稀疏的染色相比，这些动物具有略高(中等偏低)的与神经胶质瘤小灶相关的hCD45+染色，与这一组中的抗肿瘤活性一致，如图15B所示。

实例16：解离的小鼠垂体细胞的体外细胞毒性

为了直接测试DLL3 CART是否对垂体具有活性，在无菌条件下收获来自NSG小鼠的小鼠垂体以用于体外分析。通过在37℃下，在1mL解离混合物[5mL DMEM、高葡萄糖、GlutaMax(Gibco，目录号10564)、50μL酶H、5μL酶R、6.25μL酶A(Miltenyi肿瘤解离试剂盒#130-095-929)]中进行3轮培育来解离组织，然后使用研磨法进行机械解离。将单细胞转移到完全培养基(DMEM、高葡萄糖、20％GlutaMax、1X胰岛素-转铁蛋白-硒溶液、1X MEM非必需氨基酸、1X青霉素-链霉素)中，并在每轮后汇集起来。使细胞沉淀并在室温下用ACK溶解缓冲液处理3分钟，然后在完全培养基中进行中和。通过70u过滤器过滤细胞悬浮液，并离心以去除缓冲液。对细胞计数，并以每孔5×10⁴个细胞涂铺于96孔板中的完全培养基中，并使其恢复3天，然后加入CAR-T细胞。在添加CAR-T细胞时，预期的靶密度为每孔1×10⁴个细胞。对于对照，以相同的密度接种DLL3⁺细胞(DMS-273)和DLL3^-细胞(293T)。以E:T＝9:1、3:1和1:1添加10G1-K和2G1 DLL3 CAR-T细胞，并将其与靶共培养3天。在3天的共培养结束时，将培养基与孔分离并离心以沉淀出T细胞。用每孔50μL的Cell Titer Glo(Promega，G7570)处理靶细胞10分钟，并在SpectraMax读板器中分析细胞毒性读数。

图16A描绘了实验数据，显示尽管DLL3 CAR-T细胞对DLL3+DMS 273细胞系具有活性，但是它们在体外对小鼠垂体细胞没有细胞毒性。汇集T细胞并针对激活标志物(41BB和CD25)染色，以通过流式细胞术分析。图16B描绘，小鼠垂体细胞在体外不激活DLL3CAR-T细胞。将上清液在-80℃冷冻，然后解冻以使用人TH1/TH2 10-Plex组织培养试剂盒(MesoScale Discovery,K15010B)进行细胞因子分析。图16C描绘，尽管10G1-K和2G1 DLL3CAR-T细胞在与DLL3+DMS 273细胞系共培养时都分泌干扰素-γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IL-2，但是在将DLL3 CAR-T细胞与小鼠垂体细胞共培养后，没有细胞因子分泌。因此，DLL3 CAR-T细胞在体外对垂体细胞无细胞毒性。

Claims (45)

1.一种嵌合抗原受体，其包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述胞外结构域包含与DLL3特异性结合的DLL3抗原结合结构域，并且其中所述抗原结合结构域包含以下中的至少一种：

(a)可变重链CDR1，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO 1、10、19、28、37、46、55、64、73、82、91、100、109、118、127、136、145、154、163、172、181、190、199、208、217、226、235、244、253、262、271、280、289、298、307、316、325、334、343、352、361、370、379、388、397、406、415、424、433、442、451和460；

(b)可变重链CDR2，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ NO:2、11、20、38、47、56、65、74、83、92、101、110、119、128、137、146、155、164、173、182、191、200、209、218、227、236、245、254、263、272、281、290、299、308、317、326、335、344、353、362、371、380、389、398、407、416、425、434、443、452、461和695；

(c)可变重链CDR3，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO 3、12、21、30、39、48、57、66、75、84、93、102、111、120、129、138、147、156、165、174、183、192、201、210、219、228、237、246、255、264、273、282、291、300、309、318、327、336、345、354、363、372、381、390、399、408、417、426、435、444、453和462；

(d)可变轻链CDR1，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、13、22、31、40、49、58、67、85、94、103、112、121、130、139、148、157、166、175、184、193、202、211、220、229、238、247、256、265、274、283、292、301、310、319、328、337、346、355、364、373、382、391、400、409、418、427、436、445、454、463和696；

(e)可变轻链CDR2，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、14、23、32、41、50、59、68、77、86、95、104、113、122、131、140、149、158、167、176、185、194、203、212、221、230、239、248、257、266、275、284、293、302、311、320、329、338、347、356、365、374、383、392、401、410、419、428、437、446、455和464；以及

(f)可变轻链CDR3，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、15、24、33、42、51、60、69、78、87、96、105、114、123、132、141、150、159、168、177、186、195、204、213、222、231、240、249、258、267、276、285、294、303、312、321、330、339、348、357、366、375、384、393、402、411、420、429、438、447、456和465。

2.一种嵌合抗原受体，其包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述胞外结构域包含与DLL3特异性结合的DLL3抗原结合结构域，并且其中所述抗原结合结构域包含：

(a)可变重链CDR1，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、10、19、28、37、46、55、64、73、82、91、100、109、118、127、136、145、154、163、172、181、190、199、208、217、226、235、244、253、262、271、280、289、298、307、316、325、334、343、352、361、370、379、388、397、406、415、424、433、442、451和460；

(b)可变重链CDR2，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ NO:2、11、20、38、47、56、65、74、83、92、101、110、119、128、137、146、155、164、173、182、191、200、209、218、227、236、245、254、263、272、281、290、299、308、317、326、335、344、353、362、371、380、389、398、407、416、425、434、443、452、461和695；以及

(c)可变重链CDR3，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、12、21、30、39、48、57、66、75、84、93、102、111、120、129、138、147、156、165、174、183、192、201、210、219、228、237、246、255、264、273、282、291、300、309、318、327、336、345、354、363、372、381、390、399、408、417、426、435、444、453和462。

3.一种嵌合抗原受体，其包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述胞外结构域包含与DLL3特异性结合的DLL3抗原结合结构域，并且其中所述抗原结合结构域包含：

(a)可变轻链CDR1，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、13、22、31、40、49、58、67、85、94、103、112、121、130、139、148、157、166、175、184、193、202、211、220、229、238、247、256、265、274、283、292、301、310、319、328、337、346、355、364、373、382、391、400、409、418、427、436、445、454、463和696；

(b)可变轻链CDR2，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ NO:5、14、23、32、41、50、59、68、77、86、95、104、113、122、131、140、149、158、167、176、185、194、203、212、221、230、239、248、257、266、275、284、293、302、311、320、329、338、347、356、365、374、383、392、401、410、419、428、437、446、455和464；以及

(c)可变轻链CDR3，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、15、24、33、42、51、60、69、78、87、96、105、114、123、132、141、150、159、168、177、186、195、204、213、222、231、240、249、258、267、276、285、294、303、312、321、330、339、348、357、366、375、384、393、402、411、420、429、438、447、456和465。

4.一种嵌合抗原受体，其包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述胞外结构域包含与DLL3特异性结合的DLL3抗原结合结构域，并且其中所述抗原结合结构域包含以下中的至少一种：

(a)可变重链，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、16、25、34、43、52、61、70、79、88、97、106、115、124、133、142、151、160、169、178、187、196、205、214、223、232、241、250、259、268、277、286、295、304、313、322、331、340、349、358、367、376、385、394、403、412、421、430、439、448、457、466；以及

(b)可变轻链，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ NO:8、17、26、35、44、53、62、71、80、89、98、107、116、125、134、143、152、161、170、179、188、197、206、215、224、233、242、251、260、269、278、287、296、305、314、323、332、341、350、359、368、377、386、395、404、413、422、431、440、449、458和467，

其中所述可变重链和所述可变轻链通过至少一个接头连接。

5.一种嵌合抗原受体，其包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述胞外结构域包含与DLL3特异性结合的DLL3抗原结合结构域，并且其中所述抗原结合结构域包含：

(a)可变重链，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:7、16、25、34、43、52、61、70、79、88、97、106、115、124、133、142、151、160、169、178、187、196、205、214、223、232、241、250、259、268、277、286、295、304、313、322、331、340、349、358、367、376、385、394、403、412、421、430、439、448、457和466；以及

(b)可变轻链，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ NO:8、17、26、35、44、53、62、71、80、89、98、107、116、125、134、143、152、161、170、179、188、197、206、215、224、233、242、251、260、269、278、287、296、305、314、323、332、341、350、359、368、377、386、395、404、413、422、431、440、449、458和467，

其中所述可变重链和所述可变轻链通过至少一个接头连接。

6.一种嵌合抗原受体，其包含胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其中所述胞外结构域包含与DLL3特异性结合的DLL3抗原结合结构域，并且其中所述抗原结合结构域包含选自由表1d中列出的那些scFv组成的组的序列。

7.一种与DLL3特异性结合的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:482至533和SEQ ID NO:632-683中的任一个具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内结构域包含至少一个共刺激结构域。

9.根据权利要求8所述的嵌合抗原受体，其中所述共刺激结构域是以下物质的信号传导区：CD28、OX-40、4-1BB/CD137、CD2、CD7、CD27、CD30、CD40、程序性死亡因子-1(PD-1)、诱导型T细胞共刺激因子(ICOS)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1(CD1 1a/CD18)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD247、CD276(B7-H3)、LIGHT、(TNFSF14)、NKG2C、Igα(CD79a)、DAP-10、Fcγ受体、I类MHC分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、ICAM-1、B7-H3、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α.、CD8β、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD1 1d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD1 1a、LFA-1、ITGAM、CD1 1b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAMI(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRT AM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、与CD83特异性结合的配体，或其任何组合。

10.根据权利要求9所述的嵌合抗原受体，其中所述共刺激结构域包含4-1BB/CD137的信号传导区。

11.根据权利要求10所述的嵌合抗原受体，其中所述4-1BB/CD137共刺激结构域包含SEQ ID NO:480或其片段。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内结构域包含至少一个激活结构域。

13.根据权利要求12所述的嵌合抗原受体，其中所述激活结构域包含CD3。

14.根据权利要求13所述的嵌合抗原受体，其中所述CD3包含CD3ζ。

15.根据权利要求14所述的嵌合抗原受体，其中所述CD3ζ包含SEQ ID NO:481或其片段。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体由SEQID NO:570-621和631中任一个的多核苷酸序列编码。

17.根据权利要求1至16中任一项所述的嵌合抗原受体，其还包含安全开关。

18.根据权利要求17所述的嵌合抗原受体，其中所述安全开关包含CD20模拟表位或QBEND-10表位。

19.根据权利要求18所述的嵌合抗原受体，其中所述安全开关包含一个或多个CD20模拟表位或一个或多个QBEND-10表位，或其组合。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含一个或多个呈QR3、SR2、RSR或R2S形式的安全开关。

21.根据权利要求17至20中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含与SEQ ID NO:622-628、474-476、565和684-694中任一个具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

22.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1至21所述的嵌合抗原受体中的任一种。

23.一种载体，其包含权利要求22所述的多核苷酸。

24.根据权利要求23所述的载体，其中所述载体是逆转录病毒载体、DNA载体、质粒、RNA载体、腺病毒载体、腺病毒相关载体、慢病毒载体或其任何组合。

25.一种工程化的免疫细胞，其表达权利要求1至21所述的嵌合抗原受体中的任一种。

26.一种工程化的免疫细胞，其表达权利要求22所述的多核苷酸或者权利要求23或24所述的载体。

27.根据权利要求25或26所述的工程化的免疫细胞，其中所述免疫细胞是T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、NK细胞、表达TCR的细胞、树突状细胞或NK-T细胞。

28.根据权利要求27所述的工程化的免疫细胞，其中所述细胞是自体T细胞。

29.根据权利要求27所述的工程化的免疫细胞，其中所述细胞是同种异体T细胞。

30.一种药物组合物，其包含权利要求25至29中任一项所述的工程化的免疫细胞。

31.一种治疗有需要的受试者中的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求25至29中任一项所述的工程化的免疫细胞或权利要求30所述的药物组合物。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。

33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述疾病或病症是小细胞肺癌。

34.一种制品，其包含权利要求26至325至29中任一项所述的工程化的免疫细胞或权利要求30所述的药物组合物。

35.一种抗DLL3结合剂，其包含：

(a)可变重链CDR1，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO 1、10、19、28、37、46、55、64、73、82、91、100、109、118、127、136、145、154、163、172、181、190、199、208、217、226、235、244、253、262、271、280、289、298、307、316、325、334、343、352、361、370、379、388、397、406、415、424、433、442、451和460；

(b)可变重链CDR2，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ NO:2、11、20、38、47、56、65、74、83、92、101、110、119、128、137、146、155、164、173、182、191、200、209、218、227、236、245、254、263、272、281、290、299、308、317、326、335、344、353、362、371、380、389、398、407、416、425、434、443、452、461和695；

(c)可变重链CDR3，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO 3、12、21、30、39、48、57、66、75、84、93、102、111、120、129、138、147、156、165、174、183、192、201、210、219、228、237、246、255、264、273、282、291、300、309、318、327、336、345、354、363、372、381、390、399、408、417、426、435、444、453和462；

(d)可变轻链CDR1，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:4、13、22、31、40、49、58、67、85、94、103、112、121、130、139、148、157、166、175、184、193、202、211、220、229、238、247、256、265、274、283、292、301、310、319、328、337、346、355、364、373、382、391、400、409、418、427、436、445、454、463和696；

(e)可变轻链CDR2，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:5、14、23、32、41、50、59、68、77、86、95、104、113、122、131、140、149、158、167、176、185、194、203、212、221、230、239、248、257、266、275、284、293、302、311、320、329、338、347、356、365、374、383、392、401、410、419、428、437、446、455和464；以及

(f)可变轻链CDR3，其包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:6、15、24、33、42、51、60、69、78、87、96、105、114、123、132、141、150、159、168、177、186、195、204、213、222、231、240、249、258、267、276、285、294、303、312、321、330、339、348、357、366、375、384、393、402、411、420、429、438、447、456和465。

36.根据权利要求35所述的DLL3结合剂，其中所述结合剂是抗体、抗体缀合物或其抗原结合片段，任选地，F(ab')₂片段、Fab'片段、Fab片段、Fv片段、scFv片段、dsFv片段或dAb片段。

37.根据权利要求36所述的抗DLL3结合剂，其中所述结合剂是包含IgG恒定区的单克隆抗体。

38.根据权利要求35至37中任一项所述的抗DLL3结合剂，其包含与表1b中提供的可变重链(VH)序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的VH序列。

39.根据权利要求35至38中任一项所述的抗DLL3结合剂，其包含与表1c中提供的可变轻链(VL)序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的VL序列。

40.根据权利要求35至39中任一项所述的抗DLL3结合剂，其中所述结合剂包含与表1d中列出的scFv序列具有至少约80％、85％、90％、95％、96％、98％、99％或100％同一性的序列。

41.根据权利要求35至40中任一项所述的抗DLL3结合剂，其中所述结合剂是包含与Fc恒定区融合的scFv片段的融合蛋白。

42.一种药物组合物，其包含权利要求35至41中任一项所述的抗DLL3结合剂和药学上可接受的赋形剂。

43.一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求35至41中任一项所述的抗DLL3结合剂或权利要求42所述的药物组合物。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述疾病或病症是癌症。

45.根据权利要求43或44所述的方法，其中所述疾病或病症是小细胞肺癌。

Images