CN113528684A - 用于鉴别革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的数字pcr检测试剂盒和应用 - Google Patents
用于鉴别革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的数字pcr检测试剂盒和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于鉴别革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的数字PCR检测试剂盒和应用，本发明的一种用于鉴别革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的数字PCR检测试剂盒，包括F/R引物、探针和标准阳性模板，所述的F/R引物为BAC‑F上游引物和BAC‑R下游引物；所述的探针为BAC‑P探针、G‑P探针和G+P探针；本发明保护细菌通用检测、革兰氏阴性菌检测以及革兰氏阳性菌检测的引物探针序列。本发明保护扩增子内部区分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的检测方案。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于鉴别革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的数字PCR检测试剂盒和应用。
背景技术
革兰氏阴性菌泛指革兰氏染色反应呈红色的细菌。在革兰氏染色实验中，首先添加了龙胆紫(crystal violet)，进行初染，然后添加碘液复染。第一步染色完成后，革兰氏阳性菌和阴性菌均被染为紫色。这时进行洗色(洗色的时间至关重要，是染色的关键，大约20～30秒)，只有革兰氏阴性菌会被洗去颜色变为无色，而阳性菌仍为紫色。再添入另一种复染染料(通常使用番红(safranin)或品红(fuchsine))，从而将所有的革兰氏阴性菌染成红色或粉色，而阳性菌仍为紫色。通过这种测试我们可以区分这两种细胞壁结构不同的细菌。
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌是利用革兰氏染色法来鉴别的两大类细菌。大多数化脓性球菌都属于革兰氏阳性菌，它们能产生外毒素使人致病，而大多数肠道菌多属于革兰氏阴性菌，它们产生内毒素，靠内毒素使人致病。
使用革兰氏染色时经常发现某些革兰氏阳性菌会褪色；某些革兰氏阴性菌会由于菌龄或培养基的不同而染色反应不准确。
目前，缺乏一种检测灵敏度高的用于鉴别革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的数字PCR检测试剂盒和应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供了一种检测灵敏度高的用于鉴别革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的数字PCR检测试剂盒和应用。
为了实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：本发明的一种用于鉴别革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的数字PCR检测试剂盒，包括F/R引物、探针和标准阳性模板，所述的F/R引物为BAC-F上游引物和BAC-R下游引物；所述的探针为BAC-P探针、G-P探针和G+P探针；
所述的BAC-F上游引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列：GGTCTTAGTGATCCGGTGGTTC
所述的BAC-R下游引物具有SEQ ID No.2的核苷酸序列：CCTACTTCAGCCCCAGGATG
所述的BAC-P探针具有SEQ ID No.3的核苷酸序列：ATGGAAGGGCCATCGCTCAACG
所述的G-P探针具有SEQ ID No.4的核苷酸序列：ATCGACGGGGAGGTTTGGCACC
所述的G+P探针具有SEQ ID No.5的核苷酸序列：ATCGACGGCGGTGTTTGGCAC
本发明所述的用于鉴别革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的数字PCR检测试剂盒在检测中的应用。
本发明具有如下优点：本发明保护细菌通用检测、革兰氏阴性菌检测以及革兰氏阳性菌检测的引物探针序列。本发明保护扩增子内部区分革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的检测方案。
附图说明
图1为本发明的技术原理图；F/R：细菌通用上下游引物，FAM探针：细菌通用探针；CY5探针：革兰氏阴性菌通用探针；ROX探针：革兰氏阳性菌通用探针。
图2为本发明的革兰氏阴性菌FAM通道和ROX通道散点示意图；
图3为本发明的革兰氏阴性菌FAM通道和CY5通道散点示意图；
图4为本发明的革兰氏阳性菌FAM通道和ROX通道散点示意图；
图5为本发明的革兰氏阳性菌FAM通道和CY5通道散点示意图。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
如图1所述，
1引物探针设计
1.1依据细菌23S基因序列，设计一对细菌通用引物和一条细菌通用探针，以及一条革兰氏阴性菌特异性探针和革兰氏阳性菌特异性探针。具体信息如下：
表1
1.2样品
菌DNA样品：外购灭活菌，磁珠法提取基因组DNA。
2数字PCR扩增体系
2.1 50XBAC引物探针混合液
表2
| 组分 | 储存液(μM) | 体积(μL/人份) |
| 水 | / | 0.1125 |
| BAC-F | 400 | 0.0375 |
| BAC-R | 400 | 0.0375 |
| BAC-P | 100 | 0.0375 |
| G+P | 100 | 0.0375 |
| G-P | 100 | 0.0375 |
| 合计 | / | 0.3 |
2.2 ddPCR反应体系
表3
| 试剂 | 体积(μL) | 终浓度 |
| 水 | 10.4 | |
| 5XddPCR Mix | 3 | 1X |
| VIC染料 | 0.3 | 1X |
| 50XBAC | 0.3 | 1X |
| DNA | 1 | |
| 合计 | 15 |
3扩增程序
98℃5min【98℃15s，60℃1min】*40
4结果
表4
5结论
5.1由于内源性因素的影响，空白对照NTC会出现少量假阳性。但G-菌和G+菌的检测值都高于空白对照。
5.2在高于空白对照的情况下，本体系能够检测到细菌DNA，同时对区分细菌是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌；进一步地通过计算比值，可以计算出样品中的革兰氏阴性菌DNA或阳性菌DNA在细菌DNA中的占比。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
序列表
<110> 领航基因科技（杭州）有限公司
<120> 用于鉴别革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的数字PCR检测试剂盒和应用
<130> 2021
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(BAC-F上游引物)
<400> 1
ggtcttagtg atccggtggt tc 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(BAC-R下游引物)
<400> 2
cctacttcag ccccaggatg 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(BAC-P探针)
<400> 3
atggaagggc catcgctcaa cg 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(ROX-BHQ2 探针)
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atcgacgggg aggtttggca cc 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(CY5-BHQ2探针)
<400> 5
atcgacggcg gtgtttggca c 21
Claims (2)
1.一种用于鉴别革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的数字PCR检测试剂盒，包括F/R引物、探针和标准阳性模板，其特征在于：所述的F/R引物为BAC-F上游引物和BAC-R下游引物；所述的探针为FAM探针、CY5探针和ROX探针；
所述的BAC-F上游引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；
所述的BAC-R下游引物具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；
所述的BAC-P探针具有SEQ ID No.3的核苷酸序列；
所述的G-P探针具有SEQ ID No.4的核苷酸序列；
所述的G+P探针具有SEQ ID No.5的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的用于鉴别革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的数字PCR检测试剂盒在检测中的应用。
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