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CN113384551B - 一种减少肿瘤内过量钙离子的仿生纳米载体的制备方法和应用 - Google Patents

一种减少肿瘤内过量钙离子的仿生纳米载体的制备方法和应用 Download PDF

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CN113384551B CN202110497148.0A CN202110497148A CN113384551B CN 113384551 B CN113384551 B CN 113384551B CN 202110497148 A CN202110497148 A CN 202110497148A CN 113384551 B CN113384551 B CN 113384551B
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Abstract

一种减少肿瘤内过量钙离子的仿生纳米载体及制备方法和应用，将三乙胺和单溴聚乙二醇的混合溶液加入到修饰有钙离子捕获剂的金纳米粒子溶液中，搅拌下反应1～3天，透析，得到钙离子捕获剂被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液；将1‑(3‑二甲基氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺和肿瘤靶向剂的混合溶液加入到钙离子捕获剂被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液中，搅拌下反应1～3天，透析，得到具有靶向肿瘤功能的钙离子捕获仿生纳米粒子溶液。本发明制备的仿生纳米粒子生物相容性好，安全无毒，稳定性优异，适用于医学领域中，其中所用到的钙离子捕获剂和肿瘤靶向剂的选择范围广，修饰方法简单。

Description

一种减少肿瘤内过量钙离子的仿生纳米载体的制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及纳米材料技术与生物医用材料领域，具体涉及一种减少肿瘤内过量钙离子的仿生纳米载体的制备方法和应用。
背景技术
癌症是威胁人类健康的最恶性疾病之一，由于致瘤的细胞内和细胞外微环境是肿瘤生长的温床，因此肿瘤难以治愈。针对这些肿瘤特异性微环境的调控，有利于肿瘤的高效精准治疗。
在这些致瘤微环境中，过度表达的跨膜钙离子通道蛋白和高度活跃的钙离子相关蛋白会导致的肿瘤细胞中钙离子浓度异常增高，这会增强细胞的浸润性以及摄取外界营养的能力，有助于肿瘤的恶性增殖。在相关治疗方面，纳米载药系统的引入可以避免直接加入钙信号通路阻滞剂引起的弊端，但由于肾脏和肝脏对纳米载体的非特异性吸收以及在肿瘤内的纳米粒子滞留性差等特点，它们的临床表现仍然不太成功。
为了提高治疗效果，已经开发了将钙离子调节与其他疗法(例如化学疗法)相结合的策略。然而，仍然无法避免由这些有毒抗肿瘤药剂在其他器官积累，导致对健康组织造成损害。此外，钙信号通路阻滞剂——小干扰RNA会对钙信号通路进行非选择性持续抑制，这可能会对健康细胞功能造成紊乱，产生各种意想不到的临床效果。因此，开发一种在健康组织中无活性且无害而仅在肿瘤组织内实现钙离子调节功能和协同治疗效果的智能纳米材料非常重要，从而有望实现高效的肿瘤治疗效果，同时几乎不会对正常组织和器官产生损伤和影响。相比，基于肿瘤微环境依赖性钙离子捕获剂的解决方案将对肿瘤治疗问题更有针对性。
发明内容
为抗肿瘤药和钙信号通路阻滞剂无法精准调控作用位置的缺点，本发明的目的在于提供一种减少肿瘤内过量钙离子的仿生纳米载体及制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种减少肿瘤内过量钙离子的仿生纳米粒子的制备方法，包括以下步骤：
1)向氢氧化钠和钙离子捕获剂的混合溶液中加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液，得到混合物，然后将混合物的pH值调节至5.0～6.0后添加至修饰氨基的金纳米粒子溶液中，在室温下反应8～24小时，透析，得到修饰有钙离子捕获剂的金纳米粒子溶液；
2)将三乙胺和单溴聚乙二醇的混合溶液加入到修饰有钙离子捕获剂的金纳米粒子溶液中，搅拌下反应1～3天，透析，得到钙离子捕获剂被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液；
3)将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和肿瘤靶向剂的混合溶液加入到钙离子捕获剂被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液中，搅拌下反应1～3天，透析，得到具有靶向肿瘤功能的钙离子捕获仿生纳米粒子溶液。
本发明进一步的改进在于，步骤1)中，氢氧化钠和钙离子捕获剂的混合溶液中氢氧化钠浓度为0.075mol/L，钙离子捕获剂浓度为0.025mol/L；
1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺浓度为0.05mol/L，N-羟基琥珀酰亚胺浓度为0.025mol/L；
氢氧化钠和钙离子捕获剂的混合溶液、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合溶液与修饰氨基的金纳米粒子溶液的体积比为1：1：60～1：1：120。
本发明进一步的改进在于，步骤1)中，钙离子捕获剂为乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸或1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸四(乙酰氧基甲酯)。
本发明进一步的改进在于，步骤1)中，修饰氨基的金纳米粒子溶液通过以下过程制得：将0.025mol/L的巯基乙胺溶液添加至金纳米粒子溶液中，反应2～6小时，透析，得到修饰氨基的金纳米粒子溶液；其中，巯基乙胺溶液和金纳米粒子溶液的体积比为1：60～1：120。
本发明进一步的改进在于，金纳米粒子溶液通过以下过程制得：将0.01mol/L的氯金酸溶液添加到超纯水中，加热至沸腾后，加入0.01mol/L的柠檬酸钠溶液，继续加热至沸腾，在沸腾状态下反应10～120分钟，得到金纳米粒子溶液；其中，氯金酸溶液、超纯水和柠檬酸钠溶液的体积比为1：20：2～1：40：2。
本发明进一步的改进在于，步骤2)中，三乙胺和单溴聚乙二醇的混合溶液中三乙胺浓度为0.01mol/L，单溴聚乙二醇浓度为0.075mol/L；
三乙胺、单溴聚乙二醇与修饰钙离子捕获剂的金纳米粒子溶液的体积比为1：1：60～1：1：120。
本发明进一步的改进在于，步骤2)中，单溴聚乙二醇的分子量是1000～6000。
本发明进一步的改进在于，步骤3)中，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和肿瘤靶向剂的混合溶液中1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺浓度为0.02mol/L，N-羟基琥珀酰亚胺浓度为0.01mol/L，肿瘤靶向剂浓度为0.01mol/L；
1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和肿瘤靶向剂的混合溶液与钙离子捕获剂被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液的体积比为1：60～1：120；
肿瘤靶向剂是叶酸或透明质酸；
步骤1)、2)与3)中的透析时间均为12～36小时。
一种根据上述方法制备的减少肿瘤内过量钙离子的仿生纳米粒子，该仿生纳米粒子粒度小于等于10nm，具有酯酶响应的钙离子捕获能力。
一种根据权利上述方法制备的减少肿瘤内过量钙离子的仿生纳米粒子在制备用于抗肿瘤药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
本发明制备方法简单，反应条件温和，没有高温高压的操作条件，并且在制备过程中不产生有机废液，是一种绿色环保的制备方法。
进一步的，本发明中三乙胺和单溴聚乙二醇的混合溶液中三乙胺浓度为0.01mol/L，单溴聚乙二醇浓度为0.075mol/L；三乙胺、单溴聚乙二醇与修饰钙离子捕获剂的金纳米粒子溶液的体积比为1：1：60～1：1：120。只有在上述的钙离子捕获剂和单溴聚乙二醇比例下，使得在仿生纳米粒子中，通过酯键将钙离子捕获剂的羧基用聚乙二醇的羟基保护起来并失去钙离子捕获能力。只有在肿瘤环境的高酯酶条件下，酯键断裂恢复钙离子捕获的活性，捕获肿瘤细胞内过量的钙离子实现治疗效果。
首先本发明制备的仿生纳米粒子具有肿瘤靶向剂，引导仿生纳米粒子聚集在肿瘤细胞周围并被更多的内吞；其次，该纳米粒子只能在肿瘤环境下，实现钙离子捕获功能，从而起到肿瘤治疗效果。这种双重靶向性大大降低对肿瘤细胞周围正常细胞的毒副作用，有效解决了传统化疗对正常细胞也有杀伤作用的弊病，同时具有优异的肿瘤靶向性，也大大提升了肿瘤的治疗效果。本发明制备的仿生纳米粒子，能够通过钙离子捕获剂降低细胞内钙离子的浓度，主要是通过钙离子捕获剂的羧基与钙离子形成稳定络合物，同时相比于与其他离子形成的络合物更稳定即会优先捕获钙离子。本发明制备的仿生纳米粒子是通过降低肿瘤细胞内浓度异常高的钙离子浓度这个途径实现肿瘤治疗的。钙离子作为细胞内多功能的动态信号传递式，体内微量的离子浓度可以控制细胞的各种功能的发生或抑制。而在肿瘤细胞内具有比正常细胞较高的钙离子浓度，这促进肿瘤细胞增殖分化和迁移、肿瘤周围运送营养物质的血管生成，也是肿瘤能进行无限增殖的必要需求。本发明从改变肿瘤致瘤环境也即是促进肿瘤恶性增长的微环境入手，对化疗药物产生耐药性的肿瘤(耐药性乳腺癌、耐药性前列腺癌等)有着更加出色的治疗效果，避开了传统化疗药物通过引发细胞凋亡的途径。
附图说明
图1是以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子(AEP NPs)的透射电镜图。
图2是以叶酸-聚乙二醇(分子量为2000)为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子(AEPF NPs)的透射电镜图。
图3是酯酶处理后AEPF NPs加入氯化钙溶液的透射电镜图。
图4是酯酶处理后AEPF NPs加入氯化钙溶液的聚集体的元素面扫射图。其中，(a)为，merge，(b)为Au元素，(c)为N元素，(d)为Ca元素。
图5是分别用酯酶处理和无酯酶处理后的AEPF NPs加入氯化钙溶液的离子色谱分析结果图。
图6是酯酶处理后AEPF NPs加入氯化钙、氯化镁、氯化钠和氯化钾的混合溶液的离子色谱分析结果图。
图7是AuNPs和AEPF NPs分别和人结肠癌细胞(LoVo细胞)和正常结肠上皮细胞(NCM460细胞)共培养后细胞内钙离子浓度。
图8是FITC标记的AEPF NPs和FITC标记的AuNPs分别和LoVo细胞共培养后的荧光显微镜图像。
图9是不同组PBS、AEPF NPs、AEP NPs和AuNPs的小鼠肿瘤组织照片。
图10是不同组PBS、AEPF NPs、AEP NPs和AuNPs的小鼠肿瘤体积变化曲线。
图11是不同组PBS、AEPF NPs、AEP NPs和AuNPs的小鼠肿瘤组织用活死细胞标记物苏木精-伊红(H&E)和增殖周期中的细胞标记物Ki67免疫组织化学染色图。。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
本发明提供的一种简单的减少肿瘤内过量钙离子的仿生纳米载体的制备方法，壳的部分作为钙离子捕获剂，减少肿瘤细胞内浓度，改变致瘤环境实现制肿瘤治疗。本发明通过简单的水热反应制备了金纳米粒子，后续通过简单的酰胺化和酯化反应修饰上钙离子捕获剂作为内壳和肿瘤靶向剂-聚乙二醇作为最外层保护冠，得到调节钙离子肿瘤治疗的仿生纳米粒子。基于金纳米粒子的简单表面功能化，实现最佳治疗效果。
本发明提供一种减少肿瘤内过量钙离子的仿生纳米载体，该仿生纳米粒子具有核-壳-冠结构，通过降低肿瘤细胞内的钙离子，抑制肿瘤血管生成和肿瘤线粒体功能障碍来提供选择性和有效的肿瘤治疗。这种仿生纳米载体的核心由金纳米粒子组成，外层接枝有EGTA钙离子捕获壳，并将带肿瘤靶向剂叶酸的聚乙二醇作为保护冠修饰在捕获壳的外面。保护冠在肿瘤细胞独有的高酯酶浓度环境下脱落，裸露出能够选择性捕获钙离子的钙离子捕获壳，可以针对性的降低肿瘤细胞内的钙离子浓度，减少对正常细胞的影响。最外层的肿瘤靶向剂-聚乙二醇冠赋予了纳米粒子肿瘤靶向特性和刺激响应性，延长在体内的循环时间，从而进行精确治疗。该粒子具有酯酶响应的钙离子捕获能力以及主动靶向肿瘤功能。
本发明的减少肿瘤内过量钙离子的仿生纳米载体在制备用于治疗抗肿瘤药物中的应用。
抗肿瘤药物为用于治疗耐药性乳腺癌或耐药性前列腺癌的药物。
本发明的减少肿瘤内过量钙离子的仿生纳米粒子的制备方法包括以下步骤，但不限于以下步骤：
(1)首先是利用氯金酸溶液并添加还原剂通过简单的水热法制备出金纳米粒子作为仿生纳米载体的核；具体过程如下：将0.01mol/L的氯金酸溶液添加到超纯水中，加热至沸腾。之后，将0.01mol/L的柠檬酸钠溶液添加至沸腾的混合溶液。继续加热，在沸腾状态下反应10～120分钟，溶液变浅红色，得到金纳米粒子溶液；
所述的氯金酸溶液、超纯水和柠檬酸钠溶液的体积比为1：20：2～1：40：2。
(2)对金纳米粒子核通过金-巯键和酰胺化反应修饰钙离子捕获壳层，得到具有钙离子捕获能力的仿生纳米粒子。然后通过酯化反应修饰上聚乙二醇保护冠，得到肿瘤部位特定捕获钙离子的仿生纳米粒子；具体过程如下：将巯基乙胺溶液(0.025mol/L)缓慢地添加至金纳米粒子(AuNPs)溶液中，反应2～6小时，结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析，得到修饰氨基的金纳米粒子溶液。
其中，所述的巯基乙胺溶液和金纳米粒子溶液的体积比为1：60～1：120。
在氢氧化钠和钙离子捕获剂的混合溶液(混合溶液中氢氧化钠浓度为0.075mol/L，钙离子捕获剂浓度为0.025mol/L)中加入EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)的混合溶液(混合溶液中EDC浓度为0.05mol/L，NHS浓度为0.025mol/L)，得到混合物，然后将混合物的pH值调节至5.0～6.0后添加至修饰氨基的金纳米粒子溶液中，在室温下反应8～24小时，结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析，得到修饰有钙离子捕获剂的金纳米粒子溶液。
其中，所述的氢氧化钠和钙离子捕获剂的混合溶液、EDC和NHS混合溶液与修饰氨基的金纳米粒子溶液的体积比为1：1：60～1：1：120。
所述的钙离子捕获剂是乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)或1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸四(乙酰氧基甲酯)(BAPTA-AM)。
将三乙胺和单溴聚乙二醇(HO-PEG-Br)的混合溶液(三乙胺浓度为0.01mol/L，HO-PEG-Br浓度为0.075mol/L)加入到修饰有钙离子捕获剂的金纳米粒子溶液中，在室温下搅拌反应1～3天，结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析，得到钙离子捕获剂被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液。
所述的HO-PEG-Br的分子量是1000～6000。
所述的三乙胺与HO-PEG-Br的混合溶液与修饰钙离子捕获剂的金纳米粒子溶液的体积比为1：60～1：120。
所述的所有的透析时间为12～36小时。
(3)在聚乙二醇的外侧修饰具有肿瘤靶向性的分子，制备最终具有靶向肿瘤功能的钙离子捕获仿生纳米粒子，具体过程如下：将EDC、NHS和肿瘤靶向剂的混合溶液(EDC浓度为0.02mol/L，NHS浓度为0.01mol/L，肿瘤靶向剂浓度为0.01mol/L)加入到钙离子捕获剂被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液中，在室温下搅拌反应1～3天，结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析，得到具有靶向肿瘤功能的钙离子捕获仿生纳米粒子溶液。
所述的肿瘤靶向剂是叶酸或透明质酸。
所述的EDC、NHS和肿瘤靶向剂的混合溶液与钙离子捕获剂被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液的体积比为1：60～1：120。
所述的透析时间为12～36小时。
下面为具体实施例。
实施例1
以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子(AEP NPs)的制备：
(1)将376mg的三水合氯金酸溶于100mL的超纯水中得到氯金酸溶液(0.01mol/L)。将258mg的柠檬酸钠溶于100mL的超纯水中得到柠檬酸钠溶液(0.01mol/L)。取15mL的上述氯金酸溶液添加到510mL的超纯水中，加热至沸腾。之后，取30mL的上述柠檬酸钠溶液(0.01mol/L)添加至沸腾的混合溶液。继续加热在沸腾状态下反应10分钟，溶液变成浅红色，停止加热得到金纳米粒子(AuNPs)溶液；
(2)将192.8mg的巯基乙胺溶于100mL的超纯水得到巯基乙胺溶液(0.025mol/L)。取5mL的巯基乙胺溶液缓慢地添加至500mL金纳米粒子溶液中。反应4小时，结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到修饰氨基的金纳米粒子溶液。
将300mg的氢氧化钠和950mg的EGTA溶解到100mL的超纯水中得到氢氧化钠和EGTA的混合溶液(氢氧化钠浓度为0.075mol/L，EGTA浓度为0.025mol/L)。将955mg的EDC和287.5mg的NHS溶解到100mL的超纯水中得到EDC和NHS的混合溶液(EDC浓度为0.05mol/L，NHS浓度为0.025mol/L)。取5mL的氢氧化钠和EGTA混合溶液与5mL的EDC和NHS混合溶液混合，并调节pH值至5.0后添加至500mL的修饰氨基的金纳米粒子溶液中。在室温下反应12小时。结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到修饰有EGTA的金纳米粒子溶液。
将101mg的三乙胺和15g的分子量为2000的单溴聚乙二醇(HO-PEG-Br)溶解到100mL的超纯水中得到三乙胺和分子量为2000的单溴聚乙二醇混合溶液(三乙胺浓度为0.01mol/L，HO-PEG-Br浓度为0.075mol/L)。取5mL的上述混合溶液添加至500mL的修饰EGTA的金纳米粒子溶液中，在室温下搅拌反应2天，结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到EGTA被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液。该纳米粒子透射电镜图如图1所示，粒子为圆球形粒径约为10nm。
实施例2
以叶酸-聚乙二醇(分子量为2000)为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子(AEPF NPs)的制备：
(1)将376mg的三水合氯金酸溶于100mL的超纯水中得到氯金酸溶液(0.01mol/L)。将258mg的柠檬酸钠溶于100mL的超纯水中得到柠檬酸钠溶液(0.01mol/L)。取15mL的上述氯金酸溶液添加到510mL的超纯水中，加热至沸腾。之后，取30mL的上述柠檬酸钠溶液(0.01mol/L)添加至沸腾的混合溶液。继续加热在沸腾状态下反应10分钟，溶液变成浅红色，停止加热得到金纳米粒子(AuNPs)溶液；
(2)将192.8mg的巯基乙胺溶于100mL的超纯水得到巯基乙胺溶液(0.025mol/L)。取5mL的巯基乙胺溶液缓慢地添加至500mL金纳米粒子溶液中。反应4小时，结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到修饰氨基的金纳米粒子溶液。
将300mg的氢氧化钠和950mg的EGTA溶解到100mL的超纯水中得到氢氧化钠和EGTA的混合溶液(氢氧化钠浓度为0.075mol/L，EGTA浓度为0.025mol/L)。将955mg的EDC和287.5mg的NHS溶解到100mL的超纯水中得到EDC和NHS的混合溶液(EDC浓度为0.05mol/L，NHS浓度为0.025mol/L)。取5mL的氢氧化钠和EGTA混合溶液与5mL的EDC和NHS混合溶液混合，并调节pH值至5.0后添加至500mL的修饰氨基的金纳米粒子溶液中。在室温下反应12小时。结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到修饰有EGTA的金纳米粒子溶液。
将101mg的三乙胺和15g的分子量为2000的单溴聚乙二醇(HO-PEG-Br)溶解到100mL的超纯水中得到三乙胺和分子量为2000的单溴聚乙二醇混合溶液(三乙胺浓度为0.01mol/L，HO-PEG-Br浓度为0.075mol/L)。取5mL的上述混合溶液添加至500mL的修饰EGTA的金纳米粒子溶液中，在室温下搅拌反应2天，结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到EGTA被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液。
(3)将382mg的EDC、101mg的NHS和441mg的叶酸溶解到100mL的超纯水中得到EDC、NHS和叶酸的混合溶液(EDC浓度为0.02mol/L，NHS浓度为0.01mol/L，叶酸浓度为0.01mol/L)。将5mL的EDC、NHS和叶酸混合溶液加入到500mL的EGTA被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液中，在室温下搅拌反应2天。结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到以叶酸-聚乙二醇(分子量为2000)为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子溶液。该纳米粒子透射电镜图如图2所示，粒子为圆球形粒径约为10nm。
实施例3
以叶酸-聚乙二醇(分子量为2000)为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子的制备：
(1)将376mg的三水合氯金酸溶于100mL的超纯水中得到氯金酸溶液(0.01mol/L)。将258mg的柠檬酸钠溶于100mL的超纯水中得到柠檬酸钠溶液(0.01mol/L)。取15mL的上述氯金酸溶液添加到510mL的超纯水中，加热至沸腾。之后，取30mL的上述柠檬酸钠溶液(0.01mol/L)添加至沸腾的混合溶液。继续加热在沸腾状态下反应30分钟，溶液变成浅红色，停止加热得到金纳米粒子(AuNPs)溶液；
(2)将192.8mg的巯基乙胺溶于100mL的超纯水得到巯基乙胺溶液(0.025mol/L)。取5mL的巯基乙胺溶液缓慢地添加至500mL金纳米粒子溶液中。反应4小时，结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到修饰氨基的金纳米粒子溶液。
将300mg的氢氧化钠和950mg的EGTA溶解到100mL的超纯水中得到氢氧化钠和EGTA的混合溶液(氢氧化钠浓度为0.075mol/L，EGTA浓度为0.025mol/L)。将955mg的EDC和287.5mg的NHS溶解到100mL的超纯水中得到EDC和NHS的混合溶液(EDC浓度为0.05mol/L，NHS浓度为0.025mol/L)。取5mL的氢氧化钠和EGTA混合溶液与5mL的EDC和NHS混合溶液混合，并调节pH值至5.0后添加至500mL的修饰氨基的金纳米粒子溶液中。在室温下反应12小时。结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到修饰有EGTA的金纳米粒子溶液。
将101mg的三乙胺和15g的分子量为2000的单溴聚乙二醇(HO-PEG-Br)溶解到100mL的超纯水中得到三乙胺和分子量为2000的单溴聚乙二醇混合溶液(三乙胺浓度为0.01mol/L，HO-PEG-Br浓度为0.075mol/L)。取5mL的上述混合溶液添加至500mL的修饰EGTA的金纳米粒子溶液中，在室温下搅拌反应2天，结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到EGTA被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液。
(3)将382mg的EDC、101mg的NHS和441mg的叶酸溶解到100mL的超纯水中得到EDC、NHS和叶酸的混合溶液(EDC浓度为0.02mol/L，NHS浓度为0.01mol/L，叶酸浓度为0.01mol/L)。将5mL的EDC、NHS和叶酸混合溶液加入到500mL的EGTA被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液中，在室温下搅拌反应2天。结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到以叶酸-聚乙二醇(分子量为2000)为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子溶液。
实施例4
以叶酸-聚乙二醇(分子量为2000)为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子的制备：
(1)将376mg的三水合氯金酸溶于100mL的超纯水中得到氯金酸溶液(0.01mol/L)。将258mg的柠檬酸钠溶于100mL的超纯水中得到柠檬酸钠溶液(0.01mol/L)。取15mL的上述氯金酸溶液添加到510mL的超纯水中，加热至沸腾。之后，取30mL的上述柠檬酸钠溶液(0.01mol/L)添加至沸腾的混合溶液。继续加热在沸腾状态下反应10分钟，溶液变成浅红色，停止加热得到金纳米粒子(AuNPs)溶液；
(2)将192.8mg的巯基乙胺溶于100mL的超纯水得到巯基乙胺溶液(0.025mol/L)。取5mL的巯基乙胺溶液缓慢地添加至500mL金纳米粒子溶液中。反应4小时，结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到修饰氨基的金纳米粒子溶液。
将300mg的氢氧化钠和950mg的EGTA溶解到100mL的超纯水中得到氢氧化钠和EGTA的混合溶液(氢氧化钠浓度为0.075mol/L，EGTA浓度为0.025mol/L)。将955mg的EDC和287.5mg的NHS溶解到100mL的超纯水中得到EDC和NHS的混合溶液(EDC浓度为0.05mol/L，NHS浓度为0.025mol/L)。取5mL的氢氧化钠和EGTA混合溶液与5mL的EDC和NHS混合溶液混合，并调节pH值至6.0后添加至500mL的修饰氨基的金纳米粒子溶液中。在室温下反应12小时。结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到修饰有EGTA的金纳米粒子溶液。
将101mg的三乙胺和15g的分子量为2000的单溴聚乙二醇(HO-PEG-Br)溶解到100mL的超纯水中得到三乙胺和分子量为2000的单溴聚乙二醇混合溶液(三乙胺浓度为0.01mol/L，HO-PEG-Br浓度为0.075mol/L)。取5mL的上述混合溶液添加至500mL的修饰EGTA的金纳米粒子溶液中，在室温下搅拌反应2天，结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到EGTA被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液。
(3)将382mg的EDC、101mg的NHS和441mg的叶酸溶解到100mL的超纯水中得到EDC、NHS和叶酸的混合溶液(EDC浓度为0.02mol/L，NHS浓度为0.01mol/L，叶酸浓度为0.01mol/L)。将5mL的EDC、NHS和叶酸混合溶液加入到500mL的EGTA被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液中，在室温下搅拌反应2天。结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到以叶酸-聚乙二醇(分子量为2000)为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子溶液。
实施例5
以叶酸-聚乙二醇(分子量为2000)为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子的制备：
(1)将376mg的三水合氯金酸溶于100mL的超纯水中得到氯金酸溶液(0.01mol/L)。将258mg的柠檬酸钠溶于100mL的超纯水中得到柠檬酸钠溶液(0.01mol/L)。取15mL的上述氯金酸溶液添加到510mL的超纯水中，加热至沸腾。之后，取30mL的上述柠檬酸钠溶液(0.01mol/L)添加至沸腾的混合溶液。继续加热在沸腾状态下反应10分钟，溶液变成浅红色，停止加热得到金纳米粒子(AuNPs)溶液；
(2)将192.8mg的巯基乙胺溶于100mL的超纯水得到巯基乙胺溶液(0.025mol/L)。取5mL的巯基乙胺溶液缓慢地添加至500mL金纳米粒子溶液中。反应4小时，结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到修饰氨基的金纳米粒子溶液。
将300mg的氢氧化钠和950mg的EGTA溶解到100mL的超纯水中得到氢氧化钠和EGTA的混合溶液(氢氧化钠浓度为0.075mol/L，EGTA浓度为0.025mol/L)。将955mg的EDC和287.5mg的NHS溶解到100mL的超纯水中得到EDC和NHS的混合溶液(EDC浓度为0.05mol/L，NHS浓度为0.025mol/L)。取5mL的氢氧化钠和EGTA混合溶液与5mL的EDC和NHS混合溶液混合，并调节pH值至5.0后添加至500mL的修饰氨基的金纳米粒子溶液中。在室温下反应12小时。结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到修饰有EGTA的金纳米粒子溶液。
将101mg的三乙胺和15g的分子量为2000的单溴聚乙二醇(HO-PEG-Br)溶解到100mL的超纯水中得到三乙胺和分子量为2000的单溴聚乙二醇混合溶液(三乙胺浓度为0.01mol/L，HO-PEG-Br浓度为0.075mol/L)。取5mL的上述混合溶液添加至500mL的修饰EGTA的金纳米粒子溶液中，在室温下搅拌反应3天，结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到EGTA被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液。
(3)将382mg的EDC、101mg的NHS和441mg的叶酸溶解到100mL的超纯水中得到EDC、NHS和叶酸的混合溶液(EDC浓度为0.02mol/L，NHS浓度为0.01mol/L，叶酸浓度为0.01mol/L)。将5mL的EDC、NHS和叶酸混合溶液加入到500mL的EGTA被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液中，在室温下搅拌反应3天。结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到以叶酸-聚乙二醇(分子量为2000)为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子溶液。
实施例6
以叶酸-聚乙二醇(分子量为2000)为冠，以BAPTA-AM为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子(AEPF NPs)的制备：
(1)将376mg的三水合氯金酸溶于100mL的超纯水中得到氯金酸溶液(0.01mol/L)。将258mg的柠檬酸钠溶于100mL的超纯水中得到柠檬酸钠溶液(0.01mol/L)。取15mL的上述氯金酸溶液添加到450mL的超纯水中，加热至沸腾。之后，取30mL的上述柠檬酸钠溶液(0.01mol/L)添加至沸腾的混合溶液。继续加热在沸腾状态下反应50分钟，溶液变成浅红色，停止加热得到金纳米粒子(AuNPs)溶液；
(2)将192.8mg的巯基乙胺溶于100mL的超纯水得到巯基乙胺溶液(0.025mol/L)。取5mL的巯基乙胺溶液缓慢地添加至300mL金纳米粒子溶液中。反应2小时，结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析36小时，得到修饰氨基的金纳米粒子溶液。
将300mg的氢氧化钠和1.911g的BAPTA溶解到100mL的超纯水中得到氢氧化钠和肿瘤靶向剂的混合溶液(氢氧化钠浓度为0.075mol/L，BAPTA浓度为0.025mol/L)。将955mg的EDC和287.5mg的NHS溶解到100mL的超纯水中得到EDC和NHS的混合溶液(EDC浓度为0.05mol/L，NHS浓度为0.025mol/L)。取5mL的氢氧化钠和BAPTA混合溶液与5mL的EDC和NHS混合溶液混合，并调节pH值至5.5后添加至500mL的修饰氨基的金纳米粒子溶液中。在室温下反应8小时。结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到修饰有BAPTA的金纳米粒子溶液。
将101mg的三乙胺和15g的分子量为1000的单溴聚乙二醇(HO-PEG-Br)溶解到100mL的超纯水中得到三乙胺和分子量为2000的单溴聚乙二醇混合溶液(三乙胺浓度为0.01mol/L，HO-PEG-Br浓度为0.075mol/L)。取5mL的上述混合溶液添加至500mL的修饰BAPTA的金纳米粒子溶液中，在室温下搅拌反应1天，结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到BAPTA被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液。
(3)将382mg的EDC、101mg的NHS和441mg的叶酸溶解到100mL的超纯水中得到EDC、NHS和叶酸的混合溶液(EDC浓度为0.02mol/L，NHS浓度为0.01mol/L，叶酸浓度为0.01mol/L)。将5mL的EDC、NHS和叶酸混合溶液加入到600mL的BAPTA被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液中，在室温下搅拌反应1天。结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到以叶酸-聚乙二醇(分子量为2000)为冠，以BAPTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子溶液。
实施例7
以透明质酸-聚乙二醇(分子量为2000)为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子的制备：
(1)将376mg的三水合氯金酸溶于100mL的超纯水中得到氯金酸溶液(0.01mol/L)。将258mg的柠檬酸钠溶于100mL的超纯水中得到柠檬酸钠溶液(0.01mol/L)。取15mL的上述氯金酸溶液添加到300mL的超纯水中，加热至沸腾。之后，取30mL的上述柠檬酸钠溶液(0.01mol/L)添加至沸腾的混合溶液。继续加热在沸腾状态下反应80分钟，溶液变成浅红色，停止加热得到金纳米粒子(AuNPs)溶液；
(2)将192.8mg的巯基乙胺溶于100mL的超纯水得到巯基乙胺溶液(0.025mol/L)。取5mL的巯基乙胺溶液缓慢地添加至400mL金纳米粒子溶液中。反应3小时，结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析12小时，得到修饰氨基的金纳米粒子溶液。
将300mg的氢氧化钠和950mg的EGTA溶解到100mL的超纯水中得到氢氧化钠和EGTA的混合溶液(氢氧化钠浓度为0.075mol/L，EGTA浓度为0.025mol/L)。将955mg的EDC和287.5mg的NHS溶解到100mL的超纯水中得到EDC和NHS的混合溶液(EDC浓度为0.05mol/L，NHS浓度为0.025mol/L)。取5mL的氢氧化钠和EGTA混合溶液与5mL的EDC和NHS混合溶液混合，并调节pH值至5.0后添加至500mL的修饰氨基的金纳米粒子溶液中。在室温下反应18小时。结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到修饰有EGTA的金纳米粒子溶液。
将101mg的三乙胺和15g的分子量为6000的单溴聚乙二醇(HO-PEG-Br)溶解到100mL的超纯水中得到三乙胺和分子量为2000的单溴聚乙二醇混合溶液(三乙胺浓度为0.01mol/L，HO-PEG-Br浓度为0.075mol/L)。取5mL的上述混合溶液添加至500mL的修饰EGTA的金纳米粒子溶液中，在室温下搅拌反应3天，结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析36小时，得到EGTA被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液。
(3)将382mg的EDC、101mg的NHS和776.6mg的透明质酸溶解到100mL的超纯水中得到EDC、NHS和透明质酸的混合溶液(EDC浓度为0.02mol/L，NHS浓度为0.01mol/L，透明质酸浓度为0.01mol/L)。将5mL的EDC、NHS和透明质酸混合溶液加入到300mL的EGTA被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液中，在室温下搅拌反应3天。结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析12小时，得到以透明质酸-聚乙二醇(分子量为2000)为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子溶液。
实施例8
以叶酸-聚乙二醇(分子量为5000)为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子的制备：
(1)将376mg的三水合氯金酸溶于100mL的超纯水中得到氯金酸溶液(0.01mol/L)。将258mg的柠檬酸钠溶于100mL的超纯水中得到柠檬酸钠溶液(0.01mol/L)。取15mL的上述氯金酸溶液添加到600mL的超纯水中，加热至沸腾。之后，取30mL的上述柠檬酸钠溶液(0.01mol/L)添加至沸腾的混合溶液。继续加热在沸腾状态下反应120分钟，溶液变成浅红色，停止加热得到金纳米粒子(AuNPs)溶液；
(2)将192.8mg的巯基乙胺溶于100mL的超纯水得到巯基乙胺溶液(0.025mol/L)。取5mL的巯基乙胺溶液缓慢地添加至600mL金纳米粒子溶液中。反应6小时，结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到修饰氨基的金纳米粒子溶液。
将300mg的氢氧化钠和950mg的EGTA溶解到100mL的超纯水中得到氢氧化钠和EGTA的混合溶液(氢氧化钠浓度为0.075mol/L，EGTA浓度为0.025mol/L)。将955mg的EDC和287.5mg的NHS溶解到100mL的超纯水中得到EDC和NHS的混合溶液(EDC浓度为0.05mol/L，NHS浓度为0.025mol/L)。取5mL的氢氧化钠和EGTA混合溶液与5mL的EDC和NHS混合溶液混合，并调节pH值至5.0后添加至500mL的修饰氨基的金纳米粒子溶液中。在室温下反应24小时。结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析24小时，得到修饰有EGTA的金纳米粒子溶液。
将101mg的三乙胺和37.5g的分子量为4000的单溴聚乙二醇(HO-PEG-Br)溶解到100mL的超纯水中得到三乙胺和分子量为5000的单溴聚乙二醇混合溶液(三乙胺浓度为0.01mol/L，HO-PEG-Br浓度为0.075mol/L)。取5mL的上述混合溶液添加至500mL的修饰EGTA的金纳米粒子溶液中，在室温下搅拌反应2天，结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析12小时，得到EGTA被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液。
(3)将382mg的EDC、101mg的NHS和441mg的叶酸溶解到100mL的超纯水中得到EDC、NHS和叶酸的混合溶液(EDC浓度为0.02mol/L，NHS浓度为0.01mol/L，叶酸浓度为0.01mol/L)。将5mL的EDC、NHS和叶酸混合溶液加入到400mL的EGTA被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液中，在室温下搅拌反应2天。结束后将所得溶液通过透析袋(截留分子量为1000)用超纯水透析36小时，得到以叶酸-聚乙二醇(分子量为5000)为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子溶液。
实施例9
以叶酸-聚乙二醇为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子的体外钙离子捕获能力的研究：
(1)将10mg的酯酶溶解到10mL的超纯水中，得到酯酶溶液。将832.5mg的氯化钙溶解在100mL超纯水中(氯化钙浓度为0.075mol/L)。取实施例2中100mL的叶酸-聚乙二醇(分子量为2000)为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子溶液，加入2mL的酯酶溶液，室温下反应过夜，再缓慢加入10mL的氯化钙溶液反应过夜。所得溶液的投射电镜图如图3所示，仿生纳米粒子发生聚集，从单个分散的个体变成了聚集的整体约为200nm。对聚集区域进行元素面扫射如图4中(a)、(b)、(c)与(d)所示，聚集体含有金元素、氮元素和钙元素。这都证明了本发明设计的仿生纳米粒子能够在酯酶响应下实现钙离子的捕获。
(2)将10mg的酯酶溶解到10mL的超纯水中，得到酯酶溶液。将832.5mg的氯化钙溶解在100mL超纯水中(氯化钙浓度为0.075mol/L)。取实施例2中100mL的叶酸-聚乙二醇(分子量为2000)为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子溶液，加入2mL的酯酶溶液，室温下反应过夜，再缓慢加入10mL的氯化钙溶液反应过夜；同时取实施例2中100mL的叶酸-聚乙二醇(分子量为2000)为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子溶液，缓慢加入10mL的氯化钙溶液反应过夜。将上述两种处理方法的混合溶液离心取上清液进行离子色谱分析，计算出1mol的AEPF NPs能够捕获钙离子的物质的量。如图5所示，经过酯酶处理后1mol的AEPF NPs最多可以捕获2.7mol钙离子，在没有酯酶的情况下，在AEPF NPs仅可捕获0.26mol的钙离子，几乎不可忽略不计。定量的证明了该仿生纳米粒子，仅在酯酶环境下实现钙离子捕获能力。
实施例10
以叶酸-聚乙二醇为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子的选择性钙离子捕获能力的研究：
将10mg的酯酶溶解到10mL的超纯水中，得到酯酶溶液。将832.5mg的氯化钙、712.5mg的氯化镁、435mg的氯化钠和558.8mg的氯化钾溶解在100mL超纯水中(四种物质浓度均为0.075mol/L)。取实施例2中100mL的叶酸-聚乙二醇(分子量为2000)为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子溶液，加入2mL的酯酶溶液，室温下反应过夜，再缓慢加入10mL的上述四种离子的混合溶液反应过夜。反应结束后将混合溶液离心取上清液进行离子色谱分析，计算出1mol的AEPF NPs能够捕获钙离子、镁离子、钠离子和钾离子的物质的量。如图6所示，1mol的AEPF NPs在混合溶液中能够捕获约1.6mol的钙离子，远高于其他三种离子。这证明了该仿生纳米粒子对钙离子的高选择性捕获能力，能够避开其他离子的影响。
实施例11
以叶酸-聚乙二醇为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子的细胞内钙离子捕获能力的研究：
(1)将人结肠癌细胞(LoVo细胞)和人正常结肠上皮细胞(NCM460细胞)分别在补充有10％胎牛血清(FBS)和抗生素(100IU/mL青霉素和100μg/mL链霉素)的DMEM RPMI1640培养基中培养。环境条件为37℃和5％CO2湿润气氛。
(2)将LoVo和NcM460培养在黑色96孔板中，分别加入实施例2中步骤(1)的金纳米粒子(AuNPs)与实施例2的以叶酸-聚乙二醇(分子量为2000)为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子(AEPF NPs)，并以加入PBS缓冲溶液作为对照组(Control)。共培养6小时后，使用线粒体钙浓度测试套件测量细胞内线粒体钙离子浓度。然后通过Varioskan Lux Multimode Microplate Reader测量相对荧光单位(RFU)，线粒体钙离子浓度计算公式如下：
Figure BDA0003054834900000211
结果如图7所示，AEPF NPs和LoVo细胞共培养后的钙离子浓度远低于纯LoVo细胞和AuNPs与LoVo细胞中共培养后的钙离子浓度，表明在AEPF NPs能够显著性降低LoVo细胞中的钙离子浓度。相比之下，在纯NCM460细胞，AuNPs与NCM460细胞中共培养后和AEPF NPs与NCM460细胞共培养后的钙离子浓度非常的相近且小于LoVo细胞内的钙离子浓度。这些数据说明，肿瘤细胞内的钙离子浓度大于正常细胞，且实施例2中的AEPF NPs也具有高效肿瘤选择性钙离子浓度调节，实现肿瘤的治疗。
实施例12
荧光标记的以叶酸-聚乙二醇为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子的制备及肿瘤细胞靶向研究：
(1)将20mg的异硫氰酸荧光素(FITC)溶解到100mL的超纯水中得到FITC溶液。取实施例2中100mL的叶酸-聚乙二醇(分子量为2000)为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子(AEPF NPs)溶液，缓慢滴加5mL的FITC溶液，反应24小时，获得荧光标记的AEPF NPs。
(2)将20mg的异硫氰酸荧光素(FITC)溶解到100mL的超纯水中得到FITC溶液。取实施例1中100mL的以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子(AEP NPs)溶液，缓慢滴加5mL的FITC溶液，反应24小时，获得荧光标记的AEP NPs。
(3)将肿瘤细胞(LoVo)细胞接种在24孔板中过夜，然后分别加入步骤(1)和步骤(2)的荧光标记的仿生纳米粒子共培养6小时。结束后将细胞在PBS中冲洗3次，并在室温下用DAPI对细胞核染色5分钟，使细胞核在荧光显微镜呈蓝色，而荧光纳米粒子呈绿色。激光共聚焦显微图如图8所示，修饰有肿瘤靶向剂叶酸的AEPF NPs的荧光强度明显高于没有肿瘤靶向剂的AEP NPs，说明AEPF NPs优异的肿瘤靶向效果有利于后续的治疗。
实施例13
以叶酸-聚乙二醇为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子的小鼠体内治疗效果研究：
(1)Balb/C小鼠，每只裸鼠皮下接种结肠癌细胞。当肿瘤达到约100mm3时，将裸鼠随机分配成4组(n＝4)，分别接受尾静脉注射200μL的PBS缓冲溶液、实施例2中的以叶酸-聚乙二醇为冠，以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子(AEPF NPs)溶液、实施例1中的以EGTA为捕获壳和以金纳米粒子为核的仿生纳米粒子(AEP NPs)溶液和实施例2中步骤(1)的金纳米粒子(AuNPs)溶液。每两天监测并记录小鼠肿瘤体积。肿瘤体积被测量为(A×B2)/2，其中A是肿瘤的较大尺寸，而B是肿瘤的较小尺寸。结果如图9的肿瘤组织照片和图10的肿瘤体积变化曲线所示，注射AEPF NPs的荷瘤小鼠肿瘤组织的体积降低最多，21天后肿瘤体积最小，AEP NPs的效果次之，AuNPs的效果和注射PBS的效果一样近乎没有抑制肿瘤细胞生长的能力，这说明AEPF NPs优异的肿瘤治疗效果。
(2)在最后一天，处死四组小鼠，收集肿瘤组织，用细胞活性标记物的苏木精-伊红(H&E)和增殖周期中的细胞标记物Ki67进行免疫组织化学染色，检测肿瘤组织的细胞活性。结果如图11所示，与PBS组，AEP NPs治疗组和Au NPs治疗组相比，注射AEPF NPs的小鼠肿瘤组织的完整细胞结构受到了破坏，且Ki67阳性率最低，处于增殖周期的细胞最少，肿瘤生长收到抑制。这些结果表明，AEPF NPs可以通过钙离子调节改善致瘤环境发挥优异的抗肿瘤功能。
本发明首先通过水热反应得到金纳米粒子核，接着通过简单的酰胺化反应和酯化反应修饰上能够捕获钙离子的钙离子捕获剂作为内壳和保护捕获剂的聚乙二醇外冠，最后修饰上肿瘤靶向剂，得到设计的减少肿瘤内过量钙离子的仿生纳米粒子。介于仿生纳米粒子的纳米尺寸可以通过肿瘤引起的高通透性和滞留效应以及肿瘤主动靶向剂介导的内吞作用而特异性地积聚在肿瘤细胞内。而肿瘤细胞中过表达的酯酶会将外层保护冠脱落，激活了钙离子捕获剂的钙离子捕获能力，显著降低了细胞内钙离子浓度，能够通过响应肿瘤特殊的微环境(酯酶触发的钙离子调节)实现精确而有效的肿瘤治疗。本发明制备的仿生纳米粒子生物相容性好，安全无毒，稳定性优异，适用于医学领域中，其中所用到的钙离子捕获剂和肿瘤靶向剂的选择范围广，修饰方法简单。

Claims (8)

1.一种减少肿瘤内过量钙离子的仿生纳米粒子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)向氢氧化钠和钙离子捕获剂的混合溶液中加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液，得到混合物，然后将混合物的pH值调节至5.0～6.0后添加至修饰氨基的金纳米粒子溶液中，在室温下反应8～24小时，透析，得到修饰有钙离子捕获剂的金纳米粒子溶液；其中，钙离子捕获剂为乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸或1,2-双(2-氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸四(乙酰氧基甲酯)；
2)将三乙胺和单溴聚乙二醇的混合溶液加入到修饰有钙离子捕获剂的金纳米粒子溶液中，搅拌下反应1～3天，透析，得到钙离子捕获剂被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液；其中，三乙胺和单溴聚乙二醇的混合溶液中三乙胺浓度为0.01mol/L，单溴聚乙二醇浓度为0.075mol/L；
三乙胺、单溴聚乙二醇与修饰钙离子捕获剂的金纳米粒子溶液的体积比为1：1：60～1：1：120；
3)将1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和肿瘤靶向剂的混合溶液加入到钙离子捕获剂被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液中，搅拌下反应1～3天，透析，得到具有靶向肿瘤功能的钙离子捕获仿生纳米粒子溶液；其中，肿瘤靶向剂是叶酸或透明质酸。
2.根据权利要求1所述的减少肿瘤内过量钙离子的仿生纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤1)中，氢氧化钠和钙离子捕获剂的混合溶液中氢氧化钠浓度为0.075mol/L，钙离子捕获剂浓度为0.025mol/L；
1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液中1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺浓度为0.05mol/L，N-羟基琥珀酰亚胺浓度为0.025mol/L；
氢氧化钠和钙离子捕获剂的混合溶液、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺混合溶液与修饰氨基的金纳米粒子溶液的体积比为1：1：60～1：1：120。
3.根据权利要求1所述的减少肿瘤内过量钙离子的仿生纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤1)中，修饰氨基的金纳米粒子溶液通过以下过程制得：将0.025mol/L的巯基乙胺溶液添加至金纳米粒子溶液中，反应2～6小时，透析，得到修饰氨基的金纳米粒子溶液；其中，巯基乙胺溶液和金纳米粒子溶液的体积比为1：60～1：120。
4.根据权利要求3所述的减少肿瘤内过量钙离子的仿生纳米粒子的制备方法，其特征在于，金纳米粒子溶液通过以下过程制得：将0.01mol/L的氯金酸溶液添加到超纯水中，加热至沸腾后，加入0.01mol/L的柠檬酸钠溶液，继续加热至沸腾，在沸腾状态下反应10～120分钟，得到金纳米粒子溶液；其中，氯金酸溶液、超纯水和柠檬酸钠溶液的体积比为1：20：2～1：40：2。
5.根据权利要求1所述的减少肿瘤内过量钙离子的仿生纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤2)中，单溴聚乙二醇的分子量是1000～6000。
6.根据权利要求1所述的减少肿瘤内过量钙离子的仿生纳米粒子的制备方法，其特征在于，步骤3)中，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和肿瘤靶向剂的混合溶液中1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺浓度为0.02mol/L，N-羟基琥珀酰亚胺浓度为0.01mol/L，肿瘤靶向剂浓度为0.01mol/L；
1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和肿瘤靶向剂的混合溶液与钙离子捕获剂被聚乙二醇保护的仿生纳米粒子溶液的体积比为1：60～1：120；
步骤1)、2)与3)中的透析时间均为12～36小时。
7.一种根据权利要求1-6中任意一项所述方法制备的减少肿瘤内过量钙离子的仿生纳米粒子，其特征在于，该仿生纳米粒子粒度小于等于10nm，具有酯酶响应的钙离子捕获能力。
8.一种根据权利要求1-6中任意一项所述方法制备的减少肿瘤内过量钙离子的仿生纳米粒子在制备用于抗肿瘤药物中的应用。
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