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CN113330056A - 基于花青的末端树枝状共聚物及其治疗癌症的用途 - Google Patents

基于花青的末端树枝状共聚物及其治疗癌症的用途 Download PDF

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CN113330056A
CN113330056A CN201980071701.5A CN201980071701A CN113330056A CN 113330056 A CN113330056 A CN 113330056A CN 201980071701 A CN201980071701 A CN 201980071701A CN 113330056 A CN113330056 A CN 113330056A
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CN
China
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cancer
cpci
acid
dox
peg
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Application number
CN201980071701.5A
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English (en)
Inventor
林杰生
张路
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University of California San Diego UCSD
Original Assignee
University of California San Diego UCSD
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Publication date
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Abstract

本发明提供了一种由花青修饰的末端树枝状共聚物及其纳米颗粒，和使用所述纳米颗粒治疗各种疾病(如癌症)的方法。

Description

基于花青的末端树枝状共聚物及其治疗癌症的用途
相关申请的交叉引用
本专利申请案要求2018年8月31日提交的编号为62/725,540的美国临时专利申请的优先权，其各自全部内容以引用方式并入本文中。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明是在美国国立卫生研究院授予的编号为2R01CA115483-06、R01EB012569和UJ01CA198880的政府赠款资助下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
背景技术
近红外光热转化剂(PTCAs)具有较强和可控的光学性能，在生物传感，生物成像和治疗等领域具有广泛的应用前景。应用PTCAs的光引发光热疗法(PTT)在局部癌症治疗方面展现了多种治疗优势，例如空间分辨率高、靶点选择性更好、不良副作用小或者中等、无创伤性、无需手术、起效快、疗效好、耐药性可忽略不计，并且成本相对较低。
迄今为止，许多近红外PTCAs被用于各种肿瘤模型的PTT研究中，例如卟啉、酞菁、二氢卟酚e6(Ce6)、金基纳米材料、碳纳米管和氧化石墨烯。在中，一些传统的花菁染料也被用作光介导的生物医学临床应用的中间体。例如，吲哚菁绿(ICG)是唯一一个被美国食品药品监督管理局(FDA)批准的近红外试剂，已经在临床上广泛用于光学造影确定心排血量、肝功能和血流量，以及眼科血管造影，突显了有机小分子染料在临床转化和实际应用方面的潜力。但是，大部分PTCAs仍然在PTT临床转化中面临着重大挑战，包括生物相容性差(例如无机纳米剂)、光热转化率低和内在稳定性差(体内肾脏或肝脏清除快，对光漂白的抵抗力较弱(易被光漂白)，例如小分子染料)。改善光热转换效率的重要前提是提高目标组织光吸收量，限制激发态光转换剂以非热能的形式释放能量。在近红外询问窗口范围(>800nm)具有超强吸收能力的高效PTCAs是首选，因为近红外光可以渗透更深层的组织，对血液和组织的干扰有限，对正常组织的光损伤更少以及光子组织衰减更低。其他改善光热转化效率的方法有提高目标肿瘤区域PTCAs的聚集密度/结构以及光吸收截面。
近期，许多文献都报道了用具有生物相容性的光热纳米材料物理封装诸如卟啉、Ce6或ICG之类的有机小分子，用于改善这类小分子染料的药代动力学和肿瘤靶向效率。但是，由于这类光热材料的激发波长是短波(例如卟啉和Ce6的激发波长为650nm)，所以光热转化效率低，组织渗透量低和循环泄露。通常，聚合物和大分子PTCAs比有机小分子PTCAs或其纳米制剂的光稳定性要高，特别是在PTCAs自组装成纳米颗粒之后，光稳定性有了进一步提升。这种方法获得的纳米结构在一定程度上避免了循环泄露和体内肾脏或肝脏的快速清除。在过去十年间，开发出了一种由线性PEG和基于树枝状胆酸的两亲聚合物(又称为末端树枝状共聚物(telodendrimer))组成的25-50nm的胶束纳米平台，作为构建模块。近年来，报道了具有胆酸和卟啉的杂化的末端树枝状共聚物的发展，可以自组装形成具有优良光热性能的胶束纳米卟啉。
总的来说，PTT的应用范围局限于治疗可接受光辐射的局部肿瘤。当患者的肿瘤部位在手术过程暴露出来后，PTT也可用于术中治疗肿瘤床。同步化疗联合PTT可能会产生一定的协同作用。对于转移性肿瘤来说，PTT联合免疫疗法可能会起到一定的效果，因为肿瘤部位的局部光热效应可能会激活全身性抗肿瘤免疫反应。一些接受过检查点阻断抗体治疗的患者身上出现了持续的临床反应。众所周知，程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)是一种免疫检查点，通过促进淋巴结中抗原特异性T细胞凋亡，同时减少调节性T细胞凋亡的双重机制来防止自身免疫。针对PD-1检查点的免疫疗法在远端转移瘤治疗中很有前景。尽管前景远大，但PD-1检查点阻断式免疫疗法的响应率有限(～20％)，只对肿瘤已经被T细胞预先浸润的患者有效。因此，将免疫疗法与其他有效的治疗方法组合的协同疗法是当今癌症治疗的主流。近期，研究发现PTT不仅可以在激光照射下诱导细胞凋亡和坏死，直接杀死肿瘤细胞，还可以产生抗肿瘤免疫反应，从消解的肿瘤细胞残余中产生肿瘤相关物质，从而改善全身免疫治疗作用。这一效果已在一份初步临床试验研究中得到证实。
本发明将报道一种基于末端树枝状共聚物的新型光热纳米颗粒，用作一种高性能PTCA和可控递送系统，用于癌症治疗。通过对原位OSC-3口腔癌异种移植和转移性4T1同基因乳腺癌模型的研究，分别评估了PTT/化学疗法和PTT/免疫疗法的协同效应(图1)。这种光热纳米颗粒源自于一种新型的杂化的末端树枝状共聚物(PEG5K-CA4-ICGD4,PCI)，其中包括线性PEG模块(Mr≈5000)，四个树突状疏水光热转化剂(吲哚菁绿衍生物，ICGD)和四个树突状胆酸(CA)，一种面部两亲物。为了进一步提高纳米颗粒的稳定性和光热转化效率，将一种由PEG、4个半胱氨酸、8个亲水连接基和8个胆酸(PEG5K-Cys4-L8-CA8,PCLC)组成的末端树枝状共聚物按1:1的比例加入到PCI中，在中性环境下共组装形成胶束。最终形成一个由二硫键交联的胶束纳米体系(CPCI-NP)(图2a)，该体系具有理想的更小尺寸，在体内的循环时间更长，对肿瘤的靶向选择性更好，渗透度更深。为了提高肿瘤响应，将阿霉素整合到纳米体系中，用于评估光热/化学疗法的组合对原位OSC-3口腔癌异种移植模型的疗效。此外，本发明还探究了一种装载有效免疫激动剂咪喹莫特的CPCI纳米平台与PD-1检查点抗体联用的有效光免疫疗法在4T1同基因乳腺癌模型中的应用。
发明内容
在一个实施方式中，本发明提供了一种式I所示化合物：
Figure BDA0003044282380000031
式中，PEG为一种聚乙二醇(PEG)聚合物，其中，各个PEG聚合物的分子重量为1-100kDa；X各自为支链单体单元；R1各自独立地为胆酸或胆酸衍生物；R2各自独立地为花青。
在另一个实施方式中，在本发明提供了一种含有多个第一偶联物的纳米颗粒，所述第一偶联物各自独立地为本发明所述的式(I)化合物，其中，多个偶联物在水溶液中自组装形成纳米颗粒，从而在纳米颗粒的内部形成疏水核，其中，每个偶联物的PEG自组装在纳米颗粒的外部。
在另一实施方式中，本发明提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括给有需要的受试者施用治疗有效量的本发明所述的纳米颗粒。
在另一实施方式中，本发明提供了一种通过光热疗法治疗疾病的方法，所述方法包括给有需要的受试者施用治疗有效量的本发明所述的纳米颗粒，和对有需要的受试者进行辐射，从而实现通过光热疗法治疗疾病。在另一实施方式中，本发明提供了一种治疗患有病变组织的受试者方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本发明所述的纳米颗粒，使得纳米颗粒集中在病变组织中；用第一波长的光照射以确定病变组织；并且从受试者上移除病变组织，从而实现对受试者的治疗。
在另一实施方式中，本发明提供了一种成像方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明所述纳米颗粒，并且对受试者进行成像。
在另一实施方式中，本发明提供了一种制备本发明所述的纳米颗粒的方法，包括：将多个本发明所述的式(I)第一偶联体与水溶液混合形成反应液，其中，所述偶联体自组装形成形成纳米颗粒，从而在纳米颗粒的内部形成疏水核，其中，每个偶联体的PEG自组装在纳米颗粒的外部。
附图说明
图1示出了高性能光热疗法纳米药物(CPCI NP)与化学疗法联合治疗原位口腔癌和与免疫疗法联合治疗转移性乳腺癌的示意图。
图2示出了PCI NPs和CPCI NPs的设计和表征。(a)PCI NPs和CPCI NPs的自组装示意图。(b)ICGD分子和PCI末端树枝状共聚物在甲醇中的紫外-可见-近红外光吸收光谱。(c)PCI NPs的DLS和TEM成像。(d)CPCI NPs的PBS溶液(磷钨酸染色；末端树枝状共聚物浓度为1mgmL-1)。(e)在SDS溶液中，连续测量PCI NPs和CPCINPs的动态光散射120min后，加入GSH(10mM)。(f)用808nm激光辐照300s，比较CPCI NPs、PCI NPs和GNRs的光热转换行为(ICGD浓度：30μg mL-1，GNRs浓度：18μg mL-1)。(g)在5轮加热-冷却操作中，CPCI NPs、PCI NPs和PBS溶液中ICG的反光解性能(ICGD和ICG的浓度：30μg mL-1)。
图3示出了CPCI NPs高光热转换效率的机理分析。使用735/20nm处的激发光带通滤波器，在不存在和存在SDS或GSH+SDS的情况下，不同浓度的PCI NPs(a)和CPCI NPs(b)溶液(10μL)的近红外荧光成像。PCI NPs(c)&(e)和CPCI NPs(d)&(f)的热成像图和定量温度变化曲线；测量结果为平均值±标准差(n＝3)。用强度为0.8W cm-2的808nm近红外激光辐照20s后，用热像仪监测温度。用于探究CPCI NPs和PCLC/TBAI&ICG NPs在808nm激光辐照下渗透深度和热效应的模拟装置(g)及其(h)温度变化。
图4示出了体外CPCI/DOX NPs的体外表征及CPCI/DOX NPs与808nm激光对OSC-3口腔癌细胞的协同细胞毒性作用。(a)CPCI/DOX NPs自组装和CPCI/DOX NPs释放DOX的示意图。(b)在pH为7.4的含有/不含有10％FBS的PBS溶液中，用动态光散射测量CPCI/DOX NPs的血清稳定性(孵育温度：37℃；数据取值为平均值±标准差，n＝3)。(c)DOX荧光强度的变化。(d)CPCI/DOX NPs在PBS、GSH(10mM)以及808nm(0.8W cm-2,2min,3次)激光中的体外定量DOX释放(DOX浓度：0.05mg mL-1；数据取值为平均值±标准差，平行实验样品数为3)。(e)OSC-3口腔癌细胞对装载DOX(红色)的CPCI NPs(绿色)的吸收。将细胞预先用细胞核染色剂Hoechst 33342(蓝色)染色30min，然后与含有CPCI/DOX NPs的PBS溶液共孵育。孵育6h后，用三角视觉去卷积显微镜进行成像(比例尺＝5μm)。(f)与CPCI NPs共同孵育的OSC-3口腔细胞在有/没有近红外激光辐照条件下的存活率(0.8W cm-2，2min)(n＝3)。(g)OSC-3口腔细胞的成活率，(h)用DiO/PI对OSC-3口腔细胞进行活/死细胞染色，比例尺＝25μm，各处理条件如下：CPCI NPs、808nm激光辐照、游离DOX、CPCI/DOX NPs、808nm激光辐照的CPCI NP和808nm激光辐照的CPCI/DOX NPs，CPCI NPs浓度为50μg mL-1。DOX与CPCI-NPs联合激光治疗OSC-3口腔细胞的(i)协同治疗效果和(j)联合指数。
图5示出了CPCI/DOX NPs的体内肿瘤成像。(a)5mg kg-1剂量的CPCI NPs、PCLC/TBAI&ICG NPs和游离ICG在活体内的血液清除动力学。数据取值为平均值±标准差，n＝3。(b)在尾部静脉注射后，ICGD在不同时间点在肿瘤处堆积的荧光成像。(c)静脉注射CPCI/DOX NPs后(DOX的剂量是2.5mg kg-1；末端树枝状共聚物的总剂量是50mg kg-1；ICGD的剂量是7mg kg-1)，GFP标记的携带原位OSC-3口腔癌的裸鼠的代表性活体成像。红色箭头指的是肿瘤区域。(d)在注射48h后，从同一动物体内切除下来的器官和肿瘤的离体ICGD代表性荧光成像。(e)在注射48h后，用激光扫描共聚焦显微镜观察OSC-3肿瘤组织中CPCI/DOX NPs分布图。红色：DOX；绿色：ICGD。(f)在CPCI/DOX NPs注射48h后，器官和肿瘤中ICGD荧光信号强度。(g)在CPCI/DOX NPs注射24h、48h和5d后，用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS，安捷伦科技，7500ce)测量DOX在原位OSC-3口腔癌小鼠的器官和肿瘤组织中的分布情况。在每个时间点采样3只小鼠。每只小鼠接受CPCI/DOX NPs的剂量为2.5mg kg-1。数据取值为平均值±标准差。
图6示出了光热疗法/化学疗法对携带原位OSC-3口腔癌的小鼠的协同抗肿瘤活性作用。对OSC-3口腔癌小鼠全身施用PBS、PCI NPs、CPCI NPs或CPCI/DOX NPs24h后，用强度为0.8W cm-2的808nm激光辐照(a)红外热成像图和(b)肿瘤平均温度(n＝3)。(c)基于PTT的CPCI/DOX NPs与化学疗法联用抑制原位口腔肿瘤生长的示意图。(d)携带原位OSC-3口腔癌的小鼠体内肿瘤的生长曲线(每组5只小鼠)。(e)在CPCI/DOX NPs与808nm激光的条件下，肿瘤体积变化的代表图。(f)用不同方法处理(在X100图中，比例尺＝100μm；在X400图中，比例尺＝25μm)，在第28天，取肿瘤切片进行H&E染色。DOX的剂量：2.5mg kg-1，ICGD的剂量：7mgkg-1。通过比较其他组与最后一组(CPCI/DOX NPs+808nm激光)，用Tukey法(*P<0.05)计算d中的*P值。数据取值为平均值±标准差。
图7示出了光热/免疫疗法对携带原位4T1乳腺癌(两侧)的小鼠的协同抗肿瘤活性。(a)CPCI/咪喹莫德NPs与α-PD-1联合治疗引发的抗肿瘤免疫应答的机理示意图。
(b)CPCI NPs中咪喹莫德的封装率以及CPCI/咪喹莫德NPs的粒径变化与载药量的比值。封装率是指纳米颗粒中装载的药物含量与初始药物含量的比值。溶液的最终体积为1mL，末端树枝状共聚物的最终浓度为20mg mL-1。(c)光热/免疫疗法协同抑制原发部位和远端部位肿瘤生长示意图。s.c.接种4T1肿瘤的小鼠(每组6只小鼠)的(d)原发肿瘤和(e)远端肿瘤的生长曲线，(咪喹莫德的剂量：1.25mg kg-1，总末端树枝状共聚物的剂量：50mg kg-1，ICGD的剂量：7mg kg-1，分别在第2天和第8天给每只小鼠腹腔注射200μg抗-PD-1)。将第5组(CPCI/咪喹莫德NPs+α-PD-1)和第7组(CPCI/咪喹莫德NPs+808nm激光+α-PD-1)比较，通过第5组(CPCI/咪喹莫德NPs+α-PD-1)和第7组(CPCI/咪喹莫德NPs+808nm激光+α-PD-1)比较，d中*P<0.05；通过第4组(CPCI/咪喹莫德NPs)与第3组(CPCI/咪喹莫德NPs+808nm激光)比较，e中*P<0.05。(f)用CPCI/咪喹莫德NPs加808nm激光加α-PD-1治疗后，小鼠体内肿瘤体积变化的代表图。红圈和蓝圈分别显示原发肿瘤和远端肿瘤。(g)用如图所示的不同条件治疗后，收集肿瘤切片，进行H&E染色(比例尺＝25μm)。(h)RT-qPCR评估不同治疗条件下两侧肿瘤组织中CD11b、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-6和IL-12的表达量(数值取平均值±s.d.；n＝3)。(i)用不同治疗条件后，对两侧肿瘤组织中的CD8+、PD-1、CD3+和CD4+T细胞进行IHC染色，比例尺为25μm。
图8示出了光热/免疫协同治疗的免疫记忆效应。(a)抑制原发和远端癌症复发的免疫记忆示意图。在第一次接种的肿瘤消除50天(在第67天和第73天，每只小鼠腹腔注射α-PD-1200μg)后，再次植入肿瘤后，(b)原发肿瘤和(c)远端肿瘤的生长曲线。
图9示出了ICGD的多步化学反应合成路径。
图10示出了ICGD分子的表征数据：(a)化学结构；(b)1H NMR谱(溶剂为CDCl3)；(c)ICGD分子的质谱图(ESI质谱测试)。
图11示出了PCI末端树枝状共聚物的表征数据：(a)化学结构；(b)示意图；(c)PCI末端树枝状共聚物的质谱图(MALDI-TOF质谱测试)。
图12示出了PCLC末端树枝状共聚物的表征数据：(a)化学结构；(b)示意图(c)PCLC末端树枝状共聚物的质谱图(MALDI-TOF质谱测试)。
图13示出了(a)ICGD和PCI末端树枝状共聚物在甲醇中的荧光光谱；(b)ICGD和PCI末端树枝状共聚物在甲醇中紫外-可见-近红外吸收光谱以及PCI纳米颗粒在PBS(ICGD浓度为30μg mL-1)中的紫外-可见-近红外吸收光谱；(c)来自PCI NPs中的ICGD分别在PBS和SDS(PCI末端树枝状共聚物浓度为0.1mg mL-1)中的荧光光谱；(d)来自CPCI NPs中的ICGD分别在PBS、SDS、GSH和GSH+SDS(PCI末端树枝状共聚物浓度为0.1mg mL-1)溶液中的荧光光谱。
图14示出了(a)DOX在CPCI NPs中的封装率及CPCI/DOX NPs粒径随载药量的变化。封装率是封装进纳米颗粒药物含量与初始药物含量的比值。溶液的最终体积保持在1mL，末端树枝状共聚物的最终浓度为20mg/mL。(b)PBS溶液中CPCI NPs和CPCI/DOX NPs的示意图和代表图(末端树枝状共聚物总浓度：20mg mL-1；DOX浓度：1mg mL-1)。
图15示出了健康Balb/c小鼠静脉注射三种不同浓度的CPCI NPs 24h和72h后，血液中白细胞(WBC)、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞分布宽度(RDW)、血小板和平均血小板体积(MPV)等血液参数检测数据。
图16示出了健康Balb/c小鼠静脉注射三种不同浓度的CPCI NPs 24h和72h后，血液中丙氨酸转氨酶、白蛋白、碱性磷酸酶、天冬氨酸转氨酶、血尿素氮、肌酐、胆红素、总蛋白、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和甘油三酯等肝功能参数检测数据。
图17示出了Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)流式细胞法检测不同细胞培养情况下凋亡的OSC-3口腔细胞。Q1：坏死细胞；Q2：晚期凋亡细胞；Q3：正常活细胞；Q4：早期凋亡细胞。DOX剂量：0.005mg mL-1；808nm激光辐照：0.8W cm-2，2min。
图18示出了实验小鼠的体重变化曲线。对携带原位OSC-3口腔癌的小鼠通过尾部静脉每隔3天注射不同配方的药物，(n＝5；DOX的剂量：2.5mg kg-1；ICGD的剂量为7mg kg-1，数据取三个平行实验样品的平均值±标准误差)。
具体实施方式
I.定义
除非另外特别指出，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。另外，与本文描述的方法或材料相似或等同的任何方法或材料都可以用于本发明的实践中。为了保护本发明，定义了以下术语。
本发明所述“一个(a)”、“一个(an)”或“某个”不仅包括一个成员的方面，也包括一个以上成员的方面。例如，单数形式的“一个”、“一个”或“某个”除非特别指出，一般包括复数形式。因此，例如涉及到“一个细胞”指的是多个此类细胞，涉及到“某个试剂”指的是本领域技术人员所熟知的一个或多个试剂等。
如本文所述，术语“树枝状聚合物”和“树枝化聚合物”指包含中心(focal point)、多个支链单体单元和多个终端基团的支化聚合物。单体相互连接以形成从中心延伸并在端基结束的臂(也称树突(dendrons))。树枝状聚合物的中心可与本发明所述化合物的其他部分相连，终端基团可进一步被其他化学基团修饰。
如本文所述，术语“末端树枝状共聚物(telodendrimer)”指一种包含亲水性PEG链段的树枝状聚合物，一个或多个化学部分(moiety)以共价键的形式连接至一个或多个端基上。这些化学部分包括但不限于疏水基团、亲水基团、两亲化合物和有机部分。通过正交保护基团法，可以将不同的化学部分有选择地结合到适合的末端基团上。
如本文所述，术语“单体”、“单体单元”或“支链单体单元”指二氨基羧酸、二羟基羧酸或羟基氨基羧酸。本发明所述的二氨基羧酸基团包括但不限于：2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸、2,5-二氨基戊酸(鸟氨酸)、2,6-二氨基己酸(赖氨酸)、(2-氨基乙基)-半胱氨酸、3-氨基-2-氨基甲基丙酸、3-氨基-2-氨基甲基-2-甲基丙酸、4-氨基-2-(2-氨基乙基)丁酸和5-氨基-2-(3-氨基丙基)戊酸。本发明所述的二羟基羧酸基团的实例包括但不限于：甘油酸、2，4-二羟基丁酸、甘油酸、2，4-二羟基丁酸、2，2-双(羟甲基)丙酸和2，2-双(羟甲基)丁酸。本发明所述的羟基氨基羧酸包括但不限于：丝氨酸和高丝氨酸。本领域技术人员将理解，其他单体单元可用于本发明。
如本文所述，术语“氨基酸”指带有氨基官能团的羧酸。氨基酸包括上述的二氨基羧酸。氨基酸包括天然存在的α-氨基酸，其中氨基连接在与羧酸的羰基相邻的碳上。天然存在的α-氨基酸的实例包括但不限于：L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-赖氨酸和L-精氨酸。氨基酸还可以包括天然存在的α-氨基酸的D-对映异构体，以及β-氨基酸和其他非天然存在的氨基酸。
如本文所述，术语“胆酸”是指(R)-4-((3R，5S，7R，8R，9S，10S，12S，13R，14S，17R)-3，7，12-三羟基-10，13-二甲基十六烷基-1H-环戊[a]菲基-1-7-基)戊酸。胆酸也称为3α，7α，12α-三羟基-5β-胆酸；3-α，7-α，12-α-三羟基-5-胆烷-24-酸；17-β-(1-甲基-3-羧丙基)本胆烷-3α，7α，12α-三醇；胆酸和胆碱。胆酸衍生物和类似物，例如别胆酸、蟒胆酸(pythocholic acid)、禽胆酸(avicholic acid)、脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸也可用于本发明。胆酸衍生物可用于调节末端树枝状共聚物组装的纳米颗粒的性质，例如胶束稳定性和膜活性。例如，在胆酸衍生物表面修饰一个或多个甘油基团、氨基丙二醇基团或其他基团可获得一个亲水面。
如本文所述，术语“花青(cyanine)”指聚次甲基型合成染料家族。花青素可用作生物医学成像的荧光染料。花青可以是链花青(streptocyanine)(也称为开链花青)、半花青(hemicyanines)或闭链花青。闭链花青上含有氮原子，其各自独立地为杂芳基部分的一部分。
如本文所述，术语“纳米颗粒”指由本发明所述树枝状聚合物偶联体聚集形成的胶束。纳米颗粒含有一个疏水内核和一个亲水外部。
如本文所述，术语“两亲化合物”是指一种既具有疏水基团又具有亲水基团的化合物。例如，本发明所述的两亲化合物具有一个亲水面和一个疏水面。可用于本发明的两亲化合物包括但不限于胆酸、胆酸类似物及其衍生物。
如本文所述，术语“交联基团”和“可交联基团”指能够与另一个分子上相似或互补的基团成键的官能团，例如，第一树状聚合物上的第一可交联基团与第二树状聚合物上的第二可交联基团连接。“含巯基的交联基团”指含有硫原子的交联基团。本发明中适合嵌入树枝状大分子内部的交联基团的基团有巯基，例如半胱氨酸、硼酸和1,2-二醇，包括1,2-二羟基苯，如邻苯二酚。本发明中适合与树枝状大分子的一到两个端基结合的交联基团有硫醇，如半胱氨酸和N-乙酰-半胱氨酸。交联基团在结合时会形成交联键，例如二硫键和硼酸酯键。其他可交联和交联基团适用于本发明。
如本文所述，术语“连接基团”指将树状大分子偶联体的一个片段与另一个片段连接的化学部分。连接树状大分子偶联体的一个片段与连接基团的化学键包括但不限于酰胺、胺、酯、氨基甲酸酯、脲、硫醚、硫代氨基甲酸酯、硫代碳酸盐和硫脲。本领域技术人员应理解，其他化学键可用于本发明。
如本文所述，术语“药物”或“治疗剂”指能够治疗和/或改善病症或疾病的药剂。所述药物可以是任何排斥水的疏水性药物。可用于本发明的疏水性药物包括但不限于紫杉烷类(例如紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛、巴卡亭III、10-脱乙酰基巴卡亭、红豆杉A、红豆杉B或红豆杉C)、阿霉素、依托泊苷、伊立替康、SN-38、环孢菌素A、鬼臼毒素、卡莫司汀、两性霉素、伊沙贝比隆、帕土匹龙(埃博霉素(epothelone)类)、雷帕霉素和铂类药物。其他药物包括非甾体类抗炎药和长春花生物碱，例如长春碱和长春新碱。本发明所述药物还包括前药形式。本领域技术人员将理解，其他药物可用于本发明。
如本文所述，术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”指治疗或减轻损伤、病理、病状或症状(例如疼痛)方面的任何成功的标志，其包括任何客观或主观参数，例如症状的消减、缓解和减轻、使症状、损伤、病理或病况对于患者更耐受，减少症状或病症的发生频率或持续时间或在某些情况下，防止症状或病症的出现。症状的治疗或缓解是基于所有的客观或主观参数做出的判断，包括体检结果。
如本文所述，术语“施用(给药)”指口服给药、栓剂给药、局部接触、肠外给药、静脉注射、腹腔内给药、肌肉注射、病灶内给药、鼻内或皮下给药、鞘内给药或将缓释装置例如微型渗透泵植入受试者体内。
如本文所述，术语“治疗有效量或剂量”或“治疗充足或剂量”或“有效/充足量或剂量”皆指对施药对象产生治疗效果的剂量。具体剂量取决于治疗目的，且由本领域技术人员用已知技术确定(参见，例如Lieberman，《药物剂型(PharmaceuticalDosage Forms)》(卷.1-3，1992)；Lloyd，《药物配制的艺术，科学和技术(The Art,Science and Technology ofPharmaceutical Compounding)》(1999)；Pickar，《剂量计算(Dosage Calculations)》(1999)和《雷明顿：药学的科学与实践(Remington:The Science and Practice ofPharmacy)》，第20版，2003年，詹纳罗编辑，利平科特·威廉姆斯·威尔金斯出版公司)。敏化细胞的有效治疗剂量通常低于非敏化细胞的常规有效治疗剂量。
如本文所述，术语“受试者”指哺乳动物，包括但不限于：灵长类(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔子、大鼠和小鼠等。在某些实施方式中，所述受试者是人。
如本文所述，术语“疾病”指非外部伤害引起的，对生物体的部分或全部功能或结构产生负面影响的异常状况。疾病通常被解释为与特定症状和体征相关的医学状况。疾病包括癌症、免疫缺陷、超敏反应、过敏和自身免疫性疾病。
如本文所述，术语“病变组织”指本文所描述的疾病的部分细胞组织。
如本文所述，术语“检查点阻断抗体”指抑制免疫检查点的抗体；免疫系统的关键调节因子受到刺激时，会抑制免疫系统对免疫刺激的反应。检查点阻断抗体可阻断抑制性检查点，恢复免疫系统功能。检查点阻断抗体包括但不限于：抗PD-1、抗PDL-1、抗PDL-2和抗CTLA-4。
如本文所述，术语“光热疗法”指使用在光照下产生热的无毒光敏化合物进行治疗的方法。与光动力疗法一样，光热疗法需要光敏剂和光源，而光源通常是红外光。但光热疗法不需要氧气。可供使用的光敏剂有很多，例如卟啉、叶绿素和染料。
如本文所述，术语“辐射(radiation)”指能量以波或粒子的形式在空间或物质介质间发射或传输；“辐照(irradiation)”指受试者暴露于辐射的过程。例如，辐照包括红外光的使用。
II.花青末端树枝状共聚物
在一些实施方式中，本发明提供了式(I)化合物：
Figure BDA0003044282380000091
式中，PEG为聚乙二醇(PEG)聚合物，其中，各个PEG聚合物的分子重量为1-100kDa；X各自为支链单体单元；R1各自独立地为胆酸或胆酸衍生物；R2各自独立地为花青。
任何尺寸和结构的PEG聚合物均可用于本发明的末端树枝状共聚物。在一些实施方式中，PEG的分子量为1-100kDa。在一些实施方式中，PEG的分子量为1-50kDa。在一些实施方式中，PEG的分子量为1-10kDa。在一些实施方式中，PEG的分子量约为10kDa、9kDa、8kDa、7kDa、6kDa、5kDa、4kDa、3kDa、2kDa或1kDa。在一些实施方式中，PEG的分子量约为5kDa。本领域技术人员应理解，其他PEG聚合物和其他亲水性聚合物可用于本发明。PEG可以是任何合适长度。
树枝状聚合物可以由支链单体单元X构成，如氨基酸或其他双官能的AB2型单体，其中A和B分别是两个可以相互反应的不同官能团，所得的聚合物链的支链点为官能团A和B形成的化学键。在一些实施方式中，各支链单体单元X可以式二氨基羧酸、二羟基羧酸和羟基氨基羧酸。在一些实施方式中，X为二氨基羧酸。在一些实施方式中，二氨基羧酸可以是2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸、2,5-二氨基戊酸(鸟氨酸)、2,6-二氨基己酸(赖氨酸)、(2-氨基乙基)-半胱氨酸、3-氨基-2-氨基甲基丙酸、3-氨基-2-氨基甲基-2-甲基丙酸、4-氨基-2-(2-氨基乙基)丁酸或5-氨基-2-(3-氨基丙基)戊酸。在一些实施方式中，各二羟基羧酸可以是甘油酸、2，4-二羟基丁酸、2，2-双(羟甲基)丙酸、2，2-双(羟甲基)丁酸、丝氨酸或苏氨酸。在一些实施方式中，羟基氨基羧酸可以是丝氨酸或高丝氨酸。在一些实施方式中，二氨基羧酸各自为氨基酸。在一些实施方式中，支链单体单元X各自为二氨基羧酸，其中，二氨基羧酸各自为赖氨酸。
可用于本发明的两亲化合物包括但不限于：胆酸、胆酸类似物及其衍生物。“胆酸”指(R)-4-(((3R，5S，7R，8R，9S，10S，12S，13R，14S，17R))-3,7,12-三羟基-10,13-二甲基十六氢-1H-环戊[a]菲-17-基)戊酸，其结构如下：
Figure BDA0003044282380000101
胆酸衍生物及其类似物包括但不限于别胆酸、蟒胆酸、禽胆酸、脱氧胆酸和鹅去氧胆酸。胆酸衍生物可用于调节树枝状两亲嵌段共聚物自组装形成的纳米颗粒的性质，例如胶束稳定性和膜活性。例如，胆酸衍生物可以用一个或多个甘油基团、氨基丙二醇基团或其他基团修饰形成亲水面。
在一些实施方式中，R1各自独立地为胆酸、(3α，5β，7α，12α)-7,12-二羟基-3-(2,3-二羟基-1-丙氧基)-胆酸(CA-4OH)、(3α，5β，7α，12α)-7-羟基-3,12-二(2,3-二羟基-1-丙氧基)-胆酸(CA-5OH)或(3α，5β，7α，12α)-7,12-二羟基-3-(3-氨基-2-羟基-1-丙氧基)-胆酸(CA-3OH-NH2)。在一些实施方式中，R1为胆酸。
本发明所述花青指一种含有至少一个季胺的聚次甲基的合成染料家族。花青可用于成像。在一些实施方式中，花青为链花青、半花青或闭链花青。半花青结构如下：
Figure BDA0003044282380000111
式中，n为0-5的整数；环A为杂芳基部分。闭链花青含有氮原子，其各自独立地为杂芳基部分的一部分，其结构如下：
Figure BDA0003044282380000112
式中，n为0至5的整数；环A各自独立地为杂芳基部分。所述杂芳环基可以是吡咯、咪唑、噻唑、吡啶、喹诺酮、吲哚、苯并吲哚或苯并噻唑，其中，每一个都可被选自下组的1，4官能团取代：C1-6烷基和磺酸酯。R基团各自独立地选自下组：C1-10烷基、(CH2)mSO3Na和(CH2)mCOOH，其中，m为1至10的整数。
在一些实施方式中，R2各自独立地为花青3、花青3.5、花青5、花青5.5、花青7、花青7.5、吲哚菁绿或具有(S1)结构的吲哚菁绿衍生物：
Figure BDA0003044282380000113
在一些实施方式中，R2为具有(S1)结构的花青。
在一些实施方式中，所述化合物为式(I)化合物，式中：各个PEG的分子量为5kDa：各X为赖氨酸；R1各自为胆酸；R2各自独立地为具有(S1)结构的花青。在一些实施方式中，所述化合物具有如下结构：
Figure BDA0003044282380000114
III.纳米颗粒
本发明所述的末端树枝状共聚物聚集形成具有内部疏水核和外部亲水的纳米颗粒。在一些实施方式中，本发明提供了一种具有内部和外部结构的纳米颗粒，所述纳米颗粒具有一种或多种本发明所述的树枝状聚合物偶联体，其中，各化合物在水溶液中自组装形成形成纳米载体，从而在纳米载体内部形成疏水口袋，其中，各化合物上的PEG自组装在纳米载体的外部。
在一些实施方式中，本发明提供了一种含有多个第一偶联体的纳米颗粒，其中，第一偶联体各自独立地为本发明所描述的式(I)化合物，其中：多个偶联体在水溶液中自组装形成纳米颗粒，从而在纳米颗粒的内部形成疏水核，其中，各偶联体的PEG自组装在纳米颗粒的外部。
用于本发明的多个第一偶联体包括所描述的式(I)偶联体。在一些实施方式中，纳米颗粒包含多个第二偶联体，其中，第二偶联体各自独立地为式(II)化合物：
Figure BDA0003044282380000121
其中，PEG为聚乙二醇(PEG)聚合物，其中，各个PEG聚合物的分子量为1-100kDa；X各自为支链单体单元；Y各自为是含硫醇的交联基团；各L为连接基团；R1各自独立地为胆酸或胆酸衍生物。
任何尺寸和结构的PEG聚合物均可用于本发明的末端树枝状共聚物，用于制备式(II)化合物。在一些实施方式中，PEG的分子量为1-100kDa。在一些实施方式中，PEG的分子量为1-50kDa。在一些实施方式中，PEG的分子量为1-10kDa。在一些实施方式中，PEG的分子量约为10kDa、9kDa、8kDa、7kDa、6kDa、5kDa、4kDa、3kDa、2kDa或1kDa。在一些实施方式中，PEG的分子量为5kDa。本领域技术人员应理解，其他PEG聚合物和其他亲水性聚合物可用于本发明。PEG可以是任何合适的长度。
本发明所用的支链单体单元包括所有适合的氨基酸和其他AB2-型双官能团单体，其中，A和B是两个能相互反应的不同官能团，由此产生的聚合物链在支链点处形成一个A-B键。在一些实施方式中，支链单体单元X可以是二氨基羧酸、二羟基羧酸和羟基氨基羧酸。在一些实施方式中，X为二氨基羧酸。在一些实施方式中，二氨基羧酸可以是2，3-二氨基丙酸、2，4-二氨基丁酸、2，5-二氨基戊酸(鸟氨酸)、2，6-二氨基己酸(赖氨酸)、(2-氨基乙基)-半胱氨酸、3-氨基-2-氨基甲基丙酸、3-氨基-2-氨基甲基-2-甲基丙酸、4-氨基-2-(2-氨基乙基)丁酸或5-氨基-2-(3-氨基丙基)戊酸。在一些实施方式中，各二羟基羧酸可以是甘油酸、2，4-二羟基丁酸、2，2-双(羟甲基)丙酸、2，2-双(羟甲基)丁酸、丝氨酸或苏氨酸。在一些实施方式中，各羟基氨基羧酸可以是丝氨酸或高丝氨酸。在一些实施方式中，各二氨基羧酸为氨基酸。在一些实施方式中，各支链单体单元X为二氨基羧酸，其中，各二氨基羧酸为赖氨酸。
连接基团L包括所有合适的连接基。一般来说，连接基团是双官能的连接基，具有两个官能团，分别与末端树枝状共聚物的两段进行反应。在一些实施例中，连接基团为异双官能连接基团。在一些实施方式中，连接基团为同双官能连接基团。在一些实施方式中，连接基团L可以是聚乙二醇、聚丝氨酸、聚甘氨酸、聚(丝氨酸-甘氨酸)、脂族氨基酸、6-氨基己酸、5-氨基戊酸、4-氨基丁酸或β-丙氨酸。在一些实施方式中，连接基团L是具有下式的Ebes连接基：
Figure BDA0003044282380000131
本领域技术人员应知连接基团的大小与化学特性根据所连接的末端树枝状共聚物片段的结构而有所调整。
在一些实施方式中，本发明所述的纳米颗粒包括第一偶联体和/或第二偶联体，其中，R1各自独立地为胆酸或胆酸衍生物。R1各自独立地为胆酸、(3α，5β，7α，12α)-7,12-二羟基-3-(2,3-二羟基-1-丙氧基)-胆酸(CA-4OH)、(3α，5β，7α，12α)-7-羟基-3,12-二(2,3-二羟基-1-丙氧基)-胆酸(CA-5OH)或(3α，5β，7α，12α)-7,12-二羟基-3-(3-氨基-2-羟基-1-丙氧基)-胆酸(CA-3OH-NH2)。在一些实施方式中，各R1为胆酸。
在一些实施方式中，纳米颗粒包含式(I)第的一偶联体，其中，PEG的分子量为5kDa；各X为赖氨酸；各R1为胆酸；各R2为具有S1结构的花青。在另一些实施方式中，纳米颗粒还包含式(II)的第二偶联体，其中，PEG的分子量为5kDa；各X为赖氨酸；各Y为半胱氨酸；各L为连接基团，其结构式为：
Figure BDA0003044282380000132
各R1为胆酸。
在一些实施方式中，本发明所述纳米颗粒通过含有式(II)交联基团的硫醇交联。在一些实施方式中，含有交联键的硫醇为半胱氨酸或N-乙酰半胱氨酸。在一些实施方式中，含有交联键的硫醇为半胱氨酸。
在一些实施方式中，本发明所述纳米颗粒包含式(I)的第一偶联体和式(II)的第二偶联体的比例(w/w)为约100:1至1:100、50:1至1:50、25:1至1:25、10:1至1:10或1:1。在一些实施例中，式(I)的第一偶联体与式(II)的第二偶联体的比例(w/w)约为100:1、50:1、25:1、10:1或1:1。在一些实施方式中，式(I)第一偶联体与式(II)第二偶联体的比例约为1:1(w/w)。
在一些实施例中，纳米颗粒的平均直径约为250nm、100nm、50nm或20nm。在一些实施方式中，纳米颗粒的平均直径约为20nm。
在一些实施方式中，本发明所述的纳米颗粒还包含疏水核里的治疗药物。所述的治疗药物的水溶性可能不好。在一些实施例中，治疗药物选自下组：硼替佐米、紫杉醇、SN38、喜树碱、依托泊苷和阿霉素、多西他赛、VP16、泼尼松、地塞米松、长春新碱、长春碱、西罗莫司、卡莫西因、嘎德莫特(Gardiquimod)、阿霉素、柔红霉素、长春新碱、长春碱、紫杉醇、SN-38、咪喹莫特、雷西莫特、莫托莫德、来那度胺、泊马利度胺和具有(S2)结构的LLS30：
Figure BDA0003044282380000141
在另一些实施方式中，治疗药物选自下组：嘎德莫特、阿霉素、柔红霉素、长春新碱、长春碱、紫杉醇、SN-38、咪喹莫特、雷西莫特、莫托莫德、来那度胺、泊马利度胺和具有(S2)结构的LLS30。
IV.治疗方法
本发明所述纳米颗粒可用于治疗疾病。本发明所述纳米颗粒可通过光热疗法治疗疾病。本发明所述纳米颗粒可用于治疗有病变组织的受试者。本发明所述纳米颗粒可用于成像，通过将成像剂螯合在纳米颗粒的内部，或将成像剂附着到纳米颗粒的偶联体上。
在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明所述纳米颗粒。
本发明所述纳米颗粒可以施用在受试者上用于治疗的疾病(如癌症)包括但不限于：恶性上皮肿瘤(carcinoma)、神经胶质瘤、间皮瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、腺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤、白血病、淋巴瘤、前列腺癌和伯基特氏淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、非小细胞癌细胞肺癌、小细胞肺癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、肝胆癌、胆囊癌、小肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、阴茎癌、尿道癌、睾丸癌、宫颈癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、胰腺内分泌癌、类癌、骨癌、皮肤癌、视网膜母细胞瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤(其他癌症参见《癌症：原理与实践》(CANCER:PRINCIPLES AND PRACTICE)(DeVita,V.T.等.eds 2008))。
本发明所述的纳米载体可以治疗的其他疾病包括：(I)炎症或过敏性疾病，例如全身性过敏反应或超敏反应、药物过敏、昆虫叮咬过敏；炎性肠病，例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、回肠炎和肠炎；阴道炎；牛皮癣和炎症性皮肤病，例如皮炎、湿疹、特应性皮炎、过敏性接触性皮炎、荨麻疹；血管炎；脊椎关节病；硬皮病；呼吸道过敏性疾病，例如哮喘、过敏性鼻炎、过敏性肺疾病等；(2)自身免疫性疾病，例如关节炎(类风湿和牛皮癣)、骨关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、糖尿病、肾小球性肾炎等；(3)移植物排斥反应(包括同种异体移植物排斥反应和移植物抗宿主病)，以及(4)其他需要抑制不希望的炎症反应的疾病(例如动脉粥样硬化、肌炎、中风和头部闭合性损伤、神经退行性疾病、阿尔茨海默氏症、脑炎、脑膜炎等神经系统疾病、骨质疏松症、痛风、肝炎、肾炎、败血症、结节病、结膜炎、耳炎、慢性阻塞性肺疾病、鼻窦炎和白塞病综合症)。
在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗疾病的方法，其中，所述疾病为癌症。在一些实施方式中，所述疾病为乳腺癌、口腔癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌、脑癌、黑素瘤、骨髓瘤、白血病、结肠癌、前列腺癌、食道癌、肝癌、头颈癌、淋巴瘤或转移性癌症。
在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗疾病的方法，疏水核进一步包含治疗药物。本发明的方法可用的治疗药物如上所述。在一些实施方式中，治疗疾病的方法包括选自下组的治疗药物：阿霉素、嘎德莫特和咪喹莫特。在一些实施方式中，治疗疾病的方法包括治疗药物，其中所述治疗药物为咪喹莫特，其还包括施用检查点阻断抗体。
可用于本发明的检查点阻断抗体包括但不限于：抗PD-1、抗PDL1、抗CLTA-4、纳武单抗、派姆单抗、派姆单抗、斯巴达珠单抗(spartalizumab)、阿特珠单抗和伊匹单抗。在一些实施方式中，可用于本发明的检查点阻断抗体为抗PD-1、抗PDL1或抗CLTA-4。在一些实施方式中，检查点阻断抗体为抗PD-1。
在一些实施方式中，本发明提供了一种通过光热疗法治疗疾病的方法，包括以下步骤：向有需要的受试者施用有效治疗量的本发明所述纳米颗粒；将所述受试者暴露在辐射下，从而通过光热疗法实现疾病的治疗。
使用本发明所述纳米载体治疗疾病的方法还包括通过光热疗法治疗疾病，所述方法通常包括向受试者施用本发明所述纳米载体，而后将受试者暴露在某一特定波长的光的辐照下，基于辐照的波长诱导光动力疗法或光热疗法。在辐照或光照后，纳米颗粒为进行光热疗法产生足够的热量。在一些实施方式中，本发明提供了一种通过光热疗法治疗疾病的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本发明所述的纳米载体，并对所述受试者进行辐照，从而实现疾病的光热治疗。在一些实施方式中，所述方法是一种通过光热疗法治疗疾病的方法。
本发明方法用到的辐射包括：电磁辐射、粒子辐射、声波辐射和重力辐射。所述电磁辐射包括但不限于：无线电波、微波、红外线、可见光、紫外线、X射线和伽马射线。
在一些实施方式中，本发明提供了一种通过光热疗法治疗疾病的方法，将受试者暴露于电磁辐射下。在一些实施方式中，本发明提供了一种通过光热疗法治疗疾病的方法，将受试者暴露于近红外光辐射下。
本发明所述纳米颗粒可以施用于受试者以通过光热疗法治疗疾病，其中，所述疾病如本文所述。
在一些实施方式中，本发明提供了一种通过光热疗法治疗疾病的方法，其中，所述疾病为癌症。在一些实施方式中，所述疾病为乳腺癌、口腔癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌、脑癌、黑素瘤、骨髓瘤、白血病、结肠癌、前列腺癌、食道癌、肝癌、头颈癌、淋巴瘤或转移性癌症。
在一些实施方式中，本发明提供了一种通过光热疗法治疗疾病的方法，其中还包括疏水核中的治疗药物。本文上面描述了用于本发明方法的合适的治疗药物。在一些实施方式中，治疗疾病的方法包括治疗药物，治疗药物选自下组：阿霉素、嘎德莫特和咪喹莫特。在一些实施方式中，治疗疾病的方法包括治疗药物，其中，所述治疗药物为咪喹莫特，还包括通过注射施用抗PD-1。
在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗患有病变组织的受试者的方法，所述方法包括：向受试者施用有效量的本发明所述纳米颗粒，使得纳米颗粒集中在病变组织；用第一波长的光照射以确定病变组织；从受试者上移除病变组织，从而治疗受试者。
在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗患有病变组织的受试者的方法，其中，所述方法进一步包括在给药步骤后延迟辐照步骤至少1小时；在给药后步骤延迟辐照步骤至少2小时；在给药步骤后延迟辐照步骤至少3小时；辐照步骤后至少4小时；辐照步骤后至少5小时或辐照步骤后至少6小时。在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗患有病变组织的受试者的方法，其中，所述方法进一步包括给药步骤后延迟辐照步骤至少3小时。
在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗患有病变组织的受试者的方法，其中，本发明还进一步包括用第二波长照射受试者身上剩余的病变组织。在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗患有病变组织的受试者的方法，其中，对受试者的移除步骤和两个辐照步骤在单次操作中完成。
在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗患有病变组织的受试者的方法，其中，第一波长和第二波长各自独立地在紫外光谱区、可见光光谱区和红外光谱区。在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗患有病变组织的受试者的方法，其中，第一波长和第二波长各自独立地在极端紫外光谱区、近紫外光谱区、近红外光谱区、中红外光谱区或远红外光谱区。在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗患有病变组织的受试者的方法，其中，第一波长和第二波长处在近红外光谱区。
在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗患有病变组织的受试者的方法，其中，病变组织是本文所述任何合适的病变组织。在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗患有病变组织的受试者的方法，其中，病变组织为癌症。在一些实施方式中，病变组织为乳腺癌、口腔癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌、脑癌、黑素瘤、骨髓瘤、白血病、结肠癌、前列腺癌、食道癌、肝癌、头颈癌、淋巴瘤或转移性癌症。在一些实施方式中，本发明提供了一种治疗患有病变组织的受试者的方法，其中，病变组织为卵巢癌。
在一些实施方式中，本发明提供了一种成像方法，包括步骤：向有需要的受试者施用有效剂本发明所述纳米颗粒，对所述受试者进行成像。在一些实施方式中，所述纳米颗粒的疏水内核里还进一步包括成像试剂。
典型的成像试剂包括顺磁性试剂、光学探针和放射性核素。顺磁性成像试剂在外场下具有磁性。典型的顺磁性剂包括但不限于：铁颗粒(包括纳米颗粒)。光学探针为荧光化合物，可以通过激发一个波长的辐射和检测第二个不同波长的辐射来检测。可用于本发明的光学探针包括但不限于：Cy5.5、Alexa 680、Cy5、DiD(1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基茚二碳菁高氯酸盐)和DiR(1,1'-二十八烷基-3,3,3',3'-四甲基吲哚并花青碘化物)。其他光学探针包括量子点。放射性核素是经受放射性衰变的元素。可用于本发明的放射性核素包括但不限于：3H、11C、13N、18F、19F、60Co、64Cu、67Cu、68Ga、82Rb、90Sr、90Y、99Tc、99mTc、111In、123I、124I、125I、129I、131I、137Cs、177Lu、186Re、188Re、211At、Rn、Ra、Th、U、Pu和241Am。
V.纳米颗粒的制备方法
在一些实施方式中，本发明提供了一种制备本发明所述纳米颗粒的方法，包括：形成包含多个如本文所述式(I)第一偶联体的反应混合物，其中，偶联体自组装形成纳米颗粒，从而在纳米颗粒的内部形成疏水核，其中，每个偶联体的PEG自组装在纳米颗粒的外部。
在一些实施方式中，本发明提供了一种制备本发明所述纳米颗粒的方法，所述方法还进一步包括多个如本文所述式(II)第二偶联体。
在一些实施方式中，本发明提供了一种制备本发明所述纳米颗粒的方法，其中，水溶液为缓冲溶液。缓冲溶液可以是任何缓冲剂的组合，包括但不限于：柠檬酸、乙酸KH2PO4、CHES、硼酸盐、TAPS、二羟乙甘胺酸(Bicine)、Tris、三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、TAPS、HEPES、TES、MOPS、PIPES、二甲胂酸盐(Cacodylate)和MES。在一些实施方式中，水溶液包括PBS。
在一些实施方式中，本发明提供了一种制备本发明所述纳米颗粒的方法，所述方法还进一步包括声波处理反应混合物。反应混合物可以声波处理约5分钟、10分钟、20分钟、30分钟或1小时。在一些实施方式中，反应混合物声波处理10分钟。
在一些实施方式中，本发明提供了一种制备本发明所述纳米颗粒的方法，其中，水溶液是PBS。所述方法还进一步包括对反应液声波处理10分钟。
在一些实施方式中，本发明提供了一种制备本发明所述纳米颗粒的方法，其中，所述纳米颗粒包含式(I)第一偶联体和式(II)第二偶联体的比例(w/w)约为100:1至1:100、50:1至1:50、25:1至1:25、10:1至1:10或1:1。在一些实施方式中，式(I)第一偶联体与式(II)第二偶联体的比例(w/w)约为100:1、50:1、25:1、10:1或1:1。在一些实施方式中，式(I)第一偶联体与式(II)第二偶联体的比例约为1:1(w/w)。
在一些实施方式中，本发明提供了一种制备本发明所述纳米颗粒的方法，其中，所述纳米颗粒进一步包括多种式(II)第二偶联体，其中，含交联基团的硫醇为半胱氨酸或N-乙酰半胱氨酸。在一些实施方式中，含交联基团的硫醇为半胱氨酸。在一些实施方式中，半胱氨酸经氧化形成交联键。
VI.配方和药物组成
本发明的组合物可以制备成口服制剂、肠胃外和局部剂型等多种剂型。口服制剂包括适合于患者服用的片剂、丸剂、粉剂、糖衣丸、胶囊剂、液体剂、锭剂、扁囊剂、凝胶剂、糖浆剂、浆剂和混悬剂等。本发明所述的组合物也可以通过注射给药，即静脉内、肌内、皮内、皮下、十二指肠内或腹膜内给药。同样，本文所述的组合物可以通过吸入例如鼻内进行给药。另外，本发明所述的组合物可以经皮肤给药。本发明所述的组合物还可以通过眼内、阴道内和直肠内途径给药，剂型包括栓剂、吸入剂、粉末和气雾剂(例如，类固醇吸入剂，参见Rohatagi，《临床药理学杂志(J.Clin.Pharmacol.)》.35：1187-1193，1995；Tjwa，《过敏性哮喘和免疫学年鉴(Ann.Allergy Asthma Immunol)》.75：107-111，1995)。因此，本发明还提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体或赋形剂以及本发明所述组合物。
为了制备含有本发明所述化合物的药物组合物，药学上可接受的载体可以是固体或液体。固体制剂包括粉末、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒剂。固体载体可以是一种或多种物质，亦可以用作稀释剂、调味剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包囊材料。科学和专利文献对有关配制和给药技术的具体细节给出了详尽地描写，例如参见马克出版公司最新出版的《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences,MaackPublishing Co,Easton PA("Remington's"))。
在粉剂中，载体是一种精细分离的固体，其与精细分离的活性成分混合在一起。在片剂中，活性成分与具有一定粘合性能的载体按合适的比例混合，然后压制成所需的形状和尺寸。优选地，粉剂和片剂包含5％或10％至70％的本发明所述组合物。
合适的固体赋形剂包括但不限于：碳酸镁；硬脂酸镁；滑石；果胶；糊精；淀粉；黄芩胶；低熔点蜡；可可脂和碳水化合物；糖类包括但不限于：乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇，或玉米、小麦、水稻、马铃薯等其他植物的淀粉；纤维素，如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠，以及黏胶类包括阿拉伯胶和黄芩胶；蛋白质类包括但不限于：明胶和胶原蛋白。如果需要，可以加入崩解剂或增溶剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐，例如海藻酸钠。
糖丸类药物外层具有恰当的包衣，例如浓缩糖溶液，其中还可能含有阿拉伯树胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆以及合适的有机溶剂或溶剂混合物。可在片剂或糖丸包衣中加入染料或颜料以便区分产品或表征活性化合物的含量(即剂量)。本发明所述药物制剂也可口服使用，例如由明胶制成硬胶囊，和由明胶和甘油或山梨醇等组成的包衣制成的软封胶囊。硬胶囊包含本发明所述化合物，混合填料或粘合剂，例如乳糖或淀粉，润滑剂，如滑石粉或硬脂酸镁，选择性地加入稳定剂。在软胶囊中，本发明所述组合物溶解或悬浮在适当的液体中，例如脂肪油、液体石蜡、带稳定剂的液体聚乙二醇及不带稳定剂的液体聚乙二醇。
对于制备栓剂，首先熔融低熔点蜡，例如脂肪酸甘油酯或可可脂熔融液，同时在搅拌下将本发明的组合物均匀地分散在其中，然后将熔融的均质混合物倒入常规尺寸的模具中，使其冷却，固化。
液体制剂包括溶液、悬浮液和乳状液，例如水或水/丙二醇溶液。对于肠胃外注射，可以用聚乙二醇水溶液配制液体溶剂。
要制备适于口服的水溶液，可以将本发明所述组合物溶于水中，按需加入适宜的着色剂、香料、稳定剂和增稠剂。要制备适于口服的水性悬浮液，可以将精细分离的活性成分分散在具有粘性物质的水中，所述粘性物质包括天然或合成树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄芩胶和阿拉伯树胶，以及分散剂或润湿剂，例如天然存在的磷脂(例如卵磷脂)，环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)，环氧乙烷与长链脂族醇(例如，十七碳烯氧基鲸蜡醇)的缩合产物，环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物(例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)或环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯)。水性悬浮液还可包含一种或多种防腐剂，例如乙基或正丙基对羟基苯甲酸酯、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂，例如蔗糖、阿斯巴甜或糖精。配方可以根据渗透压进行调节。
同样适于口服的还包括固体形式的制剂，仅需在口服前，将固体形式的制剂转化为液体形式制剂。所述的液体形式包括溶液、悬浮液和乳浊液。这些制剂除了包括活性成分，还包括着色剂、调味剂、稳定剂、缓冲剂、人工和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。
要制备油性悬浮液，将本发明所述化合物悬浮与植物油，例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油；或矿物油，例如液体石蜡；或上述油的混合物中。油性悬浮液可以添加增稠剂，如蜂蜡、硬石蜡或十六醇。也可添加甜味剂制备口味适宜的口服制剂，例如甘油、山梨醇或蔗糖。这些制剂可以通过添加抗坏血酸等抗氧化剂来保存。有关可注射油性载体的例子，参见Minto,《药理学与实验治疗学杂志(J.Pharmacol.Exp.Ther)》.281:93-102,1997。本发明的药物制剂也可以是水包油乳剂的形式。油相可以是上述的植物油或矿物油或两者的混合物。适宜的乳化剂包括天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶和黄芩胶；天然存在的磷脂，例如大豆卵磷脂；衍生自脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如山梨醇酐单油酸酯，以及上述偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨醇单油酸酯。如制备糖浆和药水那般，乳状液中可添加甜味剂和调味剂。乳状液中也可添加缓和剂、防腐剂或着色剂。
本发明所述组合物可制成体内缓释微球。例如，微球可以通过皮内注射含药微球的方式进行给药，在皮下缓慢释放(参见Rao,《生物材料科学聚合物版(J.BiomaterSci.Polym.Ed)》.7:623-645,1995)；或制成生物降解的可注射凝胶制剂(参见Gao，《药学研究(Pharm.Res)》.12:857-863,1995)；或将微球制成口服制剂(参见Eyles,《药学与药理学杂志(J.Pharm.Pharmacol)》.49:669-674,1997)。无论是透皮给药法还是皮内给药法都能持续递送数周或数月。
在一些实施方式中，本发明所述组合物可制备成非肠道给药制剂，例如静脉内(IV)给药、体腔或器官腔内给药。给药制剂通常是将本发明所述组合物溶解在药学上可接受的载体里形成的溶液。可接受的载体和溶剂有水和林格氏溶液，即等渗氯化钠。另外，无菌固定油通常可用作溶剂或悬浮介质。因此，包括合成单甘油三酯和双甘油三酯在内的所有温和的固定油均可用作溶剂或悬浮介质。此外，油酸等脂肪酸也可用于制备注射剂。这些溶液是无菌的且通常不含有害物质。这些制剂可以通过常规、众所周知的灭菌技术进行灭菌消毒。所述制剂可包含医药上可接受的辅料，如近似生理条件所需的pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。本发明所述组合物在上述制剂中的浓度的选择范围很大，且主要根据体液量、粘度、体重等来选择，还根据特定的给药方式和病人的需求进行选择。对于IV给药，制剂可以是无菌注射制剂，例如无菌注射水性或油性悬浮液。悬浮液可以根据已知技术运用合适的分散剂或润湿剂或悬浮剂来配制。无菌注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中制备的无菌注射溶液或悬浮液，例如1，3-丁二醇的溶液。
在一些实施方式中，本发明所述组合物的制剂可通过脂质体递送到人体，脂质体与细胞膜融合或被内吞，即，应用与脂质体粘连的配体或直接与寡核苷酸粘连，与细胞表面膜蛋白受体连接，发生内吞作用。通过使用脂质体，尤其是表面具有特定靶细胞配体的脂质体，或是优先指向某个特定器官的脂质体，可以将本发明所述组合物递送至活体靶细胞处(参见Al-Muhammed,《微囊化杂志(J.Microencapsul)》.13:293-306,1996；Chonn,《生物技术现状(Curr.Opin.Biotechnol.)》:698-708,1995；Ostro,《美国医院药学杂志(Am.J.Hosp.Pharm.)》46:1576-1587,1989)。
VII.给药方法
本发明所述组合物可以通过任何合适的方式给药，包括口服/肠胃外和局部方法。用局部透皮给药的方法可以配制涂药棒、溶液、悬浮液、乳剂、凝胶剂、乳膏、软膏、糊剂、胶冻剂、涂剂、粉剂和气雾剂。
药物制剂优选单元剂型。单元制剂在制备过程中，首先将制剂细分为含有适量本发明所述组合物的单元剂量。单元剂型可以是包装制剂，该包装含有离散量的制剂，例如包装的片剂、胶囊剂和小瓶或安瓿中的粉剂。同样，单元剂型本身可以是胶囊、片剂、扁囊剂或锭剂，或者是上述任意形式制剂组合的包装制剂。
本发明所述化合物可以是任意合适的量，或取决于各种因素，包括但不限于受试者的体重、年龄或疾病状态等。适用于本发明所述化合物的剂量范围包括约0.1mg至10,000mg、1mg至1000mg、10mg至750mg、25mg至500mg、50mg至250mg。适用于本发明所述化合物的剂量包括1mg、5mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg或1000mg。
本发明所述化合物可以按任意合适的频率、间隔或时间段给药。例如，为了达到优选的剂量水平，本发明所述化合物的给药频率可以是一小时一次、两次、三次或多次；也可以是一天一次、两次、三次或多次；或是每2天、3天、4天、5天、6天或7天给药一次。当本发明所述化合物每天的给药频率大于一次时，代表性的给药时间间隔包括5min、10min、15min、20min、30min、45min或60min；也可以是1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、16h、20h或24h。本发明所述化合物的给药频率可以是1h内、1至6h内、1至12h内、1至24h内、6至12h内、12至24h内、一天内、1至7天内、一周内、1至4周内、一个月内、1至12个月内、一年或几年内、甚至无限期给药1次、2次和3次。
本文所述组合物也含有其他相容的治疗剂。本文所述的化合物可以相互组合，也可与其他活性试剂组合，或与其他辅助剂联用，所述辅助剂可能无法单独发挥作用，但可能有助于活性试剂的功效。
本发明所述化合物可以同另一个活性剂共给药(co-administered)。共给药包括本发明所述化合物和活性试剂的给药间隔为0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、20或24h。共给药还包括同时或近乎同时(间隔时间为1、5、10、15、20或30min)或不分先后顺序施用本发明所述化合物和活性试剂。此外，为了达到每日优选的剂量水平，本发明所述化合物和活性试剂可分别每天给药1次、2次、3次或多次。
在一些实施方式中，共给药可以通过共制剂(co-formulation)实现，即，制备一个既含有本发明所述化合物又含有活性成分的单一药物组合物。在一些实施方式中，本发明所述化合物和活性成分可单独配制。
本发明所述的化合物和活性剂可以以任何合适的重量比(w/w)存在于本发明的组合物中，例如约从1：100至100：1、1:50至1:50、1:25至25：1、1:10至10：1、或1：5至5：1(w/w)。本发明所述的化合物和其他活性剂可以以任何合适的重量比(w/w)存在，例如约1：100(w/w)、1：50、1：25、1：10、1：5、1：4、1：3、1：2、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、10：1、25：1、50：1或100：1(w/w)。本发明所述化合物和活性剂的其他剂量和剂量比适用于本发明的组合物和方法。
VIII.实施例
结果
CPCI-NP的设计与制备：为了赋予材料光热特性，首先合成了高度稳定的疏水性光热转化剂吲哚菁绿衍生物(ICGD)，并将其引入到末端树枝状共聚物体系中(图9)。1H NMR和ESI质谱测试如图10a，10b和10c所示，确定了ICGD的化学结构。从UV–vis吸收光谱来看，在甲醇溶剂中，ICGD在500至900nm范围内显示出较宽的吸收带，呈现两个吸收峰。一个肩峰在720nm附近，另一个肩峰在近红外785nm附近(图2b)。在甲醇溶剂中，808nm红外光激发下，获得ICGD的荧光发射光谱峰值为835nm。经羧酸基团修饰后，四个ICGD分子单元可轻松接枝到PEG5k-CA4-末端树枝状共聚物上，得到PEG5K-CA4-ICGD4(PCI)-末端树枝状共聚物，其分子量经MALDI-TOF质谱检测确定为10,430Da(图11a和11b)。在甲醇中，PCI末端树枝状共聚物的吸收和荧光发射几乎与甲醇的单个ICGD分子的吸收和荧光发射相同，表明ICGD已成功引入到PCI上(图2b，图13a)。
两亲性PCI末端树枝状共聚物自组装成尺寸(～30nm)均匀的热力学稳定纳米颗粒(PCI-NP)，动态光散射(DLS)和透射电子显微镜(TEM)图像(图2c)验证了这一结果。考虑到π-π相互作用和强疏水性，ICGD和CA很容易自组装成高度有序的结构，形成PCI-NP的疏水核。如图13b所示，PCI-NP在PBS中的UV–vis吸收比PCI末端树枝状共聚物在甲醇中的UV–vis吸收更宽，且稍有红移，表明ICGD是自组装的。与此同时，在PBS溶液中，PCI-NP中ICGD的荧光强度很弱(激发波长：808nm)，可能与聚集引起的猝灭效应有关，进一步表明ICGD自组装成高度有序的结构。胶束解离后荧光的恢复进一步证实了这一解释。在PCI-NP的PBS溶液中加入强离子洗涤剂十二烷基硫酸钠(SDS；最终浓度为2.5mg mL-1)，PCI-NP分解，ICGD在835nm处的荧光强度显著增强(图13c)。
为了改善PCI-NP在体内研究中的稳定性，将含半胱氨酸的末端树枝状共聚物(PEG5k-Cys4-L8-CA8,PCLC)和PCL末端树枝状共聚物按合理的的重量比(1:1)共-自组装形成二硫交联的杂交纳米颗粒，生成CPCI-NP。如图12a和12b所示，在PCLC末端树枝状共聚物(Mn≈12000)的骨架上引入了8个CA和4个半胱氨酸单元。半胱氨酸上的硫醇基团在NPs的疏水内部里氧化形成二硫键，就像捆扎绳索，可提高NPs的密度和稳定性。如DLS和TEM图所示(图2d)，在这种组合设计下，CPCI-NP的尺寸比PCI-NP小(即20±6nm vs.30±8nm)。这是利用增强的渗透和保留(EPR)效应，在肿瘤内实现有效积累的理想粒径。当溶液中纳米颗粒干扰剂SDS的最终浓度达2.5mg mL-1时，测量PCI-NP和CPCI-NP的稳定性。如图2e所示，PCI-NP粒子信号的瞬间消失<10s)表明非交联PCI-NP具备独特的动态缔合解离特性。与此成鲜明对比，在SDS存在下，CPCI-NP的粒径仍然保持在20左右，表明这种交联NP具有高度的稳定性。另外，当溶液中存在SDS且细胞内有还原性谷胱甘肽(GSH)(～10mM)时，CPCI-NP的粒径信号快速消失，表明CPCI NP因二硫键被GSH切断而发生解离。与PCI-NP类似的是，CPCI-NP中ICGD(激发波长：808nm)的荧光也快速淬灭。在没有GSH的SDS溶液中或有GSH的PBS溶液中，CPCI-NP溶液的荧光强度略有增加，因为GSH(～10mM)或SDS(2.5mg mL-1)在单独存在下，不能分解交联的NP。但是，如图15d所示，相比于PBS中完整形态的CPCI-NP胶束，当SDS和GSH同时存在时，CPCI-NP溶液在峰值为835nm处的荧光强度增强了100倍。
CPCI-NP的光热性能：用强度为0.8W cm-2的808nm激光辐照PBS中的CPCI-NP和PCI-NP，通过定量测量CPCI-NP和PCI-NP的温度变化，评估其光热转化性能；用聚乙二醇(PEG)修饰的金纳米棒(GNRs)作为对照。如图2f所示，CPCI-NP溶液和PCI-NP溶液的温度均在最初的60s内有明显的上升，其中，CPCI-NP的温度升到了64.5℃，PCI-NP的温度升到了56.6℃。继续激光照射300s后，CPCI-NP溶液和PCI-NP溶液的温度到达一个稳定值，在同一ICGD浓度下，CPCI-NP溶液的温度为78.5℃，比具有相同浓度的ICGD的PCI-NP溶液的温度高10.5℃。GNRs的最高温度为51.2℃，与先前报道的其他金纳米结构的温度相似。根据先前报道的步骤，计算得出CPCI-NP在808nm处的光热转换效率(η)为30.6％，高于PCI-NP的24.3％和GNRs的18.1％。结果表明，CPCI-NP的光热转换效率比GNRs更高。而后，通过交替加热和冷却NPs溶液来研究CPCI-NP和PCI-NP的光热稳定性，并与FDA批准的光热剂吲哚菁绿(ICG)进行比较。结果发现即使经过五次808nm激光照射，CPCI-NP仍能保持强大的光热效率(图2g)，其稳定性略高于PCI-NP，远高于ICG的PBS溶液。同样，与PCI-NP相比，CPCI-NP具有更高的稳定温度和更快的升温速率。CPCI-NP所具备的高光热转换效率和高稳定性可能源于强π-π相互作用以及交联诱导的ICGD的密集组装(图2c，2d)。
为了进一步研究CPCI-NP的高光热转换效率，探究了不同浓度的PCI-NP和CPCI-NP在组装和分解状态下荧光强度的变化。如图3a和3b所示，由于NPs内核中ICGD荧光的自淬灭，胶束PCI-NP和CPCI-NP在PBS中的荧光强度很弱。相反，加入SDS解离后，PCI-NP和CPCI-NP的荧光强度显著增强。另一方面，PCI-NP和CPCI-NP的光热转换的测量结果显示出完全相反的性质，即胶束形式具有高光热转换效率，解离形式具有低光热转换效率。ICGD在胶束PCI-NP或CPCI-NP中的紧凑结构使得PCI-NP或CPCI-NP在808nm激光照射下产热高(图3c和3d)。值得注意的是，CPCI-NP的荧光强度比PCI-NP的荧光强度弱(如320vs.800，PCI浓度为10μM)，但是，CPCI-NP的光热转化效率(温度)比同浓度PBS溶液中PCI-NP的光热转化效率更高(如69.6℃ vs.58.2℃，PCI浓度为10μM，图3e和3f)，表明CPCI-NP中ICGD的结构能够更高效地将激发态能量转化为热能，而不是荧光。这些结果表明稳定紧实的胶束结构对光热转化剂的热转化起着至关重要的作用。
考虑到CPCI-NP是在体内使用，用2mm厚的牛肉切片作为光的替代组织屏障，在体外测量组织深度和808nm激光照射下CPCI-NP的温度的关系。将传统ICG与TBAI络合后，物理封装进PCLC末端树枝状共聚物中，作为对照物。如图3g和3h所示，用强度为0.8W cm-2的808nm激光透过2mm厚的牛肉切片辐照CPCI-NP和PCLC/TBAI&ICG-NPs30 s，CPCI-NP和PCLC/TBAI&ICG-NPs温度分别达到70℃和50℃。当牛肉切片的厚度增加到4mm时，PCLC/TBAI&ICGNPs的温度降到不足40℃。相反，即使牛肉切片的厚度增加到6mm，CPCI-NP的温度也能达到45℃左右。因为正常人皮肤的厚度通常不足4mm，面部皮肤的厚度通常不足2mm，CPCI-NP光热疗法有望用来治疗原发性皮肤癌(包括黑色素瘤)。这种纳米系统优异的光热性能源自其高的近红外吸收率、优异的光热转换效率、较快的发热能力和优异的光稳定性。
CPCI-NP的DOX装载能力：上文表明封装阿霉素能够与卟啉纳米载体光疗法产生协同作用。基于末端树枝状共聚物胶束纳米载体的制备经验，CPCI-NP可以成为装载阿霉素(DOX)的优良载体(图4a)。如图14a所示，当DOX浓度为0.5mg mL-1时，CPCI-NP的DOX的药物封装效率达100％。当DOX浓度上升至3mg mL-1时，封装效率仍超过70％，而粒径保持在～20nm，证实CPCI-NP具有优异的载药能力。CPCI/DOX-NP在37℃水溶液中表现出良好的血清稳定性。加入10％胎牛血清(FBS)后，中性溶液中CPCI/DOX-NP的粒径在96h的实验过程中也不会变化(图4b)。相应地，在一定的刺激下，CPCI/DOX-NP可以可控地释放DOX。由于封装DOX分子的荧光猝灭，CPCI/DOX-NP PBS溶液中的DOX荧光信号较弱。但是，因为二硫键断裂导致DOX释放，所以GSH(～10mM)中的DOX的荧光强度更高。用808nm(0.8W cm-2)激光照射GSH中的CPCI/DOX-NP 5min，可以进一步增强DOX的荧光强度(图4c)。DOX定量释放实验也呈现了类似的结果。如图4d所示，从CPCI/DOX-NP中释放的DOX展现了典型的GSH和光响应释放曲线。在没有GSH和808nm激光照射时，DOX在PBS中的释放速度非常慢(4h后释放5.1％，24h后释放不到11％)。在溶液加入GSH(～10mM)，24h后，DOX的释放量增加到30％。值得注意的是，任何时候只要有激光辐照，都可以极大地提高DOX的释放量，当暴露在GSH(～10mM)中，继而进行808nm(每次2min)激光辐照，CPCI/DOX-NP中DOX的总释放量在24h后，可以提高到55％。DOX释放量的增多大概率是因为S-S键在GSH还原条件下的断裂，外加激光光热转换引起的局部热疗，两者均可加速交联NPs中DOX的扩散。在大部分CPCI/DOX-NP到达肿瘤区域后，利用GSH(或N-乙酰半胱氨酸)-和光响应型药物的按需释放减少化疗药物对正常组织的副作用，增强肿瘤部位的细胞毒作用。
CPCI/DOX-NP的细胞摄取和体外抗肿瘤活性：用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察OSC-3口腔癌细胞中CPCI/DOX-NP的摄取和分布。共聚焦荧光显微图像清楚地显示了DOX和CPCI-NP在细胞内的分布状况(图4e)。在孵育6h后，ICGD的绿色荧光信号大部分出现在细胞质中。相反，此时DOX的荧光主要出现在细胞核内，由于DOX的红色荧光和4'，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)的蓝色荧光重叠，细胞核呈粉红色。这一结果表明，CPCI/DOX-NP能快速被癌细胞摄取，并且包封的DOX在短时间内释放到细胞核内进行DNA插入。
用MTS法评估CPCI/DOX-NP对OSC-3细胞的化疗/光热协同治疗效果。如图4f所示，在培养12h后，高浓度(200μg mL-1)CPCI-NP在无激光照射下对细胞的毒性可忽略。然而，用强度为0.8W cm-2的808nm近红外光辐射2min，发现随着CPCI-NP浓度的增加，OSC-3细胞的活力显著降低。当CPCI-NP浓度为200μg mL-1时，细胞存活率小于5％，说明CPCI-NP的光热效应能有效杀伤癌细胞。用浓度为50μg mL-1的CPCI-NP进一步研究CPCI-NP的化疗/光热协同治疗效果。在无激光辐照下，单独使用较低浓度CPCI/DOX-NP，只有45％的细胞被杀死。与此形成鲜明对比的是，在808nm激光辐照下，用CPCI/DOX-NP可以杀死85％以上的细胞，比游离DOX(细胞存活率为61％)或808nm激光照射下的CPCI-NP(细胞存活率为46％)的治疗效果更好(图5g)。用绿色荧光DiO和红色荧光碘化丙啶(PI)共同染色活/死细胞。如图4h所示，施用CPCI/DOX-NP并用808nm激光辐照后，大多数细胞凋亡/死亡，并被碘化丙啶(PI)染色呈红色荧光，而在其他对照组中仍能观察到大量呈现绿色荧光的活细胞。通过计算联用指数确定联合治疗效果。结果显示，随着DOX和CPCI-NP浓度的增加，DOX和CPCI-NP+光在体外对肿瘤细胞具有良好的协同杀伤作用(图4i和4j)。通过Annexin-FITC/PI法揭示上述协同作用对OSC-3细胞的作用是否可能导致细胞凋亡增强。如图17所示，808nm激光辐照和CPCI-NP均无明显的促凋亡作用。相比之下，无激光辐照的CPCI/DOX NPs和有激光辐照的CPCI-NP均能促进细胞凋亡，凋亡率分别为27.39％和27.31％。用CPCI/DOX-NPs和激光辐照联用后，细胞凋亡率进一步提高到51.1％，与MTS结果一致。
CPCI/DOX-NP的生物分布和药物递送：通过体外实验证明CPCI/DOX-NP与808nm激光辐照联用具有协同作用，并对其在动物肿瘤模型中的疗效进行了评价。为了研究CPCI-NP的潜在的毒性，给健康Balb/c小鼠静脉注射三种剂量(50、100和200mg kg-1，基于末端树枝状共聚物)的CPCI-NP，并在第1天和第3天采集血液进行血清化学和血液计数分析。第1天和第3天的白细胞(WBC)、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞分布宽度(RDW)、血小板以及平均血小板体积(MPV)均正常(图15)。类似地，肝功能测试(丙氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、天冬氨酸转氨酶、胆红素)、肾功能测试(血尿素氮、肌酐)和其他血液化学测试(白蛋白、总蛋白、胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白和甘油三酯)均正常(图16)，表明无明显肝肾毒性。可以得出CPCI-NP是一种生物相容性很好的光热转化纳米制剂，且对小鼠无明显副作用。由于CPCI-NP是通过二硫键交联的，因此在血液循环中，CPCI-NP能相对保持稳定。在SD大鼠体内，对游离ICG、由含有末端树枝状共聚物的PCLC半胱氨酸共封装(co-encapsulated)的ICG和TBAI(PCLC/TBAI&ICG NPs)和CPCI-NP的药代动力学研究进行了比较。如图5a所示，亲水性游离ICG迅速扩散到组织中，并在静脉给药后30分钟内从血液循环中清除(t1/2＝5.22分钟；AUC＝12.091mg/L*h)。在静脉注射48小时后，发现血液中PCLC/TBAI&ICG NPs的ICG浓度降至每克组织注射剂量的9.4％(％ID g-1)(t1/2＝28.421；AUC＝677.571mg/L*h)。相反，CPCI-NP中ICGD有约20.4％ID g-1仍在血液循环中(t1/2＝41.098；AUC＝1196.274mg/L*h)，表明ICGD和CPCI-NP具有很高的稳定性。
CPCI/DOX-NP的粒径约为20nm(图2d)，这是肿瘤靶向和穿透的最佳粒径。由于CPCI/DOX-NP的尺寸相对较小、交联性质可逆和结构相关近红外荧光特性独特，因此CPCI/DOX-NP特别适合用作可激活的光学纳米探针，通过血液中的背景抑制以及肿瘤部位的优先聚集和信号放大来改进癌症检测。图4c是携带原位OSC-3口腔癌的裸鼠在静脉注射(i.v.)CPCI/DOX-NP(DOX:1.25mg kg-1，PCI末端树枝状共聚物：12.5mg kg-1和PCLC末端树枝状共聚物：12.5mg kg-1)后的近红外荧光图像。图像显示肿瘤部位ICGD的荧光信号(由绿色荧光蛋白(GFP)指示)具有时间相关性，并在CPCI/DOX-NP注射36h后达到峰值(图5c)。在注射后48h，肿瘤部位的强荧光没有明显衰减，表明CPCI/DOX-NP在肿瘤中持续聚集，这意味着在体内启动光疗具有很宽的时间窗。在注射48h后，收集以主要器官和肿瘤的体外成像为基础的半定量生物分布，表明肿瘤对CPCI/DOX-NP的高摄取(图5d和5f)。同时在荧光显微镜下观察肿瘤组织切片，进一步证实CPCI/DOX-NP在肿瘤组织中的聚集。如图5e所示，绿色ICGD荧光信号和红色DOX荧光信号在肿瘤区域同时出现。
对携带OSC-3口腔癌的裸鼠经尾部静脉给药CPCI/DOX-NP后，DOX随时间的组织分布进行测定。分别在注射24h、48h和5d后，用高压液相色谱-质谱法(HPLC-MS)测定肿瘤及正常器官中DOX的浓度。如图5g所示，在CPCI/DOX-NP给药24h后，观察到DOX在肿瘤处、肝脏甚至肾脏处有明显积累。但是，DOX在肝脏和肾脏中的累积浓度随着时间的推移而迅速清除，尤其是5d后。更令人兴奋的是，在CPCI/DOX-NP注射5天后，肿瘤部位的DOX浓度在每克组织中仍高达约2μg g-1，这可以解释其下述抗肿瘤作用。DOX通常用于治疗许多不同的癌症；心脏中毒和骨髓功能抑制是这一非常重要的药物的剂量限制性毒副作用。幸运的是，如图5e和5g所示，ICGD的荧光强度和DOX在心脏中的浓度极低，表明CPCI/DOX-NP在心脏中的积聚量少，DOX在心脏处的释放量低。这项非常重要的特性是未来CPCI/DOX-NP用于临床所需要的。
基于CPCI/DOX-NP的体内光热/化学疗法的协同作用：由于CPCI/DOX-NP体系具有良好的生物分布和体外抗肿瘤活性，接下来对携带原位口腔癌的裸鼠进行了疗效研究。首先，研究了CPCI/DOX-NP在体内的光热效果。在给小鼠全身给药PBS、PCI-NP、CPCI-NP或CPCI/DOX-NP 24小时后，用强度为0.8W cm-2的808nm激光辐照小鼠肿瘤区2min。如图6a和6b所示，激光辐照后，CPCI-NP组和CPCI/DOX-NP组肿瘤辐照部位的平均温度均升高了约50℃，比PCI-NP组(△T≈36.5℃)高约1.37倍，比PBS组(△T≈5.6℃)高8.92倍。这种大幅的升温足以对癌细胞造成不可逆转的损害。值得注意的是，CPCI-NP组或CPCI/DOX-NP组在肿瘤部位快速升温40℃以上仅需45秒，与体外快速升温试验一致。这些结果清楚地表明，CPCI/DOX-NP能有效地吸收近红外光能，并在体内转化成局部热能进行光热治疗。
探究这些光热转化剂对携带原位OSC-3细胞口腔癌裸鼠的治疗效果。将小鼠随机分成5组：(1)PBS，(2)游离DOX，(3)PCI-NP，(4)CPCI-NP和(5)CPCI/DOX-NP。每组均用强度为0.8W cm-2的808nm近红外激光辐照2min。动物实验设计如图6c所示，当肿瘤体积达到约50mm3时，经尾静脉给小鼠注射CPCI/DOX-NP。在注射24h和48h(即第2天和第3天)后，将肿瘤部位暴露在强度为0.8W cm-2的808nm激光下辐照2min。随后，第7、8、9天重复相同的治疗方案(施用光热转换剂后进行光照)。如图6d所示，PCI-NP组、CPCI-NP组和CPCI/DOX-NP组在治疗后10天内展现出了令人满意的抗肿瘤作用。但是，治疗10天后，PCI-NP组和CPCI-NP组中肿瘤又开始在原发地生长。相较而言，经CPCI/DOX-NP联合激光照射治疗的动物，其体内的肿瘤得到完全缓解，证实了光热/化疗的协同治疗效果。图5e显示CPCI/DOX-NP与激光辐照联合治疗的小鼠的照片。在第28天没发现肿瘤。另外，治疗后，小鼠的体重没有显著的变化(图18)。组织学分析进一步证实大多数肿瘤细胞经CPCI/DOX-NP与激光辐照联合治疗后被杀死，并且与其他组相比，肿瘤切片的细胞核多态性水平更低，癌细胞密度低(图6f)。
基于CPCI/咪喹莫特-NP的体内光热/免疫疗法的协同作用：上文提到的实验结果清楚地表明CPCI/DOX-NP是一种高效的光疗法，且治疗位置要易于光照。但是，癌症通常伴随着复发和转移，且绝大多数癌症死亡是因为癌症转移。在过去几年间，虽然不同类型肿瘤的治疗效果不尽相同，但结合检查点阻断抗体的免疫疗法在临床上展现了广泛的前景。咪喹莫特是一种与Toll样受体7结合的免疫反应调节因子，已获FDA批准，用于生殖器疣、浅表性基底细胞癌和光化性角化病的外部治疗。但是咪喹莫特毒性太大，不能全身给药。由于CPCI-NP具有优异的封装性能且具有极高的药物封装能力，因此可以将咪喹莫特载入CPCI-NP内核中(咪喹莫特浓度：0.5mg mL-1)，同时将纳米颗粒尺寸保持在理想状态22±4nm，便于EPR效应中肿瘤积累(图7b)。基于新型CPCI/咪喹莫特-NPs光热/免疫疗法与PD-1检查点阻断疗法相结合，可增强转移性肿瘤的抗肿瘤协同治疗效果(图6a)。
细胞实验的设计路线如图7c。将4T1细胞原位注射到同一个免疫活性小鼠的左右乳腺脂肪垫中，建立了转移瘤的人工模拟转移性肿瘤模型(双侧乳腺肿瘤模型)。将左侧肿瘤指定为原发肿瘤，用激光辐照治疗；将右侧肿瘤定为远端肿瘤或转移性肿瘤，不用激光辐照治疗。将小鼠随机分为7组：(每组6只)：(1)PBS(不做治疗)；(2)用CPCI/咪喹莫德-NP进行两轮治疗；(3)用CPCI-NP联合激光辐照进行两轮治疗；(4)用CPCI/咪喹莫德-NP联合激光辐照进行两轮治疗；(5)CPCI/咪喹莫德-NP结合抗-PD-1进行两轮治疗；(6)CPCI/咪喹莫德-NP与抗-PD-1和激光辐照联用进行一轮治疗；(7)CPCI/咪喹莫德-NP与抗-PD-1和激光辐照联用进行两轮治疗。在第七组中，当肿瘤体积达到50mm3，将CPCI/咪喹莫德-NP溶液经尾部静脉注射进小鼠体内。在注射24h后，用强度为0.8W cm-2的808nm激光辐照原发肿瘤部位2min。随后，在第2天对小鼠腹腔注射抗-PD-1(α-PD-1)，剂量为200μg只-1。之后，在第6、7和8天重复进行第二轮治疗(i.v.注射CPCI/咪喹莫德-NP，肿瘤部位激光辐照，i.p.注射α-PD-1)。每隔一天用卡尺测量各组原发肿瘤和远端肿瘤的生长情况。如图7d所示，在所有经808nm激光辐照的小组中，原发肿瘤几乎均被基于CPCI-NP的早期光热疗法消除。由于缺乏后续治疗，例如第二次激光辐照或缺乏咪喹莫德或α-PD-1免疫效应，对照组3、4、6经激光照射后肿瘤轻度复发。值得注意的是，第5组(CPCI/咪喹莫德-NP联合抗-PD-1)对原发肿瘤的生长有一定的抑制作用，但不经激光照射不能消除肿瘤。与之相反，CPCI/咪喹莫德-NP联合α-PD-1(第7组)进行两轮联合治疗的疗法能在最早的16天内明显消除原发肿瘤而不复发，表明这种非特异性的联合免疫疗法在肿瘤治疗中是有效的。
另一方面，如图7e所示，对于用基于CPCI/咪喹莫德-NP的光热疗法治疗原发肿瘤的小鼠，其远端肿瘤的生长也被部分延迟。尤其是第7组，其远端肿瘤几乎全消失了，获得的疗效远好于第5组(用CPCI/咪喹莫德-NP联合α-PD-1治疗原发肿瘤，不含PTT)，表明原发肿瘤的光热疗法对远端肿瘤也具有明显的抑制效果。第7组小鼠治疗后体内原发肿瘤和远端肿瘤体积变化的代表图(图7f)。作为另一对照组，第4组(用基于CPCI/咪喹莫德-NP的PTT联合α-PD-1阻断治疗原发肿瘤)引发的免疫应答明显优于第3组(未加咪喹莫德)，说明咪喹莫德对NP引发强免疫应答具有重要作用。最后但同样重要的是，第4组(未使用α-PD-1)或第6组(α-PD-1仅治疗1轮)中基于CPCI/咪喹莫德-NP的光热疗法引发的原发肿瘤的免疫应答仅能抑制早期继发性肿瘤的生长，表明α-PD-1阻断治疗策略在激活T细胞识别肿瘤细胞，并持续杀死肿瘤细胞中扮演着重要作用。进一步探讨基于CPCI/咪喹莫德-NP的光热疗法联合α-PD-1协同抗肿瘤作用的机制。在实验中，将小鼠分成4组，进行1轮治疗(第1组：PBS；第2组：CPCI/咪喹莫德-NP；第3组：CPCI/咪喹莫德-NP与激光辐照联用；第4组：CPCI/咪喹莫德-NP与激光辐照和α-PD-1联用；每组6只小鼠)。处死小鼠，收集原发肿瘤和远处肿瘤的残留组织进行H&E染色、RT-PCR和IHC检测。H&E染色直接显示第3组和第4组原发肿瘤细胞大面积破坏和凋亡，远端肿瘤也因免疫治疗效果应答而缩小，与对照组1和2形成鲜明对比(图7g)。咪喹莫特是一种强效TLR7激动剂，可通过TLR-7分泌细胞因子(IFN-α、IL-6和TNF-α)激活自然杀伤细胞、巨噬细胞和B淋巴细胞，进一步增强免疫应答。通过RT-PCR对IFN-α、TNF-α、IL4、IL6(细胞免疫相关标记物)和IL-12(天然免疫标记物)基因表达进行了评估。如图7h所示，这些免疫标记物在激光辐照的原发肿瘤组织中的相对表达均高于未经激光辐照的原发肿瘤组织，证明PTT通过从切除的肿瘤细胞残基中产生肿瘤相关抗原来诱导强烈的肿瘤特异性免疫反应。另外，这些免疫标记物在远端肿瘤中的相对表达证明光照对原发肿瘤的重要性(第3组和第4组)。细胞毒性T淋巴细胞(CD8+)可直接杀伤靶肿瘤细胞，同时，CD3+和CD4+辅助性T细胞在适应性免疫调节中也发挥着重要作用。证实这些蛋白(CD8+、CD3+、CD4+和PD-1)在肿瘤两侧均有表达。如图7i所示，由于采用了PTT，原发肿瘤中肿瘤的细胞数量(第3组和第4组)明显减少了。另外，在第3组和第4组远端肿瘤侧发现的CD8+、CD3+、CD4+和PD-1T细胞远多于PBS组和仅用咪喹莫德组。这些结果清楚地表明全身施用CPCI/咪喹莫德-NP和α-PD-1，结合局部PTT对原发和远端转移肿瘤具有很好的治疗效果。这一治疗理念转化性高，可用于临床试验。
免疫记忆效应：为了评估协同光热-免疫疗法(基于CPCI/咪喹莫德的PTT结合α-PD-1)产生的免疫记忆，在第一次移植肿瘤消除50天后，分别在第一次肿瘤的原发位和远端再次接种4T1肿瘤。在同龄小鼠体内注射PBS作为对照。类似地，分别在第67天和第73天在两组小鼠i.p.注射α-PD-1(每次每只小鼠200μg)(图8a)。如图8b和8c所示，即使注射了α-PD-1，PBS组的肿瘤体积仍旧迅速增加。相反，基于CPCI/咪喹莫德-NP的PTT联合α-PD-1的协同治疗方法可显著延缓原发和远端再接种肿瘤的生长，表明通过激活先天免疫系统和适应性免疫系统可以产生免疫记忆效应。不幸的是，这种方法只能延缓肿瘤的生长，但不能完全抑制肿瘤的复发，这可能是由于缺乏足够的肿瘤由第一次治疗产生相关抗原。
讨论
尽管多年来光热疗法所用的近红外光热转化剂(PTCAs)已经得到广泛的研究，且被用于多种肿瘤模型的研究中，但是在改善光热转化效率和稳定性方面仍然面临着极大的挑战，包括体内肾脏快速排除或肝脏的代谢，以及激光持续照射下的分解/漂白。因此，迫切需要开发出具有高稳定性和高效能的新一代PTCAs，用于肿瘤的光热疗法。以往和目前的研究表明，阿霉素等具有细胞毒性的化疗药物能够与PTT产生协同抗肿瘤作用。由于绝大多数与癌症有关的死亡案例都是由于肿瘤转移所致，因此迫切需要开发有效的系统疗法来治疗转移性疾病。近年来，免疫疗法，尤其是单克隆抗体检查点阻断疗法，在临床肿瘤治疗中展现了广阔的前景。这种疗法能够调动患者自身的免疫系统来对抗癌症。近年来，有报道称，PTT能够促使切除的肿瘤细胞残余中产生肿瘤相关抗原，从而改善抗肿瘤免疫效果。
本文开发了一种基于末端树枝状共聚物的新型高效光热纳米颗粒(CPCI-NP)，不仅可以作为一种优质的PTCA，也可以作为一种治疗癌症的方便高效可控的药物递送系统。末端树枝状共聚物上共价连接的ICGD和通过二硫键交联的互聚物可以使CPCI-NP上聚集高密度的ICGD和π-电子相互作用，从而确保在自组装后具有高光热转化效率和光稳定性。经过5个周轮期的激光照射后，CPCI-NP的光热转化效率仍然保持高效(超过70℃)。值得注意的是，在辐照60秒(808nm,0.8W cm-2)后，CPCI-NP溶液的温度几乎达到最大值，表明ICGD的独特结构赋予了ICGD理想的光热性质。由疏水ICGD和表面两亲胆酸单元构成的杂化末端树枝状共聚物给化学治疗剂或免疫调节剂的封装和递送提供了一个理想平台。例如，CPCI/DOX-NP具备理想的小颗粒尺寸(～20nm)，能够聚集到靶肿瘤部位，经血液循环后渗透到更深层组织进行深度治疗(36h后CPCI/DOX-NP在肿瘤部位的最大浓度)。二硫交联可以确保NPs的稳定同时限制血液循环中DOX的提前释放；而在细胞还原的环境下，或在808nm激光辐照下(图4f)，或用N-乙酰半胱氨酸按需释放，可以使DOX自NPs中可控释放。
原位口腔癌异种移植模型已证明，在纳米颗粒给药后24和48小时后进行激光照射，光热/化学疗法与CPCI/DOX-NP联合使用疗效很好。大量CPCI/DOX-NP在肿瘤部位至少会聚集5天，因此在5天内，光疗法可以多次重复。通过这种治疗方法，可以在肿瘤消退的过程中持续进行光疗法，甚至可以达到浅表5mm以下更深层的肿瘤。选择ICGD的原因如下：(1)吸收波长长(808nm)，有助于光疗法中光的深层渗透；(2)ICG的荧光发射波长为808nm，几十年来在临床用作光学成像探针。因此，CPCI/DOX-NP不仅可以用作优异的PTCA，还可以用作图像引导手术中的肿瘤靶向探针。另外，它在手术中易于用光疗法治疗的肿瘤边缘和瘤床中具有极大的临床应用潜力。
除了局部疗法，CPCI-NP还可以用于全身免疫治疗，尤其是当装载免疫调节剂，如FDA批准的咪喹莫德时。用CPCI-NP封装后，使得i.v.咪喹莫德的毒性极大地减小，通过EPR效应将咪喹莫德递送到全身各肿瘤处。对浅表肿瘤或内窥镜可探查到的肿瘤局部的光辐照可以导致肿瘤相关抗原的生成和局部免疫细胞的致敏，随后传递到其他转移性肿瘤部位，产生抗肿瘤特效。这种光-免疫疗法与检查点阻断抗体结合使用时，预期效果是非常有效的。这一想法在4T1同系原位乳腺癌模型中得到验证。在全身注射CPCI/咪喹莫德-NP后，近红外诱导原发肿瘤被光热消融，所释放的肿瘤相关抗原和咪喹莫德佐剂联合表现出强烈的免疫反应，尤其是在结合抗-PD-1检查点阻断疗法后，激活了大量抗原特异性T细胞，同时抑制免疫抑制调节T细胞(Tregs)的活动，从而攻击小鼠体内存在的远端肿瘤细胞。另一个实验表明当再次给接受治疗的小鼠植入新的4T1肿瘤细胞时，这种联合光-免疫疗法的方法能够极大地延迟肿瘤的形成，延缓肿瘤的生长。
总而言之，基于共组装二元末端树枝状共聚物的新一代PTCA在光热疗法中展现了优异的光热转化效率、加热性能和稳定性。还可用作多功能纳米平台，分别结合化疗协同治疗原位口腔癌，或结合免疫疗法协同治疗转移性乳腺癌。这一极具前景的纳米平台在临床治疗多种类型肿瘤方面展现了巨大的潜力。将纳米颗粒引入肿瘤靶向配体，有望进一步改善其功效。
材料：端甲基聚(乙二醇)单胺(MeO-PEG-NH2，Mw：5000Da)购自Rapp Polymere(德国)。4-羧基苯基硼酸、4-羧基苯基硼酸频哪醇酯、3-羧基-5-硝基苯硼酸和3-羧基-5-硝基苯硼酸频哪醇酯购自Combi Blocks(加利福尼亚州圣地亚哥)。(Fmoc)lys(Boc)-OH、(Fmoc)Lys(Fmoc)-OH、(Fmoc)Cys(Trt)eOH和(Fmoc)Ebes-COOH购自AnaSpec Inc.(加利福尼亚州圣何塞)。所有其他化学品均购自奥德里奇(圣路易斯)。
吲哚菁绿衍生物(ICGD)的合成：简要地说，在90℃加热和回流下，1，1，2-三甲基苯并[e]吲哚(I)和碘乙烷(1.5eq)在乙腈溶液中反应3天。加入乙醚生成3-乙基-1，1，2-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓(产物II)。然后将粗产物(II)加入到N-[5-(苯氨基)-2，4-戊二烯基]苯胺单盐酸盐(1eq)的乙酸酐溶液中。将所得的混合物加热至100℃反应1.5小时，冷却至室温后，加入到去离子水中。过滤后，得到产物(III)3-乙基-1,1-二甲基-2((1E，3E，5E)-6-(N-苯基乙酰胺)六-1,3,5-三烯-1-基)-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓。此外，在100℃加热回流下，1，1，2-三甲基苯并[e]吲哚(I)和5-碘化钾溴化甘油酸(1.2eq)在乙腈溶液中反应5天后，加入乙醚，生成3-(4-羧丁基)-1，1,2-三甲基-1H-苯并[n]吲哚-3-鎓(IV)。最后，将粗产品IV加入到产物(III)的吡啶溶液中。将所得的混合物在40℃反应30分钟，并经真空浓缩得到终产物。最终的粗产物经硅胶柱纯化两次，得到ICGD。
末端树枝状共聚物的合成：根据已发表的方法(Li等人，《生物材料(Biomaterials)》2011，32(27)，6633-6645)，首个代表性的ICGD/CA末端树枝状共聚物(PEG5k-ICGD4-CA4，缩写为PIC)是通过使用逐步增长肽段化学方法由MeO-PEG-NH2经液相缩合反应制得。简言之，以DIC和HOBt为偶联剂，将(Fmoc)Lys(Fmoc)-OH(3eq)偶联到PEG的终端氨基上，直至茚三酮检测结果显示为阴性，指示偶联反应完成。加入冷乙醚后，PEG化分子析出，再用冷乙醚清洗两次。用20％(v/v)4-甲基哌啶的二甲基甲酰胺(DMF)处理去除Fmoc基团，PEG化分子析出后，再用冷乙醚清洗3次。将白色粉末状析出物在真空下干燥，分别进行(Fmoc)lys(Boc)-OH的偶联和(Fmoc)Lys(Fmoc)-OH的偶联，生成PEG的一个终端具有四个Boc基团和Fmoc基团的第三代树突状聚赖氨酸。在分别用20％(v/v)4-甲基哌啶去除Fmoc基团和用50％(v/v)三氟乙酸的二氯甲烷溶液去除Boc基团后，将CA NHS酯和ICGD偶联到树突状聚赖氨酸的终端。过滤末端树枝状共聚物溶液，用3.5KDa的MWCO水透析。最后，将末端树枝状共聚物冻干。
根据USPN 10,106,650B2.，合成了第二个硫醇化末端树枝状共聚物(命名为PEG5k-Cys4-L8-CA8，缩写为PCLC)。简言之，首先，根据上述方法合成了在PEG的一个终端具有四个Boc基团和Fmoc基团的第三代树突状聚赖氨酸。用50％(v/v)三氟乙酸的二氯甲烷溶液去除Boc基团后，将(Fmoc)Cys(Trt)eOH、(Fmoc)Ebes-OH和胆酸NHS酯逐步偶联到树突状聚赖氨酸的终端上。用TFA/H2O/乙二硫醇(EDT)/三乙基硅烷(TIS)(94：2.5：2.5：1，v/v)去除半胱氨酸上的Trt基团，得到硫醇化末端树枝状共聚物PCLC。分别用DMF和乙醚溶解/再沉淀，循环三次，从混合液中得到硫醇化末端树枝状共聚物。最终，将硫醇化末端树枝状共聚物溶解在乙腈/水，然后冻干。
PIC末端树枝状共聚物和PCLC末端树枝状共聚物的分子量分别用ABI 4700MALDI-TOF/TOF质谱仪(线性模式)测量，以R-氰基-4-羟基肉桂酸为基质。检测到末端树枝状共聚物的单分散质量迹线。从MALDI-TOF质谱上获得的末端树枝状共聚物的分子量几乎与理论一致。末端树枝状共聚物的核磁氢谱结果通过Avance 600核磁共振光谱仪(布鲁克)获得，其使用CDCl3为溶剂。
CPCI-NP的制备：将10mg PIC末端树枝状共聚物溶解在1mL PBS中，超声10min形成PIC NPs。为了制备CPIC NPs,将10mg PCLC末端树枝状共聚物和10mg PCI末端树枝状共聚物溶解在1mL PBS中形成胶束，然后超声10min。末端树枝状共聚物上的硫醇经空气氧化形成二硫键。
CPCI/DOX-NP的制备：用溶剂蒸发法将疏水药物，诸如DOX或咪喹莫特装载到CPICNPs中。在DOX被封装进NPs前，将DOX·HCl与三乙胺(3摩尔当量)的氯仿(CHCl3)/甲醇(MeOH；1:1，v/v)溶液一起搅拌，以除去DOX·HCl中的HCl。总的来说，首先将10mg PCI末端树枝状共聚物和10mg PCLC末端树枝状共聚物以及不同量的中性DOX溶解在CHCl3/MeOH溶液中，混合，并经旋蒸仪蒸发，得到均匀的干燥聚合物薄膜。将薄膜置于1mL PBS中重组，超声30min，使得样品薄膜分散到纳米颗粒溶液中。最终，用0.22mm滤器过滤纳米颗粒溶液，对样品进行灭菌。为了确定药品量，用DMSO稀释载药纳米颗粒(NP溶液/DMSO,1:9,v/v)，解离纳米颗粒。用HPLC系统(沃特世)分析载药结果，用一系列不同浓度的药物/DMSO标准溶液获得标定曲线。装载咪喹莫特的CPIC NPs的制备方法除了没有用3摩尔当量三乙胺外，其他与上述方法相同。
纳米颗粒的表征：纳米颗粒的粒径与粒径分布结果经DSL仪(美国麦奇克)测量获得。用于DSL测量的纳米颗粒浓度为1.0mg mL-1。所有的测量均在25℃下进行。纳米颗粒的形貌结果由菲利普斯(Philips)CM-120TEM测量所得。简言之，将纳米颗粒的水溶液(1mg mL-1末端树枝状共聚物)沉积在铜网上，用磷钨酸染色2s，并且室温下测量。颗粒的尺寸由TEM软件(数字显微(DigitalMicrograph),Gatan Inc)测量所得。纳米颗粒的UV-vis-NIR吸收光谱由创惟(Genesys)10S UV-Vis分光光度计(赛默飞世尔科技(Thermo Scientific),麻省沃尔瑟姆(Waltham,MA))测量所得。纳米颗粒的荧光信号由荧光光谱仪(SpectraMax M2,分子设备(Molecular Devices),美国加利福尼亚州，森尼韦尔(Sunnyvale,CA,USA))测量所得。
纳米颗粒在SDS和人血浆中的稳定性：在SDS中，监测PCI-NP和CPCI-NP荧光强度和颗粒尺寸的变化情况以研究纳米颗粒在SDS和人血浆中的稳定性，有研究表明它能够有效分解聚合物胶束。将SDS溶液(7.5mg mL-1)加入到纳米颗粒水溶液中(1.5mg mL-1)。SDS溶液的最终浓度为2.5mg mL-1，胶束浓度保持在1.0mg mL-1。溶液的荧光信号由荧光光谱仪测量所得。纳米颗粒溶液的尺寸和尺寸分布按之前确定的时间间隔检测并经DSL测量。在GSH(10mM)和SDS存在条件下，对胶束的稳定性进行评估。对装载DOX的CPCI/DOX-NP在10％(v/v)健康人血浆中的稳定性进行了研究，血浆由志愿者提供。将混合物置于生理体温(37℃)下进行培养，之后按之前确定的长达96h的时间间隔对颗粒尺寸进行测量。
纳米颗粒的光热效应：分别将1mL的PCI-NP(ICGD剂量为30μg mL-1)、CPCI-NP(ICGD剂量为30μg mL-1)和PEG修饰的金纳米棒(GNR浓度：18μg mL-1)加入到4mL的透明石英皿。将溶液置于光纤耦合连续半导体二极管激光器(808nm，北京榜首科技有限公司(BeijingViasho Technology Co.,Ltd.,China))下进行激光照射。激光功率密度为0.8W cm-2，用红外热成像仪检测温度(Flir C2,USA)。为了研究CPCI-NP的光稳定性，将1mL的CPCI-NP(ICGD浓度为30μg mL-1)、PCI-NP(ICGD浓度为30μg mL-1)或ICG(30μg mL-1)水溶液置于808nm激光下照射5min，然后冷却至室温。
体外渗透深度和纳米颗粒的热效应：为了研究CPCI-NP在808nm激光照射下，热效应与组织渗透深度的关系，首先设计了体外模拟实验。将实验分成两组：(1)CPCI-NP和(2)PCLC/TBAI&ICG NPs。用以下方法准备第(2)组实验：将游离ICG和四正丁基碘化铵(TBAI)通过静电相互作用形成的复合物物理封装在PCLC末端树枝状共聚物中，命名为PCLC/TBAI&ICG NP。选取火锅牛肉作为模拟组织，切成正方形(每片厚度为2mm)。将100μL CPCI-NP(ICGD浓度为30μg mL-1)溶液或PCLC/TBAI&ICG NPs(游离ICG浓度为30μg mL-1)溶液滴到牛肉切片表明，用808nm激光从设备下方(激光功率0.8W cm-2)照射2min。用热红外成像仪记录温度和牛肉切片的厚度。
CPCI/DOX-NP中DOX的释放：进一步用透析法测定了CPCI/DOX-NP的DOX体外释放曲线。将药物释放实验分为三组(n＝3)：(1)PBS；(2)GSH(10mM)；(3)GSH(10mM)和808nm近红外光辐照(功率为0.8W cm-2)。首先，将500μL CPCI/DOX-NP溶液(DOX浓度为1mg mL-1)转移到透析袋里浸入DI水中。所有实验组均在37℃摇晃4h。之后，在第(2)组中加入GSH。第(3)组中加入GSH，并在合适的时间点用808nm激光辐照3次。在所有的组别中，在所需的时间点取出10μL溶液，加入到含有90μL DMSO的瓶子中。用HPLC系统(沃特世)分析DOX的释放量，其中用一系列不同浓度的药物/DMSO标准溶液标定曲线。数据为三份样品的DOX累计释放的平均百分比。
体外细胞实验：对人OSC-3口腔癌细胞株中进行样品的体外细胞毒性、细胞摄取和联合疗法研究，细胞购自美国菌种保藏中心(ATCC)。将细胞培养在含有10％FBS和1％盘尼西林的DMEM中，在37℃，5％CO2浓度的湿润环境中培养24h。然后，将样品加入到每一个培养孔中，细胞在37℃下再培养24h。培养结束后，用MTS比色法测定细胞相对存活率。为了评估细胞的摄取量，将OSC-3细胞种到96孔板中，并与CPCI/DOX-NP(DOX浓度：25μg mL-1)中再培养6h。在DAPI染色半小时后，用共聚焦显微镜观察细胞摄取量。在体外化学/光热联合疗法中，将OSC-3细胞种在96孔板中(n＝3)，与不同的样品培养4h，随后暴露在808nm NIR激光(0.8W cm-2，2min)下。细胞在37℃下再培养24h，随后在每个孔中加入MTS试剂，用MTS比色法测定细胞相对存活率。细胞存活百分数代表了药物疗效，100％代表所有细胞均存活。细胞存活率计算公式如下：细胞存活率(％)＝(治疗组OD490nm/空白对照组OD490nm)×100％。在体外细胞凋亡实验中，将OSC-3细胞与不同样品(DOX浓度：25μgml-1和808nmNIR激光(0.8W cm-2，2min))共培养8h。细胞清洗两次，更换新鲜培养基。将细胞置于12孔板中与PI/Dio FITC共培养30min。在荧光显微镜上观察细胞凋亡。代表性的PI/annexinv FCM分析散点图显示四组均有细胞凋亡。
体内血液清除动力学：将斯普拉格-杜勒雌性大鼠的颈静脉植入导管收集血液(哈兰德，印第安纳波利斯，美国)。分别将游离ICG、PCLC/TBAI&ICG NPs和CPCI-NP以等浓度的ICG按5mg kg-1的剂量通过导管注射到每组大鼠体(每组3只)内。在不同的时间点从导管收集血液样品。用微孔板读取器(SpectraMax M2)在808nm吸收处测量ICG浓度。
动物模型：所有动物实验均符合加利福尼亚大学戴维斯分校动物使用和护理行政咨询委员会批准的第19724号规程。原位OSC-3口腔癌模型：6-8周龄的雌性裸鼠购自Harlan(美国加利福尼亚州利弗莫尔)，首次建立植入嘴唇的原位口腔癌模型。将含有1×106OSC-3口腔癌细胞的10μL PBS溶液注射移植到各雌性裸鼠体内。当小鼠荷载的OSC-3口腔癌肿瘤体积达到～50mm3时，对小鼠实施治疗。4T1乳腺癌模型：雌性Balb/c小鼠(8-10周龄)购自Harlan(美国加利福尼亚州利弗莫尔)。将1×106个4T1细胞悬浮在80μL PBS和基质胶的混合物(1:1v/v)中，然后注入到第四乳腺脂肪垫中。当小鼠荷载的4T1肿瘤体积达到～50mm3时，对小鼠实施治疗。
体内/离体荧光成像：按7mgICGD每kg体重的剂量，对携带原位OSC-3口腔癌的裸鼠进行尾部静脉注射CPCI/DOX-NP。在预先设计的时间点，用体内荧光成像系统(美国Carestream活体成像系统FX PRO)对异氟醚麻醉的小鼠进行成像。在注射NPs48h后，所有动物均被杀死，并切下相关器官进行体外成像。
体内癌症治疗：分别对携带原位OSC-3口腔癌的小鼠注射PBS、游离DOX(2.5mg kg-1)、PCI-NP(PCI末端树枝状共聚物25mg kg-1；ICGD 7mg kg-1)，CPCI-NP(总末端树枝状共聚物50mg kg-1；ICGD 7mg kg-1)，CPCI/DOX-NP(总末端树枝状共聚物50mg kg-1；DOX 2.5mgkg-1,ICGD 7mg kg-1)。分别在24h和48h后，在全麻状态下用激光(0.8W cm-2持续2min)对肿瘤部位照射两次，激光光斑覆盖肿瘤全部区域。每周对小鼠进行一次两个周期的治疗。用热成像仪(FLIR)记录肿瘤表面温度。每周用卡尺测量测量肿瘤体积两次，其中，“w”和“l”分别表示肿瘤的宽度和长度。治疗持续30天。一旦小鼠的体重减轻20％或肿瘤的生长影响到小鼠的饮水和进食，小鼠就会被杀死。将携带有4T1肿瘤的小鼠随机分成7组(n＝6)，分别用PBS、CPCI/Imi、CPCI+L、CPCI/Imi+L、CPCI/Imi+α-PD-1、CPCI/Imi+L+α-PD-1和CPCI/Imi+L+α-PD-1(1轮)(ICGD 7mg kg-1、咪喹莫德1.25mg kg-1，每只小鼠腹腔注射200μg抗PD-1)进行治疗。当肿瘤体积达到50mm3，开始实施治疗。每两周测量一次肿瘤的大小，并用如下公式进行计算：体积＝0.5×L×W2。
组织学研究：在注射NPs后，经过两个周期的治疗后，处死携带OSC-3口腔癌的小鼠。固定肿瘤组织并用石蜡包埋。苏木精和伊红(H&E)染色玻片购自BBC生化公司(华盛顿州弗农山)，用显微镜观察。
尽管为了清晰的理解，已经通过图解和实施例对上述发明进行了一些详细描述，但是本领域的技术人员将理解，可以在所附权利要求的范围内实施某些更改和修改。此外，本文提供的每个参考文件都以引用的形式整体嵌入本文，如同每一篇参考文献是通过引用单独合并的一样。如果本申请与本文提供的参考之间存在冲突，以本申请为准。

Claims (45)

1.一种式I所示化合物：
Figure FDA0003044282370000011
式中：
PEG为聚乙二醇(PEG)聚合物，其中，各个PEG聚合物的分子重量为1-100kDa；
X各自为支链单体单元；
R1各自独立地为胆酸或胆酸衍生物；和
R2各自独立地为花青。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，X为二氨基羧酸。
3.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，二氨基羧酸各自独立地选自下组：2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸、2,5-二氨基戊酸(鸟氨酸)、2,6-二氨基己酸(赖氨酸)、(2-氨基乙基)-半胱氨酸、3-氨基-2-氨基甲基丙酸、3-氨基-2-氨基甲基-2-甲基丙酸、4-氨基-2-(2-氨基乙基)丁酸和5-氨基-2-(3-氨基丙基)戊酸。
4.如权利要求2所述的化合物，其特征在于，各二氨基羧酸为赖氨酸。
5.如权利要求1-4中任一项所述的化合物，其特征在于，R1各自独立地为胆酸、(3α，5β，7α，12α)-7,12-二羟基-3-(2,3-二羟基-1-丙氧基)-胆酸(CA-4OH)、(3α，5β，7α，12α)-7-羟基-3,12-二(2,3-二羟基-1-丙氧基)-胆酸(CA-5OH)或(3α，5β，7α，12α)-7,12-二羟基-3-(3-氨基-2-羟基-1-丙氧基)-胆酸(CA-3OH-NH2)。
6.如权利要求1-5中任一项所述的化合物，其特征在于，各R1各自为胆酸。
7.如权利要求1-6中任一项所述的化合物，其特征在于，R2各自独立地为花青3、花青3.5、花青5、花青5.5、花青7、花青7.5、吲哚菁绿或具有(S1)结构的吲哚菁绿衍生物：
Figure FDA0003044282370000012
8.如权利要求7所述的化合物，其特征在于，R2各自为具有(S1)结构的花青。
9.如权利要求7或8所述的化合物，其特征在于，PEG分子量各自为5kDa；
X各自为赖氨酸；
R1各自为胆酸；和
R2各自为具有(S1)结构的花青。
10.一种含有多个第一偶联体的纳米颗粒，其特征在于，所述第一偶联体各自独立地为如权利要求1至9中任一项所述的化合物：
其中；
多个偶联体在水溶液中自组装形成形成纳米载体，从而在纳米载体内部形成疏水核，其中，各偶联体的PEG自组装在纳米颗粒的外部。
11.如权利要求10所述的纳米颗粒，其特征在于，其还包含多个第二偶联体，其中，第二偶联体各自独立地为式(II)化合物：
Figure FDA0003044282370000021
式中：
PEG为聚乙二醇(PEG)聚合物，其中，各个PEG聚合物的分子重量为1-100kDa；
X各自为支链单体单元；
Y各自为含硫醇的交联基团；
L各自为连接基团；和
R1各自独立地为胆酸或胆酸衍生物。
12.如权利要求10-11中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，所述第一偶联体为如权利要求9所述的偶联体。
13.如权利要求11或12所述的纳米颗粒，其特征在于，所述第二偶联体为式(II)化合物：
式中：
各PEG的分子量为5kDa；
X各自为赖氨酸；
Y各自为半胱氨酸；
L各自为具有下式的连接基团
Figure FDA0003044282370000022
R1各自为胆酸。
14.如权利要求11-13中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，式(II)偶联体通过含硫醇的交联基团实现交联。
15.如权利要求11-14中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，第一偶联体和第二偶联体的比例约为1:1(w/w)。
16.如权利要求15所述的纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒的平均直径约为20nm。
17.如权利要求10-16中任一项所述的纳米颗粒，其特征在于，其疏水核中进一步包含治疗药物。
18.如权利要求17所述的纳米颗粒，其特征在于，所述治疗药物选自下组：嘎德莫特、阿霉素、柔红霉素、长春新碱、长春碱、紫杉醇、SN-38、咪喹莫特、雷西莫特、莫托莫德、来那度胺、泊马利度胺和具有(S2)结构的LLS30：
Figure FDA0003044282370000031
19.一种治疗疾病的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如权利要求10-18所述的纳米颗粒。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述疾病为癌症。
21.如权利要求19或20所述的方法，其特征在于，所述疾病为乳腺癌、口腔癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌、脑癌、黑素瘤、骨髓瘤、白血病、结肠癌、前列腺癌、食道癌、肝癌、头颈癌、淋巴瘤或转移性癌症。
22.如权利要求19-21中任一项所述的方法，其特征在于，疏水核中还包含治疗药物，其中，所述治疗药物选自下组：阿霉素、嘎德莫特和咪喹莫特。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述治疗药物为咪喹莫特，还包括施用检查点阻断抗体。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述检查点阻断抗体为抗PD-1、抗PDL1或抗CTLA-4。
25.如权利要求23或24所述的方法，其特征在于，所述检查点阻断抗体为抗PD-1。
26.一种通过光热疗法治疗疾病的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如权利要求10-18所述的纳米颗粒，并将所述受试者进行辐射，从而通过光热疗法治疗疾病。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述受试者暴露在近红外光辐照下。
28.如权利要求26或27所述的方法，其特征在于，所述疾病为癌症。
29.如权利要求26-28中任一项所述的方法，其特征在于，所述疾病为乳腺癌、口腔癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌、脑癌、黑素瘤、骨髓瘤、白血病、结肠癌、前列腺癌、食道癌、肝癌、头颈癌、淋巴瘤或转移性癌症。
30.如权利要求26-29中任一项所述的方法，其特征在于，疏水核中进一步包含治疗药物，其中，所述治疗药物选自下组：阿霉素、嘎德莫特和咪喹莫特。
31.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述治疗药物为咪喹莫特，还包括注射施用抗PD-1。
32.一种治疗患有病变组织的受试者的方法，其特征在于，所述方法包括向受试者施用有效治疗剂量的如权利要求10-18所述的纳米颗粒，使得纳米颗粒集中在病变组织；用第一波长的光照射以确定病变组织；从受试者上移除病变组织，从而治疗受试者。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述方法还包括给药步骤后延迟辐照步骤至少3小时。
34.如权利要求32或33所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以第二种波长的光照射受试者的其余病变组织。
35.如权利要求33或34所述的方法，其特征在于，移除步骤和两个辐照步骤是在对受试者的在单次手术中进行。
36.如权利要求34所述的方法，其特征在于，所述第一波长和第二波长均处在近红外光谱中。
37.如权利要求32-36中任一项所述的方法，其特征在于，所述病变组织为癌症。
38.如权利要求32-37中任一项所述的方法，其特征在于，所述病变组织为乳腺癌、口腔癌、宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌、脑癌、黑素瘤、骨髓瘤、白血病、结肠癌、前列腺癌、食道癌、肝癌、头颈癌、淋巴瘤或转移性癌症。
39.如权利要求32-38中任一项所述的方法，其特征在于，所述病变组织为卵巢癌。
40.一种成像方法，其特征在于，向有需要的受试者施用有效治疗量的如权利要求10-18的纳米颗粒，并对受试者进行成像。
41.一种制备如权利要求10-18中任一项所述纳米颗粒的方法，其特征在于，包括：形成包含多个如权利要求1-9中任一项所述第一偶联体与水溶液的反应混合物，其中，所述偶联体自组装形成纳米颗粒，从而在纳米颗粒的内部形成疏水核，其中，每个偶联体的PEG自组装在纳米颗粒的外部。
42.如权利要求41所述的方法，其特征在于，所述反应溶液还包含多个式(II)第二偶联体：
Figure FDA0003044282370000051
式中：
PEG为聚乙二醇(PEG)聚合物，其中，各个PEG聚合物的分子量为1-100kDa；
X各自为支链单体单元；
Y各自为含硫醇的交联基团；
L各自为连接基团；
R1各自独立地为胆酸或胆酸衍生物。
43.如权利要求41或42所述的方法，其特征在于，所述水溶液中包含PBS，所述方法还包括将反应混合物超声处理约10分钟。
44.如权利要求42或43所述的方法，其特征在于，所述第一偶联体和第二偶联体以约为1:1(w/w)的比例加入。
45.如权利要求42-44中任一项所述的方法，其特征在于，通过半胱氨酸氧化形成交联键。
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