[go: up one dir, main page]

CN113336857A - 一种新型新冠病毒亚单位疫苗及其构建方法 - Google Patents

一种新型新冠病毒亚单位疫苗及其构建方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113336857A
CN113336857A CN202110363334.5A CN202110363334A CN113336857A CN 113336857 A CN113336857 A CN 113336857A CN 202110363334 A CN202110363334 A CN 202110363334A CN 113336857 A CN113336857 A CN 113336857A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rbd
ifn
sequence
subunit vaccine
fusion protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110363334.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113336857B (zh
Inventor
吴松
朱士茂
王飞
孙海燕
雷崎方
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Following Precision Medicine Research Institute Technical Director
Original Assignee
Shenzhen Following Precision Medicine Research Institute Technical Director
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Following Precision Medicine Research Institute Technical Director filed Critical Shenzhen Following Precision Medicine Research Institute Technical Director
Priority to CN202110363334.5A priority Critical patent/CN113336857B/zh
Publication of CN113336857A publication Critical patent/CN113336857A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113336857B publication Critical patent/CN113336857B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/20011—Coronaviridae
    • C12N2770/20034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种新型新冠病毒亚单位疫苗及其构建方法，其中，方法包括步骤：将RBD序列和IFN序列连接至Fc序列的两端，得到融合蛋白基因RBD‑Fc‑IFN；将所述融合蛋白基因RBD‑Fc‑IFN接入pCMV‑MCS‑3flag质粒，得到重组质粒pCMV‑RBD‑Fc‑IFN；将所述重组质粒pCMV‑RBD‑Fc‑IFN转染至293T细胞并培养预定时间后，收集转染上清液；对所述转染上清液进行纯化处理，得到RBD‑Fc‑IFN融合蛋白，即制得所述新型新冠病毒亚单位疫苗。本发明制备的新型新冠病毒亚单位疫苗有效解决了RBD亚单位疫苗在临床应用中遇到的半衰期短、免疫原性较弱以及联合使用IFN时存在不利因素的问题，为开发安全有效的新型SARS‑CoV‑2疫苗提供候选疫苗。

Description

一种新型新冠病毒亚单位疫苗及其构建方法
技术领域
本发明涉及生物疫苗技术领域，尤其涉及一种新型新冠病毒亚单位疫苗及其构建方法。
背景技术
冠状病毒是一类可在多种动物中引起不同严重程度的单股正链RNA病毒。自从公布SARS-CoV-2全基因组序列后，各国科研机构及制药公司都在积极开发SARS-CoV-2疫苗。针对SARS-CoV-2已建立多个不同的疫苗平台，包括灭活全病毒疫苗、核酸疫苗、亚单位疫苗、载体疫苗和减毒活疫苗等，不同平台各有优缺点。
SARS-CoV-2棘突蛋白(Spike，S)位于病毒最外层，参与病毒与宿主细胞表面受体的结合，是宿主中和抗体的重要作用位点和疫苗研发最重要的靶抗原。S蛋白在病毒表面以三聚体形式存在，在结构上可分为S1和S2 两个亚基，其中S1亚基的331-524位氨基酸为其受体结合结构域(Receptor binding domain,RBD)，负责与细胞膜上特异性受体血管紧张素转化酶2 (Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)结合，介导病毒进入细胞。 SRAS-CoV-2S蛋白存在融合前和融合后两种构象形式，在天然状态下呈现不稳定的融合前构象(prefusion)，与ACE2受体结合介导病毒进入细胞过程中，S蛋白构象发生显著变化，转变为更稳定的融合后构象 (postfusion)。除了构象不稳定，S蛋白序列较长且高度糖基化，直接使用全长S蛋白作为抗原设计，对体外表达和翻译后修饰要求较高。
鉴于S蛋白的复杂性，一个有效的策略是采用S蛋白核心区域RBD进行疫苗研发。基于RBD抗原设计的亚单位疫苗，不仅可以避免S蛋白构象变化问题，且可以诱导中和抗体产生。此外，亚单位更容易进行体外重组表达和放大，极大降低疫苗的开发和生产成本。然而，通常情况下亚单位疫苗存在半衰期短以及免疫原性较弱的问题，因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型新冠病毒亚单位疫苗及其构建方法，旨在解决现有RBD亚单位疫苗在临床应用中遇到的半衰期短、免疫原性较弱的问题。
本发明的技术方案如下：
一种新型新冠病毒亚单位疫苗的构建方法，其中，包括步骤：
提供编码SARS-CoV-2S蛋白331-524位氨基酸的基因序列，记为RBD 序列；
提供编码人IgG1 Fc区的基因序列，记为Fc序列；
提供编码人或鼠IFN的基因序列，记为IFN序列；
将所述RBD序列和IFN序列连接至所述Fc序列的两端，得到融合蛋白基因RBD-Fc-IFN；
将所述融合蛋白基因RBD-Fc-IFN接入pCMV-MCS-3flag质粒，得到重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN；
将所述重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN转染至293T细胞并培养预定时间后，收集转染上清液；
对所述转染上清液进行纯化处理，得到RBD-Fc-IFN融合蛋白，即制得所述新型新冠病毒亚单位疫苗。
所述新冠病毒亚单位疫苗的构建方法，其中，所述RBD序列和IFN序列通过编码GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS连接肽的序列连接至所述Fc 序列的两端。
所述新冠病毒亚单位疫苗的构建方法，其中，将所述融合蛋白基因 RBD-Fc-IFN接入pCMV-MCS-3flag质粒的步骤包括：
采用HindIII酶和EcoRI酶对所述融合蛋白基因RBD-Fc-IFN以及 pCMV-MCS-3flag质粒进行酶切处理，使酶切后的融合蛋白基因RBD-Fc-IFN 接入pCMV-MCS-3flag质粒，得到重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN。
所述新冠病毒亚单位疫苗的构建方法，其中，将所述重组质粒 pCMV-RBD-Fc-IFN转染至293T细胞的步骤包括：
将处于对数生长期的293T细胞用胰酶消化后稀释至预定密度，接种到培养皿中，每个培养皿加入无血清培养基；
采用转染试剂将所述重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN转染至培养皿中的 293T细胞中。
所述新冠病毒亚单位疫苗的构建方法，其中，对所述转染上清液进行纯化处理的步骤包括：
采用Protein A亲合层析柱对所述转染上清液进行纯化处理。
一种新冠病毒亚单位疫苗，其中，采用本发明所述新冠病毒亚单位疫苗的构建方法制得，所述新冠病毒亚单位疫苗为RBD-Fc-IFN融合蛋白。
有益效果：本发明提供的新型新冠病毒亚单位疫苗，通过将SARS-CoV-2 S蛋白RBD和IFN分别连接至IgG1 Fc的两端，利用IFN作为内源佐剂并通过Fc实现RBD二聚体化，实现提高RBD半衰期的同时，增强其免疫原性。本发明提供的新型新冠病毒亚单位疫苗有效解决了RBD亚单位疫苗在临床应用中遇到的半衰期短、免疫原性较弱以及联合使用IFN时存在不利因素的问题，为开发安全有效的新型SARS-CoV-2疫苗提供候选疫苗。
附图说明
图1为本发明提供的一种新冠病毒亚单位疫苗的构建方法较佳实施例的流程图。
图2为RBD-Fc-IFN血浆半衰期测定结果图。
图3为RBD-Fc-IFN诱导产生中和抗体测定结果图。
图4为RBD-Fc-IFN引起细胞免疫应答测定结果图。
具体实施方式
本发明提供一种新冠病毒亚单位疫苗及其构建方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
通常情况下亚单位疫苗存在半衰期短以及免疫原性较弱的问题，尽管可以通过构建抗原二聚体或三聚体以增强亚单位疫苗的免疫原性，但主流策略仍然是通过添加疫苗佐剂提高其免疫原性。先天免疫应答在机体识别和清除病原体过程中发挥重要作用，其中干扰素(Interferon,IFN)应答是机体抗病毒最主要的第一道防线。研究表明，IFN应答不健全与患者对疾病易感程度相关。联合应用IFN可以提供保护作用，延长患者治疗窗口期，对于COVID-19早期患者、IFN应答发生延迟或受阻的人群以及老年患者等特殊人群具有重要意义，但联合应用IFN存在费用昂贵、半衰期短等缺点，不利于推广普及。
基于此，本发明提供了一种新型新冠病毒亚单位疫苗的构建方法，如图1所示，其包括步骤：
S10、提供编码SARS-CoV-2S蛋白331-524位氨基酸的基因序列，记为RBD序列；
S20、提供编码人IgG1 Fc区的基因序列，记为Fc序列；
S30、提供编码人或鼠IFN的基因序列，记为IFN序列；
S40、将所述RBD序列和IFN序列连接至所述Fc序列的两端，得到融合蛋白基因RBD-Fc-IFN；
S50、将所述融合蛋白基因RBD-Fc-IFN接入pCMV-MCS-3flag质粒，得到重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN；
S60、将所述重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN转染至293T细胞并培养预定时间后，收集转染上清液；
S70、对所述转染上清液进行纯化处理，得到RBD-Fc-IFN融合蛋白，即制得所述新型新冠病毒亚单位疫苗。
本实施例通过将编码SARS-CoV-2S蛋白331-524位氨基酸的RBD序列和编码人或鼠IFN的IFN序列分别连接至Fc序列的两端，得到融合蛋白基因RBD-Fc-IFN，所述融合蛋白基因RBD-Fc-IFN表达后得到RBD-Fc-IFN融合蛋白，即制得本实施例中的新型新冠病毒亚单位疫苗。本实施例制得的新型新冠病毒亚单位疫苗利用IFN作为内源佐剂并通过Fc实现RBD二聚体化，实现提高RBD半衰期的同时，增强其免疫原性。所述新型新冠病毒亚单位疫苗有效解决了RBD亚单位疫苗在临床应用中遇到的半衰期短、免疫原性较弱以及联合使用IFN时存在不利因素的问题，为开发安全有效的新型SARS-CoV-2疫苗提供候选疫苗。
在一些实施方式中，所述RBD序列和IFN序列通过编码 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS连接肽的序列连接至所述Fc序列的两端。
在本实施例中，所述RBD序列如SEQ ID.1所示，所述Fc序列如SEQ ID.2 所示，所述编码鼠IFN的基因序列如SEQ ID.3所示，所述编码 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS连接肽的序列如SEQ ID.4所示。本实施例制得的融合蛋白基因RBD-Fc-IFN如SEQ ID.5所示。
在一些实施方式中，将所述融合蛋白基因RBD-Fc-IFN接入 pCMV-MCS-3flag质粒的步骤包括：采用HindIII酶和EcoRI酶对所述融合蛋白基因RBD-Fc-IFN以及pCMV-MCS-3flag质粒进行酶切处理，使酶切后的融合蛋白基因RBD-Fc-IFN接入pCMV-MCS-3flag质粒，得到重组质粒 pCMV-RBD-Fc-IFN。
在一些实施方式中，将所述重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN转染至293T细胞的步骤包括：将处于对数生长期的293T细胞用胰酶消化后稀释至预定密度，接种到培养皿中，每个培养皿加入无血清培养基；采用转染试剂将所述重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN转染至培养皿中的293T细胞中。
作为举例，使用无内毒素质粒抽提试剂盒抽提所述重组质粒 pCMV-RBD-Fc-IFN，备用；将处于对数生长期的293T细胞用胰酶消化后稀释至5x105/mL的密度，接种到10cm培养皿中，每个培养皿加10ml无血清培养基，培养24小时左右后，利用Lipofectamine 2000转染试剂 (Invitrogen)将重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN转染至培养皿内的293T细胞，并在转染后3-4天后收取转染上清液，所述转染上清液中包括表达的 RBD-Fc-IFN融合蛋白。本实施例制得的RBD-Fc-IFN融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID.6所示。
在一些实施方式中，采用Protein A亲合层析柱对所述转染上清液进行纯化处理。具体来讲，用20mM PBS(PH＝7.4)清洗和平衡纯化柱，上样速度1ml/min，过10倍柱体积。调节上样流速至1ml/min进行转染上清液上样，上样结束后，用20mM PBS(PH＝7.4)清洗纯化柱，上样速度1ml/min，过10倍柱体积。之后使用甘氨酸溶液(PH＝3.0)进行洗脱，洗脱流速为 1ml/min。向收集管中加入一定量的pH8.0的Tris-HCl缓冲液将蛋白调至接近中性，并透析至20mM PBS(PH＝7.4)保存，得到纯化后的RBD-Fc-IFN 融合蛋白。
在一些实施方式中，还提供一种新冠病毒亚单位疫苗，其采用本发明所述新冠病毒亚单位疫苗的构建方法制得，所述新冠病毒亚单位疫苗为RBD-Fc-IFN融合蛋白。
下面通过具体实施例对本发明制备的新冠病毒亚单位疫苗的性能做进一步的测试：
实施例1
RBD-Fc-IFN融合蛋白的血浆半衰期测定
取6只8-10周龄BALB/c小鼠，通过尾静脉注射融合蛋白，每只给药 20μg蛋白，并在注射后12小时、1天、2天、4天、6天、8天、10天和 12通过眼静脉取血，采集的血清经12000rpm离心5min，取上清ELISA检测融合蛋白浓度，结果如图2所示。从图2可以看出，RBD-Fc-IFN融合蛋白在注射小鼠体内12天后，其浓度由6000ng/ml降低为2000ng/ml；而 RBD-His在注射小鼠体内12天后，其浓度由6000ng/ml降低为接近于 0ng/ml。显然RBD-Fc-IFN融合蛋白在体内的半衰期要长于RBD在体内的半衰期。
实施例2
RBD-Fc-IFN融合蛋白诱导产生中和抗体测定
使用5μg RBD-Fc、RBD-Fc-IFN或PBS免疫小鼠，在免疫后第7天通过眼静脉采集血清。采集的血清经12000rpm离心5min，取上清进行梯度稀释，ELISA测定与RBD蛋白的结合情况，结果如图3所示。从图3可以看出RBD-Fc-IFN诱导产生的中和抗体显著高于RBD诱导产生的中和抗体。
实施例3
RBD-Fc-IFN融合蛋白引起细胞免疫应答测定 1，取免疫后小鼠的脾脏，分离淋巴细胞，计数后加入预包被有抗鼠IFN- γ或IL-4捕获抗体的ELISpot板中，之后分别加入5μg/ml的RBD-Fc-IFN、 RBD以及PBS培养72h，计数IFN-γ或IL-4阳性斑点数目，结果如图4所示。从图4可以看出，所述RBD-Fc-IFN免疫小鼠产生较强的Th1型细胞免疫应答。
综上所述，本发明提供的新型新冠病毒亚单位疫苗，通过将SARS-CoV-2 S蛋白RBD和IFN分别连接至IgG1 Fc的两端，利用IFN作为内源佐剂并通过Fc实现RBD二聚体化，实现提高RBD半衰期的同时，增强其免疫原性。本发明提供的新型新冠病毒亚单位疫苗有效解决了RBD亚单位疫苗在临床应用中遇到的半衰期短、免疫原性较弱以及联合使用IFN时存在不利因素的问题，为开发安全有效的新型SARS-CoV-2疫苗提供候选疫苗。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 深圳市众循精准医学研究院
<120> 一种新型新冠病毒亚单位疫苗及其构建方法
<160> 6
<210> 1
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 1
atggagttgg ggctgagctg ggttttcctt gttgctattt tagaaggtgt ccagtgtaac 60
atcaccaacc tgtgcccctt cggcgaggtg ttcaacgcca caaggttcgc cagcgtgtac 120
gcctggaacc ggaagaggat cagcaactgc gtggccgatt acagcgtgct gtacaactcc 180
gccagcttca gcaccttcaa gtgctacggg gtgagcccca caaagctgaa cgacctgtgc 240
ttcacaaacg tgtacgccga tagcttcgtg atcaggggcg atgaggtgag gcagatcgcc 300
cccggccaga caggcaagat cgccgactac aactacaagc tgcccgatga cttcacaggc 360
tgcgtgatcg cctggaacag caacaacctg gatagcaagg tgggcgggaa ctacaactac 420
ctgtaccggc tcttccggaa gagcaacctg aagcccttcg agagggatat cagcacagag 480
atctaccagg ccggcagcac accctgcaac ggggtggagg gcttcaactg ctacttcccc 540
ctgcagagct acgggttcca gcccaccaac ggggtggggt accagcccta cagggtggtg 600
gtgctgagct tcgagctgct gcacgccccc gccaccgtg 639
<210> 2
<211> 693
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 2
gagcccaaga gctgcgacaa gacccacacc tgtccccctt gtcctgcccc tgagctgctg 60
ggcggaccca gcgtgttcct gttcccccca aagcccaagg accagctgat gatcagccgg 120
acccccgaag tgacctgcgt ggtggtggac gtgtcccacg aggaccctga agtgaagttc 180
aattggtacg tggacggcgt ggaggtgcac aacgccaaga ccaagccccg ggaggaacag 240
tacaacagca cctaccgggt ggtgtccgtg ctgaccgtgc tgcaccagga ctggctgaac 300
ggcaaagagt acaagtgcaa ggtctccaac aaggccctgc ctgcccccat cgaaaagacc 360
atcagcaagg ccaagggcca gcccagagaa ccccaggtgt acaccctgcc ccccagcaga 420
gatgagctga ccaagaacca ggtgtccctg acctgcctgg tcaagggctt ctaccccagc 480
gatatcgccg tggagtggga gagcaacggc cagcctgaga acaactacaa gaccaccccc 540
cctgtgctgg acagcgatgg cagcttcctc tacagcaaac tgaccgtgga caagagccgg 600
tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgttgcacg aggccctgca caaccactac 660
acccagaagt ccctgagcct gagccccggc aaa 693
<210> 3
<211> 801
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 3
tgttctctag gatgtgacct gcctcacact tataacctcg ggaacaagag ggccttgaca 60
gtcctggaag aaatgagaag actcccccct ctttcctgcc tgaaggacag gaaggatttt 120
ggattcccct tggagaaggt ggataaccaa cagatccaga aggctcaagc catccttgtg 180
ctaagagatc ttacccagca gattttgaac ctcttcacat caaaagactt gtctgctact 240
tggaatgcaa ctctactaga ctcattctgc aatgacctcc atcagcagct caatgacctc 600
aaagcctgtg tgatgcagga acctcctctg acccaggaag actccctgct ggctgtgagg 660
acatacttcc acaggatcac tgtgtacctg agaaagaaga aacacagcct ctgtgcctgg 720
gaggtgatca gagcagaagt ctggagagcc ctctcttcct caaccaactt gctggcaaga 780
ctgagtgagg agaaggagta a 801
<210> 4
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 4
ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 60
<210> 5
<211> 1959
<212> DNA
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 5
gccaccatgg agttggggct gagctgggtt ttccttgttg ctattttaga aggtgtccag 60
tgtaacatca ccaacctgtg ccccttcggc gaggtgttca acgccacaag gttcgccagc 120
gtgtacgcct ggaaccggaa gaggatcagc aactgcgtgg ccgattacag cgtgctgtac 180
aactccgcca gcttcagcac cttcaagtgc tacggggtga gccccacaaa gctgaacgac 240
ctgtgcttca caaacgtgta cgccgatagc ttcgtgatca ggggcgatga ggtgaggcag 300
atcgcccccg gccagacagg caagatcgcc gactacaact acaagctgcc cgatgacttc 360
acaggctgcg tgatcgcctg gaacagcaac aacctggata gcaaggtggg cgggaactac 420
aactacctgt accggctctt ccggaagagc aacctgaagc ccttcgagag ggatatcagc 480
acagagatct accaggccgg cagcacaccc tgcaacgggg tggagggctt caactgctac 540
ttccccctgc agagctacgg gttccagccc accaacgggg tggggtacca gccctacagg 600
gtggtggtgc tgagcttcga gctgctgcac gcccccgcca ccgtgggcgg tggtggctcc 660
ggcggtggtg gctccggcgg tggtggctcc ggcggtggtg gctccgagcc caagagctgc 720
gacaagaccc acacctgtcc cccttgtcct gcccctgagc tgctgggcgg acccagcgtg 780
ttcctgttcc ccccaaagcc caaggaccag ctgatgatca gccggacccc cgaagtgacc 840
tgcgtggtgg tggacgtgtc ccacgaggac cctgaagtga agttcaattg gtacgtggac 900
ggcgtggagg tgcacaacgc caagaccaag ccccgggagg aacagtacaa cagcacctac 960
cgggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agagtacaag 1020
tgcaaggtct ccaacaaggc cctgcctgcc cccatcgaaa agaccatcag caaggccaag 1080
ggccagccca gagaacccca ggtgtacacc ctgcccccca gcagagatga gctgaccaag 1140
aaccaggtgt ccctgacctg cctggtcaag ggcttctacc ccagcgatat cgccgtggag 1200
tgggagagca acggccagcc tgagaacaac tacaagacca ccccccctgt gctggacagc 1260
gatggcagct tcctctacag caaactgacc gtggacaaga gccggtggca gcagggcaac 1320
gtgttcagct gcagcgtgtt gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1380
agcctgagcc ccggcaaagg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc 1440
agcggcggcg gcggcagctg ttctctagga tgtgacctgc ctcacactta taacctcggg 1500
aacaagaggg ccttgacagt cctggaagaa atgagaagac tcccccctct ttcctgcctg 1560
aaggacagga aggattttgg attccccttg gagaaggtgg ataaccaaca gatccagaag 1620
gctcaagcca tccttgtgct aagagatctt acccagcaga ttttgaacct cttcacatca 1680
aaagacttgt ctgctacttg gaatgcaact ctactagact cattctgcaa tgacctccat 1740
cagcagctca atgacctcaa agcctgtgtg atgcaggaac ctcctctgac ccaggaagac 1800
tccctgctgg ctgtgaggac atacttccac aggatcactg tgtacctgag aaagaagaaa 1860
cacagcctct gtgcctggga ggtgatcaga gcagaagtct ggagagccct ctcttcctca 1920
accaacttgc tggcaagact gagtgaggag aaggagtaa 1959
<210> 6
<211> 650
<212> PRT
<213> 人工序列（rengongxulie）
<400> 6
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Glu Gly
5 10 15
Val Gln Cys Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn
20 25 30
Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser
25 30 35
Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser
40 45 50
Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys
55 60 65 70
Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val
75 80 85
Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr
90 95 100
Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn
105 110 115
Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu
120 125 130
Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu
135 140 145 150
Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn
155 160 165
Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val
170 175 180
Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His
185 190 195
Ala Pro Ala Thr Val Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
200 205 210
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
215 220 225 230
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
235 240 245
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser
250 255 260
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
265 270 275
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
280 285 290
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
295 300 305 310
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
315 320 325
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
330 335 340
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
345 350 355
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
360 365 370
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
375 380 385 390
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
395 400 405
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
410 415 420
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala
425 430 435
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
440 445 450
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
465 470 475 480
Gly Gly Gly Ser Cys Ser Leu Gly Cys Asp Leu Pro His Thr Tyr Asn
485 490 495
Leu Gly Asn Lys Arg Ala Leu Thr Val Leu Glu Glu Met Arg Arg Leu
500 505 510
Pro Pro Leu Ser Cys Leu Lys Asp Arg Lys Asp Phe Gly Phe Pro Leu
515 520 525
Glu Lys Val Asp Asn Gln Gln Ile Gln Lys Ala Gln Ala Ile Leu Val
530 535 540
Leu Arg Asp Leu Thr Gln Gln Ile Leu Asn Leu Phe Thr Ser Lys Asp
545 550 555 560
Leu Ser Ala Thr Trp Asn Ala Thr Leu Leu Asp Ser Phe Cys Asn Asp
565 570 575
Leu His Gln Gln Leu Asn Asp Leu Lys Ala Cys Val Met Gln Glu Pro
580 585 590
Pro Leu Thr Gln Glu Asp Ser Leu Leu Ala Val Arg Thr Tyr Phe His
595 600 605
Arg Ile Thr Val Tyr Leu Arg Lys Lys Lys His Ser Leu Cys Ala Trp
610 615 620
Glu Val Ile Arg Ala Glu Val Trp Arg Ala Leu Ser Ser Ser Thr Asn
625 630 635 640
Leu Leu Ala Arg Leu Ser Glu Glu Lys Glu
645 650

Claims (6)

1.一种新型新冠病毒亚单位疫苗的构建方法，其特征在于，包括步骤：
提供编码SARS-CoV-2S蛋白331-524位氨基酸的基因序列，记为RBD序列；
提供编码人IgG1 Fc区的基因序列，记为Fc序列；
提供编码人或鼠IFN的基因序列，记为IFN序列；
将所述RBD序列和IFN序列连接至所述Fc序列的两端，得到融合蛋白基因RBD-Fc-IFN；
将所述融合蛋白基因RBD-Fc-IFN接入pCMV-MCS-3flag质粒，得到重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN；
将所述重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN转染至293T细胞并培养预定时间后，收集转染上清液；
对所述转染上清液进行纯化处理，得到RBD-Fc-IFN融合蛋白，即制得所述新型新冠病毒亚单位疫苗。
2.根据权利要求1所述新冠病毒亚单位疫苗的构建方法，其特征在于，所述RBD序列和IFN序列通过编码GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS连接肽的序列连接至所述Fc序列的两端。
3.根据权利要求1所述新冠病毒亚单位疫苗的构建方法，其特征在于，将所述融合蛋白基因RBD-Fc-IFN接入pCMV-MCS-3flag质粒的步骤包括：
采用HindIII酶和EcoRI酶对所述融合蛋白基因RBD-Fc-IFN以及pCMV-MCS-3flag质粒进行酶切处理，使酶切后的融合蛋白基因RBD-Fc-IFN接入pCMV-MCS-3flag质粒，得到重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN。
4.根据权利要求1所述新冠病毒亚单位疫苗的构建方法，其特征在于，将所述重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN转染至293T细胞的步骤包括：
将处于对数生长期的293T细胞用胰酶消化后稀释至预定密度，接种到培养皿中，每个培养皿加入无血清培养基；
采用转染试剂将所述重组质粒pCMV-RBD-Fc-IFN转染至培养皿中的293T细胞中。
5.根据权利要求1所述新冠病毒亚单位疫苗的构建方法，其特征在于，对所述转染上清液进行纯化处理的步骤包括：
采用Protein A亲合层析柱对所述转染上清液进行纯化处理。
6.一种新冠病毒亚单位疫苗，其特征在于，采用权利要求1-5任一所述新冠病毒亚单位疫苗的构建方法制得，所述新冠病毒亚单位疫苗为RBD-Fc-IFN融合蛋白。
CN202110363334.5A 2021-04-02 2021-04-02 一种新冠病毒亚单位疫苗及其构建方法 Active CN113336857B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110363334.5A CN113336857B (zh) 2021-04-02 2021-04-02 一种新冠病毒亚单位疫苗及其构建方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110363334.5A CN113336857B (zh) 2021-04-02 2021-04-02 一种新冠病毒亚单位疫苗及其构建方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113336857A true CN113336857A (zh) 2021-09-03
CN113336857B CN113336857B (zh) 2023-01-31

Family

ID=77467878

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110363334.5A Active CN113336857B (zh) 2021-04-02 2021-04-02 一种新冠病毒亚单位疫苗及其构建方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113336857B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114874340A (zh) * 2022-05-30 2022-08-09 衢州学院 一种新型冠状病毒刺突蛋白与人γ干扰素融合蛋白及制备方法
CN115368468A (zh) * 2021-05-18 2022-11-22 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2突变体疫苗与应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111333704A (zh) * 2020-02-24 2020-06-26 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所 新型冠状病毒covid-19疫苗、制备方法及其应用
CN111662389A (zh) * 2020-06-05 2020-09-15 广州中医药大学(广州中医药研究院) 一种SARS-CoV-2的融合蛋白及其疫苗组合物
CN111732638A (zh) * 2020-07-02 2020-10-02 重庆博唯佰泰生物制药有限公司 一种针对SARS-CoV-2的疫苗
US20200407402A1 (en) * 2020-06-29 2020-12-31 The Scripps Research Institute Stabilized Coronavirus Spike (S) Protein Immunogens and Related Vaccines
CN112156183A (zh) * 2020-08-21 2021-01-01 浙江皇冠科技有限公司 一种CpG复合佐剂及作为新型冠状病毒疫苗佐剂的用途
CN112225814A (zh) * 2020-09-29 2021-01-15 东莞博盛生物科技有限公司 一种新型冠状病毒rbd融合蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用
CN112500498A (zh) * 2020-02-26 2021-03-16 四川大学 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111333704A (zh) * 2020-02-24 2020-06-26 军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所 新型冠状病毒covid-19疫苗、制备方法及其应用
CN112500498A (zh) * 2020-02-26 2021-03-16 四川大学 新型冠状病毒疫苗及其制备方法和应用
CN111662389A (zh) * 2020-06-05 2020-09-15 广州中医药大学(广州中医药研究院) 一种SARS-CoV-2的融合蛋白及其疫苗组合物
US20200407402A1 (en) * 2020-06-29 2020-12-31 The Scripps Research Institute Stabilized Coronavirus Spike (S) Protein Immunogens and Related Vaccines
CN111732638A (zh) * 2020-07-02 2020-10-02 重庆博唯佰泰生物制药有限公司 一种针对SARS-CoV-2的疫苗
CN112156183A (zh) * 2020-08-21 2021-01-01 浙江皇冠科技有限公司 一种CpG复合佐剂及作为新型冠状病毒疫苗佐剂的用途
CN112225814A (zh) * 2020-09-29 2021-01-15 东莞博盛生物科技有限公司 一种新型冠状病毒rbd融合蛋白亚单位疫苗及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SHICHANGHONG等: "Therapeutic efficacy of a tuberculosis DNA vaccine encoding heat shock protein 65 of Mycobacterium tuberculosis and the human interleukin 2 fusion gene", 《TUBERCULOSIS》 *
罗满林主编: "《兽医生物制品学》", 30 April 2019, 中国农业大学出版社 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115368468A (zh) * 2021-05-18 2022-11-22 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2突变体疫苗与应用
WO2022242649A1 (zh) * 2021-05-18 2022-11-24 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2突变体疫苗与应用
CN115368468B (zh) * 2021-05-18 2025-09-23 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 一种新型冠状病毒SARS-CoV-2突变体疫苗与应用
CN114874340A (zh) * 2022-05-30 2022-08-09 衢州学院 一种新型冠状病毒刺突蛋白与人γ干扰素融合蛋白及制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113336857B (zh) 2023-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN103483421B (zh) 用于治疗hbv感染及相关疾病的多肽及抗体
WO2024109611A1 (zh) 突变型呼吸道合胞病毒融合前f蛋白及其应用
CN113185613A (zh) 新型冠状病毒s蛋白及其亚单位疫苗
CN111217918A (zh) 一种基于2,4-二氧四氢喋啶合酶的新型冠状病毒s蛋白双区域亚单位纳米疫苗
JP7090335B2 (ja) 治療剤に対する免疫応答を除去するための改善された方法及び化合物
WO2022184027A1 (zh) 一种新型冠状病毒多价抗原、其制备方法和应用
EP4282880A1 (en) Fully human broad-spectrum neutralizing antibody 76e1 against coronavirus, and use thereof
CN113943373A (zh) 一种β冠状病毒多聚体抗原、其制备方法和应用
CN114106164B (zh) 抗新型冠状病毒s蛋白的单克隆抗体及其应用
CN111040036B (zh) 抗gpc3单克隆抗体、由其修饰的免疫效应细胞及其应用
CN116547000A (zh) 经修饰的红细胞及其在递送活性剂中的用途
CN115160433B (zh) 人源化hbv b和c基因型前s1蛋白抗体及其应用
WO2022207645A1 (en) Sars-cov-2 subunit vaccine
JP2023540486A (ja) 免疫原性コロナウイルス融合タンパク質および関連方法
CN120022357A (zh) 融合蛋白疫苗平台的构建与应用
CN113336857A (zh) 一种新型新冠病毒亚单位疫苗及其构建方法
EP2834263B9 (en) Epitope-scaffold immunogens against respiratory syncytial virusm (rsv)
CN119562828A (zh) 抗ccr8抗体及其应用
CN119735707B (zh) 一种猴痘病毒多抗原单价疫苗及其应用
US20170198014A1 (en) Polypeptides and their use for treating influenza
US20100055135A1 (en) Enhancin of hepatitis b virus vaccine and its gene
TW202239960A (zh) 新型冠狀病毒疫苗組合物及其用途
US10772949B2 (en) Dengue virus glycoprotein E DIII variants and uses thereof
CN120209163B (zh) 一种cart细胞的制备方法及其在抗肿瘤治疗中的应用
RU2848314C1 (ru) Профилактика и лечение бетакоронавируса

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant