CN113336836A - 一种水貂蛙抗菌肽的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水貂蛙抗菌肽的制备方法及其应用，属于生物工程技术领域，包括以下步骤：所述水貂蛙抗菌肽为[D4K]B2RP，所述[D4K]B2RP的序列为GIWKTIKSMGKVFAGKILQNL，并在该序列的3′端加入氨基酸形成[D4K]B2RPR，将[D4K]B2RPR与[D4K]B2RPR之间通过Gly和Arg连接，进行多次重复串联，形成抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM；将所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM连接至PGEX‑4T‑2载体上，并与PGEX‑4T‑2载体自带的融合蛋白GST标签进行融合表达出抗菌肽多聚体融合蛋白；上GST标签亲和层析柱，去除GST标签，得到抗菌肽单体[D4K]B2RPR。通过该制备方法能够大大提高抗菌肽的产量，且制备相对精简，有利于降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体属于一种水貂蛙抗菌肽的制备方法及其应用。
背景技术
从1928年英国科学家弗莱明发现了青霉素开始，抗生素在对抗病魔的应用上已经八十多年之久，然而毫无节制的使用抗生素使得目前抗生素的药效减弱，而细菌的耐药性增强。在中国每年生产抗生素原料大约21万吨，除去原料出口大概3万吨之外，其与的18万吨在国内使用，包括在医疗与农业等领域的使用，中国研制一个抗生素大约需要十年时间，而产生耐药菌素却在两年之内。然而现在抗生素的开发正变得越来越难，而多种类抗生素的全民式滥用，催生病菌的强耐药能力，这使得医生也对它们几乎束手无策。
目前，抗生素的滥用问题及其严重，抗生素的残留以及微生物产生耐药性的问题很是突出，细菌性的疾病感染问题再次威胁到人类的生命健康。而随着细菌抗药性继续增强，新的“超级细菌”还会陆续出现，如果不对抗生素使用加以有效控制的话，很有可能真的出现无药可用的局面。
抗菌肽作为短肽，具有易被降解，而且不易产生耐受性，抗菌效果良好等特点，有望成为替代抗生素的新型替代物而被广泛研究。目前，抗菌肽的制备主要有从动植物原料提取、化学合成及基因工程表达三种生产手段。然而，由于动植物原料提取以及化学合成的生产制备产量低，成本较高，很难进行大规模生产，尚未实现其产业化。再者也不能一味追求抗菌效果，还需要考虑抗菌肽的溶血率，因此，到目前为止，很难找到真正适合、具有良好应用前景的抗菌肽。
发明内容
针对背景技术中存在的缺陷和不足，本发明提供了一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，通过该制备方法能够大大提高抗菌肽的产量，且制备相对精简，有利于降低生产成本。
本发明的目的之二是将上述一种水貂蛙抗菌肽的制备方法制备得到的抗菌肽[D4K]B2RPR应用于抗生素的替代药物中，从而有利于减少抗生素的使用，且对环境更友好。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：
抗菌肽多聚体的设计：所述水貂蛙抗菌肽为[D4K]B2RP，所述[D4K]B2RP的序列为GIWKTIKSMGKVFAGKILQNL，并在该序列的3′端加入氨基酸形成[D4K]B2RPR，将[D4K]B2RPR与[D4K]B2RPR之间通过Gly和Arg连接，进行多次重复串联，形成抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM；
抗菌肽多聚体的融合表达：将所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM连接至PGEX-4T-2载体上，并与PGEX-4T-2载体自带的融合蛋白GST标签进行融合表达出抗菌肽多聚体融合蛋白，且所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM与融合蛋白GST标签之间通过Gly和Arg进行连接；
水解与去除标签：将所述抗菌肽多聚体融合蛋白通过凝血酶进行水解，上GST标签亲和层析柱，去除GST标签，得到抗菌肽单体[D4K]B2RPR。
进一步所采取的措施是：所述[D4K]B2RPR进行四次重复串联，形成所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM的氨基酸序列为GIWKTIKSMGKVFAGKILQNLRGIWKTIKSMGKVFAGKILQNLRGIWKTIKSMGKVFAGKILQNLRGIWKTIKSMGKVFAGKILQNLR。
进一步所采取的措施是：还包括步骤：偏好密码子优化：将设计好的所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM的氨基酸序列基于大肠杆菌进行偏好密码子优化，并进行核苷酸序列合成，并在所述核苷酸序列两端引入BamH I和EcoR I位点。
进一步所采取的措施是：所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM的氨基酸序列基于大肠杆菌进行偏好密码子优化得到核苷酸序列如SEQ 1。
进一步所采取的措施是：还包括步骤：通过双酶切和PCR进行重组子验证：设计一对引物进行重组子鉴定，其中上游引物位于抗菌肽多聚体上，下游引物位于PGEX-4T-2载体上；然后将含抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM基因序列的载体和PGEX-4T-2载体均用BamH I和EcoR I双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定。
进一步所采取的措施是：所述引物扩增片段大小为368bp，且引物序列分别如下：
F：5'——ATCAAAAGCATGGGCAAGGTT——3'；
R：5'——CCACCTGACGTCTAAGAAACCATT——3'；
所述重组子以F、R为引物进行PCR反应,PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察。
进一步所采取的措施是：所述抗菌肽多聚体的融合表达步骤中，利用PGEX-4T-2载体上的酶切位点BamH I和EcoR I将所述核苷酸序列插入到PGEX-4T-2载体，并导入大肠杆菌BL21中。
进一步所采取的措施是：将含有所述核苷酸序列的大肠杆菌BL21，转入2*YT培养基中进行发酵培养，并待OD600数值接近1.5的时候加入IPTG，进行诱导培养6个小时。
进一步所采取的措施是：所述水解与去除标签步骤中，将诱导培养6个小时后的产物通过GST标签亲和层析，获得纯化后的抗菌肽多聚体融合蛋白。
将上述一种水貂蛙抗菌肽的制备方法制备得到的抗菌肽[D4K]B2RPR应用于抗生素的替代药物。
为了尽可能简化抗菌肽的制备工序，降低生产升本，并有效提高抗菌肽的产量，形成产量化生产和供给抗菌肽，进而可以减少使用抗生素甚至可以替代抗生素，避免抗生素滥用和耐药病菌的爆发，本发明团队经过长期研究，发现并提供了一种新的抗菌肽生产表达方式，利用该方式进行制备抗菌肽，可以大大降低抗菌肽表达过程中对宿主的抑制能力，显著提高抗菌肽的产量，并且该抗菌肽由氨基酸构成，容易被降解，无残留，对环境影响相对较小。
本发明通过长期研究各类抗菌物质，发现可以利用来自蛙皮肤分泌物中分离出来的抗菌肽[D4K]B2RP。C末端a酰胺化的brevinin-2相关肽首次从水貂蛙的皮肤分泌物中分离，B2RP来源于该肽，并与广泛分布的brevinin-2抗菌肽家族的肽序列相似，但是缺乏C端环七肽结构。而[D4K]源自该种抗菌肽与起始发现的B2RP氨基酸序列的差异为：第四个氨基酸原本为D，而该种抗菌肽的第四个氨基酸为K，所以全称为[D4K]B2RP。而[D4K]B2RPR则是在[D4K]B2RP序列的3’末端加入了氨基酸R作为接口，即在[D4K]B2RP中加入R，形成新的抗菌肽[D4K]B2RPR。
[D4K]B2RP是一种广谱阳离子抗菌肽，对变异链球菌等多种微生物具有良好抑制作用，且氨基酸构成精简，很容易被降解，不会对环境产生影响或者危害。
形成接口的方式很多，但是如何能够精简、方便的加入适合的接口且不会影响抗菌肽的活性，还能够实现重复串联，进而使得生产工艺更加的精简、高效，本申请巧妙的通过在[D4K]B2RP序列的3’末端加入了氨基酸Arg作为接口，形成新的抗菌肽[D4K]B2RPR，从而可以将[D4K]B2RPR进行多次重复串联，形成[D4K]B2RPR多聚体。通过在[D4K]B2RP序列的3′端加入氨基酸形成[D4K]B2RPR，引入阳性氨基酸不会降低阳离子抗菌肽活性，且整体抗菌活性良好，而能便捷高效的串联形成[D4K]B2RPR多聚体，例如进行四次重复串联，重复串联四次形成的多聚体[D4K]B2RPRM，可以大大降低抗菌肽表达过程中对宿主的抑制能力，并显著提高抗菌肽的产量。
本发明通过在[D4K]B2RPR与[D4K]B2RPR之间通过Gly和Arg连接，且抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM与融合蛋白GST标签之间也通过Gly和Arg进行连接，而这些位点都可用凝血酶进行切割，使得分离纯化水解获得抗菌肽单体只需要通过单个凝血酶进行水解即可，进而大大简化分离、纯化步骤，降低制备成本，也有利于提高产量。
本发明还通过双酶切和PCR进行重组子验证，并设计出引物扩增片段大小为368bp，以及相应的引物核苷酸序列，并通过PCR扩增出368bp的条带重组子为阳性转化子。
本发明制备得到的抗菌肽[D4K]B2RPR安全、有效、对环境友好，并为日后的扩大量产打下了坚实的技术基础，有望推广应用于抗生素的替代药物中，从而减少抗生素的使用，预防超级病菌的爆发，保护环境和生物健康。
通过上述技术方案，本发明与现有技术相比，所具有的有益效果如下：
1、本发明通过在[D4K]B2RP序列的3′端加入氨基酸形成[D4K]B2RPR，引入阳性氨基酸不会降低阳离子抗菌肽活性，且整体抗菌活性良好，而串联形成的[D4K]B2RPR多聚体可以大大降低抗菌肽表达过程中对宿主的抑制能力，并显著提高抗菌肽的产量。
2、本发明在各[D4K]B2RPR之间，以及抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM与融合蛋白GST标签之间都通过Gly和Arg进行连接，使得分离纯化水解获得抗菌肽单体只需要通过单个凝血酶进行水解即可，进而大大简化分离、纯化步骤，降低制备成本，也有利于提高产量。
3、本发明制备得到的抗菌肽[D4K]B2RPR安全、有效、溶血率表现良好，对环境友好，填补了行业空白，并为日后的扩大量产打下了技术基础，有望推广应用于抗生素的替代药物中，从而减少抗生素的使用，预防超级细菌的爆发，保护环境和生物健康。
附图说明
图1为重组载体PCR验证琼脂糖凝胶电泳结果图；
图2为蛋白诱导表达SDS-PAGE电泳结果图；
图3为亲和纯化SDS-PAGE电泳分析结果图；
图4为抗菌肽对变异链球菌的MIC柱形图；
图5为抗菌肽对大肠杆菌的MIC的柱形图；
图6为抗菌肽的溶血率测试结果折线图。
具体实施方式
为了更清楚的了解本发明所采用的技术方案，下面对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明一种实施例：一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：
抗菌肽多聚体的设计：所述水貂蛙抗菌肽为[D4K]B2RP，所述[D4K]B2RP的序列为GIWKTIKSMGKVFAGKILQNL，并在该序列的3′端加入氨基酸形成[D4K]B2RPR，将[D4K]B2RPR与[D4K]B2RPR之间通过Gly和Arg连接，进行多次重复串联，形成抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM；
抗菌肽多聚体的融合表达：将所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM连接至PGEX-4T-2载体上，并与PGEX-4T-2载体自带的融合蛋白GST标签进行融合表达出抗菌肽多聚体融合蛋白，且所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM与融合蛋白GST标签之间通过Gly和Arg进行连接；
水解与去除标签：将所述抗菌肽多聚体融合蛋白通过凝血酶进行水解，上GST标签亲和层析柱，去除GST标签，得到抗菌肽单体[D4K]B2RPR。
将[D4K]B2RPR进行四次重复串联，形成抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM的氨基酸序列为GIWKTIKSMGKVFAGKILQNLRGIWKTIKSMGKVFAGKILQNLRGIWKTIKSMGKVFAGKILQNLRGIWKTIKSMGKVFAGKILQNLR。
还包括步骤：偏好密码子优化：将设计好的所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM的氨基酸序列基于大肠杆菌进行偏好密码子优化，优化得到核苷酸序列如SEQ 1，并进行核苷酸序列合成，并在两端引入BamH I和EcoR I位点，便于克隆至融合表达载体PGEX-4T-2中。
还包括步骤：通过双酶切和PCR进行重组子验证：设计一对引物进行重组子鉴定，其中上游引物位于抗菌肽多聚体上，下游引物位于PGEX-4T-2载体上；然后将含抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM基因序列的载体和PGEX-4T-2载体均用BamH I和EcoR I双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定。
其中引物扩增片段大小为368bp，且引物核苷酸序列分别如下：
F：5'——ATCAAAAGCATGGGCAAGGTT——3'；
R：5'——CCACCTGACGTCTAAGAAACCATT——3'；
所述重组子以F、R为引物进行PCR反应,PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察。
在抗菌肽多聚体的融合表达步骤中，利用PGEX-4T-2载体上的酶切位点BamH I和EcoR I将所述核苷酸序列插入到PGEX-4T-2载体，并导入大肠杆菌BL21中；将含有所述核苷酸序列的大肠杆菌BL21，转入2*YT培养基中进行发酵培养，并待OD600数值接近1.5的时候加入IPTG，进行诱导培养6个小时；将诱导培养6个小时后的产物通过GST标签亲和层析，获得纯化后的抗菌肽多聚体融合蛋白。
将上述实施例制备得到的抗菌肽[D4K]B2RPR应用于抗生素的替代药物。
为了更好的理解本实施例，特将本实施例的整个试验过程记录的详细内容进行展示，且为了验证本实施例的成功表达及效果，进行了相关验证试验，详细情况如下。
本实施例设计好的序列优化密码子，由金斯瑞生物科技股份有限公司进行合成，同时委托金斯瑞生物科技股份有限公司合成[D4K]B2RPR，进行对比实验，并通过抑菌圈实验和MIC实验进行表达抗菌肽的活性测定。
1.重组阳性质粒转化酵母菌株与筛选
本实施例所选用的转基因受体为大肠杆菌(Escherichia coli BL21)。从平板上挑取大肠杆菌宿主菌单菌落，接种至3mL LB液体培养基的试管中，37℃、200r/min过夜(16-18h)。取1mL菌液接种到含有100mL的LB培养基的锥形瓶中，37℃摇振培养2～3h，待培养2h后每隔20min测定OD600值来检测培养物的生长情况，待OD600值达到0.5～0.6时，立即将锥形瓶冰浴15min，使培养物冷却至0℃。在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、用冰预冷的50mL离心管中。在4℃条件下，以4000r/min离心10min，回收细胞。倒出培养液，将离心管倒置于滤纸上1min，以使最后残留的培养液流尽。用约20mL(每管10mL)用冰预冷的0.1mol/LCaCl2溶液重悬菌体(重悬时操作要轻)，冰浴30min。在4℃条件下，以4000r/min离心10min，回收细胞。弃去上清液，倒置于滤纸上1min，以使最后残留的液体流尽。再加4mL用冰预冷的0.1mol/L CaCl2溶液轻轻振荡重悬菌体。将感受态细胞分装于Eppendorf管中，每份200μL，加入30％体积的甘油保存液，置于-80℃冰箱冻存备用。
质粒转化入大肠杆菌(Escherichia coli BL21)
取200μL制备好的感受态细胞于无菌的Eppendorf管中。每管加入待转化的质粒10μL(质粒约30-50ng)，轻轻地用枪头将质粒与感受态细胞混合均匀，冰浴30min。将冰浴混合液于42℃水浴中热休克2min，不要摇动离心管。取出冰浴冷却2min。每管加入预热至37℃的无Kana的LB培养基800μL，37℃，150r/min温和摇振45min。取0.2mL菌液涂布含有Kana的LBK平板，37℃倒置培养12～16h。同时做阴性对照，即用蒸馏水代替质粒。
重组子以F、R为引物进行PCR反应,PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察。
试验结果如图1所示，图中，M为D2000加标记；1-3为pGEX-4T-2载体；4、5为阴性对照ddH2O；6、7为含抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM目的基因的PGEX-4T-2载体pGEX-4T-2-[D4K]B2RPRM。
由图1中可以明显看出，泳道1-5为去掉关键条件的试验，均无产物扩增出条带；而在泳道6、7均能扩增出与预期的介于250bp和500bp之间的368bp条带，表明成功将目的基因构建至载体pGEX-4T-2上。
2.阳性克隆的诱导表达
将筛选到的阳性重组菌单菌落接种于含100μg/mL AMP的2*YT培养液中，37℃振摇培养18个小时。取此菌液按1％体积比转接于2*YT培养基中，37℃摇振培养至OD600值约为1.5。往培养物中加入IPTG至浓度为1mM，诱导培养6个小时。4℃5000r/min离心10min，收集沉淀进行SDS-PAGE验证表达。
试验结果如图2所示，图中M未标记物；1为pGEX-4T-2不含IPTG；2为pGEX-4T-2与IPTG；3为pGEX-4T-2-[D4K]B2RPRM，不含IPTG；4为pGEX-4T-2-[D4K]B2RPRM与IPTG；5为蛋白质印迹Western Blot。
由图2中可以明显看出，泳道4于33KDa和43KDa之间比泳道3多一条带，与预期目的蛋白36KDa相符，且Western Blot结果在相应位置出现杂交带，表明成功在工程菌中诱导表达抗菌肽多聚体融合蛋白GST-[D4K]B2RPRM。
3.抗菌肽多聚体融合蛋白表达量检测
将Rosetta在30℃条件下培养至OD值为1.5左右，加入1mM IPTG诱导8h后，纯化得到的抗菌肽多聚体融合蛋白，再通过BCA法进行检测表达量。
最终测得融合蛋白表达量为274.52mg/L，可以表明抗菌肽多聚体融合蛋白不会对底盘抑制，能够大大降低抗菌肽表达过程中对宿主的抑制能力，生长良好，远远高于单体的抑菌值，为以后的量化生产打下了基础。
4.抗菌肽多聚体融合蛋白的分离纯化和水解
制备细胞裂解液：4℃离心10分钟(3000g)收获细胞，弃上清。用冷1×PBS重悬细胞(每50ml细胞培养基所需3ml冷1×PBS)，4℃离心10分钟(3000g)收获细胞，弃上清。将细胞置于-80℃冷冻1小时。在冰上解冻细胞，用步骤2中同样量的冷1×PBS重悬细胞。用超声波破碎法在冰上破碎细胞(35min)，直到样品不再是粘性则破碎完全。4℃离心10分钟(12,000g)，并小心将上清(可溶组分)转移至一支预冷的洁净试管中，用步骤2中同样量的冷1×PBS重悬沉淀(不溶组分)。分别吸取10μl的可溶组分和不溶组分，用SDS-PAGE分析GST融合蛋白的含量及可溶性。
纯化重组GST融合串联抗菌肽蛋白：轻轻摇动高亲和力GST纯化介质以充分重悬。吸取适量的浆液至重力柱中。通常1ml柱体积的树脂可以吸附35-45mg GST标签蛋白(26kDa)。用10倍柱体积的冷1×PBS(4℃)洗涤高亲和力GST纯化介质。将制备好的含有GST融合蛋白的澄清细胞裂解液加入到层析柱中，流速控制为10-15cm/h。裂解液全部流出层析柱后就立刻加入1×PBS清洗柱子，所需量大约为柱体积的20倍。同时也可以加入PMSF等蛋白酶抑制剂抑制蛋白酶的活性。用10-15倍柱体积的现配10mM谷胱甘肽洗脱液(0.154g还原性谷胱甘肽溶于50ml50 mM Tris-HCl,pH 8.0)洗脱融合蛋白。用紫外分光光度计测定洗脱液A280值，计算洗脱液蛋白浓度。分别吸取10-20μl GST融合蛋白原液、流出液、洗涤液和洗脱液，通过SDS-PAGE电泳分析各样品，确定是否存在标签蛋白。洗脱液可以通过4℃透析或者分子筛去除游离的谷胱甘肽。
试验结果如图3所示，图中M为标记物；1为pGEX-4T-2不含IPTG；2为pGEX-4T-2与IPTG；3为pGEX-4T-2-[D4K]B2RPRM，不含IPTG；4为pGEX-4T-2-[D4K]B2RPRM与IPTG；5-6为净化的流出物；7为纯化的洗涤剂；8为纯化的洗脱液。
由图3中可以看出，泳道8中可观察到于33KDa和43KDa之间有条带出现，符合预期大小，表明已成功纯化出串联融合抗菌肽蛋白即抗菌肽多聚体融合蛋白。
串联融合抗菌肽蛋白的水解：反应体系中酶切缓冲溶液为20mM Tris-HCl缓冲液，含150mM NaCl，pH8.0。1mL串联融合蛋白浓度为1mg/mL，加入15μL的1U/μL的凝血酶，22℃酶切8h。重新过GST亲和层析柱，去除GST蛋白，得到抗菌肽单体[D4K]B2RPR。
5.抗菌肽单体活性测定
菌种活化：通过MIC法对表达抗菌肽单体的活性进行测定。从-80℃冰箱中取出一支甘油保存管，划线培养过夜活化，挑取单菌落接种至30mL培养活化，按1:100比例接种于灭菌三角烧瓶中的BHI培养基中，微氧培养20h。再按1：100的菌液与培养基的比例稀释菌种。
肉汤微量稀释方法：在96孔板的第1-12孔中分别加入空白BHI培养基100μl。在A/B/C(平行测3次)三排的第1孔加抗菌肽水解粗溶液100μl，然后对药物进行二倍稀释。即，第1孔中加入药液后用移液枪充分吹打(至少三次以上)使药物与BHI充分混匀，然后从第一孔中吸取100μl加入第二孔再充分吹打使之与BHI充分混匀，照此重复直至第4孔。在第1-10中加入稀释好的菌液100μl，这样就形成测定一个药物MIC值的三次重复(A/B/C三排样品)；第5孔加入100μL菌液，第6孔加100μL BHI。将96孔板置于厌氧培养中培养24h后，测定OD600，在最小浓度抗菌肽作用下，孔中OD至变化＜0.05。
试验结果如图4和图5所示，图中B2RPR为[D4K]B2RPR；B2RP为[D4K]B2RP。
由图4显示可知，[D4K]B2RPR的MIC值为20μg/mL，[D4K]B2RP的MIC值为5μg/mL，虽然[D4K]B2RPR活性没有原来的[D4K]B2RP高，但也能看出[D4K]B2RPR达到抑菌效果需要的单体浓度很低，具有良好的抗菌活性，表明抗菌肽[D4K]B2RPR具有良好的抑制变异链球菌生长的能力。而且在水解纯化获得单体具有活性的抗菌肽方面，[D4K]B2RPR比[D4K]B2RP更方便，仅需单酶水解，成本更低。
由图5可以看出，[D4K]B2RPR的MIC值为10μg/mL，[D4K]B2RP的MIC值为5μg/mL，[D4K]B2RP的活性比[D4K]B2RPR的活性更高，但可以看出[D4K]B2RPR达到抑菌效果需要的单体浓度很低，具有良好的抗菌活性，表明[D4K]B2RPR对大肠杆菌具有良好的抑菌能力，从而也能看出直接表达[D4K]B2RP会对底盘如大肠杆菌的生长造成强烈的抑制，甚至长不起来，无法进行大量制备、生产。
而结合试验3的结果，测得融合蛋白表达量为274.52mg/L，那么换算成单体[D4K]B2RPR则为76.26μg/mL，比[D4K]B2RPR对大肠杆菌的MIC为10μg/mL，高出7.6倍，说明通过本实施例能够显著提升抗菌肽的[D4K]B2RPR的产量。
6.溶血率测定
用360μL 1％红细胞悬液加入40μL系列稀释梯度(200μg/mL，100μg/mL，50μg/mL，25μg/mL，12.5μg/mL，6.25μg/mL，3.125μg/mL，1.5625μg/mL，0.78125μg/mL，0.390625μg/mL)的抗菌肽[D4K]B2RP和[D4K]B2RPR。分别以10％的TritonX-100、PBS溶液40μL为阳性和阴性对照，各做4组平行对照，37℃培养3h后，用酶标仪检测540nm处吸光值。按照公式计算溶血率。红细胞溶血率(％)＝(实验孔OD540值-阴性对照孔OD540值)/(阳性对照孔OD540值-阴性对照孔OD540值)×100％。
结果如图6所示，图中B2RPR为[D4K]B2RPR；B2RP为[D4K]B2RP。
从图6中可以看出，在200μg/mL时，两种抗菌肽的溶血率均高于5％，当两种抗菌肽的浓度低于100μg/mL时，其溶血率都小于5％，几乎无溶血性，结合上面测得MIC值可知，在达到抑菌效果的时候，溶血率均未超过5％，同时抑菌效果又表现良好，因此本实施例制备出来的[D4K]B2RPR具有良好的应用前景。
以上所述仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通人员对本发明的技术方案所做的均等修饰与变化，只要不脱离本发明创造整体构思的情况下，均仍属于本发明创造涵盖的范围之中。
序列表
<110> 深圳职业技术学院
<120> 一种水貂蛙抗菌肽的制备方法及其应用
<130> 2021.01.01
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 282
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatccaggg gaatatggaa aacaattaag tcaatgggta aagttttcgc tggcaaaatc 60
ctgcaaaacc tgcgtggcat ctggaaaacc attaaaagca tgggtaaggt gtttgcgggc 120
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gtttttgcag gcaagatcct gcagaatttg cgttaagaat tc 282
Claims (10)
1.一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
抗菌肽多聚体的设计：所述水貂蛙抗菌肽为[D4K]B2RP，所述[D4K]B2RP的序列为GIWKTIKSMGKVFAGKILQNL，并在该序列的3′端加入氨基酸形成[D4K]B2RPR，将[D4K]B2RPR与[D4K]B2RPR之间通过Gly和Arg连接，进行多次重复串联，形成抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM；
抗菌肽多聚体的融合表达：将所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM连接至PGEX-4T-2载体上，并与PGEX-4T-2载体自带的融合蛋白GST标签进行融合表达出抗菌肽多聚体融合蛋白，且所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM与融合蛋白GST标签之间通过Gly和Arg进行连接；
水解与去除标签：将所述抗菌肽多聚体融合蛋白通过凝血酶进行水解，上GST标签亲和层析柱，去除GST标签，得到抗菌肽单体[D4K]B2RPR。
2.根据权利要求1的一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：所述[D4K]B2RPR进行四次重复串联，形成所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM的氨基酸序列为GIWKTIKSMGKVFAGKILQNLRGIWKTIKSMGKVFAGKILQNLRGIWKTIKSMGKVFAGKILQNLRGIWKTIKSMGKVFAGKILQNLR。
3.根据权利要求2的一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：还包括步骤：偏好密码子优化：将设计好的所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM的氨基酸序列基于大肠杆菌进行偏好密码子优化，并进行核苷酸序列合成，并在所述核苷酸序列两端引入BamHI和EcoRI位点。
4.根据权利要求3的一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：所述抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM的氨基酸序列基于大肠杆菌进行偏好密码子优化得到核苷酸序列如SEQ1。
5.根据权利要求4的一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：还包括步骤：通过双酶切和PCR进行重组子验证：在所述核苷酸序列两端引入BamHI和EcoRI位点，并设计一对引物进行重组子鉴定，其中上游引物位于抗菌肽多聚体上，下游引物位于PGEX-4T-2载体上；然后将含抗菌肽多聚体[D4K]B2RPRM基因序列的载体和PGEX-4T-2载体均用BamHI和EcoRI双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定。
6.根据权利要求5的一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：所述引物扩增片段大小为368bp，且引物核苷酸序列分别如下：
F：5'——ATCAAAAGCATGGGCAAGGTT——3'；
R：5'——CCACCTGACGTCTAAGAAACCATT——3'；
所述重组子以F、R为引物进行PCR反应,PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察。
7.根据权利要求3的一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：所述抗菌肽多聚体的融合表达步骤中，利用PGEX-4T-2载体上的酶切位点BamHI和EcoRI将所述核苷酸序列插入到PGEX-4T-2载体，并导入大肠杆菌BL21中。
8.根据权利要求7的一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：将含有所述核苷酸序列的大肠杆菌BL21，转入2*YT培养基中进行发酵培养，并待OD600数值接近1.5的时候加入IPTG，进行诱导培养6个小时。
9.根据权利要求8的一种水貂蛙抗菌肽的制备方法，其特征在于：所述水解与去除标签步骤中，将诱导培养6个小时后的产物通过GST标签亲和层析，获得纯化后的抗菌肽多聚体融合蛋白。
10.将权利要求1-9中任一项所述的一种水貂蛙抗菌肽的制备方法制备得到的抗菌肽[D4K]B2RPR应用于抗生素的替代药物。
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Citations (2)
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| CN110205336A (zh) * | 2019-05-22 | 2019-09-06 | 华南理工大学 | 一种Brevinin-2GUb多肽的重组表达方法及应用 |
Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| CUN-BAO LIU等: "Hydrophilic/hydrophobic characters of antimicrobial peptides derived from animals and their effects on multidrug resistant clinical isolates", 《动物学研究》 * |
| J. MICHAEL CONLON,ET AL.: "Antimicrobial Properties of Brevinin-2-Related Peptide and its Analogs: Efficacy Against Multidrug-Resistant Acinetobacter baumannii", 《CHEM BIOL DRUG DES》 * |
| 刘悦等: "棘胸蛙抗菌肽Spinosan-C的串联表达与活性检测", 《生物工程学报》 * |
| 刘秉文 等: "《医学分子生物学》", 30 November 2000, 中国协和医科大学出版社 * |
| 唐春红: "《天然防腐剂与抗氧化剂》", 31 May 2010, 中国轻工业出版社 * |
| 张丽芳 等: "中国林蛙皮肤抗菌肽temporin-1CEa基因的串联融合表达", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 基础科学辑》 * |
| 粮食大辞典编辑委员会: "《粮食大辞典》", 31 December 2009, 中国物质出版社 * |
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