CN113322303A

CN113322303A - 一种石蜡切片样本核酸提取液及提取方法

Info

Publication number: CN113322303A
Application number: CN202110513982.4A
Authority: CN
Inventors: 宋莲; 翁国武; 季昱
Original assignee: Nanjing Zhongkebio Medical Technology Co ltd
Current assignee: Nanjing Zhongkebio Medical Technology Co ltd
Priority date: 2021-05-12
Filing date: 2021-05-12
Publication date: 2021-08-31

Abstract

本发明公开了一种石蜡切片样本核酸提取液，组分包括：5%~30%液态脱蜡剂、10~300mM的Tris‑HCl、1~100mM的EDTA、0.02~3%的LDS、0.05~3M盐酸胍、0.05~5%的N‑乙酰半胱氨酸、1～30mg/ml氯化钾、0.05～1M氯化钠、0.02～2M氢氧化钠、0.1～10%的曲拉通、0.1～5%的吐温20。本发明提供的核酸提取液可提供强碱环境促进细胞膜破裂核酸释放，同时LDS可有效去除蛋白等杂质，N‑乙酰半胱氨酸可降低样本黏稠度，协助细胞膜破裂，整个提取过程无需经过脱蜡、裂解液、洗涤、洗脱等繁琐操作，无需与离心机、提取仪等配合使用，操作简便，效率高，降低了提取成本。

Description

一种石蜡切片样本核酸提取液及提取方法

技术领域

本发明属于核酸提取技术领域，具体涉及一种石蜡切片样本核酸提取液及提取方法。

背景技术

福尔马林固定石蜡包埋组织作为一种最为方便的临床材料来源，常被用于大宗病例的回顾性研究。近年，随着众多与疾病诊断、预后及治疗相关的分子标记物的出现，以石蜡组织切片为材料进行分子水平的基因检测和筛查已成为临床诊断及相关研究的常规手段。对于各种基因分析方法而言，重要的是首先获得足够纯度和数量的核酸。

目前石蜡切片样本的核酸提取方法及试剂盒绝大部分还是以手工操作为主，整个操作流程比较繁琐且耗时在4个小时以上；有少部分采用含机械臂移液的自动化仪器提取，该仪器属于大型的自动化工作站，仪器成本较高，对于少量样本提取不适合；市场上目前使用较多的提取方法主要是采用离心柱提取法和小型化核酸提取仪提取法；离心柱和小型化核酸提取仪提取法，多数均需要经过脱蜡、裂解液、结合、洗涤、洗脱等步骤；离心柱提取法需要多次使用离心机进行离心，过程较为复杂，不能实现自动化提取；小型核酸提取仪的提取特点是通过磁棒的移动，将结合有核酸的磁珠转移至洗涤、洗脱等缓冲液体系中，最终实现核酸提取纯化的目的，但是小型自动化的机器通量小，且对于需要分步添加试剂的核酸提取方法不能应用于该机器上实现全自动化，需结合手动操作完成半自动提取，虽有一些提取方法已实现集脱蜡、裂解液结合一步的全自动化提取，但该方法仍存在一定的问题，如裂解液不充分、脱蜡不充分等原因造成提取效果差，且核酸孔位存在较多磁珠残留，从而导致下游检测失败，因此目前很多厂家对于石蜡切片样本核酸提取过程中的脱蜡和裂解步骤均采用手工机器结合的半自动化提取，操作过程繁琐不便。

发明内容

有鉴于此，本发明期望提供一种石蜡切片样本核酸提取液及提取方法，以便解决上述现有技术存在的问题。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种石蜡切片样本核酸提取液，包括以下质量份的组分：5%~30%液态脱蜡剂、10mM~300mM的Tris-HCl、1mM~100mM的EDTA、0.02%~3%的LDS（十二烷基硫酸锂）、0.05M~3M的盐酸胍、0.05%~5%的N-乙酰半胱氨酸、1mg/ml～30mg/ml的氯化钾、0.05～1M的氯化钠、0.02～2M的氢氧化钠、0.1%～10%的曲拉通、0.1～5%的吐温20。

优选地，所述质量份的组分为：10%~25%液态脱蜡剂、10mM~200mM的Tris-HCl、1mM~50mM的EDTA、0.1%~1%的LDS、0.5M~1M的盐酸胍、0.5%~2%的N-乙酰半胱氨酸、1mg/ml～10mg/ml的氯化钾、0.05～0.5M的氯化钠、0.02～1M的氢氧化钠、0.1%～2%的曲拉通、0.1～2%的吐温20。

本发明还提供了一种石蜡切片样本核酸提取方法，使用上述核酸提取液，包括：将石蜡切片样本去除周围多余石蜡放入无核酸酶的离心管中，加入所述核酸提取液，放入90℃～98℃恒温振荡孵育仪中振荡孵育20min~60min，中间澄清液即为所提取核酸，可直接取样进行下游PCR等检测。

优选地，所述方法为：将石蜡切片样本去除周围多余石蜡放入无核酸酶的离心管中，加入所述核酸提取液，放入95℃恒温振荡孵育仪中振荡孵育30min，中间层澄清液即为所提取核酸。

本发明有益效果如下：本发明提供的核酸提取液可提供强碱环境促进细胞膜破裂核酸释放，同时LDS可有效去除蛋白等杂质，N-乙酰半胱氨酸可降低样本黏稠度，协助细胞膜破裂，无需经过多步骤处理进行除去杂质，所释放的核酸可直接用于下游PCR等实验，整个提取过程无需使用二甲苯等有机溶剂进行脱蜡，醇类试剂进行洗涤，减少对人体伤害，同时整个提取过程无需经过脱蜡、裂解液、洗涤、洗脱等繁琐操作，减少过程损失，也无需与离心机、提取仪等配合使用，操作简便，效率高，降低了提取成本。

附图说明

图1为荧光定量PCR扩增曲线图；

图2为编号1和编号4样本扩增后的产物琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

为了能够更加详尽地了解本发明的特点与技术内容，下面结合附图对本发明的实现进行详细阐述，所附附图仅供参考说明之用，并非用来限定本发明。

本发明一种石蜡切片样本核酸提取液，包括以下质量份的组分：5%~30%液态脱蜡剂、10mM~300mM的Tris-HCl、1mM~100mM的EDTA、0.02%~3%的LDS、0.05M~3M的盐酸胍、0.05%~5%的N-乙酰半胱氨酸、1mg/ml～30mg/ml的氯化钾、0.05～1M的氯化钠、0.02～2M的氢氧化钠、0.1%～10%的曲拉通、0.1～5%的吐温20。

本发明提供的核酸提取液可提供强碱环境促进细胞膜破裂核酸释放，同时LDS可有效去除蛋白等杂质，N-乙酰半胱氨酸可降低样本黏稠度，协助细胞膜破裂，无需经过多步骤处理进行除去杂质，所释放的核酸可直接用于下游PCR等实验。

本发明一种石蜡切片样本核酸提取方法，使用上述核酸提取液，包括：将石蜡切片样本去除周围多余石蜡放入无核酸酶的离心管中，加入所述核酸提取液，放入90℃～98℃恒温振荡孵育仪中振荡孵育20min~60min，取出离心管中间澄清液即为所提取核酸，可直接取样进行下游PCR等检测。

优选地，所述方法为：将石蜡切片样本去除周围多余石蜡放入无核酸酶的离心管中，加入所述核酸提取液，放入95℃恒温振荡孵育仪中振荡孵育30min，取出离心管中间澄清液即为所提取核酸，可直接取样进行下游PCR等检测。

整个提取过程无需使用二甲苯等有机溶剂进行脱蜡，醇类试剂进行洗涤，减少对人体伤害，同时整个提取过程无需经过脱蜡、裂解液、洗涤、洗脱等繁琐操作，减少过程损失，也无需与离心机、提取仪等配合使用，操作简便，效率高，降低了提取成本。

实施例1

一种石蜡切片样本核酸提取液，包括以下质量份的组分：20%液态脱蜡剂、200mM的Tris-HCl、20mM的EDTA、1M的盐酸胍、1%的N-乙酰半胱氨酸、2mg/ml的氯化钾、0.2M的氯化钠、0.04M的氢氧化钠、1%的曲拉通、1%的吐温20。

实施例2

一种石蜡切片样本核酸提取液，包括以下质量份的组分：20%液态脱蜡剂、200mM的Tris-HCl、20mM的EDTA、1%的LDS、1M的盐酸胍、1%的N-乙酰半胱氨酸、2mg/ml的氯化钾、0.2M的氯化钠、0.04M的氢氧化钠、1%的曲拉通、1%的吐温20。

实施例3

一种石蜡切片样本核酸提取方法，利用实施例2所述的提取液进行提取，具体步骤如下：

（1）将切片样本去除周围多余石蜡放入无核酸酶的1.5ml离心管中；

（2）向离心管中加入500μl核酸提取液，放入95℃恒温振荡孵育仪中振荡孵育30min；

（3）取出离心管，中间澄清溶液即为所提取核酸溶液，可直接取样进行PCR等下游检测。

实施例4

一种石蜡切片样本核酸提取方法，利用实施例1所述的提取液进行提取，具体步骤如下：

（2）向离心管中加入500μl核酸提取液，放入95℃恒温振荡孵育仪（型号：VIB1000）中振荡孵育30min；

对比例

一种石蜡切片样本DNA提取试剂盒和方法，利用上海生工Ezup柱式石蜡切片基因组DNA抽提试剂盒（货号B518269）进行提取，具体步骤如下：

（1）样本处理，将石蜡切片样本加入至1.5ml离心管；

（2）向离心管加入550μl Buffer FLS，再加入50μl Buffer RLA，剧烈涡旋10秒；

（3）95-98℃水浴30分钟，期间颠倒混匀4次；

（4）12000 rpm离心5-10分钟;

（5）小心吸取中间层水相转移至新的离心管中；

（6）向离心管加入2倍体积的无水乙醇，充分混匀，室温静置2-5分钟；

（7）将（6）混合液加入到吸附柱，8000 rpm离心2min，倒掉废液，吸附柱重新放回收集管中；

（8）向吸附柱加入500μl PW Solution，8000 rpm离心2min，倒掉废液，吸附柱重新放回收集管中；

（9）向吸附柱加入600μl PW Solution，8000 rpm离心2min，倒掉废液，吸附柱重新放回收集管中；

（10）重复步骤（9）一次；

（11）将吸附柱放回收集管中，12000 rpm离心2min。

（12）取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30-50μlElution Buffer，静置3分钟，12000 rpm离心2min，即可得到的DNA溶液。

取石蜡切片样本，每3、6、9、12片分别为一组，共4组，分别编号1~4，将每组中的样本均分为3份，得到4组3等份的石蜡切片样本；每组3等份石蜡切片样本分别采用实施案例3、实施例4和对比例中的提取方法进行DNA提取，得到DNA提取溶液后，稀释成同比例DNA溶液后取5μl进行荧光定量PCR扩增，结果如表1和图1所示，并分别取编号1和编号4样本扩增后的产物5μl进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，图2中M：DNA Marker；Y：阴性对照；1-3：依次为编号1样本的实施例3、4和对比例；4-6：依次为编号4样本的实施例3、4和对比例。

表1 荧光定量PCR扩增结果

由表1可知实施例3、4所述方法可以成功对石蜡切片样本进行核酸提取，且所提取的核酸能够满足下游荧光定量PCR检测，与实施例4相比实施例3核酸提取扩增Ct值提前0.5左右，主要原因为实施例3核酸提取液比实施例4提取液中多加了1%的LDS，有利于去除蛋白杂质等，减少了对下游检测的影响，使核酸提取纯度更高；实施例3和4提取扩增Ct值与对比例相比均有所提前，实施例3核酸提取扩增Ct值比对比例提前0.5-1个Ct，扩增电泳图与实施例3差异性不明显，但本发明提取方法的操作步骤明显比对比例少，提取过程无需经过复杂提取步骤，且整个提取过程无需使用离心机等机器；另外本发明提取时间30分钟，比对比例（约50-60分钟）节省20-30分钟，可大大降低时间成本；同时与对比例相比，本发明无需使用洗涤、洗脱等多种试剂成分，可有效节省试剂成本。

以上所涉及器件的具体型号不作限制及详细描述，以上所涉及器件的深入连接方式不作详细描述，作为公知常识，本领域的技术人员能够理解。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种石蜡切片样本核酸提取液，其特征在于，包括以下质量份的组分：5%~30%液态脱蜡剂、10mM~300mM的Tris-HCl、1mM~100mM的EDTA、0.02%~3%的LDS、0.05M~3M的盐酸胍、0.05%~5%的N-乙酰半胱氨酸、1mg/ml～30mg/ml的氯化钾、0.05～1M的氯化钠、0.02～2M的氢氧化钠、0.1%～10%的曲拉通、0.1～5%的吐温20。

2.根据权利要求1所述的一种石蜡切片样本核酸提取液，其特征在于，所述质量份的组分为：10%~25%液态脱蜡剂、10mM~200mM的Tris-HCl、1mM~50mM的EDTA、0.1%~1%的LDS、0.5M~1M的盐酸胍、0.5%~2%的N-乙酰半胱氨酸、1mg/ml～10mg/ml的氯化钾、0.05～0.5M的氯化钠、0.02～1M的氢氧化钠、0.1%～2%的曲拉通、0.1～2%的吐温20。

3.一种石蜡切片样本核酸提取方法，其特征在于，使用权利要求1或2所述的核酸提取液，包括：将石蜡切片样本去除周围多余石蜡放入无核酸酶的离心管中，加入所述核酸提取液，放入90℃～98℃恒温振荡孵育仪中振荡孵育20min~60min，中间澄清液即为所提取核酸。

4.根据权利要求3所述的一种石蜡切片样本核酸提取方法，其特征在于，所述方法为：将石蜡切片样本去除周围多余石蜡放入无核酸酶的离心管中，加入所述核酸提取液，放入95℃恒温振荡孵育仪中振荡孵育30min，中间层澄清液即为所提取核酸。