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CN113286601A - Foxp3表达的调节剂 - Google Patents

Foxp3表达的调节剂 Download PDF

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CN113286601A
CN113286601A CN201980074383.8A CN201980074383A CN113286601A CN 113286601 A CN113286601 A CN 113286601A CN 201980074383 A CN201980074383 A CN 201980074383A CN 113286601 A CN113286601 A CN 113286601A
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CN
China
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cancer
compound
certain embodiments
cell
modified
Prior art date
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Application number
CN201980074383.8A
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A·雷文科
R·A·麦克莱奥德
S·M·弗雷尔
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Ionis Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Ionis Pharmaceuticals Inc
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Publication date
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Abstract

本发明实施例提供了可用于抑制FOXP3表达的方法、化合物、和组合物，这些方法、化合物、和组合物可用于治疗、预防、或缓解癌症。本文提供的某些实施例涉及可用于抑制FOXP3表达的强效且可耐受的化合物和组合物，这些化合物和组合物可用于治疗、预防、缓解、或减缓癌症的进展。在某些实施例中，所述癌症与免疫抑制微环境或间质相关。

Description

FOXP3表达的调节剂
序列表
本申请连同电子格式的序列表一起提交。序列表被提供为创建于2019年11月11日的、题为BIOL0344WOSEQ_ST25.txt的文件，该文件大小是698kb。将电子格式的序列表的信息通过引用以其全文并入本文。
技术领域
本发明实施例提供了可用于抑制FOXP3表达的方法、化合物、和组合物，这些方法、化合物、和组合物可用于治疗、预防、或缓解癌症。
背景技术
Foxp3是调节性T细胞(Treg)的谱系定义转录因子，其控制与免疫抑制相关的基因的限制性组。Treg通过多种效应机制抑制免疫(包括抗肿瘤免疫)。肿瘤内Treg的存在在多种类型的癌症中预后不良。Treg不具有可利用生物制剂进行靶向的已知的独特的表面标志物或信号传导蛋白。FOXP3不能被单克隆抗体或常规小分子靶向。
发明内容
本文提供的某些实施例涉及可用于抑制FOXP3表达的强效且可耐受的化合物和组合物，这些化合物和组合物可用于治疗、预防、缓解、或减缓癌症的进展。在某些实施例中，所述癌症与免疫抑制微环境或间质相关。某些实施例涉及可用于抑制Treg中FOXP3表达的化合物和组合物，所述化合物和组合物可用于治疗、预防、缓解或减缓与免疫抑制性Treg相关的癌症的进展。
具体实施方式
应理解的是，前面的概述和下面的详述两者都只是示例性和说明性的，并且不限制如所要求的实施例。在本文中，单数的使用包括复数，除非另外明确说明。如本文使用的，“或”的使用意指“和/或”，除非另外说明。此外，术语“包括(including)”以及其他形式(如“包括”(includes)和“包括”(included))的使用没有限制性。
本文使用的章节标题只是出于组织的目的，而不应被解释为限制所描述的主题。在本申请中引用的所有文献、或文献的部分(包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍、论文、以及GenBank和NCBI参考序列记录)都针对本文讨论的文献的部分并且以其全文通过引用而清楚地特此结合。
应理解的是，本文包含的实例中的每个SEQ ID NO中列出的序列独立于对糖部分、核苷间连接、或核碱基的任何修饰。因此，由SEQ ID NO定义的化合物可以独立地包括对糖部分、核苷间连接、或核碱基的一种或多种修饰。通过ION编号描述的化合物指示核碱基序列、化学修饰、和基序的组合。
除非另外指明，以下术语具有以下含义：
“2’-脱氧核苷”意指包含2’-H(H)呋喃糖基糖部分的核苷，如在天然存在的脱氧核糖核酸(DNA)中发现的。在某些实施例中，2’-脱氧核苷可以包含修饰的核碱基或者可以包含RNA核碱基(尿嘧啶)。
“2’-O-甲氧基乙基”(亦是2’-MOE和2’-O(CH2)2-OCH3)是指呋喃糖基环的2’位置处的O-甲氧基-乙基修饰。2’-O-甲氧基乙基修饰的糖是经修饰的糖。
“2’-MOE核苷”(亦是2’-O-甲氧基乙基核苷)意指包含2’-MOE修饰的糖部分的核苷。
“2’-取代的核苷”或“2-修饰的核苷”意指包含2’-取代的或2’-修饰的糖部分的核苷。如本文使用的，关于糖部分的“2’-取代的”或“2-修饰的”意指包含除H或OH之外的至少一种2’-取代基基团的糖部分。
“3’靶位点”是指与特定化合物的最3’核苷酸互补的靶核酸的核苷酸。
“5’靶位点”是指与特定化合物的最5’核苷酸互补的靶核酸的核苷酸。
“5-甲基胞嘧啶”意指具有附接至5位的甲基基团的胞嘧啶。
“约”意指在某值的±10％内。例如，如果指出“这些化合物影响FOXP3的约70％抑制”，则暗示FOXP3水平被抑制在60％和80％的范围内。
“施用(administration或administering)”是指将在此提供的化合物或组合物引入个体体内以执行其预定功能的途径。可以使用的施用途径的实例包括但不限于胃肠外施用，如皮下、静脉内、或肌内注射或输注。
“同时施用”或“共施用”意指以任何方式施用两种或更多种化合物，以此方式，两种药物的药理作用在患者体内显现。同时施用不要求以单个药物组合物、以相同剂型、通过相同施用途径、或同时施用两种化合物。两种化合物的作用本身不需要同时显现出来。这些作用仅需重叠一段时间并且不需同延。同时施用或共施用涵盖并行地或顺序地施用。
“缓解”是指相关疾病、障碍、或病症的至少一种指标、体征、或症状的改善或减轻。在某些实施例中，缓解包括病症或疾病的一种或多种指标的进展或严重性的延迟或减缓。指标的进展或严重性可以通过本领域技术人员已知的主观或客观量度来确定。
“动物”是指人或非人动物，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、猫、猪、以及非人灵长类动物(包括但不限于猴和黑猩猩)。
如在本披露中使用的“抗体”是指免疫球蛋白或其片段或衍生物，并且涵盖包含抗原结合位点的任何多肽，无论它是在体外或在体内产生的。该术语包括但不限于：多克隆、单克隆、单特异性、多特异性、非特异性、人源化、单链、嵌合、合成、重组、杂交、突变、以及接枝抗体。除非用术语“完整”另外修饰，如在“完整抗体”中，出于本披露的目的，术语“抗体”还包括抗体片段如Fab、F(ab′)2、Fv、scFv、Fd、dAb和保留抗原结合功能(即特异性结合例如CTLA-4或PD-L1的能力)的其他抗体片段。通常，此类片段将包含抗原结合结构域。
“抗CTLA-4抗体”是指特异性结合CTLA-4多肽的抗体或其抗原结合片段。示例性抗CTLA-4抗体例如在以下专利中有所描述：美国专利号6,682,736；7,109,003；7,123,281；7,411,057；7,824,679；8,143,379；7,807,797；以及8,491,895(在其中，曲美木单抗是11.2.1)中，将这些专利通过引用并入本文。曲美木单抗(美国专利号6,682,736)是示例性抗CTLA-4抗体。
“抗OX40抗体”是指特异性结合OX40的抗体或其抗原结合片段。OX40抗体包括对OX40具有特异性的单克隆抗体和多克隆抗体以及其抗原结合片段。在某些方面，如在此所述的抗OX40抗体是单克隆抗体(或其抗原结合片段)，例如鼠类、人源化或全人单克隆抗体。在一个具体实施例中，该OX40抗体是OX40受体激动剂，诸如由Weinberg等人,J Immunother[免疫学治疗杂志]29,575-585(2006)所描述的小鼠抗人OX40单克隆抗体(9B12)。在另一个实施例中，OX40抗体是如US 2016/0137740(通过引用并入本文)所述的MEDI0562。在其他实施例中，特异性地结合OX40的抗体或其抗原结合片段与mAb 9B12结合相同OX40表位。
“抗PD-L1抗体”是指特异性结合PD-L1多肽的抗体或其抗原结合片段。示例性抗PD-L1抗体描述于例如US 2013/0034559、美国专利号8,779,108和9,493,565，将其通过引用并入本文。度伐鲁单抗(MEDI4736)是示例性抗PD-L1抗体。其他抗PD-L1抗体包括BMS-936559(美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb))和MPDL3280A(阿特珠单抗)(罗氏公司(Roche))。
“抗PD-1抗体”是指特异性结合PD-1多肽的抗体或其抗原结合片段。示例性抗PD-1抗体例如在以下专利中有所描述：美国专利号7,521,051；8,008,449；8,354,509；9,073,994；9,393,301；9402899；和9,439,962，其通过引用并入本文。示例性抗PD-1抗体包括但不限于纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗和AMP-514。
“抗原结合结构域”、“抗原结合片段”和“结合片段”是指抗体分子的包含负责抗体和抗原之间特异性结合的氨基酸的一部分。例如，在抗原很大的情况下，抗原结合结构域可只结合抗原的一部分。抗原分子的负责与抗原结合结构域特异性相互作用的一部分被称为“表位”或“抗原决定簇”。抗原结合结构域典型地包括抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)，然而，它不一定必须包括两者。例如，所谓的Fd抗体片段仅由VH结构域组成，但是仍然保留完整抗体的一些抗原结合功能。抗体的结合片段通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学裂解来产生。结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv以及单链抗体。除了“双特异性”或“双功能”抗体以外，抗体应理解为其每个结合位点是相同的。使用酶(木瓜蛋白酶)来消化抗体的结果是两个相同的抗原结合片段，又称为“Fab”片段和“Fc”片段，它们不具有抗原结合活性，但具有结晶的能力。用酶(胃蛋白酶)来消化抗体的结果是F(ab')2片段，其中该抗体分子的两个臂保持连接并且包括两个抗原结合位点。F(ab')2片段具有交联抗原的能力。当本文使用时，“Fv”是指保留了抗原识别和抗原结合位点两者的抗体的最小片段。当本文使用时，“Fab”是指抗体的包含轻链的恒定结构域和重链的CH1结构域的片段。
“mAb”是指单克隆抗体。本披露的抗体包含但不限于全天然抗体、双特异性抗体；嵌合抗体；Fab、Fab'、单链V区片段(scFv)、融合多肽以及非常规抗体。
“反义活性”意指可归因于反义化合物与其靶核酸的杂交的任何可检测的和/或可测量的活性。在某些实施例中，反义活性是与不存在靶标的反义化合物的情况下的靶核酸水平或由这样的靶核酸编码的靶蛋白水平相比，该靶核酸或该靶蛋白的量或表达降低。
“反义化合物”意指包含寡核苷酸和任选地一种或多种另外的特征(如缀合物基团或端基)的化合物。反义化合物的实例包括单链的和双链的化合物，如寡核苷酸、核糖酶、siRNA、shRNA、ssRNA、以及基于占用的化合物。
“反义抑制”意指与不存在与靶核酸互补的反义化合物的情况下的靶核酸水平相比，在存在该反义化合物的情况下的靶核酸水平的降低。
“反义机制”是涉及化合物与靶核酸的杂交的所有那些机制，其中杂交的结果或作用是靶标降解或靶标占用，同时伴随涉及例如转录或剪接的细胞机器的停转。
“反义寡核苷酸”意指具有与靶核酸或其区域或区段互补的核碱基序列的寡核苷酸。在某些实施例中，反义寡核苷酸可特异性地与靶核酸或其区域或区段杂交。
“二环核苷”或“BNA”意指包含二环糖部分的核苷。“二环糖”或“二环糖部分”意指包含两个环的经修饰的糖部分，其中第二环经由连接第一环中的原子中的两个的桥而形成，由此形成二环结构。在某些实施例中，二环糖部分的第一环是呋喃糖基部分。在某些实施例中，该二环糖部分不包括呋喃糖基部分。
“分支基团”意指具有至少3个以下位置的一组原子，所述位置能够与至少3个基团形成共价连接。在某些实施例中，分支基团提供了用于经由缀合物接头和/或可切割的部分将系链配体连接至寡核苷酸的多个反应性位点。
“靶向细胞的部分”意指能够结合至一种特定细胞类型或多种特定细胞类型的缀合物基团或缀合物基团的部分。
“cEt”或“受约束的乙基”意指包含连接4’-碳和2’-碳的桥的二环呋喃糖基糖部分，其中该桥具有化学式：4’-CH(CH3)-O-2’。
“cEt核苷”意指包含cEt经修饰的糖部分的核苷。
化合物中的“化学修饰”描述了相对于这样的单位的初始状态，通过该化合物中的任何单位的化学反应的取代或改变。“经修饰的核苷”意指独立地具有经修饰的糖部分和/或修饰的核碱基的核苷。“经修饰的寡核苷酸”意指包含至少一种经修饰的核苷间连接、经修饰的糖、和/或修饰的核碱基的寡核苷酸。
“化学上不同的区域”是指化合物的在某种程度上来说与同一化合物的另一个区域在化学上不同的区域。例如，具有2’-O-甲氧基乙基核苷酸的区域在化学上不同于具有没有2’-O-甲氧基乙基修饰的核苷酸的区域。
“嵌合反义化合物”意指具有至少2个化学上不同的区域的反义化合物，每个位置具有多个亚单位。
“手性富集群体”是指具有相同分子式的多个分子，其中群体中在特定手性中心处具有特定立体化学构型的分子的数量或百分比大于在特定的手性中心是立体随机的情况下预期在所述群体中在相同特定手性中心处具有相同特定立体化学构型的分子的数量或百分比。在每个分子内具有多个手性中心的手性富集分子群体可以包含一个或多个立体随机手性中心。在某些实施例中，所述分子是经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，所述分子是包含经修饰的寡核苷酸的化合物。
“可切割的键”意指能够被分离的任何化学键。在某些实施例中，可切割的键选自：酰胺，聚酰胺，酯，醚，磷酸二酯、磷酸酯中的一者或两者酯，氨基甲酸酯，二硫化物或肽。
“可切割的部分”意指在例如细胞、动物或人内的生理条件下被切割的键或原子基团。
关于寡核苷酸的“互补”意指当将两个核碱基序列在相反方向上进行比对时，这样的寡核苷酸或其一个或多个区域的核碱基序列匹配另一个寡核苷酸或核酸或其一个或多个区域的核碱基序列。如本文所述，核碱基匹配或互补核碱基限于以下对：腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)，腺嘌呤(A)和尿嘧啶(U)，胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)，以及5-甲基胞嘧啶(mC)和鸟嘌呤(G)，除非另有说明。互补寡核苷酸和/或核酸无需在每个核苷处都具有核碱基互补性，并且可以包括一个或多个核碱基错配。相比之下，关于寡核苷酸的“完全互补”或“100％互补”意指此类寡核苷酸在每个核苷处都具有核碱基匹配而没有任何核碱基错配。
“缀合物基团”意指附接至寡核苷酸的一组原子。缀合物基团包括缀合物部分和将缀合物部分附接至寡核苷酸的缀合物接头。
“缀合物接头”意指包含将缀合物部分连接至寡核苷酸的至少一个键的一组原子。
“缀合物部分”意指通过缀合物接头附接至寡核苷酸的一组原子。
在寡核苷酸的背景下，“连续”是指彼此紧邻的核苷、核碱基、糖部分、或核苷间连接。例如，“连续核碱基”意指在序列中彼此紧邻的核碱基。
“设计”或“被设计为”是指设计与所选核酸分子特异性杂交的化合物的过程。
“稀释剂”意指组合物中缺少药理活性，但是在药学上是必需的或所希望的成分。例如，注射组合物中的稀释剂可以是液体，例如盐水溶液。
“不同修饰的”意指彼此不同的化学修饰或化学取代基，包括不存在修饰。因此，例如，MOE核苷和未经修饰的DNA核苷是“不同修饰的”，虽然该DNA核苷是未经修饰的。同样地，DNA和RNA是“不同修饰的”，即使两者都是天然存在的未经修饰的核苷。除包含不同的核碱基以外相同的核苷不是不同修饰的。例如，包含2’-OMe经修饰的糖和未经修饰的腺嘌呤核碱基的核苷与包含2’-OMe经修饰的糖和未经修饰的胸腺嘧啶核碱基的核苷不是不同修饰的。
“剂量”意指在单次施用中、或在指定的时间段内提供的化合物或药剂的指定量。在某些实施例中，剂量可以按两个或更多个大丸剂、片剂或注射剂形式施用。例如，在某些实施例中，在希望皮下施用的情况下，所希望的剂量可以要求不是通过单次注射容易地提供的体积。在此类实施例中，可以使用两次或更多次注射达到所希望的剂量。在某些实施例中，剂量可以按两次或更多次注射施用，以使个体体内的注射部位反应最小化。在其他实施例中，经延长的时间段或连续地通过输注施用化合物或药剂。可以将剂量指明为每小时、每天、每周或每月的药剂的量。
“给药方案”是被设计为实现一种或多种所希望的效果的剂量的组合。
“双链反义化合物”意指包含两种寡聚化合物的反义化合物，这两种寡聚化合物彼此互补并且形成双链体，并且其中这两种所述寡聚化合物之一包括寡核苷酸。
“有效量”意指足以在对化合物有需要的个体体内实现所希望的生理学结果的化合物的量。有效量在个体之间可以根据有待治疗的个体的健康和身体状况、有待治疗的个体的分类群、组合物的配方、个体的医学症状的评估、以及其他相关因素而变化。
“功效”意指产生所希望的效果的能力。
“表达”包括借此以将基因的编码信息转变成存在于细胞中并且在细胞中运转的结构的所有功能。此类结构包括但不限于转录和翻译的产物。
“缺口体(Gapmer)”意指寡核苷酸，该寡核苷酸包含多个核苷的内部区域，这些核苷支持被定位在具有一个或多个核苷的外部区域之间的RNA酶H切割，其中这些包含内部区域的核苷在化学上不同于包含外部区域的该一个核苷或多个核苷。内部区域可以被称作“缺口(gap)”并且外部区域可以被称作“翼(wing)”。
“杂交”意指寡核苷酸和/或核酸的退火。虽然不局限于具体的机制，但最常见的杂交机制包括在互补核碱基之间的氢键合，所述氢键合可以是沃森-克里克(Watson-Crick)、胡斯坦(Hoogsteen)或反向胡斯坦氢键合。在某些实施例中，互补核酸分子包括但不限于反义化合物和核酸靶标。在某些实施例中，互补核酸分子包括但不限于寡核苷酸和核酸靶标。
“紧邻”意指在相同种类的紧邻元件之间不存在间插元件(例如在紧邻核碱基之间没有间插核碱基)。
“免疫检查点抑制剂”是指对抑制免疫应答的蛋白质的表达或活性进行抑制的药剂。在一个实施例中，免疫检查点抑制剂是抑制CTLA-4或PD-1途径的药剂。特定的检查点抑制剂包括抑制PD-1、PD-L1或CTLA-4的抗体。
“免疫调节剂”意指增强免疫应答(例如，抗肿瘤免疫应答)的药剂。本披露的示例性免疫调节剂包括抗体，诸如一种抗CTLA-4抗体、一种抗PD-L1抗体、一种抗PD-1抗体以及这些抗体中的任一种的抗原片段以及OX40激动剂，包括蛋白质类，诸如OX40配体融合蛋白、OX40抗体或其片段。在一个实施例中，该免疫调节剂是免疫检查点抑制剂。
“个体”意指选择用于治疗或疗法的人或非人动物。
“抑制表达或活性”是指相对于未经处理的或对照样品中的表达或活性，表达或活性的降低或阻断，并且不一定指示表达或活性的彻底消除。
“核苷间连接”意指在寡核苷酸中的相邻核苷之间形成共价连接的基团或键。“经修饰的核苷间连接”意指除天然存在的、磷酸酯核苷间连接之外的任何核苷间连接。非磷酸酯连接在此意指经修饰的核苷间连接。
“加长的寡核苷酸”是相对于在此披露的寡核苷酸(例如母体寡核苷酸)具有一个或多个另外的核苷的那些。
“连接的核苷”意指通过核苷间连接而连接在一起的相邻核苷。
“接头-核苷”意指将寡核苷酸连接至缀合物部分的核苷。接头-核苷位于化合物的缀合物接头内。不认为接头-核苷是化合物的寡核苷酸部分的一部分(即使它们与寡核苷酸邻接)。
“错配”或“非互补”意指当将第一和第二寡核苷酸进行比对时，该第一寡核苷酸的核碱基不与该第二寡核苷酸或靶核酸的相应核碱基互补。例如，核碱基(包括但不限于通用核碱基、肌苷、和次黄嘌呤)能够与至少一个核碱基杂交，但是相对于它所杂交的核碱基仍是错配的或非互补的。作为另一个实例，当将第一和第二寡核苷酸进行比对时，不能够杂交到该第二寡核苷酸或靶核酸的相应核碱基上的该第一寡核苷酸的核碱基是错配或非互补核碱基。
“调节”是指改变或调整细胞、组织、器官或生物体中的特征。例如，调节FOXP3 RNA可以意指升高或降低FOXP3 RNA和/或FOXP3蛋白在细胞、组织、器官或生物体中的水平。“调节剂”在该细胞、组织、器官或生物体中实现该改变。例如，FOXP3化合物可以是降低细胞、组织、器官或生物体中的FOXP3 RNA和/或FOXP3蛋白的量的调节剂。
“MOE”意指甲氧基乙基。
“单体”是指寡聚体的单个单位。单体包括但不限于核苷和核苷酸。
“基序”意指未经修饰的和/或经修饰的糖部分、核碱基、和/或核苷间连接在寡核苷酸中的模式。
“天然的”或“天然存在的”意指在自然界中发现的。
“非-二环经修饰的糖”或“非二环经修饰的糖部分”意指经修饰的糖部分，该糖部分包含不形成该糖的两个原子之间的桥从而形成第二环的修饰(如取代)。
“核酸”是指由单体核苷酸组成的分子。核酸包括但不限于核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、单链核酸、以及双链核酸。
“核碱基”意指能够与另一个核酸的碱基配对的杂环部分。如本文使用的，“天然存在的核碱基”是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)、和鸟嘌呤(G)。“修饰的核碱基”是经化学修饰的天然存在的核碱基。“通用碱基”或“通用核碱基”是除了天然存在的核碱基和修饰的核碱基之外的核碱基，并且能够与任何核碱基配对。
“核碱基序列”意指在核酸或寡核苷酸中独立于任何糖或核苷间连接的连续核碱基的顺序。
“核苷”意指包含核碱基和糖部分的化合物。核碱基和糖部分各自独立地是未经修饰的或修饰的。“经修饰的核苷”意指包含修饰的核碱基和/或经修饰的糖部分的核苷。经修饰的核苷包括缺少核碱基的无碱基核苷。
“寡聚化合物”意指包含单个寡核苷酸和任选地一种或多种另外的特征(如缀合物基团或端基)的化合物。
“寡核苷酸”意指连接的核苷的聚合物，这些核苷中的每个核苷都可以彼此独立地被修饰或不被修饰。除非另有说明，寡核苷酸由8-80个连接的核苷组成。“经修饰的寡核苷酸”意指寡核苷酸，其中至少一个糖、核碱基、或核苷间连接是被修饰的。“未经修饰的寡核苷酸”意指不包含任何糖、核碱基、或核苷间经修饰的寡核苷酸。
“母体寡核苷酸”意指其序列被用作具有类似的序列但不同的长度、基序、和/或化学的更多的寡核苷酸的设计基础的寡核苷酸。新设计的寡核苷酸可以具有与母体寡核苷酸相同的或重叠的序列。
“胃肠外施用”意指通过注射或输注施用。胃肠外施用包括皮下施用、静脉内施用、肌内施用、动脉内施用、腹膜内施用、或颅内施用(例如鞘内或脑室内施用)。
“药学上可接受的载体或稀释剂”意指适合于在施用个体中使用的任何物质。例如，药学上可接受的载体可以是无菌水溶液，如PBS或注射用水。
“药学上可接受的盐”意指化合物(如寡聚化合物或寡核苷酸)的生理学和药学上可接受的盐，即保留母体化合物的所希望的生物学活性并且不对其赋予不希望的毒理学效应的盐。
“药剂”意指当施用至个体时提供治疗益处的化合物。
“药物组合物”意指适于向个体施用的物质的混合物。例如，药物组合物可以包括一种或多种化合物或其盐和无菌水溶液。
“硫代磷酸酯连接”意指修饰的磷酸酯连接，其中非桥氧原子之一被硫原子替换。硫代磷酸酯核苷间连接是经修饰的核苷间连接。
“磷部分”意指包含磷原子的一组原子。在某些实施例中，磷部分包括单-、二-、或三-磷酸酯、或硫代磷酸酯。
“部分”意指核酸的限定数目的连续(即，连接的)核碱基。在某些实施例中，一个部分是靶核酸的限定数目的连续核碱基。在某些实施例中，一个部分是寡聚化合物的限定数目的连续核碱基。
“预防”是指在从数分钟到无限期的时间段内，延迟或预先阻止疾病、障碍或病症的发病、发展或进展。
“前药”意指处于身体外形式的化合物，当施用至个体时，被代谢为其身体或细胞内的另一种形式。在某些实施例中，代谢形式是该化合物(例如，药物)的具有活性、或更具活性形式。通常，通过存在于细胞或组织中的一种或多种酶(例如内源性或病毒性酶)或一种或多种化学物质的作用，和/或通过生理条件促进前药在体内的转化。
“减少”意味着降低至更小程度、规模、数量或数目。
“RefSeq No.”是分配给序列的字母和数字的唯一组合，从而表示该序列是针对特定靶转录物(例如，靶基因)。关于靶基因的这种序列和信息(统称为基因记录)可以在遗传序列数据库中找到。遗传序列数据库包括NCBI参考序列数据库、GenBank、欧洲核苷酸存档、和日本DNA数据库(后三者形成国际核苷酸序列数据库合作或INSDC)。
“区域”被定义为具有至少一种可辨认的结构、功能、或特征的靶核酸部分。
“RNAi化合物”意指至少部分地通过RISC或Ago2而非通过RNA酶H起作用以调节靶核酸和/或由靶核酸编码的蛋白的反义化合物。RNAi化合物包括但不限于双链siRNA、单链RNA(ssRNA)、和微小RNA(包括微小RNA模拟物)。
“区段”被定义为核酸内的更小的区域或区域的子部分。
“副作用”意指除所希望的作用以外的可归因于治疗的生理疾病和/或病症。在某些实施例中，副作用包括注射部位反应、肝功能测试异常、肾功能异常、肝毒性、肾毒性、中枢神经系统异常、肌肉疾病、以及不适。例如，血清中的转氨酶水平增加可以指示肝毒性或肝功能异常。例如，胆红素增加可以指示肝毒性或肝功能异常。
关于化合物的“单链的”意指该化合物仅具有一种寡核苷酸。“自我互补”意指寡核苷酸至少部分地与其自身杂交。由一种寡核苷酸组成的化合物(其中该化合物的寡核苷酸是自我互补的)是单链化合物。单链的化合物能够与互补化合物结合，以形成双链体。
“位点”被定义为靶核酸内的独特核碱基位置。
“可特异性杂交”是指寡核苷酸在该寡核苷酸与靶核酸之间具有足够的互补程度以诱导所希望的效应，同时对非靶核酸展现出最小效应或没有效应。在某些实施例中，特异性杂交在生理条件下发生。
关于靶核酸的“特异性抑制”意指，当对非靶核酸展示出较少、最低、或无影响时，减少或阻断靶核酸的表达。减少并不一定表明完全消除了靶核酸的表达。
“标准细胞测定”意指在实例中描述的一种或多种测定及其合理变化。
“标准体内实验”意指一个或多个实例中描述的一个或多个程序及其合理变化。
在具有同一分子式的分子群体的背景下，“立体随机手性中心(Stereorandomchiral center)”是指具有随机立体化学构型的手性中心。例如，在包含立体随机手性中心的分子群体中，具有立体随机手性中心的(S)构型的分子的数量可以但不一定与具有立体随机手性中心的(R)构型的分子的数量相同。当手性中心的立体化学构型是未设计用于控制立体化学构型的合成方法的结果时，其被认为是随机的。在某些实施例中，立体随机手性中心是立体随机硫代磷酸酯核苷间连接。
“糖部分”意指未经修饰的糖部分或经修饰的糖部分。“未经修饰的糖部分”或“未经修饰的糖”意指如在RNA中发现的2’-OH(H)呋喃糖基部分(“未经修饰的RNA糖部分”)或如在DNA中发现的2’-H(H)部分(“未经修饰的DNA糖部分”)。未经修饰的糖部分在1’、3’、和4’位的每处具有一个氢，在3’位处具有氧，并且在5’位处具有两个氢。“经修饰的糖部分”或“经修饰的糖”意指修饰的呋喃糖基糖部分或糖代用品。“修饰的呋喃糖基糖部分”意指呋喃糖基糖，其包含代替未经修饰的糖部分的至少一个氢的非氢取代基。在某些实施例中，修饰的呋喃糖基糖部分是2’-取代的糖部分。此类修饰的呋喃糖基糖部分包括二环糖和非二环糖。
“糖代用品”意指具有不同于呋喃糖基部分的经修饰的糖部分，该经修饰的糖部分可以将核碱基连接至另一个基团(如寡核酸中的核苷间连接、缀合物基团、或端基)。包含糖代用品的经修饰的核苷可以掺入到寡核苷酸内的一个或多个位置，并且此类寡核苷酸能够与互补化合物或核酸杂交。
“协同作用(synergy)”或“起协同作用(synergize)”是指组合的效果大于在相同剂量下单独各组分的作用的相加。
“FOXP3”意指FOXP3的任何核酸或蛋白。“FOXP3核酸”意指编码FOXP3的任何核酸。例如，在某些实施例中，FOXP3核酸包括编码FOXP3的DNA序列、从编码FOXP3的DNA(包括含有内含子和外显子的基因组DNA)转录的RNA序列、以及编码FOXP3的mRNA序列。“FOXP3 mRNA”意指编码FOXP3蛋白的mRNA。靶标可以用大写字母或小写字母来表示。
“FOXP3特异性抑制剂”是指能够在分子水平上特异性地抑制FOXP3 RNA和/或FOXP3蛋白的表达或活性的任何试剂。例如，FOXP3特异性抑制剂包括能够抑制FOXP3 RNA和/或FOXP3蛋白表达的核酸(包括反义化合物)、肽、抗体、小分子、以及其他试剂。
“靶基因”是指编码靶标的基因。
“靶向”意指化合物与靶核酸的特异性杂交以便引起所希望的效果。
“靶核酸”、“靶RNA”、“靶RNA转录物”以及“核酸靶标”全部意指能够被本文描述的化合物靶向的核酸。
“靶区域”意指一种或多种化合物所靶向的靶核酸部分。
“靶区段”意指化合物所靶向的靶核酸的核苷酸序列。“5’靶位点”是指靶区段的最5’核苷酸。“3’靶位点”是指靶区段的最3’核苷酸。
“端基”意指共价地连接至寡核苷酸的末端的化学基团或一组原子。
“治疗有效量”意指为个体提供治疗益处的化合物、药剂、或组合物的量。
“治疗”是指向动物施用化合物或药物组合物，以便实现该动物的疾病、障碍或病症的改变或改善。
某些实施例
某些实施例提供了用于抑制FOXP3表达的方法、化合物和组合物。
某些实施例提供了靶向FOXP3核酸的化合物。在某些实施例中，FOXP3核酸具有在以下各项中列出的序列：RefSeq或GENBANK登录号NM_014009.3(SEQ ID NO:1)；NT_011568.12_TRUNC_11907130_11921808_COMP(SEQ ID NO:2)；NM_001114377.1(SEQ ID NO:3)；NC_000023.11_TRUNC_49247001_49273000_COMP(SEQ ID NO:4)；或UCSC登录号UC064ZFP.1，对应于装配体GRCh38/hg38上的基因座标chrX:49,251,334-49,259,240(SEQID NO:5)；将其各自通过引用以其全文而结合。在某些实施例中，该化合物是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，该化合物是单链的。在某些实施例中，该化合物是双链的。
某些实施例提供了包含经修饰的寡核苷酸的化合物，该经修饰的寡核苷酸长8至80个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO:9-3246的核碱基序列中任一项的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，该化合物是单链的。在某些实施例中，该化合物是双链的。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长10至30个连接的核苷。
某些实施例提供了包含经修饰的寡核苷酸的化合物，该经修饰的寡核苷酸长9至80个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO:9-3246的核碱基序列中任一项的至少9个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，该化合物是单链的。在某些实施例中，该化合物是双链的。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长10至30个连接的核苷。
某些实施例提供了包含经修饰的寡核苷酸的化合物，该经修饰的寡核苷酸长10至80个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO:9-3246的核碱基序列中任一项的至少10个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，该化合物是单链的。在某些实施例中，该化合物是双链的。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长10至30个连接的核苷。
某些实施例提供了包含经修饰的寡核苷酸的化合物，该经修饰的寡核苷酸长11至80个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO:9-3246的核碱基序列中任一项的至少11个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，该化合物是单链的。在某些实施例中，该化合物是双链的。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长11至30个连接的核苷。
某些实施例提供了包含经修饰的寡核苷酸的化合物，该经修饰的寡核苷酸长12至80个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO:9-3246的核碱基序列中任一项的至少12个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，该化合物是单链的。在某些实施例中，该化合物是双链的。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长12至30个连接的核苷。
某些实施例提供了包含经修饰的寡核苷酸的化合物，该经修饰的寡核苷酸长16至80个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO:9-3246中任一项的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，该化合物是单链的。在某些实施例中，该化合物是双链的。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16至30个连接的核苷。
某些实施例提供了包含经修饰的寡核苷酸的化合物，该经修饰的寡核苷酸由SEQID NO:9-3246中任一项的核碱基序列组成。在某些实施例中，该化合物是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，该化合物是单链的。在某些实施例中，该化合物是双链的。
在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长8至80个连接核苷并具有与SEQ ID NO:1的核苷酸2269-2284中的等长部分互补的至少8、9、10、11、12、13、14、15或16个连续核碱基部分。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长10至30个连接的核苷。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16至30个连接的核苷。
在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长8至80个连接的核苷并且具有与SEQ ID NO:2的核苷酸1233-1248、2156-2171、2735-2750、4661-4676、7307-7322、7331-7346、7980-7995、11581-11596、或12396-12411中的等长部分互补的至少8、9、10、11、12、13、14、15、或16个连续的核碱基部分。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长10至30个连接的核苷。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16至30个连接的核苷。
在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长8至80个连接的核苷且在SEQ ID NO:1的核苷酸2269-2284内互补。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长10至30个连接的核苷。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16至30个连接的核苷。
在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长8至80个连接的核苷并且在SEQ ID NO:2的核苷酸1233-1248、2156-2171、2735-2750、4661-4676、7307-7322、7331-7346、7980-7995、11581-11596或12396-12411中是互补的。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长10至30个连接的核苷。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16至30个连接的核苷。
在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长8至80个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492或2575中任一项的至少8、9、10、11、12、13、14、15、或16个连续核碱基部分的核碱基序列。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长10至30个连接的核苷。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16至30个连接的核苷。
在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长16至80个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492或2575中任一项的核碱基序列。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16至30个连接的核苷。
在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长16个连接的核苷，具有由SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492或2575中任一项组成的核碱基序列。
在某些实施例中，靶向FOXP3的化合物是ION 1063734。在如以下实例部分中所述而筛选的超过3,000种化合物中，ION 1062428、1062641、1062835、1062937、1063268、1063649、1063655、1063734、1064096或1064313作为靠前的先导化合物出现。
在某些实施例中，上述经修饰的寡核苷酸中任一种包含至少一种经修饰的核苷间连接、至少一种经修饰的糖、和/或至少一种修饰的核碱基。
在某些实施例中，上述经修饰的寡核苷酸中任一种包含至少一种经修饰的糖。在某些实施例中，至少一种经修饰的糖包括2’-O-甲氧基乙基基团。在某些实施例中，至少一种经修饰的糖是二环糖，如4’-CH(CH3)-O-2’基团、4’-CH2-O-2’基团、或4’-(CH2)2-O-2’基团。
在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸包括至少一种经修饰的核苷间连接，如硫代磷酸酯核苷间连接。
在某些实施例中，上述经修饰的寡核苷酸中任一种包含至少一种修饰的核碱基，如5-甲基胞嘧啶。
在某些实施例中，上述经修饰的寡核苷酸中的任一种包含：
由连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由连接的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含经修饰的糖。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16至80个连接的核苷，并具有包含在SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492或2575中任一项中列举的序列的核碱基序列。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16至30个连接的核苷，并且具有包含SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492或2575中任一项列举的序列的核碱基序列。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16个连接的核苷，并且具有由SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492或2575中任一项列举的序列组成的核碱基序列。
在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸或由其组成，该经修饰的寡核苷酸长16-80个连接的核碱基，具有包含SEQ ID NO:9-3246中任一项中列举的序列的核碱基序列，其中该经修饰的寡核苷酸包含：
由连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由连接的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含经修饰的糖。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16-30个连接的核苷。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16个连接的核苷。
在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸或由其组成，该经修饰的寡核苷酸长16-80个连接的核碱基并且具有包含SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492或2575中任一项列举的序列的核碱基序列，其中该经修饰的寡核苷酸包含：
由连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由连接的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含经修饰的糖。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16-30个连接的核苷。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16个连接的核苷。
在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸或由其组成，该经修饰的寡核苷酸长16-80个连接的核碱基并且具有包含SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492或2575中任一项列举的序列的核碱基序列，其中该经修饰的寡核苷酸包含：
由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由三个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间；其中每个翼段的每个核苷包含cEt核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16-30个连接的核苷。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16个连接的核苷。
在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸或由其组成，该经修饰的寡核苷酸长16-80个连接的核碱基，具有包含SEQ ID NO:449中列举的序列的核碱基序列，其中该经修饰的寡核苷酸包含：
由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由三个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间；其中每个翼段的每个核苷包含cEt核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16-30个连接的核苷。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16个连接的核苷。
在某些实施例中，化合物包含ION 1063734或其盐或由它们组成，该ION 1063734或其盐具有以下化学结构：
Figure BDA0003058421320000231
在某些实施例中，化合物包含ION 1063734的钠盐或由其组成，该ION 1063734的钠盐具有以下化学结构：
Figure BDA0003058421320000241
在上述实施例的任一项中，该化合物或寡核苷酸可以与编码FOXP3的核酸是至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或100％互补的。
在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链的。在某些实施例中，该化合物包含脱氧核糖核苷酸。在某些实施例中，该化合物是双链的。在某些实施例中，该化合物是双链的并且包含核糖核苷酸。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是反义化合物或寡聚化合物。
在上述实施例的任一项中，该化合物的长度可以是8至80、10至30、12至50、13至30、13至50、14至30、14至50、15至30、15至50、16至30、16至50、17至30、17至50、18至22、18至24、18至30、18至50、19至22、19至30、19至50、或20至30个连接的核苷。在某些实施例中，该化合物包含寡核苷酸或由其组成。
在某些实施例中，在此提供的化合物或组合物包括该经修饰的寡核苷酸的盐。在某些实施例中，该盐是钠盐。在某些实施例中，该盐是钾盐。
在某些实施例中，如本文描述的化合物或组合物是可高度耐受的，如通过具有相对于经盐水处理的动物丙氨酸转氨酶(ALT)或天冬氨酸转氨酶(AST)值不超过4倍、3倍、或2倍的增加，或与对照处理的动物相比肝、脾、或肾重量不超过30％、20％、15％、12％、10％、5％、或2％的增加中至少一者所证明的。在某些实施例中，如在此描述的化合物或组合物是可高度耐受的，如通过相对于对照处理的动物ALT或AST没有增加所证明的。在某些实施例中，如本文描述的化合物或组合物是可高度耐受的，如通过相对于对照动物肝、脾、或肾重量没有增加所证明的。
某些实施例提供了组合物，该组合物包含前述提及的实施例中任一项所述的化合物或其盐以及至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。在某些实施例中，该组合物具有小于约40厘泊(cP)、小于约30厘泊(cP)、小于约20厘泊(cP)、小于约15厘泊(cP)、或小于约10厘泊(cP)的黏度。在某些实施例中，具有前述提及的黏度中任一种的组合物包含约100mg/mL、约125mg/mL、约150mg/mL、约175mg/mL、约200mg/mL、约225mg/mL、约250mg/mL、约275mg/mL、或约300mg/mL浓度的本文提供的化合物。在某些实施例中，具有前述提及的黏度和/或化合物浓度中任一种的组合物具有的温度为室温或约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、或约30℃。
某些适应症
本文提供的某些实施例涉及抑制FOXP3表达的方法，通过施用靶向FOXP3的化合物，该方法可以用于在个体中治疗、预防、或缓解癌症。在某些实施例中，该化合物可以是FOXP3特异性抑制剂。在某些实施例中，该化合物可以是靶向FOXP3的反义化合物、寡聚化合物、或寡核苷酸。
用本文提供的化合物和方法可治疗、可预防和/或可缓解的癌症的实例包括：在微环境或间质或肿瘤引流淋巴结中具有FOXP3阳性(FOXP3+)Treg的癌症、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、鳞状细胞癌(SCC)、头颈癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、胃肠道癌、大肠癌、小肠癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)、食道癌、胰腺癌、胆道癌、胃癌、尿路上皮癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、间皮瘤、肉瘤(例如上皮样肉瘤、横纹肌样肉瘤和滑膜肉瘤)、脊索瘤、肾癌、肾细胞癌(RCC)、脑癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、皮肤癌、黑素瘤、基底细胞癌、默克尔细胞癌、血液癌、造血癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤(MM)、B细胞恶性肿瘤、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、白血病或急性淋巴细胞性白血病(ALL)。
在某些实施例中，B细胞淋巴瘤是非霍奇金B细胞淋巴瘤。可以用本文提供的化合物治疗的某些实施例的非霍奇金B细胞淋巴瘤的实例包括但不限于弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、活化B细胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)、生发中心B细胞淋巴瘤(GCB DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小细胞淋巴细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、纵隔大B细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(
Figure BDA0003058421320000261
macroglobulinemia)、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤和淋巴瘤样肉芽肿。
在某些实施例中，可以用本文提供的化合物治疗的T细胞淋巴瘤包括但不限于外周T细胞淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)。
在某些实施例中，可以用本文提供的化合物治疗的白血病包括但不限于急性淋巴细胞白血病(ALL)。
在某些实施例中，乳腺癌具有以下特征中的一个或多个：雄激素受体阳性，生长依赖雄激素；雌激素受体(ER)阴性，生长不依赖雌激素；孕酮受体(PR)阴性，生长不依赖孕酮；或Her2/neu阴性。在某些实施例中，乳腺癌是ER、PR和HER2三阴性(ER-、PR-、HER2-)。在某些实施例中，乳腺癌是三阴性和AR阳性(ER-、PR-、HER2-、AR+)。在某些实施例中，乳腺癌是ER阴性和AR阳性(ER-、AR+)。在某些实施例中，乳腺癌是ER阳性和AR阳性(ER+，AR+)。在某些实施例中，乳腺癌是顶泌的。顶泌乳腺癌通常是“三阴性”，意味着细胞不表达ER、PR或HER2受体，通常但不一定是AR阳性。在某些实施例中，顶泌乳腺癌是ER、PR和HER2三阴性和AR阳性(ER-、PR-、HER2-、AR+)。在某些实施例中，顶泌乳腺癌是ER阴性和AR阳性(ER-、AR+)。在某些实施例中，顶泌乳腺癌源自乳房的汗腺。在某些实施例中，顶泌乳腺癌是乳腺的导管癌或癌细胞。在某些实施例中，顶泌乳腺癌可以具有以下特征中的任何一个或多个：大量嗜酸性颗粒胞质，边缘清楚，大泡状核，核与胞质的比例约为1:2，和/或分泌颗粒在称为顶端吻部的顶端细胞质中累积。在某些实施例中，乳腺癌是ER阴性和AR阳性(ER-、AR+)分子顶泌乳腺癌。在某些方面，ER阴性和AR阳性(ER-、AR+)分子顶泌乳腺癌还可以是PR阳性、PR阴性、HER2阴性或HER2阳性。在某些实施例中，乳腺癌是HER2阳性。在某些实施例中，乳腺癌是PR阳性。在某些实施例中，乳腺癌是ER阳性。乳腺癌可通过标准组织学技术鉴定为激素受体(如ER、PR或HER2)阳性或阴性。例如，在一些实施例中，当少于1％的细胞表现出雌激素和孕激素受体的核染色，以及HER2的免疫组织化学染色显示0、1倍或2倍的阳性得分以及FISH比率(HER2基因信号比17号染色体信号)小于1.8(根据相关的ASCO和CAP指南)时，组织学乳腺癌样品可分类为“三阴性”(ER-，PR-，HER2-)。(Meyer,P.等人,PLoS ONE[公共科学图书馆·综合]7(5):e38361(2012))。
在某些实施例中，治疗、预防、或缓解个体癌症的方法包括向该个体施用包含FOXP3特异性抑制剂的化合物，由此治疗、预防、或缓解癌症。在某些实施例中，该化合物包括靶向FOXP3的反义化合物。在某些实施例中，该化合物包括靶向FOXP3的寡核苷酸。在某些实施例中，化合物包含长8至80个连接核苷的经修饰的寡核苷酸，并且该寡核苷酸具有包含SEQ ID NO:9-3246的核碱基序列中任一项的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长16至80个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO:9-3246中任一项的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸由SEQ ID NO:9-3246中任一项的核碱基序列组成。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长16至80个连接的核苷，具有包含SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492或2575中任一项的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸具有由SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492、或2575中任一项组成的核碱基序列。在上述实施例的任一项中，该经修饰的寡核苷酸可以长10至30个连接的核苷。在某些实施例中，该化合物是ION 1062428、1062641、1062835、1062937、1063268、1063649、1063655、1063734、1064096、或1064313。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链或双链的。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，将化合物胃肠外地施用至个体。在某些实施例中，施用该化合物抑制或降低免疫抑制、Treg免疫抑制活性、癌细胞增殖、肿瘤生长或转移。在某些实施例中，施用该化合物诱导或活化抗癌或抗肿瘤免疫；抗癌或抗肿瘤免疫应答；免疫细胞活化或浸润；炎性细胞活化或浸润；效应免疫细胞活化或浸润；T细胞活化或浸润；CD8 T细胞活化或浸润；NK细胞活化或浸润；巨噬细胞和树突状细胞活化或浸润；炎症；或炎性细胞因子或趋化因子表达。
在某些实施例中，在患有癌症或处于患癌症的风险中的个体中抑制FOXP3表达的方法包括向该个体施用包含FOXP3特异性抑制剂的化合物，从而在个体中抑制FOXP3的表达。在某些实施例中，施用该化合物抑制FOXP3在Treg细胞、肿瘤微环境、肿瘤间质、Treg浸润的肿瘤、免疫细胞、淋巴组织、淋巴结或肿瘤内Foxp3+细胞中的表达。在某些实施例中，个体患有以下或处于患以下的风险中：具有微环境或间质或肿瘤引流淋巴结中的FOXP3阳性(FOXP3+)Treg的癌症、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、鳞状细胞癌(SCC)、头颈癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、胃肠道癌、大肠癌、小肠癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)、食道癌、胰腺癌、胆道癌、胃癌、尿路上皮癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、间皮瘤、肉瘤(例如上皮样肉瘤、横纹肌样肉瘤和滑膜肉瘤)、脊索瘤、肾癌、肾细胞癌(RCC)、脑癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、皮肤癌、黑素瘤、基底细胞癌、默克尔细胞癌、血液癌、造血癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤(MM)、B细胞恶性肿瘤、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、白血病或急性淋巴细胞性白血病(ALL)。在某些实施例中，该化合物包括靶向FOXP3的反义化合物。在某些实施例中，该化合物包括靶向FOXP3的寡核苷酸。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长8至80个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO:9-3246的核碱基序列中任一项的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长16至80个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO:9-3246中任一项的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸由SEQ ID NO:9-3246中任一项的核碱基序列组成。
在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长16至80个连接的核苷，具有包含SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492或2575中任一项的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸具有由SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492、或2575中任一项组成的核碱基序列。在上述实施例的任一项中，该经修饰的寡核苷酸可以长10至30个连接的核苷。在某些实施例中，该化合物是ION 1062428、1062641、1062835、1062937、1063268、1063649、1063655、1063734、1064096、或1064313。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链或双链的。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，将化合物胃肠外地施用至个体。在某些实施例中，施用该化合物抑制或降低免疫抑制、Treg免疫抑制活性、癌细胞增殖、肿瘤生长或转移。在某些实施例中，施用该化合物诱导或活化抗癌或抗肿瘤免疫；抗癌或抗肿瘤免疫应答；免疫细胞活化或浸润；炎性细胞活化或浸润；效应免疫细胞活化或浸润；T细胞活化或浸润；CD8 T细胞活化或浸润；NK细胞活化或浸润；巨噬细胞和树突状细胞活化或浸润；炎症；或炎性细胞因子或趋化因子表达。在某些实施例中，该个体被鉴定为患有癌症或处于患癌症的风险中。
在某些实施例中，抑制细胞中FOXP3表达的方法包括使该细胞与包含FOXP3特异性抑制剂的化合物接触，从而抑制细胞中FOXP3的表达。在某些实施例中，该细胞是癌细胞。在某些实施例中，该细胞是Treg细胞、肿瘤微环境细胞、肿瘤间质细胞、肿瘤中浸润的Treg细胞、免疫细胞、淋巴样细胞、淋巴结细胞或肿瘤内Foxp3+细胞。在某些实施例中，该细胞位于患有癌症或处于患癌症风险中的个体的肿瘤微环境、肿瘤间质或淋巴结中。在某些实施例中，癌症是具有以下的癌症：微环境或间质或肿瘤引流淋巴结中的FOXP3阳性(FOXP3+)Treg、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、鳞状细胞癌(SCC)、头颈癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、胃肠道癌、大肠癌、小肠癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)、食道癌、胰腺癌、胆道癌、胃癌、尿路上皮癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、间皮瘤、肉瘤(例如上皮样肉瘤、横纹肌样肉瘤和滑膜肉瘤)、脊索瘤、肾癌、肾细胞癌(RCC)、脑癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、皮肤癌、黑素瘤、基底细胞癌、默克尔细胞癌、血液癌、造血癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤(MM)、B细胞恶性肿瘤、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、白血病或急性淋巴细胞性白血病(ALL)。在某些实施例中，该化合物包括靶向FOXP3的反义化合物。在某些实施例中，该化合物包括靶向FOXP3的寡核苷酸。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长8至80个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO:9-3246的核碱基序列中任一项的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长16至80个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO:9-3246中任一项的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸由SEQ ID NO:9-3246中任一项的核碱基序列组成。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长16至80个连接的核苷，具有包含SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492或2575中任一项的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸具有由SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492、或2575中任一项组成的核碱基序列。在上述实施例的任一项中，该经修饰的寡核苷酸可以长10至30个连接的核苷。在某些实施例中，该化合物是ION1062428、1062641、1062835、1062937、1063268、1063649、1063655、1063734、1064096、或1064313。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链或双链的。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是反义化合物或寡聚化合物。
在某些实施例中，一种降低或抑制患有癌症或处于患癌症风险的个体的免疫抑制、Treg免疫抑制活性、癌细胞增殖、肿瘤生长或转移的方法包括给该个体施用包含FOXP3特异性抑制剂的化合物，从而降低或抑制该个体中的免疫抑制、Treg免疫抑制活性、癌细胞增殖、肿瘤生长或转移。在某些实施例中，在患有癌症或处于患癌症风险的个体中诱导或活化抗癌或抗肿瘤免疫；抗癌或抗肿瘤免疫应答；免疫细胞活化或浸润；炎性细胞活化或浸润；效应免疫细胞活化或浸润；T细胞活化或浸润；CD8 T细胞活化或浸润；NK细胞活化或浸润；巨噬细胞和树突状细胞活化或浸润；炎症；炎性细胞因子或趋化因子表达的方法包括给该个体施用包含FOXP3特异性抑制剂的化合物。在某些实施例中，个体患有以下或处于患以下的风险中：具有微环境或间质或肿瘤引流淋巴结中的FOXP3阳性(FOXP3+)Treg的癌症、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、鳞状细胞癌(SCC)、头颈癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、胃肠道癌、大肠癌、小肠癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)、食道癌、胰腺癌、胆道癌、胃癌、尿路上皮癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、间皮瘤、肉瘤(例如上皮样肉瘤、横纹肌样肉瘤和滑膜肉瘤)、脊索瘤、肾癌、肾细胞癌(RCC)、脑癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、皮肤癌、黑素瘤、基底细胞癌、默克尔细胞癌、血液癌、造血癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤(MM)、B细胞恶性肿瘤、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、白血病或急性淋巴细胞性白血病(ALL)。在某些实施例中，该化合物包括靶向FOXP3的反义化合物。在某些实施例中，该化合物包括靶向FOXP3的寡核苷酸。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长8至80个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO:9-3246的核碱基序列中任一项的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长16至80个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO:9-3246中任一项的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸由SEQ ID NO:9-3246中任一项的核碱基序列组成。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长16至80个连接的核苷，具有包含SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492或2575中任一项的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸具有由SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492、或2575中任一项组成的核碱基序列。在上述实施例的任一项中，该经修饰的寡核苷酸可以长10至30个连接的核苷。在某些实施例中，该化合物是ION1062428、1062641、1062835、1062937、1063268、1063649、1063655、1063734、1064096、或1064313。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链或双链的。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，将化合物胃肠外地施用至个体。在某些实施例中，该个体被鉴定为患有癌症或处于患癌症的风险中。
某些实施例涉及包含FOXP3特异性抑制剂的化合物，该化合物用于在治疗癌症中使用。在某些实施例中，癌症是具有微环境或间质或肿瘤引流淋巴结中的FOXP3阳性(FOXP3+)Treg的癌症、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、鳞状细胞癌(SCC)、头颈癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、胃肠道癌、大肠癌、小肠癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)、食道癌、胰腺癌、胆道癌、胃癌、尿路上皮癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、间皮瘤、肉瘤(例如上皮样肉瘤、横纹肌样肉瘤和滑膜肉瘤)、脊索瘤、肾癌、肾细胞癌(RCC)、脑癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、皮肤癌、黑素瘤、基底细胞癌、默克尔细胞癌、血液癌、造血癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤(MM)、B细胞恶性肿瘤、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、白血病或急性淋巴细胞性白血病(ALL)。在某些实施例中，该化合物包括靶向FOXP3的反义化合物。在某些实施例中，该化合物包括靶向FOXP3的寡核苷酸。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长8至80个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO:9-3246的核碱基序列中任一项的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长16至80个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO:9-3246中任一项的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸由SEQ ID NO:9-3246中任一项的核碱基序列组成。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长16至80个连接的核苷，具有包含SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492或2575中任一项的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸具有由SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492、或2575中任一项组成的核碱基序列。在上述实施例的任一项中，该经修饰的寡核苷酸可以长10至30个连接的核苷。在某些实施例中，该化合物是ION 1062428、1062641、1062835、1062937、1063268、1063649、1063655、1063734、1064096、或1064313。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链或双链的。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是反义化合物或寡聚化合物。
某些实施例涉及包含FOXP3特异性抑制剂的化合物，其用于降低或抑制患有癌症的个体中的免疫抑制、Treg免疫抑制活性、癌细胞增殖、肿瘤生长或转移。某些实施例涉及包含FOXP3特异性抑制剂的化合物，其用于在患有癌症的个体中诱导或活化抗癌或抗肿瘤免疫；抗癌或抗肿瘤免疫应答；免疫细胞活化或浸润；炎性细胞活化或浸润；效应免疫细胞活化或浸润；T细胞活化或浸润；CD8 T细胞活化或浸润；NK细胞活化或浸润；巨噬细胞和树突状细胞活化或浸润；炎症；或炎性细胞因子或趋化因子表达。在某些实施例中，癌症是具有微环境或间质或肿瘤引流淋巴结中的FOXP3阳性(FOXP3+)Treg的癌症、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、鳞状细胞癌(SCC)、头颈癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、胃肠道癌、大肠癌、小肠癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)、食道癌、胰腺癌、胆道癌、胃癌、尿路上皮癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、间皮瘤、肉瘤(例如上皮样肉瘤、横纹肌样肉瘤和滑膜肉瘤)、脊索瘤、肾癌、肾细胞癌(RCC)、脑癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、皮肤癌、黑素瘤、基底细胞癌、默克尔细胞癌、血液癌、造血癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤(MM)、B细胞恶性肿瘤、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、白血病或急性淋巴细胞性白血病(ALL)。在某些实施例中，该化合物包括靶向FOXP3的反义化合物。在某些实施例中，该化合物包括靶向FOXP3的寡核苷酸。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长8至80个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO:9-3246的核碱基序列中任一项的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长16至80个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO:9-3246中任一项的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸由SEQ ID NO:9-3246中任一项的核碱基序列组成。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长16至80个连接的核苷，具有包含SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492或2575中任一项的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸具有由SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492、或2575中任一项组成的核碱基序列。在上述实施例的任一项中，该经修饰的寡核苷酸可以长10至30个连接的核苷。在某些实施例中，该化合物是ION 1062428、1062641、1062835、1062937、1063268、1063649、1063655、1063734、1064096、或1064313。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链或双链的。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是反义化合物或寡聚化合物。
撰写某些实施例涉及包含FOXP3特异性抑制剂的化合物用于生产或制备用于治疗癌症的药物的用途。撰写某些实施例涉及包含FOXP3特异性抑制剂的化合物用于制备治疗癌症用的药物的用途。在某些实施例中，癌症是具有微环境或间质或肿瘤引流淋巴结中的FOXP3阳性(FOXP3+)Treg的癌症、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、鳞状细胞癌(SCC)、头颈癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、胃肠道癌、大肠癌、小肠癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)、食道癌、胰腺癌、胆道癌、胃癌、尿路上皮癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、间皮瘤、肉瘤(例如上皮样肉瘤、横纹肌样肉瘤和滑膜肉瘤)、脊索瘤、肾癌、肾细胞癌(RCC)、脑癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、皮肤癌、黑素瘤、基底细胞癌、默克尔细胞癌、血液癌、造血癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤(MM)、B细胞恶性肿瘤、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、白血病或急性淋巴细胞性白血病(ALL)。在某些实施例中，该化合物包括靶向FOXP3的反义化合物。在某些实施例中，该化合物包括靶向FOXP3的寡核苷酸。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长8至80个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO:9-3246的核碱基序列中任一项的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长16至80个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO:9-3246中任一项的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸由SEQ ID NO:9-3246中任一项的核碱基序列组成。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长16至80个连接的核苷，具有包含SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492或2575中任一项的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸具有由SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492、或2575中任一项组成的核碱基序列。在上述实施例的任一项中，该经修饰的寡核苷酸可以长10至30个连接的核苷。在某些实施例中，该化合物是ION 1062428、1062641、1062835、1062937、1063268、1063649、1063655、1063734、1064096、或1064313。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链或双链的。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是反义化合物或寡聚化合物。
某些实施例涉及包含FOXP3特异性抑制剂的化合物在制造或制备药物中的用途，该药物用于降低或抑制患有癌症的个体中的免疫抑制、Treg免疫抑制活性、癌细胞增殖、肿瘤生长或转移。撰写某些实施例涉及包含FOXP3特异性抑制剂的化合物用于生产或制备药物的用途，该药物用于在患有癌症的个体中诱导或活化抗癌或抗肿瘤免疫；抗癌或抗肿瘤免疫应答；免疫细胞活化或浸润；炎性细胞活化或浸润；效应免疫细胞活化或浸润；T细胞活化或浸润；CD8 T细胞活化或浸润；NK细胞活化或浸润；巨噬细胞和树突状细胞活化或浸润；炎症；或炎性细胞因子或趋化因子表达。在某些实施例中，癌症是具有微环境或间质或肿瘤引流淋巴结中的FOXP3阳性(FOXP3+)Treg的癌症、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、鳞状细胞癌(SCC)、头颈癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、胃肠道癌、大肠癌、小肠癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)、食道癌、胰腺癌、胆道癌、胃癌、尿路上皮癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、间皮瘤、肉瘤(例如上皮样肉瘤、横纹肌样肉瘤和滑膜肉瘤)、脊索瘤、肾癌、肾细胞癌(RCC)、脑癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、皮肤癌、黑素瘤、基底细胞癌、默克尔细胞癌、血液癌、造血癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤(MM)、B细胞恶性肿瘤、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、白血病或急性淋巴细胞性白血病(ALL)。在某些实施例中，该化合物包括靶向FOXP3的反义化合物。在某些实施例中，该化合物包括靶向FOXP3的寡核苷酸。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长8至80个连接的核苷并且具有包含SEQ IDNO:9-3246的核碱基序列中任一项的至少8个连续核碱基的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长16至80个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO:9-3246中任一项的核碱基序列的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸由SEQ ID NO:9-3246中任一项的核碱基序列组成。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸长16至80个连接的核苷，具有包含SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492或2575中任一项的核碱基序列。在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸具有由SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492、或2575中任一项组成的核碱基序列。在上述实施例的任一项中，该经修饰的寡核苷酸可以长10至30个连接的核苷。在某些实施例中，该化合物是ION 1062428、1062641、1062835、1062937、1063268、1063649、1063655、1063734、1064096、或1064313。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是单链或双链的。在上述实施例的任一项中，该化合物可以是反义化合物或寡聚化合物。
在上述方法或用途的任一项中，该化合物可以靶向FOXP3。在某些实施例中，该化合物包含经修饰的寡核苷酸或由其组成，例如，经修饰的寡核苷酸长8至80个连接的核苷、10至30个连接的核苷、12至30个连接的核苷、或20个连接的核苷。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸与SEQ ID NO:1-5所列举的核碱基序列中任一项是至少80％、85％、90％、95％或100％互补的。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸包括至少一种经修饰的核苷间连接、至少一种经修饰的糖和/或至少一种修饰的核碱基。在某些实施例中，该经修饰的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接，该经修饰的糖是二环糖或2’-O-甲氧基乙基，并且该修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸包括由连接的脱氧核苷组成的缺口区段；由连接的核苷组成的5’翼区段；和由连接的核苷组成的3’翼区段，其中该缺口区段被定位成紧邻该5’翼区段和该3’翼区段并且位于它们之间，并且其中每个翼区段的每个核苷都包括经修饰的糖。
在任何上述实施例中，该经修饰的寡核苷酸可以长12至30、15至30、15至25、15至24、16至24、17至24、18至24、19至24、20至24、19至22、20至22、16至20、或17个或20个连接的核苷。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸与SEQ ID NO:1-5所列举的核碱基序列中任一项是至少80％、85％、90％、95％或100％互补的。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸包括至少一种经修饰的核苷间连接、至少一种经修饰的糖和/或至少一种修饰的核碱基。在某些实施例中，该经修饰的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接，该经修饰的糖是二环糖或2’-O-甲氧基乙基，并且该修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸包括由连接的2’-脱氧核苷组成的缺口区段；由连接的核苷组成的5’翼区段；和由连接的核苷组成的3’翼区段，其中该缺口区段被定位成紧邻该5’翼区段和该3’翼区段并且位于它们之间，并且其中每个翼区段的每个核苷都包括经修饰的糖。
在上述方法或用途的任一项中，该化合物可以包含经修饰的寡核苷酸或由其组成，该经修饰的寡核苷酸长16至80个连接的核苷并且具有包含SEQ ID NO:9-3246中的任一项的核碱基序列，其中该经修饰的寡核苷酸包含：
由连接的2’-脱氧核苷组成的缺口区段；
由连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由连接的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含经修饰的糖。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16-30个连接的核苷。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16个连接的核苷。
在前述任何方法或用途中，化合物可以包含经修饰的寡核苷酸或由其组成，该经修饰的寡核苷酸长16-80个连接的核碱基并且具有包含SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492或2575中任一项列举的序列的核碱基序列，其中该经修饰的寡核苷酸包含：
由连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由连接的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含经修饰的糖。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16-30个连接的核苷。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16个连接的核苷。
在前述任何方法或用途中，化合物可以包含经修饰的寡核苷酸或由其组成，该经修饰的寡核苷酸长16-80个连接的核碱基并且具有包含SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492或2575中任一项列举的序列的核碱基序列，其中该经修饰的寡核苷酸包含：
由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由三个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间；其中每个翼段的每个核苷包含cEt核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16-30个连接的核苷。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16个连接的核苷。
在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸或由其组成，该经修饰的寡核苷酸长16-80个连接的核碱基，具有包含SEQ ID NO:449中列举的序列的核碱基序列，其中该经修饰的寡核苷酸包含：
由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由三个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间；其中每个翼段的每个核苷包含cEt核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16-30个连接的核苷。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸长16个连接的核苷。
在上述方法或用途的任一项中，该化合物可以包括ION 1063734或其盐，或由ION1063734或其盐组成，该ION 1063734或其盐具有以下化学结构：
Figure BDA0003058421320000421
在上述方法或用途的任一项中，该化合物包括ION 1063734或由ION 1063734组成，该ION 1063734具有以下化学结构：
Figure BDA0003058421320000431
在上述方法或用途的任一项中，可以将该化合物胃肠外地施用。例如，在某些实施例中，可以将该化合物通过注射或输注施用。胃肠外施用包括皮下施用、静脉内施用、肌内施用、动脉内施用、腹膜内施用、或颅内施用(例如鞘内或脑室内施用)。
某些组合和组合疗法
在某些实施例中，包含本文所述化合物的第一药剂与一种或多种第二药剂共同施用。在某些实施例中，这样的第二药剂被设计成治疗与本文所述的第一药剂相同的疾病、障碍或病症。在某些实施例中，这样的第二药剂被设计成治疗与本文所述的第一药剂不同的疾病、障碍或病症。在某些实施例中，第一药剂被设计成治疗第二药剂的不希望的副作用。在某些实施例中，第二药剂与第一药剂共同施用，以治疗第一药剂的不希望的作用。在某些实施例中，这样的第二试剂被设计成治疗本文所述的一种或多种药物组合物的不希望的副作用。在某些实施例中，第二药剂与第一药剂共同施用以产生组合作用。在某些实施例中，第二药剂与第一药剂共同施用以产生协同作用。在某些实施例中，第一和第二药剂的共同施用允许使用比作为独立疗法施用时获得治疗或预防作用所需的更低的剂量。
在某些实施例中，本文提供的一种或多种化合物或组合物与一种或多种第二药剂共同施用。在某些实施例中，在不同时间施用本文提供的一种或多种化合物或组合物和一种或多种第二药剂。在某些实施例中，本文提供的一种或多种化合物或组合物和一种或多种第二药剂一起以单一配制品制备。在某些实施例中，本文提供的一种或多种化合物或组合物和一种或多种第二药剂分开制备。
在某些实施例中，第二药剂选自：先天免疫细胞活化剂，包括但不限于TLR激动剂(例如MEDI9197)和STING激动剂(例如MK-1454)；免疫抑制性介质的抑制剂，包括但不限于CD39和CD73抑制剂(例如奥来鲁单抗)、IDO1抑制剂(例如依多司他)和精氨酸酶抑制剂(例如INCB001158)；T细胞共刺激性受体的活化剂，包括但不限于CD137激动剂(例如乌瑞鲁单抗、乌托鲁单抗)、CD27激动剂(例如varlimumab)和CD40激动剂(例如MEDI5083)；T细胞抑制性受体的抑制剂，包括但不限于LAG3抑制剂(例如relatlimab)、TIM3抑制剂(例如LY3321367)和TIGIT抑制剂(例如tiragolumab)；Treg抑制性受体的活化剂，包括但不限于GITR激动剂(例如MEDI1873)；NK细胞活化策略，包括但不限于NKG2a(例如莫那利珠单抗)；癌症疫苗(如Sipuleucel-T)；和肿瘤的免疫原性杀伤，包括但不限于溶瘤病毒、辐射、光动力疗法和化疗(例如蒽环类、奥沙利铂等)。
在某些实施例中，第二药剂选自：免疫肿瘤制(IO)剂；免疫检查点抑制剂；免疫调节剂；PD1-PDL1/2途径抑制剂；PD-L1抑制剂，包括但不限于度伐鲁单抗、阿维鲁单抗和阿特珠单抗；PD-1抑制剂，包括但不限于纳武单抗和派姆单抗；CTLA-4抑制剂，包括但不限于艾匹利木单抗和tremilimumab；STAT3抑制剂，包括但不限于STAT3siRNA、STAT3反义寡核苷酸和danvatirsen(AZD9150)；和腺苷2A受体(A2AR)拮抗剂，包括但不限于AZD4635。
某些实施例涉及如本文所述靶向FOXP3的化合物与第二药剂组合的用途。在特定实施例中，这种用途是在治疗患有癌症的患者的方法中，所述癌症包括但不限于具有微环境或间质或肿瘤引流淋巴结中的FOXP3阳性(FOXP3+)Treg的癌症、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、鳞状细胞癌(SCC)、头颈癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、胃肠道癌、大肠癌、小肠癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)、食道癌、胰腺癌、胆道癌、胃癌、尿路上皮癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、间皮瘤、肉瘤(例如上皮样肉瘤、横纹肌样肉瘤和滑膜肉瘤)、脊索瘤、肾癌、肾细胞癌(RCC)、脑癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、皮肤癌、黑素瘤、基底细胞癌、默克尔细胞癌、血液癌、造血癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤(MM)、B细胞恶性肿瘤、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、白血病或急性淋巴细胞性白血病(ALL)。在某些实施例中，第二药剂选自：免疫肿瘤制(IO)剂；免疫检查点抑制剂；免疫调节剂；PD1-PDL1/2途径抑制剂；PD-L1抑制剂，包括但不限于度伐鲁单抗、阿维鲁单抗和阿特珠单抗；PD-1抑制剂，包括但不限于纳武单抗和派姆单抗；CTLA-4抑制剂，包括但不限于艾匹利木单抗和tremilimumab；STAT3抑制剂，包括但不限于STAT3 siRNA、STAT3反义寡核苷酸和danvatirsen(AZD9150)。
撰写某些实施例涉及如本文所述靶向FOXP3的化合物和二第二药剂的组合，例如选自以下的第二药剂：免疫肿瘤制(IO)剂；免疫检查点抑制剂；免疫调节剂；PD1-PDL1/2途径抑制剂；PD-L1抑制剂，包括但不限于度伐鲁单抗、阿维鲁单抗和阿特珠单抗；PD-1抑制剂，包括但不限于纳武单抗和派姆单抗；CTLA-4抑制剂，包括但不限于艾匹利木单抗和tremilimumab；STAT3抑制剂，包括但不限于STAT3 siRNA、STAT3反义寡核苷酸和danvatirsen(AZD9150)。
在某些实施例中，本文所述靶向FOXP3的化合物和第二药剂通过同时、分开或顺序施用两种药剂用于组合治疗。在某些实施例中，两种药剂配制成固定剂量的组合产品。在其他实施例中，将两种药剂作为分开的单元提供给患者，其可以同时或连续(顺序)服用。
在某些实施例中，本文所述靶向FOXP3的化合物与免疫调节剂组合使用，所述免疫调节剂例如抗PD-L1抗体(或其抗原结合片段)、抗PD-1抗体(或其抗原结合片段)、抗CTLA-4抗体(或其抗原结合片段)或OX40激动剂((例如，OX40配体融合蛋白、或OX40激动剂抗体或其抗原结合片段))。
在某些实施例中，本文所述靶向FOXP3的化合物与免疫检查点抑制剂组合使用，免疫检查点抑制剂例如抗PD-L1抗体(或其抗原结合片段)、抗PD-1抗体(或其抗原结合片段)或抗CTLA-4抗体(或其抗原结合片段)。
抗PD-L1抗体在本领域中是已知的。示例性抗PD-L1抗体包括：MEDI4736(度伐鲁单抗)、MPDL3280A、BMS936559、2.7A4、AMP-714、MDX-1105和MPDL3280A(阿特珠单抗)。
抗PD-1抗体在本领域中是已知的。示例性抗PD-1抗体包括：纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗和AMP-514
抗CTLA-4抗体在本领域中是已知的。示例性抗CTLA-4抗体包括：tremelimumab和艾匹利木单抗，也称为MDX-010(或BMS-734016)。
OX40激动剂和抗体是本领域已知的。示例性OX40激动剂和/或抗体包括：MEDI6383、9B12和MEDI0562。
在一个实施例中，所述组合包括反义寡核苷酸Ionis 651987或其盐，和至少一种选自下组的免疫调节剂，该组由以下组成：MEDI4736、MPDL3280A、BMS936559、2.7A4、AMP-714、MDX-1105、纳武单抗、派姆单抗、匹地利珠单抗，MPDL3280A、tremelimumab、艾匹利木单抗、MEDI0562和MEDI0562。
在一个实施例中，该组合包括抗PD-L1抗体MEDI4736(度伐鲁单抗)和ION1063734。
在一个实施例中，该组合包括ION 1063734、抗PD-L1抗体MEDI4736(度伐鲁单抗)和抗CTLA-4抗体tremelimumab。
某些抗PD-L1抗体
特异性结合并抑制PD-L1的抗体包括在本披露中。
度伐鲁单抗(MEDI4736)是一种示例性的抗PD-L1抗体，其对PD-L1多肽具有选择性，并阻断PD-L1与PD-1和CD80受体的结合。度伐鲁单抗在体外可解除PD-L1介导的对人T细胞活化的抑制，并通过T细胞依赖机制抑制异种移植瘤模型中的肿瘤生长。
关于用于本文提供的方法中的度伐鲁单抗(或其片段)的信息可以见于美国专利号8,779,108，该专利的披露内容通过引用以其全文并入本文。度伐鲁单抗的片段可结晶(Fc)结构域在IgG1重链的恒定结构域中含有三重突变，该三重突变减少与负责介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的补体组分C1q和Fcγ受体的结合。在某些实施例中，用于在本文提供的方法中使用的MEDI4736或其抗原结合片段包括如在美国专利号8,779,108和9493565(将其通过引用以其全文并入本文)中披露的2.14H9OPT抗体的可变重链和可变轻链CDR序列。
在所公开的文献中存在可以在本发明中表征的许多抗PD-L1抗体，包括在开发中和/或在临床试验中的化合物，诸如：度伐鲁单抗(MEDI4736)、MPDL3280A、BMS936559、2.7A4、AMP-714和MDX-1105。披露在可在本披露中有用的抗PD-L1抗体的专利说明书包括：美国专利号7,943,743；8,383,796；9,102,725；9,273,135(BMS/Medarex)，US 2006/0153841(丹娜法伯(Dana Farber))，US 2011/0271358(丹娜法伯)，美国专利号8,552,154和9,102,727(丹娜法伯)，美国专利号8,217,149(基因技术公司(Genentech))，包括已发行的美国专利号8,217,149，US 2012/0039906(因塞穆公司(INSERM))，US 2016/0031990(爱普利姆公司(Amplimune))，美国专利号8,779,108(英商梅迪缪思(MedImmune)-对于度伐鲁单抗/MEDI4726和2.7A4)，US 2014/0044738(爱普利姆公司-对于AMP-714)和US 2010/0285039(约翰霍普金斯大学)。这些披露中的每一个通过引用以其全部内容结合在此。
某些抗CTLA-4抗体
特异性结合CTLA-4并抑制CTLA-4活性的抗体用于增强抗肿瘤免疫应答。关于用于本文提供的方法中的曲美木单抗(或其抗原结合片段)的信息可以发现于US 6,682,736(其中曲美木单抗被称为11.2.1)，所述专利的披露内容通过引用以其全文并入本文。曲美木单抗(也称为CP-675,206、CP-675、CP-675206、和替西木单抗)是一种人IgG2单克隆抗体，该单克隆抗体对于CTLA-4有高度选择性并阻断了CTLA-4与CD80(B7.1)和CD86(B7.2)的结合。它已被证明导致体外免疫活化，并且用曲美木单抗治疗的一些患者已表现出肿瘤消退。在某些实施例中，用于本文提供的这些方法中的曲美木单抗或其抗原结合片段包含如在美国专利号6,682,736中所披露的11.2.1抗体的可变重链和可变轻链CDR序列，将该专利通过引用以其全文并入本文。
其他抗CTLA-4抗体描述于例如US 20070243184中。在一个实施例中，该抗CTLA-4抗体是艾匹利木单抗，也被称作MDX-010；BMS-734016。
某些OX40激动剂
在通过抗原引发过程中或在该引发后不久，OX40激动剂与CD4+T细胞上的OX40受体相互作用，从而导致CD4+T细胞对该抗原的应答增加。与对单独抗原的应答相比，OX40激动剂与抗原特异性CD4+T细胞上的OX40受体相互作用可以增加T细胞增殖。与OX40激动剂不存在的情况相比，对抗原的升高的应答可以维持实质上更长的时间段。因此，经由OX40激动剂的刺激通过加强抗原例如肿瘤细胞的T细胞识别来增强抗原特异性免疫应答。OX40激动剂例如在美国专利号6,312,700、7,504,101、7,622,444以及7,959,925中有所描述，这些专利通过引用以其全部内容结合在此。在癌症治疗中使用这些激动剂的方法例如在US 2015/0098942和US 2015/0157710中有所描述，这些专利中的每一个通过引用以其全文结合在此。
OX40激动剂包括但不限于OX40结合分子，例如结合多肽，例如OX40配体(“OX40L”)或OX40结合片段、变体或其衍生物(诸如可溶性细胞外配体结构域和OX40L融合蛋白)以及抗OX40抗体(例如，单克隆抗体诸如人源化单克隆抗体)或其抗原结合片段、变体或衍生物。抗OX40单克隆抗体的实例例如在美国专利号5,821,332和6,156,878中有所描述，这些专利的披露内容通过引用以其全部内容结合在此。在某些实施例中，该抗OX40单克隆抗体是9B12或其抗原结合片段、变体或衍生物，如Weinberg,A.D.等人，J Immunother[免疫学治疗杂志]29，575-585(2006)中所描述，该文献通过引用以其全文结合在此。在另一个实施例OX40抗体是如US 2016/0137740所述的MEDI0562。
在其他实施例中，特异性地结合到OX40的抗体或其抗原结合片段结合到与mAb9B12相同的OX40表位。示例性人源化OX40抗体在以下中描述：Morris等人,Mol Immunol.[分子免疫学]2007年5月；44(12):3112-3121。9B12是鼠类IgG1，针对人OX40(CD134)的细胞外结构域的抗OX40 mAb(Weinberg,A.D.,等人J Immunother[免疫学治疗杂志]29,575-585(2006))。由于9B12引发对于OX40信号传导的激动剂应答的能力、稳定性以及其通过杂交瘤的高水平产生，所以从一系列抗OX40单克隆抗体中选择9B12。对于在临床应用中的使用，将9B12 mAb用磷酸盐缓冲盐水(pH 7.0)平衡，并且通过渗滤将它的浓度调节至5.0mg/ml。
“OX40配体”(“OX40L”)(也不同地称作肿瘤坏死因子配体超家族成员4、gp34、TAX转录活化糖蛋白-1以及CD252)在很大程度上被发现于抗原呈递细胞(APC)上，并且可以在活化的B细胞、树突细胞(DC)、朗格汉斯细胞、浆细胞样DC以及巨噬细胞上被诱导(Croft,M.,(2010)Ann Rev Immunol[免疫学年鉴]28:57-78)。其他细胞，包括活化的T细胞、NK细胞、肥大细胞、内皮细胞以及平滑肌细胞可以响应于炎性细胞因子(同上)中表达OX40L。OX40L特异性结合到OX40受体。人蛋白在美国专利6,156,878中有所描述。小鼠OX40L在美国专利5,457,035中有所描述。OX40L表达于细胞的表面上，并包括细胞内、跨膜和细胞外受体结合结构域。OX40L的功能活性可溶形式可以通过缺失细胞内和跨膜结构域来产生，如例如在以下专利中所描述的：美国专利号5,457,035；6,312,700；6,156,878；6,242,566；6,528,055；6,528,623；7,098,184；以及7,125,670，这些专利的披露内容出于所有目的结合在此。OX40L的功能活性形式是保留特异性结合到OX40的能力的形式，即具有OX40“受体结合结构域”的形式。一个实例是人OX40L的氨基酸51至183。确定OX40L分子或衍生物特异性结合到OX40的能力的方法在以下进行讨论。制备和使用OX40L以及其衍生物(诸如包含OX40结合结构域的衍生物)的方法在以下专利中有所描述：美国专利号6,156,878；6,242,566；6,528,055；6,528,623；7,098,184；以及7,125,670，这些专利还描述包含连接到其他肽的OX40L可溶形式的蛋白质，诸如人免疫球蛋白(“Ig”)Fc区，这些蛋白质可以产生来促进OX40配体从培养细胞的纯化，或者增强在体内施用给哺乳动物之后分子的稳定性(还参见，美国专利号5,457,035和7,959,925，这两者均通过引用以其全文结合在此)。
在OX40L的定义内还包括的是OX40配体变体，它的氨基酸序列与天然存在的OX40配体分子不同，但是它保留特异性结合到OX40受体的能力。这些变体在以下专利中有所描述：美国专利号5,457,035；6,156,878；6,242,566；6,528,055；6,528,623；7,098,184；以及7,125,670。在相关的实施例中，使用已经丧失特异性结合到OX40的能力的OX40L的突变体，例如氨基酸51至183，其中人OX40L的受体结合结构域的位置180处的苯丙氨酸已被替换为丙氨酸(F180A)。
OX40激动剂包括融合蛋白，在该融合蛋白中，OX40L的一个或多个结构域共价地连接到一个或多个另外的蛋白结构域。可用作OX40激动剂的示例性OX40L融合蛋白在美国专利号6,312,700中有所描述，该专利的披露内容通过引用以其全部内容结合在此。在一个实施例中，OX40激动剂包括自组装成多聚体(例如，三聚体或六聚体)OX40L融合蛋白的OX40L融合多肽。这样的融合蛋白例如在美国专利号7,959,925中有所描述，该专利通过引用以其全文结合在此。该多聚体OX40L融合蛋白在增强受试者(尤其是人受试者)的抗原特异性免疫应答方面表现出增加的效力，这是由于其自发地组装成高度稳定的三聚体和六聚体的能力。
在另一个实施例中，能够组装成多聚体形式的OX40激动剂包括在N末端至C末端方向上包含以下各项的融合多肽：免疫球蛋白结构域，其中该免疫球蛋白结构域包括Fc结构域、三聚化结构域，其中该三聚化结构域包括卷曲螺旋三聚化结构域；以及受体结合结构域，其中该受体结合结构域是OX40受体结合结构域，例如OX40L或OX40结合片段、其变体或衍生物，其中该融合多肽可以自组装成三聚体融合蛋白。在一个方面，能够组装成多聚体形式的OX40激动剂能够结合OX40受体并且刺激至少一种OX40介导的活性。在某些方面，OX40激动剂包含OX40配体的细胞外结构域。
能够组装成多聚体形式的OX40激动剂的三聚结构域用于促进单个OX40L融合多肽分子自组装成三聚体蛋白。因此，具有三聚化结构域的OX40L融合多肽自组装成三聚体OX40L融合蛋白。在一个方面中，该三聚化结构域是异亮氨酸拉链结构域(zipper domain)或其他卷曲螺旋多肽结构。示例性卷曲螺旋的三聚化结构域包括：TRAF2(
Figure BDA0003058421320000521
登录号Q12933，氨基酸299-348；凝血酶反应蛋白1(登录号PO7996，氨基酸291-314；母系蛋白-4(登录号O95460，氨基酸594-618；CMP(母系蛋白-1)(登录号NP-002370，氨基酸463-496；HSF1(登录号AAX42211，氨基酸165-191；和Cubilin(登录号NP-001072，氨基酸104-138)。在某些特定方面，三聚化结构域包括TRAF2三聚化结构域、母系蛋白-4三聚化结构域或其组合。
OX40L FP是特异性结合到人OX40受体(TNFR家族成员)并通过人OX40受体触发信号传导的人OX40配体IgG4P融合蛋白。OX40L FP还在US 2016/0024176中披露，该专利通过引用以其全部内容结合在此。OX40L FP由三个不同结构域构成：(1)形成同源三聚体并结合OX40受体的人OX40配体细胞外受体结合结构域(RBD)；(2)使OX40配体RBD的同源三聚体结构稳定的从TNFR相关联因子2衍生的异亮氨酸拉链三聚化结构域；以及(3)人IgG4片段可结晶γ(Fcγ)结构域，该结构域促进融合蛋白在结合到OX40受体时的Fcγ受体聚集，并且在铰链区(IgG4P)的位置228(根据EU编号)处包含丝氨酸对脯氨酸取代，以提升两组OX40配体RBD同源三聚体的稳定性。该IgG4P Fc结构域直接融合到从人肿瘤坏死因子2(TRAF2)的氨基酸残基310-349衍生的异亮氨酸拉链三聚化结构域。融合到TRAF2域的C-末端的是人OX40L(基因名称TNFSF4)的细胞外受体结合结构域(RBD)的氨基酸残基51-183。该TRAF2结构域使OX40L RBD的同源三聚体结构稳定，以使得OX40能够结合和活化，而该IgG4P Fc结构域赋予血清稳定性、OX40L三聚体的二聚化，并且促进六聚体融合蛋白的Fcγ受体聚集。一种OX40L FP变体在对应于OX40L的位置180的氨基酸处具有苯丙氨酸(F)到丙氨酸(A)突变。另一种OX40L FP变体用人IgG1 Fc结构域替换IgG4P Fc结构域。在具体实施例中，用于本披露中的OX40激动剂是这些OX40L FP变体中的一种。
在具体实施例中，用于本披露中的OX40激动剂已经被修饰以增加它的血清半衰期。例如，OX40激动剂的血清半衰期可以通过与异源分子如血清白蛋白、抗体Fc区或PEG缀合来增加。在某些实施例中，OX40激动剂可以与其他治疗剂或毒素缀合以形成免疫缀合物和/或融合蛋白。在某些实施例中，OX40激动剂可以进行配制以便促进施用并提升活性剂的稳定性。
抗体衍生物
用于在本披露中使用的抗体(例如，抗CTLA-4、抗PD-L1、抗PD-1、抗OX40)可以包括这些序列的保留特异性结合它们的靶标的变体。这些变体可以由熟练的技术人员通过使用本领域中公知的技术从这些抗体的序列中衍生而来。例如，可以在FR和/或CDR中制造氨基酸取代、缺失、或添加。虽然FR的改变一般被设计来改进抗体的稳定性及免疫原性，而CDR的改变典型地被设计来增加抗体对它的靶标的亲和力。FR的变体还包括天然存在的免疫球蛋白同种异型。此类亲和力增加的改变可凭经验通过涉及改变CDR和测试其靶标的亲和抗体的常规技术来确定。例如，可以在所披露的CDR中的任一个中制造保守的氨基酸取代。可以根据Antibody Engineering[抗体工程],第2版,牛津大学出版社(Oxford UniversityPress),Borrebaeck编辑,1995中所述的方法进行不同改变。这些包括(但不限于)由在序列内编码功能上等同的氨基酸残基的不同密码子的取代改变的核苷酸序列，从而产生“沉默”的变化。例如，非极性氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以及蛋氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺。带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸以及组氨酸。带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
本披露的抗体的衍生物和类似物可以通过本领域中公知的各种技术来生产，这些技术包括重组的和合成的方法(Maniatis(1990)Molecular Cloning,A LaboratoryManual[分子克隆，实验室手册]，第2版，冷泉港实验室，纽约州冷泉港；和Bodansky等人(1995)The Practice of Peptide Synthesis[肽合成的实践]，第2版，施普林格出版社，德国柏林)。Stemmer(Nature[自然](1994)370:389-391)也披露了类似改组或组合技术，描述了与β-内酰胺酶基因相关的技术但观察到该方法可用于产生抗体。
可以使用一个或多个选择的VH和/或VL基因的随机诱变来生成携带从在此所披露的序列衍生的一个或多个序列的新的VH或VL区。格拉姆(Gram)等人(美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.)(1992)89:3576-3580)描述了一种这样的技术，易错PCR。
可使用的另一个方法是将诱变引导至VH或VL基因的CDR。Barbas等人(美国国家科学院院刊(Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.)(1994)91:3809-3813)和希尔(Schier)等人(分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)(1996)263:551-567)披露了这样的技术。
类似地，一个或多个或所有三个CDR可以接合至VH或VL结构域的谱系中，然后针对对CTLA-4或PD-L1具有特异性的抗原结合片段来对这些结构域进行筛选。
免疫球蛋白可变结构域的一部分将包括大致上如在此阐述的CDR中的至少一个，以及任选地，来自如在此阐述的scFv片段的干预框架区。该部分可以包括FR1和FR4中的一个或两个的至少约50％，该50％是FR1的C末端50％和FR4的N末端50％。可变域的实质性部分的N-末端或C-末端的另外的残基可以是通常不与天然存在的可变域区域相关的那些残基。例如，通过重组DNA技术构建抗体可以导致由所引入的接头编码的N-或C-末端残基的引入，以便促进克隆或其他操纵步骤。其他操纵步骤包括引入接头以将可变结构域连接至另外的蛋白质序列，这些蛋白质序列包括免疫球蛋白重链恒定区、其他可变结构域(例如在双抗体产生中)、或蛋白质的标签，如在下文更详细地讨论。
熟练的技术人员将认识到，用于本披露中的抗体可以包含仅含有来自VL或VH结构域的单个CDR的抗原结合片段。这些单链特异性结合结构域中的任一个可以用于筛选能够形成一个双结构域特异性抗原结合片段的互补结构域，该抗原结合片段能够例如结合到CTLA-4和PD-L1。
用于在此所描述的本披露中的抗体可以连接至另一功能性分子，例如另一种肽或蛋白质(白蛋白、另一种抗体等)。例如，这些抗体可以通过化学交联或通过重组方法连接。这些抗体还可以按以下专利中所列出的方式连接至多种非蛋白质聚合物例如，聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯中的一种：美国专利号4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192；或4,179,337。这些抗体可以通过共价缀合至一种聚合物而被化学地修饰，例如来增加它们的循环半衰期。示例性聚合物和附接这些抗体的方法还在美国专利号4,766,106；4,179,337；4,495,285以及4,609,546中示出。
这些抗体还可以改变以具有不同于天然模式的糖基化模式。例如，一个或多个碳水化合物部分可以被缺失和/或一个或多个糖基化位点可以被添加到原始抗体。将糖基化位点添加到当前披露的抗体可以通过改变氨基酸序列以包含本领域中已知的糖基化位点共有序列来实现。在抗体上增加碳水化合物部分的数量的另一种方式是通过使糖苷与抗体的氨基酸残基进行化学或酶促偶联。这种方法描述在WO 87/05330和在阿普林(Aplin)等人(1981)化学橡胶公司生物化学关键评论(CRC Crit.Rev.Biochem.)，22:259-306中。将任何碳水化合物部分从抗体除去可以通过化学或酶促方法来实现，例如，如Hakimuddin等人(1987)Arch.Biochem.Biophys.[生物化学与生物物理学集刊],259:52；和Edge等人(1981)Anal.Biochem.[分析生物化学],118:131，以及通过Thotakura等人(1987)Meth.Enzymol.[酶学方法],138:350中所述的。抗体也可以用可检测或功能性标记来加标记。可检测标记包括放射性标记，如131I或99Tc，可使用常规化学来将它们附接至抗体。可检测标记还包括酶标记，例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。可检测标记进一步包括化学部分，如生物素，其可经由结合至特定同源可检测部分(例如标记的抗生物素蛋白)来检测。
在本披露的范围内涵盖CDR序列仅在非本质上与本文所列出的抗体不同的抗体。典型地，一个氨基酸被具有类似电荷、疏水性或立体化学特征的相关氨基酸取代。此类取代将在技术人员的普通技能之内。不像在CDR中，可以在FR中进行更多实质性的改变，而不对抗体的结合特性造成不利影响。对FR的改变包括(但不限于)人源化非人起源的或工程化某些框架残基，这些框架氨基对于抗原接触或稳定结合位点是重要的，例如，改变恒定区的类或亚类，改变可能改变效应子功能(如Fc受体结合)的特定氨基酸残基，例如，如在美国专利号5,624,821和5,648,260和伦德(Lund)等人(1991)免疫学杂志(J.Immun.)147:2657-2662和摩根(Morgan)等人(1995)免疫学(Immunology)86:319-324中所描述的，或改变恒定区起源的物种。
本领域的技术人员将理解，以上所述的改变不是全部详尽的，并且由于本披露的传授内容，许多其他的改变将对熟练的技术人员是显而易见的。
某些化合物
在某些实施例中，本文描述的化合物可以是反义化合物。在某些实施例中，该反义化合物包括寡聚化合物或由其组成。在某些实施例中，该寡聚化合物包括经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸具有与靶核酸的核碱基序列互补的核碱基序列。
在某些实施例中，本文描述的化合物包括经修饰的寡核苷酸或由其组成。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸具有与靶核酸的核碱基序列互补的核碱基序列。
在某些实施例中，化合物或反义化合物是单链的。这样的单链化合物或反义化合物包括寡聚化合物或由其组成。在某些实施例中，这样的寡聚化合物包括寡核苷酸以及任选地缀合物基团，或由其组成。在某些实施例中，该寡核苷酸是反义寡核苷酸。在某些实施例中，该寡核苷酸被修饰。在某些实施例中，单链反义化合物或寡聚化合物的寡核苷酸包括自我互补的核碱基序列。
在某些实施例中，化合物是双链的。此类双链化合物包括具有与靶核酸互补的区域的第一经修饰的寡核苷酸以及具有与第一经修饰的寡核苷酸互补的区域的第二经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，该经修饰的寡核苷酸是RNA寡核苷酸。在此类实施例中，在经修饰的寡核苷酸中的胸腺嘧啶核碱基被尿嘧啶核碱基替换。在某些实施例中，化合物包括缀合物基团。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸中的一种是缀合的。在某些实施例中，两种经修饰的寡核苷酸均是缀合的。在某些实施例中，第一经修饰的寡核苷酸是缀合的。在某些实施例中，第二经修饰的寡核苷酸是缀合的。在某些实施例中，第一经修饰的寡核苷酸长12-30个连接的核苷，并且第二经修饰的寡核苷酸长12-30个连接的核苷。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸中的一种具有包含SEQ ID NO:9-3246中任一项的至少8个连续核碱基的核碱基序列。
在某些实施例中，反义化合物是双链的。此类双链反义化合物包括具有与靶核酸互补的区域的第一寡聚化合物以及具有与第一寡聚化合物互补的区域的第二寡聚化合物。此类双链反义化合物的第一寡聚化合物通常包括经修饰的寡核苷酸和任选地缀合物基团，或由经修饰的寡核苷酸和任选地缀合物基团组成。此类双链反义化合物的第二寡聚化合物的寡核苷酸可以是修饰的或未修饰的。双链反义化合物的任一寡聚化合物或两种寡聚化合物可以包括缀合物基团。双链反义化合物的这些寡聚化合物可以包括非互补突出的核苷。
单链的和双链的化合物的实例包括但不限于寡核苷酸、siRNA、靶向寡核苷酸的微小RNA、以及单链RNAi化合物，如小发夹RNA(shRNA)、单链siRNA(ssRNA)、和微小RNA模拟物。
在某些实施例中，本文描述的化合物具有以下核碱基序列，当按5’至3’方向编写时，该核碱基序列包括所靶向的靶核酸的靶区段的反向互补序列。
在某些实施例中，本文描述的化合物包括长10至30个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长12至30个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包含长度为12至22个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长14至30个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长14至20个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长15至30个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长15至20个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长16至30个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长16至20个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长17至30个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长17至20个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长18至30个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长18至21个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长18至20个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长20至30个连接的亚单位的寡核苷酸。换言之，此类寡核苷酸分别长12至30个连接的亚单位、14至30个连接的亚单位、14至20个亚单位、15至30个亚单位、15至20个亚单位、16至30个亚单位、16至20个亚单位、17至30个亚单位、17至20个亚单位、18至30个亚单位、18至20个亚单位、18至21个亚单位、20至30个亚单位、或12至22个连接的亚单位。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长14个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长16个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长17个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长18个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长19个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些实施例中，本文描述的化合物包括长20个连接的亚单位的寡核苷酸。在其他实施例中，本文描述的化合物包括长8至80、12至50、13至30、13至50、14至30、14至50、15至30、15至50、16至30、16至50、17至30、17至50、18至22、18至24、18至30、18至50、19至22、19至30、19至50、或20至30个连接的亚单位的寡核苷酸。在某些这样的实施例中，本文描述的化合物包括长8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、或80个连接的亚单位，或由以上值中任两个所限定的范围的寡核苷酸。在一些实施例中，这些连接的亚单位是核苷酸、核苷、或核碱基。
在某些实施例中，该化合物可以进一步包括另外的附接至该寡核苷酸的特征或元件，如缀合物基团。在某些实施例中，此类化合物是反义化合物。在某些实施例中，此类化合物是寡聚化合物。在缀合物基团包括核苷(即将该缀合物基团连接至该寡核苷酸的核苷)的实施例中，该缀合物基团的核苷未被算在该寡核苷酸的长度中。
在某些实施例中，化合物可以被缩短或截短。例如，可以从5’端(5’截短)、或可替代地从3’端(3’截短)缺失单个亚单位。靶向FOXP3核酸的经缩短的或经截短的化合物可以从该化合物的5’端缺失两个亚单位，或可替代地，可以从该化合物的3’端缺失两个亚单位。可替代地，被缺失的核苷可以分散遍及该化合物。
当单个的另外的亚单位存在于加长的化合物中时，该另外的亚单位可以位于该化合物的5’或3’端。当两个或更多个另外的亚单位存在时，所添加的亚单位可以彼此相邻，例如，在向该化合物的5’端(5’添加)、或可替代地向3’端(3’添加)添加了两个亚单位的化合物中。可替代地，经添加的亚单位可以分散遍及该化合物。
增加或减少化合物(如寡核苷酸)的长度和/或引入错配碱基而不消除活性是可能的(Woolf等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]1992,89:7305-7309；Gautschi等人J.Natl.Cancer Inst.[美国国家癌症研究所杂志]2001年3月,93:463-471；Maher和Dolnick Nuc.Acid.Res.[核酸研究]1998,16:3341-3358)。然而，表面上看来，寡核苷酸序列、化学和基序中的小变化可以在临床开发所需的许多特性的一者或多者中造成较大的差异(Seth等人J.Med.Chem.[药物化学杂志]2009,52,10；Egli等人J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志]2011,133,16642)。
在某些实施例中，本文描述的化合物是干扰RNA化合物(RNAi)，其包括双链RNA化合物(也称为短干扰RNA或siRNA)和单链RNAi化合物(或ssRNA)。此类化合物至少部分地通过RISC途径起作用，以降解和/或螯合靶核酸(因此，包括微小RNA/微小RNA模拟化合物)。如本文使用的，术语siRNA意在与用于描述能够介导序列特异性RNAi的核酸分子的其他术语是等效的，这些核酸分子是例如短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)、短发夹RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸、短干扰经修饰的寡核苷酸、化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)、以及其他。另外，如本文使用的，术语RNAi意在与用于描述序列特异性RNA干扰(如转录后基因沉默、翻译抑制、或表观遗传学)的其他术语是等效的。
在某些实施例中，本文所述的化合物可以包含靶向本文所述的FOXP3的寡核苷酸序列中的任一个。在某些实施例中，该化合物可以是双链的。在某些实施例中，该化合物包括第一链和第二链，该第一链包含SEQ ID NO:13-3246中任一项的至少8、9、10、11、12、9、14、15、16、17、18、19、或20个连续核碱基部分。在某些实施例中，该化合物包括第一链和第二链，该第一链包含SEQ ID NO:9-3246中任一项的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物包括核糖核苷酸，在这些核糖核苷酸中第一链具有代替SEQ ID NO:9-3246的任一项中的胸腺嘧啶(T)的尿嘧啶(U)。在某些实施例中，该化合物包括(i)第一链，其包含与SEQ ID NO:9-3246中任一项所靶向的FOXP3上的位点互补的核碱基序列，和(ii)第二链。在某些实施例中，该化合物包括一个或多个经修饰的核苷酸，在这些核苷酸中，糖的2’位包含卤素(如氟基团；2’-F)或包含烷氧基基团(如甲氧基基团；2’-OMe)。在某些实施例中，该化合物包括至少一个2’-F糖修饰和至少一个2’-OMe糖修饰。在某些实施例中，对于沿着该dsRNA化合物的链的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个连续核碱基而言，该至少一个2’-F糖修饰和至少一个2’-OMe糖修饰被布置成交替模式。在某些实施例中，该化合物在相邻核苷酸之间包括除天然存在的磷酸二酯连接之外的一种或多种连接。此类连接的实例包括磷酰胺、硫代磷酸酯、和二硫代磷酸酯连接。这些化合物还可以是化学修饰的核酸分子，如在美国专利号6,673,661中所传授的。在其他实施例中，该化合物包含一条或两条加帽链，如由例如2000年4月19日提交的WO 00/63364。
在某些实施例中，该化合物的第一链是siRNA引导链，并且该化合物的第二链是siRNA随从链(passenger strand)。在某些实施例中，该化合物的第二链与第一链互补。在某些实施例中，该化合物的每条链长16、17、18、19、20、21、22、或23个连接的核苷。在某些实施例中，该化合物的第一链或第二链可以包括缀合物基团。
在某些实施例中，本文所述的化合物可以包含靶向本文所述的FOXP3的寡核苷酸序列中的任一个。在某些实施例中，该化合物是单链的。在某些实施例中，这样的化合物是单链RNAi(ssRNAi)化合物。在某些实施例中，该化合物包括SEQ ID NO:13-3246中任一项的至少8、9、10、11、12、9、14、15、16、17、18、19、或20个连续核碱基部分。在某些实施例中，该化合物包括SEQ ID NO:9-3246中任一项的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物包括核糖核苷酸，在这些核糖核苷酸中尿嘧啶(U)代替SEQ ID NO:9-3246的任一项中的胸腺嘧啶(T)。在某些实施例中，该化合物包括与SEQ ID NO:9-3246中任一项所靶向的FOXP3上的位点互补的核碱基序列。在某些实施例中，该化合物包括一个或多个经修饰的核苷酸，在这些核苷酸中，糖的2’位包含卤素(如氟基团；2’-F)或包含烷氧基基团(如甲氧基基团；2’-OMe)。在某些实施例中，该化合物包括至少一个2’-F糖修饰和至少一个2’-OMe糖修饰。在某些实施例中，对于沿着该化合物的链的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个连续核碱基而言，该至少一个2’-F糖修饰和至少一个2’-OMe糖修饰被布置成交替模式。在某些实施例中，该化合物在相邻核苷酸之间包括除天然存在的磷酸二酯连接之外的一种或多种连接。此类连接的实例包括磷酰胺、硫代磷酸酯、和二硫代磷酸酯连接。这些化合物还可以是化学修饰的核酸分子，如在美国专利号6,673,661中所传授的。在其他实施例中，该化合物包含加帽链，如由例如2000年4月19日提交的WO 00/63364所披露的。在某些实施例中，该化合物由16、17、18、19、20、21、22、或23个连接的核苷组成。在某些实施例中，该化合物可以包括缀合物基团。
在某些实施例中，本文描述的化合物包括经修饰的寡核苷酸。某些经修饰的寡核苷酸具有一个或多个不对称中心并且因此产生对映异构体、非对映异构体、和其他立体异构构型，就绝对立体化学而言，它们可以被定义为(R)或(S)，或定义为α或β(如针对糖异头物)，或定义为(D)或(L)(如针对氨基酸)等。在此提供的经修饰的寡核苷酸中包括所有此类可能的异构体，包括其外消旋的和光学纯的形式，除非另外说明。同样地，也包括所有顺式-和反式-异构体以及互变异构形式。
在此描述的化合物包括其中一个或多个原子被指定元素的非放射性同位素或放射性同位素置换的变体。例如，包含氢原子的本文的化合物涵盖对于每个1H氢原子的所有可能的氘取代。由本文的化合物涵盖的同位素取代包括但不限于：2H或3H代替1H、13C或14C代替12C、15N代替14N、17O或18O代替16O、及33S、34S、35S或36S代替32S。在某些实施例中，非放射性同位素取代可以赋予化合物新的特性，这些特性有益于用作治疗或研究工具。在某些实施例中，放射性同位素取代可使化合物适合于研究或诊断目的，例如成像测定。
某些机制
在某些实施例中，本文描述的化合物包括经修饰的寡核苷酸或由其组成。在某些实施例中，本文描述的化合物是反义化合物。在某些实施例中，化合物包括寡聚化合物。在某些实施例中，本文描述的化合物能够杂交到靶核酸上，从而产生至少一种反义活性。在某些实施例中，本文描述的化合物选择性地影响一个或多个靶核酸。此类化合物包括杂交到一个或多个靶核酸上的核碱基序列，从而产生一种或多种所希望的反义活性，并且不杂交到一个或多个非靶核酸上或不以产生显著所不希望的反义活性的这样一种方式杂交到一个或多个非靶核酸上。
在某些反义活性中，本文描述的化合物与靶核酸的杂交导致募集切割该靶核酸的蛋白。例如，本文描述的某些化合物导致RNA酶H介导的靶核酸切割。RNA酶H是一种切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶。这样的RNA:DNA双链体中的DNA不必是未经修饰的DNA。在某些实施例中，本文描述的化合物具有足够的“DNA样(DNA-like)”以引起RNA酶H活性。进一步地，在某些实施例中，在缺口体的缺口中耐受一个或多个非DNA样核苷。
在某些反义活性中，将本文描述的化合物或化合物的一部分加载到RNA诱导沉默复合体(RISC)中，从而最终导致靶核酸的切割。例如，本文描述的某些化合物导致该靶核酸被Argonaute切割。加载到RISC中的化合物是RNAi化合物。RNAi化合物可以是双链(siRNA)或单链(ssRNA)的。
在某些实施例中，本文描述的化合物与靶核酸的杂交不导致募集切割该靶核酸的蛋白。在某些这样的实施例中，该化合物与靶核酸的杂交导致该靶核酸的剪接的改变。在某些实施例中，该化合物与靶核酸的杂交导致该靶核酸与蛋白或其他核酸之间的结合相互作用的抑制。在某些这样的实施例中，该化合物与靶核酸的杂交导致该靶核酸的翻译的改变。
可以直接地或间接地观察到反义活性。在某些实施例中，反义活性的观察或检测涉及观察或检测靶核酸或由这样的靶核酸编码的蛋白的量的变化、核酸或蛋白的剪接变体的比率的变化、和/或细胞或动物中的表型变化。
靶核酸、靶区域以及核苷酸序列
在某些实施例中，本文描述的这些化合物包括寡核苷酸或由其组成，该寡核苷酸包含与靶核酸互补的区域。在某些实施例中，该靶核酸是内源RNA分子。在某些实施例中，该靶核酸编码蛋白。在某些这样的实施例中，该靶核酸选自：mRNA和前mRNA，包括内含子区、外显子区和非翻译区。在某些实施例中，该靶RNA是mRNA。在某些实施例中，该靶核酸是前mRNA。在某些这样的实施例中，该靶区域整个在内含子内。在某些实施例中，该靶区域跨内含子/外显子接点。在某些实施例中，该靶区域的至少50％在内含子内。
编码FOXP3的核苷酸序列包括但不限于以下：RefSEQ No.NM_014009.3(SEQ IDNO:1)；NT_011568.12_TRUNC_11907130_11921808_COMP(SEQ ID NO:2)；NM_001114377.1(SEQ ID NO:3)；NC_000023.11_TRUNC_49247001_49273000_COMP(SEQ ID NO:4)；或UCSC登录号UC064ZFP.1，对应于装配体GRCh38/hg38上的基因座标chrX:49,251,334-49,259,240(SEQ ID NO:5)；将其各自通过引用以其全文而结合。
杂交
在一些实施例中，杂交发生在本文披露的化合物与FOXP3核酸之间。最常见的杂交机制涉及核酸分子的互补核碱基之间的氢键合(例如，沃森-克里克(Watson-Crick)、胡斯坦(Hoogsteen)或反向胡斯坦氢键合)。
杂交能在不同的条件下发生。杂交条件是序列依赖性的，并且由待杂交的核酸分子的性质和组成决定。
测定序列是否可与靶核酸特异性地杂交的方法是本领域熟知的。在某些实施例中，本文提供的化合物与FOXP3核酸特异性地杂交。
互补性
当将两个核碱基序列在相反方向上进行比对时，这样的寡核苷酸或其一个或多个区域的核碱基序列匹配另一个寡核苷酸或核酸或其一个或多个区域的核碱基序列，寡核苷酸被说成与另一个核酸互补。如本文所述，核碱基匹配或互补核碱基限于以下对：腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)，腺嘌呤(A)和尿嘧啶(U)，胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)，以及5-甲基胞嘧啶(mC)和鸟嘌呤(G)，除非另有说明。互补寡核苷酸和/或核酸无需在每个核苷处都具有核碱基互补性，并且可以包括一个或多个核碱基错配。当此类寡核苷酸在每个核苷处都具有核碱基匹配而没有任何核碱基错配时，寡核苷酸是完全互补的或100％互补的。
在某些实施例中，本文描述的化合物包括经修饰的寡核苷酸或由其组成。在某些实施例中，本文描述的化合物是反义化合物。在某些实施例中，化合物包括寡聚化合物。化合物和FOXP3核酸之间的非互补核碱基可以被接受，只要该化合物仍然能够与靶核酸特异性地杂交。此外，化合物可以杂交到FOXP3核酸的一个或多个区段上，使得间插或相邻区段不包括在杂交事件中(例如，环结构、错配或发夹结构)。
在某些实施例中，本文提供的化合物、或其指定部分与、至少与、或至多与FOXP3核酸、其靶区域、靶区段、或指定部分是70％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％互补的。在某些实施例中，本文提供的化合物、或其指定部分与FOXP3核酸、其靶区域、靶区段、或指定部分是70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至95％、95％至100％、或这些范围之间的任何数字互补的。化合物与靶核酸的百分比互补性可以使用常规方法测定。
例如，在化合物的20个核碱基中有18个与靶区域互补并且因此特异性杂交的化合物代表90％互补性。在这个实例中，剩余的非互补核碱基可以与互补核碱基成簇或散布，并且不需要彼此连续或与互补核碱基连续。因此，长18个核碱基、具有由与靶核酸完全互补的两个区域侧接的四个非互补核碱基的化合物与靶核酸具有77.8％的总体互补性。使用本领域已知的BLAST程序(基本局部比对搜索工具)和PowerBLAST程序(Altschul等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],1990,215,403 410；Zhang和Madden，Genome Res.[基因组研究],1997,7,649 656)可以常规地确定化合物与靶核酸区域的互补性百分比。可以通过例如使用Smith和Waterman的算法(Adv.Appl.Math.[应用数学进展],1981,2,482 489)的Gap程序(威斯康星序列分析软件包(Wisconsin Sequence Analysis Package)，用于Unix的版本8，遗传学计算机集团(Genetics Computer Group)，威斯康星州麦迪逊市大学科技园(University Research Park,Madison Wis.))，使用默认设置确定百分比同源性、序列同一性或互补性。
在某些实施例中，本文描述的化合物或其指定部分与靶核酸、或其指定部分完全互补(即100％互补)。例如，化合物可以与FOXP3核酸、或其靶区域或靶区段或靶序列完全互补。如本文使用的，“完全互补”意指化合物的每个核碱基与靶核酸的对应核碱基是互补的。例如，20个核碱基的化合物与400个核碱基长的靶序列完全互补，只要存在与该化合物完全互补的靶核酸的相应的20个核碱基部分。完全互补也可以关于第一和/或第二核酸的指定部分来使用。例如，30个核碱基的化合物的20个核碱基部分可以与400个核碱基长的靶序列“完全互补”。30个核碱基的化合物的20个核碱基部分与该靶序列完全互补，如果该靶序列具有相应的20个核碱基部分、其中每个核碱基与该化合物的20个核碱基部分互补的话。同时，整个30个核碱基的化合物可以完全或可以不完全与该靶序列互补，这取决于该化合物的剩余10个核碱基是否也与该靶序列互补。
在某些实施例中，相对于该靶核酸，本文描述的化合物包括一个或多个错配的核碱基。在某些这样的实施例中，针对该靶标的反义活性被此类错配降低，但是针对非靶标的活性被降低更大的量。因此，在某些这样的实施例中，该化合物的选择性得以改进。在某些实施例中，该错配特别地位于具有缺口体基序的寡核苷酸内。在某些这样的实施例中，该错配在离该缺口区域的5’-端的位置1、2、3、4、5、6、7、或8处。在某些这样的实施例中，该错配在离该缺口区域的3’-端的位置9、8、7、6、5、4、3、2、1处。在某些这样的实施例中，该错配在离翼区域的5’-端的位置1、2、3、或4处。在某些这样的实施例中，该错配在离翼区域的3’-端的位置4、3、2、或1处。在某些实施例中，该错配特别地位于不具有缺口体基序的寡核苷酸内。在某些这样的实施例中，该错配在离寡核苷酸的5’-端的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12处。在某些这样的实施例中，该错配在离寡核苷酸的3’-端的位置2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12处。
非互补核碱基的位置可以在该化合物的5’端或3’端。可替代地，非互补核碱基或核碱基可以在该化合物的内部位置处。当存在两个或更多个非互补核碱基时，它们可以是连续的(即连接的)或不连续的。在一个实施例中，非互补核碱基位于缺口体寡核苷酸的翼区段中。
在某些实施例中，长或至多长11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个核碱基的本文描述的化合物相对于靶核酸(如FOXP3核酸)或其指定部分包括不超过4、不超过3、不超过2、或不超过1个非互补核碱基。
在某些实施例中，长或至多长11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核碱基的本文描述的化合物相对于靶核酸(如FOXP3核酸)或其指定部分包括不超过6、不超过5、不超过4、不超过3、不超过2、或不超过1个非互补核碱基。
在某些实施例中，本文描述的化合物还包括与靶核酸的一部分互补的那些。如本文使用的，“部分”是指靶核酸的区域或区段内确定数目的连续的(即连接的)核碱基。“部分”也可以指化合物的确定数目的连续核碱基。在某些实施例中，这些化合物与靶区段的至少8个核碱基部分互补。在某些实施例中，这些化合物与靶区段的至少9个核碱基部分互补。在某些实施例中，这些化合物与靶区段的至少10个核碱基部分互补。在某些实施例中，这些化合物与靶区段的至少11个核碱基部分互补。在某些实施例中，这些化合物与靶区段的至少12个核碱基部分互补。在某些实施例中，这些化合物与靶区段的至少13个核碱基部分互补。在某些实施例中，这些化合物与靶区段的至少14个核碱基部分互补。在某些实施例中，这些化合物与靶区段的至少15个核碱基部分互补。在某些实施例中，这些化合物与靶区段的至少16个核碱基部分互补。还考虑了与靶区段的至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、或更多个核碱基部分、或由这些值中任两个所限定的范围互补的化合物。
同一性
本文提供的这些化合物也可以与特定核苷酸序列、SEQ ID NO、或由特定ION编号代表的化合物、或其部分具有确定的百分比同一性。在某些实施例中，本文描述的化合物是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，本文描述的化合物是经修饰的寡核苷酸。如本文使用的，如果化合物具有与本文披露的序列相同的核碱基配对能力，则该化合物与本文披露的序列是相同的。例如，代替披露的DNA序列中的胸腺嘧啶而包含尿嘧啶的RNA被认为与该DNA序列是相同的，因为尿嘧啶和胸腺嘧啶两者均与腺嘌呤配对。还考虑了本文描述的化合物的缩短和加长形式、以及相对于本文提供的化合物具有非同一碱基的化合物。这些非同一碱基可以彼此相邻或分散遍及该化合物。化合物的百分比同一性根据相对于与它正在进行比较的序列具有同一碱基配对的碱基数来计算。
在某些实施例中，本文描述的化合物或其部分与本文披露的化合物或SEQ ID NO、或其部分的一个或多个具有，或至少具有70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在某些实施例中，本文描述的化合物与特定核苷酸序列、SEQ ID NO、或由特定ION编号代表的化合物、或其部分具有约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％，或这些值之间的任何百分比的同一性，其中这些化合物包括具有一个或多个错配核碱基的寡核苷酸。在某些这样的实施例中，该错配在离寡核苷酸的5’-端的位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12处。在某些这样的实施例中，该错配在离寡核苷酸的3’-端的位置2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12处。
在某些实施例中，本文描述的化合物包括反义化合物或由其组成。在某些实施例中，将该反义化合物的一部分与该靶核酸的等长部分进行比较。在某些实施例中，将8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个核碱基的部分与该靶核酸的等长部分进行比较。
在某些实施例中，本文描述的化合物包括寡核苷酸或由其组成。在某些实施例中，将该寡核苷酸的一部分与该靶核酸的等长部分进行比较。在某些实施例中，将8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或25个核碱基的部分与该靶核酸的等长部分进行比较。
某些修饰的化合物
在某些实施例中，本文描述的化合物包括寡核苷酸或由其组成，该寡核苷酸由连接的核苷组成。寡核苷酸可以是未经修饰的寡核苷酸(RNA或DNA)或可以是经修饰的寡核苷酸。相对于未经修饰的RNA或DNA，经修饰的寡核苷酸包括至少一种修饰(即，包括至少一种经修饰的核苷(包含经修饰的糖部分和/或修饰的核碱基)和/或至少一种经修饰的核苷间连接)。
A.经修饰的核苷
经修饰的核苷包括经修饰的糖部分或修饰的核碱基或同时包括经修饰的糖部分和修饰的核碱基。
1.经修饰的糖部分
在某些实施例中，糖部分是非二环经修饰的糖部分。在某些实施例中，经修饰的糖部分是二环的或三环的糖部分。在某些实施例中，经修饰的糖部分是糖代用品。此类糖代用品可以包括对应于经修饰的糖部分其他类型的那些的一个或多个取代。
在某些实施例中，经修饰的糖部分是非二环经修饰的糖部分，这些非二环经修饰的糖部分包含具有一个或多个非环状取代基(包括但不限于2’、4’、和/或5’位处的取代基)的呋喃糖基环。在某些实施例中，非二环经修饰的糖部分的一个或多个无环取代基是支链的。适于非二环经修饰的糖部分的2’-取代基基团的实例包括但不限于：2’-F、2'-OCH3(“OMe”或“O-甲基”)和2'-O(CH2)2OCH3(“MOE”)。在某些实施例中，2’-取代基基团选自：卤素、烯丙基、氨基、叠氮基、SH、CN、OCN、CF3、OCF3、O-C1-C10烷氧基、O-C1-C10取代的烷氧基、O-C1-C10烷基、O-C1-C10取代的烷基、S-烷基、N(Rm)-烷基、O-烯基、S-烯基、N(Rm)-烯基、O-炔基、S-炔基、N(Rm)-炔基、O-烷基烯基(alkylenyl)-O-烷基、炔基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基、O-芳烷基、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2ON(Rm)(Rn)或OCH2C(＝O)-N(Rm)(Rn)，其中每个Rm和Rn独立地是H、氨基保护基团、或取代的或未取代的C1-C10烷基，以及在Cook等人,U.S.6,531,584；Cook等人,U.S.5,859,221；以及Cook等人,U.S.6,005,087中描述的2’-取代基基团。这些2'-取代基基团的某些实施例可以进一步被独立地选自以下项的一个或多个取代基基团取代：羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基(NO2)、硫醇、硫代烷氧基、硫代烷基、卤素、烷基、芳基、烯基以及炔基。适合线性非二环经修饰的糖部分的4’-取代基基团的实例包括但不限于烷氧基(例如，甲氧基)、烷基以及在Manoharan等人，WO 2015/106128中描述的那些。适于非二环经修饰的糖部分的5’-取代基基团的实例包括但不限于：5’-甲基(R或S)、5'-乙烯基、和5’-甲氧基。在某些实施例中，非二环经修饰的糖包括不止一种非桥接糖取代基，例如，2'-F-5'-甲基糖部分，并且该经修饰的糖部分和经修饰的核苷描述于Migawa等人，US2010/190837和Rajeev等人，US 2013/0203836中。
在某些实施例中，2’-取代的核苷或2’-非二环修饰的核苷包括包含选自以下项的线性2’-取代基基团的糖部分：F、NH2、N3、OCF3、OCH3、O(CH2)3NH2、CH2CH＝CH2、OCH2CH＝CH2、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2ON(Rm)(Rn)、O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2、和N-取代的乙酰胺(OCH2C(＝O)-N(Rm)(Rn))，其中每个Rm和Rn独立地是H、氨基保护基团、或取代的或未取代的C1-C10烷基。
在某些实施例中，2’-取代的核苷或2’-非二环修饰的核苷包括包含选自以下项的线性2’-取代基基团的糖部分：F、OCF3、OCH3、OCH2CH2OCH3、O(CH2)2SCH3、O(CH2)2ON(CH3)2、O(CH2)2O(CH2)2N(CH3)2、和OCH2C(＝O)-N(H)CH3(“NMA”)。
在某些实施例中，2’-取代的核苷或2’-非二环修饰的核苷包括包含选自以下项的线性2’-取代基基团的糖部分：F、OCH3、和OCH2CH2OCH3。
包含经修饰的糖部分(如非二环经修饰的糖部分)的核苷通过该核苷的糖部分上的一个或多个取代的位置来提及。例如，包含2’-取代的或2-经修饰的糖部分的核苷被称为2’-取代的核苷或2-修饰的核苷。
某些经修饰的糖部分包括形成第二环的桥接糖取代基，从而产生二环糖部分。在某些这样的实施例中，该二环糖部分在4'与2'呋喃糖环原子之间包括桥。此类4’到2’桥接糖取代基的实例包括但不限于：4'-CH2-2'、4'-(CH2)2-2'、4'-(CH2)3-2'、4'-CH2-O-2'(“LNA”)、4'-CH2-S-2'、4'-(CH2)2-O-2'(“ENA”)、4'-CH(CH3)-O-2'(当处于S构型时，被称为“受约束的乙基”或“cEt”)、4’-CH2-O-CH2-2’、4’-CH2-N(R)-2’、4’-CH(CH2OCH3)-O-2’(“受约束的MOE”或“cMOE”)及其类似物(参见，例如Seth等人,U.S.7,399,845；Bhat等人,U.S.7,569,686；Swayze等人,U.S.7,741,457，和Swayze等人,U.S.8,022,193)、4'-C(CH3)(CH3)-O-2'及其类似物(参见，例如Seth等人,U.S.8,278,283)、4'-CH2-N(OCH3)-2'及其类似物(参见，例如Prakash等人,U.S.8,278,425)、4'-CH2-O-N(CH3)-2'(参见，例如Allerson等人,U.S.7,696,345和Allerson等人,U.S.8,124,745)、4'-CH2-C(H)(CH3)-2'(参见，例如Zhou等人,J.Org.Chem.[有机化学杂志],2009,74,118-134)、4'-CH2-C(＝CH2)-2'及其类似物(参见，例如Seth等人,U.S.8,278,426)、4’-C(RaRb)-N(R)-O-2’、4’-C(RaRb)-O-N(R)-2’、4'-CH2-O-N(R)-2'、和4'-CH2-N(R)-O-2'，其中每个R、Ra、和Rb独立地是H、保护基团、或C1-C12烷基(参见，例如Imanishi等人,U.S.7,427,672)。
在某些实施例中，此类4’到2’桥独立地包含1到4个连接的基团，这些基团独立地选自：-[C(Ra)(Rb)]n-、-[C(Ra)(Rb)]n-O-、-C(Ra)＝C(Rb)-、-C(Ra)＝N-、-C(＝NRa)-、-C(＝O)-、-C(＝S)-、-O-、-Si(Ra)2-、-S(＝O)x-、和-N(Ra)-；
其中：
x是0、1、或2；
n是1、2、3、或4；
每个Ra和Rb独立地是H、保护基团、羟基、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、杂环基、取代的杂环基、杂芳基、取代的杂芳基、C5-C7脂环基、取代的C5-C7脂环基、卤素、OJ1、NJ1J2、SJ1、N3、COOJ1、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、CN、磺酰基(S(＝O)2-J1)、或次硫酸基(sulfoxyl，S(＝O)-J1)；并且每个J1和J2独立地是H、C1-C12烷基、取代的C1-C12烷基、C2-C12烯基、取代的C2-C12烯基、C2-C12炔基、取代的C2-C12炔基、C5-C20芳基、取代的C5-C20芳基、酰基(C(＝O)-H)、取代的酰基、杂环基、取代的杂环基、C1-C12氨基烷基、取代的C1-C12氨基烷基、或保护基团。
另外的二环糖部分是本领域已知的，参见，例如：Freier等人,Nucleic AcidsResearch[核酸研究],1997,25(22),4429-4443；Albaek等人,J.Org.Chem.[有机化学杂志],2006,71,7731-7740；Singh等人,Chem.Commun.[化学通讯],1998,4,455-456；Koshkin等人,Tetrahedron[四面体],1998,54,3607-3630；Wahlestedt等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊],2000,97,5633-5638；Kumar等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学快报],1998,8,2219-2222；Singh等人,J.Org.Chem.[有机化学杂志],1998,63,10035-10039；Srivastava等人,J.Am.Chem.Soc.[美国化学会志],2007,129,8362-8379；Elayadi等人，Curr.Opinion Invens.Drugs[研究药物的最新观点],2001,2,558-561；Braasch等人,Chem.Biol.[化学生物学],2001,8,1-7；Orum等人,Curr.Opinion Mol.Ther.[分子疗法的最新观点],2001,3,239-243；Wengel等人,U.S.7,053,207，Imanishi等人,U.S.6,268,490，Imanishi等人,U.S.6,770,748，Imanishi等人,U.S.RE44,779；Wengel等人,U.S.6,794,499，Wengel等人,U.S.6,670,461；Wengel等人,U.S.7,034,133，Wengel等人,U.S.8,080,644；Wengel等人,U.S.8,034,909；Wengel等人,U.S.8,153,365；Wengel等人,U.S.7,572,582；和Ramasamy等人,U.S.6,525,191，Torsten等人,WO 2004/106356，Wengel等人,WO 1999/014226；Seth等人,WO 2007/134181；Seth等人,U.S.7,547,684；Seth等人,U.S.7,666,854；Seth等人,U.S.8,088,746；Seth等人,U.S.7,750,131；Seth等人,U.S.8,030,467；Seth等人,U.S.8,268,980；Seth等人,U.S.8,546,556；Seth等人,U.S.8,530,640；Migawa等人,U.S.9,012,421；Seth等人,U.S.8,501,805；Allerson等人,US 2008/0039618；和Migawa等人,US 2015/0191727。
在某些实施例中，二环糖部分和掺入此类二环糖部分的核苷进一步通过同分异构构型来定义。例如，LNA核苷(本文描述的)可以处于α-L构型或处于β-D构型。
Figure BDA0003058421320000741
α-L-亚甲基氧基(4’-CH2-O-2’)或α-L-LNA二环核苷已经被掺入显示反义活性的寡核苷酸中(Frieden等人,Nucleic Acids Research[核酸研究],2003,21,6365-6372)。本文，二环核苷的概述包括两种同分异构构型。当在本文的示例实施例中鉴定具体二环核苷(例如，LNA或cEt)的位置时，它们处于β-D构型，除非另外说明。
在某些实施例中，经修饰的糖部分包括一个或多个非桥接糖取代基和一个或多个桥接糖取代基(例如，5’-取代的和4’-2’桥接的糖)。
在某些实施例中，经修饰的糖部分是糖代用品。在某些这样的实施例中，该糖部分的氧原子被例如硫、碳或氮原子替换。在某些这样的实施例中，此类经修饰的糖部分还包括本文描述的桥接和/或非桥接取代基。例如，某些糖代用品包括4’-硫原子和在2’-位(参见，例如Bhat等人,U.S.7,875,733和Bhat等人,U.S.7,939,677)和/或5’位处的取代。
在某些实施例中，糖代用品包括具有不是5个原子的环。例如，在某些实施例中，糖代用品包括六元四氢吡喃(“THP”)。此类四氢吡喃可以被进一步修饰或取代。包含此类修饰的四氢吡喃的核苷包括但不限于己糖醇核酸(“HNA”)、安尼妥(anitol)核酸(“ANA”)、甘露醇核酸(“MNA”)(参见例如Leumann,CJ.Bioorg.&Med.Chem.[生物有机化学与医药化学]2002,10,841-854)、氟HNA：
Figure BDA0003058421320000751
(“F-HNA”，参见例如，Swayze等人,U.S.8,088,904；Swayze等人,U.S.8,440,803；和Swayze等人，U.S.9,005,906，F-HNA还可以称为F-THP或3’-氟四氢吡喃)、以及包含另外的具有下式的修饰的THP化合物的核苷：
Figure BDA0003058421320000761
其中，独立地，对于所述修饰的THP核苷中的每者：
Bx是核碱基部分；
T3和T4各自独立地是将该修饰的THP核苷连接至寡核苷酸的剩余部分的核苷间连接基团，或T3和T4之一是将该修饰的THP核苷连接至寡核苷酸的剩余部分的核苷间连接基团，并且T3和T4中另一者是H、羟基保护基团、连接的缀合物基团、或5'或3'-端基；q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自独立地是H、C1-C6烷基、取代的C1-C6烷基、C2-C6烯基、取代的C2-C6烯基、C2-C6炔基、或取代的C2-C6炔基；并且R1和R2各自独立地选自：氢、卤素、取代的或未取代的烷氧基、NJ1J2、SJ1、N3、OC(＝X)J1、OC(＝X)NJ1J2、NJ3C(＝X)NJ1J2、和CN，其中X是O、S或NJ1，并且每个J1、J2、和J3独立地是H或C1-C6烷基。
在某些实施例中，提供了修饰的THP核苷，其中q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7各自是H。在某些实施例中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中至少一个不同于H。在某些实施例中，q1、q2、q3、q4、q5、q6和q7中至少一个是甲基。在某些实施例中，提供了修饰的THP核苷，其中R1和R2之一是F。在某些实施例中，R1是F，并且R2是H。在某些实施例中，R1是甲氧基，并且R2是H，并且在某些实施例中，R1是甲氧基乙氧基，并且R2是H。
在某些实施例中，糖代用品包括具有超过5个原子和超过一个杂原子的环。例如，已经报道了包含吗啉基糖部分的核苷及其在寡核苷酸中的使用(参见，例如，Braasch等人,Biochemistry[生物化学],2002,41,4503-4510和Summerton等人,U.S.5,698,685；Summerton等人,U.S.5,166,315；Summerton等人,U.S.5,185,444；以及Summerton等人,U.S.5,034,506)。如这里使用的，术语“吗啉基”意指具有以下结构的糖代用品：
Figure BDA0003058421320000771
在某些实施例中，可以例如通过添加或改变来自以上吗啉基结构的不同取代基基团来修饰吗啉基。此类糖代用品在本文中被称为“修饰的吗啉基”。
在某些实施例中，糖代用品包括非环状部分。包含此类非环状糖代用品的核苷和寡核苷酸的实例包括但不限于：肽核酸(“PNA”)、非环状丁基核酸(参见，例如，Kumar等人，Org.Biomol.Chem.[有机化学与生物分子化学]，2013，11,5853-5865)，并且核苷和寡核苷酸描述于Manoharan等人，US 2013/130378中。
在本领域中已知许多其他可以用于经修饰的核苷中的二环和三环糖以及糖代用品环系统。
2.修饰的核碱基
核碱基(或碱基)修饰或取代在结构上可与天然存在的或合成的未经修饰的核碱基区别，但是在功能上可与其互换。天然的和修饰的核碱基两者都能够参与氢键合。此类核碱基修饰可以赋予反义化合物以核酸酶稳定性、结合亲和力或一些其他有益的生物学特性。
在某些实施例中，本文描述的化合物包括经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸包括一个或多个包含未经修饰的核碱基的核苷。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸包括一个或多个包含经修饰的核碱基的核苷。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸包括一个或多个不包含核碱基的核苷(被称为无碱基核苷)。
在某些实施例中，修饰的核碱基选自：5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶、烷基或炔基取代的嘧啶、烷基取代的嘌呤、以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤。在某些实施例中，修饰的核碱基选自：2-氨丙基腺嘌呤，5-羟甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，6-N-甲基鸟嘌呤，6-N-甲基腺嘌呤，2-丙基腺嘌呤，2-硫代尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-丙炔基(C≡C-CH3)尿嘧啶，5-丙炔基胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶，6-偶氮胞嘧啶，6-偶氮胸腺嘧啶，5-核糖基尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫代尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫醇基、8-硫代烷基、8-羟基、8-氮杂和其他8-取代的嘌呤，5-卤代(特别是5-溴)、5-三氟甲基、5-卤代尿嘧啶、和5-卤代胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤，7-甲基腺嘌呤，2-F-腺嘌呤，2-氨基腺嘌呤，7-去氮杂鸟嘌呤，7-去氮杂腺嘌呤，3-去氮杂鸟嘌呤，3-去氮杂腺嘌呤，6-N-苯甲酰基腺嘌呤，2-N-异丁酰基鸟嘌呤，4-N-苯甲酰基胞嘧啶，4-N-苯甲酰基尿嘧啶，5-甲基4-N-苯甲酰基胞嘧啶，5-甲基4-N-苯甲酰基尿嘧啶，通用碱基，疏水性碱基，混杂的碱基，大小扩大的碱基，以及氟化的碱基。另外的修饰的核碱基包括三环嘧啶，如1,3-二氮杂吩噁嗪-2-酮、1,3-二氮杂吩噻嗪-2-酮和9-(2-氨基乙氧基)-1,3-二氮杂吩噁嗪-2-酮(G-钳)。修饰的核碱基还可以包括其中的嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环替换的那些，例如7-去氮杂-腺嘌呤、7-去氮杂鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。另外的核碱基包括披露于Merigan等人,U.S.3,687,808中的那些，披露于The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering[高分子科学与工程简明百科],Kroschwitz,J.I.编辑,约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons),1990,858-859；Englisch等人,Angewandte Chemie[应用化学],国际版,1991,30,613；Sanghvi,Y.S.,第15章，Antisense Research and Applications,[反义研究与应用],Crooke,S.T.和Lebleu,B.,编辑,CRC出版社,1993,273-288中的那些；以及披露于Antisense Drug Technology[反义药物技术]第6和第15章,Crooke S.T.编辑,CRC出版社,2008,163-166和442-443中的那些。
传授了上文指出的修饰的核碱基中的某些以及其他修饰的核碱基的制备的公开物包括但不限于Manoharan等人,US 2003/0158403，Manoharan等人,US 2003/0175906；Dinh等人,U.S.4,845,205；Spielvogel等人,U.S.5,130,302；Rogers等人,U.S.5,134,066；Bischofberger等人,U.S.5,175,273；Urdea等人,U.S.5,367,066；Benner等人,U.S.5,432,272；Matteucci等人,U.S.5,434,257；Gmeiner等人,U.S.5,457,187；Cook等人,U.S.5,459,255；Froehler等人,U.S.5,484,908；Matteucci等人,U.S.5,502,177；Hawkins等人,U.S.5,525,711；Haralambidis等人，U.S.5,552,540；Cook等人,U.S.5,587,469；Froehler等人,U.S.5,594,121；Switzer等人,U.S.5,596,091；Cook等人,U.S.5,614,617；Froehler等人,U.S.5,645,985；Cook等人,U.S.5,681,941；Cook等人,U.S.5,811,534；Cook等人,U.S.5,750,692；Cook等人,U.S.5,948,903；Cook等人,U.S.5,587,470；Cook等人,U.S.5,457,191；Matteucci等人,U.S.5,763,588；Froehler等人,U.S.5,830,653；Cook等人,U.S.5,808,027；Cook等人,U.S.6,166,199；以及Matteucci等人,U.S.6,005,096。
在某些实施例中，靶向FOXP3核酸的化合物包含一个或多个修饰的核碱基。在某些实施例中，该修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。在某些实施例中，每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
3.经修饰的核苷间连接
RNA和DNA的天然存在的核苷间连接是3’至5’磷酸二酯连接。在某些实施例中，由于所希望的特性，例如像，增强的细胞摄取、对靶核酸的增强的亲和力、和在核酸酶存在下增加的稳定性，具有一个或多个修饰的(即，非天然存在的)核苷间连接的本文描述的化合物被选择为优于具有天然存在的核苷间连接的化合物。
具有手性中心的代表性的核苷间连接包括但不限于烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。包含具有手性中心的核苷间连接的经修饰的寡核苷酸可以制备为包含立体随机核苷间连接的经修饰的寡核苷酸群体，或者制备为包含呈特定的立体化学构型的硫代磷酸酯连接的修饰寡核苷酸群体。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸群体包含硫代磷酸酯核苷间连接，其中所有硫代磷酸酯核苷间连接是立体随机的。可以使用合成方法产生这种经修饰的寡核苷酸，该合成方法导致每个硫代磷酸酯连接的立体化学构型的随机选择。尽管如此，如本领域技术人员所熟知的，每个单独的寡核苷酸分子的每个单独的硫代磷酸酯具有确定的立体构型。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸群体富含以下经修饰的寡核苷酸，该经修饰的寡核苷酸包含以特定的、独立选择的立体化学构型的一个或多个特定的硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施例中，特定硫代磷酸酯连接的特定构型存在于群体中至少65％的分子中。在某些实施例中，特定硫代磷酸酯连接的特定构型存在于群体中至少70％的分子中。在某些实施例中，特定硫代磷酸酯连接的特定构型存在于群体中至少80％的分子中。在某些实施例中，特定硫代磷酸酯连接的特定构型存在于群体中至少90％的分子中。在某些实施例中，特定硫代磷酸酯连接的特定构型存在于群体中至少99％的分子中。这种手性富集的经修饰的寡核苷酸群体可以使用本领域已知的合成方法产生，例描述于Oka等人,JACS 125,8307(2003)，Wan等人Nuc.Acid.Res.[核酸研究]42,13456(2014)，和WO 2017/015555中的方法。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸群体富含具有至少一个呈(Sp)构型的指示的硫代磷酸酯的经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸群体富含具有至少一个呈(Rp)构型的硫代磷酸酯的经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，包含(Rp)和/或(Sp)硫代磷酸酯的经修饰的寡核苷酸分别包含下式中的一个或多个，其中“B”指示核碱基：
Figure BDA0003058421320000811
除非另有说明，否则本文所述的经修饰的寡核苷酸的手性核苷间连接可以是立体随机的或以特定的立体化学构型。
在某些实施例中，靶向FOXP3核酸的化合物包含一个或多个经修饰的核苷间连接。在某些实施例中，该经修饰的核苷间连接是硫代磷酸酯连接。在某些实施例中，反义化合物的每个核苷间连接均为硫代磷酸酯核苷间连接。
在某些实施例中，本文描述的化合物包括寡核苷酸。具有经修饰的核苷间连接的寡核苷酸包括保留磷原子的核苷间连接以及不具有磷原子的核苷间连接。代表性的含磷核苷间连接包括但不限于磷酸二酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、以及硫代磷酸酯。制备含磷连接和非含磷连接的方法是熟知的。
在某些实施例中，可以使用任何核苷间连接将经修饰的寡核苷酸的核苷连接在一起。通过存在或不存在磷原子来定义两类主要的核苷间连接基团。代表性的含磷核苷间连接包括但不限于包含磷酸二酯键(“P＝O”)的磷酸酯(也被称为未经修饰的或天然存在的连接)、磷酸三酯、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯、以及硫代磷酸酯(“P＝S”)和二硫代磷酸酯(“HS-P＝S”)。代表性的非含磷核苷间连接基团包括但不限于亚甲基甲亚氨基(-CH2-N(CH3)-O-CH2-)、硫代二酯、硫氨酯(-O-C(＝O)(NH)-S-)；硅氧烷(-O-SiH2-O-)；以及N,N’-二甲基肼(-CH2-N(CH3)-N(CH3)-)。与天然存在的磷酸酯连接相比，经修饰的核苷间连接可以用于改变(典型地是增加)寡核苷酸的核酸酶抗性。在某些实施例中，具有手性原子的核苷间连接可以被制备为外消旋混合物，或制备为单独的对映异构体。代表性的手性核苷间连接包括但不限于烷基膦酸酯和硫代磷酸酯。制备含磷核苷间连接和非含磷核苷间连接的方法是本领域的技术人员所熟知的。
中性核苷间连接包括但不限于磷酸三酯、甲基膦酸酯、MMI(3'-CH2-N(CH3)-O-5')、酰胺-3(3'-CH2-C(＝O)-N(H)-5')、酰胺-4(3'-CH2-N(H)-C(＝O)-5')、缩甲乙醛(formacetal)(3'-O-CH2-O-5')、甲氧丙基、以及硫代缩甲乙醛(3'-S-CH2-O-5')。另外的中性核苷间连接包括包含硅氧烷(二烷基硅氧烷)、羧酸酯、羧酰胺、硫化物、磺酸酯和酰胺的非离子连接(参见例如：Carbohydrate Modifications inAntisense Research[反义研究中的碳水化合物修饰]；Y.S.Sanghvi和P.D.Cook,编辑,ACS Symposium Series 580[ACS研讨会文集580]；第3和第4章,40-65)。另外的中性核苷间连接包括包含混合的N、O、S和CH2组成部分的非离子连接。
在某些实施例中，寡核苷酸包括沿着该寡核苷酸或其区域布置成限定模式或修饰的核苷间连接基序的修饰的核苷间连接。在某些实施例中，核苷间连接被布置成带缺口的基序。在这样的实施例中，两个翼区域的每个中的核苷间连接与缺口区域中的核苷间连接是不同的。在某些实施例中，翼中的核苷间连接是磷酸二酯，并且缺口中的核苷间连接是硫代磷酸酯。独立地选择核苷基序，所以具有带缺口的核苷间连接基序的此类寡核苷酸可以具有或可以没有带缺口的核苷基序，并且如果它的确具有带缺口的核苷基序，则翼和缺口长度可以相同或可以不相同。
在某些实施例中，寡核苷酸包括具有交替的核苷间连接基序的区域。在某些实施例中，寡核苷酸包括一致修饰的核苷间连接的区域。在某些这样的实施例中，该寡核苷酸包括通过硫代磷酸酯核苷间连接均匀地连接的区域。在某些实施例中，该寡核苷酸通过硫代磷酸酯均匀地连接。在某些实施例中，该寡核苷酸的每个核苷间连接都选自磷酸二酯和硫代磷酸酯。在某些实施例中，该寡核苷酸的每个核苷间连接选择磷酸二酯和硫代磷酸酯，并且至少一种核苷间连接是硫代磷酸酯。
在某些实施例中，该寡核苷酸包括至少6个硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施例中，该寡核苷酸包括至少8个硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施例中，该寡核苷酸包括至少10个硫代磷酸酯核苷间连接。在某些实施例中，该寡核苷酸包括至少6个连续硫代磷酸酯核苷间连接的至少一个嵌段。在某些实施例中，该寡核苷酸包括至少8个连续硫代磷酸酯核苷间连接的至少一个嵌段。在某些实施例中，该寡核苷酸包括至少10个连续硫代磷酸酯核苷间连接的至少一个嵌段。在某些实施例中，该寡核苷酸包括至少12个连续硫代磷酸酯核苷间连接的至少一个嵌段。在某些这样的实施例中，至少一个此类嵌段位于该寡核苷酸的3’端。在某些这样的实施例中，至少一个此类嵌段位于该寡核苷酸的3’端的3个核苷内。
在某些实施例中，寡核苷酸包括一个或多个甲基膦酸酯连接。在某些实施例中，具有缺口体核苷基序的寡核苷酸包括包含除一个或两个甲基膦酸酯连接之外的所有硫代磷酸酯连接的连接基序。在某些实施例中，一个甲基膦酸酯连接在具有缺口体核苷基序的寡核苷酸的中心缺口中。
在某些实施例中，令人希望的是将硫代磷酸酯核苷间连接和磷酸二酯核苷间连接的数目布置成维持核酸酶抗性。在某些实施例中，令人希望的是将硫代磷酸酯核苷间连接的数目和位置以及磷酸二酯核苷间连接的数目和位置布置成维持核酸酶抗性。在某些实施例中，可以减少硫代磷酸酯核苷间连接的数目，并且可以增加磷酸二酯核苷间连接的数目。在某些实施例中，可以减少硫代磷酸酯核苷间连接的数目，并且可以增加磷酸二酯核苷间连接的数目，同时仍维持核酸酶抗性。在某些实施例中，令人希望的是减少硫代磷酸酯核苷间连接的数目，同时保留核酸酶抗性。在某些实施例中，令人希望的是增加磷酸二酯核苷间连接的数目，同时保留核酸酶抗性。
某些基序
在某些实施例中，本文描述的化合物包括寡核苷酸。寡核苷酸可以具有基序，例如未经修饰的和/或经修饰的糖部分、核碱基、和/或核苷间连接的模式。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸包括一个或多个经修饰的核苷，这些核苷包含经修饰的糖。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸包括一个或多个经修饰的核苷，这些核苷包含修饰的核碱基。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸包括一个或多个经修饰的核苷间连接。在这样的实施例中，经修饰的寡核苷酸的修饰的、未经修饰的、和不同经修饰的糖部分、核碱基、和/或核苷间连接限定了模式或基序。在某些实施例中，糖部分、核碱基、和核苷间连接的模式是各自彼此独立的。因此，经修饰的寡核苷酸可以由其糖基序、核碱基基序和/或核苷间连接基序来描述(如本文使用的，独立于核碱基的序列，核碱基基序描述了对这些核碱基的修饰)。
a.某些糖基序
在某些实施例中，本文描述的化合物包括寡核苷酸。在某些实施例中，寡核苷酸包括一种或多种类型的沿着该寡核苷酸或其区域布置成限定模式或糖基序的经修饰的糖和/或未经修饰的糖部分。在某些情况下，此类糖基序包括但不限于本文讨论的糖修饰中的任一种。
在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸包括具有缺口体基序的区域或由其组成，该缺口体基序包括两个外部区域或“翼”和中心或内部区域或“缺口”。缺口体基序的这三个区域(5’-翼、缺口、和3’-翼)形成连续序列的核苷，其中这些翼中每者的核苷的糖部分中的至少一些不同于该缺口的核苷的糖部分中的至少一些。具体地，至少每个翼的离缺口最近的核苷(5’-翼的最3’核苷和3’-翼的最5’核苷)的糖部分不同于相邻缺口核苷的糖部分，因此在翼与缺口之间限定了边界(即，翼/缺口接点)。在某些实施例中，缺口内的糖部分彼此相同。在某些实施例中，该缺口包括一个或多个具有以下糖部分的核苷，该糖部分不同于该缺口的一个或多个其他核苷的糖部分。在某些实施例中，这两个翼的糖基序彼此相同(对称缺口体)。在某些实施例中，5'-翼的糖基序不同于3'-翼的糖基序(不对称缺口体)。
在某些实施例中，缺口体的翼包括1-5个核苷。在某些实施例中，缺口体的翼包括2-5个核苷。在某些实施例中，缺口体的翼包括3-5个核苷。在某些实施例中，缺口体的核苷全部是经修饰的核苷。
在某些实施例中，缺口体的缺口包括7-12个核苷。在某些实施例中，缺口体的缺口包括7-10个核苷。在某些实施例中，缺口体的缺口包括8-10个核苷。在某些实施例中，缺口体的缺口包括10个核苷。在某个实施例中，缺口体的缺口的每个核苷都是未经修饰的2’-脱氧核苷。
在某些实施例中，该缺口体是脱氧缺口体。在这样的实施例中，每个翼/缺口接点的缺口侧上的核苷是未经修饰的2’-脱氧核苷，并且每个翼/缺口接点的翼侧上的核苷是经修饰的核苷。在某些这样的实施例中，该缺口的每个核苷都是未经修饰的2’-脱氧核苷。在某些这样的实施例中，每个翼的每个核苷都是经修饰的核苷。
在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸具有完全经修饰的糖基序，其中经修饰的寡核苷酸的每个核苷包含经修饰的糖部分。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸包括具有完全经修饰的糖基序的区域，或由该区域组成，其中该区域的每个核苷包含经修饰的糖部分。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸包括具有完全经修饰的糖基序的区域或由其组成，其中该完全修饰的区域内的每个核苷都包括相同的经修饰的糖部分，本文被称为一致经修饰的糖基序。在某些实施例中，完全经修饰的寡核苷酸是一致经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，一致经修饰的寡核苷酸的每个核苷都包括相同的2’-修饰。
在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸可以包括糖基序，该糖基序被描述于Swayze等人，US 2010/0197762；Freier等人，US2014/0107330；Freier等人，US 2015/0184153；和Seth等人，US2015/0267195，其中每项通过引用以其全部内容结合在此。
本文提供的某些实施例涉及可用于抑制靶核酸表达的经修饰的寡聚化合物，其可用于治疗、预防、缓解或减缓与这种靶核酸相关的疾病的进展。在某些实施例中，所述经修饰的寡聚化合物包含反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸是具有某些糖基序的缺口体。在某些实施例中，本文提供的缺口体糖基序可与任何核碱基序列和任何核苷间连接基序组合以形成有效的反义寡核苷酸。
在某些实施例中，一种方法包括接触细胞或给受试者施用包含经修饰的寡核苷酸的化合物，所述经修饰的寡核苷酸的长度为16个连接的核苷，具有以下基序：ekk-d9-kkee，其中‘d’表示2’-脱氧核糖，‘k’表示cEt核苷，并且‘e’表示2’-MOE核苷。在某些实施例中，该细胞是癌细胞。在某些实施例中，该受试者患有癌症。在某些实施例中，给受试者施用化合物治疗受试者的癌症。
在某些实施例中，一种方法包括接触细胞或给受试者施用包含经修饰的寡核苷酸的化合物，所述经修饰的寡核苷酸的长度为16个连接的核苷，具有以下基序：k-d9-kekeke，其中‘d’表示2’-脱氧核糖，‘k’表示cEt核苷，并且‘e’表示2’-MOE核苷。在某些实施例中，该细胞是癌细胞。在某些实施例中，该受试者患有癌症。在某些实施例中，给受试者施用化合物治疗受试者的癌症。
在某些实施例中，一种方法包括接触细胞或给受试者施用包含经修饰的寡核苷酸的化合物，所述经修饰的寡核苷酸的长度为16个连接的核苷，具有以下基序：kkk-d8-kekek，其中‘d’表示2’-脱氧核糖，‘k’表示cEt核苷，并且‘e’表示2’-MOE核苷。在某些实施例中，该细胞是癌细胞。在某些实施例中，该受试者患有癌症。在某些实施例中，给受试者施用化合物治疗受试者的癌症。
在某些实施例中，一种方法包括接触细胞或给受试者施用包含经修饰的寡核苷酸的化合物，所述经修饰的寡核苷酸的长度为16个连接的核苷，具有以下基序：kkk-d9-keke，其中‘d’表示2’-脱氧核糖，‘k’表示cEt核苷，并且‘e’表示2’-MOE核苷。在某些实施例中，该细胞是癌细胞。在某些实施例中，该受试者患有癌症。在某些实施例中，给受试者施用化合物治疗受试者的癌症。
在某些实施例中，一种方法包括接触细胞或给受试者施用包含经修饰的寡核苷酸的化合物，所述经修饰的寡核苷酸的长度为16个连接的核苷，具有以下基序：kk-d9-kdkdk，其中‘d’表示2’-脱氧核糖，‘k’表示cEt核苷，并且‘e’表示2’-MOE核苷。在某些实施例中，该细胞是癌细胞。在某些实施例中，该受试者患有癌症。在某些实施例中，给受试者施用化合物治疗受试者的癌症。
在某些实施例中，化合物包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸的长度为16个连接的核苷，具有以下基序：kk-d9-eeekk，其中‘d’表示2’-脱氧核糖，‘k’表示cEt核苷，并且‘e’表示2’-MOE核苷。在某些实施例中，一种方法包括接触细胞或给受试者施用包含经修饰的寡核苷酸的化合物，所述经修饰的寡核苷酸的长度为16个连接的核苷，具有以下基序：kk-d9-eeekk，其中‘d’表示2’-脱氧核糖，‘k’表示cEt核苷，并且‘e’表示2’-MOE核苷。在某些实施例中，该细胞是癌细胞。在某些实施例中，该受试者患有癌症。在某些实施例中，给受试者施用化合物治疗受试者的癌症。
在某些实施例中，一种方法包括接触细胞或给受试者施用包含经修饰的寡核苷酸的化合物，所述经修饰的寡核苷酸的长度为16个连接的核苷，具有以下基序：kk-d9-ekeke，其中‘d’表示2’-脱氧核糖，‘k’表示cEt核苷，并且‘e’表示2’-MOE核苷。在某些实施例中，该细胞是癌细胞。在某些实施例中，该受试者患有癌症。在某些实施例中，给受试者施用化合物治疗受试者的癌症。
b.某些核碱基基序
在某些实施例中，本文描述的化合物包括寡核苷酸。在某些实施例中，寡核苷酸包括沿着该寡核苷酸或其区域布置成限定模式或基序的修饰的和/或未经修饰的核碱基。在某些实施例中，每个核碱基都被修饰。在某些实施例中，这些核碱基都未被修饰。在某些实施例中，每个嘌呤或每个嘧啶被修饰。在某些实施例中，每个腺嘌呤被修饰。在某些实施例中，每个鸟嘌呤被修饰。在某些实施例中，每个胸腺嘧啶被修饰。在某些实施例中，每个尿嘧啶被修饰。在某些实施例中，每个胞嘧啶被修饰。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸中的一些或全部胞嘧啶核碱基是5-甲基胞嘧啶。
在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸包括修饰的核碱基的嵌段。在某些这样的实施例中，该嵌段在该寡核苷酸的3’-端处。在某些实施例中，该嵌段在该寡核苷酸的3’-端的3个核苷内。在某些实施例中，该嵌段在该寡核苷酸的5’-端处。在某些实施例中，该嵌段在该寡核苷酸的5’-端的3个核苷内。
在某些实施例中，具有缺口体基序的寡核苷酸包括包含修饰的核碱基的核苷。在某些这样的实施例中，包含修饰的核碱基的一个核苷在具有缺口体基序的寡核苷酸的中心缺口中。在某些这样的实施例中，该核苷的糖部分是2’-脱氧核糖基部分。在某些实施例中，所述修饰的核碱基选自：2-硫代嘧啶和5-丙炔嘧啶。
c.某些核苷间连接基序
在某些实施例中，本文描述的化合物包括寡核苷酸。在某些实施例中，寡核苷酸包括沿着该寡核苷酸或其区域布置成限定模式或基序的修饰的和/或未经修饰的核苷间连接。在某些实施例中，基本上每个核苷间连接基团都是磷酸酯核苷间连接(P＝O)。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸的每个核苷间连接基团都是硫代磷酸酯(P＝S)。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸的每个核苷间连接基团独立地选自硫代磷酸酯和磷酸酯核苷间连接。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸的糖基序是缺口体，并且该缺口内的核苷间连接全部是修饰的。在某些这样的实施例中，这些翼中的一些或所有核苷间连接是未经修饰的磷酸酯连接。在某些实施例中，末端核苷间连接是修饰的。
4.某些经修饰的寡核苷酸
在某些实施例中，本文描述的化合物包括经修饰的寡核苷酸。在某些实施例中，将以上这些修饰(糖、核碱基、核苷间连接)掺入经修饰的寡核苷酸中。在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸通过其修饰、基序、和总长度来表征。在某些实施例中，此类参数各自彼此独立。因此，除非另外指明，具有缺口体糖基序的寡核苷酸的每个核苷间连接都可以是修饰的或未经修饰的，并且可以或可以不遵循这些糖修饰的缺口体修饰模式。例如，糖缺口体的翼区域内的核苷间连接可以彼此相同或不同，并且可以与糖基序的缺口区域的核苷间连接相同或不同。同样地，独立于这些糖修饰的缺口体模式，此类缺口体寡核苷酸可以包括一个或多个修饰的核碱基。此外，在某些情况下，通过总长度或范围并且通过两个或更多个区域(例如，具有指定糖修饰的核苷的区域)的长度或长度范围来描述寡核苷酸，在这种情况下，可以选择针对具有超出指定范围的总长度的寡核苷酸的每个范围的数值。在此类情况下，两种因素必需满足。例如，在某些实施例中，经修饰的寡核苷酸由15-20个连接的核苷组成并具有由三个区域(A、B、和C)组成的糖基序，其中区域A由具有指定糖基序的2-6个连接的核苷组成，区域B由具有指定糖基序的6-10个连接的核苷组成，并且区域C由具有指定糖基序的2-6个连接的核苷组成。此类实施例不包括经修饰的寡核苷酸，其中A和C各自由6个连接的核苷组成，并且B由10个连接的核苷组成(即使核苷的那些数量在A、B、和C的要求内允许)，因为这样的寡核苷酸的总长度是22，该长度超过经修饰的寡核苷酸的总长度的上限(20)。本文，如果相对于一个或多个参数寡核苷酸的描述是未提及的，则这样的参数不受限。因此，仅被描述为具有缺口体糖基序而没有进一步描述的经修饰的寡核苷酸可以具有任何长度、核苷间连接基序、和核碱基基序。除非另外指明，所有修饰都独立于核碱基序列。
某些缀合的化合物
在某些实施例中，本文描述的这些化合物包括寡核苷酸(修饰的或未修饰的)以及任选地一个或多个缀合物基团和/或端基或由其组成。缀合物基团由一个或多个缀合物部分和缀合物接头组成，该缀合物接头将缀合物部分连接至寡核苷酸。缀合物基团可以附接至寡核苷酸的任一端或两端和/或附接在任何内部位置处。在某些实施例中，缀合物基团附接至经修饰的寡核苷酸的核苷的2’-位。某些实施例中，附接至寡核苷酸的任一端或两端的缀合物基团是端基。在某些这样的实施例中，缀合物基团或端基附接在寡核苷酸的3’和/或5’-端处。在某些这样的实施例中，缀合物基团(或端基)附接在寡核苷酸的3’-端处。在某些实施例中，缀合物基团附接在寡核苷酸的3’-端附近。在某些实施例中，缀合物基团(或端基)附接在寡核苷酸的5’-端处。在某些实施例中，缀合物基团附接在寡核苷酸的5’-端附近。
在某些实施例中，该寡核苷酸被修饰。在某些实施例中，化合物的寡核苷酸具有与靶核酸互补的核碱基序列。在某些实施例中，寡核苷酸与信使RNA(mRNA)互补。在某些实施例中，寡核苷酸与有义转录物互补。
端基的实例包括但不限于缀合物基团、加帽基团、磷酸酯部分、保护基团、修饰的或未经修饰的核苷、以及两个或更多个独立地修饰的或未经修饰的核苷。
A.某些缀合物基团
在某些实施例中，寡核苷酸共价地附接至一个或多个缀合物基团。在某些实施例中，缀合物基团修饰该附接的寡核苷酸的一种或多种特性，包括但不限于药效学、药代动力学、稳定性、结合、吸收、组织分布、细胞分布、细胞摄取、电荷以及清除率。在某些实施例中，缀合物基团赋予附接的寡核苷酸新的特性，例如能够检测寡核苷酸的荧光团或报告基团。
先前已经描述了某些缀合物基团和缀合物部分，例如：胆固醇部分(Letsinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],1989,86,6553-6556)、胆酸(Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学快报],1994,4,1053-1060)、硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.[纽约科学院年鉴],1992,660,306-309；Manoharan等人,Bioorg.Med.Chem.Lett.[生物有机化学与医药化学快报],1993,3,2765-2770)、巯基胆固醇(Oberhauser等人,Nucl.Acids Res.[核酸研究],1992,20,533-538)、脂肪链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等人,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志],1991,10,1111-1118；Kabanov等人,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报],1990,259,327-330；Svinarchuk等人,Biochimie[生物化学],1993,75,49-54)、磷脂例如二-十六烷基-外消旋-丙三醇或三乙基-铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-丙三基-3-H-磷酸酯(Manoharan等人,Tetrahedron Lett.[四面体快报],1995,36,3651-3654；Shea等人,Nucl.Acids Res.[核酸研究],1990,18,3777-3783)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等人,Nucleosides&Nucleotides[核苷&核苷酸],1995,14,969-973)、或金刚烷乙酸，棕榈基部分(Mishra等人,Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学学报],1995,1264,229-237)、十八胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分(Crooke等人,J.Pharmacol.Exp.Ther.[药理学和实验治疗学杂志],1996,i,923-937)、生育酚基团(Nishina等人,Molecular Therapy Nucleic Acids[分子治疗-核酸],2015,4,e220；doi:10.1038/mtna.2014.72和Nishina等人,Molecular Therapy[分子治疗],2008,16,734-740)、或GalNAc簇(例如，WO 2014/179620)。
1.缀合物部分
缀合物部分包括但不限于，嵌入剂、报告分子、聚胺、聚酰胺、肽、碳水化合物(例如，GalNAc)、维生素部分、聚乙二醇、硫醚、聚醚、胆固醇、巯基胆固醇、胆酸部分、叶酸、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、菲啶、蒽醌、金刚烷、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素、荧光团、以及染料。
在某些实施例中，缀合物部分包括活性药品，例如，阿司匹林、华法令、保泰松、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)-(+)-普拉洛芬、卡洛芬、丹肌氨酸、2,3,5-三碘苯甲酸、芬戈莫德、氟芬那酸、亚叶酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮杂卓、吲哚美辛、巴比妥、头孢菌素、磺胺类药物、抗糖尿病药、抗菌药或抗生素。
2.缀合物接头
缀合物部分通过缀合物接头附接至寡核苷酸。在某些化合物中，缀合物基团是单一化学键(即，通过单键，缀合物部分经缀合物接头附接至寡核苷酸)。在某些实施例中，该缀合物接头包括链结构(如烃基链)，或重复单位(如乙二醇、核苷、或氨基酸单位)的寡聚体。
在某些实施例中，缀合物接头包括一个或多个选自以下项的基团：烷基、氨基、氧代、酰胺、二硫化物、聚乙二醇、醚、硫醚、以及羟基氨基。在某些这样的实施例中，该缀合物接头包括选自以下项的基团：烷基、氨基、氧代、酰胺以及醚基。在某些实施例中，该缀合物接头包括选自烷基和酰胺基团的基团。在某些实施例中，该缀合物接头包括选自烷基和醚基的基团。在某些实施例中，该缀合物接头包括至少一个磷部分。在某些实施例中，该缀合物接头包括至少一个磷酸酯基团。在某些实施例中，该缀合物接头包括至少一个中性连接基团。
在某些实施例中，缀合物接头(包括上文描述的缀合物接头)是双功能连接部分，例如本领域中已知的可用于将缀合物基团附接至母体化合物(如本文提供的寡核苷酸)的那些。通常，双功能连接部分包括至少两个官能团。官能团之一被选择为结合至化合物上的特定位点，并且另一官能团被选择为结合至缀合物基团。用于双功能连接部分中的官能团的实例包括但不限于用于与亲核基团反应的亲电子试剂和用于与亲电子基团反应的亲核试剂。在某些实施例中，双功能连接部分包括一个或多个选自以下项的基团：氨基、羟基、羧酸、硫醇、烷基、烯基、以及炔基。
缀合物接头的实例包括但不限于吡咯烷、8-氨基-3,6-二氧杂辛酸(ADO)、琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)和6-氨基己酸(AHEX或AHA)。其他缀合物接头包括但不限于取代的或未取代的C1-C10烷基、取代的或未取代的C2-C10烯基或取代的或未取代的C2-C10炔基，其中优选取代基基团的非限制性列表包括羟基、氨基、烷氧基、羧基、苄基、苯基、硝基、硫醇基、硫代烷氧基、卤素、烷基、芳基、烯基以及炔基。
在某些实施例中，缀合物接头包括1-10个接头-核苷。在某些实施例中，此类接头-核苷是经修饰的核苷。在某些实施例中，此类接头-核苷包括经修饰的糖部分。在某些实施例中，接头-核苷是未修饰的。在某些实施例中，接头-核苷包括选自以下项的任选地受保护的杂环碱基：嘌呤、取代的嘌呤、嘧啶或取代的嘧啶。在某些实施例中，可切割的部分是选自以下项的核苷：尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、4-N-苯甲酰基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、4-N-苯甲酰基-5-甲基胞嘧啶、腺嘌呤、6-N-苯甲酰基腺嘌呤、鸟嘌呤以及2-N-异丁酰基鸟嘌呤。通常理想的是接头-核苷在其到达靶组织后从该化合物上被切割下来。因此，接头-核苷通常通过可切割键彼此连接并与化合物的剩余部分连接。在某些实施例中，此类可切割的键是磷酸二酯键。
本文，不认为接头-核苷是该寡核苷酸的一部分。因此，在以下实施例中，其中化合物包括由指定数目或范围的连接的核苷组成的和/或对于参考核酸的指定百分比互补性的寡核苷酸，并且该化合物还包括包含缀合物接头的缀合物基团，该缀合物接头含有接头-核苷，那些接头-核苷不计入寡核苷酸的长度并且不用于确定寡核苷酸对于参考核酸的百分比互补性。例如，化合物可以包括(1)由8-30个核苷组成的经修饰的寡核苷酸，和(2)包含1-10个接头-核苷的缀合物基团，这些接头-核苷与经修饰的寡核苷酸的核苷邻接。在这样的化合物中的连续连接的核苷的总数超过30个。可替代地，化合物可以包括经修饰的寡核苷酸，该寡核苷酸由8-30个核苷组成并且没有缀合物基团。在这样的化合物中的连续连接的核苷的总数不超过30个。除非另有说明，缀合物接头包括不超过10个接头-核苷。在某些实施例中，缀合物接头包括不超过5个接头-核苷。在某些实施例中，缀合物接头包括不超过3个接头-核苷。在某些实施例中，缀合物接头包括不超过2个接头-核苷。在某些实施例中，缀合物接头包括不超过1个接头-核苷。
在某些实施例中，理想的是缀合物基团从寡核苷酸上切割下来。例如，在某些情况下，包含特定缀合物部分的化合物被特定细胞类型更好地吸收，但是一旦化合物被吸收，则理想的是缀合物基团被切割以释放未缀合的或母体寡核苷酸。因此，某些缀合物可以包含一个或多个可切割部分，典型地在缀合物接头内。在某些实施例中，可切割的部分是可切割的键。在某些实施例中，可切割的部分是包含至少一个可切割的键的一组原子。在某些实施例中，可切割的部分包括具有一个、两个、三个、四个、或超过四个可切割的键的一组原子。在某些实施例中，可切割的部分被选择性地在细胞或亚细胞区室(如溶酶体)内切割。在某些实施例中，可切割的部分被内源酶(如核酸酶)选择性地切割。
在某些实施例中，可切割的键选自：酰胺，酯，醚二酯、磷酸酯中的一者或两者酯，氨基甲酸酯或二硫化物。在某些实施例中，可切割的键是磷酸二酯的一个酯或两个酯。在某些实施例中，可切割的部分包括磷酸酯或磷酸二酯。在某些实施例中，该可切割的部分是寡核苷酸与缀合物部分或缀合物基团之间的磷酸酯连接。
在某些实施例中，可切割的部分包括一个或多个接头-核苷或由其组成。在某些这样的实施例中，一个或多个接头-核苷通过可切割的键彼此连接和/或与化合物的剩余部分连接。在某些实施例中，此类可切割的键是未经修饰的磷酸二酯键。在某些实施例中，可切割的部分是2'-脱氧核苷，该脱氧核苷通过磷酸酯核苷间连接附接至寡核苷酸的3'或5'-末端核苷并且通过磷酸酯或硫代磷酸酯连接共价地附接至缀合物接头或缀合物基团的剩余部分。在某些这样的实施例中，该可切割的部分是2'-脱氧腺苷。
组合物和用于配制药物组合物的方法
可以将本文描述的化合物与药学上可接受的活性或惰性物质混合以制备药物组合物或配制品。组合物和用于配制药物组合物的方法取决于多个标准，包括但不限于施用途径、疾病程度、或待施用的剂量。
某些实施例提供了包含一种或多种化合物或其盐的药物组合物。在某些实施例中，这些化合物是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，这些化合物包括经修饰的寡核苷酸或由其组成。在某些这样的实施例中，该药物组合物包括合适的药学上可接受的稀释剂或载体。在某些实施例中，药物组合物包括无菌盐溶液和一种或多种化合物。在某些实施例中，这样的药物组合物由无菌盐溶液和一种或多种化合物组成。在某些实施例中，该无菌盐水是药用级盐水。在某些实施例中，药物组合物包括一种或多种化合物和无菌水。在某些实施例中，药物组合物由一种化合物和无菌水组成。在某些实施例中，该无菌水是药用级水。在某些实施例中，药物组合物包括一种或多种化合物和磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在某些实施例中，药物组合物由一种或多种化合物和无菌PBS组成。在某些实施例中，该无菌PBS是药用级PBS。组合物和用于配制药物组合物的方法取决于多个标准，包括但不限于施用途径、疾病程度、或待施用的剂量。
可以在药物组合物中利用靶向FOXP3核酸的本文描述的化合物，这些药物组合物通过将该化合物与合适的药学上可接受的稀释剂或载体组合而获得。在某些实施例中，药学上可接受的稀释剂是水，如适于注射的无菌水。因此，在一个实施例中，本文描述的方法中采用的是包含靶向FOXP3核酸的化合物和药学上可接受的稀释剂的药物组合物。在某些实施例中，该药学上可接受的稀释剂是水。在某些实施例中，该化合物包括本文提供的经修饰的寡核苷酸或由其组成。
包含本文提供的化合物的药物组合物涵盖任何药学上可接受的盐、酯、或此类酯的盐、或任何其他寡核苷酸，它们在被施用动物(包括人)后能够提供(直接地或间接地)生物上具有活性的代谢物或其残余物。在某些实施例中，这些化合物是反义化合物或寡聚化合物。在某些实施例中，该化合物包括经修饰的寡核苷酸或由其组成。因此，例如，本披露还起草涉及化合物的药学上可接受的盐、前药、这些前药的药学上可接受的盐、以及其他生物等效物。合适的药学上可接受的盐包括但不限于钠盐和钾盐。
前药可以包括在化合物的一端或两端掺入另外的核苷，所述核苷在体内被内源核酸酶切割，以形成活性化合物。
在某些实施例中，这些化合物或组合物进一步包括药学上可接受的载体或稀释剂。
实例
以下实例描述了用于鉴定靶向FOXP3的先导化合物的筛选过程。在筛选的超过3,000种寡核苷酸中，ION 1062428、1062641、1062835、1062937、1063268、1063649、1063655、1063734、1064096或1064313作为靠前的先导化合物出现。
非限制性披露和通过引用并入
虽然本文件所附序列表将每个序列根据需要鉴定为“RNA”或“DNA”，但实际上那些序列可以用化学修饰的任何组合进行修饰。本领域的技术人员应容易地意识到，如“RNA”或“DNA”这样的名称描述经修饰的寡核苷酸在某些情况下是任意的。例如，包含含有2’-OH糖部分和胸腺嘧啶碱基的核苷的寡核苷酸可以被描述为具有经修饰的糖(针对DNA的天然2’-H为2’-OH)的DNA或具有修饰的碱基(针对RNA的天然尿嘧啶为胸腺嘧啶(甲基化的尿嘧啶))的RNA。
因此，本文提供的核酸序列(包括但不限于在序列表中的那些)旨在涵盖含有任何组合的天然或修饰的RNA和/或DNA的核酸，包括但不限于具有修饰的核碱基的此类核酸。作为另外的实例而非限制，具有核碱基序列“ATCGATCG”的寡核苷酸涵盖具有这样的核碱基序列的任何寡核苷酸，无论是修饰的还是未经修饰的，包括但不限于包含RNA碱基的此类化合物，如具有序列“AUCGAUCG”的那些以及具有一些DNA碱基和一些RNA碱基如“AUCGATCG”的那些，以及具有其他修饰的核碱基例如“ATmCGAUCG”的化合物(其中mC表示含有在5-位置处的甲基基团的胞嘧啶碱)。
尽管本文描述的某些化合物、组合物和方法已经根据某些实施例具体地进行了描述，但以下实例仅用以说明本文描述的化合物并不旨在限制它们。在本申请中引用的各个参考文献通过引用以其全文并入本文。
实例1：cEt缺口体对LNCaP细胞中的人Foxp3的反义抑制
设计经修饰的寡核苷酸以靶向Foxp3核酸，并在体外测试其对Foxp3 mRNA水平的影响。在一系列具有类似培养条件的实验中对这些经修饰的寡核苷酸进行测试。将每个实验的结果呈现在如下所示的单独的表中。使用电穿孔用3,000nM经修饰的寡核苷酸以每孔30,000个细胞的密度转染培养的LNCaP细胞。在大约24小时的处理期之后，从细胞中分离RNA，并且通过定量实时RTPCR测量Foxp3 mRNA水平。人引物探针组RTS35925(正向序列CTACTTCAAGTTCCACAACATGC，在本文指定为SEQ ID NO:6；反向序列CCAGTGGTAGATCTCATTGAGTG；在本文指定为SEQ ID NO:7；探针序列CCTTTCACCTACGCCACGCTCAT，在本文指定为SEQ ID NO:8)用于测量mRNA水平。如通过
Figure BDA0003058421320000981
所测量的，根据总RNA含量调整Foxp3 mRNA水平。结果在下表中以相对于未处理对照细胞的Foxp3 mRNA量的百分比对照表示(％UTC)。带有用星号(*)标记的百分比对照值的经修饰的寡核苷酸靶向引物探针组的扩增子区域。另外的测定可用于测量靶向扩增子区域的经修饰的寡核苷酸的效力和功效。
将下表中的新设计的经修饰的反义寡核苷酸设计为3-10-3cEt缺口体。这些缺口体长16个核苷，其中中心缺口区段由十个2’-脱氧核苷构成并且在5’方向和3’方向上侧接翼区段，每个翼区段包括三个核苷。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷都具有cEt糖修饰。遍及每个缺口体的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。遍及每个缺口体的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。
“起始位点”指示缺口体所靶向的人基因序列中的最5’核苷。“终止位点”指示缺口体所靶向的人基因序列中的最3’核苷。下表中所列的每个缺口体靶向SEQ ID NO.:1(GENBANK登录号NM_014009.3)，或SEQ ID NO.:2(从核苷酸11907130至11921808截短的GENBANK登录号NT_011568.12的互补序列)，或SEQ ID No.:3(GENBANK登录号NM_001114377.1)，或SEQ ID No.:4(从核苷酸49247001至49273000截短的GENBANK登录号NC_000023.11的互补序列)，或SEQ ID No.5(UCSC登录号UC064ZFP.1，对应于装配体GRCh38/hg38上的基因座标chrX:49,251,334-49,259,240)。‘N/A’指示经修饰的寡核苷酸并未以100％互补性靶向该特定基因序列。‘N.D.’指示在该特定实验中未定义该特定的经修饰的寡核苷酸的％UTC。经修饰的寡核苷酸的活性可以在不同的实验中定义。
表1
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320000991
Figure BDA0003058421320001001
Figure BDA0003058421320001011
表2
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001012
Figure BDA0003058421320001021
Figure BDA0003058421320001031
表3
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001032
Figure BDA0003058421320001041
Figure BDA0003058421320001051
表4
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001052
Figure BDA0003058421320001061
Figure BDA0003058421320001071
表5
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001072
Figure BDA0003058421320001081
Figure BDA0003058421320001091
表6
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001092
Figure BDA0003058421320001101
Figure BDA0003058421320001111
表7
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001112
Figure BDA0003058421320001121
Figure BDA0003058421320001131
表8
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001132
Figure BDA0003058421320001141
Figure BDA0003058421320001151
实例2：cEt缺口体对SUP-M2细胞中的人类Foxp3的反义抑制
设计修饰的寡核苷酸以靶向Foxp3核酸，并在体外测试其对Foxp3 mRNA水平的影响。在一系列具有类似培养条件的实验中对这些修饰的寡核苷酸进行测试。将每个实验的结果呈现在如下所示的单独的表中。使用自由摄取用3,000nM修饰的寡核苷酸以每孔60,000个细胞的密度处理培养的SUP-M2细胞。在大约24小时的处理期之后，从细胞中分离RNA，并且通过定量实时RTPCR测量Foxp3 mRNA水平。将人类引物探针组RTS35925用于测量mRNA水平。如通过
Figure BDA0003058421320001152
所测量的，根据总RNA含量调整Foxp3 mRNA水平。结果在下表中以相对于未处理对照细胞的Foxp3 mRNA量的百分比对照表示(％UTC)。带有用星号(*)标记的百分比对照值的经修饰的寡核苷酸靶向引物探针组的扩增子区域。另外的测定可用于测量靶向扩增子区域的经修饰的寡核苷酸的效力和功效。
将下表中的新设计的经修饰的反义寡核苷酸设计为3-10-3cEt缺口体。这些缺口体长16个核苷，其中中心缺口区段由十个2’-脱氧核苷构成并且在5’方向和3’方向上侧接翼区段，每个翼区段包括三个核苷。5’翼区段中的每个核苷和3’翼区段中的每个核苷都具有cEt糖修饰。遍及每个缺口体的核苷间连接都是硫代磷酸酯(P＝S)连接。遍及每个缺口体的所有胞嘧啶残基都是5-甲基胞嘧啶。“起始位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最5’核苷。“终止位点”指示缺口体所靶向的人类基因序列中的最3’核苷。下表中所列的每个缺口体都靶向SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。‘N/A’指示经修饰的寡核苷酸并未以100％互补性靶向该特定基因序列。‘N.D.’指示在该特定实验中未定义该特定的经修饰的寡核苷酸的％UTC。经修饰的寡核苷酸的活性可以在不同的实验中定义。
表9
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001161
Figure BDA0003058421320001171
Figure BDA0003058421320001181
表10
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001182
Figure BDA0003058421320001191
Figure BDA0003058421320001201
表11靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001202
Figure BDA0003058421320001211
Figure BDA0003058421320001221
表12
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001222
Figure BDA0003058421320001231
Figure BDA0003058421320001241
表13
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001242
Figure BDA0003058421320001251
Figure BDA0003058421320001261
表14
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001262
Figure BDA0003058421320001271
Figure BDA0003058421320001281
表15
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001282
Figure BDA0003058421320001291
表16
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001301
Figure BDA0003058421320001311
表17
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001321
Figure BDA0003058421320001331
表18
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001341
Figure BDA0003058421320001351
Figure BDA0003058421320001361
表19
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001362
Figure BDA0003058421320001371
Figure BDA0003058421320001381
表20
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001382
Figure BDA0003058421320001391
Figure BDA0003058421320001401
表21
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001402
Figure BDA0003058421320001411
Figure BDA0003058421320001421
表22
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001422
Figure BDA0003058421320001431
Figure BDA0003058421320001441
表23
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001442
Figure BDA0003058421320001451
Figure BDA0003058421320001461
表24
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001462
Figure BDA0003058421320001471
Figure BDA0003058421320001481
表25
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001482
Figure BDA0003058421320001491
Figure BDA0003058421320001501
表26
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001502
Figure BDA0003058421320001511
Figure BDA0003058421320001521
表27
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001522
Figure BDA0003058421320001531
Figure BDA0003058421320001541
表28
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001542
Figure BDA0003058421320001551
Figure BDA0003058421320001561
表29
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001562
Figure BDA0003058421320001571
Figure BDA0003058421320001581
表30
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001582
Figure BDA0003058421320001591
Figure BDA0003058421320001601
表31
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001602
Figure BDA0003058421320001611
Figure BDA0003058421320001621
表32
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001622
Figure BDA0003058421320001631
Figure BDA0003058421320001641
表33
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001642
Figure BDA0003058421320001651
Figure BDA0003058421320001661
表34
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001662
Figure BDA0003058421320001671
Figure BDA0003058421320001681
表35
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001682
Figure BDA0003058421320001691
Figure BDA0003058421320001701
表36
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001702
Figure BDA0003058421320001711
Figure BDA0003058421320001721
表37
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001722
Figure BDA0003058421320001731
Figure BDA0003058421320001741
表38
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001742
Figure BDA0003058421320001751
Figure BDA0003058421320001761
表39
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001762
Figure BDA0003058421320001771
表40
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001781
Figure BDA0003058421320001791
表41
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001801
Figure BDA0003058421320001811
表42
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001821
Figure BDA0003058421320001831
表43
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001841
Figure BDA0003058421320001851
表44
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001861
Figure BDA0003058421320001871
表45
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001881
Figure BDA0003058421320001891
表46
靶向SEQ ID NO.:1和2的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001901
Figure BDA0003058421320001911
Figure BDA0003058421320001921
表47
靶向SEQ ID NO:3、4和5的3-10-3cEt缺口体对Foxp3 mRNA的抑制
Figure BDA0003058421320001922
实例3：cEt缺口体对LNCaP细胞中的人Foxp3的剂量依赖性抑制
在LNCaP细胞中以不同剂量对描述于以上研究中的经修饰的寡核苷酸进行测试。将以每孔30,000个细胞的密度培养的LNCaP细胞使用电穿孔用稀释至浓度8,000nM、4,000nM、500nM和125nM的经修饰的寡核苷酸转染24小时。24小时后，如前所述使用人Foxp3引物-探针组RTS35925测量Foxp3 mRNA水平。如通过
Figure BDA0003058421320001923
所测量的，根据总RNA含量调整Foxp3mRNA水平。结果在下表中以相对于未处理对照细胞的Foxp3 mRNA量的百分比对照表示(％UTC)。使用Excel中数据的对数/线性图上的线性回归来计算IC50。
表48
LNCaP细胞中经修饰的寡核苷酸对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320001931
表49
LNCaP细胞中经修饰的寡核苷酸对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320001932
Figure BDA0003058421320001941
实例4：cEt缺口体对SUP-M2细胞中的人Foxp3的剂量依赖性抑制
在SUP-M2细胞中以不同剂量对描述于以上研究中的经修饰的寡核苷酸进行测试。ION No.141923(5-10-5MOE缺口体，CCTTCCCTGAAGGTTCCTCC，本文指定为SEQ ID NO:3247)，一种不靶向Foxp3的对照修饰寡核苷酸作为阴性对照被包括在每个实验中。
以每孔60,000个细胞的密度如下处理培养的SUP-M2细胞：使用稀释至浓度7,000nM、1,750nM、437.5nM和109.375nM的经修饰的寡核苷酸的自由摄取持续24小时。24小时后，如前所述使用人Foxp3引物-探针组RTS35925测量Foxp3 mRNA水平。如通过
Figure BDA0003058421320001942
所测量的，根据总RNA含量调整Foxp3mRNA水平。结果在下表中以相对于未处理对照细胞的Foxp3 mRNA量的百分比对照表示(％UTC)。使用Excel中数据的对数/线性图上的线性回归来计算IC50。带有用星号(*)标记的百分比对照值的经修饰的寡核苷酸靶向引物探针组的扩增子区域。另外的测定可用于测量靶向扩增子区域的经修饰的寡核苷酸的效力和功效。
表50
SUP-M2细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320001951
表51
SUP-M2细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320001952
Figure BDA0003058421320001961
表52
SUP-M2细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320001962
Figure BDA0003058421320001971
表53
SUP-M2细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320001972
表54
SUP-M2细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320001973
Figure BDA0003058421320001981
表55
SUP-M2细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320001982
Figure BDA0003058421320001991
表56
SUP-M2细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320001992
表57
SUP-M2细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002001
表58
SUP-M2细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002002
Figure BDA0003058421320002011
表59
SUP-M2细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002012
Figure BDA0003058421320002021
表60
SUP-M2细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002022
表61
SUP-M2细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002023
Figure BDA0003058421320002031
表62
SUP-M2细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002032
Figure BDA0003058421320002041
表63
SUP-M2细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002042
表64
SUP-M2细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002051
表65
SUP-M2细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002052
Figure BDA0003058421320002061
实例5：cEt缺口体对SUP-M2细胞中的人Foxp3的剂量依赖性抑制
在SUP-M2细胞中以不同剂量对描述于以上研究中的经修饰的寡核苷酸进行测试。以每孔60,000个细胞的密度如下处理培养的SUP-M2细胞：使用稀释至浓度6,000nM、1,500nM、375.0nM和93.75nM的经修饰的寡核苷酸的自由摄取持续24小时。24小时后，如前所述使用人Foxp3引物-探针组RTS35925测量Foxp3 mRNA水平。如通过
Figure BDA0003058421320002062
所测量的，根据总RNA含量调整Foxp3 mRNA水平。结果在下表中以相对于未处理对照细胞的Foxp3 mRNA量的百分比对照表示(％UTC)。使用Excel中数据的对数/线性图上的线性回归来计算IC50。带有用星号(*)标记的百分比对照值的经修饰的寡核苷酸靶向引物探针组的扩增子区域。另外的测定可用于测量靶向扩增子区域的经修饰的寡核苷酸的效力和功效。
表66
SUP-M2细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002071
表67
SUP-M2细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002072
Figure BDA0003058421320002081
表68
SUP-M2细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002082
Figure BDA0003058421320002091
实例6：cEt缺口体对CD4 T细胞中的人Foxp3的剂量依赖性抑制
在原代PBMC衍生的CD4 T细胞中以不同剂量对描述于以上研究中的经修饰的寡核苷酸进行测试。使用Easysep人CD4 T细胞分离试剂盒(干细胞技术公司(StemcellTechnologies))从人外周血白细胞单采样品(Leukopak，干细胞技术公司)中纯化总的人CD4 T细胞。纯化的人CD4细胞在补充有30ng/mL的人重组IL-2(干细胞技术公司)的Immunocult-XT T细胞扩增培养基(干细胞技术公司)中进行培养。以每孔50,000个细胞的密度如下处理培养的CD4 T-细胞：使用稀释至以下表中所指定的浓度的经修饰的寡核苷酸的自由摄取。48小时孵育后，如前所述使用人Foxp3引物-探针组RTS35925测量Foxp3mRNA水平。如通过
Figure BDA0003058421320002093
所测量的，根据总RNA含量调整Foxp3 mRNA水平。结果在下表中以相对于未处理对照细胞的Foxp3 mRNA量的百分比对照表示(％UTC)。
表69
CD4 T细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002092
Figure BDA0003058421320002101
表70
CD4 T细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002102
表71
CD4 T细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002111
实例7：cEt缺口体对调节性T细胞(T-reg)中的人Foxp3的剂量依赖性抑制
在体外分化的调节性T细胞中以各种剂量测试了上述研究中描述的经修饰的寡核苷酸。在补充有ImmunoCult人Treg分化补充剂和ImmunoCult人CD3/CD28 T细胞活化剂(干细胞技术公司)的Immunocult-XT T细胞扩增培养基(干细胞技术公司)中，从原初人CD4细胞(使用EasySep人原初CD4 T细胞分离试剂盒从冷冻的PBMC(干细胞技术公司)纯化)分化T-reg 2周。以每孔20,000个细胞的密度如下处理培养的T-reg细胞：使用稀释至以下表中所指定的浓度的经修饰的寡核苷酸的自由摄取。48小时孵育后，如前所述使用人Foxp3引物-探针组RTS35925测量Foxp3 mRNA水平。如通过
Figure BDA0003058421320002122
所测量的，根据总RNA含量调整Foxp3 mRNA水平。结果在下表中以相对于未处理对照细胞的Foxp3 mRNA量的百分比对照表示(％UTC)。
表72
T-reg细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002121
表73
T-reg细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002131
表74
T-reg细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002132
Figure BDA0003058421320002141
表75
T-reg细胞中经修饰的寡核苷酸的自由摄取对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002142
实例8：在Balb/c小鼠中靶向人Foxp3的经修饰的寡核苷酸的耐受性
用从以上描述的研究中选择的经修饰的寡核苷酸治疗Balb/c小鼠，并且评估不同血浆化学标志物的水平的变化。
治疗
每周两次对雌性Balb/c小鼠(从查尔斯河(Charles River)获得)组以50mg/kg的经修饰的寡核苷酸进行皮下注射，持续三周(共7次治疗)。一组雌性Balb/c小鼠注射PBS。在治疗开始后第21天(最后施用后24小时)对小鼠进行安乐死。
血浆化学标志物
为评估经修饰的寡核苷酸对肝功能的影响，用全自动临床化学分析仪(日立奥林巴斯AU400c，梅尔维尔(Melville)，纽约)测定血液尿素氮(BUN)、白蛋白、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)和白蛋白(ALB)的血浆水平。结果呈现在下表中。将导致超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的任何肝或肾功能标志物的水平变化的经修饰的寡核苷酸在进一步的研究中排除。
表76
雌性Balb/c小鼠中的血浆化学标志物
Figure BDA0003058421320002151
身体重量和器官重量
在第22天测量Balb/c小鼠的体重，每个组的平均体重显示在下表中。在研究结束时测量肾、脾和肝的重量，并且显示在下表中。将导致超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的器官重量的任何变化的经修饰的寡核苷酸从进一步的研究中排除。
表77
身体重量和器官重量(以克计)
Figure BDA0003058421320002161
实例9：在CD-1小鼠中靶向人Foxp3的经修饰的寡核苷酸的耐受性
用从以上描述的研究中选择的经修饰的寡核苷酸治疗CD-1小鼠，并且评估不同血浆化学标志物的水平的变化。
治疗
每周一次对雄性CD-1小鼠(从查尔斯河(Charles River)获得)组以50mg/kg的经修饰的寡核苷酸进行皮下注射，持续六周(共7次治疗)。一组雄性CD-1小鼠注射PBS。在治疗开始后第39天(最后施用后24小时)对小鼠进行安乐死。
血浆化学标志物
为评估经修饰的寡核苷酸对肝功能的影响，用全自动临床化学分析仪(日立奥林巴斯AU400c，梅尔维尔(Melville)，纽约)测定血液尿素氮(BUN)、白蛋白、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)和白蛋白(ALB)的血浆水平。结果呈现在下表中。将导致超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的任何肝或肾功能标志物的水平变化的经修饰的寡核苷酸在进一步的研究中排除。
表78
雄性CD-1小鼠中血浆化学标志物
Figure BDA0003058421320002171
身体重量和器官重量
在小鼠被处死的当天测量CD-1小鼠的体重，每个组的平均体重显示在下表中。在研究结束时测量肾、脾和肝的重量，并且显示在下表中。将导致超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的器官重量的任何变化的经修饰的寡核苷酸从进一步的研究中排除。
表79
身体重量和器官重量(以克计)
Figure BDA0003058421320002181
血液学测定
在第40天将从小鼠组中获得的血液送至爱德士生物研究公司(IDEXXBioResearch)进行血细胞计数的测量。采集的计数包括红细胞(RBC)计数、白细胞(WBC)计数、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)和单个白细胞计数，例如单核细胞(MON)、中性粒细胞(NEU)、淋巴细胞(LYM)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱性粒细胞(BAS)、网织红细胞(RETIC)和血小板(PLT)的计数。结果呈现在下表中。N.D是指没有数据可用的样品。将导致超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的血细胞计数的变化的Ionis寡核苷酸在进一步研究中排除。
表80
CD-1小鼠中的血细胞计数
Figure BDA0003058421320002191
表81
CD-1小鼠中的血细胞计数
Figure BDA0003058421320002192
Figure BDA0003058421320002201
实例10：在CD-1小鼠中靶向人Foxp3的经修饰的寡核苷酸的耐受性
用从以上描述的研究中选择的经修饰的寡核苷酸治疗CD-1小鼠，并且评估不同血浆化学标志物的水平的变化。
治疗
每周一次对雄性CD-1小鼠(从查尔斯河(Charles River)获得)组以50mg/kg的经修饰的寡核苷酸进行皮下注射，持续六周(共7次治疗)。一组雄性CD-1小鼠注射PBS。在治疗开始后第40天(最后施用后24小时)对小鼠进行安乐死。此外，每周一次对另外6组小鼠(分别用ION No 1062413、1062669、1062712、1062835、1063655和1063946处理)以50mg/kg的经修饰的寡核苷酸进行皮下处理，持续5周(共6次治疗)。在治疗开始后第33天(最后施用后24小时)对小鼠进行安乐死。
血浆化学标志物
为评估经修饰的寡核苷酸对肝功能的影响，用全自动临床化学分析仪(日立奥林巴斯AU400c，梅尔维尔(Melville)，纽约)测定血液尿素氮(BUN)、白蛋白、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)和白蛋白(ALB)的血浆水平。结果呈现在下表中。将导致超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的任何肝或肾功能标志物的水平变化的经修饰的寡核苷酸在进一步的研究中排除。
表82
雄性CD-1小鼠中血浆化学标志物
Figure BDA0003058421320002211
身体重量和器官重量
在小鼠被处死的当天测量CD-1小鼠的体重，每个组的平均体重显示在下表中。在研究结束时测量肾、脾和肝的重量，并且显示在下表中。将导致超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的器官重量的任何变化的经修饰的寡核苷酸从进一步的研究中排除。
表83
身体重量和器官重量(以克计)
Figure BDA0003058421320002221
血液学测定
在第40天将从小鼠组中获得的血液送至爱德士生物研究公司(IDEXXBioResearch)进行血细胞计数的测量。采集的计数包括红细胞(RBC)计数、白细胞(WBC)计数、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)和单个白细胞计数，例如单核细胞(MON)、中性粒细胞(NEU)、淋巴细胞(LYM)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱性粒细胞(BAS)、网织红细胞(RETIC)和血小板(PLT)的计数。结果呈现在下表中。将导致超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的血细胞计数的变化的Ionis寡核苷酸在进一步研究中排除。
表84
CD-1小鼠中的血细胞计数
Figure BDA0003058421320002231
表85
CD-1小鼠中的血细胞计数
Figure BDA0003058421320002232
Figure BDA0003058421320002241
实例11：在CD-1小鼠中靶向人Foxp3的经修饰的寡核苷酸的耐受性
用从以上描述的研究中选择的经修饰的寡核苷酸治疗CD-1小鼠，并且评估不同血浆化学标志物的水平的变化。
治疗
每周一次对雄性CD-1小鼠(从查尔斯河(Charles River)获得)组以50mg/kg的经修饰的寡核苷酸进行皮下注射，持续六周(共7次治疗)。一组雄性CD-1小鼠注射PBS。在治疗开始后第41天(最后施用后24小时)对小鼠进行安乐死。此外，每周一次对另外4组小鼠(分别用ION No 1062247、1063619、1063653和1064096处理)以50mg/kg的经修饰的寡核苷酸进行皮下处理，持续5周(共6次治疗)。在治疗开始后第38天(最后施用后5天)对小鼠进行安乐死。
血浆化学标志物
为评估经修饰的寡核苷酸对肝功能的影响，用全自动临床化学分析仪(日立奥林巴斯AU400c，梅尔维尔(Melville)，纽约)测定血液尿素氮(BUN)、白蛋白、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)和白蛋白(ALB)的血浆水平。结果呈现在下表中。将导致超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的任何肝或肾功能标志物的水平变化的经修饰的寡核苷酸在进一步的研究中排除。
表86
雄性CD-1小鼠中血浆化学标志物
Figure BDA0003058421320002251
身体重量和器官重量
在小鼠被处死的当天测量CD-1小鼠的体重，每个组的平均体重显示在下表中。在研究结束时测量肾、脾和肝的重量，并且显示在下表中。将导致超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的器官重量的任何变化的经修饰的寡核苷酸从进一步的研究中排除。
表87
身体重量和器官重量(以克计)
Figure BDA0003058421320002261
血液学测定
在第40天将从小鼠组中获得的血液送至爱德士生物研究公司(IDEXXBioResearch)进行血细胞计数的测量。采集的计数包括红细胞(RBC)计数、白细胞(WBC)计数、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)和单个白细胞计数，例如单核细胞(MON)、中性粒细胞(NEU)、淋巴细胞(LYM)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱性粒细胞(BAS)、网织红细胞(RETIC)和血小板(PLT)的计数。结果呈现在下表中。以下N/A是指由于血液量不足而无法获得数据的样品。将导致超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的血细胞计数的变化的Ionis寡核苷酸在进一步研究中排除。
表88
CD-1小鼠中的血细胞计数
Figure BDA0003058421320002271
Figure BDA0003058421320002281
表89
CD-1小鼠中的血细胞计数
Figure BDA0003058421320002282
Figure BDA0003058421320002291
实例12：在斯普拉-道来大鼠中靶向人Foxp3的经修饰的寡核苷酸的耐受性
斯普拉-道来大鼠是用于安全性和功效评估的、多重目的的模型。用来自以上实例中描述的研究中的Ionis经修饰的寡核苷酸治疗大鼠，并且评估不同血浆化学标志物的水平的变化。
治疗
将雄性斯普拉-道来大鼠保持在12小时光暗循环中，并以任意量喂养正常的Purina大鼠食物。将每组4只斯普拉-道来大鼠的各组每周皮下注射50mg/kg的Ionis寡核苷酸，持续6周(总共7个剂量)。另外，一组3只斯普拉-道来大鼠皮下注射生理盐水持续相同时间段。末次给药四十八小时后，对大鼠实施安乐死；并收获器官、尿液和血浆作进一步分析。
血浆化学标志物
为评估Ionis寡核苷酸对肝功能的影响，使用自动临床化学分析仪(日立奥林巴斯AU400c，梅尔维尔，纽约)测量转氨酶的血浆水平。测量ALT(丙氨酸转氨酶)和AST(天冬氨酸转氨酶)的血浆水平，并且将这些结果呈现在下表中，以IU/L表示。总胆红素(TBIL)、白蛋白(ALB)和血尿素氮(BUN)的血浆水平也使用同一临床化学分析仪进行测量，结果也显示在下表中。将导致超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的任何肝功能标志物的水平变化的Ionis经修饰的寡核苷酸在进一步的研究中排除。
表90
斯普拉-道来大鼠中的血浆化学标志物
Figure BDA0003058421320002292
Figure BDA0003058421320002301
血液学测定
在第6周将从小鼠组中获得的血液送至爱德士生物研究公司(IDEXXBioResearch)进行血细胞计数的测量。采集的计数包括红细胞(RBC)计数、白细胞(WBC)计数、血红蛋白(HGB)、红细胞压积(HCT)、平均红细胞体积(MCV)、平均红细胞血红蛋白(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)和单个白细胞计数，例如单核细胞(MON)、中性粒细胞(NEU)、淋巴细胞(LYM)、嗜酸性粒细胞(EOS)、网织红细胞(RETIC)和血小板(PLT)的计数。结果呈现在下表中。将导致超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的血细胞计数的变化的Ionis寡核苷酸在进一步研究中排除。
表91
斯普拉-道来大鼠中的血细胞计数
Figure BDA0003058421320002302
Figure BDA0003058421320002311
表92
斯普拉-道来大鼠中的血细胞计数
Figure BDA0003058421320002312
肾功能
为评估Ionis寡核苷酸对肾功能的影响，使用自动临床化学分析仪(日立奥林巴斯AU400c，梅尔维尔，纽约)测量总尿蛋白水平和尿肌酸酐水平。将总蛋白与肌酸酐的比率(P/C比率)呈现在下表中。将导致超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的比率水平变化的Ionis寡核苷酸在进一步研究中排除。
表93
斯普拉-道来大鼠中总蛋白与肌酸酐的比率
Figure BDA0003058421320002313
Figure BDA0003058421320002321
身体重量和器官重量
在研究结束时测量肝、心脏、脾和肾的重量，并且呈现在下表中。尸检前测量终末体重。将导致超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的器官重量的任何变化的Ionis寡核苷酸从进一步的研究中排除。
表94
身体重量和器官重量
Figure BDA0003058421320002322
实例13：人源化PBMC小鼠模型中经修饰寡核苷酸对人FOXP3表达的影响
从杰克森实验室(Jackson Laboratory)获得的人源化PBMC小鼠(hu-PBMC-NSG)。将NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ小鼠植入人PBMC以建立hu-PBMC-NSG模型。用从以上描述的研究中选择的经修饰的寡核苷酸治疗小鼠，并且评估不同血浆化学标志物以及mRNA的水平的变化。
治疗
每天对4只雌性hu-PBMC-NSG小鼠(从杰克森实验室获得)的组以25mg/kg的经修饰的寡核苷酸进行皮下注射(共4次治疗)。在4只的组中用经修饰的寡核苷酸治疗小鼠。另一组8只雌性huPBMC小鼠注射PBS。在治疗开始后第4天(最后施用后24小时)对小鼠进行安乐死。
血浆化学标志物
为评估经修饰的寡核苷酸对肝功能的影响，用全自动临床化学分析仪(日立奥林巴斯AU400c，梅尔维尔(Melville)，纽约)测定血液尿素氮(BUN)、白蛋白、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBIL)和白蛋白(ALB)的血浆水平。结果呈现在下表中。将导致超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的任何肝或肾功能标志物的水平变化的经修饰的寡核苷酸在进一步的研究中排除。
表95
雌性huPBMC小鼠中的血浆化学标志物
Figure BDA0003058421320002331
Figure BDA0003058421320002341
体重
在小鼠被处死的当天测量hu-PBMC-NSG小鼠的体重，每个组的平均体重显示在下表中。将导致超出经修饰的寡核苷酸的预期范围的器官重量的任何变化的经修饰的寡核苷酸从进一步的研究中排除。
表96
身体重量和器官重量(以克计)
Figure BDA0003058421320002342
RNA分析
提取脾细胞和淋巴结进行RNA分析。在gentleMACS分离器(梅旖旎公司(Mitelnyi))上在组织分离管(梅旖旎公司)中通过机械破碎法从脾中分离脾细胞。使用上述引物探针组RTS35925和RTS35988(正向序列，CAAATGGTGTCTGCAAGTGG，在此指定为SEQ IDNO:3248；反向序列，CTCTGGAGGAGACATTGTGC，在本文指定为SEQ ID NO:3249；探针序列，CCTGGCAGTGCTTGAGGAAGTCC，在本文指定为SEQ ID NO:3250)来测量分离PCR中人Foxp3 RNA水平。结果以相对于PBS对照的RNA变化百分比表示，归一化为人GAPDH和人CD4。使用引物探针组RTS104(正向序列，GAAGGTGAAGGTCGGAGTC，在本文指定为SEQ ID NO:3251；反向序列，GAAGATGGTGATGGGATTTC，在本文指定为SEQ ID NO:3252；探针序列，CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC，在本文指定为SEQ ID NO:3253)扩增人GAPDH。使用ABI引物探针组Hs01058407_m1扩增人CD4。
如下表所示，与PBS对照相比，用Ionis经修饰的寡核苷酸治疗导致Foxp3 RNA的减少。结果在下表中以相对于PBS对照的Foxp3mRNA量的百分比对照表示(％对照)。
表97
huPBMC模型中经修饰的寡核苷酸介导的对人Foxp3 RNA表达的抑制
Figure BDA0003058421320002351
流式细胞术
使用流式细胞仪在调节性T细胞中测量Foxp3蛋白水平。在与经修饰的寡核苷酸孵育后，CD4+T-细胞被荧光标记的CD3、CD4、Helios和FOXP3抗体(生物传奇公司(Biolegend))使用真实核转录因子缓冲液组(TrueNuclear Transcription Factor Buffer Set)(生物传奇公司)染色。调节性T细胞门控为CD3+CD4+Helios+细胞，使用Foxp3抗体染色的中值荧光强度定量Foxp3蛋白水平。
表98
huPBMC模型中经修饰的寡核苷酸介导的对人Foxp3蛋白水平的抑制
Figure BDA0003058421320002361
实例14：衍生自hu-PBMC-NSG小鼠的CD4 T细胞中经修饰的寡核苷酸对人Foxp3mRNA和蛋白水平的剂量依赖性抑制
通过以下组合从人源化PBMC小鼠(hu-PBMC-NSG，杰克森实验室)的脾细胞中分离人CD4+T细胞：使用人Easysep CD4 T细胞纯化试剂盒(干细胞技术公司)进行初步纯化，随后使用小鼠Easysep CD4 T细胞纯化试剂盒(干细胞技术公司)进行阴性选择以仅仅富集人群体。纯化的人CD4+T细胞在补充有30ng/mL的人重组IL-2(干细胞技术公司)的Immunocult-XT T细胞扩增培养基(干细胞技术公司)中进行培养。在剂量应答研究中通过自由摄取用经修饰的寡核苷酸对CD4+T细胞进行离体处理72小时。细胞在Imunocult人CD3/CD28/CD2 T细胞活化剂(干细胞技术公司)存在下活化24h。收集细胞并评估Foxp3 mRNA水平的变化。
引物探针组RTS35988用于检测人Foxp3 RNA水平。Foxp3 RNA水平归一化至人GAPDH或人CD4。使用引物探针组RTS104扩增人GAPDH。使用ABI引物探针组Hs01058407_m1扩增人CD4。结果在下表中以相对于PBS对照的Foxp3 mRNA量的百分比对照表示(％对照)。
使用流式细胞仪在调节性T细胞中测量Foxp3蛋白水平。在与经修饰的寡核苷酸孵育后，CD4+T-细胞被荧光标记的CD3、CD4、Helios和FOXP3抗体(生物传奇公司(Biolegend))使用真实核转录因子缓冲液组(TrueNuclear Transcription Factor Buffer Set)(生物传奇公司)染色。调节性T细胞门控为CD3+CD4+Helios+细胞，使用Foxp3抗体染色的中值荧光强度定量Foxp3蛋白水平。
表99
经修饰的寡核苷酸介导的对来自huPBMC模型的CD4 T细胞中人Foxp3 RNA表达的抑制(归一化至GAPDH)
Figure BDA0003058421320002371
表100
经修饰的寡核苷酸介导的对来自huPBMC模型的CD4 T细胞中人Foxp3 RNA表达的抑制(归一化至CD4)
Figure BDA0003058421320002381
表101
调节性T细胞中经修饰的寡核苷酸对人Foxp3蛋白表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002382
实例15：经修饰的寡核苷酸对SUP-M2细胞中的人Foxp3的剂量依赖性抑制
测试了经修饰的寡核苷酸在体外对SUP-M2细胞中Foxp3 mRNA水平的影响。将以每mL 35,000个细胞的密度培养的SUP-M2细胞使用电穿孔用稀释至浓度10μM、2.5μM、0.63μM、0.16μM和0.04μM的经修饰的寡核苷酸转染。在大约48小时的处理期之后，从细胞中分离RNA，并且通过定量实时RTPCR测量Foxp3 mRNA水平。人引物探针组RTS35925和RTS35988均用于在单独的RTPCR反应中测量mRNA水平。根据总RNA含量调整Foxp3 mRNA水平(如通过
Figure BDA0003058421320002391
所测量的)，以及针对通过人引物探针组RTS104测量的GAPDH水平调整。结果在下表中以相对于未处理对照细胞的Foxp3mRNA量的百分比对照表示(％UTC)。
表102
SUP-M2细胞中经修饰的寡核苷酸对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002392
表103
SUP-M2细胞中经修饰的寡核苷酸对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002401
表104
SUP-M2细胞中经修饰的寡核苷酸对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002402
Figure BDA0003058421320002411
表105
SUP-M2细胞中经修饰的寡核苷酸对人Foxp3 mRNA表达的剂量依赖性抑制
Figure BDA0003058421320002412

Claims (59)

1.一种化合物，所述化合物包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸长8至80个连接的核苷，具有包含SEQ ID NO:9-3246的核碱基序列中任一项的至少8个连续核碱基的核碱基序列。
2.一种化合物，所述化合物包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸长9至80个连接的核苷，具有包含SEQ ID NO:9-3246的核碱基序列中任一项的至少9个连续核碱基的核碱基序列。
3.一种化合物，所述化合物包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸长10至80个连接的核苷，具有包含SEQ ID NO:9-3246的核碱基序列中任一项的至少10个连续核碱基的核碱基序列。
4.一种化合物，所述化合物包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸长11至80个连接的核苷，具有包含SEQ ID NO:9-3246的核碱基序列中任一项的至少11个连续核碱基的核碱基序列。
5.一种化合物，所述化合物包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸长12至80个连接的核苷，具有包含SEQ ID NO:9-3246的核碱基序列中任一项的至少12个连续核碱基的核碱基序列。
6.一种化合物，所述化合物包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸长16至80个连接的核苷，具有包含SEQ ID NO:9-3246中任一项的核碱基序列的核碱基序列。
7.一种化合物，所述化合物包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸具有由SEQID NO:9-3246中任一项组成的核碱基序列。
8.一种化合物，所述化合物包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸长8至80个连接的核苷，在SEQ ID NO:1的核苷酸2269-2284中或在SEQ ID NO:2的核苷酸1233-1248、2156-2171、2735-2750、4661-4676、7307-7322、7331-7346、7980-7995、11581-11596或12396-12411中是互补的。
9.一种化合物，所述化合物包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸长8至80个连接的核苷，具有包含SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492或2575中任一项的核碱基序列。
10.一种化合物，所述化合物包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸具有由SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492、或2575中任一项组成的核碱基序列。
11.如权利要求1-10中任一项所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸包含至少一种经修饰的核苷间连接、至少一种经修饰的糖、或至少一种经修饰的核碱基。
12.如权利要求11所述的化合物，其中所述经修饰的核苷间连接是硫代磷酸酯核苷间连接。
13.如权利要求11或12所述的化合物，其中所述经修饰的糖是二环糖。
14.如权利要求13所述的化合物，其中所述二环糖选自下组，该组由以下组成：4'-(CH2)-O-2'(LNA)；4'-(CH2)2-O-2'(ENA)；和4'-CH(CH3)-O-2'(cEt)。
15.如权利要求11或12所述的化合物，其中所述经修饰的糖是2’-O-甲氧基乙基。
16.如权利要求11-15中任一项所述的化合物，其中所述经修饰的核碱基是5-甲基胞嘧啶。
17.如权利要求1-16中任一项所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸包含：
由连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由连接的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含经修饰的糖。
18.一种化合物，所述化合物包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸长16至80个连接的核苷，具有包含SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492或2575中任一项的核碱基序列，其中所述经修饰的寡核苷酸包含：
由连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由连接的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间并且其中每个翼区段的每个核苷包含经修饰的糖。
19.一种化合物，所述化合物包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸长16-80个连接的核碱基，具有包含SEQ ID NO:449、501、544、794、1293、1307、1511、1755、2492或2575中任一项列举的序列的核碱基序列，其中所述经修饰的寡核苷酸包含：
由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由三个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间；其中每个翼段的每个核苷包含cEt核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
20.一种化合物，所述化合物包含经修饰的寡核苷酸，所述经修饰的寡核苷酸长16-80个连接的核碱基，具有包含SEQ ID NO:449中列举的序列的核碱基序列，其中所述经修饰的寡核苷酸包含：
由十个连接的脱氧核苷组成的缺口区段；
由三个连接的核苷组成的5’翼区段；以及
由三个连接的核苷组成的3’翼区段；
其中所述缺口区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间；其中每个翼段的每个核苷包含cEt核苷；其中每个核苷间连接都是硫代磷酸酯连接；并且其中每个胞嘧啶都是5-甲基胞嘧啶。
21.如权利要求1-20中任一项所述的化合物，其中所述寡核苷酸与SEQ ID NO:1-5中任一项是至少80％、85％、90％、95％或100％互补的。
22.如权利要求1-21中任一项所述的化合物，其中所述化合物是单链的。
23.如权利要求1-21中任一项所述的化合物，其中所述化合物是双链的。
24.如权利要求1-23中任一项所述的化合物，其中所述化合物包含核糖核苷酸。
25.如权利要求1-23中任一项所述的化合物，其中所述化合物包含脱氧核糖核苷酸。
26.如权利要求1-25中任一项所述的化合物，其中所述经修饰的寡核苷酸由16至30个连接的核苷组成。
27.如任一前述权利要求所述的化合物，其中所述化合物由所述经修饰的寡核苷酸组成。
28.一种化合物，所述化合物由如权利要求1-27所述的化合物中任一项的药学上可接受的盐组成。
29.如权利要求28所述的化合物，其中所述药学上可接受的盐是钠盐。
30.如权利要求28所述的化合物，其中所述药学上可接受的盐是钾盐。
31.一种化合物，所述化合物具有下式：
Figure FDA0003058421310000051
或其盐。
32.一种化合物，所述化合物具有下式：
Figure FDA0003058421310000061
33.一种组合物，所述组合物包含如权利要求1-32中任一项所述的化合物以及药学上可接受的载体。
34.一种组合物，所述组合物包含任一前述权利要求所述的化合物或经修饰的寡核苷酸，用于在疗法中使用。
35.一种治疗或改善个体中的癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用靶向FOXP3的化合物，从而治疗或缓解所述癌症。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述化合物是靶向FOXP3的反义化合物。
37.如权利要求35或36所述的方法，其中所述癌症是具有微环境或间质或肿瘤引流淋巴结中的FOXP3阳性(FOXP3+)Treg的癌症、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、鳞状细胞癌(SCC)、头颈癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、胃肠道癌、大肠癌、小肠癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)、食道癌、胰腺癌、胆道癌、胃癌、尿路上皮癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、间皮瘤、肉瘤(例如上皮样肉瘤、横纹肌样肉瘤和滑膜肉瘤)、脊索瘤、肾癌、肾细胞癌(RCC)、脑癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、皮肤癌、黑素瘤、基底细胞癌、默克尔细胞癌、血液癌、造血癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤(MM)、B细胞恶性肿瘤、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、白血病或急性淋巴细胞性白血病(ALL)。
38.如权利要求40-42中任一项所述的方法，其中施用所述化合物抑制或降低免疫抑制、Treg免疫抑制活性、癌细胞增殖、肿瘤生长、或转移，或诱导或活化抗癌或抗肿瘤免疫；抗癌或抗肿瘤免疫应答；免疫细胞活化或浸润；炎性细胞活化或浸润；效应免疫细胞活化或浸润；T细胞活化或浸润；CD8 T细胞活化或浸润；NK细胞活化或浸润；巨噬细胞和树突状细胞活化或浸润；炎症；或炎性细胞因子或趋化因子表达。
39.一种在细胞中抑制FOXP3表达的方法，所述方法包括使靶向FOXP3的化合物接触所述细胞，从而抑制所述细胞中FOXP3的表达。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述细胞是癌细胞。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述癌症是具有微环境或间质或肿瘤引流淋巴结中的FOXP3阳性(FOXP3+)Treg的癌症、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、鳞状细胞癌(SCC)、头颈癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、胃肠道癌、大肠癌、小肠癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)、食道癌、胰腺癌、胆道癌、胃癌、尿路上皮癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、间皮瘤、肉瘤(例如上皮样肉瘤、横纹肌样肉瘤和滑膜肉瘤)、脊索瘤、肾癌、肾细胞癌(RCC)、脑癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、皮肤癌、黑素瘤、基底细胞癌、默克尔细胞癌、血液癌、造血癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤(MM)、B细胞恶性肿瘤、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、白血病或急性淋巴细胞性白血病(ALL)。
42.一种降低或抑制具有癌症的个体中的免疫抑制、Treg免疫抑制活性、癌细胞增殖、肿瘤生长或转移的方法，所述方法包括向所述个体施用靶向FOXP3的化合物，从而降低或抑制所述个体中的免疫抑制、Treg免疫抑制活性、癌细胞增殖、肿瘤生长或转移。
43.一种方法，所述方法在具有癌症的个体中诱导或活化抗癌或抗肿瘤免疫；抗癌或抗肿瘤免疫应答；免疫细胞活化或浸润；炎性细胞活化或浸润；效应免疫细胞活化或浸润；T细胞活化或浸润；CD8T细胞活化或浸润；NK细胞活化或浸润；巨噬细胞和树突状细胞活化或浸润；炎症；或炎性细胞因子或趋化因子表达，所述方法包括向所述个体施用靶向FOXP3的化合物。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述个体患有具有微环境或间质或肿瘤引流淋巴结中的FOXP3阳性(FOXP3+)Treg的癌症、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、鳞状细胞癌(SCC)、头颈癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、胃肠道癌、大肠癌、小肠癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)、食道癌、胰腺癌、胆道癌、胃癌、尿路上皮癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、间皮瘤、肉瘤(例如上皮样肉瘤、横纹肌样肉瘤和滑膜肉瘤)、脊索瘤、肾癌、肾细胞癌(RCC)、脑癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、皮肤癌、黑素瘤、基底细胞癌、默克尔细胞癌、血液癌、造血癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤(MM)、B细胞恶性肿瘤、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、白血病或急性淋巴细胞性白血病(ALL)。
45.如权利要求35-44中任一项所述的方法，其中所述化合物是靶向FOXP3的反义化合物。
46.如权利要求35-45中任一项所述的方法，其中所述化合物是如权利要求1-34中任一项所述的化合物或如权利要求35或36所述的组合物。
47.如权利要求35-46中任一项所述的方法，其中所述化合物胃肠外地施用。
48.靶向FOXP3的化合物用于治疗、预防或缓解癌症的用途。
49.如权利要求48所述的用途，其中所述癌症是具有微环境或间质或肿瘤引流淋巴结中的FOXP3阳性(FOXP3+)Treg的癌症、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、鳞状细胞癌(SCC)、头颈癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、胃肠道癌、大肠癌、小肠癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)、食道癌、胰腺癌、胆道癌、胃癌、尿路上皮癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、间皮瘤、肉瘤(例如上皮样肉瘤、横纹肌样肉瘤和滑膜肉瘤)、脊索瘤、肾癌、肾细胞癌(RCC)、脑癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、皮肤癌、黑素瘤、基底细胞癌、默克尔细胞癌、血液癌、造血癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤(MM)、B细胞恶性肿瘤、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、白血病或急性淋巴细胞性白血病(ALL)。
50.如权利要求48或49所述的用途，其中所述化合物是靶向FOXP3的反义化合物。
51.如权利要求48-50中任一项所述的用途，其中所述化合物是如权利要求1-32中任一项所述的化合物或如权利要求33或34所述的组合物。
52.靶向FOXP3的化合物在制造用于治疗或缓解癌症的药物中的用途。
53.如权利要求51所述的用途，其中所述癌症是具有以下的癌症：微环境或间质或肿瘤引流淋巴结中的FOXP3阳性(FOXP3+)Treg、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、鳞状细胞癌(SCC)、头颈癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、胃肠道癌、大肠癌、小肠癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)、食道癌、胰腺癌、胆道癌、胃癌、尿路上皮癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、间皮瘤、肉瘤(例如上皮样肉瘤、横纹肌样肉瘤和滑膜肉瘤)、脊索瘤、肾癌、肾细胞癌(RCC)、脑癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、皮肤癌、黑素瘤、基底细胞癌、默克尔细胞癌、血液癌、造血癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤(MM)、B细胞恶性肿瘤、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、白血病或急性淋巴细胞性白血病(ALL)。
54.如权利要求52或53所述的用途，其中所述化合物是靶向FOXP3的反义化合物。
55.如权利要求52-54中任一项所述的用途，其中所述化合物是如权利要求1-32中任一项所述的化合物或如权利要求33或34所述的组合物。
56.靶向FOXP3的化合物在制备用于治疗或缓解癌症的药物中的用途。
57.如权利要求56所述的用途，其中所述癌症是具有以下的癌症：微环境或间质或肿瘤引流淋巴结中的FOXP3阳性(FOXP3+)Treg、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、鳞状细胞癌(SCC)、头颈癌、头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、胃肠道癌、大肠癌、小肠癌、胃癌、结肠癌、结直肠癌、膀胱癌、肝癌、肝细胞癌(HCC)、食道癌、胰腺癌、胆道癌、胃癌、尿路上皮癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌(TNBC)、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌、前列腺癌、间皮瘤、肉瘤(例如上皮样肉瘤、横纹肌样肉瘤和滑膜肉瘤)、脊索瘤、肾癌、肾细胞癌(RCC)、脑癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、皮肤癌、黑素瘤、基底细胞癌、默克尔细胞癌、血液癌、造血癌、骨髓瘤、多发性骨髓瘤(MM)、B细胞恶性肿瘤、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、白血病或急性淋巴细胞性白血病(ALL)。
58.如权利要求56或57所述的用途，其中所述化合物是靶向FOXP3的反义化合物。
59.如权利要求56-58中任一项所述的用途，其中所述化合物是如权利要求1-32中任一项所述的化合物或如权利要求33或34所述的组合物。
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