CN113181136B

CN113181136B - 一种装载和递送核酸的复合颗粒及其制备方法和用途

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Publication number: CN113181136B
Application number: CN202110112912.8A
Authority: CN
Inventors: 任贺; 高超; 赵潇
Original assignee: Affiliated Hospital of University of Qingdao
Current assignee: Affiliated Hospital of University of Qingdao
Priority date: 2021-06-29
Filing date: 2021-06-29
Publication date: 2022-09-16
Anticipated expiration: 2041-06-29
Also published as: CN113181136A

Abstract

本发明属于RNA药物技术领域，涉及一种装载和递送核酸的复合颗粒及其制备方法和用途。所述的复合颗粒在水凝胶内部包封脂质体，在所述的脂质体内部包封所述的核酸，所述的核酸为DNA或RNA的整体或片段。利用本发明的装载和递送核酸的复合颗粒及其制备方法和用途，能够使制备得到的复合颗粒在用于肿瘤，尤其是胰腺癌的免疫增效治疗时，具有更好的治疗效果。

Description

一种装载和递送核酸的复合颗粒及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于RNA药物技术领域，涉及一种装载和递送核酸的复合颗粒及其制备方法和用途。

背景技术

胰腺癌是一种高度恶性的消化系统肿瘤，手术、放化疗等传统治疗手段对于胰腺癌患者生存周期的延长十分有限，而且增加了患者对药物的毒性反应。近些年来，肿瘤免疫治疗技术的发展为改善胰腺癌患者预后开拓了一种全新的途径和方法。但是，免疫治疗存在明显的个体差异，如何提高免疫治疗的应答率及降低免疫治疗的系统毒性，已经成为目前肿瘤免疫治疗的关键问题。

胰腺癌肿瘤免疫微环境中，免疫细胞多数处于数量与功能的失衡状态，通常表现为具有免疫抑制作用的肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages,TAMs)、调节性T细胞(Regulatory T cells,Tregs)和髓源性抑制细胞(Myeloid derived suppressorcells,MDSCs)功能活跃且大量存在；而通常表现为具有抗肿瘤作用的CD4+、CD8+效应T细胞、NK细胞和DC细胞数量减少，并呈现无功能或不成熟的表型和状态。而肿瘤微环境中免疫抑制细胞是影响肿瘤发生及预后的关键因素。

肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)根据活化状态和发挥功能不同，可分为M1型即经典活化型巨噬细胞(classically activated macrophage)和M2型即替代活化型巨噬细胞(alternatively activated macrophage)。M1型巨噬细胞主要参与炎症反应和抗肿瘤免疫过程；M2型巨噬细胞表现为刺激血管形成，降解细胞外基质，促进肿瘤发生远端转移。此外，调节性T细胞(Tregs)能够分泌抑制性细胞因子(TGF-β、IL-10等)抑制效应T细胞的活化和功能，介导肿瘤相关抗原免疫耐受，使肿瘤细胞逃避免疫监视。研究表明，在胰腺癌肿瘤的转移及复发过程中，M2表型的TAMs以及Tregs数量显著增加，是预后差的重要指标。因此，通过药物促进肿瘤微环境中M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞的极化，以及降低Tregs细胞数量，重塑肿瘤免疫微环境，有望成为提高胰腺癌预后的一种有效方法。

研究表明，IRF5在巨噬细胞的极化中具有重要的调控作用，能够将M2型巨噬细胞重新极化成M1型巨噬细胞，从而抑制肿瘤发生和转移。此外，趋化因子配体5(CCL5)是一类调节正常T细胞表达和分泌的细胞因子，又称为活化T细胞表达和分泌的调节因子(RANTES)。CCL5/CCR5的相互作用可能以多种方式促进肿瘤的发生，刺激血管生成，调节细胞外基质，诱导补充基质细胞和炎症细胞及参与免疫逃逸机制。因此，提高肿瘤微环境中IRF5的表达量以及降低CCL5的表达量，促进M2型巨噬细胞向M1型巨噬细胞极化，降低Tregs的招募，重塑肿瘤免疫微环境，有助于降低胰腺癌发生和转移。

RNA(如mRNA)作为基因传递分子，携带遗传信息，指导蛋白质合成，对蛋白质的翻译效率进行上调或下调，解决蛋白“不可成药”难题。近些年来，基于RNA(mRNA、siRNA)的药物在癌症免疫治疗中的应用越来越广泛。但是，RNA极易被环境中富含的核酸酶降解从而失去活性。因此，需要一种载体将RNA输送到靶点避免其被降解。

阳离子脂质体制备简单、可重复转染和易降解等特点被认为具有重要的临床应用价值。其中DOTAP阳离子脂质体是一种应用较多的非病毒载体系统，能够将RNA包封于脂质双分子层中，保护RNA免受核酸酶降解并输送至靶点部位。

水凝胶是一种亲水性极强但不溶于水的高分子聚合物，在水中可保持其形状和三维空间网络结构，具有吸水、保水、缓释等特点，在药物缓释、靶向递送等方面发挥着重要的作用。根据不同敏感性，水凝胶可分为温敏性水凝胶、pH敏感性水凝胶及生物分子响应型水凝胶等。温敏性水凝胶具有一定比例的疏水基团和亲水集团，温度变化可以影响基团的疏水作用及大分子链间的氢键作用。

壳聚糖是一种带正电荷的直链碱性聚氨基多糖，具有天然的抗菌性质、无毒性质及广泛的来源，使得其在医药学领域具有广泛的应用。壳聚糖的温敏性水凝胶不仅具有优良的生物相容性和可降解性，而且在药物缓释等方面具有独特优势，能够实现药物持续高效释放至靶点。

发明内容

本发明的首要目的是提供一种装载和递送核酸的复合颗粒，以能够在用于肿瘤，尤其是胰腺癌的免疫增效治疗时，具有更好的治疗效果。

为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供一种装载和递送核酸的复合颗粒，所述的复合颗粒在水凝胶内部包封脂质体，在所述的脂质体内部包封所述的核酸，所述的核酸为DNA或RNA的整体或片段。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种装载和递送核酸的复合颗粒，其中所述的核酸为针对胰腺癌的免疫治疗的RNA(能够极化巨噬细胞及抑制免疫抑制细胞招募的因子，例如IRF5mRNA、CCL5 siRNA)。

在一种更加优选的实施方案中，本发明提供一种装载和递送核酸的复合颗粒，其中所述的RNA为SEQ ID NO.1所示序列的mRNA和/或SEQ ID NO.2所示正义链序列，SEQ IDNO.3所示反义链序列的siRNA。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种装载和递送核酸的复合颗粒，其中所述的水凝胶为天然高分子化合物形成的水凝胶，所述的天然高分子化合物选自壳聚糖、透明质酸、海藻酸中的一种或几种。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种装载和递送核酸的复合颗粒，其中所述的脂质体为阳离子脂质体，选自氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵(DOTMA)和/或溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵(DOTAP)。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种装载和递送核酸的复合颗粒，其中所述的复合颗粒为纳米复合颗粒，平均粒径为80-150nm。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种装载和递送核酸的复合颗粒，其中所述的复合颗粒中所述的水凝胶的平均厚度为80-150mm，所述的脂质体的平均厚度为80-150mm。

在一种优选的实施方案中，本发明提供一种装载和递送核酸的复合颗粒，其中所述的复合颗粒中所述的水凝胶、所述的脂质体、所述的核酸的质量比为2000-3000:0.5-2:1。

本发明的第二个目的是提供上述复合颗粒的制备方法，以能够使制备得到的复合颗粒在用于肿瘤，尤其是胰腺癌的免疫增效治疗时，具有更好的治疗效果。

为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供上述复合颗粒的制备方法，所述的制备方法包括如下步骤：

(1)制备所述的脂质体；

(2)将所述的核酸包封在所述的脂质体中；

(3)制备所述的水凝胶；

(4)将包封了所述的核酸的所述的脂质体包封在所述的水凝胶中。

本发明的第三个目的是提供上述复合颗粒用于制备治疗胰腺癌的药物的用途，以能够使复合颗粒在用于胰腺癌的免疫增效治疗时，具有更好的治疗效果。

为实现此目的，在基础的实施方案中，本发明提供上述复合颗粒用于制备治疗胰腺癌的药物的用途。

本发明的有益效果在于，利用本发明的装载和递送核酸的复合颗粒及其制备方法和用途，能够使制备得到的复合颗粒在用于肿瘤，尤其是胰腺癌的免疫增效治疗时，具有更好的治疗效果。

现有肿瘤治疗技术存在如下问题：

(1)现有肿瘤免疫治疗技术中，存在着免疫应答率低的问题，其关键原因在于肿瘤微环境中免疫细胞受到了抑制，无法发挥免疫调节作用；

(2)蛋白药物的活性及半衰期问题，往往造成药物疗效欠佳；

(3)现有纳米药物靶向肿瘤治疗中，存在药物系统毒性等问题，毒副作用比较大。

针对以上问题，本发明主要利用脂质体核酸药物，克服了蛋白药物的不可成药性，实现了蛋白的上调或下调；并且重塑肿瘤免疫微环境，激活免疫细胞，提高免疫应答率；通过水凝胶的缓释，实现了脂质体核酸药物高效持续的释放到肿瘤部位，从而降低了药物系统毒性并提高了肿瘤免疫治疗应答率。

附图说明

图1为实施例1的凝胶成像结果图。

图2为实施例2中电子显微镜下观察微粒的形态和大小的结果图。

图3为实施例2中粒径测量结果图。

图4为实施例2中电势测量结果图。

图5为实施例3中水凝胶表面形貌表征结果图。

图6为实施例3中水凝胶溶胀性检测结果图。

图7为实施例3中水凝胶降解性检测结果图。

图8为实施例4中EGFP mRNA的体外转染实验结果图。

图9为实施例4中IRF5 mRNA的体外转染实验结果图。

图10为实施例4中CCL5 siRNA的体外转染实验结果图。

图11为实施例5中RNA复合颗粒对巨噬细胞极化的影响实验结果图。

图12为实施例6中RNA复合颗粒的免疫荧光染色实验结果图。

图13为实施例7中RNA复合颗粒抗肿瘤效果评价实验结果图，其中(a)为肿瘤术后模型构建及治疗流程图；(b)为肿瘤术后体积大小表征图；(c)为肿瘤组织的H&E染色表征图。

图14为实施例8中RNA复合颗粒的肿瘤免疫学评价实验结果图，其中(a)为CD86,(b)为CD206，(c)为CD8的表达及分布情况。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作出进一步的说明。

实施例1：IRF5 mRNA和CCL5 siRNA的合成制备(一)IRF5 mRNA的合成制备

1、重组表达载体的构建

以pST1374为表达载体，构建包含SEQ ID NO.4所示序列的IRF5基因的重组质粒载体。

2、目的RNA的体外合成制备

对步骤1得到的重组质粒载体进行PCR目的基因扩增，并以此为模板，使用mRNA体外转录试剂盒合成IRF5 mRNA。在此合成过程中，同时对mRNA结构进行优化，加入假尿嘧啶和胞嘧啶，5’段ARCA帽子结构修饰及3’端多聚A尾巴修饰，以增强所得IRF5 mRNA的稳定性，并降低其免疫原性，所得IRF5 mRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。

(1)IRF5体外模板制备

PCR体外扩增成分表如下所示：

PCR体外扩增程序如下所示：

引物序列如下所示：

引物	序列
		上游引物	CTGGCTAACTAGAGAACCCAC
下游引物	CTAGAAGGCACAGTCGAGGCTG

(2)琼脂糖凝胶电泳检测IRF5模板

①配置1％琼脂糖溶液(0.3g琼脂糖+30mL 1×TAE Buffer，1块小板)，微波炉加热5min至完全溶解；冷却至温度50-60℃，加入浓缩的10000×GeneGreen Nucleic Acid Dye核酸染料(TIANGEN,RT210)，使其在凝胶中的终浓度为1×(30mL的凝胶+3μL染料)轻轻摇晃混匀，倒胶。

②上样：Marker为TIANGEN D2000分子量标准，浓度0.05mg DNA/mL，目录号MD114。使用时取3-6μL加入琼脂糖凝胶的加样孔中(每1mm点样孔的宽度加1μL)。样品5μL(一般DNA的量在1μg左右即可)+1μL 6×Loading Buffer.

③电泳：电泳条件为1.0-2.5％琼脂糖凝胶，正负极之间电压4-10v/cm，电泳时间30min。

④成像：打开凝胶成像系统，取出凝胶，选择Nucleic acid,Bio rad成像，结果如图1所示。。

(3)IRF5 mRNA体外合成

①HiScribe T7 ARCA mRNA Kit(with tailing)，冰浴条件下解冻试剂盒各组分；

②充分混匀，37℃，30min；

③每20μL体系加入2μL DNase I，用于去除DNA模板；充分混匀，37℃，15min；

④Poly(A)加尾反应：充分混匀，37℃，30min。

(4)IRF5 mRNA纯化

①每50μL反应加25μL LiCl溶液，轻弹混匀，-20℃，30min；

②4℃,12000rpm,15-20min，弃掉上清，保留沉淀，加500μL预冷75％乙醇，轻轻弹匀；

③4℃,12000rpm,15-20min，弃掉上清，保留沉淀，瞬离1-2min，室温晾干至半湿润；

④预热60℃的DEPC水100μL溶解RNA，弹匀至完全溶解；稀释10倍(1μL RNA+9μLDEPC水)。

(5)IRF5 mRNA浓度测定

①选择所需检测项目为RNA，Nuclease-free water Blank校准；

②mRNA样品稀释10倍，(1μL RNA Sample+9μL Nuclease-free water),2μL样品检测，重复3-5次，取平均值，结果浓度为532ng/μL。

③检测完成后，利用Nuclease-free water清洗机器3次。

(二)CCL5 siRNA的合成制备

针对CCL5设计干扰靶点，优化干扰效率。设计的CCL5 siRNA的正义链序列如SEQID NO.2，反义链序列如SEQ ID NO.3所示，该siRNA委托上海吉玛制药技术有限公司合成制备。

实施例2：阳离子脂质体-RNA的制备

以DOTAP、胆固醇及鱼精蛋白为原料，通过薄膜-分散法制备纳米脂质体载体，并进一步装载实施例1合成制备的RNA。

1、DOTAP阳离子脂质体制备

成分	量
		DOTAP(M＝698.54)	6.99mg
胆固醇(M＝386.65)	3.86mg
		三氯甲烷	2mL

DOTAP与胆固醇摩尔比为1:1，溶解完全，梨形瓶中混匀，45℃旋转蒸发成膜。旋转蒸发仪的使用步骤：首先将梨形瓶接入到仪器之上，然后打开仪器上的孔伐，使之与外界大气相通；其次打开真空泵，关闭孔伐，开始抽真空；打开旋转开关，持续10-15min，至三氯甲烷抽尽。关闭仪器的时候，首先抬起梨形瓶，关闭旋转，放气，关闭真空泵。

1mL DEPC水水化完全。挤出器分别200nm，100nm膜挤出15-20次。

2、鱼精蛋白制备

称取一定量的鱼精蛋白溶于5％(m/v)葡萄糖溶液中，鱼精蛋白最终浓度为1μg/μl。

3、脂质体-鱼精蛋白-RNA(LPR)制备

首先取20μg的鱼精蛋白配制的溶液，与IRF5 mRNA 10μg，CCL5 siRNA10μg孵育10分钟至充分混匀，然后再将20μg的步骤1制备的DOTAP阳离子脂质体与上述溶液混合15分钟至完全融合。DOTAP阳离子脂质体/鱼精蛋白/RNA三者质量比为1:1:1。

4、LPR粒径及形貌表征

LPR样品适当稀释1倍后，滴加在覆盖碳膜的铜网上，用2％磷钨酸负染，在透射电子显微镜下观察微粒的形态和大小，结果如图2所示。LPR的粒径及表面电荷用激光粒度仪测定，取20μl的样品用2ml Hepes缓冲液(10mmol/L)稀释后加入样品池，在25℃下重复测定5次，粒径结果如图3所示、电势结果如图4所示。

5、LPR对细胞转染表征

转染成分如下表所示：

实施例3：RNA复合颗粒的制备及理化性质表征

以壳聚糖为基本原料，与季铵盐反应，形成季铵盐壳聚糖(HTCC)，之后和β-甘油磷酸盐反应形成原位可注射壳聚糖水凝胶。进而将实施例2制备得到的LPR装载至水凝胶内部，通过优化水凝胶成胶温度、pH及浓度，制备可持续性释放LPR的水凝胶。并通过流变仪表征水凝胶的机械力学性质，称重法表征水凝胶的降解性，进一步优化水凝胶的可控释放性能。

1、壳聚糖/季铵盐壳聚糖/甘油磷酸盐水凝胶制备

(1)称取壳聚糖0.15g，溶于7mL 0.1M乙酸溶液，搅拌至完全溶解；

(2)称取壳聚糖0.17g，壳聚糖季铵盐0.02g，溶于7mL 0.1M乙酸溶液，搅拌至完全溶解透明；添加2mL去离子水稀释；

(3)称取甘油磷酸盐2g，溶于4mL去离子水(w/v,50％)至完全溶解；

(4)冰浴搅拌条件下，甘油磷酸盐逐滴加入到上述壳聚糖、壳聚糖/壳聚糖季铵盐溶液中，体积比为1:4，继续搅拌10-20min至完全混合，4℃备用；

(5)水浴35℃-37℃温度条件下，1-3min形成混浊状态的水凝胶。

2、RNA复合颗粒的制备

将上述制备好的LPR纳米颗粒逐滴加入到壳聚糖/季铵盐壳聚糖溶液100ul中，溶解完全，然后在冰浴条件下逐滴加入25ul甘油磷酸盐溶液，完全混合，4℃备用。

3、制备得到RNA复合颗粒的检测

(1)水凝胶表面形貌表征

准备上述制备好的RNA复合颗粒200μl，冷冻真空干燥处理，将干燥的多孔水凝胶切割成立方体结构，用双面胶将样品观察面向上黏贴在扫描电镜铜板之上，扫描电子显微镜(SEM)观察。结果如图5所示，表明该RNA复合颗粒内部具有均匀的孔隙率结构。

(2)水凝胶溶胀性检测

准备上述制备好的RNA复合颗粒200μl，分别在PBS、KPC细胞培养基上清液、RAW264.7细胞培养基上清液中浸没28天，初始重量记为M₀，分别在1,4,7,10,13,16,19,22,25,28天时间点吸掉多余残留液，剩余水凝胶重量为M_t，带入公式M％＝(M₀-M_t)/M₀。结果如图6所示，表明RNA复合颗粒在上述溶液中基本没有发生溶胀。

(3)水凝胶降解性检测

准备上述制备好的RNA复合颗粒200μl，分别在PBS、KPC细胞培养基上清液、RAW264.7细胞培养基上清液、壳聚糖酶(100活力单位)中浸没28天，初始重量记为M₀，分别在1,4,7,10,13,16,19,22,25,28天时间点吸掉多余残留液，剩余水凝胶重量为M_t，带入公式M％＝(M₀-M_t)/M₀。结果如图7所示，表明RNA复合颗粒在上述溶液中基本没有发生溶胀，。

实施例4：RNA复合颗粒的体外转染表征

(1)EGFP mRNA的体外转染实验

实验分为4个组，分别为对照组(Ctrl)、脂质体-EGFP mRNA纳米颗粒组(LP-mEGFP)、壳聚糖/季铵盐壳聚糖/甘油磷酸盐水凝胶组(CHG)和EGFP mRNA复合颗粒组(LP-mEGFP@CHG)。具体步骤如下：

首先将事先准备好的CHG及LP-mEGFP@CHG水凝胶各100μl均匀铺板于48孔板中，待形成稳定的水凝胶后，分别将KPC、RAW264.7细胞铺板2万个/孔，在LP-mEGFP中加入1μgEGFP mRNA的脂质体纳米颗粒。细胞培养24小时后，荧光显微镜观察各组转染情况，结果如图8所示，表明LP-mEGFP及LP-mEGFP@CHG组mEGFP均能高效转染KPC和RAW264.7细胞。

(2)IRF5 mRNA的体外转染实验

实验分为4组，分别为对照组(Ctrl)、脂质体-IRF5 mRNA纳米颗粒组(LPR₁)(其中IRF5 mRNA 3μg)、壳聚糖/季铵盐壳聚糖/甘油磷酸盐水凝胶组(CHG)和IRF5 mRNA复合颗粒组(LPR₁@CHG)(其中IRF5 mRNA 3μg)。

首先将事先准备好的CHG及LPR₁@CHG水凝胶各500μl均匀铺板于6孔板中，待形成稳定的水凝胶后，分别将KPC、RAW264.7细胞铺板于各组中，每孔10万个细胞，细胞培养24小时后，提取细胞蛋白。具体如下：

倒掉培养基，PBS清洗细胞。RIPA(Sigma)冰上裂解细胞，收集裂解液12000转/分钟，离心10分钟，收集上清液之加入上样缓冲液煮沸5分钟，-20摄氏度储存备用。用8％-10％凝胶电泳分离不同分子量的蛋白，然后通过湿转法将凝胶上的蛋白质电转到PVDF膜上，膜封闭，加入抗IRF5一抗(Abcam)，4摄氏度过夜，PBST清洗膜，加入IgG-HRP二抗(Bioss)，室温孵育2小时，PBST清洗膜3次，ECL发光检测蛋白表达。结果如图9所示，表明LPR₁及LPR₁@CHG中IRF5表达量均有提高。

(3)CCL5 siRNA的体外转染实验

实验分为4组，分别为对照组(Ctrl)、脂质体-CCL5 siRNA纳米颗粒组(LPR₂)(其中CCL5 siRNA 3μg)、壳聚糖/季铵盐壳聚糖/甘油磷酸盐水凝胶组(CHG)和CCL5 siRNA复合颗粒组(LPR₂@CHG)(其中CCL5 siRNA 3μg)。

首先将事先准备好的CHG及LPR₂@CHG水凝胶各500μl均匀铺板于6孔板中，待形成稳定的水凝胶后，分别将KPC、RAW264.7细胞铺板于各组中，每孔10万个细胞，细胞培养24小时后，提取细胞蛋白，方法同上。然后用12％凝胶电泳，分离不同分子量的蛋白，然后通过湿转法将凝胶上的蛋白质电转到PVDF膜上，膜封闭，加入抗CCL5一抗(CST)，4摄氏度过夜，PBST清洗膜，加入IgG-HRP二抗(Bioss)，室温孵育2小时，PBST清洗膜3次，ECL发光检测蛋白表达。结果如图10所示，表明LPR₂及LPR₂@CHG中CCL5表达量均有降低。

实施例5：RNA复合颗粒对巨噬细胞极化的影响

首先将事先准备好的CHG及LPR₁@CHG水凝胶各500μl均匀铺板于6孔板中，待形成稳定的水凝胶后，分别将M2表型的RAW264.7细胞铺板于各组中，每孔10万个细胞，细胞培养24小时后，提取细胞蛋白，方法同上。用10％凝胶电泳，分离不同分子量的蛋白，然后通过湿转法将凝胶上的蛋白质电转到PVDF膜上，膜封闭，加入抗CD206,CD86一抗(Bioss)，4摄氏度过夜，PBST清洗膜，加入IgG-HRP二抗(Bioss)，室温孵育2小时，PBST清洗膜3次，ECL发光检测蛋白表达。结果如图11所示，表明LPR₁及LPR₁@CHG中CD86表达量提高，CD206表达量降低。

实施例6：RNA复合颗粒的免疫荧光染色实验

实验分组同实施例4，首先将事先准备好的CHG及LPR₁@CHG水凝胶各100μl均匀铺板于共聚焦小平皿中，待形成稳定的水凝胶后，分别将M2表型的RAW264.7细胞铺板于各组中，每孔1万个细胞，细胞培养24小时后，免疫荧光染色。具体步骤如下：

去除培养基，PBS清洗，预热4％多聚甲醛室温固定10分钟，PBS清洗3次，1％BSA室温封闭1小时，加入抗-CD86,CD206一抗(Bioss)，4℃过夜，PBS清洗3次，每次5分钟，AlexaFluor488标记山羊抗兔IgG(H+L)(Sigma)室温封闭1小时，PBS清洗3次，DAPI染色细胞核10分钟，激光共聚焦显微镜检测，结果如图12所示，表明LPR₁及LPR₁@CHG中CD86表达量提高，CD206表达量降低。

实施例7：RNA复合颗粒抗肿瘤效果评价

C57/BL6小鼠胰腺癌术后肿瘤模型构建。8周龄雌性小鼠皮下注射KPC细胞，每只小鼠细胞注射量为60万个细胞，第7日，小鼠肿瘤切除，留存少许肿瘤组织，构建术后切除模型。在第10日，对小鼠进行不同治疗，实验分为三组，对照组(Ctrl)、水凝胶组(CHG)、装载脂质体-RNA纳米颗粒的水凝胶组(LPR@CHG)。在第40日，取材小鼠肿瘤组织，观察肿瘤大小，结果表明，LPR@CHG组能够显著抑制小鼠肿瘤术后的复发情况。

进一步，对小鼠肿瘤组织进行H&E染色分析，首先将肿瘤组织进行冰冻切片，然后进行染色，具体步骤如下：

切片室温孵育10分钟，然后放入100％、95％、90％、80％、70％浓度(v/v)酒精溶液中各5分钟，蒸馏水冲洗5分钟。切片放入苏木精中染色3分钟，流水冲洗3分钟，将切片放入1％盐酸乙醇液(v/v)中分化处理2秒，流水漂洗3分钟，伊红染色3分钟，流水漂洗3分钟，染色后，用浓度递增的酒精脱水各5秒，浓度梯度为70％、80％、90％、95％、100％。之后中性树脂封片，正置荧光显微镜观察。结果如图13所示，表明在LPR@CHG组中，肿瘤细胞数量明显少于其余组。

实施例8：RNA复合颗粒的肿瘤免疫学评价

免疫荧光染色分析肿瘤组织内免疫相关细胞的募集及分布情况。具体步骤如下：

冰冻切片室温孵育10分钟，然后放入100％、95％、90％、80％、70％浓度(v/v)酒精溶液中各5分钟，蒸馏水冲洗5分钟。山羊血清室温封闭45分钟，加入抗CD86,CD206,CD8一抗(Bioss)，4℃湿盒过夜，湿盒复温1小时，PBS清洗5次，每次5分钟；加入IgG-FITC二抗(Sigma)，室温避光孵育2小时，PBS清洗5次，每次5分钟，DAPI细胞核染色；高级正置荧光显微镜观察。结果如图14所示，表明在LPR@CHG组中，CD86、CD8的表达量显著提升，CD206表达下降。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若对本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其同等技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。上述实施例或实施方式只是对本发明的举例说明，本发明也可以以其它的特定方式或其它的特定形式实施，而不偏离本发明的要旨或本质特征。因此，描述的实施方式从任何方面来看均应视为说明性而非限定性的。本发明的范围应由附加的权利要求说明，任何与权利要求的意图和范围等效的变化也应包含在本发明的范围内。

序列表

<110> 青岛大学附属医院

<120> 一种装载和递送核酸的复合颗粒及其制备方法和用途

<130> -

<141> 2021-01-25

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1521

<212> RNA

<213> 人造序列(Artificial sequence)

<400> 1

augcugcaaa acccaaagcc cuuugccaug aaccacucag ccccagggau ucccccacca 60

ccccgccgug ugaggcugaa gcccugguug guggcccagg ugaacagcug ccaguaccca 120

gggcuucagu gggucaacgg ggaaaagaaa cucuucuaua uacccuggcg ccaugccacg 180

aggcaugguc ccagccagga uggggacaac accaucuuca aggccugggc uaaagagaca 240

gggaaguaca cugaaggggu ggaugaggcu gacccagcca aguggaaggc caaccugcgc 300

ugugcccuua acaaaagccg ugacuuccag cuguucuaug auggcccucg ggacaugcca 360

ccucagccgu acaagaucua cgaggucugc uccaacggcc cugcucccac agagagccaa 420

cccacugaug auuacguucu gggagaagag gaggaggagg aagaggaaga gcuccagaga 480

augcuaccag gccugagcau cacagagccu gcgcuaccug ggccucccaa cgcacccuau 540

uccuuaccca aagaagacac caaguggcca ccugcucucc agccaccugu agggcugggu 600

cccccugucc cagacccaaa ucuccuggcc ccucccucug gaaauccugc uggcuucagg 660

cagcuucucc cugagguccu ggagccugga ccucuggcuu ccagccagcc cccuacagaa 720

ccacucuugc cugaccugcu gaucagcccc cacauguugc cuuugacgga ccuagagauc 780

aaguuccagu accggggacg cgcaccccgg acccucacca ucagcaaccc acaaggcugc 840

aggcucuucu acagccagcu agaggcuacc caggagcaag uggaacucuu uggcccugug 900

acccuggagc aagugcgcuu cccuagccca gaggacaucc ccagugacaa gcagcguuuc 960

uauacgaacc agcugcuaga uguccuggac cgugggcuca uccugcagcu gcagggccag 1020

gaccuguacg ccauccgucu gugccagugu aagguguucu ggagugggcc cugcgccuug 1080

gcccauggcu ccugccccaa ccccauucag cgggaaguca agacgaagcu cuuuagccua 1140

gagcaguuuc ucaaugagcu cauccuguuc cagaagggcc agacuaauac cccaccaccu 1200

uuugagaucu ucuuuugcuu uggagaagaa uggccugaug ucaaaccccg agagaagaag 1260

cucauuacug uacagguggu accuguugca gcccgguugc ugcuggagau guucucaggg 1320

gagcuuucuu ggucggcaga cagcauccga cugcagaucu caaacccgga ucucaaagac 1380

cacaugguag agcaguuuaa agagcuucau caccucuggc agucccagca gcaauugcag 1440

cccauggucc aggccccucc uguggcaggc cucgaugcaa gccaggggcc cuggcccaug 1500

cacccaguug gcaugcaaua a 1521

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列(Artificial sequence)

<400> 2

ccaaucuugc aaucguguu 19

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> 人造序列(Artificial sequence)

<400> 3

aacacgacug caagauugg 19

<210> 4

<211> 1545

<212> DNA

<213> 人造序列(Artificial sequence)

<400> 4

atgaaccagt ccatcccagt ggctcccacc ccaccccgcc gcgtgcggct gaagccctgg 60

ctggtggccc aggtgaacag ctgccagtac ccagggcttc aatgggtcaa cggggaaaag 120

aaattattct gcatcccctg gaggcatgcc acaaggcatg gtcccagcca ggacggagat 180

aacaccatct tcaaggcctg ggccaaggag acagggaaat acaccgaagg cgtggatgaa 240

gccgatccgg ccaagtggaa ggccaacctg cgctgtgccc ttaacaagag ccgggacttc 300

cgcctcatct acgacgggcc ccgggacatg ccacctcagc cctacaagat ctacgaggtc 360

tgctccaatg gccctgctcc cacagactcc cagccccctg aggattactc ttttggtgca 420

ggagaggagg aggaagaaga ggaagagctg cagaggatgt tgccaagcct gagcctcaca 480

gatgcagtgc agtctggccc ccacatgaca ccctattctt tactcaaaga ggatgtcaag 540

tggccgccca ctctgcagcc gcccactctg cggccgccta ctctgcagcc gcccactctg 600

cagccgcccg tggtgctggg tccccctgct ccagacccca gccccctggc tcctccccct 660

ggcaaccctg ctggcttcag ggagcttctc tctgaggtcc tggagcctgg gcccctgcct 720

gccagcctgc cccctgcagg cgaacagctc ctgccagacc tgctgatcag cccccacatg 780

ctgcctctga ccgacctgga gatcaagttt cagtaccggg ggcggccacc ccgggccctc 840

accatcagca acccccatgg ctgccggctc ttctacagcc agctggaggc cacccaggag 900

caggtggaac tcttcggccc cataagcctg gagcaagtgc gcttccccag ccctgaggac 960

atccccagtg acaagcagcg cttctacacg aaccagctgc tggatgtcct ggaccgcggg 1020

ctcatcctcc agctacaggg ccaggacctt tatgccatcc gcctgtgtca gtgcaaggtg 1080

ttctggagcg ggccttgtgc ctcagcccat gactcatgcc ccaaccccat ccagcgggag 1140

gtcaagacca agcttttcag cctggagcat tttctcaatg agctcatcct gttccaaaag 1200

ggccagacca acaccccacc acccttcgag atcttcttct gctttgggga agaatggcct 1260

gaccgcaaac cccgagagaa gaagctcatt actgtacagg tggtgcctgt agcagctcga 1320

ctgctgctgg agatgttctc aggggagcta tcttggtcag ctgatagtat ccggctacag 1380

atctcaaacc cagacctcaa agaccgcatg gtggagcaat tcaaggagct ccatcacatc 1440

tggcagtccc agcagcggtt gcagcctgtg gcccaggccc ctcctggagc aggccttggt 1500

gttggccagg ggccctggcc tatgcaccca gctggcatgc aataa 1545

Claims

1.一种装载和递送核酸的复合颗粒，其特征在于：所述的复合颗粒在水凝胶内部包封脂质体，在所述的脂质体内部包封所述的核酸，所述的核酸为SEQ ID NO.1所示序列的针对胰腺癌的免疫治疗的mRNA。

2.根据权利要求1所述的复合颗粒，其特征在于：所述的水凝胶为天然高分子化合物形成的水凝胶，所述的天然高分子化合物选自壳聚糖、透明质酸、海藻酸中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的复合颗粒，其特征在于：所述的脂质体为阳离子脂质体，选自氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基铵和/或溴化三甲基-2,3-二油酰氧基丙基铵。

4.根据权利要求1所述的复合颗粒，其特征在于：所述的复合颗粒为纳米复合颗粒，平均粒径为80-150nm。

5.根据权利要求1所述的复合颗粒，其特征在于：所述的复合颗粒中所述的水凝胶的平均厚度为80-150mm，所述的脂质体的平均厚度为80-150mm。

6.根据权利要求1所述的复合颗粒，其特征在于：所述的复合颗粒中所述的水凝胶、所述的脂质体、所述的核酸的质量比为2000-3000:0.5-2:1。

7.一种根据权利要求1-6之一所述的复合颗粒的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下步骤：

（1）制备所述的脂质体；

（2）将所述的核酸包封在所述的脂质体中；

（3）制备所述的水凝胶；

（4）将包封了所述的核酸的所述的脂质体包封在所述的水凝胶中。

8.根据权利要求1-6之一所述的复合颗粒用于制备治疗胰腺癌的药物的用途。