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CN113186203B - 治疗或者预防冠状病毒病的疫苗试剂 - Google Patents

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CN113186203B CN202110109503.2A CN202110109503A CN113186203B CN 113186203 B CN113186203 B CN 113186203B CN 202110109503 A CN202110109503 A CN 202110109503A CN 113186203 B CN113186203 B CN 113186203B
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Abstract

本发明提供一种治疗或者预防冠状病毒病的疫苗试剂，该试剂包括冠状病毒抗原的mRNA片段,或者涉及改良的核酸片段用于制备冠状病毒疫苗试剂。

Description

治疗或者预防冠状病毒病的疫苗试剂
相关文件
本申请主张以下在先申请的优先权，申请号：202010090564.4；申请日2020年2 月13日；申请号：202010418211.2，申请日2020年5月18日；申请号：202010767364.8， 申请日2020年8月03日；这些文件所披露的内容作为本发明的一部分。
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种治疗和预防冠状病毒感染的疫苗或者疫苗试剂。
背景技术
该背景技术的描述仅仅是对为了方便理解本发明的内容的一般描述，不构成对本发明的任何限制。
冠状病毒感染分布在全世界多个地区,该病毒引起的感染主要发生在冬季和早春。 冠状病毒引起的人类疾病主要是呼吸系统感染，该病毒对温度很敏感，在33℃时生长良好，但35℃就使之受到抑制。由于这个特性，冬季和早春是该病毒疾病的流行季节。 冠状病毒是成人普通感冒的主要病原之一，也是成人慢性气管炎患者急性加重的重要 病原。
这就需要开发一种既可以预防也可以起到治疗作用的疫苗试剂，该试剂可以让人体或者哺乳动物产生抗体，用于抵抗冠状病毒的侵染或者治疗冠状病毒感染的人体或 者哺乳动物。
发明内容
本发明提供一种预防和治疗作用的冠状病毒疫苗试剂，该疫苗试剂既可以起到预防冠 状病毒病的作用，也可以起到治疗该疾病的效果。
一方面，本发明提供一种疫苗试剂，该试剂包括冠状病毒抗原的mRNA片段，其中所述的该mRNA片段为包含S，S1,RBD，N,E，M等抗原序列中的一段或者几段组 合。在一些方式中，所述的这些片段部分是经过人工优化或者改良过的。
这里的冠状病毒为人或者哺乳动物的冠状病毒。在一些方式中，所述的冠状病毒为严重急性呼吸综合征(SARS)、中东呼吸综合征(MERS)和新冠肺炎(COVID-19) 中的一种。在一些方式中，所述的冠状病毒病毒为HCoV-229E、HCoV-OC43、 HCoV-NL63和HCoV-HKU1中的一种或者几种。
在一些方式中，所述的mRNA序列选自SEQ NO：1.1-1.9中的一条或者几条。 在一些方式中，所述的序列为SEQ NO：1.1。在一些方式中，所述的mRNA序列经 过了核酸的修饰，修饰的比例为20-100％。在一些方式中，所述的修饰是尿苷被1- 甲基假尿嘧啶修饰。1-甲基假尿嘧啶的结构如下：
Figure BDA0002917999930000031
一些方式中，所述的修饰是尿苷被1-甲基假尿嘧啶修饰,修饰比例为50％。
在一些方式中，所述的核酸还包括帽子结构。在一些方式中，帽子结构为如下结构 ：
Figure BDA0002917999930000032
加的帽子是在5’端。在一些方式中，也可以是在3’端进行加帽。
在一些方式中，所述的核酸被包裹，所述的包裹结构包括核酸与聚合物或者蛋白混合形成的核结构。在一些方式中，所述的核结构外还包括壳结构，例如磷脂所形 成的壳结构。
另一方面，在一些方式中，本发明提供一种DNA序列，所述的DNA序列如SEQ NO：1、SEQ NO：2、SEQ NO：3、SEQ NO：4、SEQ NO：5、SEQ NO：6、SEQ NO： 7、SEQ NO：8或者SEQ NO：9所示的序列中的一条或者多条，或者与所述任意序 列之一的同源性为60％-100％,或者与之功能相同的序列。或者这些序列为互补的序列。
在一些方式中，所述的序列为SEQ NO：1，SEQ NO：2、SEQ NO：4、SEQ NO： 5、SEQ NO：8或者SEQ NO：9所示的序列中的一条或者多条；或者与之功能相同的 序列。
在一些方式中，所述的序列为SEQ NO：1所示的序列。
在一些方式中，在所述序列的5‘端还包括如SEQ NO：11所示的序列。
在一些方式中，在所述序列的5‘端还包括如SEQ NO：12所示的序列。
在一些方式中，，在所述序列的3‘端还包括如SEQ NO：13所示的序列。
在一些方式中，在所述序列的3‘端还包括如SEQ NO：14所示的序列。
在一些方式中，还包括尾巴序列。在一些优选的方式中，所述的尾巴序列为SEQNO：15所述的序列。
在一些方式中，所述的同源性为65-100％。在一些方式中，所述的同源性为 70-100％。在一些方式中，所述的同源性为71-100％。在一些方式中，所述的同源性 为73-100％。在一些方式中，所述的同源性为74-100％。在一些方式中，所述的同源 性为100％。
在一些方式中，所述与SEQ NO：1所示的序列的同源性为70-100％的序列；与 SEQNO：3所示序列的同源性为74--100％的序列；与SEQ NO：5所示序列的同源性 为70-100％的序列；与SEQ NO：6所示序列的同源性为65-100％的序列；与SEQ NO： 7所示序列的65-100％的序列；与SEQ NO：8所示序列的同源性为70-100％的序列； 或者与SEQ NO：9所述序列同源性为70-100％的序列。
另一方面，本发明提供一种RNA序列，所述的RNA序列如SEQ NO：1.1、SEQ NO：2.2、SEQ NO：3.3、SEQ NO：4.4、SEQ NO：5.5、SEQ NO：6.6、SEQ NO： 7.7、SEQ NO：8.8或者SEQ NO：9.9所示的序列中的一条或者多条，或者与所述序 列之一的同源性为60％-100％；或者与之功能相同的序列，或者与以上序列互补的序列。 在一些优选的方式中，所述的序列为SEQNO：1.1，SEQ NO：2.2、SEQ NO：4.4、 SEQ NO：5.5、SEQ NO：8.8或者SEQ NO：9.9所示的序列中的一条或者多条；或者 与所述序列之一的同源性为60％-100％。
在一些优选的方式中，所述的序列为SEQ NO：1所示的序列或者或者与所述序 列的同源性为60％-100％。在一些优选的方式中，所述的同源性为65-100％。在一些 优选的方式中，所述的同源性为75-100％。在一些优选的方式中，所述的同源性为 85-100％。在一些优选的方式中，所述的同源性为95-100％。在一些优选的方式中，， 所述的同源性为98-100％。在一些优选的方式中，其中，所述的同源性为99-100％。 在一些优选的方式中，所述的同源性为100％。
在一些优选的方式中，在所述序列的5‘端还包括如UTR序列和/或者在所述序列的3‘端还包括UTR序列。在一些方式中，在5端还包括启动子区域。在一些方式中， 所述的3端还包括尾巴结构。在一些优选的方式中，在所述序列的5‘端还包括如SEQ NO：36-1至SEQNO：36-12所示的序列中的一条。在一些优选的方式中，在所述序 列的5‘端还包括如SEQNO：36-11或者SEQ NO：36-12所示的序列。在一些优选的 方式中，在所述序列的3‘端还包括如SEQ NO：37-1至SEQ NO：37-12所示的序列 中的一条序列。在一些优选的方式中，在所述序列的3‘端还包括如SEQ NO：37-11 或者SEQ NO：37-12所示的序列。在一些方式中，在所述序列的5‘端还可以是如SEQ NO：11所示的序列。在一些方式中，在所述序列的5‘端还可以是如SEQ NO：12所 示的序列。在一些方式中，，在所述序列的3‘端还可以是如SEQ NO：13所示的序列。
在一些方式中，在所述序列的3‘端还包括如SEQ NO：14所示的序列。
在一些方式中，在3端还包括尾巴序列，所述的尾巴序列为SEQ NO：15所述的 序列。
在一些方式中，在5端的还包括启动子，在一些方式中，所述的启动子的序列为SEQ ID NO:12所示的序列。
在一些方式中，所诉的序列还包括SEQ ID NO:38或者SEQ ID NO:39所示的附加序列。在一些方式中，这些序列是在AUG核苷酸之后插入的。在一些方式中，所述 的附加序列位于5端。
在一些方式中，所述的RNA序列包括ORF序列，启动子序列，5‘端UTR序列和 /或者3‘端UTR序列。在一些方式中，所述的ORF序列包括所述的附加序列。在一 些方式中，按照从5端到3‘端的排序方式，顺次为一下方式：启动子序列-5‘端UTR 序列-ORF序列-3‘端UTR序列-尾巴序列。
另一方面，本发明提供一种冠状病毒mRNA疫苗试剂，所述的疫苗试剂包括如权 属任意方案之一的mRNA序列，或者由前述权利任意方案的DNA序列体外反转率 而获得的mRNA序列。
在一些方式中，所述的所述的mRNA包括经过修饰的核苷酸，其中修饰的核苷酸 选择如下一种或者几种核苷酸：2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲 基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、 C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺 苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、假尿 苷、N-1-甲基-假尿苷、2-硫代尿苷以及2-硫代胞苷；甲基化碱基；插入碱基；2'-氟 代核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖以及己糖；硫代磷酸基和5'-N-亚磷酰胺键。 以及PCT/CN2020/074825，PCT/CN2020/106696中所描述的改性核苷酸进行修饰。在 一些方式中，mRNA包括经过修饰的核苷酸，所述的修改核苷酸为N-1-甲基-假尿苷。
在一些方式中，所述的修饰比例为0.1％-100％。在一些方式中，所述的修饰比例为2％-90％。在一些方式中，所述的修饰比例为5％-80％。在一些方式中，所述的修 饰比例为20％-80％。在一些方式中，所述的修饰比例为40％-70％。在一些方式中， 所述的修饰比例为50％。
在一些方式中，所述的试剂还包括聚合物，该聚合物与所述的核苷酸形成纳米颗粒，所述的聚合物选自以下聚合物中的一种或者几种：聚丙烯酸酯、聚烷基氰基丙烯 酸酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己内酯、葡聚糖、白蛋白、明胶、藻 酸盐、胶原、壳聚糖、环糊精、聚乙烯亚胺、聚乙烯亚胺(PEI)、或者支化的PEI。 在一些方式中，所述的试剂还包括脂质体，所述的包括核苷酸聚合物的核结构别封装 在脂质体中形成纳米颗粒。
在一些方式中，所述的试剂还包括脂质体，所述的核苷酸被脂质体包裹形成纳米颗粒。在一些方式中，所述的脂质体选择如下脂质体的一种或者几种：阳离子脂质、 非阳离子脂质、基于甾醇的脂质、和/或PEG-改性脂质。在一些方式中，阳离子脂质 包括：C12-200、MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、cKK-E12、ICE(咪唑基)、HGT5000、 HGT5001、OF-02、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA和DMDMA、 DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、 DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA和HGT4003、或其组合。在一些方式中，所述的非阳离子脂质的非限制性实例可以包括 神经酰胺、脑磷脂、脑苷脂、二酰基甘油、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酰基甘油钠盐 (DPPG)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷 酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙 醇胺(DOPE)、1,2-二油基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸 乙醇胺(DPPE)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、和1,2-二油酰基-sn- 甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)，1-棕榈酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、1- 棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙 醇胺(SOPE)、鞘磷脂、或其组合。在一些方式中，所述的基于甾醇的阳离子脂质可 构成脂质纳米颗粒中总脂质的不超过70％。在一些方式中，所述的基于甾醇的阳离子 脂质包括磷脂酰化合物、磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、 鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂，或其组合物。在一些方式中，其中还包括PEG改性脂 质，例如DMG-PEG、DMG-PEG2K、C8-PEG、DOGPEG、神经酰胺PEG和DSPE-PEG、 或其组合。
在一些方式中，所述的疫苗试剂还包括硫酸鱼精蛋白、DOPE、DSPE-mPEG2000 和M5，所述M5的结构如下：
Figure BDA0002917999930000071
在一些方式中，所述M5:DOPE:DSPE-mPEG2000＝49:49:2(质量比)。
本发明提供一种DNA疫苗试剂，所述的试剂包括前述任意方案中的所述的 NDA序列。在一些方式中，该序列选在SEQ NO：1-9条序列中的一条或者多条。
在一方面，本发明提供一种UTR序列，所述的序列包括如SEQ NO：36-1至36-12 的5‘UTR，或者’SEQ NO：37-1至37-12的3‘UTR序列中的一条或者多条。在一些方 式中，所述的5‘序列为SEQ NO：36-11，3为SEQ NO：37-11所示的序列；或者5‘序 列为SEQ NO：36-12，3为SEQ NO：37-12所示的序列。
另一方面，本发明提供一种一种3‘端UTR序列，所述的序列包括；SEQ NO：37-11 或者SEQ NO：37-12所示的序列。
在本发明的另一方面，提供用于ORF的RNA的附加序列，所述的附加序列如SEQ NO：38或者SEQ NO：39所示的序列。在一些方式中，所述的附加序列位于5端。 在一些方式中，所述的附加序列从AUG序列插入。在一些方式中，所述的RNA的 ORF序列如前述任意方式中的任何序列之一。
附图说明
图1为质粒中DNA模板的结构示意图,表示该DNA序列包括T1启动子,UTR序列和DNA的ORF序列的连接示意图。
图2为从DNA模板转录而获得的RNA序列结构图,该图中也含有从DNA序列转录而获得的T7,UTR序列和PolyA序列。
图3位9条RNA序列采用脂质体传染细胞水平的抗原表达结果图。
图4是9种mRNA疫苗在小鼠体内免疫原性的对比，其中，PBS为空白对照，其它 都是含有不同RNA序列(ORF)的核壳结构的纳米可以在小鼠体内的免疫原性的对 比，发现有些高于空白对照，有些低于空白对照，有些没有免疫原性，即不能引起哺 乳动物产生抗体或者抗体的量或者效价低。
图5是筛选的疫苗试剂对于小鼠体重的变化影响(不同浓度COVID-19-LPP-mRNA免疫C57BL/6小鼠试验)。
图6是BALB/c小鼠抗体检测稀释曲线(对于不同剂量的疫苗试剂的)
图7是C57BL/6小鼠抗体检测稀释曲线(对于不同剂量的疫苗试剂的)。
图8特异性IgG滴度比较图(对于不同剂量的疫苗试剂的)。
图9是BALB/c小鼠中和抗体滴度曲线(对于不同剂量的疫苗试剂的))。
图10是C57BL/6小鼠中和抗体滴度曲线(对于不同剂量的疫苗试剂的)。
图11是两种小鼠中假病毒中和抗体滴度总结(对于不同剂量的疫苗试剂的)。
图12是BALB/c小鼠中和抗体滴度曲线图(对于不同剂量的疫苗试剂的)。
图13是C57BL/6小鼠中和抗体滴度曲线图(对于不同剂量的疫苗试剂的)
图14是抗体滴度总结图(对于不同剂量的疫苗试剂的)。
图15为不同抗体亚型的抗体滴度结果图(不同浓度或者不同剂量的疫苗试剂)。其中 图15A为IgM，图15B为IgG，图15C为IgM。
图16A是不同剂量COVID-LPP-mRNA免疫后小鼠抗原特异性T细胞应答水平的评价结果图。图16B为是不同剂量COVID-LPP-mRNA免疫后小鼠血清中和抗体水平的评 价结果图(斑点图)。
图17为是不同剂量COVID-LPP-mRNA免疫后小鼠血清中和抗体水平的评价结果图 。
图18COVID-19-LPP-mRNA免疫后对小鼠抵抗SARS-CoV-2感染的保护效果评价(Balb/C小鼠体重变化)
图19是COVID-19-LPP-mRNA免疫后对小鼠抵抗SARS-CoV-2感染的保护效果评价(C57鼠体重变化)。
图20是攻毒后第4天Balb/C小鼠肺组织病毒载量，其中，图20A表示RNA拷贝数 ，图20B为TCID50滴度数据比较图。
图21为攻毒后第4天C57BL/6小鼠肺组织病毒载量，其中，图21A表示RNA拷贝 数，图21B为TCID50滴度数据比较图.
图22是攻毒后第4天Balb/C小鼠肺组织病理切片(不同的实验处理，HD为高剂量(上)，LD为低剂量(中)，以及与冠状病毒对比(下))。
图23为攻毒后第4天C57BL/6小鼠肺组织病理切片(不同的实验处理，HD为高剂 量(双针DD-上)，HD为高剂量(单针SD-中上)；LD为低剂量的双针(DD)和单 针(SD)，以及与冠状病毒对比(下))。
图24为实验猴感染SARS-CoV-2后肺组织、气管、支气管中gRNA检测结果。
图25为实验猴感染SARS-CoV-2肺灌洗液中gRNA检测结果图。
图26为实验猴感染SARS-CoV-2后鼻拭子中gRNA检测结果图。
图27为实验猴感染SARS-CoV-2后咽拭子中gRNA检测结果图。
图28为编号16139的对照PBS的肺部组织切片图，可见，肺间隔局部增厚、轻度出血，淋巴细胞结节，局部血管壁增厚，腔内见血栓形成，气管管腔内见血细胞样渗出 物。
图29为编号16113的对照PBS的肺部组织切片图，可见，肺间隔轻度出血，炎细胞浸润，色素沉着，局部血管壁增厚，管腔内见血栓形成。
图30为编号16217的对照PBS的肺部组织切片图，可见，肺间隔大部增厚、轻中度出血，淋巴细胞结节，血管壁局部增厚，血管管腔内见血栓形成，气管管腔内见组织 细胞脱落物，局部碳末沉着。
图31为编号16145的疫苗组的肺部组织切片图，可见，肺泡结构相对完好，肺间隔轻中度出血，炎细胞浸润。
图32为编号16045的疫苗组的肺部组织切片图，可见，肺泡结构相对完好，肺间隔轻度增厚和少量炎性细浸润。
图33为编号16175的疫苗组的肺部组织切片图，可见，肺泡结构相对完好，肺间隔轻度增厚、出血，淋巴细胞结节。
图34为编号16249的疫苗组的肺部组织切片图，可见，肺间隔轻度增厚、轻度出血，局灶性尘细胞分布，血管充血，炎细胞浸润。
图35为天然序列编号SEQ NO：1-1-1与优化序列SEQ NO：1.1的RNA同源性比较 结果图。
图36为天然序列编号SEQ NO：2-2-2与优化序列SEQ NO：2.2的RNA同源性比较 结果图。
图37为天然序列编号SEQ NO：3-3-3与优化序列SEQ NO：3.3的RNA同源性比较 结果图。图38为天然序列编号SEQ NO：4-4-4与优化序列SEQ NO：4.4的RNA同 源性比较结果图。
图39为天然序列编号SEQ NO：5-5-5与优化序列SEQ NO：5.5的RNA同源性比较 结果图。
图40为天然序列编号SEQ NO：6-6-6与优化序列SEQ NO：7.7的RNA同源性比较 结果图。
图41为天然序列编号SEQ NO：7-7-7与优化序列SEQ NO：7.7的RNA同源性比较 结果。
图42为天然序列编号SEQ NO：8-8-8与优化序列SEQ NO：8.8的RNA同源性比较 结果图。
图43为天然序列编号SEQ NO：9-9-9与优化序列SEQ NO：9.1的RNA同源性比较 结果。
详细说明
定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语所具有的含义与本发 明所属领域的普通技术人员通常理解的相同。以下参考文献为本领域技术人员提 供了本发明中使用的许多术语的一般定义：生物化学与分子生物学词典 (Dictionary ofBiochemistry and Molecular Biology)，(第2版)J.Stenesh(编著)，Wiley-Interscience(1989)；微生物学与分子生物学词典(Dictionary of Microbiology and MolecularBiology)(第3版)，P.Singleton和D.Sainsbury(编著)， Wiley-Interscience(2007)；钱伯斯科技词典(Chambers Dictionary of Science and Technology)(第2版)，P.Walker(编著)，Chambers(2007)；遗传学词汇(Glossary of Genetics)(第5版)，R.Rieger等(编著)，Springer-Verlag(1991)；以及哈珀柯林 斯生物学词典(The HarperCollins Dictionaryof Biology)，W.G.Hale和J.P. Margham，(编著)，HarperCollins(1991)。
尽管与本文所描述的类似或等效的任何方法和组合物可用于本发明的实践或 检验，但本文描述了优选的方法和组合物。出于本发明的目的，下面为了清楚和 便于参考起见对以下术语加以定义：根据长期以来的专利法惯例，当在本申请包 括权利要求书中使用不带数量指示的指称物时，表示“一或多”。术语“约”和 “近似”用于本文中时是可互换的，并且一般应理解为是指一个给定数字周围的 数字范围，以及所叙述的数字范围内的所有数字(例如，“约5至15”意味着“约 5至约15”，除非另有说明)。此外，本文中的所有数值范围应理解为包括该范 围内的各个整数。
用于本文中时，“抗原性多肽”或“免疫原性多肽”是这样的多肽，当其被 引入脊椎动物时，与脊椎动物的免疫系统分子反应，即是抗原性的，和/或在该脊 椎动物中诱导免疫应答，即是免疫原性的。
“生物相容”是指下述物质，当暴露于活细胞时将支持细胞的适当细胞活性 而不会在细胞中引起不想要的效应如细胞生命周期的变化、细胞增殖速率的变化 或细胞毒性效应。
术语“生物功能等效”在本领域中是公知的，并且在本文中进一步详细定义。 因此，具有约85％至约90％、或更优选约91％至约95％、或甚至更优选约96％ 至约99％的核苷酸与本文提供的一种或多种核苷酸序列一致或功能等效的序列， 被特别考虑可用于本申请中阐述的方法和组合物的实践。
用于本文时，术语“缓冲剂”包括一种或多种组合物或其水溶液，当将酸或 碱添加到包含所述缓冲剂的溶液或组合物中时，所述缓冲剂抵抗pH的波动。这 种对pH变化的抗性是由于这种溶液的缓冲性质，并且可以是包含在所述组合物 中的一种或多种特定化合物的功能。因此，表现出缓冲活性的溶液或其他组合物 被称为缓冲剂或缓冲溶液。缓冲剂一般不具有无限的维持溶液或组合物的pH的 能力；而是，它们通常能够将pH维持在一定范围内，例如约5至7的pH。
用于本文时，术语“载体(carrier)”旨在包括药学上可接受用于向相关动物施 用或者如果适用的话可接受用于治疗或诊断目的的任何溶剂、分散介质、包衣、 稀释剂、缓冲剂、等渗剂、溶液、悬浮液、胶体、惰性体等，或其组合。
用于本文时，术语“DNA区段”是指已经从特定物种的总基因组DNA分离 出来的DNA分子。因此，使用本文公开的组合物之一从生物样品获得的DNA 区段是指一种或多种已经从从其获得它们的特定物种的总基因组DNA中分离出 来或纯化出来的DNA区段。术语“DNA区段”内包括DNA区段和这种区段的 较小片段，以及重组载体，包括例如质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。
术语“有效量”，用于本文时，是指能够治疗或改善疾病或病况或者能够产 生预期治疗效果的量。
用于本文时，术语“表位”是指给定免疫原性物质的一部分，通过本领域已 知的任何方法确定，所述部分是已对所述给定的免疫原性物质发动免疫应答的宿 主免疫系统的抗体或细胞表面受体的靶标，即被所述抗体或细胞表面受体结合。 进一步地，表位可以被定义为免疫原性物质的一部分，如通过本领域可利用的任 何方法所确定(参见，例如，Geysen等人，1984)，所述部分在动物中引发抗体应 答或诱导T细胞应答。表位可以是任何免疫原性物质的一部分，所述免疫原性物 质例如蛋白质、多核苷酸、多糖、有机或无机化学物质或其任何组合。术语“表 位”也可以与“抗原决定簇”或“抗原决定簇位点”可互换地使用。
术语“例如”用于本文时仅用于举例而非意图限制，并且不应被解释为仅仅 是指在说明书中明确列举的那些项。
用于本文时，“异源的”是相对于预定的参考核酸序列定义的。例如，对于 结构基因序列，异源启动子被定义为不会与所述参考结构基因相邻地天然存在、 但通过实验室操作将其放置的启动子。同样地，异源基因或核酸区段被定义为不 会与参考启动子和/或增强子元件相邻地天然存在的基因或区段。
用于本文时，当提及多核苷酸时，“同源的”是指尽管来自不同来源，但具 有相同的或者基本相同的核苷酸序列的序列。通常，同源核酸序列源自于具有一 个或多个基本相似的基因组序列的密切相关的基因或生物体。相反，“同功的(analogous)”多核苷酸是与来自不同物种或生物体的多核苷酸共有相同功能、 但可具有明显不同的一级核苷酸序列的多核苷酸，其编码一种或多种实现相似功 能或具有相似生物活性的蛋白质或多肽。同功多核苷酸经常可以源自于两种或更 多种(例如，遗传上或系统发育上)不密切相关的生物体。
用于本文时，术语“同源性”是指两个或更多个多核苷酸或多肽序列之间的 互补性程度。当第一核酸或氨基酸序列具有与第二核酸或氨基酸序列完全相同的 一级序列时，词语“同一性”可以代替词语“同源性”。序列同源性和序列同一 性可通过使用本领域已知的算法和计算机程序分析两个或更多个序列来确定。这 样的方法可用于评估给定序列是否与另一选定序列具有同一性或同源性。
在两个或更多个核酸或多肽序列的环境下，术语“同一”或“同一性”百分 比是指当使用下面描述的序列比较算法之一(或普通技术人员可用的其他算法)或 通过视觉检查测量进行比较和比对最大对应性时，两个或更多个序列或子序列相 同或具有特定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸。
用于本文时，短语“需要治疗”是指由护理人员例如医生或兽医做出的判断， 患者需要(或将以一种或多种方式受益于)治疗。这样的判断可以基于护理人员的 专业知识领域中的各种因素做出，并且可以包括下述认识，即患者因可由一种或 多种化合物或药物组合物例如本文陈述的那些进行治疗的疾病状态而抱病。
短语“分离的”或“生物纯的”是指物质基本上或实质上不含在天然状态下 通常伴随该物质存在的组分。因此，根据本公开的分离的多核苷酸或多肽优选不 含在它们的天然或原位环境中通常与那些多核苷酸或多肽关联的物质。
用于本文时，术语“试剂盒”可用于描述便携式自备外壳的变体，其包括至 少一组本发明的试剂、组分或药学上配制的组合物。任选地，这样的试剂盒可包 括一套或多套说明书，所述说明书关于，例如在实验室或临床应用中，使用所封 装的组合物。
“联接”或“接合”是指本领域已知的用于功能性连接一种或多种蛋白质、 肽、核酸或多核苷酸的任何方法，包括但不限于重组融合、共价键合、二硫键键 合、离子键合、氢键键合、静电键合等。
本文所用的术语“天然存在”在应用于物体时是指物体可以在自然界中存在 的事实。例如，存在于生物体(包括病毒)中、能够从自然界中的来源分离并且未 在实验室中经人工有意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。用于本文时， 已经根据经典遗传学选择性繁殖的啮齿动物实验室品种被认为是天然存在的动 物。
用于本文时，术语“核酸”包括以下的一种或多种类型：多脱氧核糖核苷酸 (含有2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)以及任何其他类型的多核苷酸， 其是嘌呤或嘧啶碱基或者修饰的嘌呤或嘧啶碱基(包括无碱基位点)的N-糖苷。术 语“核酸”，用于本文时，也包括核糖核苷或脱氧核糖核苷的共价键合的聚合物， 所述共价键合通常通过亚基之间的磷酸二酯键，但在有些情况下通过硫代磷酸酯、 甲基膦酸酯等键合。“核酸”包括单链和双链DNA以及单链和双链RNA。示例 性核酸包括但不限于gDNA；hnRNA；mRNA；rRNA，tRNA，微小RNA(miRNA)， 小干扰RNA(siRNA)，小核仁RNA(snoRNA)，小核RNA(snRNA)和小时序 RNA(stRNA)等，及其任何组合。
术语“可操作地联接”，用于本文时，是指所联接的核酸序列通常是邻接的 或基本上邻接的，并且在需要接合两个蛋白质编码区的情况下，是邻接的并且在 阅读框内。然而，由于增强子一般在与启动子分隔数千碱基时起作用，并且内含 子序列可以具有可变长度，因此一些多核苷酸元件可以可操作地联接但不邻接。
用于本文时，术语“患者”(也可互换地称为“接受者”、“主体”、“宿主” 或“对象”)是指可作为本文所论述的一种或多种血管进入装置的接受者的任何 宿主。在某些方面，所述接受者将是脊椎动物，其旨在表示任何动物物种(并且 优选地，哺乳动物物种，例如人类)。在某些实施方式中，“患者”是指任何动 物宿主，包括但不限于，人类和非人类灵长类动物、禽类、爬行动物、两栖动物、 牛、犬、山羊(caprines)、cavines、乌鸦、epines、马属动物、猫科动物、山羊(hircines)、 兔、野兔(leporines)、狼(lupines)、鼠科动物、绵羊、猪、racines、狐狸等，包括 但不限于家养的牲畜、放牧或迁徙的动物或鸟类、外来或动物园样本以及伴侣动 物、宠物和任何受执业兽医护理的动物。
短语“可药用的”是指当施用于人时，特别是当施用于人眼时，不产生过敏 或类似的不良反应的分子实体和组合物。含有蛋白质作为活性成分的水性组合物 的制备在本领域中是公知的。通常，将这样的组合物制备成注射剂，或作为液体 溶液或作为悬液。或者，它们可以被制备成适合在注射前溶解或悬浮于液体中的 固体形式。
用于本文时，“可药用盐”是指保留想要的母体化合物生物活性并且不产生 任何不想要的毒理学效应的盐。这样的盐的实例包括但不限于与无机酸例如盐酸、 氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等形成的酸加成盐；以及与有机酸例如乙酸、草酸、 酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡萄糖酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、苯 甲酸、鞣酸、扑酸(亚甲基双羟萘酸)、藻酸、萘甲酸、聚谷氨酸、萘磺酸、萘二 磺酸、聚半乳糖醛酸形成的盐；与多价金属阳离子例如锌、钙、铋、钡、镁、铝、 铜、钴、镍、镉等的盐；与由N,N'-二苄基乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子形 成的盐；及其组合。
用于本文时，术语“质粒”或“载体(vector)”是指由遗传物质(即核酸)组成 的遗传构建体。通常，质粒或载体含有在细菌宿主细胞、例如大肠杆菌中有功能 的复制起点，以及用于检测包含所述质粒的细菌宿主细胞的选择性标志。本发明 的质粒和载体可包括一个或多个如本文所述的遗传元件，安排所述遗传元件使得 插入的编码序列可在合适的表达细胞中转录和翻译。另外，所述质粒或载体可包 括一个或多个核酸区段、基因、启动子、增强子、激活子、多克隆区或其任何组 合，包括从一种或多种天然和/或人工来源获得或衍生的区段。
用于本文时，术语“多肽”旨在包涵单数“多肽”以及复数“多肽”，并且 包括两个或更多个氨基酸的任何链。因此，用于本文时，包括但不限于“肽”、 “二肽”、“三肽”、“蛋白质”、“酶”、“氨基酸链”和“连续氨基酸序列” 的术语都包涵在“多肽”的定义内，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任 何一个或者可以与这些术语中的任何一个可互换地使用。该术语还包括已经历一 种或多种翻译后修饰或通过包含一种或多种非天然存在的氨基酸进行修饰的多 肽，所述翻译后修饰包括，例如但不限于，糖化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、衍 生化、蛋白水解切割、翻译后加工。本领域中存在对于多核苷酸和多肽结构的常 规命名法。
例如，一字母和三字母缩写被广泛用于描述氨基酸：丙氨酸(A；Ala)，精氨 酸(R；Arg)，天冬酰胺(N；Asn)，天冬氨酸(D；Asp)，半胱氨酸(C；Cys)，谷 氨酰胺(Q；Gln)，谷氨酸(E；Glu)，甘氨酸(G；Gly)，组氨酸(H；His)，异亮 氨酸(I；Ile)，亮氨酸(L；Leu)，甲硫氨酸(M；Met)，苯丙氨酸(F；Phe)，脯 氨酸(P；Pro)，丝氨酸(S；Ser)，苏氨酸(T；Thr)，色氨酸(W；Trp)，酪氨酸 (Y；Tyr)，缬氨酸(V；Val)，和赖氨酸(K；Lys)。本文所述的氨基酸残基优选 是“1”异构形式。然而，“d”异构形式的残基可以取代l氨基酸残基，条件是 保留想要的多肽性质。
用于本文时，术语“预防”和“抑制”用于本文时是指在疾病状态的临床症 状发作之前施用单独的或包含在药物组合物中的化合物，以阻止所述疾病状态的 任何症状、方面或特征。这样的预防和抑制不需要是绝对被认为是医学上有用的。
“蛋白质”在本文中可与“肽”和“多肽”互换使用，并包括合成、重组或 体外产生的肽和多肽二者，以及在将核酸序列施用于宿主动物或人类对象后在体 内表达的肽和多肽。术语“多肽”优选意指任何氨基酸链长度，包括长度从约2 至约20个氨基酸残基的短肽，长度从约10至约100个氨基酸残基的寡肽，以及 包括长度约100个氨基酸残基或更多的更长的多肽。此外，该术语还旨在包括酶， 即包括至少一种氨基酸聚合物的功能性生物分子。本发明的多肽和蛋白质也包括 被翻译后修饰或已经被翻译后修饰的多肽和蛋白质，并且包括添加到主链氨基酸 链中的任何糖或其他衍生物或缀合物。
“纯化”，用于本文时，意味着与许多其他化合物或实体分开。化合物或实 体可以是部分纯化的、基本纯化的或纯的。当化合物或实体从基本上所有其他化 合物或实体中除去时，其被认为是纯的，即优选至少约90％，更优选至少约91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％，或大于99％纯。部分或基本 上纯化的化合物或实体可以除去天然与其一起存在的物质例如细胞物质如细胞 蛋白质和/或核酸的至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。
术语“重组”表明通过人为干预人工或(非天然)合成改变的物质(例如，多核 苷酸或多肽)。所述改变可以对在其自然环境或天然状态下的物质进行，或对从 其自然环境或天然状态移除的物质进行。具体地，例如，当启动子序列通过表达 被人工工程化的核酸区段而产生时，它是“重组的”。例如，“重组核酸”是通 过在例如克隆、DNA改组或其他程序期间的核酸重组、或通过化学或其他诱变 制成的；“重组多肽”或“重组蛋白质”是通过重组核酸的表达而产生的多肽或 蛋白质；以及“重组病毒”，例如重组AAV病毒，是通过重组核酸的表达而产 生的。
术语“调节元件”，用于本文时，是指调节转录的核酸序列的区域。示例性 调节元件包括但不限于增强子、转录后元件、转录控制序列等。
术语“RNA区段”是指已经从特定物种的总细胞RNA分离的RNA分子。 因此，RNA区段可以指一种或多种已经从其他RNA分离出来或纯化出来的RNA 区段(天然或合成来源)。术语“RNA区段”包括RNA区段和这种区段的较小片 段。
当提及氨基酸时，术语“序列”涉及给定氨基酸链、例如多肽或蛋白质内氨 基酸的线性N-末端至C-末端顺序的全部或一部分；“子序列”意指序列内任何 连续的氨基酸段，例如给定蛋白质或多肽序列内的至少3个连续氨基酸。关于核 苷酸链，“序列”和“子序列”具有与5'至3'核苷酸顺序相关的相似含义。
术语“基本上如SEQ ID NO：X所示的序列”是指该序列基本上对应于SEQ ID NO：X的一部分并且有相对很少的核苷酸(或在多肽序列的情况下为氨基酸) 与SEQ ID NO：X的核苷酸(或氨基酸)不一致或为SEQ ID NO：X的核苷酸(或氨 基酸)的生物学功能等效物。术语“生物学功能等效物”在本领域中是公知的， 并且在本文中进一步详细定义。因此，具有约65％至约90％、或更优选约85％ 至约95％、或甚至更优选约96％至约99％的核苷酸与本文提供的一种或多种核苷 酸序列一致或功能等效的序列，被特别考虑可用于本发明的实践。在提到如某种 编号序列所示的序列的时候，也包括该序列互补的序列。例如如SEQ IDNO：X 所示的序列，不仅包括该序列本身的序列特征，也自然包括与该序列互补的序列 特征，这里的“互补”表示基本上所有的序列都是一一对应关系，按照生物学基 本常识下的互补序列。例如如如SEQ ID NO：X表示的是DNA序列，也自然包 括与该序列互补的另外一条DNA序列，除非明确排除另一条序列。
用于本发明的适合的标准核酸杂交条件包括，例如，在50％甲酰胺、5×邓波 特(Denhardt’s)溶液、5×SSC、25mM磷酸钠、0.1％SDS和100μg/mL变性鲑鱼 精子DNA中在42℃下杂交16小时，然后用0.1×SSC、0.1％SDS溶液在60℃ 下连续洗涤1小时以除去要求量的背景信号。严格性较低的本发明杂交条件包括， 例如，在35％甲酰胺、5×邓波特溶液、5×SSC、25mM磷酸钠、0.1％SDS和100μg/mL变性鲑鱼精子DNA或大肠杆菌DNA中在42℃下杂交16小时，然后 用0.8×SSC、0.1％SDS在55℃下连续洗涤。本领域普通技术人员将认识到，可以容易地调节这样的杂交条件以获得针对特定应用的所需严格性水平。
用于本文时，术语“结构基因”旨在一般性描述被表达而产生所编码的肽、 多肽、蛋白质、核酶、催化性RNA分子或反义分子的多核苷酸，例如基因。
术语“对象”，用于本文时，描述了可以对其提供使用本发明组合物的治疗 的生物体，包括哺乳动物例如灵长类动物。可以从所公开的治疗方法中受益的哺 乳动物物种包括但不限于，猿；黑猩猩；猩猩；人类；猴子；家养动物例如狗和 猫；牲畜例如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；以及其他动物，例如小鼠、大鼠、 豚鼠和仓鼠。
术语“基本互补”，当用于定义氨基酸或核酸序列时，意指特定的目标序列， 例如寡核苷酸序列，与选定序列的全部或一部分基本互补，并因此将与编码所述 选定序列的mRNA的一部分特异性结合。因此，通常所述序列将与mRNA“靶” 序列高度互补，并且在所述序列的互补部分中将具有不超过约1、约2、约3、约 4、约5、约6、约7、约8、约9、或约10个等的碱基错配。在许多情况下，可 能希望所述序列是精确匹配的，即与所述寡核苷酸特异性结合的序列完全互补， 因此沿互补链段具有零错配。因而，高度互补的序列通常将相当特异性地与 mRNA的靶序列区域结合，因此将会高效地降低和/或甚至抑制靶mRNA序列翻 译成多肽产物。
基本互补的核酸序列将与和所述核酸特异性结合的相应核酸靶序列大于约 80％互补(或“％精确匹配”)，并将更优选与和所述核酸特异性结合的相应靶序 列大于约85％互补。在某些方面，如上所述，将会希望具有甚至更基本互补的核 酸序列以用于本发明的实践，并且在这样的情况下，所述核酸序列将与和所述核 酸特异性结合的相应靶序列大于约90％互补，并且在某些实施方式中可以与和所 述核酸特异性结合的相应靶序列大于约95％互补，并且甚至高达并包括与和所设 计的核酸特异性结合的靶序列的全部或部分约96％、约97％、约98％、约99％ 和甚至约100％的精确匹配互补。
任何所公开的核酸序列的相似性百分比或互补百分比可以，例如，通过使用 可从威斯康星大学遗传学计算机小组(University of Wisconsin Genetics Computer Group，UWGCG)获得的GAP计算机程序6.0版比较序列信息来确定。GAP程序 利用Needleman和Wunsch的比对方法(1970)。简而言之，GAP程序将相似性定 义为相似的比对符号(即，核苷酸或氨基酸)的数量除以两个序列的较短序列中的 符号总数。GAP程序的优选默认参数包括：(1)核苷酸的一元比较矩阵(包含表示 同一性的值1和表示非同一性的值0)，和Gribskov和Burgess的加权比较矩阵 (1986)，2)每个间隙的罚分为3.0并且每个间隙中每个符号的额外0.10罚分；以 及(3)末端间隙没有罚分。
自然，本发明也包括与至少一种或多种本文具体阐述的特定核苷酸序列互补、 本质互补和/或基本互补的核酸区段。“互补”的核酸序列是能够根据标准 Watson-Crick互补规则进行碱基配对的核酸序列。用于本文时，术语“互补序列” 是指基本互补的核酸序列，这可以通过上文阐述的相同核苷酸比较来评估，或定 义为能够在比较严格的条件、例如上面刚刚描述的那些条件下与一种或多种本文 公开的特定核酸区段杂交。
用于本文时，与组分的量有关的术语“基本不含”或“本质不含”优选是指 组合物含有小于约10重量％、优选小于约5重量％、更优选小于约1重量％的某 种化合物。在优选的实施方式中，这些术语是指小于约0.5重量％、小于约0.1 重量％或小于约0.01重量％。
用于本发明的探针和引物可具有任何合适的长度。通过为序列分配数值，例 如，第一个残基是1，第二个残基是2等，可以提出限定给定序列内含有的所有 探针或引物的算法：n至n+y，其中n是从1到序列的最后一个数的整数，y是 探针或引物的长度减去1，其中n+y不超过序列的最后一个数。因此，对于25 个碱基对的探针或引物(即“25聚体”)而言，探针或引物的集合在序列的整个长 度上对应于碱基1至25、碱基2至26、碱基3至27、碱基4至28等等。类似地， 对于35个碱基对的探针或引物(即“35聚体”)而言，示例性的引物或探针序列 包括但不限于在序列的整个长度上对应于碱基1至35、碱基2至36、碱基3至 37、碱基4至38等等的序列。同样地，对于40聚体而言，这样的探针或引物可 以对应于从第一个碱基对到bp 40、从序列的第二个bp到bp 41、从第三个bp到 bp 42等等的核苷酸，而对于50聚体而言，这样的探针或引物可以对应于从bp 1 至bp 50、从bp 2至bp 51、从bp 3至bp 52、从bp4至bp 53延伸的核苷酸序列， 等等。
术语“基本对应于”、“基本同源的”或“基本同一性”，用于本文时，表 示核酸或氨基酸序列的特征，其中选定的核酸或氨基酸序列与选定的参考核酸或 氨基酸序列相比具有至少约70或约75％的序列同一性。更通常地，所述选定的 序列和参考序列将具有至少约76、77、78、79、80、81、82、83、84或甚至85％ 的序列同一性，更优选至少约86、87、88、89、90、91、92、93、94或95％的 序列同一性。还更优选地，高度同源序列在选定的序列和与它作比较的参考序列 之间经常共有大于至少约96、97、98或99％的序列同一性。
用于本文时，“合成的”应该是指该物质不是人类或动物来源的。
术语“治疗实践期”是指一种或多种活性剂对于治疗有效所必需的时间周期。 术语“治疗有效”是指降低一种或多种症状的严重性和/或频率，消除一种或多种 症状和/或潜在病因，预防症状和/或其潜在病因的发生，以及改善或修复损伤。
“治疗剂”可以是任何生理或药理活性物质，其可以在对象的靶向部位产生 期望的生物效应。所述治疗剂可以是化疗剂、免疫抑制剂、细胞因子、细胞毒性 剂、核溶解化合物、放射性同位素、受体和前药活化酶，其可以是天然存在的或 通过合成或重组方法产生的或其任何组合。受经典多药耐药影响的药物，例如长 春花生物碱(例如长春碱和长春新碱)、蒽环霉素(例如多柔比星和柔红霉素)、RNA 转录抑制剂(例如放线菌素-D)和微管稳定药物(例如紫杉醇)，可具有作为治疗剂 的特定用途。细胞因子也可用作治疗剂。这样的细胞因子的实例是淋巴因子、单 核因子和传统的多肽激素。癌症化疗剂可以是优选的治疗剂。对于抗癌剂和其他 治疗剂的更详细描述，本领域技术人员可参考许多指导性手册，包括但不限于， 医师案头参考(Physician's Desk Reference)以及Goodman和Gilman的“治疗学的 药理基础(Pharmacological Basis of Therapeutics)”，第十版，Hardman等(编著) (2001)。
用于本文时，“转录因子识别位点”和“转录因子结合位点”是指多核苷酸 序列或序列基序，其被鉴定为是一个或多个转录因子的序列特异性相互作用的位 点，经常采取直接蛋白质-DNA结合的形式。通常，转录因子结合位点可以通过DNA足迹法、凝胶迁移率变动分析等鉴定，和/或可以基于已知的共有序列基序 或通过本领域普通技术人员已知的其他方法预测。
转录调节元件”是指单独或与一种或多种其他核酸序列组合来激活转录的多 核苷酸序列。转录调节元件可以，例如，包含一个或多个启动子、一个或多个响 应元件、一个或多个负调节元件和/或一个或多个增强子。
“转录单元”是指包含至少第一结构基因的多核苷酸序列，所述第一结构基 因与至少第一顺式作用启动子序列可操作地联接并任选与有效转录所述结构基 因序列所必需的一个或多个其他顺式作用核酸序列可操作地联接，以及如可能是 将所述结构基因序列的适当组织特异性和发育性转录可操作地置于启动子和/或 增强子元件控制下所需要的至少第一远端调节元件，以及有效转录和翻译所必需 的任何另外的顺式序列(例如，多腺苷酸化位点，mRNA稳定性控制序列等)。
用于本文时，术语“转化”旨在一般性地描述将外源多核苷酸序列(例如，病 毒载体、质粒或重组DNA或RNA分子)引入宿主细胞或原生质体中的方法，在 所述宿主细胞或原生质体中所述外源多核苷酸并入至少第一染色体中或能够在 转化的宿主细胞内自主复制。转染、电穿孔和“裸”核酸摄取都表示用于用一种 或多种多核苷酸转化宿主细胞的技术的实例。
用于本文时，术语“转化细胞”意指已通过将一种或多种外源多核苷酸引入 该细胞而改变其核酸互补的宿主细胞。
“治疗”用于本文时是指向对象提供任何类型的医疗或手术管理。治疗可包 括但不限于向对象施用包含治疗剂的组合物。“治疗”包括为了诸如治愈、逆转、 缓解、减轻疾病、病症或病况或者疾病、病症或病况的一种或多种症状或表现的 严重性、抑制其进展或降低其可能性的目的而向对象施用或应用本发明的化合物 或组合物。在某些方面，本发明的组合物也可以被预防性施用，即，在病况的任 何症状或表现形成之前施用，其中这样的预防是有保证的。通常，在这样的情况 下，所述对象将是由于家族史、病历或完成一项或多项指示随后产生这样的疾病 或病症的倾向性的诊断或预后检验而被诊断为“有风险”产生这样的疾病或病 症的对象。
术语“载体(vector)”用于本文时是指核酸分子(通常由DNA组成)，其能够在 宿主细胞中复制和/或可以与另一核酸区段在操作上联接从而引起相连区段的复 制。质粒、粘粒或病毒是示例性的载体。
如应用于来自所公开的疫苗递送组合物的活性剂的释放动力学的表述“零级” 或“接近零级”，旨在包括在施用所述组合物后的治疗实践时间周期内所述活性 剂以受控方式释放的速率，以此达到所述活性剂的治疗有效性血浆浓度。
在某些实施方式中，将本发明的一种或多种核酸区段与合适的可检测标志( 即“标记物”)组合使用将是有利的，例如在杂交分析中使用标记的多核苷酸探针确 定给定的靶序列的存在的情况下。本领域已知多种适当的指示剂化合物和组合物 用于标记寡核苷酸探针，包括但不限于荧光配体、放射性配体、酶配体或其他配 体，例如亲和素/生物素等，它们能够在合适的分析中被检测到。在具体的实施方 案中，也可以使用一种或多种荧光标记物或酶标签，例如脲酶、碱性磷酸酶或过 氧化物酶，代替放射性或其他环境上不太理想的试剂。在酶标签的情况下，已知 比色、显色或荧光指示剂底物可用于提供人眼可见或通过分析方法如闪烁扫描、 荧光测定法、分光光度测定法等来检测样品的方法，以鉴定与含有一种或多种互 补或基本互补的核酸序列的样品的特异性杂交。在同时或依次检测两种或更多种 标记探针的所谓“多重”分析情况下，可能需要用具有第一检测性质或参数(例如， 发射和/或激发光谱最大值)的第一标记物标记第一寡核苷酸探针，其也用具有不 同的(即与第一标记物不相关或可辨别)的第二检测性质或参数的第二标记物标记 第二寡核苷酸。多重分析的使用，特别是在遗传扩增/检测方案的环境下，是分子 遗传学领域的普通技术人员所公知的。
核酸
术语“核酸”包括任何可以掺入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。根据本申请使用 的示例性核酸包括但不限于DNA，RNA包括信使mRNA(mRNA)、其杂交体、RNAi 诱导剂、RNAi剂、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、核酶、催化DNA、诱导 三螺旋形成的RNA、适体、载体等，在本申请中详细描述。
术语“脱氧核糖核酸”、“DNA”或“DNA分子”是指由两条链(多核苷酸)组成的分子，每 条链包含单体单元核苷酸。核苷酸通过一个核苷酸的糖与下一个核苷酸的磷酸基之间的共价键在链中彼此连接，产生交替的糖-磷酸基骨架。两条分开的多核苷酸链的含氮 碱基与氢键结合在一起以制备双链DNA。
术语“核糖核酸”、“RNA”或“RNA分子”是指至少2个碱基-糖基-磷酸基组合串 成的链。在一个实施例中，术语包括由核苷酸组成的化合物，其中糖部分是核糖。在 另一个实施例中，末端包括其中主链被改性的RNA和RNA衍生物。在一个实施例中， RNA可能是以tRNA(转移RNA)、snRNA(小核RNA)、rRNA(核糖体RNA)、mRNA( 信使RNA)、反义RNA、小抑制RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)和核酶的形式 存在。siRNA和miRNA的用途已有描述(Caudy A Aet al,Genes&Devel16: 2491-96andreferencescitedtherein)。另外，这些形式的RNA可以是单链、双链、三链 或四链的绞合。在另一实施例中，术语也包括其他类型的主链但具有相同碱基的人造核 酸。在另一实施例中，人造核酸为PNA(肽核酸)。PNA含有肽主链和核苷酸碱基，并且 能够在另一实施例中与DNA和RNA分子结合。在另一实施例中，核苷酸为改性氧杂 环丁烷。在另一实施例中，通过用硫代磷酸基键取代一个或以上磷酸二酯键来改性核苷酸。在另一实施例中，改性核酸包括本领域已知的天然核酸的磷酸基主链的任何其 他变体。本领域普通技术人员熟悉硫代磷酸基核酸和PNA的用途，其描述，例如， Neilsen P E，CurrOpin Struct Biol 9：353-57；[0280]and Raz N Ket al BiochemBiophys ResCommun.297:1075-84。核酸的生产和使用是本领域技术人员熟知的，其描述，inMolecularCloning,(2001),SambrookandRussell,eds.andMethodsinEnzymology:Methodsf ormolecularcloningin eukaryotic cells(2003)Purchio and G.C.Fareed每个核酸衍生物代 表本发明的单独实施例。
修饰核酸
本文披露了一种修饰核酸，例如mRNA，及其合成方法。根据本申请使用的核酸 可根据任何现有技术，包括但不限于化学合成、酶促合成，通常是较长前体的末端体 外转录、酶促或化学切割等。合成RNA的方法是本领域熟知的(参见，例如，盖特, M.J.(Gait,M.J.)(编辑)寡核苷酸合成：一种实用的方法(Oligonucleotide synthesis ：a practicalapproach)，牛津[牛津郡]，华盛顿，哥伦比亚特区：IRL出版社，1984 ；以及赫德威金，P.(Herdewijn,P.)(编辑)寡核苷酸合成：方法和应用(Oligonucleotide synthesis：methodsandapplications)，分子生物学方法(Methods in Molecular Biology )，v.288(克利夫顿，新泽西州)托托华，新泽西州：胡玛娜出版社(Humana Press )，2005；两篇都是通过引用完整的并入本申请)。mRNA可以用包括RNA聚合酶、 线性DNA模板以及RNA聚合酶反应缓冲液(例如，核苷酸如核糖核苷酸)的反应混 合物产生。美国专利公布US20120195936和国际公布WO2011012316披露了RNA的 用途，这两篇文献的全部内容通过引用并入本申请。RNA聚合酶反应缓冲液通常包 括盐/缓冲剂，例如Tris、HEPES、硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾、 磷酸钠、氯化钠以及氯化镁。反应混合物的pH可以为约6至8.5、6.5至8.0、7.0至 7.5，并且在一些实施例中，pH为7.5。在一个实例中，反应混合物包括浓度范围为 1-10mM的NTP、浓度范围为0.01-0.5mg/ml的DNA模板以及浓度范围为 0.01-0.1mg/ml的RNA聚合酶，例如，反应混合物包括浓度为5mM的NTP、浓度为 0.1mg/ml的DNA模板和浓度为0.05mg/ml的RNA聚合。在一些方式中，所述的DNA 模板是经过优化或者改性的，与天然的DNA存在差异，这种差异体现在同源性分析 上的差异。这种经过修改后的DNA来体外反转率形成优化的序列。在一些方式中， 优化的DNA序列是双链，也可以是体外合成的单链序列。这种优化或者改良的DNA 序列与天然序列的同源性小于40％，或者小于45％，小于50％，小于55％，小于58％ ，小于60％，小于65％，小于70％，小于69％，小于75％，小于77％，小于78％， 小于80％，小于90％或者小于95％。甚至可以认为，优化的DNA序列与天然序列虽 然从同源性上仅仅小于95-99.9％，改变1-2个核苷酸，但是功能上确具有差异，也作 为本发明的一个实施方式。
类似的道理，优化或者改良的DNA所翻译或者转录的RNA序列与天然的RNA 序列的同源性小于小于40％，或者小于45％，小于50％，小于55％，小于58％，小 于60％，小于65％，小于70％，小于69％，小于75％，小于77％，小于78％，小于 80％，小于90％或者小于95％。甚至可以认为，优化的RNA序列与天然序列虽然从 同源性上仅仅小于95-99.9％，改变1-2个核苷酸，但是功能上确具有差异，也作为本 发明的一个实施方式。
根据本发明，天然存在的或修饰核苷和/或核苷酸，或者优化的核苷酸可以用于制备修饰核酸，例如修饰mRNA。例如，修饰mRNA可包括一种或以上天然核苷( 例如，腺苷、鸟苷、胞苷、尿苷)；修饰核苷(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷 、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2- 氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、 C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O (6)-甲基鸟嘌呤、假尿苷、(例如，N-1-甲基-假尿苷)、2-硫代尿苷以及2-硫代胞苷 )；化学修饰碱基；生物修饰碱基(例如，甲基化碱基)；插入碱基；修饰糖(例如， 2'-氟代核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖以及己糖)；修饰磷酸基基团(例如硫代 磷酸基和5'-N-亚磷酰胺键)，或其任意组合。这些经过修饰的核苷酸可以是天然的核 苷酸，也可以是经过人工优化或者改良的核苷酸。
RNA分子(例如，mRNA)可以包括至少两种核苷酸。核苷酸可以是天然存在 的核苷酸或修饰核苷酸。在一些实施例中，RNA分子包括约5种核苷酸至约5,000种 核苷酸。在一些实施例中，RNA分子包括至少约5种核苷酸。在一些实施例中，RNA 分子包括至多约5,000种核苷酸。在一些实施例中，RNA分子包括约5种核苷酸至约 20种核苷酸、约5种核苷酸至约40种核苷酸、约5种核苷酸至约60种核苷酸、约5 种核苷酸至约80种核苷酸、约5种核苷酸至约100种核苷酸、约5种核苷酸至约200 种核苷酸、约5种核苷酸至约500种核苷酸、约5种核苷酸至约1,000种核苷酸核苷 酸、约5种核苷酸至约2,000种核苷酸、约5种核苷酸至约5,000种核苷酸、约20种 核苷酸至约40种核苷酸、约20种核苷酸至约60种核苷酸、约20种核苷酸至约80 种核苷酸、约20种核苷酸至约100种核苷酸、约20种核苷酸至约200种核苷酸、约 20种核苷酸至约500种核苷酸、约20种核苷酸至约1,000种核苷酸、约20种核苷酸 至约2,000种核苷酸、约20种核苷酸至约5,000种核苷酸、约40种核苷酸至约60种 核苷酸、约40种核苷酸至约80种核苷酸、约40种核苷酸至约100种核苷酸、约40 种核苷酸至约200种核苷酸、约40种核苷酸约500种核苷酸、约40种核苷酸至约1,000 种核苷酸、约40种核苷酸至约2000种核苷酸、约40种核苷酸至约5,000种核苷酸、 约60种核苷酸至约80种核苷酸、约60种核苷酸至约100种核苷酸、约60种核苷酸 至约200种核苷酸、约60种核苷酸至约500种核苷酸、约60种核苷酸至约1,000种 核苷酸、约60种核苷酸至约2,000种核苷酸、约60种核苷酸至约5,000种核苷酸、 约80种核苷酸至约100种核苷酸、约80种核苷酸至约200种核苷酸、约80种核苷 酸至约500种核苷酸、约80种核苷酸至约1,000种核苷酸、约80种核苷酸至约2,000 种核苷酸、约80种核苷酸至约5,000种核苷酸、约100种核苷酸至约200种核苷酸、 约100种核苷酸至约500种核苷酸、约100种核苷酸至约1,000种核苷酸、约100种 核苷酸至约2000种核苷酸、约100种核苷酸至约5,000种核苷酸、约200种核苷酸至 约500种核苷酸、约200种核苷酸至约1,000种核苷酸、约200种核苷酸至约2000 种核苷酸、约200种核苷酸约5000种核苷酸、约500种核苷酸至约1,000种核苷酸、 约500种核苷酸至约2000种核苷酸、约500种核苷酸至约5,000种核苷酸、约1,000 种核苷酸以约2000种核苷酸、约1,000种核苷酸至约5,000种核苷酸或约2000种核 苷酸至约5,000种核苷酸。在一些实施例中，RNA分子包括约5种核苷酸、约20种 核苷酸、约40种核苷酸、约60种核苷酸、约80种核苷酸、约100种核苷酸、约200 种核苷酸、约500种核苷酸、约1,000种核苷酸、约2000种核苷酸或约5000种核苷 酸。
RNA分子(例如，mRNA)可以包括至少一种本申请所述的修饰核苷酸。在一 些实施例中，RNA分子包括约1种修饰核苷酸至约100种修饰核苷酸。在一些实施 例中，RNA分子包括至少约1种修饰核苷酸。在一些实施例中，RNA分子包括至多 约100种修饰核苷酸。在一些实施例中，RNA分子包括约1种修饰核苷酸至约2种 修饰核苷酸、约1种修饰核苷酸至约3种修饰核苷酸、约1种修饰核苷酸至约4种修 饰核苷酸、约1种修饰核苷酸至约5种修饰核苷酸、约1种修饰核苷酸至约10种修 饰核苷酸、约1种修饰核苷酸至约20种修饰核苷酸、约1种修饰核苷酸至约100种 修饰核苷酸、约2种修饰核苷酸至约3种修饰核苷酸、约2种修饰核苷酸至约4种修 饰核苷酸、约2种修饰核苷酸至约5种修饰核苷酸、约2种修饰核苷酸至约10种修 饰核苷酸、约2种修饰核苷酸至约20种修饰核苷酸、约2种修饰核苷酸至约100种 修饰核苷酸、约3种修饰核苷酸至约4种修饰核苷酸、约3种修饰核苷酸至约5种修 饰核苷酸、约3种修饰核苷酸至约10种修饰核苷酸、约3种修饰核苷酸至约20种修 饰核苷酸、约3种修饰核苷酸至约100种修饰核苷酸、约4种修饰核苷酸至约5种修 饰核苷酸、约4种修饰核苷酸至约10种修饰核苷酸、约4种修饰核苷酸至约20种修 饰核苷酸、约4种修饰核苷酸至约100种修饰核苷酸、约5种修饰核苷酸至约10种 修饰核苷酸、约5种修饰核苷酸至约20种修饰核苷酸、约5种修饰核苷酸至约100 种修饰核苷酸、约10种修饰核苷酸至约20种修饰核苷酸、约10种修饰核苷酸至约 100种修饰核苷酸或者约20种修饰核苷酸至约100种修饰核苷酸。在一些实施例中， RNA分子包括约1种修饰核苷酸、约2种修饰核苷酸、约3种修饰核苷酸、约4种 修饰核苷酸、约5种修饰核苷酸、约10种修饰核苷酸、约20种修饰核苷酸或者约100 种修饰核苷酸。
RNA分子(例如，mRNA)可以包括至少0.1％的修饰核苷酸。修饰核苷酸的分数 可以计算为：修饰核苷酸的数量/核苷酸的总数*100％。在一些实施例中，RNA分子 包括约0.1％修饰核苷酸至约100％修饰核苷酸。在一些实施例中，RNA分子包括至少 约0.1％的修饰核苷酸。在一些实施例中，RNA分子包括至多约100％修饰核苷酸。在 一些实施例中，RNA分子包括约0.1％修饰核苷酸至约0.2％修饰核苷酸、约0.1％修 饰核苷酸至约0.5％改性核苷酸、约0.1％修饰核苷酸至约1％修饰核苷酸、约0.1％修 饰核苷酸至约2％修饰核苷酸、约0.1％修饰核苷酸至约5％修饰核苷酸、约0.1％修饰 核苷酸至约10％修饰核苷酸、约0.1％修饰核苷酸至约20％修饰核苷酸、约0.1％修饰 核苷酸至约50％修饰核苷酸、约0.1％修饰核苷酸至约100％修饰核苷酸、约0.2％修 饰核苷酸至约0.5％修饰核苷酸、约0.2％修饰核苷酸至约1％修饰核苷酸、约0.2％修 饰核苷酸至约2％修饰核苷酸、约0.2％修饰核苷酸至约5％修饰核苷酸、约0.2％修饰 核苷酸至约10％修饰核苷酸、约0.2％修饰核苷酸至约20％修饰核苷酸、约0.2％修饰 核苷酸至约50％修饰核苷酸、约0.2％修饰核苷酸至约100％修饰核苷酸、约0.5％修 饰核苷酸至约1％修饰核苷酸、约0.5％修饰核苷酸至约2％修饰核苷酸、约0.5％修饰 核苷酸至约5％修饰核苷酸、约0.5％修饰核苷酸至约10％修饰核苷酸、约0.5％修饰 核苷酸至约20％修饰核苷酸、约0.5％修饰核苷酸至约50％修饰核苷酸、约0.5％修饰 核苷酸至约100％修饰核苷酸、约1％修饰核苷酸至约2％修饰核苷酸、约1％修饰核 苷酸至约5％修饰核苷酸、约1％修饰核苷酸至约10％修饰核苷酸、约1％修饰核苷酸 至约20％修饰核苷酸、约1％修饰核苷酸至约50％修饰核苷酸、约1％修饰核苷酸至约100％修饰核苷酸、约2％修饰核苷酸至约5％修饰核苷酸、约2％修饰核苷酸至约 10％修饰核苷酸、约2％修饰核苷酸至约20％修饰核苷酸、约2％修饰核苷酸至约50％ 修饰核苷酸、约2％修饰核苷酸至约100％修饰核苷酸、约5％修饰核苷酸至约10％修 饰核苷酸、约5％修饰核苷酸至约20％修饰核苷酸、约5％修饰核苷酸至约50％修饰 核苷酸、约5％修饰核苷酸至约100％修饰核苷酸、约10％修饰核苷酸至约20％修饰 核苷酸、约10％修饰核苷酸至约50％修饰核苷酸、约10％改性核苷酸至约100％修饰 核苷酸、约20％修饰核苷酸至约50％修饰核苷酸、约20％修饰核苷酸至约100％修饰 核苷酸或者约50％修饰核苷酸至约100％修饰核苷酸。在一些实施例中，RNA分子包 括约0.1％修饰核苷酸、约0.2％修饰核苷酸、约0.5％修饰核苷酸、约1％修饰核苷酸 、约2％修饰核苷酸、约5％修饰核苷酸、约10％修饰核苷酸、约20％修饰核苷酸、 约50％修饰核苷酸、或约100％修饰核苷酸。
在反应中使用的核苷酸，例如核糖核苷酸(例如组合的ATP、GTP、CTP以及 UTP)的总浓度在0.5mM至约500mM之间。在一些实施例中，核苷酸的总浓度为约 0.5mM至约500mM。在一些实施例中，核苷酸的总浓度为至少约0.5mM。在一些实 施例中，核苷酸的总浓度为至多约500mM。在一些实施例中，核苷酸的总浓度为约 0.5mM至约1mM、约0.5mM至约5mM、约0.5mM至约10mM、约0.5mM至约50mM 、约0.5mM至约100mM、约0.5mM至约200mM、约0.5mM至约300mM、约0.5mM 至约500mM、约1mM至约5mM、约1mM至约10mM、约1mM至约50mM、约1mM 至约100mM、约1mM至约200mM、约1mM至约300mM、约1mM至约500mM、 约5mM至约10mM、约5mM至约50mM、约5mM至约100mM、约5mM至约200mM 、约5mM至约300mM、约5mM至约500mM、约10mM至约50mM、约10mM至 约100mM、约10mM至约200mM、约10mM至约300mM、约10mM至约500mM、 约50mM至约100mM、约50mM至约200mM、约50mM至约300mM、约50mM至 约500mM、约100mM至约200mM、约100mM至约300mM、约100mM至约500mM 、约200mM至约300mM、约200mM至约500mM或者约300mM至约500mM。在 一些实施例中，核苷酸的总浓度为约0.5mM、约1mM、约5mM、约10mM、约50mM 、约100mM、约200mM、约300mM或者约500mM。
合成后处理
合成后可加入5'帽和/或3'尾。帽的存在可以提供对大多数真核细胞中发现的核酸酶的抗性。“尾”的存在可以用于保护mRNA免于核酸外切酶降解和/或调节蛋白质 表达水平。
可以如下添加5'帽：第一，RNA末端磷酸酶从5'核苷酸中去除一个末端磷酸基 ，留下两个末端磷酸基；然后通过鸟苷酰转移酶将鸟苷三磷酸(GTP)加入到末端磷 酸基中，产生5,5,5三磷酸键；然后用甲基转移酶将鸟嘌呤的7-氮甲基化。帽结构的 实例包括但不限于m7G(5')ppp(5'(A，G(5')ppp(5')A和G(5')ppp(5')G 。更多帽结构在已公布的美国申请No.US 2016/0032356中进行了描述，阿什奎尔海 克(Ashiqul Haque)等，“化学修饰的hCFTR mRNA在囊性纤维化小鼠模型中恢复肺 功能”(ChemicallymodifiedhCFTR mRNAsrecuperate lung function in a mouse model of cysticfibrosis)，科学报告(Scientific Reports)(2018)8：16776，以及科尔(Kore) 等，“5'-端帽类似物的最新进展：合成和生物分支”(Recent Developments in 5’-Terminal Cap Analogs：SynthesisandBiological Ramifications)有机化学迷你读物(Mini-Reviews in Organic Chemistry)2008，5，179-192，其通过引用并入本申请。
尾结构可以包括聚(A)和/或聚(C)尾。mRNA的3'末端(例如，3'末端的10 、20、30、40、50、60、70、80、90或100种核苷酸)上的聚-A尾可以包括至少50％ 、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％ 或99％的腺苷核苷酸。mRNA的3'末端(例如，3'末端的10、20、30、40、50、60 、70、80、90或100种核苷酸)上的聚-A尾可以包括至少50％、55％、65％、70％、 75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或99％胞嘧啶核苷酸 。
如本申请所述，添加5'帽和/或3'尾可以有助于检测体外合成期间产生的无效转录物，因为没有加帽和/或加尾，那些过早中止的mRNA转录物的大小可能太小而无 法被检测到。因此，在一些实施例中，在测试mRNA纯度(例如，mRNA中存在的 无效转录物的水平)之前，将5'帽和/或3'尾加入合成的mRNA中。在一些实施例中 ，在如本申请所述纯化mRNA之前，将5'帽和/或3'尾加入到合成的mRNA中。在其 他实施例中，在如本申请所述纯化mRNA后，将5'帽和/或3'尾加入到合成的mRNA 中。
除了以上方法外，加帽或者加尾的步骤是在从DNA体外转录为RNA的转录过 程总完成的，这些方法都是本领域一般技术人员可以自由选择。
根据本发明合成的mRNA可以不需进一步纯化而使用。特别地，可以使用根 据本发明合成的mRNA而无需去除短聚物的步骤。在一些实施例中，根据本发明合 成的mRNA可以进一步纯化。根据本发明可以使用各种方法纯化合成的mRNA。例 如，可以使用离心、过滤和/或色谱方法进行mRNA的纯化。在一些实施例中，合成 的mRNA通过乙醇沉淀或过滤或色谱法、或凝胶纯化或任何其它合适的方法纯化。 在一些实施例中，通过HPLC纯化mRNA。在一些实施例中，在标准酚：氯仿：异戊 醇溶液中提取mRNA，这是本领域技术人员所熟知的。在一些实施例中，使用切向流 过滤纯化mRNA。合适的纯化方法包括在US 2016/0040154、US2015/0376220、于2018 年2月27日提交的PCT申请PCT/US18/19954，名称为“用于纯化信使RNA的方法” 以及于2018年2月27日提交的题为“纯化信使RNA的方法”的PCT申请 PCT/US18/19978中所描述的方法，所有这些都通过引用并入本申请并且可以用于实 施本发明。
在一些实施例中，mRNA在加帽和封尾之前被纯化。在一些实施例中，在加帽和 封尾之后纯化mRNA。在一些实施例中，在加帽和封尾之前和之后均纯化mRNA。在 一些实施例中，通过离心在加帽和封尾之前或之后或之前和之后均纯化mRNA。在一 些实施例中，通过过滤在加帽和封尾之前或之后或之前和之后均纯化mRNA。在一些 实施例中，通过切向流过滤(TFF)在加帽和封尾之前或之后或之前和之后均纯化 mRNA。在一些实施例中，通过色谱法在加帽和封尾之前或之后或之前和之后均纯化 mRNA。
在一些方式中,加尾是伴随转录同时完成的，因此，也可以在加尾和加帽步骤完成后对核酸进行纯化，纯化的方法如前述的方法。所以，在一些方式中，纯化步骤应该 都是在封尾之后。当然,mRNA也可以在加帽之前被纯化。当然也可以在转录之后就 进行纯化。
可以使用本领域可用的任何方法来检测和定量mRNA的全长或无效转录物。在 一些实施例中，使用印迹、毛细管电泳、色谱、荧光、凝胶电泳、HPLC、银染色、 光谱、紫外(UV)或UPLC或其组合检测合成的mRNA分子。本领域已知的其他检 测方法包括在本发明中。在一些实施例中，使用UV吸收光谱法通过毛细管电泳分离 来检测合成的mRNA分子。在一些实施例中，在凝胶电泳(“乙二醛凝胶电泳”)之 前，mRNA被乙二醛染料变性。在一些实施例中，合成的mRNA在加帽或封尾前表 征。在一些实施例中，合成的mRNA在加帽和封尾后表征。
在一些实施例中，通过本文披露的方法产生的mRNA包括小于10％、小于9％、 小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、 小于0.5％、小于0.1％的除全长mRNA之外的杂质。杂质包括IVT污染物，例如蛋白 质、酶、游离核苷酸和/或短聚物。
在一些实施例中，根据本发明制备的mRNA基本上没有短聚物或无效转录物。 特别地，通过毛细管电泳或乙二醛凝胶电泳，根据本发明制备的mRNA包括不可检 测水平的短聚物或无效转录物。如本文所用，术语“短聚物”或“无效转录物”是指任何 小于全长的转录物。在一些实施例中，“短聚物”或“无效转录物”的长度小于100核苷 酸、小于90、小于80、小于70、小于60、小于50、小于40、小于30、小于20或者 长度小于10核苷酸。在一些实施例中，在添加5'-帽和/或3'-聚A尾后检测或量化短 聚物。
UTR序列
3’-非翻译区(3’-UTR)：通常，术语“3’-UTR”是指人工核酸分子的一部分，其位 于可读框的3’(即“下游”)，并且其不翻译为蛋白。通常，3’-UTR是mRNA的蛋白编 码区(可读框(ORF)或编码序列(CDS))和聚腺苷酸序列之间的mRNA的一部分。在本发 明的情况中，术语3’-UTR还可以包含这样的元件，其不在模板中编码，RNA由其转 录，但在成熟过程中在转录后添加，例如聚腺苷酸序列。mRNA的3’-UTR不翻译为 氨基酸序列。3′UTR序列通常由在基因表达过程中被转录为各自的mRNA的基因编 码。基因组序列首先转录为包含任选内含子的成熟前mRNA。成熟前mRNA随后在 成熟过程中进一步被加工为成熟mRNA。该成熟过程包含以下步骤：5′加帽、剪接成 熟前mRNA以切除任选内含子和3′末端修饰(如成熟前mRNA 3′末端的聚腺苷酸化和 任选的核酸内切酶/或核酸外切酶切割等)。在本发明范围内，3′-UTR对应于位于蛋白 编码区终止密码子，优选紧接蛋白编码区终止密码子的3′端和mRNA的聚腺苷酸序 列之间。术语“对应于”意为3′-UTR序列可以是如用于限定3′-UTR序列的mRNA序 列中的RNA序列，或对应于此RNA序列的DNA序列中。在本发明范围内，术语“基 因的3′-UTR”，为对应于源自该基因的成熟mRNA的3′-UTR的序列，所述成熟mRNA 即通过基因转录和成熟前mRNA的成熟获得的mRNA。术语“基因的3′-UTR”包括 3′-UTR的DNA序列和RNA序列(正义和反义链二者以及成熟和未成熟的二者)。优 选3′UTR具有多于20，30，40或50个核苷酸的长度。3′-非翻译区(3′UTR)：3′UTR 典型地是mRNA的一部分，其位于mRNA的蛋白编码区(即可读框)和多聚腺苷酸序 列之间。mRNA的3′UTR不翻译为氨基酸序列。在本发明范围内，3′UTR对应于位 于蛋白编码区终止密码子的3′端，优选紧接蛋白编码区终止密码子的3′端，并且向多 聚腺苷酸序列的5′侧，优选向紧接多聚腺苷酸序列的5′侧的核苷酸延伸的成熟mRNA 序列。术语“对应于”意为3′UTR序列可以是如用于限定3′UTR序列的mRNA序列中 的RNA序列，或对应于此RNA序列的DNA序列中。在本发明范围内，术语“基因 的3′UTR”，如“白蛋白基因的3′UTR”，为对应于源自该基因的成熟mRNA的3′UTR 的序列，所述成熟mRNA即通过基因转录和成熟前mRNA的成熟获得的mRNA。术 语“基因的3′UTR”包括3′UTR的DNA序列和RNA序列。
5’-非翻译区(5’-UTR)：通常，术语“5’-UTR”是指人工核酸分子的一部分，其位于可读框的5’(即“上游”)，并且其不翻译为蛋白。5’-UTR通常理解为信使RNA(mRNA) 的特定区段，所述信使RNA位于mRNA的可读框的5’。通常，5’-UTR在转录起始 位点起始并且在可读框的起始密码子之前的一个核苷酸处终止。优选地，所述5’UTR 具有多于20，30，40或50个核苷酸的长度。5’-UTR可以包含用于控制基因表达的 元件，也称为调控元件。所述调控元件可以是例如核糖体结合位点。5’-UTR可以被 转录后修饰，例如通过加入5’-帽修饰。mRNA的5’-UTR不翻译为氨基酸序列。5’-UTR 序列通常由基因表达过程中转录为各个mRNA的基因编码。基因组序列首先转录为 成熟前mRNA，其包含任选的内含子。成熟前mRNA然后在成熟过程中进一步加工 为成熟mRNA。该成熟过程包括以下步骤：5′加帽、剪接成熟前mRNA以切除任选内 含子和3′末端修饰(如成熟前mRNA 3′末端的聚腺苷酸化和任选的核酸内切酶/或核酸 外切酶切割等)。在本发明范围内，5′-UTR对应于位于起始密码子和例如5’-帽之间的 成熟mRNA序列。优选地，5′-UTR对应于从位于5′帽的3′侧的核苷酸，更优选从紧 邻5′帽的3′侧核苷酸，向位于蛋白编码区起始密码子5′侧的核苷酸，优选向紧接蛋白 编码区起始密码子5′侧的核苷酸延伸的序列。紧接成熟mRNA 5′帽的3′侧的核苷酸典 型地对应于转录起始位点。术语“对应于”意为5′-UTR序列可以是如用于限定5′-UTR 序列的mRNA序列中的RNA序列，或与此RNA序列对应的DNA序列。在本发明范 围内，术语“基因的5′-UTR”，是对应于源自该基因的成熟mRNA的5′-UTR的序列， 所述成熟mRNA即通过基因转录和成熟前mRNA的成熟获得的mRNA。术语“基因 的5′-UTR”包括5′-UTR的DNA序列和RNA序列(正义和反义链以及成熟和未成熟的 二者)。
本发明涉及人工核酸分子，其包含可读框ORF，3’-非翻译区元件(3’-UTR元件)和/或5’-非翻译区元件(5’-UTR元件)和任选地聚腺苷酸序列和/或聚腺苷酸化-信号。
本发明还涉及包含3’-UTR元件和/或5’-UTR元件的载体，涉及包含所述人工核 酸分子或所述载体的细胞，涉及包含所述人工核酸分子或所述载体的药物组合物，以 及涉及包含所述人工核酸分子，所述载体和/或所述药物组合物的试剂盒，优选用于基 因治疗和/或基因接种疫苗的领域。
作为mRNA稳定化的备选方案，已经发现天然存在的真核mRNA分子含有特 征稳定化元件。例如，它们可以包含在其5＇末端(5＇-UTR)和/或在其3＇末端(3＇ -UTR)的所谓非翻译区(UTR)以及其它结构特征，如5＇帽结构或3＇-聚腺苷酸尾。5＇ -UTR和3＇-UTR二者都典型地从基因组DNA转录并且因此是成熟前 (premature)mRNA元件。在mRNA加工过程中，成熟mRNA的特有结构特征，如5＇ 帽和3＇-聚腺苷酸尾(也称为多聚腺苷酸尾或聚腺苷酸序列)通常被添加于转录的(成熟 前)mRNA。
3＇-聚腺苷酸尾典型地是添加在转录的mRNA的3＇末端的一段单调腺苷核苷 酸序列。其可以包含至多约400个腺苷核苷酸。发现此种3＇-聚腺苷酸尾的长度对于 个体mRNA的稳定性是可能的关键要素。此外，已显示α-球蛋白mRNA的3＇UTR 可能是对于公知的α-球蛋白mRNA稳定性的重要因素(Rodgers等人， Regulatedα-globin mRNA decay is acytoplasmic eventproceeding through 3＇-to-5＇ exosome-dependent decapping，RNA，8，第1526-1537页，2002)。α-球蛋白mRNA 的3＇UTR明显参与特定核蛋白-复合物(α-复合物)的形成，其存在与mRNA体外稳 定性相关(Wang等人，An mRNA stability complexfunctions with poly(A)-binding protein to stabilize mRNA in vitro，Molecularand Cellular biology，第19卷，第7期，1999年 7月，第4552-4560页)。对于核糖体蛋白mRNA中的UTR已经进一步表明有趣的调 节功能：在核糖体蛋白mRNA的5’-UTR控制生长相关的mRNA翻译的同时，该调 节的严格性由核糖体蛋白mRNA中的各个3’-UTR赋予(Ledda等人，Effect of the 3’-UTR length on the translationalregulation of 5’-terminaloligopyrimidine mRNAs，Gene， 第344卷，2005，p.213-220)。该机制促进核糖体蛋白的特异表达，所述核糖体蛋白 通常以恒定的方式转录从而一些核糖体蛋白mRNA如核糖体蛋白S9或核糖体蛋白 L32称为看家基因(Janovick-Guretzky等人，Housekeeping GeneExpression in Bovine Liver is Affected by PhysiologicalState，Feed Intake，andDietary Treatment，J.Dairy Sci.， Vol.90，2007，p.2246-2252)。核糖体蛋白的生长相关的表达模式因此主要是由于对翻 译水平的调节。
术语“3’-UTR元件”是指包含源自3’-UTR或源自3’-UTR的变体或片段的核酸序 列或由源自3’-UTR或源自3’-UTR的变体或片段的核酸序列组成的核酸序列。
“3’-UTR元件”优选是指人工核酸序列，如人工mRNA的3’-UTR包含的核酸序列。
因此，在本发明的意义中，优选地，3’-UTR元件可以由mRNA，优选人工mRNA的 3’-UTR包含，或3’-UTR元件可以由各自的转录模板的3’-UTR包含。优选地，3’-UTR 元件是对应于mRNA的3’-UTR，优选人工mRNA，如通过转录基因改造的载体构建 体获得的mRNA的3’-UTR的核酸序列。优选地，本发明的意义中的3’-UTR元件作 为3’-UTR行使功能或编码执行3’-UTR的功能的核苷酸序列。
因此，术语“5’-UTR元件”是指包含源自5’-UTR或5’-UTR的变体或片段的核酸 序列或由源自5’-UTR或5’-UTR的变体或片段的核酸序列组成的核酸序列。“5’-UTR 元件”优选是指人工核酸序列，如人工mRNA的5’-UTR包含的核酸序列。因此，在 本发明的意义中，优选地，5’-UTR元件可以由mRNA，优选人工mRNA的5’-UTR 包含，或5’-UTR元件可以由各自的转录模板的5’-UTR包含。优选地，5’-UTR元件 是对应于mRNA的5’-UTR，优选人工mRNA，如通过转录基因改造的载体构建体获 得的mRNA的5’-UTR的核酸序列。优选地，本发明的意义中的5’-UTR元件作为 5’-UTR行使功能或编码执行5’-UTR的功能的核苷酸序列。
根据本发明的人工核酸分子中的3’-UTR元件和/或5’-UTR元件延长和/或增加从所述人工核酸分子的蛋白生产。因此，根据本发明的人工核酸分子可以尤其包含一下 一种或者几种功能的3’-UTR元件和/或5’-UTR元件：增加从所述人工核酸分子的蛋 白生产的3’-UTR元件，延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件，增加 和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件，增加从所述人工核酸分子的 蛋白生产的5’-UTR元件，延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，增 加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，增加从所述人工核酸分子 的蛋白生产的3’-UTR元件和增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件， 增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和延长从所述人工核酸分子的蛋 白生产的5’-UTR元件，增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和增加 和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，延长从所述人工核酸分子的 蛋白生产的3’-UTR元件和增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，延 长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和延长从所述人工核酸分子的蛋白 生产的5’-UTR元件，延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和增加和 延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，增加和延长从所述人工核酸分 子的蛋白生产的3’-UTR元件和增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件，增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件和延长从所述人工核酸分 子的蛋白生产的5’-UTR元件，或增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的 3’-UTR元件和增加和延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件。优选地， 根据本发明的人工核酸分子包含延长从所述人工核酸分子的蛋白生产的3’-UTR元件 和/或增加从所述人工核酸分子的蛋白生产的5’-UTR元件。优选地，根据本发明的人 工核酸分子包含至少一个3’-UTR元件和至少一个5’-UTR元件，即延长和/或增加从 所述人工核酸分子的蛋白生产并且源自稳定mRNA的至少一个3’-UTR元件和延长和 /或增加从所述人工核酸分子的蛋白生产并且源自稳定mRNA的至少一个5’-UTR元 件。“延长和/或增加从所述人工核酸分子的蛋白生产”通常是指与从缺少3’-UTR和/ 或5’-UTR或包含参比3’-UTR和/或参比5’-UTR(如天然与ORF组合存在的3’-UTR 和/或5’-UTR)的各个参比核酸产生的蛋白的量相比，从具有各个3’-UTR元件和/或 5’-UTR元件的根据本发明的人工核酸分子产生的蛋白的量。尤其是，与缺少3’-UTR 和/或5’-UTR或包含参比3’-UTR和/或5’-UTR，如天然与ORF组合存在的3’-和/或 5’-UTR的各个核酸相比，根据本发明的人工核酸分子的至少一个3’-UTR元件和/或 5’-UTR元件延长从根据本发明的人工核酸分子，例如从根据本发明的mRNA的蛋白 生产。尤其是，与缺少3’-和/或5’-UTR或包含参比3’-和/或5’-UTR，如天然与ORF 组合存在的3’-和/或5’-UTR的各个核酸相比，根据本发明的人工核酸分子的至少一 个3’-UTR元件和/或5’-UTR元件增加从根据本发明的人工核酸分子，例如从根据本 发明的mRNA的蛋白生产，尤其是蛋白表达和/或总蛋白生产。优选地，与缺少3’-UTR 和/或5’-UTR或包含参比3’-UTR和/或参比5’-UTR，如天然与ORF组合存在的 3’-UTR和/或5’-UTR的各个核酸的翻译效率相比，根据本发明的人工核酸分子的所 述至少一个3’-UTR元件和/或所述至少一个5’-UTR元件不消极影响核酸的翻译效率。 甚至更优选地，与其天然情况下各个ORF编码的蛋白的翻译效率相比，翻译效率由 3’-UTR和/或5’-UTR增强。本文中使用的术语“各个核酸分子”或“参比核酸分子”意为 -除不同3’-UTR和/或5’-UTR之外-参比核酸分子是与包含3’-UTR元件和/或5’-UTR 元件的本发明的人工核酸分子相当的，优选相同的。
在一些方式中，本发明的ORF的5‘端和3‘端包括如一种UTR序列，所述的序列 包括如SEQ NO：36-1至36-12的5‘UTR，或者’SEQ NO：37-1至37-12的3‘UTR序 列中的一条或者多条。在一些方式中，所述的5‘序列为SEQ NO：36-11，3为SEQ NO：37-11所示的序列；或者5‘序列为SEQ NO：36-12，3为SEQ NO：37-12 所示的序列。或者，在一些方式中，本发明的ORF序列的3‘端包括SEQ NO：37-11 或者SEQ NO：37-12所示的序列。
药物组合物
本申请还披露了包括化合物、改性核苷、改性核苷酸或本申请提供的改性核酸的药物组合物。
在一些实施例中，本发明的药物组合物可以通过本领域技术人员已知的任何方法给予受试者，例如肠胃外、经口、经粘膜、经皮、肌肉内、静脉内、皮内、皮下、 腹膜内、心室内、颅内、阴道内或肿瘤内。
药物组合物可以通过静脉内、动脉内或肌内注射液体制剂来施用。合适的液体 制剂包括溶液、悬浮液、分散液、乳液、油等。在一些实施例中，药物组合物是静脉 内给药的，因此配制成适于静脉内给药的形式。在一些实施例中，药物组合物是动脉 内给药的，因此配制成适于动脉内给药的形式。在一些实施例中，药物组合物是肌肉 内给药的，因此配制成适于肌内给药的形式。
药物组合物可以使用囊泡给药，例如，脂质体(see Langer,Science 249:1527-1533(1990)；Treatetal.,inLiposomesintheTherapyofInfectious DiseaseandCancer,Lopez-BeresteinandFidler(eds.),Liss,NewYork,pp.353-365(1989)； Lopez-Berestein,ibid.,pp.317-327；see generallyibid)。
药物组合物可以口服给药，因此可以配制成适于口服给药的形式，即固体或液 体制剂。合适的固体口服制剂可以包括片剂、胶囊、颗粒剂、丸剂等。合适的液体口 服制剂可以包括溶液、悬浮液、分散液、乳液、油。
药物组合物可以局部给予体表，因此可以配制成适于局部给药的形式。合适的 局部制剂可包括凝胶、软膏、乳膏、洗剂、滴剂等。对于局部给药，可以制备组合物 或其生理学上可耐受的衍生物，并在有或没有药物载体的情况下作为溶液，悬浮液或 乳液施用于生理学上可接受的稀释剂中。药物组合物可以作为栓剂给药，例如直肠栓 剂或尿道栓剂。在一些实施例中，药物组合物通过皮下植入颗粒给药。在一些实施例 中，颗粒在一段时间内提供药剂的受控释放。药物组合物可另外包括药学上可接受的 赋形剂，如本申请所用，包括任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体载体、分 散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂 等，适合于所需的特定剂型。雷明顿的《药学的科学与实践》，第21版，A.R.Gennaro (Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,Md.,2006；incorporated herein byreference)披 露了用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于其制备的已知技术。
在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂的纯度为至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％。在一些实施例中，赋形剂被批准用于人类和兽医用途 。在一些实施例中，赋形剂经美国食品和药物管理局批准。在一些实施例中，赋形剂 是药用级的。在一些实施例中，赋形剂符合美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国 药典和/或国际药典的标准。
用于液体制剂的药学上可接受的载体可以是水性或非水性溶液、悬浮液、乳液 或油。非水溶剂的实例可以是丙二醇、聚乙二醇和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。 含水载体可包括水、醇/水溶液、乳液或悬浮液、包括盐水和缓冲介质。油的实例可以 是石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、橄榄油、向日 葵油和鱼肝油。
非消化道给药的载体(用于皮下、静脉内、动脉内或肌内注射)可包括氯化钠 溶液、林格氏葡萄糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏液和固定油。静脉内载体包括液 体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格氏葡萄糖的电解质补充剂等。实例可 以是无菌液体，例如水和油，添加或不添加表面活性剂和其他药学上可接受的佐剂。 通常，水、盐水、葡萄糖水溶液和相关糖溶液、以及二醇如丙二醇或聚乙二醇是优选 的液体载体，特别是对于可注射溶液。油的实例可以是石油、动物、植物或合成来源的 油，例如花生油、大豆油、矿物油、橄榄油、向日葵油和鱼肝油。
药物组合物可进一步包括粘合剂(例如阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、卡波姆、乙 基纤维素、瓜尔胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮)、崩解剂(例如玉 米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮、瓜尔胶、 羟基乙酸淀粉钠)、各种pH和离子强度的缓冲剂(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸基)、 白蛋白或明胶等添加剂、以防止吸收到表面、洗涤剂(例如吐温20、吐温80、普朗尼 克F68、胆汁酸盐)、蛋白酶抑制剂、表面活性剂(例如十二烷基硫酸钠)、渗透增强 剂、增溶剂(例如甘油、聚乙二醇甘油)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠 、丁基化羟基苯甲醚)、稳定剂(例如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)、增粘剂( 例如卡波姆、胶体二氧化硅、乙基纤维素、瓜尔胶)、甜味剂(例如阿斯巴甜、柠檬 酸)、防腐剂(如硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯)、润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁 、聚乙二醇、十二烷基硫酸钠)、流动助剂(如胶体二氧化硅)、增塑剂(如邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三乙酯)、乳化剂(例如卡波姆、羟丙基纤维素、十二烷基硫酸钠)、聚合物 涂层(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)、涂料和成膜剂(例如乙基纤维素、丙烯酸酯、聚 甲基丙烯酸酯)和/或佐剂。
本申请提供的药物组合物可以是控释组合物，即组合物，其中化合物在给药后 的一段时间内释放。控释或持续释放组合物可包括在亲脂性贮库(例如脂肪酸、蜡、 油)中的制剂。在一些实施例中，药物组合物可以是立即释放组合物，即组合物，其 中整个化合物在给药后立即释放。
用于递送本申请所述的皮内药物组合物的合适设备可包括短针设备，例 如在美国专利4,886,499、5,190,521、5,328,483、5,527,288、4,270,537、5,015,235 、5,141,496、和5,417,662中描述的那些。皮内组合物可以通过限制针进入皮肤的有 效穿透长度的设备施用，例如PCT公布WO 99/34850中描述的那些及其功能等同物 。通过液体喷射注射器和/或通过刺穿角质层并产生到达真皮的射流的针将液体组合物 输送到真皮的喷射注射设备可能是合适的。喷射注射设备描述于例如美国专利 5,480,381、5,599,302、5,334,144、5,993,412、5,649,912、5,569,189、5,704,911、 5,383,851、5,893,397、5,466,220、5,339,163、5,312,335、5,503,627、5,064,413、 5,520,639、4,596,556、4,790,824、4,941,880、4,940,460、和PCT公布WO 97/37705 和WO 97/13537。使用压缩气体将粉末形式的疫苗加速通过皮肤外层到达真皮的弹道粉 末/颗粒递送设备可能是合适的。作为另外一种选择或除此之外，常规注射器可用于皮 内施用的经典结核菌素皮内方法中。
递送载体
可以使用任何方法配制和递送根据本发明合成的mRNA用于体内蛋白质生产。在一些实施例中，将mRNA封装到转移载体中，例如纳米颗粒。除此之外，这种包封的一 个目的通常是保护核酸免受可能含有降解核酸和/或引起核酸快速排泄的系统或受体 的酶或化学物质的环境的影响。因此，在一些实施例中，合适的递送载体能够增强其 中包括mRNA的稳定性和/或促进mRNA递送至靶细胞或组织。在一些实施例中，纳 米颗粒可以是基于脂质的纳米颗粒，例如包括脂质体或基于聚合物的纳米颗粒。在一 些实施例中，纳米颗粒可以具有小于约40-100nm的直径。纳米颗粒可包括至少1μg 、10μg、100μg、1mg、10mg、100mg、1g或更多mRNA。
当然，这种纳米粒子也可以是核壳类结构的颗粒，如果核酸与聚合物混合形成了核，然后再在核结构外包裹脂质体，也可以通过本发明的混合器来完成。可以先通过 混合器让核酸和聚合物形成微粒结构，然后在通过混合器让微粒与脂质成分形成微粒 结构。这种所谓的核壳结构，例如专利申请号201880001680.5中所有核的材料以及壳 的材料都可以用本发明的混合器来形成，该专利的所有组成核的材料和形成壳的材料 都是本发明的一个具体实施方式。
在一些实施例中，转运载体是脂质体囊泡、或促进核酸转移至靶细胞和组织的其他手段。合适的转运载体可以包括但不限于脂质体、纳米脂质体、含神经酰胺的纳米 脂质体、蛋白脂质体、纳米颗粒、磷酸钙-硅酸盐纳米颗粒、磷酸钙纳米颗粒、二氧化 硅纳米颗粒、纳米晶颗粒、半导体纳米颗粒、聚(D-精氨酸)、纳米树枝状聚合物、 淀粉基递送系统、胶束、乳剂、囊泡、质粒、病毒、钙磷酸基核苷酸、适体、肽和其 他载体标签。还考虑使用生物离子胶囊和其他病毒衣壳蛋白组装体作为合适的转 移载体。(Hum.GeneTher.2008September；19(9):887-95)。
脂质体可以包括一种或以上阳离子脂质、一种或以上非阳离子脂质、一种或以 上基于甾醇的脂质、和/或一种或以上PEG-改性脂质。脂质体可包括三种或更多种不 同的脂质组分，脂质的一种不同组分是基于甾醇的阳离子脂质。在一些实施例中， 基于甾醇的阳离子脂质是咪唑胆固醇酯或“ICE”脂质(参见WO2011/068810，其通 过引用并入本申请)。在一些实施例中，基于甾醇的阳离子脂质可构成脂质纳米颗粒 (例如，脂质体)中总脂质的不超过70％(例如，不超过65％和60％)。合适的脂质 的实例可包括，例如，磷脂酰化合物(例如，磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨 酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、脑苷脂和神经节苷脂。
阳离子脂质的非限制性实例可包括C12-200、MC3、DLinDMA、 DLinkC2DMA、cKK-E12、ICE(咪唑基)、HGT5000、HGT5001、OF-02、DODAC、DDAB 、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA和DMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE 、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP 、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA和HGT4003、或其组合。
非阳离子脂质的非限制性实例可以包括神经酰胺、脑磷脂、脑苷脂、二酰基甘油、1,2- 二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酰基甘油钠盐(DPPG)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇 胺(DSPE)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆 碱(DPPC)、1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱 (DOPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷 酸乙醇胺(DMPE)、和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)，1-棕 榈酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC )、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、鞘磷脂、或其组合。
在一些实施例中，PEG改性脂质可以是长度高达5kDa的聚(乙烯)二醇链，其共 价连接到具有C6-C20长度的烷基链的脂质上。PEG改性脂质的非限制性实例可包 括DMG-PEG、DMG-PEG2K、C8-PEG、DOGPEG、神经酰胺PEG和DSPE-PEG、或 其组合。
还考虑使用聚合物作为转移载体，无论是单独使用还是与其他转移载体组合使用。合适的聚合物可包括，例如，聚丙烯酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚丙交酯、聚 丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己内酯、葡聚糖、白蛋白、明胶、藻酸盐、胶原、壳聚糖 、环糊精和聚乙烯亚胺。基于聚合物的纳米颗粒可包括聚乙烯亚胺(PEI)，例如支化 的PEI。
载体的核壳结构也是另外一种具体的实施方式。在一些方式中，所述的疫苗试 剂包括前述的核酸，该核酸可以翻译，表达冠状病毒的抗原或者抗原片段，这样的核 酸被包含在多个多聚复合物或蛋白质核粒子内，并且其中所述多个多聚复合物或蛋白 质核粒子本身被囊封在第一生物相容性脂质双层壳中。在一些方式中，所述多聚复合 物或蛋白质核粒子含有至少第一带正电荷的聚合物或蛋白质。其中所述第一生物相容 性脂质双层壳促进一种或多种哺乳动物抗原呈递细胞对所述多个多聚复合物或蛋白 质核粒子的巨胞饮作用。在一些方式中，该疫苗试剂还包含囊封在所述生物相容性脂 质双层内的选自CpG、聚(I:C)、明矾及其任何组合的佐剂。在一些方式中，疫苗试剂 还包括含囊封在所述生物相容性脂质双层之间的空间内的免疫调节化合物，例如IL-12p70蛋白质、FLT3配体、或吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO-1)抑制剂。在一些方式中， 其中所述吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO-1)抑制剂是GDC-0919、INCB24360或其组合。在 一些方式中，其中所述带正电荷的聚合物或蛋白质包含鱼精蛋白、聚乙烯亚胺、聚(β -氨基酯)或其任何组合。在一些方式中，所述生物相容性脂质双层包含以下的一种或 多种：1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(EDOPC)；1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙 醇胺(DOPE)；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二 醇)-2000](DSPE-PEG)；及其组合。在一些方式中，所述生物相容性脂质双层包含：(a)
约30％至约70％的1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(EDOPC)；(b)约70％ 至约30％的1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺(DOPE)；或(c)约0.5％至约5％的 1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG)。在一些方 式中，所述生物相容性脂质双层包含：(a)约45％至约55％的1,2-二油酰-sn-甘油-3- 乙基磷酸胆碱(EDOPC)；(b)约55％至约45％的1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺 (DOPE)；和(c)约1％至约2％的1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二 醇)-2000](DSPE-PEG)。
尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可用于本发明的实践或测试 ，但下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他 参考文献都通过引用整体并入。本文引用的参考文献不被认为是要求保护的发明的现 有技术。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，而不是限制性的。
具体实施方式
本发明的具体实施方式仅仅是在发明的精髓下的有限列举来说明本发明是如何实现的，不能构成对本发明的任何限制。
实施例子1：mRNA候选序列设计和制备：SEQ ID NO:1NDA序列为模板制备mRNA序列
实验试剂：(1)SpeI DNA内切酶，(2)高保真DNA聚合酶，(3)DNA纯化柱，(4)thermofisher T7 RNA聚合酶，(5)thermofisher 75mM rNTP，(6)100mM N1-甲基假 尿苷-5’-三磷酸，(7)yeasen牛痘病毒加帽酶，(8)32mM SAM(9) thermofisherdynabeadsmyone等。
1.1模板质粒的全基因合成：将不同目的抗原的DNA序列ORF(open readingframe) 序列(SEQ ID NO:1到SEQ ID NO:9)按照如下方式(如下图1)与T7启动子序列(SEQID NO:11)，5’UTR序列，3’UTR序列和polyA序列串联后以Puc57(由全基因合成公 司“南京金斯瑞生物科技有限公司”提供)为载体进行全基因合成，即可获得模板质粒。 该DNA序列中的一些是经过人工改造过的序列，改造后的序列通过人工合成，并克 隆到所述的载体上，有一些是没有经过人工优化改造的。
1.2PCR获得转录模板DNA序列：以线性化后的模板质粒为模板，使用polyT长引物，高保真DNA聚合酶，dNTP等原料，于PCR仪上使用合适的程序即可获得转录 模板DNA。(如下图图2所示)。
上游引物：5’TTGGACCCTCGTACAGAAGCTAATACG3’(SEQ ID NO:10)；
下游长引物：
5’TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTAGTTCTAGACCCTCACTTCCTACTCAGG3’(SEQ ID NO:11)
表1：例如，以获得SEQ ID NO:1的PCR反应体系配置。
Figure BDA0002917999930000421
表2：SEQ ID NO:1的PCR程序。
Figure BDA0002917999930000422
Figure BDA0002917999930000431
1.3体外转录反应制备mRNA(以60uL反应体系为例)(SEQ ID NO:1))：将制备的IVT模板与T7 RNA聚合酶，rNTPs单核苷酸等原料按照如下表3配比混合，于37℃ 进行8小时转录反应。转录反应结束后，使用DNA酶消化IVT模板，以降低残余 DNA模板带来的风险。其中,甲基假尿嘧啶核苷酸的修饰比例为50％。
表3：体外转录体系配比。
反应体系 用量(μL)
10×T7转录buffer 6
T7 enzyme 4
ATP(75mM) 4
CTP(75mM) 4
GTP(75mM) 4
UTP(75mM) 2
甲基假尿嘧啶核苷酸(100mM) 1.5
DNA模板 1μg
H<sub>2</sub>O 补至60
加帽反应：使用牛痘病毒加帽酶，对上述转录后的mRNA进行5’端加帽修饰，产生cap0帽子结构的mRNA。反应体系如下表4：
表4：加帽反应体系
组分 体积
RNA 15μL
10×Capping Buffer 2.0μL
GTP(10mM) 1.0μL
SAM(2mM) 1.0μL
Vaccinia Capping Enzyme(10U/μL) 1.0μL
1.5纯化：使用thermo fisher dynabeadsmyone对加帽反应结束的mRNA进行纯化。mRNA与磁珠纯化buffer的体积比为1:2，磁珠与mRNA质量比为1:1。纯化后的mRNA 溶解于柠檬酸钠溶液中，即可用于后续制剂包被。
以上仅仅是对于序列1(SEQ NO：1)所示的DNA制备最终的mRNA的过程， 其它的8条DNA制备mRNA序列的过程与上类似，仅仅是开放阅读框架中的序列不 同。这些都是本领域的一般技术人员在看到本发明公开的方法都是可以完成的。本发 明采用了9条DNA新冠序列的具体信息如下表5：
表5：DNA序列说明(包括优化的和非优化的天然序列)
序号 序列名称 是否序列优化
(SEQ NO：1) S 是
(SEQ NO：2) S RBD 否(天然序列)
(SEQ NO：3) M 是
(SEQ NO：4) N 否
(SEQ NO：5) S-RBD 是
(SEQ NO：6) S-RBD 是
(SEQ NO：7) E 是
(SEQ NO：8) S partial 是
(SEQ NO：9) S1 是
以上优化序列对应的野生型天然序列如下表6。表5中的序列编号1,8,9基于表6中的序列编号1-1所示的天然序列进行了优化；表5中的序列编号5,6基于表6中的 序列编号3-3所示的天然序列进行了优化；表5中的序列编号3基于表6中的序列编 号5-5所示的天然序列进行了优化；表5中的序列编号7基于表6中的序列编号9-9 天然序列进行了优化。所示，实际上，只有序列4和2为天然序列，未进行优化；因 此，天然序列只有2条。所谓的优化，可以是全长序列的全部优化，也可以是部分序 列的优化，例如对于表5中的编号1，8，9都是S基因的全长优化或者部分优化，仅 仅表现出序列的长度或者在全长序列中的不同位置的部分序列的优化。优化的过程就 是对于核酸DNA进行改良或者设计，让其转化的RNA序列可以更多的在细胞内表 达更多量的目的抗原，或者更加稳定，或者其它方面的功能要求。
表6:表5中优化序列所对应的天然(野生型,WT)DNA序列列表。
序号 序列名称
(SEQ NO：1-1) S
(SEQ NO：3-3) S-RBD
(SEQ NO：5-5) M
(SEQ NO：6-6) N
(SEQ NO：7-7) S-RBD
(SEQ NO：8-8) S-RBD
(SEQ NO：9-9) E
以上DNA序列，编号1-9的DNA模板序列仅ORF区域序列不同，其余功能区 域如T7启动子序列，5‘和3‘端的UTR序列和polyA序列完全一致。
通过优化后的序列与对应的天然野生型DNA序列进行同源性比较，比较的方 法如该网站地址所描述的方法进行：Clustal Omega(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)比对，获得的结果如下表7所示。当 然，编号2和4两条序列没有经过优化，所以序列同源性为100％。
表7：天然和优化DNA序列的同源性对比较结果。
Figure BDA0002917999930000451
按照以上方法，体外转录获得的9条mRNA的序列如下表8所示：
表8：按照上述方法获得的mRNA序列列表。
序号 序列名称 是否序列优化
(SEQ NO：1.1) S 是
(SEQ NO：1.2) S-RBD 否(天然序列)
(SEQ NO：1.3) M 是
(SEQ NO：1.4) N 否(天然序列)
(SEQ NO：1.5) S-RBD 是
(SEQ NO：1.6) S-RBD 是
(SEQ NO：1.7) E 是
(SEQ NO：1.8) S partial 是
(SEQ NO：1.9) S1 是
以上获得的如表8所列举的9条的mRNA序列仅ORF区域不同，其它功能区域 如UTR序列和polyA序列完全一致：而且ORF区域都是有优化过或者没有优化的的 DNA序列转录过来的序列。没有优化的序列是指与天然野生型的核酸序列一样或者 同源性大于或者等于95％的一样，例如本发明新冠的SEQ NO：2或者SEQ NO：1.2； 或者SEQ NO：1.4或者SEQ NO：4所示的序列。
T7启动子：TAATACGACTCACTATA(SEQ ID NO:12)
5’UTR序列：
ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACC(SEQ ID NO:13)；
3’UTR序列：
GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAA CTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATA AAAAACATTTATTTTCATTGC(SEQ ID NO:14)；
polyA尾序列：
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA(SEQ ID NO:15)。
表7中的DNA优化序列对应表9的mRNA序列。这是因为优化的DNA序列与天 然序列的分析对比，从而也就按照这样的逻辑，所获得优化的mRNA序列与天然序 列(野生型)也有类似的关系存在。具体见表9的列举。表8中的序列编号所示的1.1； 1.8；1.9序列基于表9中的1-1-1天然序列进行了优化；表8中的序列编号所示的1.5； 1.6基于表9中编号5-5-5天然序列进行了优化；表8中的序列编号所示的序列1.3基 于表9中编号3-3-3天然序列进行了优化；表8中的序列编号1.7所示的序列是基于 表9中编号7-7-7天然序列进行了优化；序列2和4为天然序列，未进行优化；因此， 天然序列只有2条：SEQ NO：2-2-2；SEQ NO：4-4-4。
表9：天然mRNA序列。
序号 序列名称
(SEQ NO：1-1-1) S
(SEQ NO：2-2-2) S-RBD
(SEQ NO：3-3-3) M
(SEQ NO：4-4-4) N
(SEQ NO：5-5-5) S-RBD
(SEQ NO：6-6-6) S-RBD
(SEQ NO：7-7-7) E
(SEQ NO：8-8-8) S partial(部分)
(SEQ NO：9-9-9) S1
表10：天然mRNA序列与通过优化后的序列的同源性比较。
Figure BDA0002917999930000461
Figure BDA0002917999930000471
在这里可以理解，可以通过优化的DNA序列获得优化的RNA序列，当然也可以 通过序列合成直接生成RNA序列也是可以的。对于启动子，都是可以采用常规的启 动子序列来进行，也可以在序列的首尾增加非翻译区域，例如UTR序列，可以让RNA 序列更加稳定。具体对于UTR序列的筛选，在本发明的具体实施方式中会有详细阐 述。一般的UTR序列都是可以实现的，这些所谓启动子的具体序列，合适的UTR序 列，poly序列，以及对于核酸修饰和序列的优化，都是为保证核酸序列在体内稳定传 输，同时，或者高的表达量。一般本领域的人应该理解，任何的其它序列在于本发明 都是可以实现的，是本发明的一些优选的例子，但是如果没有这些元件，仅仅是优化 的新冠序列，也是可以实现的，仅仅可能效果并不是非常理想。从后面的实验也可以 看出，就算这些元件的序列一样，起到效果好与不好的关键，或者决定性的还是ORF 序列本身的性子而决定的。但是不可否认，有这些额外的序列与ORF序列一起，能 够有更好的效果。
在一些可选的方式中,可以在ORF序列的前方插入一些额外的附加序列，这些序列也可以帮助实现RNA表达的功能性上的改善，例如减少一些酶切位点，从而让蛋 白更具有活性，这样的序列可为如下序列：例如在ORF序列的5端的第四个核苷酸 插入一下序列。例如5‘端都是以AUG开始的核苷酸，然后插入的序列从第4个核苷 酸查入以下下序列中的一条或者几条。
5’－AUGUUCCUGCUGACUACAAAACGGACU－3’(SEQ NO：38)
5’-GACGCUAUGAAGAGGGGCCUGUGCUGUGUGCUGCUGCUGUGCGGAGCUGUGUUCGUGUCCAACAGC-3’(SEQ NO：39)。
对于插入的位点，可以是5端的开始几个核苷酸后插入，当然，也可以在3端的 几个核苷酸插入，当然，也可以直接连接ORF(开放阅读框)序列，这些序列的公功 是多样性的，具有综合改善RNA性能的序列。这些附加序列可以插入到ORF序列中， 成为ORF序列的一部分。可以理解，除了ORF序列之外的其它序列，都是本发明的 一个优选实施方式，但是这些优选的实施方式并不能说明必须具有这些序列才能实现 本发明的发明目的和意图。
表11：表8中翻译表达的的氨基酸序列。
Figure BDA0002917999930000481
表8中的mRNA翻译表达的氨基酸序列与表9中的天然mRNA序列所翻译表达的 氨基酸，序列上相比，同源性都是100％。这说明，无论是经过优化的序列还是天然 序列，最终所表达的氨基酸，也就是蛋白的氨基酸序列都是一样的。序列一样仅仅说 明从物质本质上是一样的，但是对于含量、活性却并不是相等的概念。
实施例子2：候选mRNA序列的体外细胞表达水平验证
1.1供试品:
9种新冠mRNA疫苗：为了检测蛋白产物，每个mRNA序列的3’端都融合了6个 连续的组氨酸密码子(CAU，具体见表12)，可以在蛋白产物的C端产生由6个连续 的组氨酸形成的组氨酸标签(His-tag)，从而可以利用抗组氨酸标签的抗体间接检测 目的抗原的表达。
表12：9种新冠mRNA疫苗的具体序列特征。
Figure BDA0002917999930000482
Figure BDA0002917999930000491
以上表格中的“********”代表含有表8中9不同RNA的完整序列，完整序列包括 其它功能区域如启动子序列，UTR序列和polyA序列完全一致，(不含有附加序列)， 合计9条，分别命名为nCoV-N，其中N为1-9的自然数，具体见表。
2.2试验试剂：HEK-293细胞(购买的厂家：)；DMEM完全培养基(Gibco)：1％双抗(Gibco)，10％FBS(Hyclone)；PBS(索莱宝)；转染稀释液：Opti-MEM(Gibco)；Lipofectamine MessengerMAX(Invitrogen)；RIPA裂解液(强)(蛋白酶抑制剂混合物PierceTM Protein Concentrator PES,3K MWCO(Pierce)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(增 强型)(碧云天)；Tris-甘氨酸电泳缓冲液(索莱宝)；电转液(索莱宝)；TBST：1×TBS (索莱宝)+1‰Tween-20(索莱宝)；脱脂奶粉(安佳)；甲醇(阿拉丁)；BeyoGelTM Plus PAGE预制胶(4-20％,15孔)(碧云天)；His Tag Antibody(HRP)(索莱宝)；High-sig ECL WesternBlotting Substrate(Tanon)；显影定影试剂盒(碧云天)。
2.3试验耗材：T75细胞培养瓶(Thermo)；15/50ml离心管(Corning)；移液管(Corning)； 1.5/0.5ml离心管(Axygen)；PVDF膜(碧云天)；转印滤纸(碧云天)；X-OMAT BT胶片(5×7英寸)(碧云天)；压片暗盒(碧云天)；3.3试验仪器；CO2培养箱(Panasonic)； 倒置显微镜(Leica)；电泳仪(Bio-Rad)；电泳槽(Bio-Rad)；转印槽(Bio-Rad)； 离心机(Kubota)；凝胶成像Universal HoodⅡ(Bio-Rad)。
试验方法
1.)将HEK 293细胞铺在六孔板中，每孔种1×106个细胞，37℃培养箱孵育16小时。
2.)使用Lipofectamine MessengerMAX转染试剂分别转染表1中9种mRNA疫苗序列各2μg(实施例子1制备的)，具体如下步骤：溶液A孵育10分钟，与溶液B混 合，室温孵育5分钟后进行细胞传染。
表13：溶液A和溶液B的试剂成分和含量
Figure BDA0002917999930000501
3).转染24小时后，收集培养基上清，立即加入1/100体积蛋白酶抑制剂，并置于冰上；向每孔细胞加200μL RIPA裂解液(已加入1/100体积蛋白酶抑制剂)，于冰上裂 解30分钟，将裂解液转移至1.5ml离心管中，4℃18000rpm离心20分钟，将上清 转移至新的离心管。
4).使用Protein Concentrator PES浓缩培养基上清：吸取收集的培养基上清500μl加到 吸附柱中，12000rpm离心30分钟，将浓缩后的培养基上清转移至新的离心管。
5).使用BCA试剂盒检测细胞裂解液蛋白浓度。
BSA标准品制备：取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(20mg BSA)中， 充分溶解后配制成25mg/ml的BSA标准溶液。取80μl 25mg/ml BSA标准溶液， 加入920μl PBS，配制成2mg/ml的BSA标准品。
BCA工作液配制：根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B (50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。
稀释BSA标准品以制作标准曲线，体系如下(表14)：
Figure BDA0002917999930000502
8个标准品各取100μl加入96孔板中，设两个复孔。样品孔：96孔板中每孔加入100μl H2O，分别加入1μl样品，设两个复孔。各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。 用酶标仪测定A562。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
6).蛋白样品制备：根据样品的蛋白浓度，各吸取含45μg蛋白的细胞裂解液至0.5ml 离心管中，各加入3μl 5×SDS上样缓冲液，用H2O将各蛋白样品调整为终体积15μl；培养基上清蛋白样品按照对应的细胞裂解液体积配制，上样前沸水中煮5分钟使蛋白 变性(获得含有编码抗原蛋白)。
7).取出预制胶，组装电泳装置，加入电泳缓冲液，上样。未加入蛋白样品的孔道加入 15μl 1×SDS上样缓冲液。
8).电泳：恒压80V进行电泳30分钟，后调电压至100V，电泳40分钟。电泳结束后，用H2O清洗胶板，小心取下胶。
9).转膜：将PVDF膜在甲醇中活化，将膜、海绵、滤纸浸入预冷转膜液中。将转膜夹黑色向下放入转膜液中，依次向其上放入海绵、两层滤纸、胶、PVDF膜、两层滤纸、 海绵，每一步不能有气泡。合上转印夹，放入转印槽中，使夹子黑面对槽的黑面，夹 子白面对槽的红面，向转印槽中放入冰盒，倒入电转液，插入电极。对于分子量较大 的nCoV-1/4/8/9，恒压100V，转膜90分钟；对于分子量较小的nCoV-2/3/5/6/7，恒 压100V，转膜60分钟。结束后，将PVDF膜取出，标记膜的方向，置于Western blot 抗体孵育盒中。
10).封闭：利用1×TBST配制10％脱脂奶粉，将膜放入封闭液中，室温摇床上封闭1小时。
11).一抗孵育：利用1×TBST配制1％脱脂奶粉，按照1:10000稀释His-Tag(HRP)一抗， 室温摇床孵育2小时。
12).洗膜：回收一抗，1×TBST洗膜4次，每次5分钟。
13).化学发光，显影，定影：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影，将胶片进行扫描。
2.5实验结果如图3所示。结果分析：利用Lipofectamine MessengerMAX转染9个mRNA疫苗序列后，细胞状态良好；Western blot曝光结果经凝胶成像Universal Hood Ⅱ扫描后，利用Image J和Adobe Illustrator作图并分析，结果显示，曝光背景低，蛋 白条带清晰、特异(图3所示)。9种mRNA疫苗序列分别转染HEK-293细胞后，均 在培养基上清或细胞裂解液中检测到目的条带，其中因nCoV-5/6/8/9中有信号肽序列， 因此可在培养基上清中检测到分泌到胞外的nCoV-5/6/8/9蛋白。
各蛋白分子量大小与预期蛋白分子量相比：nCoV-2/4/5/7蛋白分子量与预期基本一致。nCoV-1/6/8/9蛋白分子量比预期略大，可能是由于S蛋白在体内会被高度糖基 化修饰。培养基上清中，nCoV-8在预期条带之下有一条分子量较小的条带，可能为S 蛋白在体内被剪切形成的S2亚单位。nCoV-3在预期条带之下有一条分子量较小的条 带，可能在体内存在剪切，此外，在高分子量处有弥散带，提示在体内可能存在多聚 体形式。
综上所述，结果表明9种mRNA疫苗序列设计正确，均能在体外正确表达。RNA 是基因表达的主要角色，整个遗传信息的维持和表达过程都是在“RNA世界”中进行的， 其中信使RNA(messenger RNA,mRNA)提供了代表蛋白质的DNA序列的信息传递 中间体。基因表达可分成两个阶段——转录和翻译。转录是以细胞中DNA为模板， 依据碱基互补配对原则产生一条单链mRNA作为蛋白质生物合成的直接摸板，其序 列与DNA非编码链互补，而与编码链相同；翻译是解读蕴藏在mRNA核苷酸序列中 的遗传信息并产生蛋白质氨基酸序列的过程，根据每三个核苷酸决定一个氨基酸的三 联体密码规则，由mRNA 5’端起始密码子开始，按5’→3’方向合成有特定氨基酸顺序 的蛋白质肽链。mRNA疫苗正是基于mRNA能够快速翻译出目标蛋白的特性，通过 递送系统将体外转录的mRNA运送至抗原递呈细胞(树突状细胞)，进而使树突状细 胞直接高效表达抗原，通过MHC I或者MHC II类分子刺激和活化抗原特异性T细胞， 从而活化B细胞和T细胞，使机体产生抗原特异性免疫应答。因此，mRNA正确表 达目标蛋白是mRNA疫苗发挥作用的首要前提。
这也说明，一些在ORF区域前或者后的其它序列是可行的，从功能上讲是能够 实现抗原的表达的。同时，对于附加序列的增加，也同样可以实现抗原在体外细胞的 成功表达(具体实验数据略)。如上面所说，起到决定作用的RNA本身自带的核心编 码蛋白的信息。
在真核细胞中，直接作为翻译模板的成熟mRNA需具备以下结构特征中的一个 或者几个：(1)包含起始密码子和终止密码子的蛋白质编码序列，密码子之间具有连 续性，无任何核苷酸隔开；(2)编码序列两端具有非编码区(untranslated region,UTR)， 5’端'UTR位于从mRNA起点的甲基化鸟嘌呤核苷酸帽延伸至起始密码子AUG，3’端 'UTR从编码区末端的终止密码子延伸至多聚A尾巴(Poly-A)的前端，对于翻译效 率和mRNA稳定性非常重要；(3)5’端帽子结构，即一个通过与众不同的5’-5’结合 方式与mRNA的5’端结合的甲基化鸟嘌呤核苷酸(m7GpppNp)，在翻译过程中有助 于核糖体对mRNA的识别，稳定核糖体与mRNA的结合，促进起始反应并保证翻译 沿正确方向进行；(4)3’端poly A尾结构，可募集关键翻译起始因子使其与mRNA 的3’端紧密结合，使mRNA维持一种环状的构象，从而提高翻译起始效率，且对于 重新起始翻译过程具有促进作用。此外，Poly A尾和与其结合的蛋白质有助于保护 mRNA免于被核酸外切酶降解，从而增强mRNA的稳定性。
通过本发明，也筛选过一些更有效的UTR序列，这些序列对于同样的ORF区 域的表达的效果都不尽相同，同时本发明也改善过UTR序列，从而可以改善mRNA 的稳定系。本发明的一般技术人员可以理解，对于UTR序列，不仅仅是对于新冠mRNA 具有作用，同时对于其它非mRNA序列也同样具有类似的作用。
因此，为保证体外转录的mRNA可以像成熟mRNA分子一样在细胞内高效稳定 表达，本试验在疫苗设计和合成过程中进行了一系列优化，包括：1)对核苷酸进行 修饰，降低人体对mRNA的固有免疫反应；2)对密码子进行优化，将mRNA中较为 罕见的密码子换为更常见的同义密码子，提高蛋白表达量；3)优化5’UTR和3’UTR 序列，提高mRNA的翻译效率，并增强mRNA的稳定性，延长mRNA的半衰期；4) 5’加帽，增强mRNA的稳定性和提高蛋白表达量；5)3’加poly-A尾，增强mRNA的 稳定性和翻译效率；6)对制备的mRNA进行纯化，减少双链副产物，防止不必要的 免疫刺激。这些优化中,任何一个优化都可以对于传统技术的改善。
从本发明来看，对于新冠1-9条mRN，由于在具体实施方式中，所使用的5’UTR 和3’UTR的序列是一样的，所以，导致该核酸都能在细胞内表达，表示这些筛选的 基因都有可能在体内产生抗原，从而引起主体产生抗体。
为检测设计的9种新冠mRNA疫苗是否能够正确表达，本试验利用 LipofectamineMessengerMAX转染使mRNA进入HEK293细胞进行表达，转染24小 时后，外源蛋白表达水平达到峰值，同时收集培养基上清和细胞裂解液，利用Western blot技术检测目的抗原表达。HEK-293细胞极少表达细胞外配体所需的内生受体，且 容易转染，是一个很常用的表达研究外源基因的工具细胞株，因此选择HEK-293细 胞作为宿主细胞，可以保证mRNA顺利进入细胞。由于一些mRNA序列中有信号肽， 其蛋白产物会分泌到胞外，因此本试验在检测细胞裂解液中蛋白表达的同时，也检测 了培养基上清中的蛋白表达情况。Western blot技术是通过特异性抗体对凝胶电泳处 理过的蛋白样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析 的细胞或组织中表达情况的信息。由于缺乏特异性抗体，本试验在每个mRNA序列 的3’端都融合了6个连续的组氨酸密码子(CAU)，可以在蛋白产物的C端产生由6 个连续的组氨酸形成的组氨酸标签，从而可以利用抗组氨酸标签的抗体间接检测目的 抗原的表达。实际上就是利用氨酸形成的组氨酸标签来进行间接检测在细胞内是否产 生抗原物质(这里的抗原实际就是mRNA编码的蛋白信息)。
实验3：9种mRNA疫苗在小鼠体内免疫原性的对比
3.1实验目的
9种不同的新冠病毒mRNA疫苗免疫小鼠后，利用ELISA方法检测小鼠体内抗原特异性抗体滴度，通过比较抗体滴度水平筛选最佳的疫苗试剂。
3.2供试品信息
药品由斯微(上海)生物科技有限公司-制剂部直接提供，按照规定浓度调整完毕。2-8℃携带至上海南方模式生物研究中心，专递至屏障内给药。
表15：各种给药的浓度和剂量以及注射方式。
Figure BDA0002917999930000541
注:编号为1-9的序列与前文的表8中的mRNA1-9的序列对应,其中，2019-nCoV-1-9对应SEQ NO：1.1-1.9的序列。
3.3递送载体的LPP的制备过程。
材料：PbAE(指硫酸鱼精蛋白，sigma)，DOPE(Avanti)，M5(药明康德)，DSPE-mPEG2000(lipoid)，mRNA(如表8所含有不同mRNAOFR的完整序列，编 号为2019-nCoV-1.1-1.9；
M5的结构式如下：
Figure BDA0002917999930000551
制备过程：
3.3.1溶液的配制：
PbAE溶液的配制：取适量的PbAE溶解于适量的水溶液中，配制得到1mg/ml的PbAE溶液；
脂质溶液的配制：按照质量比M5:DOPE:DSPE-mPEG2000＝49:49:2的比例配制浓度为 40mg/ml的脂质溶液；
mRNA溶液：适当溶液稀释到1mg/ml；
3.3.2核纳米粒的制备：
PbAE相的配制：取适量的PbAE溶液，纯化水稀释到0.60mg/ml；
mRNA相的配制：取适量的mRNA溶液，纯化水稀释到0.20mg/ml；
搅拌中将PbAE溶液加入到mRNA溶液中去，混合体积比为PbAE溶液：mRNA溶 液＝5:1。
3.3.3LPP脂质纳米粒的制备：
按照参数Volume＝12.0mL；Start waste＝0.35mL，End waste＝0.10mL，流速比＝3(核 纳米粒溶液):1(脂质溶液)，流速＝20ml/min，温度＝37℃混合；该操作是是微流芯片设备上进行，该设备是市售的厂家PNI的鱼骨芯片进行脂质纳米粒的制备。
4、LPP脂质纳米粒的纯化：
取制备得到的LPP脂质纳米粒用PBS溶液稀释，用超滤离心管进行离心纯化得到纯化后的脂质纳米粒溶液。
3.3实验试剂
0.01M PBS缓冲液(PH＝7.4)(索莱宝)；清洗液：0.05％Tween-20(索莱宝)+PBS 封闭液：10％成牛血清(四季青)+PBS；样品稀释液：10％成牛血清+0.05％Tween-20 +PBS；显色液：3,3',5,5'-四甲基联苯胺TMB(Thermo)；终止液：2N H2SO4；二抗：anti-mouse IgG-HRP(Abcam)；包被抗原(抗体对应的抗原)：
表16：不同抗原的列表
Figure BDA0002917999930000561
3.4给药
给药途径采用肌肉注射，选择与临床试验拟用途径相似的给药方式。给药体积为100 μl/只，小鼠左右后肢大腿肌肉各注射50μl药物。免疫后第10天采血进行抗体滴度检测。
3.5观察和检查
试验期间每日由动物房管理人员按试验规定协查小鼠状态及观察小鼠状态。试验人员进行定期观察小鼠状态，包括但不限于：行为活动，摄食摄水量，体重变化(每 周测量3次体重)，外观体征或其它不正常情况。基于各组动物数量记录组内动物死 亡数和副作用。小鼠异常情况包括但不限于：明显消瘦，体重降低大于20％；不能自 由取食和饮水；以及动物出现以下临床表现且持续恶化：立毛；弓背；耳、鼻、眼或 足色发白；呼吸仓促；抽搐；连续腹泻；脱水；行动迟缓；发声。
3.5.3抗体滴度检测
1).抗原包被：按照表15不同疫苗对应的抗原进行抗原包被，抗原列表参见表16。抗原使用PBS稀释，浓度为5μg/ml进行包被，96孔板每孔加入50μl，空气浴4度 孵育12小时。
2).洗涤：每孔加入200μl清洗液进行清洗，清洗三次。
3).封闭：使用封闭液进行96孔板封闭，每孔加入200μl，空气浴27度孵育2小时。封闭后的板子，每孔加入200μl清洗液进行清洗，清洗三次。
4).样本稀释：使用样品稀释液，按照相同体积的血清稀释梯度 (200/600/1800/5400/16200/48600/145800/437400)对样品进行稀释，每个样本进行双 复孔检测，每孔加入50μl样品，空气浴27度孵育2小时。
5).洗涤：使用清洗液清洗板子3遍，每次200μl。
6).二抗孵育(HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗)：使用样品稀释液，按照1:100000稀释度对二抗进行稀释，每孔加入50μl，空气浴27度孵育1小时。
7).洗涤：清洗ELISA板4遍，每次200μl每孔，最后一次清洗将板子内液体去除干净。
8).显色：清洗后的板子，每孔加入50μl TMB显色液进行显色，实时观察显色状态。
9).终止：每孔加入50μl终止液进行终止，随后上机检测。
10).酶标仪双波长检测指标：使用450nm波长及610nm波长，进行读取OD值。
11).数据分析：1)将样品稀释度与检测OD值进行曲线拟合。2)得到对数曲线方程Y＝M*ln(X)+Z，其中Y值代入阴性对照OD值，确认R2。3)将阴性对照(Cut off) 2.1倍OD值带入方程X＝EXP((Y-Z)/M)，计算出抗体滴度。
结果如图4显示的实验结果，结果显示：在疫苗给药后第10天检测小鼠血清中 抗原特异性IgG抗体得知，1号疫苗给药小鼠血清滴度最高，2/5/9号疫苗几乎无抗体 产生，4/8号疫苗产生较低水平抗体。1号疫苗抗体滴度水平达到104，能够有效的激 活体液免疫应答。相比于其他疫苗，1号疫苗((SEQ NO：1)，SEQ NO：1-1)(命名 为COVID-19-LPP-mRNA)能够在短时间内刺激机体产生较高水平的抗原特异性的抗 体。从而确定1号疫苗(命名为COVID-19-LPP-mRNA)进行后续工艺开发及临床研 究。
新冠mRNA疫苗采用肌肉给药方式对小鼠进行免疫，试验期间，除2019-nCoV-2 试验组意外死亡一只，未见动物出现濒死/死亡情况。日常观察小鼠没有发现出明显的 体态及行为异常。给药后的1-2天，试验组小鼠体重有略微的下降，但都在可接受范 围之内，且体重都在1-2天以后恢复。
在免疫后第10天通过检测小鼠血清内抗体滴度，评价不同mRNA疫苗免疫原性 的强弱，进而筛选出免疫原性较强的，有效激活体内抗原特异性免疫应答的mRNA 疫苗。根据结果显示得知，nCoV-1疫苗给药组小鼠体内抗体滴度最高，nCoV-2/5/9 疫苗给药组小鼠体内几乎无抗原特异性抗体产生，nCoV-4/8疫苗能够激活机体产生抗 原特异性抗体，但抗体滴度较低。可以得知，nCoV-1新冠mRNA疫苗能够有效的激 活机体内体液免疫应答，包括生发中心B细胞的形成、抗体类型转换及高亲和抗体成 熟等。
促进
Figure BDA0002917999930000581
B细胞向记忆B细胞及浆细胞分化，产生较高水平的抗原特异性抗体。其余疫苗，2号、4号、5号、8号及9号疫苗均不能很好的激活机体内体液免疫应答， 抗原特异性抗体滴度较低不能达到理想标准。3号、6号及7号疫苗由于抗原合成原 因未能进行疫苗免疫原性检测，在抗体滴度检测试验中未展示其数据，但是后来经过 检测，这三种疫苗也有抗体产生，抗体的滴度不高，但是比对照要高，表示都有抗体 的产生，能够引起机体的免疫。
从上面的实验结果显示，1号试剂具有很好的效果，但是4或者8号具有抗体的 产生。这些差异，可能是在设计和优化核酸序列的不同而引起的不同的抗体的产生， 从而综合表现出滴度的不同。
试验4:不同浓度COVID-19-LPP-mRNA免疫C57BL/6小鼠试验
1试验目的：C57BL/6小鼠肌肉注射不同浓度COVID-19-LPP-mRNA两次，第0天和 第7天各一次，观察小鼠体重变化，并在第二次免疫后的第10天采集血液，离心获得 血清；在第二次免疫后的第14天取脾脏组织，处理脾脏细胞。
2.试验药品信息
表17：名称：COVID-19-LPP-mRNA的浓度稀释表
Figure BDA0002917999930000582
3.试验动物和管理
3.1试验动物：种属/品系：C57BL/6小鼠；等级：SPF级；雌性：30只；体重：约 18-20g；周龄：8-9周。动物分组当天使用打洞器对小鼠耳朵进行标识，左耳上中下 分别代表1/2/3号，右耳上中下分别代表4/5/6号。
3.2动物饲养：检疫期为三天，由动物房兽医于检疫期内按规定抽样对本批次动物进 行检疫。小鼠采用IVC笼具饲养，每笼不超过五只。饲养期间对动物房(411)环境 参数进行记录。所有饲料及饮水均由上海南方模式生物研究中心协助购买及提供。经 60Co辐照灭菌的SPF级小鼠饲料由江苏省协同医药生物责任有限公司提供，每批饲料 均提供包含营养，农药和微生物等检测指标的质量检测报告。去离子水、饲养容器及 垫料经由高压灭菌进入屏障内，每周更换两次。
4试验方法
给药：分别于第0天和第7天给药(第一次给药当天记为第0天)。剂量为100μl/只，于小鼠左右后肢大腿肌肉各注射50μl药物。
4.1观察和检查：试验期间每日由南模动物房动物管理人员按规定协查小鼠状态并观 察小鼠状态。试验人员按规定定期观察小鼠状态，包括但不限于：行为活动，摄食摄水量，体重变化(每周测量3次体重)，外观体征或其它不正常情况。基于各组动物 数量记录组内动物死亡数和副作用。小鼠异常情况包括但不限于：明显消瘦，体重降 低大于20％；不能自由取食和饮水；以及动物出现以下临床表现且持续恶化：立毛； 弓背；耳、鼻、眼或足色发白；呼吸仓促；抽搐；连续腹泻；脱水；行动迟缓；发声。
4.2采血准备及血样处理：在第二次免疫的第10天后，我们将对试验内的所有小鼠进 行采血。将采用眼眶丛静脉采血，每只小鼠采血约500uL。采集的全血在室温静置2 小时后，使用8000rpm，10分钟离心，取血清，血清置于-20℃保存。
4.3脾脏采取及细胞处理：在第二次免疫的第14天后，小鼠安乐死解剖取脾脏，制备 脾脏单细胞悬液。
试验结果
5.1死亡及临床观察
试验期间，未见动物出现死亡/濒死情况。试验期间，所有试验小鼠未见明显异常现象。
5.2体重
试验期间没有出现明显的体重波动。因为随机分组，各组小鼠基础体重平均值不在 同一基线，所以比较体重变化百分比以衡量动物体重变化情况。具体体重百分比变化趋势见下图5。试验期间，日常观察小鼠，没有发现明显的体态及行为异常。免疫后 1-2天，试验组小鼠均有略微体重下降，但没有体重下降超过10％的情况，且体重均 在1-2天以后恢复。体重下降程度和受试品浓度基本对应，但是差距不明显。初步推 测，体重下降由免疫系统应激反应所致。
讨论和结论
综上所述，本试验条件下，C57BL/6小鼠肌肉注射给予COVID-19-LPP-mRNA两 次，第0天和第7天各一次，剂量分别为30/15/7.5/2.5/1μg/只，结果显示，未见试验 药品相关的濒死/死亡情况。小鼠行为活动，摄食摄水量，体重变化(每周测量3次体 重)，外观体征等未见异常情况。以上数据初步说明COVID-19-LPP-mRNA无明显毒 性。
实验6：COVID-19-LPP-mRNA免疫后小鼠抗体应答效果评价
6.1实验目的：使用间接ELISA，SARS-CoV-2假病毒中和法，活病毒空斑检测法， 评价新冠mRNA疫苗COVID-19-LPP-mRNA诱导小鼠产生特异性结合抗体与中和抗 体的水平。
6.2供试品信息：名称：mRNA疫苗COVID-19-LPP-mRNA(实施例子3筛选出来的 1号疫苗)规格：0.5mg/ml；性状：乳白色液体；有效期：2-8℃储藏可保存28天
6.3实验动物：名称：SPF级近交系小鼠；数量：BALB/C小鼠18只；C57BL/6小鼠 30只(是白变种实验室老鼠，与众多常用亚系一样，起源于小家鼠(Mus musculus)。 从1920年它们在纽约诞生至今，BALB/c小鼠在全球研究机构繁衍了超过200代，广 泛用于免疫学、生理学的动物实验)；性别：雌性；年龄：6-8周龄。
4.4实验试剂及耗材：SARS-CoV-2(2019-nCoV)Spike Protein(S1+S2 ECD,Histag) (S1+S2 ECD的全称为S1+S2 extra-cellular domain,即S蛋白的胞外结构域，S蛋白全长分子量为141.20kDa，S1+S2 ECD蛋白的分子量为134.36kDa)；购买自北京义 翘神州科技股份有限公司。
EIA/RIA 96孔板；0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液(包被液)；0.5‰Tween-20 PBS(PBST洗液)；10％山羊血清PBS(封闭液)；2％山羊血清PBST(抗体稀释液)；HRP标 记的山羊抗小鼠IgG二抗；单组分TMB显色液；2M H2SO4溶液(终止液)；细胞 培养瓶；96孔细胞培养板；12孔细胞培养板(Corning)；DMEM培养基(Hyclone)； 胎牛血清(Gibco；GEMINI)；青链霉素混合液(Gibco)；Avicel RC-581(FMC Biopolymer)；结晶紫(索莱宝)；Bright-Glo荧光素酶检测试剂(Promega) SARS-CoV-2病毒：SARS-CoV-2(C-Tan-nCoV-HB-01strain,GISAIDaccession no. EPI_ISL_402119)
SARS-CoV-2假病毒：本实验室制备HIV-1核心的SARS-CoV-2假病毒(就是含有HIV-1的抗原的而不是新冠的病毒)。
4.5实验方法
4.5.1.动物免疫：本实验中，我们使用BALB/C和C57BL/6两种小鼠进行疫苗免疫原性检测，采用2种免疫剂量：30μg(高剂量)/3μg(低剂量)；2种免疫周期：单针免 疫(第0天免疫)和双针免疫(第0，21天免疫)，共8组。疫苗经PBS稀释达到规 定浓度后，经大腿部位进行肌肉注射，注射体积为30μl每侧，双侧注射。BALB/c 与C57BL/6品系小鼠每组各6只，共18只BALB/c小鼠，30只C57BL/6小鼠(具体 见表18)。
4.5.2.血清样品获取：免疫后第5周，眼眶取血500μL，10000×g离心2次，分离血清， 样品于-30℃保存。
4.5.3.间接ELISA：
抗原包被:使用包被液稀释SARS-CoV-2Spike抗原蛋白至0.5μg/mL,加入100μL至EIA/RIA 96孔板中，4℃过夜包被抗原。
检测板封闭：包被后的EIA板使用洗液清洗3次，每孔加入250μL 10％山羊血清PBS封闭液，37℃封闭2h。
血清样品稀释：使用抗体稀释液稀释血清，样品从1:100或1:300起，2或3倍比稀释，共9个稀释度，具体稀释倍数简图7，图9，图10，图12的X轴数值。
血清抗体吸附：封闭后的检测板使用洗液清洗3次，每孔加入100μL稀释好的血清样 品，于37℃孵育1h，设置空白对照，仅加入抗体稀释液
二抗结合：检测板使用洗液清洗5次，每孔加入100μL 1:10000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG二抗，室温孵育1h。
显色与终止：检测板使用洗液清洗5次，每孔加入100μL单组分TMB显色液，室温 显色5min左右，加入50μL终止液。
吸光度检测与滴度判定：使用酶标仪测定450波长吸收峰(630测定作为参考值，仅做稳定性判定)，以检测板空白孔的OD450为基础值，空白孔的2.1倍判定为阳性。 样品判定为阳性的最高稀释倍率为该样品结合抗体滴度。
4.5.4.SARS-CoV-2假病毒中和检测
细胞准备：感染前一天将Huh7.5细胞传代，按照1×105细胞/mL的量接种至96孔板， 置CO2孵箱培养至细胞60％-80％汇合度。
血清稀释与病毒预混：血清样品使用DMEM培养基稀释至50μL，从1:25起，2倍比 稀释9个稀释度，与相同体积假病毒混合，37℃共同孵育1h(具体稀释倍数简图7， 图9，图10，图12的X轴数值)。
病毒感染：将前一天准备好的细胞上清吸去，加入血清病毒混合液，孵箱培养过夜， 次日更换为2％FBS DMEM继续培养48h。
中和检测：使用Bright-Glo Luciferase Assay System检测细胞中Fluc表达情况，记为 相对光单位(RLU)，中和计算方法如下，中和百分数＝(空白对照RLU–血清中和RLU)/空白对照RLU*100％。
半数有效浓度计算：EC50的对数＝大于50％的阳性百分比的最高稀释对数+距离比例 x稀释系数的对数(距离比例＝(大于50％的阳性百分比-50)/(大于50％的阳性比-小于50％的阳性百分比)
4.5.5.SARS-CoV-2活病毒空斑减少中和实验
细胞准备：感染前一天将Vero细胞传代，按照1×104细胞/100μL，的量接种1mL至12孔板，置CO2孵箱培养至细胞80％-90％成片。
血清稀释：将待检血清56℃灭活30分钟，无菌条件下以无血清DMEM稀释血清，4 倍稀释做3个稀释度。
洗涤细胞：第二天在进入P3实验室前，弃细胞培养液，加入2％FBS-DMEM维持培 养基500μL/孔，由操作人员带入P3实验室。
病毒的准备：从-70℃冰箱取出病毒，在P3生物安全柜内化开，用无血清DMEM培 养液稀释。
血清/抗体与病毒中和：将各稀释度的血清/抗体与等体积的病毒混合，37℃，5％CO2培养箱中孵育1h。
病毒-血清/抗体感染细胞：吸弃培养基，加入稀释好的病毒-抗体混合物，37℃，5％CO2培养箱孵育1h。
加覆盖液：吸弃感染液，每孔加入1mL Avicel-2％FBS-DMEM培养基，37℃，5％CO2温箱培养72h。
固定：72h后，将12孔板从CO2孵箱取出，每孔内加入1mL预冷的4％多聚甲醛， 室温固定30min。
染色：吸弃多聚甲醛，每孔加入500μL0.1％结晶紫染色5min。
洗涤：吸弃染色液，以双蒸水1mL孔洗1-2次，晾干后计数。
观察计数：根据染色结果计数空斑数，根据病毒对照孔和实验孔的空斑数计算中和率。
中和率＝(病毒孔空斑数-实验孔空斑数)/病毒孔空斑数*100％
半数有效浓度计算：EC50的对数＝大于50％的阳性百分比的最高稀释对数+距离比例 x稀释系数的对数(距离比例＝(大于50％的阳性百分比-50)/(大于50％的阳性比-小于50％的阳性百分比)。
4.6实验结果
4.6.1动物免疫、分组与时间点
表18：剂量和不同品种小鼠接种表格
Figure BDA0002917999930000631
Figure BDA0002917999930000641
4.6.2.结合抗体滴度检测
疫苗免疫小鼠血清样品从1:300开始稀释，3倍比至1:656100，共8个稀释度。 对照组小鼠血清样品从1:100开始稀释，3倍比至1:2700，共4个稀释度(图6-图7)。
BALB/c小鼠血清检测结果见表4-1和图6，C57BL/6小鼠结果见表4-2和图7。 两种品系小鼠高剂量两针组均可检测到高水平的抗原特异性IgG，证明疫苗具有良好 的免疫原性，低剂量双针同样可以检测到抗体产生，滴度相对较低，C57BL/6单针剂 组别，高剂量单次免疫可以产生一定的特异性抗体，低剂量单次免疫无法有效诱导特 异性抗体产生。
表4-1.BALB/c小鼠抗体检测滴度
Figure BDA0002917999930000642
Figure BDA0002917999930000651
表4-2.C57BL/6小鼠抗体检测滴度
Figure BDA0002917999930000652
BALB/c&C57BL/6小鼠血清抗体滴度如图8所示：2种品系小鼠在疫苗免疫后，均 可产生针对新型冠状病毒S蛋白的抗体。高剂量二免加强后，两种品系小鼠均产 生超过1:105滴度的特异性IgG，其中BALB/c小鼠产生的抗体滴度平均1:310,000； C57BL/6小鼠产生的抗体滴度平均1:180,000。BALB/c小鼠中，低剂量2次免疫 也可诱导产生接近104滴度的特异性抗体；C57BL/6小鼠高剂量单次免疫和低剂量 2次免疫产生的抗体水平相似，均超过103。疫苗免疫后特异性体液免疫应答可以 被激活，疫苗具有良好的免疫原性。
4.6.3.基于SARS-CoV-2假病毒的血清中和抗体效价检测
高剂量双针疫苗免疫小鼠血清样品从1:100开始稀释，2倍比至1:25600，共9个 稀释度；高剂量单针及低剂量双针疫苗免疫小鼠血清样品从1:50开始稀释，2倍比至 1:12800，共9个稀释度。低剂量单针疫苗免疫小鼠血清样品从1:25开始稀释，2倍 比至1:6400，共9个稀释度；对照组小鼠血清样品从1:25开始稀释，2倍比至1:800， 共4个稀释度。
BALB/c小鼠中和抗体检测结果见表4-3和图9，C57BL/6小鼠结果见表4-4和 图10。除低剂量单针免疫外，其他免疫组别均诱导出一定水平的中和抗体，两种小鼠 的高剂量双针免疫均诱导出较高滴度的中和抗体。
表4-3.BALB/c小鼠中和抗体滴度
Figure BDA0002917999930000661
表4-4.C57BL/6小鼠中和抗体滴度
Figure BDA0002917999930000662
*无血清
BALB/c&C57BL/6小鼠血清假病毒检测中和抗体滴度如图11所示：两种品系小鼠在疫苗免疫后，均可产生针对新型冠状病毒中和抗体。高剂量二免加强后，两种品系 小鼠均产生超过1:104滴度的中和抗体，其中BALB/c小鼠产生的中和抗体滴度平均 1:13,000；C57BL/6小鼠产生的抗体滴度平均1:25,000。BALB/c小鼠中，低剂量2次 免疫也可诱导产生中和抗体，稳定可检出；C57BL/6小鼠中，高剂量单针诱导的中和 抗体滴度优于低剂量两针免疫。疫苗免疫后可以产生针对SARS-CoV-2的中和抗体， 剂量与免疫策略合适，可有诱导高水平中和抗体产生。
4.6.5.SARS-CoV-2空斑减少中和抗体检测结果
样品别均以1:50，1:200，1:800，3个稀释度，用于病毒血清混合。BALB/c小鼠 中和抗体检测结果见表4-5和图12，C57BL/6小鼠结果见表4-6和图13。两种品系小 鼠高剂量双针组别均诱导出高滴度的中和抗体，抑制SARS-CoV-2活病毒的感染。
表4-5.BALB/c小鼠活病毒中和抗体滴度
Figure BDA0002917999930000671
表4-6.C57BL/6小鼠中和抗体滴度
Figure BDA0002917999930000672
*无血清
BALB/c&C57BL/6小鼠血清活病毒检测中和抗体滴度如图14所示。
活病毒空斑减少试验结果显示，高剂量两针的两种品系小鼠均产生接近或超过1:104滴度的中和抗体，其中BALB/c小鼠产生的中和抗体滴度平均1:9,800；C57BL/6 小鼠产生的抗体滴度平均1:12,000。低剂量及高剂量单针免疫组别的多数血清样品中 和抗体滴度不足以在试验稀释度下达到半数有效浓度，但试验结果显示，低稀释度下 病毒感染可被部分抑制，与对照组别有明显差异。
4.7.实验结论
新型冠状病毒mRNA疫苗SW0123免疫小鼠后，可以诱导特异性IgG产生，并且 诱导出的抗体具有良好的中和活性。30μg剂量，间隔3周的两次免疫方案，可以有效 诱导产生高滴度特异性抗体，其中BALB/c小鼠可检出的抗体滴度平均1:310,000； C57BL/6小鼠检出的抗体滴度平均1:180,000。结合抗体滴度超过1:105，体液免疫诱 导能力优秀。两种品系小鼠在疫苗免疫后，均可产生针对新型冠状病毒中和抗体。30μg 的高剂量两针免疫，两种品系小鼠均产生接近1:104滴度的中和抗体，可有效抑制病 毒细胞水平的感染。
实验证明，SW0123疫苗可以有效诱导BALB/c和C57BL/6小鼠产生特异性体液 免疫应答，抗原特异性IgG具有良好的中和活性；高剂量双针免疫可以在动物体内诱 导出较强的中和活性抗体。
实验7：不同剂量COVID-LPP-mRNA免疫后小鼠抗原特异性T细胞应答水平的评价
7.1.实验目的：COVID-LPP-mRNA免疫小鼠后，利用ELISPOT方法检测小鼠体内细胞免疫应答水平。
7.2供试品信息：名称：mRNA疫苗COVID-19-LPP-mRNA；规格：0.5mg/ml；性状： 乳白色液体；有效期：2-8℃储藏可保存28天
7.3实验动物：种属、品系、等级、数量及体重、周龄；
种属/品系：C57BL/6小鼠，雌性
等级：SPF级
体重：约18-20g
周龄：8-9周。
检疫期为三天，由动物房兽医于检疫期内抽样对本批次动物进行检疫。小鼠采用IVC 笼具饲养，每笼不多于五只。饲养期间对动物房(411)环境参数进行记录。所有饲 料及饮水均由上海南方模式生物研究中心协助购买及提供。经60Co辐照灭菌的SPF 级小鼠饲料由江苏省协同医药生物责任有限公司提供，每批饲料均提供包含营养，农 药和微生物等检测指标的质量检测报告。去离子水、饲养容器及垫料经由高压灭菌进 入屏障内，每周更换两次。
7.4实验试剂及耗材
0.01M PBS缓冲液(PH＝7.4)(索莱宝)；红细胞裂解液(懋康生物)；RPMI-1640培养基(Gibco)；胎牛血清；ELISPOT检测：Elispot检测试剂盒(Mabtech)、OVA抗 原(金斯瑞)、PMA(达科为)；包被抗原：S蛋白胞外段(义翘神州)；离心机；二 氧化碳细胞培养箱(Panasonic)；ELISPOT读板机(德国艾迪)
7.5实验方法
5.5.1小鼠免疫
C57BL/6小鼠肌肉注射不同浓度mRNA新型冠状病毒肺炎疫苗两次，第0天和第 7天各一次，第二次免疫后第14天进行脾脏细胞制备。
5.5.2脾脏细胞制备
取脾脏进行研磨，制备脾脏单细胞悬液，每个样本脾脏细胞中加入5ml红细胞裂解液，进行红细胞裂解。
随后加入25ml 1640培养基进行终止，利用细胞筛网将细胞悬液过滤，滤除杂组织碎 片。
细胞进行离心，1500rpm离心5min，弃上清，加入5ml培养基重悬细胞进行计数。
5.5.3抗原特异性T细胞免疫应答检测
将计数完成的细胞进行浓度调整，调整为3*10E6细胞/ml。
将细胞悬液加入至检测板中，每孔加入100μl细胞悬液(30万个细胞)。
用培养基配制相应抗原多肽(20μg/ml)溶液重悬细胞，PMA-Ionomycin作为阳性对照，OVA(20μg/ml)作为阴性对照，不加任何刺激物的细胞悬液作为空白对照。 每孔加入100μl抗原稀释液(浓度：10μg/ml)，刺激细胞24小时。
刺激结束后第二天，按照试剂盒说明书进行操作：
(1)将检测板内细胞培养液丢弃，使用PBS进行清洗，200μl/孔，清洗5遍。
(2)将anti-mouse IFN-γ抗体稀释至1μg/ml，每孔加入100μl进行孵育，空气浴27度孵育2小时。
(3)孵育结束后的样本使用PBS进行清洗，200μl/孔，清洗5遍。
(4)加入二抗，按照1:1000稀释度进行稀释，每孔加入100μl进行孵育，空气浴27度孵育1小时。
(5)孵育结束后的样本使用PBS进行清洗，200μl/孔，清洗5遍。
(6)显色：每个孔中加入100μl显色剂进行显色。
(7)终止：显色完成后，将显色液丢弃，使用双蒸水进行清洗，晾干进行扫描。
5.6实验结果
根据结果得知(图15A-15C)，经过两次疫苗免疫后对小鼠进行取血检测，发现IgM、IgG及IgG1类型抗体都具有较高的抗体滴度，其中IgG抗体滴度最高。根据不 同疫苗剂量结果来看，IgM抗体滴度伴随给药剂量的降低而降低，IgG及IgG1抗体 滴度也伴随着疫苗剂量的降低而逐渐下降，但下降幅度并不显著。另外，IgG1与IgG 抗体滴度相比较发现，IgG1滴度低于IgG抗体滴度。
结果显示(图16A-16B)，COVID-LPP-mRNA能够显著激活抗原特异性T细胞反 应应答，并且呈现剂量依赖性。结果显示，经疫苗免疫后，无论是高剂量组还是低剂 量组小鼠脾脏内抗原特异性T细胞均明显增多。根据不同剂量结果得知，随着疫苗剂 量的降低抗原特异性T细胞反应强度也逐渐降低，其中30μg免疫剂量组抗原反应最 强。COVID-19-LPP-mRNA疫苗采用肌肉给药方式对小鼠进行免疫，mRNA疫苗进入 机体后能够激活抗原提呈细胞包括巨噬细胞、树突状细胞及B淋巴细胞等。同时疫苗 被抗原提呈细胞吞噬，在细胞内，mRNA经溶酶体逃逸释放至细胞质中与核糖体结合 翻译成抗原蛋白。随后，大部分抗原蛋白经蛋白酶体及溶酶体降解途径降解为抗原多 肽，少部分未被降解的蛋白表达在细胞表面。降解后的抗原多肽，在细胞内与MHC-I 类分子及MHC-II类分子进行结合提呈至细胞表面，通过与不同亚群T细胞表面TCR 分子结合，刺激不同T细胞活化。活化后的抗原提呈细胞通过MHC-I类分子与CD8 T 细胞表面TCR相互作用刺激机体产生抗原特异性CTL免疫应答，通过MHC-II类分 子与CD4 T细胞表面TCR相互作用，激活不同CD4 T细胞免疫应答。不同的CD4 T细胞展示出不同的功能，一方面能够与CD8 T细胞相互促进维持CTL免疫应答，另 一方面滤泡辅助性T细胞能够与生发中心B细胞相互促进，促进B细胞分泌抗原特 异性高亲和力的抗体。
部分表达在抗原呈递细胞(巨噬细胞、树突状细胞)表面的抗原通过与
Figure BDA0002917999930000711
B 细胞表面BCR结合激活B细胞。活化后的B细胞逐渐分化发育形成生发中心B细胞， 与经过相同抗原激活的滤泡辅助性T细胞相互作用下，生发中心B细胞经过体细胞高 频突变、抗体类型转换及高亲和力抗体成熟等过程，最终分化形成记忆B细胞及浆细 胞。
根据IgM及IgG检测结果得知，第二次免疫后第十天小鼠血清内抗原特异性IgG 类型抗体处于较高水平，而抗原特异性IgM抗体处于较低水平。主要由于，在疫苗免 疫初期机体分泌抗体主要以IgM类抗体为主，随着时间推移，在B细胞与T细胞相 互作用下，生发中心B细胞受到不同细胞因子作用下，IgM类型抗体逐渐向不同类型 抗体进行转换。到免疫后期阶段，机体内IgM抗体滴度处于较低水平，主要以IgG类 型抗体为主。
根据IgG及IgG1抗体检测结果得知，小鼠血清内IgG1类型抗体处于较高水平， 略低于总IgG抗体。这一试验结果表明，小鼠体内IgG类型抗体主要以IgG1抗体为 主。疫苗免疫后，促进生发中心B细胞与滤泡辅助性T细胞相互作用，分泌大量白细 胞介素-4(IL-4)。IL-4与B细胞表面IL-4受体结合，激活B细胞内下游与IgG1类 型抗体转换的相关信号通路，进而促进机体内IgM类型抗体向IgG1类型抗体的转换。 因此，可以得知，新冠mRNA疫苗激活机体产生的抗原特异性抗体以IgG1类型为主， 而IgG1类型抗体在抵抗病毒感染方面具有很强的作用。
根据不同给药量结果得知，IgM类型抗体分泌呈现出显著的量效关系，伴随着疫苗给药量逐渐减少，抗体滴度逐渐下降。总IgG及IgG1抗体并没有呈现明显的量效 关系，但是也能看出高剂量组与低剂量组之间抗体滴度的差异。其中30μg给药组抗 体滴度最高，1μg给药组抗体滴度则显示最低，而7.5μg与15μg组没有明显差异。 差异不明显主要由于本次试验采用两次给药后第十天进行检测抗体滴度，检测时间点 处于免疫后期，IgG类型抗体分泌水平处于最高期，很难观察由于微小剂量的不同所 引起的免疫应答强弱之前的明显差异。因此，可以得知，给药量逐渐升高机体内所产 生的抗体滴度有升高趋势，在最高剂量表现出最高抗体滴度。
根据抗原特异性T细胞免疫应答结果得知，疫苗免疫后小鼠体内抗原特异性T 细胞免疫应答显著升高，并显示出量效关系。这一结果表明，疫苗进入机体后被抗原 提呈细胞吞噬，经过一系列免疫应答激活机体内
Figure BDA0002917999930000721
CD4和CD8 T细胞活化，分化 形成效应T细胞和记忆T细胞。体外利用相同抗原对脾脏细胞再次刺激，短时间内能 够快速活化抗原特异性效应T细胞和记忆T细胞，并分泌相应的细胞因子(如IFN-γ) (图16A)。根据不同给药剂量结果得知，随着剂量的降低T细胞免疫应答反应强度 逐渐降低，呈现出量效关系。其中，15μg给药组及7.5μg给药组无明显差异，1μg 给药组与2.5μg给药组无明显差异。可能由于剂量相差较小，没有引起T细胞免疫应 答的显著变化。综上所述，疫苗能够激活机体内抗原特异性T细胞免疫应答。
综上所述，COVID-19-LPP-mRNA疫苗能够活化机体内体液及细胞免疫应答，刺 激机体产生较高滴度抗原特异性IgM、IgG及IgG1类型抗体及较强的抗原特异性T 细胞免疫应答。因此，可以认为COVID-19-LPP-mRNA疫苗具有较好的免疫原性及免 疫反应性。
试验8:检测COVID-19-LPP-mRNA疫苗免疫后小鼠血清中和抗体滴度
供试品信息：
C57BL/6小鼠肌肉注射不同浓度COVID-19-LPP-mRNA两次，第0天和第7天各一次，第二次免疫后第10天采集血液，离心获得血清，具体步骤参见“COVID-19-LPP-mRNA 免疫C57BL/6小鼠”报告。本试验选取30μg，7.5μg，1μg三个剂量组小鼠血 清进行中和抗体检测。
试验试剂：Huh-7cell(来源于中检院)；假病毒(来源于中检院)DMEM完全培养 基(Gibco)：1％双抗(Gibco)，10％FBS(Hyclone)Luciferase检测试剂盒(PerkinElmer) PBS(索莱宝)；0.25％胰酶(Gibco)
试验耗材：T75细胞培养瓶(Thermo)；96孔白色细胞培养板(Corning)；15/50ml 离心管(Corning)；3.3试验仪器；倒置显微镜(Leica)；CO2培养箱(Panasonic) 酶标仪(BioTek)
试验步骤
1.血清样品稀释：使用完全培养液稀释血清样品，稀释倍数为20X，60X，180X，540X,1620X，4860X。
2.病毒使用完全培养基稀释至2*104TCID50/ml。
3.试验组每孔加入100ul稀释血清，50ul病毒稀释液；空白对照加入150ul完全培养 基；病毒对照组加入100ul完全培养基，50ul病毒稀释液。
4. 37℃，5％CO2，孵育1小时。
5.Huh-7细胞加入胰酶消化1分钟，加入完全培养基中和，210g离心5分钟，使用完全培养基重悬细胞，计数，调整细胞浓度为2*105个/ml。
6.血清和假病毒孵育1小时后，将细胞加入96孔发光板中，每孔100ul，37℃，5％CO2， 培养20-28小时。
7.将细胞上清吸出，使用PBS清洗一遍。清洗后，每孔加入100ul PBS。
8.再加入100ul荧光素酶检测试剂。室温避光反应2min。
9.反应结束后，使用酶标仪检测荧光值。
10.计算抑制率和半数抑制稀释度ID50。抑制率＝【(1-(样品组均值-空白对照组均值) /(病毒组均值-空白对照组均值)】*100％。根据抑制率数据，利用Reed-Muench计算 半数抑制稀释度ID50，具体计算公式如下：
ID50＝10lg(X)+lg(1/K)×(0.5-B)/(A-B)
A：高于50％荧光值比例孔的抑制率；B：低于50％荧光值比例孔的抑制率；X：低于50％荧光值比例的稀释倍数；K：系列稀释倍数。
4试验结果
5.1不同剂量组小鼠血清对假病毒感染细胞的抑制率(图17)
5.2不同剂量组小鼠血清半数抑制稀释度(ID50)
Figure BDA0002917999930000731
Figure BDA0002917999930000741
通过肌肉给药方式，小鼠经COVID-19-LPP-mRNA疫苗二次免疫后第10天进行 取血，利用假病毒检测血清中和抗体水平。结果显示二次免疫后小鼠血清产生较高水 平的中和抗体，能够有效中和由SARS-CoV-2S蛋白构建的假病毒，对假病毒感染细 胞有较强抑制作用，并且呈现明显的量效关系。低剂量组(1μg/只)小鼠血清中和抗 体半数抑制稀释度ID50低于20；中剂量组(7.5μg/只)除一只小鼠血清ID50低于20， 剩余小鼠血清ID50平均值为990；高剂量组(30μg/只)小鼠血清ID50平均值为2918。 以上结果说明COVID-19-LPP-mRNA两次免疫后能够诱导产生高水平中和抗体，有效 抑制假病毒的感染。
中和抗体是衡量疫苗免疫保护效果的一项重要指标，也是疫苗评估和质控的重要依据。利用活病毒进行体外中和抗体检测，对实验室等级要求高，需要在生物安全三 级实验室内进行，给研究带来较大困难。因此研究者也可以使用假病毒体系进行中和 抗体检测，假病毒感染细胞是指通过使用含有目标病毒的棘突蛋白(S蛋白)构建的 假病毒感染易感细胞来模拟病毒的感染及复制过程，通常引入灵敏度高且易于检测的 报告基因如荧光素酶(Luciferase)来优化检测体系。本试验采用含有SARS-CoV-2 病毒的棘突蛋白(Spikeprotein，S)和Luciferase报告基因的假病毒，检测免疫后小 鼠血清中和抗体滴度。
Luciferase报告基因假病毒检测系统基本原理如下：假病毒感染易感细胞Huh-7细胞后，能够翻译出荧光素酶luciferase，荧光素酶在Mg2+、ATP、O2的参与下，催 化荧光素(D-luciferin)氧化脱羧，产生激活态的氧化荧光素，并放出光子，产生550～ 580nm的荧光，使用酶标仪对荧光强度进行检测，所得到的检测数值能够反映假病 毒对细胞的感染效率。
本试验将编码SARS-CoV-2病毒S蛋白抗原的COVID-19-LPP-mRNA疫苗免疫 小鼠，小鼠体内会产生针对SARS-CoV-2病毒S蛋白的中和抗体。将免疫后小鼠血清 与假病毒共孵育后，血清中的中和抗体能够与假病毒颗粒上的S蛋白结合，阻止S蛋 白与受体ACE2的结合，从而阻断假病毒进入宿主细胞中，荧光素酶的表达降低。我 们设置一系列浓度梯度对小鼠血清进行稀释，与假病毒共孵育后，加入到易感细胞 Huh-7中，培养20-28小时，使用luciferase检测试剂盒检测病毒对细胞的感染效率。 通过计算中和抗体对假病毒感染的抑制率，根据抑制率数据，利用Reed-Muench计算 ID50。
COVID-19-LPP-mRNA疫苗能够刺激机体产生高水平中和抗体，阻止假病毒感染 细胞，提示COVID-19-LPP-mRNA疫苗对SARS-CoV-2病毒感染具有较好的预防作用。 并通过分析三种不同剂量组小鼠的中和抗体水平，发现COVID-19-LPP-mRNA具有明 显的量效关系，这为后续的攻毒试验以及临床应用提供参考。
实验9：COVID-19-LPP-mRNA免疫后对小鼠抵抗SARS-CoV-2感染的保护效果评价
实验目的：应用SARS-CoV-2感染Ad-hACE2转导小鼠模型，评价新型冠状病毒mRNA疫苗的保护效果。
供试品信息
名称：mRNA疫苗COVID-19-LPP-mRNA
提供方：斯微(上海)生物科技有限公司
规格：0.5mg/ml
性状：乳白色液体
有效期：2-8℃储藏可保存28天
实验动物
名称：Ad-hACE2转导小鼠
数量：BALB/C小鼠12只；C57BL/6小鼠19只
性别：雌性
年龄：18-20周龄
动物来源：维通利华公司
动物生产许可证号：SCXK(京)2016-006
实验试剂及耗材
螺旋口1.5(SCT-150-C-S)和2.0ml(SCT-200-C-S)EP管；戊巴比妥钠麻醉剂；4％多聚甲醛；DMEM培养基；75％乙醇；无菌PBS；1ml移液器，200ul移液器；
金属浴一个，可以放入螺旋口管子；50ml管的泡沫盒，15ml管的泡沫盒，各2个。 体重记录表单，肺重量记录单。200ul带滤芯枪头，2盒；1ml带滤芯枪头1盒。 研磨器；核心区的高速离心机；1ml注射器；解剖板-泡沫；无菌剪刀镊子3套；
实验方法
小鼠分组情况及免疫方法
本实验中，我们使用BALB/C和C57BL/6两种小鼠共同完成免疫原性检测试验，采用2种免疫剂量：(高剂量)30μg/3μg(低剂量)；2种免疫周期：单针免疫(第0天给 药)和双针免疫(第0，21天给药)，共8组。
疫苗经PBS稀释达到规定浓度后，经大腿部位进行肌肉注射，注射体积为30μl每侧， 双侧注射。
具体分组及实验日期见下表：
Figure BDA0002917999930000761
Figure BDA0002917999930000762
注：C：C57BL/6；B：Balb/C；DD:双针免疫；SD：单针免疫；LD：低剂量；HD： 高剂量
转导Ad5-hACE2
攻毒前5天，小鼠经轻度麻醉后，将45μl含2.5×108pfu Ad5-hACE2的DMEM 培养液通过滴鼻的方式，转染小鼠呼吸系统。而后小鼠转移至ABSL3生物安全实验 室中，饲养观察5天，备用于SARS-CoV-2感染实验。
病毒攻击实验
Day 0：SARS-CoV-2感染
(1)称重：Ad5-hACE2转染的小鼠确认状态良好后，称量体重。
(2)麻醉：使用戊巴比妥钠按照60mg/Kg剂量进行麻醉。
(3)滴鼻感染：小鼠深度麻醉后，将含5×105TCID50剂量病毒50μl滴鼻感染小鼠。
Day 1-3：观察称重，准备用品
(1)观察称重：每天观察小鼠、记录体重情况，连续观察3天
(2)按照小鼠数量、实验分组准备以下实验用品：
Figure BDA0002917999930000771
1XPBS缓冲液：1000ml，高压后待用：分出500ml，按照1:100比例加入双抗PS(10000U)(5ml+500ml)。
Figure BDA0002917999930000772
解剖器具：2套，每套器械包括：弯头镊子，齿镊，小剪刀，平头镊子，弯头剪 刀，手术镊各2把，高压后待用。
Figure BDA0002917999930000773
1.5ml螺旋口EP管：2盒，高压后待用。
Figure BDA0002917999930000774
1.5ml螺旋口EP管(装好皓珠)：1盒，高压后待用。
Figure BDA0002917999930000775
5ml离心管：2盒，高压后待用。
Figure BDA0002917999930000776
50ml离心管：25个(事先装好30ml 4％多聚甲醛)
Figure BDA0002917999930000777
抗凝1.5ml离心管：1盒(视到货情况准备)
Figure BDA0002917999930000778
高通量组织匀浆仪
小鼠取血、解剖及取组织器官
(1)采血与处死：每组小鼠取3只，于生物安全柜中眼眶取血，颈椎脱臼安乐死 小鼠。
(2)解剖和肺取组织：小鼠全身喷洒75％乙醇，固定小鼠，使腹部朝上，于生物 安全柜中解剖。左手拿弯头镊子夹起腹部皮肤，右手用剪刀剪开皮下组织与肌肉剥离， 朝前剪至颈部；将皮往两侧翻，露出胸部，另换用一消毒的剪刀将两侧肋骨各剪一刀， 将胸骨与肋骨往上翻开，然后用弯的眼科镊子从肺与气管连接处放入，将整个肺托出。
(4)肺组织处理：
(A)左肺：放置于2ml PBS(PS+)中，清洗2遍后直接浸泡于10ml的4％多聚甲 醛中，用于病理切片和组化。标本经常规组织处理，石蜡包埋，切片，H.E.染色，描 切片，采集数码图像。
(B)右肺：称重记录，放置于2ml PBS(PS+)中，清洗2遍后，按照1:10～1:20体 积使用PBS(PS+)重悬(重悬体积不低于300ul，如体积太小，则按比例扩大1:30 重悬)，转移至带有皓珠的1.5ml螺旋管中。-70冻存过夜，次日制备肺组织匀浆液体 (K4实验室)。
(5)样本转移：所有样本放置密封冻存管与容器中、容器表面充分消毒后转移至K4实验室。
肺组织匀浆处理及病毒滴度测定
(1)肺组织匀浆：从-70冰箱取出肺组织，化开后进行匀浆处理。
(2)离心：匀浆液4000rpm，4℃离心5分钟，将上清转移至一新的1.5ml螺旋口 EP管。
(3)肺组织匀浆液核酸拷贝数测定(2020.5.12)：取上清100μl提取核酸，使用 RT-PCR方法测定肺组织的病毒拷贝数。
(4)肺组织匀浆液TCID50滴度测定(2020.5.12-5.15)：取上清100μl，从10-1开 始进行10倍稀释，共做4个稀释度(10-1，10-2，10-3，10-4)，100ul感染事先准备好 的Vero细胞，每个稀释度做8个复孔，72～96h后观察判定TCID50。
病毒核酸提取以及real-time qCPR检测
在生物安全柜中取200μl鼠肺悬液加入Ex-DNA/RNA病毒(CDC)核酸提取试剂盒(T104，西安天隆科技有限公司)的裂解液中进行裂解，完全灭活后，按照全自动旋 转式核酸提取仪(GeneRotex 96，西安天隆科技有限公司)说明书提取核酸，最后使 用80μl洗脱液洗脱。取核酸5μl配制体系，在ABI Q5荧光定量PCR仪上进行实时荧 光RT-PCR反应。正向引物(F)：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA；反向引物(R)： ACGATTGTGCATCAGCTGA；荧光探针(P)：
5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'，反应体系为：12.5μL 2×OneStep SYBR RT-PCR BufferⅢ、0.5μL Takara Ex Taq HS、0.5μLPrimeScript RT EnzymeMixⅡ、1μL上游引物、1μL下游引物、1μL探针、5μL RNA模板，并用无 菌双蒸水补至25μL。反应参数为：42℃5min、95℃10s一个循环；95℃10s、60℃ 30s，循环40次，延伸后采集荧光信号。
6.6实验结果
6.6.1小鼠体重：每日的小鼠体重原始数据见表6-1。以第一天的小鼠体重作为初始体 重，分析每天小鼠体重变化趋势。Balb/C小鼠结果见表6-1和图18。Balb/C小鼠转导Ad-hACE2后第5天感染新型冠状病毒，连续观测4天，状态良好，体重未见明显下 降。C57小鼠结果见表6-2和图19。C57小鼠转导Ad-hACE2后第5天感染新型冠状 病毒，连续观测4天，状态良好，体重未见明显下降。
表6-1 Balb/C小鼠体重原始数据
Figure BDA0002917999930000791
表6-2. C57小鼠体重原始数据
Figure BDA0002917999930000792
Figure BDA0002917999930000801
6.6.2小鼠肺组织病毒载量滴定：将解剖取出的肺组织经过称重、研磨、提RNA和定量PCR分析，用于研磨的肺组织重量和定量PCR得到的Ct值原始数据以及TCID50 测定结果见表6-3,表6-4以及图20,图21。Balb/C小鼠转导Ad-hACE2后感染新型 冠状病毒，可以检测到病毒在肺部的复制与增殖(平均Copies/g＝109.12； logTCID50/ml＝4.75)。高剂量mRNA疫苗免疫组可有效保护Balb/C抵抗新冠病毒攻击， 双针免疫平均Copies/g＝107.84；logTCID50/ml＝2.54，与对照组有统计学差异(表6-3， 图20)。
C57小鼠转导Ad-hACE2后感染新型冠状病毒，可以检测到病毒在肺部的复制与增殖 (平均Copies/g＝109.03；logTCID50/ml＝4.06)。高剂量mRNA疫苗免疫组可有效保护 C57小鼠抵抗新冠病毒攻击，单针免疫平均Copies/g＝106.67；logTCID50/ml＝2.79；双 针免疫平均Copies/g＝104.56；logTCID50/ml＝1.96，与对照组有统计学差异(表6-4，图 21)。
表6-3 Balb/C小鼠肺组织病毒载量滴定相关原始数据
Figure BDA0002917999930000802
表6-4 C57小鼠肺组织病毒载量滴定相关原始数据
Figure BDA0002917999930000803
Figure BDA0002917999930000811
6.6.3肺组织病理
免疫组和对照组各取3只小鼠的肺脏，包埋在石蜡中进行组织切片。而后用hematoxylin and eosin(H&E)进行染色。图22-23为Balb/C各组小鼠结果，图6-6为 C57各组小鼠结果。对照组：肺小静脉炎及间质性肺炎。肺部大面积肺泡破裂、大量 炎性细胞浸润，肺部病理严重、肺泡腔内有炎性渗出。疫苗组：肺小静脉炎及间质性 肺炎。肺泡出现部分破裂、部分炎性细胞浸润。仅见部分肺泡融合、少量肺泡壁增厚、 少量炎性细胞浸润。
6.7实验结论
Balb/C小鼠对照组攻毒后体重无明显下降。肺组织病毒滴度RNA拷贝数达每克Copies/g＝109.12，病毒TCID50达每克logTCID50/ml＝4.75。肺部病变明显，有重度的间 质性肺炎。
Balb/C小鼠免疫组攻毒后，高剂量mRNA疫苗2针免疫组小鼠体重无明显下降。 肺组织病毒滴度RNA拷贝数为每克Copies/g＝107.84，平均下降了1.28Log倍(19.1 倍)；病毒TCID50滴度为每克logTCID50/ml＝2.54平均下降了2.21Log倍(161倍)。 肺部病变较轻，有轻度的间质性肺炎。提示mRNA疫苗高剂量两针疫苗免疫有明显 的保护作用。
C57小鼠对照组攻毒后体重无明显下降。肺组织病毒滴度RNA拷贝数达每克Copies/g＝109.03病毒TCID50达每克logTCID50/ml＝4.06。肺部病变明显，有重度的间质 性肺炎。
C57小鼠免疫组攻毒后，高剂量mRNA疫苗2针免疫组小鼠体重体重无明显下降。 肺组织病毒滴度RNA拷贝数为每克Copies/g＝104.56，平均下降了4.47Log倍(29211 倍)；病毒TCID50滴度为每克logTCID50/ml＝1.96平均下降了2.1Log倍(120倍)。 肺部病变较轻，有轻度的间质性肺炎。
提示mRNA疫苗高剂量两针疫苗免疫有明显的保护作用。
实验10：恒河猴经COVID-19-LPP-mRNA免疫后抗新型冠状病毒感染效果的验证
实验目的：运用中国医学科学院医学生物学研究所国家昆明高等级生物安全灵长类动 物实验中心的P3/P4实验室，对免疫新型冠状病毒mRNA疫苗(COVID-19-LPP-mRNA) 后恒河猴体内的免疫原性和新型冠状病毒攻击后的保护效果进行评价。
供试品信息：名称：mRNA疫苗COVID-19-LPP-mRNA；提供方：斯微(上海)生物 科技有限公司；规格：0.2mg/ml；性状：乳白色液体；有效期：2-8℃储藏可保存28 天。
实验动物：7只雄性实验恒河猴由中国医学科学院医学生物学研究所提供(实验动物 生产许可证：SCXK(滇)K2015-0004)，年龄4岁，分为2个组，PBS组(3只)、 疫苗组(4只)。在攻毒前3天转入P4大动物实验室适应性饲养。所有动物实验均遵 照生物安全操作规范和动物伦理实施，并对动物给予人道关怀，确保动物福利。实验 操作均在麻醉状态下进行，可兼顾生物安全和动物伦理准则。动物实验通过了中国医 学科学院医学生物学研究所实验动物伦理委员会审查批准，批准编号： DWSP202004042。
实验用毒株：新型冠状病毒(SARS-CoV-2)来源于广东省疾病预防控制中心，所使用的一株是被命名为“GD108#株”的毒株。国家昆明高等级生物安全实验中心对该病 毒的引进和运输，获得了国家卫健委的批准，并在本中心扩增、保存。
实验用试剂
Figure BDA0002917999930000821
Figure BDA0002917999930000831
实验仪器
Figure BDA0002917999930000832
实验方法
0.7.1疫苗免疫
取相同饲养条件下猴子，按照分组要求分组，进行免疫。
实验组别 所需数量
疫苗组：COVID-19-LPP-mRNA 雄性4只
PBS注射组(模型对照组) 雄性3只
初次免疫：Day 0；二次免疫：Day 14；三次免疫：Day 33；
10.7.2免疫方式及剂量
免疫方式：进行肌肉注射，左右双臂两点注射；
剂量：无佐剂疫苗组：200μgCOVID-19-LPP-mRNA；
体积：1.0mL；
浓度：200μg/mL；
10.7.3SARS-CoV-2病毒的培养、浓缩、滴定
SARS-CoV-2病毒在VERO-E6细胞中具有较好的适应性，用20个T225细胞培养瓶 接种病毒后，用显微镜观察到明显的CPE后，约72h收毒-80℃冻存。次日4℃缓慢 解冻后离心，取上清超滤浓缩，用PBS过滤3次后以200mL的总体积洗脱病毒，获 得200mL的病毒浓缩液。然后用空斑实验进行病毒滴度的测定。
10.7.4猴子攻毒及检测
1)在第三次免疫后15天，以滴鼻+气管注射方式进行攻毒。使用GD108#株(滴度 1×106Pfu/mL)，通过鼻腔滴鼻+气管注射接种各500μL的方式进行攻毒，每只猴子攻 毒量为1×106Pfu。
2)体重检测：攻毒前3天开始，每天进行体重检测，攻毒后每天进行体重检测。
3)体温变化检测：使用电子体温测量仪进行体温测试，测试部位为肛门。攻毒前每只猴子进行体温检测，记录数据。攻毒后，每天对猴子体温进行监测，记录体温变化 数据。
4)样本处理：实验猴攻毒前，攻毒后第1，3，5，7天动物进行麻醉，采集鼻拭子、 咽拭子、肛拭子。拭子用800μL Trizol进行裂解，取其中400μL提取RNA模板，以 50μL水进行洗涤制备成RNA模板，保存于-80℃备用，用一步法进行qRT-PCR。在 解剖时取动物每叶肺组织约50mg，以500μL Trizol进行组织匀浆，取其中300μL提 取RNA模板，以50μL水进行洗涤制备成RNA模板，保存于-80℃备用。用于后续实 时qRT-PCR分析病毒载量。
5)攻毒后第7天，使用支气管肺泡灌洗法收集肺部样本。
6)利用X光对猴子肺部进行影像学分析。
7)攻毒后7天解剖观察肺部大体病变情况，分别取肺(左-上中下、右-上中下)、气管、支气管进行病毒载量检测和组织切片HE染色诊断，重点对肺组织进行病理学检 测。
10.7.5病毒载量检测
使用定量实时逆转录PCR(qRT-PCR)测定病毒基因组RNA(gRNA)。使用qRT-PCR 测定肺组织、咽拭子、肛拭子、鼻拭子等的病毒负荷量。引物和探针序列源自N基因， 参考WHO和中国CDC推荐的序列。正向：5’-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3’，
反向：5’-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3’，
探针：5'-FAMTTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'
10.7.6恒河猴免疫血清病毒中和效价测定
用VeroE6细胞对攻毒前0dpi(免疫后45天)的血清进行SARS-CoV-2活病毒中和试验，用CPE法初步评估新冠肺炎mRNA疫苗的抗体中和抗体效价。血清中和抗体的 中和病毒效价检测，在VEROE6细胞上按不同的血清稀释比以0.05MOI为标准进行 相应的SARS-CoV-2病毒感染，72h后通过细胞CPE判定血清中和抗体效价。中和抗 体检测：采用体外真病毒中和方法对免疫血清中中和抗体进行测定。
10.7.7病理分析
采集全身组织脏器进行新型冠状病毒组织嗜性和病理分析。动物安乐死后分别采集各 叶肺组织(左右肺共6叶，右肺额叶由于太小未作取材分析)进行福尔马林固定后用于组织学观察。经两位病理专家双盲，在显微镜下观察肺的组织病理学变化。进行疫 苗效果评估。
10.8实验结果
10.8.1恒河猴免疫血清病毒中和效价
恒河猴免疫血清病毒中和效价见表7-1，由表7-1可以看出，攻毒时PBS组未检测到中和效价，疫苗组猴子的中和效价分别为16249(1:16)、16175(1:8)、16145(1:64)、 16045(1:8)。
表7-1.恒河猴免疫血清病毒中和抗体滴度
Figure BDA0002917999930000851
7.8.2实验猴感染SARS-CoV-2后病毒载量变化
7.8.2.1肺组织中的病毒载量
实验猴感染SARS-CoV-2后肺组织中病毒载量检测结果见图24(gRNA检测)。 由图24可以看出，在攻毒后第7天动物安乐死后，在气管中平均病毒载量疫苗组与 PBS组比较下降了3个log值；在支气管中免疫组4只动物均未检测到病毒载量；疫 苗组4只动物的所有6叶肺组织均未检测到gRNA。PBS组所有动物的多叶肺组织中 均检测到了高水平的gRNA。
感染后，每只动物分别取左肺和右肺的肺泡灌洗液测定病毒gRNA含量，测定结 果见图25。疫苗组4只动物的左肺泡灌洗液样本均未检测到病毒；而模型组中3只动 物的左肺泡灌洗液样本均检测到高水平病毒载量。
10.8.2.2鼻拭子病毒载量
鼻拭子病毒载量的测定，所有实验猴在接种病毒后第1天均检测到较高病毒载量，第3天开始疫苗组的病毒载量与PBS组比较明显下降至少3个log值(见图26)。PBS 组的病毒载量一直保持在较高水平。在第3天，疫苗组组中一只动物病毒载量为0， 虽然在第5天小幅度的反弹，但在第7天检测中再次为0。第7天，与模型组相比， 疫苗组的病毒载量平均值降低3.3个log值。
7.8.2.3咽拭子病毒载量
实验猴感染SARS-CoV-2后咽拭子中病毒载量检测结果见图27(gRNA检测)。由 图27可以看出，在攻毒后第1天开始各实验组均能检测到gRNA。从攻毒后第3天 开始，疫苗免疫组均低于PBS组。第7天时疫苗组4只动物中的3只病毒载量为0， PBS组仍然有较高水平的病毒载量。
7.8.3病理变化
7.8.3.1病理学分析 攻毒后第七天，各组恒河猴安乐死后分别采集肺(左右肺是上中下叶共6叶)组织 进行福尔马林固定后用于组织学观察。经过严格的病理组织切片制备的程序后，由两 位病理专家双盲，在显微镜下观察肺的组织病理学变化。
7.8.3.2肺组织病变评价
不同部位的肺组织经多聚甲醛固定、石蜡包埋、HE染色后，在显微镜下观察肺的组织病理学变化。
PBS组的猴子6叶肺的综合评价结果为：肺间隔局部增厚、出血，淋巴细胞结节，局部血管壁增厚，腔内见血栓形成，气管管腔内见血细胞样渗出物，局部碳末沉着等病 理变化等。
疫苗组的猴子6叶肺的综合评价结果为：肺泡结构相对完好，肺间隔轻度增厚、轻度 出血，局灶性尘细胞分布，少量炎细胞浸润等。
7.8.3.2肺组织病理评分
所有肺组织切片均经苏木素-伊红(H&E)染色(Bar值代表100μm)根据文献(Liu L,et al.Anti-spike IgG causes severe acute lung injury by skewing macrophageresponses during acute SARS-CoV infection.JCI Insight.2019；4(4):e123158)报道的方法，对恒河 猴肺部炎性、肺部结构变化和出血等进行分级，各项指标的评分标准见下表。本批实 验的肺部组织病理评价对照评分标准表格进行评分。
恒河猴肺部病理改变评分表
Figure BDA0002917999930000871
(参见：Liu L,et al.JCI Insight.2019；4(4):e123158)
根据评分表对每只恒河猴肺组织病理的每叶肺的病理片子进行评级，首先对每只恒河 猴每叶肺组织(左上、左中、左下、右上、右中、右下，共6叶肺)随机选择至少5 个视野进行评分，所有肺叶的病理评分的平均数即为这只猴子整个肺部的综合病理评 分结果，每组每只猴子的肺部综合病理评分结果统计见下表。结果表明，疫苗组的肺 部组织综合病理评分均显著低于PBS组的评分(见以下表格和图28-34)。PBS模型 对照组动物肺部病理损伤评分均值6.28分，疫苗组动物肺部病理损伤评分均值为2.04 分。该结果表明，疫苗免疫后对于恒河猴的肺部组织损伤具有明显保护作用。
恒河猴各个肺叶肺组织病理评分统计
Figure BDA0002917999930000881
7.8实验结论
攻毒后第7天，疫苗组(3/3)的实验猴咽拭子均未检测到病毒载量，但PBS组(3/3)仍然有5个log值以上的病毒载量；疫苗组的鼻拭子较PBS组显著下降3.3个log值 的病毒载量。说明该疫苗可有效清除SARS-CoV-2。攻毒后第7天，疫苗组动物的支 气管和左下肺灌洗液均未检测到病毒载量；3/4实验猴肺部未检测到病毒载量。说明 该疫苗具有清除肺部SARS-CoV-2的作用。
实施例子11：UTR序列的筛选实验
为了在优化序列的基础上，获得更好的UTR序列，我们对UTR序列进行了筛选， 通过UTR序列筛选，获得用于本发明的一些UTR序列对。筛选的方式就是参照实施 例子1的方式，选取编号1和9的NDA的ORF序列，分别在该序列上通过转录，在 5端连接上UTR序列，在3端连接上如下3UTR序列，同时也在3端连接上PloyA 序列，这些序列都没有进行核酸修饰。
利用这些序列的RNA进行脂质体封装，具体步骤为：分别取适量的脂质溶液(可 离子化脂质MC3，DSPC，胆固醇，mPEG2000-DMG按照50：10：38.5：1.5的摩尔 比配制10mg/ml的脂质溶液)与eGFP-mRNA混合(溶于1mM pH6.4的枸橼酸-枸橼酸 钠缓冲液)，按照不同的流速12的混合流速，固定的混合比为3(mRNA溶液)：1 (脂质溶液)，固定的温度为37℃，混合，得到脂质纳米粒，测试的粒径为90.6±5.4 钠米(nm)。
然后按照实施例子2的方式进行体外细胞实验，用不包括UTR序列和PBS做空 白实验对照，发现，带有如下配对的序列的UTR序列都可以提高RNA的表达水平。 UTR配对的按照编号一一配对，5‘端的UTR-1与3‘端的UTR序列作为一对使用。
5’UTR序列
>5’UTR-1(SEQ NO：36-1)
GTCTCAGTCGCCGCTGCCAGCTCTCGCACTCTGTTCTTCCGCCGCTCCGCCGTCGCGTTTCTCTGCCGGTCGCA
>5’UTR-2(SEQ NO：36-2)
ACCCGGCGCTCCATTAAATAGCCGTAGACGGAACTTCGCCTTTCTCTCGGCCTTAGCGCCATTTTTTTGGAAACCTCTGCGCC
>5’UTR-3(SEQ NO：36-3)
CTCTCTTCCACAGGAGGCCTACACGCCGCCGCTTGTGCTGCAGCC
>5’UTR-4(SEQ NO：36-4)
GGGACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACC
>5’UTR-5(SEQ NO：36-5)
GGGAAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC
>5’UTR-6(SEQ NO：36-6)
CCCCCCGAGCGCCGCTCCGGCTGCACCGCGCTCGCTCCGAGTTTCAGGCTCGTG CTAAGCTAGCGCCGTCGTCGTCTCCCTTCAGTCGCCATC
>5’UTR-7(SEQ NO：36-7)
CTTTCCGGCGGTGACGACCTACGCACACGAGAAC
>5’UTR-8(SEQ NO：36-8)
CGCCTGGCCGGCGGGCTGAGGCGTACGGGTCGCACGCAGCGCC
>5’UTR-9(SEQ NO：36-9)
CGCTCTTATTGGCCAGGGGACGGTAGCTGCAGGACTCTGCTCTCCTGCGGCC
>5’UTR-10(SEQ NO：36-10)
TTCCATTTGGCTGCAGCTTCTGGAGGGAGCCGACAGGAGACGTGGGGAGACG
>5’UTR-11(SEQ NO：36-11)
GGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGAGCCACC
>5’UTR-12(SEQ NO：36-12)
ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACC
3’UTR序列的序列如下：
>3’UTR-1(SEQ NO：37-1)
GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAA CTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATA AAAAACATTTATTTTCATTGC
>3’UTR-2(SEQ NO：37-2)
ATGGAAGCATTAATTGTTTTGAACATGTAAATATAAATCTGTCAGCCACTACAGC CATCAAAAGAGAGCATCTGGAAGAACAGCCAGCTTGGAAGTTTTACAGCAATAA TGTTGCAGTGGAATATTATTTGTAGTTAAGGTCATCCTCCTCCCCTTTCTGTTTTTT TAAATCAAGAACTACGTTCTGCCCCTCTCTTGGGCTTCAGAAGCATCTAAGAAA AGCAGTCATCAATTATAATTAACTTTCAAAGGGCAAGTCAGAAGTTGTTTATAAATTACAAAATAAAGGCATATTATGAACTCTTA
>3’UTR-3(SEQ NO：37-3)
GAAAAGACTTCTTCCATCAAGCTTAATTGTTTTGTTATTCATTTAATGACTTTCCC TGCTGTTACCTAATTACAAATTGGATGGAACTGTGTTTTTTTCTGCTTTGTTTTTT CAGTTTGCTGTTTCTGTAGCCATATTGTATTCTGTGTCAAATAAAGTCCAGTTGGA TTCTGGAA
>3’UTR-4(SEQ NO：37-4)
CAAATGTGGCAATTATTTTGGATCTATCACCTGTCATCATAACTGGCTTCTGCTTG TCATCCACACAACACCAGGACTTAAGACAAATGGGACTGATGTCATCTTGAGCT CTTCATTTATTTTGACTGTGATTTATTTGGAGTGGAGGCATTGTTTTTAAGAAAAA CATGTCATGTAGGTTGTCTAAAAATAAAATGCATTTAAACTCATTTGAGAG
>3’UTR-5(SEQ NO：37-5)
AAGCACTCTGAGTCAAGATGAGTGGGAAACCATCTCAATAAACACATTTTGGAT AAATCCTG
>3’UTR-6(SEQ NO：37-6)
GCGCTGGGCTGTTTTAGTGCCAGGCTGCGGTGGGCAGCCATGAGAACAAAACC TCTTCTGTATTTTTTTTTTCCATTAGTAAAACACAAGACTTCAGATTCAGCCGAAT TGTGGTGTCTTACAAGGCAGGCCTTTCCTACAGGGGGTGGAGAGACCAGCCTTT CTTCCTTTGGTAGGAATGGCCTGAGTTGGCGTTGTGGGCAGGCTACTGGTTTGTATGATGTATTAGTAGAGCAACCCATTAATCTTTTGTAGTTTGTATTAAACTTGAACT GAGACCTTGATGAGTCTTTA
>3’UTR-7(SEQ NO：37-7)
GAAAAATGAAAGGAAGTTCTGCTGTCAGAGGCAAAACATCTGTTTATCATAGAC ATCAACATGACCTATAAGTAAAGTGCGTGTCTAGTGTCTTCTATTGAGAGTACTA CTATTAATTAAGCTTATTTCCAATGTGCCTTTTTAATGCTTGAAGTTTTATCTACAT ACACAGGTAACAGAGGACAGTAGTCTGTAAACATATAAATCGGTCATAACTATCG TGGTCTTTATTTCTGTGAGGATCTAGGGAAATTTCATGTCACTTCCCTCCTTCACT GCATCACAATCATATTCCCTTTTTTTTTTCTTGGATTTGTGTCAGTTGGATGATATC CCCTCCAGATAGTATCAATAAAATGTTAAAATT
>3’UTR-8(SEQ NO：37-8)
ACTCCCTCCTCCTGCCACTGGTGCCTCGAGTAGCCATGGCAACGGGCCCAGTGT CCAGTCACTTAGAAGTTCCCCCCTTGGCCAAAAACCCAATTCACATTGAGAGCT GGTGTTGTCTGAAGTTTTCGTATCACAGTGTTAACCTGTACTCTCTCCTGCAAAC CTACACACCAAAGCTTTATTTATATCATTCCAGTATCAATGCTACACAGTGTTGTC CCGAGCGCCGGGAGGCGTTGGGCAGAAACCCTCGGGAATGCTTCCGAGCACGC TGTAGGGTATGGGAAGAACCCAGCACCACTAATAAAGCTGCTGCTTGGCTGGA
>3’UTR-9(SEQ NO：37-9)
GGTGACCCGGCTGGGTCGGCCCTGCCCAAGGGCCTCCCACCAGAGACTGGGAT GGGAACACTGGTGGGCAGCTGAGGACACACCCCACACCCCAGCCCACCCTGCT CCTCCTGCCCTGTCCCTGTCCCCCTCCCCTCCCAGTCCTCCAGACCACCAGCCGC CCCAGCCCCTTCTCCCAGCACACGGCTGCCTGACACTGAGCCCCACCTCTCCAA GTCTCTCTGTGAATACAATTAAAGGTCCTGCCCTCCC
>3’UTR-10(SEQ NO：37-10)
ACCGCTAGCTTGTTGCACCGTGGAGGCCACAGGAGCAGAAACATGGAATGCCA GACGCTGGGGATGCTGGTACAAGTTGTGGGACTGCATGCTACTGTCTAGAGCTT GTCTCAATGGATCTAGAACTTCATCGCCCTCTGATCGCCGATCACCTCTGAGACC CACCTTGCTCATAAACAAAATGCCCATGTTGGTCCTCTGCCCTGGACCTGTGACATTCTGGACTATTTCTGTGTTTATTTGTGGCCGAGTGTAACAACCATATAATAAATC ACCTCTTCCGCTGTTTTAGCTGAAGAATTAAATCA
>3’UTR-11(SEQ NO：37-11)
GCUGCCUUCUGCGGGGCUUGCCUUCUGGCCAUGCCCUUCUUCUCUCCCUUGC ACCUGUACCUCUUGGUCUUUGAAUAAAGCCUGAGUAGGAAGUGAGGGUCUA GAACU
>3’UTR-12(SEQ NO：37-12)
GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAA CTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATA AAAAACATTTATTTTCATTGC
采用的mRNA序列为GFP序列((SEQ NO：40)：
Figure BDA0002917999930000911
具体过程就是在该GFP的5序列前连接上UTR-5‘的序列，然后挑选UTR-3‘的序 列连接在GFP的3端，具体连接方式就是通过实施例子1中的连接方式，在反转率 的过程中进行连接，然后通过如实施例子2中的细胞实验，获得比较好的实验配对。
具体结果是，以上按照序列编号相对应，即5’UTRSEQ NO：36-1)于3‘UTR编 号对应，获得12对序列，同时进行荧光蛋白的表达，从表达的结果来看，各个配对 表达量相差不显著，则说明以上序列都可以被用来进行信使RNA的非编码区域的使 用(具体数据略)。
为了清楚说明本发明所引用的核算序列与通过软件自动生成的核算序列编号之间 的对应关系,特制作该表格,进行清楚的说明,具体见如下表。
Figure BDA0002917999930000921
Figure BDA0002917999930000931
在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下，可以实现本文所示和所述的发明。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制，并且不希望在这些术语 和表达法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而且应该认识到各 种改型在本发明的范围内都是可行的。因此应该理解，尽管通过各种实施例和可选的 特征具体公开了本发明，但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人 员所采用，并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。 本文中所述或记载的文章、专利、专利申请以及所有其他文献和以电子方式可得的信 息的内容在某种程度上全文包括在此以作参考，就如同每个单独的出版物被具体和单 独指出以作参考一样。申请人保留把来自任何这种文章、专利、专利申请或其他文献 的任何及所有材料和信息结合入本申请中的权利。
序列表
<110> 斯微（上海）生物科技有限公司
<120> 治疗或者预防冠状病毒病的疫苗试剂
<160> 78
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3822
<212> DNA
<213> 冠状病毒(coronavirus)
<400> 1
atgtttgttt ttcttgtttt attgccacta gtctctagtc agtgtgttaa tcttacaacc 60
agaactcaat taccccctgc atacactaat tctttcacac gtggtgttta ttaccctgac 120
aaagttttca gatcctcagt tttacattca actcaggact tgttcttacc tttcttttcc 180
aatgttactt ggttccatgc tatacatgtc tctgggacca atggtactaa gaggtttgat 240
aaccctgtcc taccatttaa tgatggtgtt tattttgctt ccactgagaa gtctaacata 300
ataagaggct ggatttttgg tactacttta gattcgaaga cccagtccct acttattgtt 360
aataacgcta ctaatgttgt tattaaagtc tgtgaatttc aattttgtaa tgatccattt 420
ttgggtgttt attaccacaa aaacaacaaa agttggatgg aaagtgagtt cagagtttat 480
tctagtgcga ataattgcac ttttgaatat gtctctcagc cttttcttat ggaccttgaa 540
ggaaaacagg gtaatttcaa aaatcttagg gaatttgtgt ttaagaatat tgatggttat 600
tttaaaatat attctaagca cacgcctatt aatttagtgc gtgatctccc tcagggtttt 660
tcggctttag aaccattggt agatttgcca ataggtatta acatcactag gtttcaaact 720
ttacttgctt tacatagaag ttatttgact cctggtgatt cttcttcagg ttggacagct 780
ggtgctgcag cttattatgt gggttatctt caacctagga cttttctatt aaaatataat 840
gaaaatggaa ccattacaga tgctgtagac tgtgcacttg accctctctc agaaacaaag 900
tgtacgttga aatccttcac tgtagaaaaa ggaatctatc aaacttctaa ctttagagtc 960
caaccaacag aatctattgt tagatttcct aatattacaa acttgtgccc ttttggtgaa 1020
gtttttaacg ccaccagatt tgcatctgtt tatgcttgga acaggaagag aatcagcaac 1080
tgtgttgctg attattctgt cctatataat tccgcatcat tttccacttt taagtgttat 1140
ggagtgtctc ctactaaatt aaatgatctc tgctttacta atgtctatgc agattcattt 1200
gtaattagag gtgatgaagt cagacaaatc gctccagggc aaactggaaa gattgctgat 1260
tataattata aattaccaga tgattttaca ggctgcgtta tagcttggaa ttctaacaat 1320
cttgattcta aggttggtgg taattataat tacctgtata gattgtttag gaagtctaat 1380
ctcaaacctt ttgagagaga tatttcaact gaaatctatc aggccggtag cacaccttgt 1440
aatggtgttg aaggttttaa ttgttacttt cctttacaat catatggttt ccaacccact 1500
aatggtgttg gttaccaacc atacagagta gtagtacttt cttttgaact tctacatgca 1560
ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa atgtgtcaat 1620
ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa aaagtttctg 1680
cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg tgatccacag 1740
acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt tataacacca 1800
ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg cacagaagtc 1860
cctgttgcta ttcatgcaga tcaacttact cctacttggc gtgtttattc tacaggttct 1920
aatgtttttc aaacacgtgc aggctgttta ataggggctg aacatgtcaa caactcatat 1980
gagtgtgaca tacccattgg tgcaggtata tgcgctagtt atcagactca gactaattct 2040
cctcggcggg cacgtagtgt agctagtcaa tccatcattg cctacactat gtcacttggt 2100
gcagaaaatt cagttgctta ctctaataac tctattgcca tacccacaaa ttttactatt 2160
agtgttacca cagaaattct accagtgtct atgaccaaga catcagtaga ttgtacaatg 2220
tacatttgtg gtgattcaac tgaatgcagc aatcttttgt tgcaatatgg cagtttttgt 2280
acacaattaa accgtgcttt aactggaata gctgttgaac aagacaaaaa cacccaagaa 2340
gtttttgcac aagtcaaaca aatttacaaa acaccaccaa ttaaagattt tggtggtttt 2400
aatttttcac aaatattacc agatccatca aaaccaagca agaggtcatt tattgaagat 2460
ctacttttca acaaagtgac acttgcagat gctggcttca tcaaacaata tggtgattgc 2520
cttggtgata ttgctgctag agacctcatt tgtgcacaaa agtttaacgg ccttactgtt 2580
ttgccacctt tgctcacaga tgaaatgatt gctcaataca cttctgcact gttagcgggt 2640
acaatcactt ctggttggac ctttggtgca ggtgctgcat tacaaatacc atttgctatg 2700
caaatggctt ataggtttaa tggtattgga gttacacaga atgttctcta tgagaaccaa 2760
aaattgattg ccaaccaatt taatagtgct attggcaaaa ttcaagactc actttcttcc 2820
acagcaagtg cacttggaaa acttcaagat gtggtcaacc aaaatgcaca agctttaaac 2880
acgcttgtta aacaacttag ctccaatttt ggtgcaattt caagtgtttt aaatgatatc 2940
ctttcacgtc ttgacaaagt tgaggctgaa gtgcaaattg ataggttgat cacaggcaga 3000
cttcaaagtt tgcagacata tgtgactcaa caattaatta gagctgcaga aatcagagct 3060
tctgctaatc ttgctgctac taaaatgtca gagtgtgtac ttggacaatc aaaaagagtt 3120
gatttttgtg gaaagggcta tcatcttatg tccttccctc agtcagcacc tcatggtgta 3180
gtcttcttgc atgtgactta tgtccctgca caagaaaaga acttcacaac tgctcctgcc 3240
atttgtcatg atggaaaagc acactttcct cgtgaaggtg tctttgtttc aaatggcaca 3300
cactggtttg taacacaaag gaatttttat gaaccacaaa tcattactac agacaacaca 3360
tttgtgtctg gtaactgtga tgttgtaata ggaattgtca acaacacagt ttatgatcct 3420
ttgcaacctg aattagactc attcaaggag gagttagata aatattttaa gaatcataca 3480
tcaccagatg ttgatttagg tgacatctct ggcattaatg cttcagttgt aaacattcaa 3540
aaagaaattg accgcctcaa tgaggttgcc aagaatttaa atgaatctct catcgatctc 3600
caagaacttg gaaagtatga gcagtatata aaatggccat ggtacatttg gctaggtttt 3660
atagctggct tgattgccat agtaatggtg acaattatgc tttgctgtat gaccagttgc 3720
tgtagttgtc tcaagggctg ttgttcttgt ggatcctgct gcaaatttga tgaagacgac 3780
tctgagccag tgctcaaagg agtcaaatta cattacacat aa 3822
<210> 2
<211> 3825
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgttcgtct tcctggtgct gctgcctctg gtgtcttccc agtgcgtgaa tctgactacc 60
aggacccagc tgccccctgc ctataccaat tccttcacac ggggcgtgta ctatcccgac 120
aaggtgttta gaagctccgt gctgcactct acacaggatc tgtttctgcc tttctttagc 180
aacgtgacct ggttccacgc catccacgtg agcggcacca atggcacaaa gcggttcgac 240
aatccagtgc tgccctttaa cgatggcgtg tacttcgcct ctaccgagaa gagcaacatc 300
atcagaggct ggatctttgg caccacactg gactccaaga cacagtctct gctgatcgtg 360
aacaatgcca ccaacgtggt catcaaggtg tgcgagttcc agttttgtaa tgatccattc 420
ctgggcgtgt actatcacaa gaacaataag agctggatgg agtccgagtt tcgcgtgtat 480
tctagcgcca acaattgcac atttgagtac gtgtcccagc ccttcctgat ggacctggag 540
ggcaagcagg gcaatttcaa gaacctgagg gagttcgtgt ttaagaatat cgatggctac 600
ttcaagatct actctaagca caccccaatc aacctggtgc gcgacctgcc acagggcttc 660
agcgccctgg agccactggt ggatctgccc atcggcatca acatcacccg gtttcagaca 720
ctgctggccc tgcacagaag ctacctgaca ccaggcgact cctctagcgg atggaccgca 780
ggagcagcag cctactatgt gggctatctg cagcccagga ccttcctgct gaagtacaac 840
gagaatggca ccatcacaga cgccgtggat tgcgccctgg atcccctgag cgagacaaag 900
tgtacactga agtcctttac cgtggagaag ggcatctatc agacatccaa tttcagggtg 960
cagcctaccg agtctatcgt gcgctttccc aatatcacaa acctgtgccc ttttggcgag 1020
gtgttcaacg caaccaggtt cgcaagcgtg tacgcatgga ataggaagcg catctctaac 1080
tgcgtggccg actatagcgt gctgtacaac tccgcctctt tcagcacctt taagtgctat 1140
ggcgtgtccc ccacaaagct gaatgacctg tgctttacca acgtgtacgc cgattctttc 1200
gtgatcaggg gcgacgaggt gcgccagatc gcaccaggac agacaggcaa gatcgcagac 1260
tacaattata agctgcctga cgatttcacc ggctgcgtga tcgcctggaa cagcaacaat 1320
ctggattcca aagtgggcgg caactacaat tatctgtacc ggctgtttag aaagagcaat 1380
ctgaagccat tcgagaggga catctctaca gagatctacc aggcaggaag caccccatgc 1440
aatggagtgg agggctttaa ctgttatttc cctctgcagt cctacggctt ccagccaacc 1500
aacggcgtgg gctatcagcc ctaccgcgtg gtggtgctga gctttgagct gctgcacgca 1560
cctgcaacag tgtgcggacc aaagaagtcc accaatctgg tgaagaacaa gtgcgtgaac 1620
ttcaacttca acggcctgac cggaacaggc gtgctgaccg agtccaacaa gaagttcctg 1680
ccttttcagc agttcggcag ggacatcgca gataccacag acgccgtgcg cgaccctcag 1740
accctggaga tcctggatat cacaccatgc tctttcggcg gcgtgagcgt gatcacacca 1800
ggcaccaata caagcaacca ggtggccgtg ctgtatcagg acgtgaattg taccgaggtg 1860
ccagtggcaa tccacgcaga tcagctgacc cctacatggc gggtgtacag caccggctcc 1920
aacgtgttcc agacaagagc aggatgtctg atcggagcag agcacgtgaa caattcctat 1980
gagtgcgaca tccctatcgg cgccggcatc tgtgcctctt accagaccca gacaaactct 2040
ccaaggagag cacggagcgt ggcatcccag tctatcatcg cctataccat gtccctgggc 2100
gccgagaatt ctgtggccta ctctaacaat agcatcgcca tccctaccaa cttcacaatc 2160
tctgtgacca cagagatcct gccagtgtcc atgaccaaga catctgtgga ctgcacaatg 2220
tatatctgtg gcgattctac cgagtgcagc aacctgctgc tgcagtacgg cagcttttgt 2280
acccagctga atagagccct gacaggcatc gccgtggagc aggataagaa cacacaggag 2340
gtgttcgccc aggtgaagca gatctacaag accccaccca tcaaggactt tggcggcttc 2400
aatttttccc agatcctgcc cgatccttcc aagccctcta agcggagctt tatcgaggac 2460
ctgctgttca acaaggtgac cctggccgat gccggcttca tcaagcagta tggcgattgc 2520
ctgggcgaca tcgcagcacg ggacctgatc tgtgcccaga agtttaatgg cctgaccgtg 2580
ctgcctccac tgctgacaga tgagatgatc gcacagtaca caagcgccct gctggcagga 2640
accatcacat ccggatggac cttcggcgca ggagccgccc tgcagatccc ctttgccatg 2700
cagatggcct atcggttcaa cggcatcggc gtgacccaga atgtgctgta cgagaaccag 2760
aagctgatcg ccaatcagtt taactccgcc atcggcaaga tccaggacag cctgtcctct 2820
acagcctccg ccctgggcaa gctgcaggat gtggtgaatc agaacgccca ggccctgaat 2880
accctggtga agcagctgag ctccaacttc ggcgccatct ctagcgtgct gaatgatatc 2940
ctgagccggc tggacaaggt ggaggcagag gtgcagatcg accggctgat cacaggcaga 3000
ctgcagtctc tgcagaccta tgtgacacag cagctgatca gggcagcaga gatcagggca 3060
agcgccaatc tggcagcaac caagatgtcc gagtgcgtgc tgggccagtc taagagagtg 3120
gacttttgtg gcaagggcta tcacctgatg tccttcccac agtctgcccc tcacggagtg 3180
gtgtttctgc acgtgaccta cgtgccagcc caggagaaga acttcaccac agcaccagca 3240
atctgccacg atggcaaggc acactttcct agggagggcg tgttcgtgtc caacggcacc 3300
cactggtttg tgacacagcg caatttctac gagccacaga tcatcaccac agacaatacc 3360
ttcgtgagcg gcaactgtga cgtggtcatc ggcatcgtga acaataccgt gtatgatcct 3420
ctgcagccag agctggacag ctttaaggag gagctggata agtacttcaa gaatcacacc 3480
tcccccgacg tggatctggg cgacatcagc ggcatcaatg cctccgtggt gaacatccag 3540
aaggagatcg acaggctgaa cgaggtggcc aagaatctga acgagagcct gatcgatctg 3600
caggagctgg gcaagtatga gcagtacatc aagtggcctt ggtacatctg gctgggcttc 3660
atcgccggcc tgatcgccat cgtgatggtg accatcatgc tgtgctgtat gacatcctgc 3720
tgttcttgcc tgaagggctg ctgtagctgc ggctcctgtt gtaaattcga tgaggatgat 3780
tccgagcctg tgctgaaggg cgtgaaactg cattatacct aatag 3825
<210> 3
<211> 768
<212> DNA
<213> 冠状病毒(coronavirus)
<400> 3
atgcctaata ttacaaactt gtgccctttt ggtgaagttt ttaacgccac cagatttgca 60
tctgtttatg cttggaacag gaagagaatc agcaactgtg ttgctgatta ttctgtccta 120
tataattccg catcattttc cacttttaag tgttatggag tgtctcctac taaattaaat 180
gatctctgct ttactaatgt ctatgcagat tcatttgtaa ttagaggtga tgaagtcaga 240
caaatcgctc cagggcaaac tggaaagatt gctgattata attataaatt accagatgat 300
tttacaggct gcgttatagc ttggaattct aacaatcttg attctaaggt tggtggtaat 360
tataattacc tgtatagatt gtttaggaag tctaatctca aaccttttga gagagatatt 420
tcaactgaaa tctatcaggc cggtagcaca ccttgtaatg gtgttgaagg ttttaattgt 480
tactttcctt tacaatcata tggtttccaa cccactaatg gtgttggtta ccaaccatac 540
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<211> 2028
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<213> 冠状病毒(coronavirus)
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ucaacugaaa ucuaucaggc cgguagcaca ccuuguaaug guguugaagg uuuuaauugu 480
uacuuuccuu uacaaucaua ugguuuccaa cccacuaaug guguugguua ccaaccauac 540
agaguaguag uacuuucuuu ugaacuucua caugcaccag caacuguuug uggaccuaaa 600
aagucuacua auuugguuaa aaacaaaugu gucaauuuca acuucaaugg uuuaacaggc 660
acagguguuc uuacugaguc uaacaaaaag uuucugccuu uccaacaauu uggcagagac 720
auugcugaca cuacugaugc uguccgugau ccacagacac uugaguaa 768
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<211> 771
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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augccuaaua uuacaaacuu gugcccuuuu ggugaaguuu uuaacgccac cagauuugca 60
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uauaauuccg caucauuuuc cacuuuuaag uguuauggag ugucuccuac uaaauuaaau 180
gaucucugcu uuacuaaugu cuaugcagau ucauuuguaa uuagagguga ugaagucaga 240
caaaucgcuc cagggcaaac uggaaagauu gcugauuaua auuauaaauu accagaugau 300
uuuacaggcu gcguuauagc uuggaauucu aacaaucuug auucuaaggu uggugguaau 360
uauaauuacc uguauagauu guuuaggaag ucuaaucuca aaccuuuuga gagagauauu 420
ucaacugaaa ucuaucaggc cgguagcaca ccuuguaaug guguugaagg uuuuaauugu 480
uacuuuccuu uacaaucaua ugguuuccaa cccacuaaug guguugguua ccaaccauac 540
agaguaguag uacuuucuuu ugaacuucua caugcaccag caacuguuug uggaccuaaa 600
aagucuacua auuugguuaa aaacaaaugu gucaauuuca acuucaaugg uuuaacaggc 660
acagguguuc uuacugaguc uaacaaaaag uuucugccuu uccaacaauu uggcagagac 720
auugcugaca cuacugaugc uguccgugau ccacagacac uugaguaaua g 771
<210> 23
<211> 669
<212> RNA
<213> 冠状病毒(coronavirus)
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auggcagauu ccaacgguac uauuaccguu gaagagcuua aaaagcuccu ugaacaaugg 60
aaccuaguaa uagguuuccu auuccuuaca uggauuuguc uucuacaauu ugccuaugcc 120
aacaggaaua gguuuuugua uauaauuaag uuaauuuucc ucuggcuguu auggccagua 180
acuuuagcuu guuuugugcu ugcugcuguu uacagaauaa auuggaucac cgguggaauu 240
gcuaucgcaa uggcuugucu uguaggcuug auguggcuca gcuacuucau ugcuucuuuc 300
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<211> 672
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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auggccgaua gcaacggcac caucaccgug gaagaacuga agaaacugcu ggaacagugg 60
aaccucguga ucggcuuccu guuccugacc uggaucugcc ugcugcaguu cgccuacgcc 120
aaccggaaca gauuccugua uauuaucaag cugaucuucc uguggcugcu guggcccgug 180
acacuggccu guuuugugcu ggccgccgug uaccggauca acuggaucac aggcggaauc 240
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cggcuguucg cccggaccag auccaugugg uccuucaauc ccgagacaaa cauccugcug 360
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gugcaguaau ag 672
<210> 25
<211> 1260
<212> RNA
<213> 冠状病毒(coronavirus)
<400> 25
augucugaua auggacccca aaaucagcga aaugcacccc gcauuacguu ugguggaccc 60
ucagauucaa cuggcaguaa ccagaaugga gaacgcagug gggcgcgauc aaaacaacgu 120
cggccccaag guuuacccaa uaauacugcg ucuugguuca ccgcucucac ucaacauggc 180
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acaccaaaag aucacauugg cacccgcaau ccugcuaaca augcugcaau cgugcuacaa 480
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
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cggccccaag guuuacccaa uaauacugcg ucuugguuca ccgcucucac ucaacauggc 180
aaggaagacc uuaaauuccc ucgaggacaa ggcguuccaa uuaacaccaa uagcagucca 240
gaugaccaaa uuggcuacua ccgaagagcu accagacgaa uucguggugg ugacgguaaa 300
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<213> 冠状病毒(coronavirus)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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uag 603
<210> 29
<211> 600
<212> RNA
<213> 冠状病毒(coronavirus)
<400> 29
augauuacaa acuugugccc uuuuggugaa guuuuuaacg ccaccagauu ugcaucuguu 60
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<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
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<210> 31
<211> 228
<212> RNA
<213> 冠状病毒(coronavirus)
<400> 31
auguacucau ucguuucgga agagacaggu acguuaauag uuaauagcgu acuucuuuuu 60
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<210> 32
<211> 231
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
auguacagcu ucguguccga ggaaaccggc acacugaucg ugaacagcgu gcugcuguuc 60
cuggccuucg ugguguuucu gcuggucacc cuggccaucc ugacagcccu gagacugugc 120
gccuacugcu gcaacaucgu gaacgugucc cuggucaagc ccagcuucua cguguacagc 180
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<210> 33
<211> 3612
<212> RNA
<213> 冠状病毒(coronavirus)
<400> 33
augucuaguc aguguguuaa ucuuacaacc agaacucaau uacccccugc auacacuaau 60
ucuuucacac gugguguuua uuacccugac aaaguuuuca gauccucagu uuuacauuca 120
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ugugaauuuc aauuuuguaa ugauccauuu uuggguguuu auuaccacaa aaacaacaaa 420
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ccuggugauu cuucuucagg uuggacagcu ggugcugcag cuuauuaugu ggguuaucuu 780
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uccaucauug ccuacacuau gucacuuggu gcagaaaauu caguugcuua cucuaauaac 2100
ucuauugcca uacccacaaa uuuuacuauu aguguuacca cagaaauucu accagugucu 2160
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aaucuuuugu ugcaauaugg caguuuuugu acacaauuaa accgugcuuu aacuggaaua 2280
gcuguugaac aagacaaaaa cacccaagaa guuuuugcac aagucaaaca aauuuacaaa 2340
acaccaccaa uuaaagauuu uggugguuuu aauuuuucac aaauauuacc agauccauca 2400
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gcuggcuuca ucaaacaaua uggugauugc cuuggugaua uugcugcuag agaccucauu 2520
ugugcacaaa aguuuaacgg ccuuacuguu uugccaccuu ugcucacaga ugaaaugauu 2580
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gaaccacaaa ucauuacuac agacaacaca uuugugucug guaacuguga uguuguaaua 3360
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
augagcagcc agugcgugaa ccugaccacc agaacucagc ugccuccagc cuacaccaac 60
agcuucacca gaggcgugua cuaccccgac aagguguuca gauccagcgu gcugcacucu 120
acccaggacc uguuccugcc uuucuucagc aacgugaccu gguuccacgc cauccacgug 180
uccggcacca auggcaccaa gagauucgac aaccccgugc ugcccuucaa cgacggggug 240
uacuuugcca gcaccgagaa guccaacauc aucagaggcu ggaucuucgg caccacacug 300
gacagcaaga cccagagccu gcugaucgug aacaacgcca ccaacguggu caucaaagug 360
ugcgaguucc aguucugcaa cgaccccuuc cugggcgucu acuaccacaa gaacaacaag 420
agcuggaugg aaagcgaguu ccggguguac agcagcgcca acaacugcac cuucgaguac 480
gugucccagc cuuuccugau ggaccuggaa ggcaagcagg gcaacuucaa gaaccugcgc 540
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aaccucgugc gggaucugcc ucagggcuuc ucugcucugg aaccccuggu ggaucugccc 660
aucggcauca acaucacccg guuucagaca cugcuggccc ugcacagaag cuaccugaca 720
ccuggcgaua gcagcucugg auggacagcu ggcgccgcug ccuacuaugu gggauaccug 780
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guggugcuga gcuucgagcu gcugcaugcu ccugccacag ugugcggccc uaagaaaagc 1560
accaaucucg ugaagaacaa augcgugaac uucaacuuca acggccugac cggcaccggc 1620
gugcugacag agagcaacaa gaaguuccug ccauuccagc aguucggccg ggauaucgcc 1680
gauaccacag acgccguuag agauccccag acacuggaaa uccuggacau caccccuugc 1740
agcuucggcg gagugucugu gaucaccccu ggcaccaaca ccagcaauca gguggcagug 1800
cuguaccagg acgugaacug uaccgaagug cccguggcca uucacgccga ucagcugaca 1860
ccuacauggc ggguguacuc caccggcagc aauguguuuc agaccagagc cggcugucug 1920
aucggagccg agcacgugaa caauagcuac gagugcgaca uccccaucgg cgcuggcauc 1980
ugugccagcu accagacaca gacaaacagc cccagacggg ccagaucugu ggccagccag 2040
agcaucauug ccuacacaau gucucugggc gccgagaaca gcguggccua cuccaacaac 2100
ucuaucgcua uccccaccaa cuucaccauc agcgugacca cagagauccu gccugugucc 2160
augaccaaga ccagcgugga cugcaccaug uacaucugcg gcgauuccac cgagugcucc 2220
aaccugcugc ugcaguacgg cagcuucugc acccagcuga auagagcccu gacagggauc 2280
gccguggaac aggacaagaa cacccaagag guguucgccc aagugaagca gaucuacaag 2340
accccuccua ucaaggacuu cggcggcuuc aauuucagcc agauucugcc cgauccuagc 2400
aagcccagca agcggagcuu caucgaggac cugcuguuca acaaagugac acuggccgac 2460
gccggcuuca ucaagcagua uggcgauugu cugggcgaca uugccgccag ggaucugauu 2520
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gugacccaga augugcugua cgagaaccag aagcugaucg ccaaccaguu caacagcgcc 2760
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guggucaacc agaaugccca ggcacugaac acccugguca agcagcuguc uagcaacuuc 2880
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gugcagaucg acagacugau caccggaagg cugcaguccc ugcagaccua cguuacccag 3000
cagcugauca gagccgccga gauuagagcc ucugccaauc uggccgccac caagaugucu 3060
gagugugugc ugggccagag caagagagug gacuuuugcg gcaagggcua ccaccugaug 3120
agcuucccuc agucugcccc ucacggcgug guguuucugc acgugacaua cgugcccgcu 3180
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gagccccaga ucaucaccac cgacaacacc uucgugucug gcaacugcga cgucgugauc 3360
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gaacuggaua aguacuuuaa gaaccacaca agccccgacg uggaccuggg cgauaucagc 3480
ggaaucaaug ccagcgucgu gaacauccag aaagagaucg accggcugaa cgagguggcc 3540
aagaaucuga acgagagccu gaucgaccug caagaacugg ggaaguacga gcaguacauc 3600
aaguggcccu aauag 3615
<210> 35
<211> 2028
<212> RNA
<213> 冠状病毒(coronavirus)
<400> 35
augucuaguc aguguguuaa ucuuacaacc agaacucaau uacccccugc auacacuaau 60
ucuuucacac gugguguuua uuacccugac aaaguuuuca gauccucagu uuuacauuca 120
acucaggacu uguucuuacc uuucuuuucc aauguuacuu gguuccaugc uauacauguc 180
ucugggacca augguacuaa gagguuugau aacccugucc uaccauuuaa ugaugguguu 240
uauuuugcuu ccacugagaa gucuaacaua auaagaggcu ggauuuuugg uacuacuuua 300
gauucgaaga cccagucccu acuuauuguu aauaacgcua cuaauguugu uauuaaaguc 360
ugugaauuuc aauuuuguaa ugauccauuu uuggguguuu auuaccacaa aaacaacaaa 420
aguuggaugg aaagugaguu cagaguuuau ucuagugcga auaauugcac uuuugaauau 480
gucucucagc cuuuucuuau ggaccuugaa ggaaaacagg guaauuucaa aaaucuuagg 540
gaauuugugu uuaagaauau ugaugguuau uuuaaaauau auucuaagca cacgccuauu 600
aauuuagugc gugaucuccc ucaggguuuu ucggcuuuag aaccauuggu agauuugcca 660
auagguauua acaucacuag guuucaaacu uuacuugcuu uacauagaag uuauuugacu 720
ccuggugauu cuucuucagg uuggacagcu ggugcugcag cuuauuaugu ggguuaucuu 780
caaccuagga cuuuucuauu aaaauauaau gaaaauggaa ccauuacaga ugcuguagac 840
ugugcacuug acccucucuc agaaacaaag uguacguuga aauccuucac uguagaaaaa 900
ggaaucuauc aaacuucuaa cuuuagaguc caaccaacag aaucuauugu uagauuuccu 960
aauauuacaa acuugugccc uuuuggugaa guuuuuaacg ccaccagauu ugcaucuguu 1020
uaugcuugga acaggaagag aaucagcaac uguguugcug auuauucugu ccuauauaau 1080
uccgcaucau uuuccacuuu uaaguguuau ggagugucuc cuacuaaauu aaaugaucuc 1140
ugcuuuacua augucuaugc agauucauuu guaauuagag gugaugaagu cagacaaauc 1200
gcuccagggc aaacuggaaa gauugcugau uauaauuaua aauuaccaga ugauuuuaca 1260
ggcugcguua uagcuuggaa uucuaacaau cuugauucua agguuggugg uaauuauaau 1320
uaccuguaua gauuguuuag gaagucuaau cucaaaccuu uugagagaga uauuucaacu 1380
gaaaucuauc aggccgguag cacaccuugu aaugguguug aagguuuuaa uuguuacuuu 1440
ccuuuacaau cauaugguuu ccaacccacu aaugguguug guuaccaacc auacagagua 1500
guaguacuuu cuuuugaacu ucuacaugca ccagcaacug uuuguggacc uaaaaagucu 1560
acuaauuugg uuaaaaacaa augugucaau uucaacuuca augguuuaac aggcacaggu 1620
guucuuacug agucuaacaa aaaguuucug ccuuuccaac aauuuggcag agacauugcu 1680
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<210> 36
<211> 2031
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
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agcuucggcg gagugucugu gaucaccccu ggcaccaaca ccagcaauca gguggcagug 1800
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tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60
tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 120
tagttctaga ccctcacttc ctactcagg 149
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<211> 17
<212> DNA
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<211> 50
<212> DNA
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<400> 42
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 120
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
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Thr Ala Gly Val Thr Thr Pro Ala Leu Val Pro Ala Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gly Ala Leu Pro Leu Pro Pro Pro Ser Ala Val Thr Thr
50 55 60
Pro His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Ala Gly Thr Leu Ala Pro Ala
65 70 75 80
Ala Pro Val Leu Pro Pro Ala Ala Gly Val Thr Pro Ala Ser Thr Gly
85 90 95
Leu Ser Ala Ile Ile Ala Gly Thr Ile Pro Gly Thr Thr Leu Ala Ser
100 105 110
Leu Thr Gly Ser Leu Leu Ile Val Ala Ala Ala Thr Ala Val Val Ile
115 120 125
Leu Val Cys Gly Pro Gly Pro Cys Ala Ala Pro Pro Leu Gly Val Thr
130 135 140
Thr His Leu Ala Ala Leu Ser Thr Met Gly Ser Gly Pro Ala Val Thr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Ala Ala Cys Thr Pro Gly Thr Val Ser Gly Pro Pro Leu
165 170 175
Met Ala Leu Gly Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Ala Leu Ala Gly Pro
180 185 190
Val Pro Leu Ala Ile Ala Gly Thr Pro Leu Ile Thr Ser Leu His Thr
195 200 205
Pro Ile Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly Pro Ser Ala Leu Gly
210 215 220
Pro Leu Val Ala Leu Pro Ile Gly Ile Ala Ile Thr Ala Pro Gly Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Ala Ser Thr Leu Thr Pro Gly Ala Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Thr Thr Ala Gly Ala Ala Ala Thr Thr Val Gly Thr Leu Gly Pro
260 265 270
Ala Thr Pro Leu Leu Leu Thr Ala Gly Ala Gly Thr Ile Thr Ala Ala
275 280 285
Val Ala Cys Ala Leu Ala Pro Leu Ser Gly Thr Leu Cys Thr Leu Leu
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Ser Pro Thr Val Gly Leu Gly Ile Thr Gly Thr Ser Ala Pro Ala Val
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Gly Pro Thr Gly Ser Ile Val Ala Pro Pro Ala Ile Thr Ala Leu Cys
325 330 335
Pro Pro Gly Gly Val Pro Ala Ala Thr Ala Pro Ala Ser Val Thr Ala
340 345 350
Thr Ala Ala Leu Ala Ile Ser Ala Cys Val Ala Ala Thr Ser Val Leu
355 360 365
Thr Ala Ser Ala Ser Pro Ser Thr Pro Leu Cys Thr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Leu Leu Ala Ala Leu Cys Pro Thr Ala Val Thr Ala Ala Ser Pro
385 390 395 400
Val Ile Ala Gly Ala Gly Val Ala Gly Ile Ala Pro Gly Gly Thr Gly
405 410 415
Leu Ile Ala Ala Thr Ala Thr Leu Leu Pro Ala Ala Pro Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Thr Ala Ser Ala Ala Leu Ala Ser Leu Val Gly Gly Ala
435 440 445
Thr Ala Thr Leu Thr Ala Leu Pro Ala Leu Ser Ala Leu Leu Pro Pro
450 455 460
Gly Ala Ala Ile Ser Thr Gly Ile Thr Gly Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Ala Gly Val Gly Gly Pro Ala Cys Thr Pro Pro Leu Gly Ser Thr Gly
485 490 495
Pro Gly Pro Thr Ala Gly Val Gly Thr Gly Pro Thr Ala Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Pro Gly Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Leu
515 520 525
Leu Ser Thr Ala Leu Val Leu Ala Leu Cys Val Ala Pro Ala Pro Ala
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Gly Ser Ala Leu Leu Pro Leu
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Pro Pro Gly Gly Pro Gly Ala Ala Ile Ala Ala Thr Thr Ala Ala Val
565 570 575
Ala Ala Pro Gly Thr Leu Gly Ile Leu Ala Ile Thr Pro Cys Ser Pro
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Ala Thr Ser Ala Gly Val
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Ala Val Leu Thr Gly Ala Val Ala Cys Thr Gly Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Ala Gly Leu Thr Pro Thr Thr Ala Val Thr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Ala Val Pro Gly Thr Ala Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Gly His Val
645 650 655
Ala Ala Ser Thr Gly Cys Ala Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
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Ser Thr Gly Thr Gly Thr Ala Ser Pro Ala Ala Ala Ala Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gly Ser Ile Ile Ala Thr Thr Met Ser Leu Gly Ala Gly Ala Ser
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Ser Val Thr Thr Gly Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Leu Thr Ser Val
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Ala Cys Thr Met Thr Ile Cys Gly Ala Ser Thr Gly Cys Ser Ala Leu
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Leu Leu Gly Thr Gly Ser Pro Cys Thr Gly Leu Ala Ala Ala Leu Thr
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Gly Ile Ala Val Gly Gly Ala Leu Ala Thr Gly Gly Val Pro Ala Gly
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Pro Ile Gly Ala Leu Leu Pro Ala Leu Val Thr Leu Ala Ala Ala Gly
820 825 830
Pro Ile Leu Gly Thr Gly Ala Cys Leu Gly Ala Ile Ala Ala Ala Ala
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Leu Ile Cys Ala Gly Leu Pro Ala Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
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Leu Thr Ala Gly Met Ile Ala Gly Thr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
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Thr Ile Thr Ser Gly Thr Thr Pro Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gly Ile
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Pro Pro Ala Met Gly Met Ala Thr Ala Pro Ala Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gly Ala Val Leu Thr Gly Ala Gly Leu Leu Ile Ala Ala Gly Pro Ala
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Ser Ala Ile Gly Leu Ile Gly Ala Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Leu Leu Gly Ala Val Val Ala Gly Ala Ala Gly Ala Leu Ala
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Thr Leu Val Leu Gly Leu Ser Ser Ala Pro Gly Ala Ile Ser Ser Val
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Leu Ala Ala Ile Leu Ser Ala Leu Ala Leu Val Gly Ala Gly Val Gly
980 985 990
Ile Ala Ala Leu Ile Thr Gly Ala Leu Gly Ser Leu Gly Thr Thr Val
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Thr Gly Gly Leu Ile Ala Ala Ala Gly Ile Ala Ala Ser Ala Ala Leu
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Ala Ala Thr Leu Met Ser Gly Cys Val Leu Gly Gly Ser Leu Ala Val
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Ala Pro Cys Gly Leu Gly Thr His Leu Met Ser Pro Pro Gly Ser Ala
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Pro His Gly Val Val Pro Leu His Val Thr Thr Val Pro Ala Gly Gly
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Pro Val Ser Gly Ala Cys Ala Val Val Ile Gly Ile Val Ala Ala Thr
1125 1130 1135
Val Thr Ala Pro Leu Gly Pro Gly Leu Ala Ser Pro Leu Gly Gly Leu
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Ala Leu Thr Pro Leu Ala His Thr Ser Pro Ala Val Ala Leu Gly Ala
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Ile Ser Gly Ile Ala Ala Ser Val Val Ala Ile Gly Leu Gly Ile Ala
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Ala Leu Ala Gly Val Ala Leu Ala Leu Ala Gly Ser Leu Ile Ala Leu
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Gly Gly Leu Gly Leu Thr Gly Gly Thr Ile Leu Thr Pro Thr Thr Ile
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Thr Leu Gly Pro Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
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Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Leu Gly Cys Cys
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Ser Cys Gly Ser Cys Cys Leu Pro Ala Gly Ala Ala Ser Gly Pro Val
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Thr Ala Val Thr Ala Ala Ser Pro Val Ile Ala Gly Ala Gly Val Ala
65 70 75 80
Gly Ile Ala Pro Gly Gly Thr Gly Leu Ile Ala Ala Thr Ala Thr Leu
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Leu Pro Ala Ala Pro Thr Gly Cys Val Ile Ala Thr Ala Ser Ala Ala
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Leu Ala Ser Leu Val Gly Gly Ala Thr Ala Thr Leu Thr Ala Leu Pro
115 120 125
Ala Leu Ser Ala Leu Leu Pro Pro Gly Ala Ala Ile Ser Thr Gly Ile
130 135 140
Thr Gly Ala Gly Ser Thr Pro Cys Ala Gly Val Gly Gly Pro Ala Cys
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165 170 175
Thr Gly Pro Thr Ala Val Val Val Leu Ser Pro Gly Leu Leu His Ala
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100 105 110
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20 25 30
Ser Gly Ala Ala Ser Leu Gly Ala Ala Pro Gly Gly Leu Pro Ala Ala
35 40 45
Thr Ala Ser Thr Pro Thr Ala Leu Thr Gly His Gly Leu Gly Ala Leu
50 55 60
Leu Pro Pro Ala Gly Gly Gly Val Pro Ile Ala Thr Ala Ser Ser Pro
65 70 75 80
Ala Ala Gly Ile Gly Thr Thr Ala Ala Ala Thr Ala Ala Ile Ala Gly
85 90 95
Gly Ala Gly Leu Met Leu Ala Leu Ser Pro Ala Thr Thr Pro Thr Thr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Gly Ala Gly Leu Pro Thr Gly Ala Ala Leu Ala
115 120 125
Gly Ile Ile Thr Val Ala Thr Gly Gly Ala Leu Ala Thr Pro Leu Ala
130 135 140
His Ile Gly Thr Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ile Val Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Gly Gly Thr Thr Leu Pro Leu Gly Pro Thr Ala Gly Gly Ser
165 170 175
Ala Gly Gly Ser Gly Ala Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ala Ser Ala Ala
180 185 190
Ser Ser Ala Ala Ser Thr Pro Gly Ser Ser Ala Gly Thr Ser Pro Ala
195 200 205
Ala Met Ala Gly Ala Gly Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
210 215 220
Ala Ala Leu Ala Gly Leu Gly Ser Leu Met Ser Gly Leu Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Thr Val Thr Leu Leu Ser Ala Ala Gly Ala Ser Leu
245 250 255
Leu Pro Ala Gly Leu Ala Thr Ala Thr Leu Ala Thr Ala Val Thr Gly
260 265 270
Ala Pro Gly Ala Ala Gly Pro Gly Gly Thr Gly Gly Ala Pro Gly Ala
275 280 285
Gly Gly Leu Ile Ala Gly Gly Thr Ala Thr Leu His Thr Pro Gly Ile
290 295 300
Ala Gly Pro Ala Pro Ser Ala Ser Ala Pro Pro Gly Met Ser Ala Ile
305 310 315 320
Gly Met Gly Val Thr Pro Ser Gly Thr Thr Leu Thr Thr Thr Gly Ala
325 330 335
Ile Leu Leu Ala Ala Leu Ala Pro Ala Pro Leu Ala Gly Val Ile Leu
340 345 350
Leu Ala Leu His Ile Ala Ala Thr Leu Thr Pro Pro Pro Thr Gly Pro
355 360 365
Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gly Thr Gly Ala Leu Pro Gly
370 375 380
Ala Gly Leu Leu Gly Gly Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Ala Leu
385 390 395 400
Ala Ala Pro Ser Leu Gly Leu Gly Gly Ser Met Ser Ser Ala Ala Ser
405 410 415
Thr Gly Ala
<210> 47
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Met Ala Ala Met Leu Ala Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Pro Val Ser Ala Ser Ile Thr Ala Leu Cys Pro Pro Gly Gly
20 25 30
Val Pro Ala Ala Thr Ala Pro Ala Ser Val Thr Ala Thr Ala Ala Leu
35 40 45
Ala Ile Ser Ala Cys Val Ala Ala Thr Ser Val Leu Thr Ala Ser Ala
50 55 60
Ser Pro Ser Thr Pro Leu Cys Thr Gly Val Ser Pro Thr Leu Leu Ala
65 70 75 80
Ala Leu Cys Pro Thr Ala Val Thr Ala Ala Ser Pro Val Ile Ala Gly
85 90 95
Ala Gly Val Ala Gly Ile Ala Pro Gly Gly Thr Gly Leu Ile Ala Ala
100 105 110
Thr Ala Thr Leu Leu Pro Ala Ala Pro Thr Gly Cys Val Ile Ala Thr
115 120 125
Ala Ser Ala Ala Leu Ala Ser Leu Val Gly Gly Ala Thr Ala Thr Leu
130 135 140
Thr Ala Leu Pro Ala Leu Ser Ala Leu Leu Pro Pro Gly Ala Ala Ile
145 150 155 160
Ser Thr Gly Ile Thr Gly Ala Gly Ser Thr Pro Cys Ala Gly Val Gly
165 170 175
Gly Pro Ala Cys Thr Pro Pro Leu Gly Ser Thr Gly Pro Gly Pro Thr
180 185 190
Ala Gly Val Gly Thr Gly Pro Thr Ala Val Val Val Leu Ser Pro Gly
195 200 205
Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Leu Leu
210 215 220
<210> 48
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Met Ala Ala Met Leu Ala Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Pro Val Ser Ala Ser Ile Thr Ala Leu Cys Pro Pro Gly Gly
20 25 30
Val Pro Ala Ala Thr Ala Pro Ala Ser Val Thr Ala Thr Ala Ala Leu
35 40 45
Ala Ile Ser Ala Cys Val Ala Ala Thr Ser Val Leu Thr Ala Ser Ala
50 55 60
Ser Pro Ser Thr Pro Leu Cys Thr Gly Val Ser Pro Thr Leu Leu Ala
65 70 75 80
Ala Leu Cys Pro Thr Ala Val Thr Ala Ala Ser Pro Val Ile Ala Gly
85 90 95
Ala Gly Val Ala Gly Ile Ala Pro Gly Gly Thr Gly Leu Ile Ala Ala
100 105 110
Thr Ala Thr Leu Leu Pro Ala Ala Pro Thr Gly Cys Val Ile Ala Thr
115 120 125
Ala Ser Ala Ala Leu Ala Ser Leu Val Gly Gly Ala Thr Ala Thr Leu
130 135 140
Thr Ala Leu Pro Ala Leu Ser Ala Leu Leu Pro Pro Gly Ala Ala Ile
145 150 155 160
Ser Thr Gly Ile Thr Gly Ala Gly Ser Thr Pro Cys Ala Gly Val Gly
165 170 175
Gly Pro Ala Cys Thr Pro Pro Leu Gly Ser Thr Gly Pro Gly Pro Thr
180 185 190
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195 200 205
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Met Thr Ser Pro Val Ser Gly Gly Thr Gly Thr Leu Ile Val Ala Ser
1 5 10 15
Val Leu Leu Pro Leu Ala Pro Val Val Pro Leu Leu Val Thr Leu Ala
20 25 30
Ile Leu Thr Ala Leu Ala Leu Cys Ala Thr Cys Cys Ala Ile Val Ala
35 40 45
Val Ser Leu Val Leu Pro Ser Pro Thr Val Thr Ser Ala Val Leu Ala
50 55 60
Leu Ala Ser Ser Ala Val Pro Ala Leu Leu Val
65 70 75
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<211> 1225
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Met Ala Ala Met Leu Ala Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Pro Val Ser Ala Ser Ser Ser Gly Cys Val Ala Leu Thr Thr
20 25 30
Ala Thr Gly Leu Pro Pro Ala Thr Thr Ala Ser Pro Thr Ala Gly Val
35 40 45
Thr Thr Pro Ala Leu Val Pro Ala Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gly
50 55 60
Ala Leu Pro Leu Pro Pro Pro Ser Ala Val Thr Thr Pro His Ala Ile
65 70 75 80
His Val Ser Gly Thr Ala Gly Thr Leu Ala Pro Ala Ala Pro Val Leu
85 90 95
Pro Pro Ala Ala Gly Val Thr Pro Ala Ser Thr Gly Leu Ser Ala Ile
100 105 110
Ile Ala Gly Thr Ile Pro Gly Thr Thr Leu Ala Ser Leu Thr Gly Ser
115 120 125
Leu Leu Ile Val Ala Ala Ala Thr Ala Val Val Ile Leu Val Cys Gly
130 135 140
Pro Gly Pro Cys Ala Ala Pro Pro Leu Gly Val Thr Thr His Leu Ala
145 150 155 160
Ala Leu Ser Thr Met Gly Ser Gly Pro Ala Val Thr Ser Ser Ala Ala
165 170 175
Ala Cys Thr Pro Gly Thr Val Ser Gly Pro Pro Leu Met Ala Leu Gly
180 185 190
Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Ala Leu Ala Gly Pro Val Pro Leu Ala
195 200 205
Ile Ala Gly Thr Pro Leu Ile Thr Ser Leu His Thr Pro Ile Ala Leu
210 215 220
Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly Pro Ser Ala Leu Gly Pro Leu Val Ala
225 230 235 240
Leu Pro Ile Gly Ile Ala Ile Thr Ala Pro Gly Thr Leu Leu Ala Leu
245 250 255
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260 265 270
Gly Ala Ala Ala Thr Thr Val Gly Thr Leu Gly Pro Ala Thr Pro Leu
275 280 285
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290 295 300
Leu Ala Pro Leu Ser Gly Thr Leu Cys Thr Leu Leu Ser Pro Thr Val
305 310 315 320
Gly Leu Gly Ile Thr Gly Thr Ser Ala Pro Ala Val Gly Pro Thr Gly
325 330 335
Ser Ile Val Ala Pro Pro Ala Ile Thr Ala Leu Cys Pro Pro Gly Gly
340 345 350
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355 360 365
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Ser Pro Ser Thr Pro Leu Cys Thr Gly Val Ser Pro Thr Leu Leu Ala
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Ala Leu Cys Pro Thr Ala Val Thr Ala Ala Ser Pro Val Ile Ala Gly
405 410 415
Ala Gly Val Ala Gly Ile Ala Pro Gly Gly Thr Gly Leu Ile Ala Ala
420 425 430
Thr Ala Thr Leu Leu Pro Ala Ala Pro Thr Gly Cys Val Ile Ala Thr
435 440 445
Ala Ser Ala Ala Leu Ala Ser Leu Val Gly Gly Ala Thr Ala Thr Leu
450 455 460
Thr Ala Leu Pro Ala Leu Ser Ala Leu Leu Pro Pro Gly Ala Ala Ile
465 470 475 480
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485 490 495
Gly Pro Ala Cys Thr Pro Pro Leu Gly Ser Thr Gly Pro Gly Pro Thr
500 505 510
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515 520 525
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Leu Val Leu Ala Leu Cys Val Ala Pro Ala Pro Ala Gly Leu Thr Gly
545 550 555 560
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565 570 575
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595 600 605
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Gly Ala Val Ala Cys Thr Gly Val Pro Val Ala Ile His Ala Ala Gly
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645 650 655
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660 665 670
Gly Cys Ala Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Thr Gly Thr
675 680 685
Gly Thr Ala Ser Pro Ala Ala Ala Ala Ser Val Ala Ser Gly Ser Ile
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Gly Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Leu Thr Ser Val Ala Cys Thr Met
740 745 750
Thr Ile Cys Gly Ala Ser Thr Gly Cys Ser Ala Leu Leu Leu Gly Thr
755 760 765
Gly Ser Pro Cys Thr Gly Leu Ala Ala Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val
770 775 780
Gly Gly Ala Leu Ala Thr Gly Gly Val Pro Ala Gly Val Leu Gly Ile
785 790 795 800
Thr Leu Thr Pro Pro Ile Leu Ala Pro Gly Gly Pro Ala Pro Ser Gly
805 810 815
Ile Leu Pro Ala Pro Ser Leu Pro Ser Leu Ala Ser Pro Ile Gly Ala
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Leu Leu Pro Ala Leu Val Thr Leu Ala Ala Ala Gly Pro Ile Leu Gly
835 840 845
Thr Gly Ala Cys Leu Gly Ala Ile Ala Ala Ala Ala Leu Ile Cys Ala
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Gly Leu Pro Ala Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Ala Gly
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Met Ile Ala Gly Thr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser
885 890 895
Gly Thr Thr Pro Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gly Ile Pro Pro Ala Met
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Gly Met Ala Thr Ala Pro Ala Gly Ile Gly Val Thr Gly Ala Val Leu
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930 935 940
Leu Ile Gly Ala Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Leu Leu
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Gly Ala Val Val Ala Gly Ala Ala Gly Ala Leu Ala Thr Leu Val Leu
965 970 975
Gly Leu Ser Ser Ala Pro Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Ala Ala Ile
980 985 990
Leu Ser Ala Leu Ala Leu Val Gly Ala Gly Val Gly Ile Ala Ala Leu
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Ile Thr Gly Ala Leu Gly Ser Leu Gly Thr Thr Val Thr Gly Gly Leu
1010 1015 1020
Ile Ala Ala Ala Gly Ile Ala Ala Ser Ala Ala Leu Ala Ala Thr Leu
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Ala Ala Ser Val Val Ala Ile Gly Leu Gly Ile Ala Ala Leu Ala Gly
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Val Ala Leu Ala Leu Ala Gly Ser Leu Ile Ala Leu Gly Gly Leu Gly
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<210> 51
<211> 697
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Met Ala Ala Met Leu Ala Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Pro Val Ser Ala Ser Ser Ser Gly Cys Val Ala Leu Thr Thr
20 25 30
Ala Thr Gly Leu Pro Pro Ala Thr Thr Ala Ser Pro Thr Ala Gly Val
35 40 45
Thr Thr Pro Ala Leu Val Pro Ala Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gly
50 55 60
Ala Leu Pro Leu Pro Pro Pro Ser Ala Val Thr Thr Pro His Ala Ile
65 70 75 80
His Val Ser Gly Thr Ala Gly Thr Leu Ala Pro Ala Ala Pro Val Leu
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100 105 110
Ile Ala Gly Thr Ile Pro Gly Thr Thr Leu Ala Ser Leu Thr Gly Ser
115 120 125
Leu Leu Ile Val Ala Ala Ala Thr Ala Val Val Ile Leu Val Cys Gly
130 135 140
Pro Gly Pro Cys Ala Ala Pro Pro Leu Gly Val Thr Thr His Leu Ala
145 150 155 160
Ala Leu Ser Thr Met Gly Ser Gly Pro Ala Val Thr Ser Ser Ala Ala
165 170 175
Ala Cys Thr Pro Gly Thr Val Ser Gly Pro Pro Leu Met Ala Leu Gly
180 185 190
Gly Leu Gly Gly Ala Pro Leu Ala Leu Ala Gly Pro Val Pro Leu Ala
195 200 205
Ile Ala Gly Thr Pro Leu Ile Thr Ser Leu His Thr Pro Ile Ala Leu
210 215 220
Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly Pro Ser Ala Leu Gly Pro Leu Val Ala
225 230 235 240
Leu Pro Ile Gly Ile Ala Ile Thr Ala Pro Gly Thr Leu Leu Ala Leu
245 250 255
His Ala Ser Thr Leu Thr Pro Gly Ala Ser Ser Ser Gly Thr Thr Ala
260 265 270
Gly Ala Ala Ala Thr Thr Val Gly Thr Leu Gly Pro Ala Thr Pro Leu
275 280 285
Leu Leu Thr Ala Gly Ala Gly Thr Ile Thr Ala Ala Val Ala Cys Ala
290 295 300
Leu Ala Pro Leu Ser Gly Thr Leu Cys Thr Leu Leu Ser Pro Thr Val
305 310 315 320
Gly Leu Gly Ile Thr Gly Thr Ser Ala Pro Ala Val Gly Pro Thr Gly
325 330 335
Ser Ile Val Ala Pro Pro Ala Ile Thr Ala Leu Cys Pro Pro Gly Gly
340 345 350
Val Pro Ala Ala Thr Ala Pro Ala Ser Val Thr Ala Thr Ala Ala Leu
355 360 365
Ala Ile Ser Ala Cys Val Ala Ala Thr Ser Val Leu Thr Ala Ser Ala
370 375 380
Ser Pro Ser Thr Pro Leu Cys Thr Gly Val Ser Pro Thr Leu Leu Ala
385 390 395 400
Ala Leu Cys Pro Thr Ala Val Thr Ala Ala Ser Pro Val Ile Ala Gly
405 410 415
Ala Gly Val Ala Gly Ile Ala Pro Gly Gly Thr Gly Leu Ile Ala Ala
420 425 430
Thr Ala Thr Leu Leu Pro Ala Ala Pro Thr Gly Cys Val Ile Ala Thr
435 440 445
Ala Ser Ala Ala Leu Ala Ser Leu Val Gly Gly Ala Thr Ala Thr Leu
450 455 460
Thr Ala Leu Pro Ala Leu Ser Ala Leu Leu Pro Pro Gly Ala Ala Ile
465 470 475 480
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485 490 495
Gly Pro Ala Cys Thr Pro Pro Leu Gly Ser Thr Gly Pro Gly Pro Thr
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515 520 525
Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Leu Leu Ser Thr Ala
530 535 540
Leu Val Leu Ala Leu Cys Val Ala Pro Ala Pro Ala Gly Leu Thr Gly
545 550 555 560
Thr Gly Val Leu Thr Gly Ser Ala Leu Leu Pro Leu Pro Pro Gly Gly
565 570 575
Pro Gly Ala Ala Ile Ala Ala Thr Thr Ala Ala Val Ala Ala Pro Gly
580 585 590
Thr Leu Gly Ile Leu Ala Ile Thr Pro Cys Ser Pro Gly Gly Val Ser
595 600 605
Val Ile Thr Pro Gly Thr Ala Thr Ser Ala Gly Val Ala Val Leu Thr
610 615 620
Gly Ala Val Ala Cys Thr Gly Val Pro Val Ala Ile His Ala Ala Gly
625 630 635 640
Leu Thr Pro Thr Thr Ala Val Thr Ser Thr Gly Ser Ala Val Pro Gly
645 650 655
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660 665 670
Gly Cys Ala Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Thr Gly Thr
675 680 685
Gly Thr Ala Ser Pro Ala Ala Ala Ala
690 695
<210> 52
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
gtctcagtcg ccgctgccag ctctcgcact ctgttcttcc gccgctccgc cgtcgcgttt 60
ctctgccggt cgca 74
<210> 53
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
acccggcgct ccattaaata gccgtagacg gaacttcgcc tttctctcgg ccttagcgcc 60
atttttttgg aaacctctgc gcc 83
<210> 54
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ctctcttcca caggaggcct acacgccgcc gcttgtgctg cagcc 45
<210> 55
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
gggacatttg cttctgacac aactgtgttc actagcaacc tcaaacagac acc 53
<210> 56
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gggaaataag agagaaaaga agagtaagaa gaaatataag agccacc 47
<210> 57
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ccccccgagc gccgctccgg ctgcaccgcg ctcgctccga gtttcaggct cgtgctaagc 60
tagcgccgtc gtcgtctccc ttcagtcgcc atc 93
<210> 58
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ctttccggcg gtgacgacct acgcacacga gaac 34
<210> 59
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
cgcctggccg gcgggctgag gcgtacgggt cgcacgcagc gcc 43
<210> 60
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
cgctcttatt ggccagggga cggtagctgc aggactctgc tctcctgcgg cc 52
<210> 61
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ttccatttgg ctgcagcttc tggagggagc cgacaggaga cgtggggaga cg 52
<210> 62
<211> 47
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
gggaaauaag agagaaaaga agaguaagaa gaaauauaag agccacc 47
<210> 63
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
acatttgctt ctgacacaac tgtgttcact agcaacctca aacagacacc 50
<210> 64
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 60
taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 120
tattttcatt gc 132
<210> 65
<211> 306
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
atggaagcat taattgtttt gaacatgtaa atataaatct gtcagccact acagccatca 60
aaagagagca tctggaagaa cagccagctt ggaagtttta cagcaataat gttgcagtgg 120
aatattattt gtagttaagg tcatcctcct cccctttctg tttttttaaa tcaagaacta 180
cgttctgccc ctctcttggg cttcagaagc atctaagaaa agcagtcatc aattataatt 240
aactttcaaa gggcaagtca gaagttgttt ataaattaca aaataaaggc atattatgaa 300
ctctta 306
<210> 66
<211> 176
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
gaaaagactt cttccatcaa gcttaattgt tttgttattc atttaatgac tttccctgct 60
gttacctaat tacaaattgg atggaactgt gtttttttct gctttgtttt ttcagtttgc 120
tgtttctgta gccatattgt attctgtgtc aaataaagtc cagttggatt ctggaa 176
<210> 67
<211> 217
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
caaatgtggc aattattttg gatctatcac ctgtcatcat aactggcttc tgcttgtcat 60
ccacacaaca ccaggactta agacaaatgg gactgatgtc atcttgagct cttcatttat 120
tttgactgtg atttatttgg agtggaggca ttgtttttaa gaaaaacatg tcatgtaggt 180
tgtctaaaaa taaaatgcat ttaaactcat ttgagag 217
<210> 68
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
aagcactctg agtcaagatg agtgggaaac catctcaata aacacatttt ggataaatcc 60
tg 62
<210> 69
<211> 294
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
gcgctgggct gttttagtgc caggctgcgg tgggcagcca tgagaacaaa acctcttctg 60
tatttttttt ttccattagt aaaacacaag acttcagatt cagccgaatt gtggtgtctt 120
acaaggcagg cctttcctac agggggtgga gagaccagcc tttcttcctt tggtaggaat 180
ggcctgagtt ggcgttgtgg gcaggctact ggtttgtatg atgtattagt agagcaaccc 240
attaatcttt tgtagtttgt attaaacttg aactgagacc ttgatgagtc ttta 294
<210> 70
<211> 367
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
gaaaaatgaa aggaagttct gctgtcagag gcaaaacatc tgtttatcat agacatcaac 60
atgacctata agtaaagtgc gtgtctagtg tcttctattg agagtactac tattaattaa 120
gcttatttcc aatgtgcctt tttaatgctt gaagttttat ctacatacac aggtaacaga 180
ggacagtagt ctgtaaacat ataaatcggt cataactatc gtggtcttta tttctgtgag 240
gatctaggga aatttcatgt cacttccctc cttcactgca tcacaatcat attccctttt 300
ttttttcttg gatttgtgtc agttggatga tatcccctcc agatagtatc aataaaatgt 360
taaaatt 367
<210> 71
<211> 325
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
actccctcct cctgccactg gtgcctcgag tagccatggc aacgggccca gtgtccagtc 60
acttagaagt tccccccttg gccaaaaacc caattcacat tgagagctgg tgttgtctga 120
agttttcgta tcacagtgtt aacctgtact ctctcctgca aacctacaca ccaaagcttt 180
atttatatca ttccagtatc aatgctacac agtgttgtcc cgagcgccgg gaggcgttgg 240
gcagaaaccc tcgggaatgc ttccgagcac gctgtagggt atgggaagaa cccagcacca 300
ctaataaagc tgctgcttgg ctgga 325
<210> 72
<211> 252
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
ggtgacccgg ctgggtcggc cctgcccaag ggcctcccac cagagactgg gatgggaaca 60
ctggtgggca gctgaggaca caccccacac cccagcccac cctgctcctc ctgccctgtc 120
cctgtccccc tcccctccca gtcctccaga ccaccagccg ccccagcccc ttctcccagc 180
acacggctgc ctgacactga gccccacctc tccaagtctc tctgtgaata caattaaagg 240
tcctgccctc cc 252
<210> 73
<211> 308
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
accgctagct tgttgcaccg tggaggccac aggagcagaa acatggaatg ccagacgctg 60
gggatgctgg tacaagttgt gggactgcat gctactgtct agagcttgtc tcaatggatc 120
tagaacttca tcgccctctg atcgccgatc acctctgaga cccaccttgc tcataaacaa 180
aatgcccatg ttggtcctct gccctggacc tgtgacattc tggactattt ctgtgtttat 240
ttgtggccga gtgtaacaac catataataa atcacctctt ccgctgtttt agctgaagaa 300
ttaaatca 308
<210> 74
<211> 108
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
gcugccuucu gcggggcuug ccuucuggcc augcccuucu ucucucccuu gcaccuguac 60
cucuuggucu uugaauaaag ccugaguagg aagugagggu cuagaacu 108
<210> 75
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
gctcgctttc ttgctgtcca atttctatta aaggttcctt tgttccctaa gtccaactac 60
taaactgggg gatattatga agggccttga gcatctggat tctgcctaat aaaaaacatt 120
tattttcatt gc 132
<210> 76
<211> 720
<212> RNA
<213> 荧光蛋白(Fluorescent protein)
<400> 76
auggugagca agggcgagga gcuguucacc gggguggugc ccauccuggu cgagcuggac 60
ggcgacguaa acggccacaa guucagcgug uccggcgagg gcgagggcga ugccaccuac 120
ggcaagcuga cccugaaguu caucugcacc accggcaagc ugcccgugcc cuggcccacc 180
cucgugacca cccugaccua cggcgugcag ugcuucagcc gcuaccccga ccacaugaag 240
cagcacgacu ucuucaaguc cgccaugccc gaaggcuacg uccaggagcg caccaucuuc 300
uucaaggacg acggcaacua caagacccgc gccgagguga aguucgaggg cgacacccug 360
gugaaccgca ucgagcugaa gggcaucgac uucaaggagg acggcaacau ccuggggcac 420
aagcuggagu acaacuacaa cagccacaac gucuauauca uggccgacaa gcagaagaac 480
ggcaucaagg ugaacuucaa gauccgccac aacaucgagg acggcagcgu gcagcucgcc 540
gaccacuacc agcagaacac ccccaucggc gacggccccg ugcugcugcc cgacaaccac 600
uaccugagca cccaguccgc ccugagcaaa gaccccaacg agaagcgcga ucacaugguc 660
cugcuggagu ucgugaccgc cgccgggauc acucucggca uggacgagcu guacaaguaa 720
<210> 77
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
auguuccugc ugacuacaaa acggacu 27
<210> 78
<211> 66
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
gacgcuauga agaggggccu gugcugugug cugcugcugu gcggagcugu guucgugucc 60
aacagc 66

Claims (34)

1.一种DNA序列，所述的DNA序列如SEQ NO：1 (序列表中SEQ ID NO: 2)所示或者如与之互补的序列所示。
2.根据权利要求1所述的DNA序列，在所述序列的5’端还添加有序列，所述添加的序列如SEQ NO：12 (序列表中SEQ ID NO: 39)所示或者如与之互补的序列所示。
3.根据权利要求1所述的DNA序列，在所述序列的5’端还添加有序列，所述添加的序列如SEQ NO：13 (序列表中SEQ ID NO: 40)所示或者如与之互补的序列所示。
4.根据权利要求1所述的DNA序列，在所述序列的3’端还添加有序列，所述添加的序列如SEQ NO：14 (序列表中SEQ ID NO: 41)所示或者如与之互补的序列所示。
5.根据权利要求1所述的DNA序列，在所述序列的3’端还添加有序列，所述添加的序列如SEQ NO：15 (序列表中SEQ ID NO: 42)所示或者如与之互补的序列所示。
6.一种DNA序列，所述DNA序列如以下所示：从5’-3’方向依次为：如SEQ NO：12 (序列表中SEQ ID NO: 39)所示的序列、如SEQ NO：13 (序列表中SEQ ID NO: 40)所示的序列、如SEQ NO：1 (序列表中SEQ ID NO: 2)所示的序列、如SEQ NO：14 (序列表中SEQ ID NO: 41)所示的序列、如SEQ NO：15 (序列表中SEQ ID NO: 42)所示的序列，或者如与之互补的序列所示。
7.一种mRNA序列，所述的mRNA序列如SEQ NO：1.1 (序列表中SEQ ID NO: 20)所示。
8.根据权利要求7所述的mRNA序列，在所述序列的5’端还添加有序列，所述添加的序列如SEQ NO：36-11 (序列表中SEQ ID NO: 62)所示。
9.根据权利要求7所述的mRNA序列，在所述序列的5’端还添加有序列，所述添加的序列如SEQ NO：36-12 (序列表中SEQ ID NO: 63)所示。
10.根据权利要求7所述的mRNA序列，在所述序列的3’端还添加有序列，所述添加的序列如SEQ NO：37-11 (序列表中SEQ ID NO: 74)所示。
11.根据权利要求7所述的mRNA序列，在所述序列的3’端还添加有序列，所述添加的序列如SEQ NO：37-12 (序列表中SEQ ID NO: 75)所示。
12.一种mRNA序列，所述的mRNA序列如以下所示：从5’-3’方向依次为：如SEQ NO：36-11(序列表中SEQ ID NO: 62)所示的序列、如SEQ NO：1.1 (序列表中SEQ ID NO: 20)所示的序列、如SEQ NO：37-11 (序列表中SEQ ID NO: 74)所示的序列、polyA序列。
13.一种mRNA序列，所述的mRNA序列如以下所示：如SEQ NO：36-12 (序列表中SEQ IDNO: 63)所示的序列、如SEQ NO：1.1 (序列表中SEQ ID NO: 20)所示的序列、如SEQ NO：37-12 (序列表中SEQ ID NO: 75)所示的序列、polyA序列。
14.根据权利要求12或13所述的mRNA序列，其中所述polyA序列如SEQ NO：15 (序列表中SEQ ID NO: 42)所示。
15.一种冠状病毒mRNA疫苗试剂，所述的疫苗试剂包括mRNA，其中所述mRNA的序列如权利要求7-14之一所述的mRNA序列所示，或者如由权利要求1-6之一所述的DNA序列转录而获得的mRNA序列所示。
16.根据权利要求15所述的疫苗试剂，其中，所述的mRNA包括经过修饰的核苷酸，其中所述修饰选自如下的一种或者几种：2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟嘌呤、假尿苷、2-硫代尿苷以及2-硫代胞苷；2'-氟代核糖、2'-脱氧核糖；硫代磷酸基和5'-N-亚磷酰胺键。
17.根据权利要求15所述的疫苗试剂，其中，所述的mRNA包括经过修饰的核苷酸，其中所述修饰选自如下的一种或者几种：N-1-甲基-假尿苷和C5-甲基胞苷。
18.根据权利要求15所述的疫苗试剂，其中，所述的mRNA包括经过修饰的核苷酸，其中所述修饰为N-1-甲基-假尿苷。
19.根据权利要求18所述的疫苗试剂，所述的修饰比例为50%。
20.根据权利要求15所述的疫苗试剂，所述的试剂还包括聚合物，所述的聚合物与所述的mRNA形成包括核苷酸聚合物的核结构，所述的聚合物选自以下聚合物中的一种或者几种：聚丙烯酸酯、聚烷基氰基丙烯酸酯、聚丙交酯、聚丙交酯-聚乙交酯共聚物、聚己内酯、葡聚糖、白蛋白、明胶、藻酸盐、胶原、壳聚糖、环糊精、聚乙烯亚胺(PEI)或者支化的PEI。
21.根据权利要求20所述的疫苗试剂，所述的试剂还包括脂质体，所述的包括核苷酸聚合物的核结构被封装在脂质体中形成纳米颗粒。
22.根据权利要求15所述的疫苗试剂，所述的试剂还包括脂质体，所述的mRNA被脂质体包裹形成纳米颗粒。
23.根据权利要求21或者22所述的疫苗试剂，所述的脂质体包含选自如下脂质的一种或者几种：阳离子脂质、非阳离子脂质、基于甾醇的脂质和PEG-改性脂质。
24.根据权利要求23所述的疫苗试剂，所述的阳离子脂质包括：C12-200、MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、cKK-E12、ICE(咪唑基)、HGT5000、HGT5001、OF-02、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA、DMDMA、、DLenDMA、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA或HGT4003；或其组合。
25.根据权利要求23所述的疫苗试剂，所述的阳离子脂质包括DLin-K-XTC2-DMA。
26.根据权利要求23所述的疫苗试剂，所述的非阳离子脂质包括神经酰胺、脑磷脂、脑苷脂、二酰基甘油、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酰基甘油钠盐(DPPG)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DSPE)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二油基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二油基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油)(DOPG)、1-棕榈酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(POPE)、1-棕榈酰-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(SOPE)或鞘磷脂，或其组合。
27.根据权利要求23所述的疫苗试剂，所述的基于甾醇的脂质构成脂质纳米颗粒中总脂质的不超过70%。
28.根据权利要求23所述的疫苗试剂，所述的基于甾醇的脂质包括磷脂酰化合物、鞘脂或其组合。
29.根据权利要求23所述的疫苗试剂，所述的基于甾醇的脂质包括磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺或其组合。
30.根据权利要求23所述的疫苗试剂，所述的基于甾醇的脂质包括脑苷脂、神经节苷脂或其组合。
31.根据权利要求23所述的疫苗试剂，其中，所述的PEG-改性脂质包括DMG-PEG、DMG-PEG2K、C8-PEG、DOGPEG、神经酰胺PEG、DSPE-PEG或其组合。
32.根据权利要求15所述的疫苗试剂，所述的疫苗试剂还包括：
硫酸鱼精蛋白、DOPE、DSPE-mPEG2000和M5，所述M5的结构如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
(M5)。
33.根据权利要求32所述的疫苗试剂，所述M5:DOPE:DSPE-mPEG2000的质量比为49:49:2。
34.一种DNA疫苗试剂，所述的试剂包括DNA，其中所述DNA的序列如权利要求1-6之一所述的DNA序列所示。
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Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4379053A3 (en) 2018-10-09 2024-09-18 The University of British Columbia Compositions and systems comprising transfection-competent vesicles free of organic-solvents and detergents and methods related thereto
US11241493B2 (en) 2020-02-04 2022-02-08 Curevac Ag Coronavirus vaccine
US12194089B2 (en) 2020-02-04 2025-01-14 CureVac SE Coronavirus vaccine
WO2021213924A1 (en) 2020-04-22 2021-10-28 BioNTech SE Coronavirus vaccine
CN113322271A (zh) * 2020-06-24 2021-08-31 西南交通大学 基于酵母表面展示系统的covid-19亚单位疫苗
CA3205569A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 CureVac SE Rna vaccine against sars-cov-2 variants
CN112575008B (zh) * 2020-12-31 2023-03-24 四川大学华西医院 编码新型冠状病毒的结构蛋白的核酸分子以及新型冠状病毒疫苗
CN113633764B (zh) * 2021-09-02 2024-05-14 中国食品药品检定研究院 一种含佐剂的新冠dna疫苗
CA3234578A1 (en) * 2021-10-22 2023-04-27 Advait Vijay Badkar Compositions for administration of different doses of rna
US12186387B2 (en) 2021-11-29 2025-01-07 BioNTech SE Coronavirus vaccine
WO2023113094A1 (ko) * 2021-12-16 2023-06-22 주식회사 씨티씨백 면역원성이 증가된 코로나바이러스감염증-19 백신 조성물
CN114432435B (zh) * 2022-01-25 2024-05-17 苏州大学 一种基于多角体纳米结构的SARS-Cov-2疫苗及其制备方法和应用
CN114644686B (zh) * 2022-03-24 2023-09-05 中国人民解放军陆军军医大学 一种用于dna疫苗递送系统及其应用和dna疫苗
CN116925195B (zh) * 2022-04-22 2024-06-21 仁景(苏州)生物科技有限公司 一种基于新型冠状病毒的mRNA疫苗
AU2023260227A1 (en) * 2022-04-27 2024-11-21 Shanghai Regenelead Therapies Co., Ltd Nucleic acid construct and use thereof
JP2025515206A (ja) * 2022-05-13 2025-05-13 上海瑞宏迪医薬有限公司 Ｕｔｒを含む核酸構築物及びその使用
US11878055B1 (en) 2022-06-26 2024-01-23 BioNTech SE Coronavirus vaccine
CN119563026A (zh) * 2022-07-19 2025-03-04 深圳深信生物科技有限公司 新型冠状病毒S蛋白的mRNA及其应用
WO2024032611A1 (zh) * 2022-08-09 2024-02-15 斯微(上海)生物科技股份有限公司 一种脂质组合物
CN115869332A (zh) * 2022-10-27 2023-03-31 北京新合睿恩生物医疗科技有限公司 递送至体内后在肝脏少表达的mRNA药物及其制备方法
US12186389B2 (en) 2022-10-28 2025-01-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nucleic acid base vaccine against emerging SARS-CoV-2 variants
WO2024094211A1 (zh) * 2022-11-06 2024-05-10 斯微(上海)生物科技股份有限公司 一种脂质组合物
WO2024098361A1 (zh) * 2022-11-11 2024-05-16 斯微(上海)生物科技股份有限公司 人工核酸分子
WO2024144348A1 (ko) * 2022-12-29 2024-07-04 주식회사 바이오파마 양이온성 분자 수송체 및 mrna의 이온복합체를 포함하는 백신 조성물
CN116570736B (zh) * 2023-05-27 2025-10-31 中国医学科学院北京协和医院 基于SARS-CoV系列病毒S蛋白序列的靶向血管紧张素受体Ⅱ的放射性探针
TW202532107A (zh) * 2023-11-14 2025-08-16 大陸商上海瑞宏迪醫藥有限公司 一種含核酸構建體的醫藥組成物及其醫藥用途

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2523875A1 (en) * 2003-04-28 2004-11-11 Public Health Agency Of Canada Sars virus nucleotide and amino acid sequences and uses thereof
CN110167587A (zh) * 2016-11-11 2019-08-23 摩登纳特斯有限公司 流感疫苗
WO2018115527A2 (en) * 2016-12-23 2018-06-28 Curevac Ag Mers coronavirus vaccine
GB201718660D0 (en) * 2017-11-10 2017-12-27 Ucl Business Plc Improved liposome for mRNA delivery to cells
CN112313334A (zh) * 2018-04-27 2021-02-02 西雅图儿童医院（Dba西雅图儿童研究所） 用以编辑血红蛋白相关突变的同源定向修复模板设计和递送
JP2021525743A (ja) * 2018-05-30 2021-09-27 トランスレイト バイオ， インコーポレイテッド リン酸エステルカチオン性脂質

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