CN113174363A - 用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物及其制备方法，本发明是为了解决现有使用其他细胞诱导成功为胰岛细胞的诱导成功率较低的问题。制备方法：一、培养诱导性多能干细胞融合至45％～55％时，完全培养基培养，得到iPSC上清液；二、向iPSC上清液中加入PEG8000贮存液，混匀后离心，沉降得到iPSC外泌体；三、间充质干细胞用完全培养基重悬细胞，加入iPSC外泌体，混匀培养得到MSC上清液；四、对MSC上清液和iPSC上清液分别进行超滤、离心处理；五、将MSC外泌体和iPSC外泌体混合。本发明通过验证多次iPSC分化胰岛素分泌细胞实验后发现，细胞分化效率及胰岛素释放量，细胞标志物表达均有提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物及其制备方法。
背景技术
糖尿病因其高患病率以及诸多并发症严重威胁人类的健康和给医保系统造成重大压力。目前全世界患病人口约4.63亿，由于人口老龄化和生活方式的改变，在未来几十年受此疾病影响的人数将进一步增加,预计到2040年将超过6亿。糖尿病包含1型和2型两种，其中1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，造成大部分胰岛β细胞丧失。患者需终身依赖外源性胰岛素替代治疗。而2型糖尿病占总发病率的80％以上，常见于中老年人，肥胖者发病率高。主要原因是机体细胞对于胰岛素的敏感性下降。该类型的大多数患者最终也需胰岛素治疗。胰岛β细胞属内分泌细胞，约占胰岛细胞总数的70％，能分泌胰岛素，起促进细胞糖利用，调节血糖的作用。外源性注射胰岛素并不能完全模拟生理性胰岛素分泌模式，长期超大剂量(50u/d)胰岛素使用会导致内皮细胞增生、粥样硬化形成等不良反应，使用不当或病情严重时容易发生急性严重代谢紊乱。为了向临床提供大量功能良好的移植物，定向诱导诱导性多能干细胞(iPSC)分化成胰岛β样细胞成为近年来的研究热点，是成为治疗糖尿病的一个较好方法。但目前，许多研究表明当前使用其他细胞诱导成功为胰岛细胞的百分比只能达到40％左右，因此当前提高胰岛细胞的诱导成功率至关重要。
外泌体直径为40～100nm，内含核酸、脂质、蛋白质等多种活性物质。外泌体既可以作为载体传递mRNA、miRNA以及蛋白质等多种活性物质，通过受体-配体的结合来改变靶细胞信号传导通道，又可以和靶细胞膜融合使靶细胞具有新的生物学特性，影响包括细胞因子的产生、细胞增殖、凋亡和新陈代谢等多种生命活动。己证实外泌体携带的miRNA在调节胰岛p细胞功能方面起着至关重要的作用。iPSC来源的外泌体与骨髓间充质干细胞(BMSC)共同培养，与单一BMSC相比，其成骨能力和增殖能力显著增强。
发明内容
本发明是为了解决现有使用其他细胞诱导成功为胰岛细胞的诱导成功率较低的问题，而提供一种用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物及其制备方法。
本发明用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物的制备方法按照以下步骤实现：
一、培养第20-30代诱导性多能干细胞(iPSC)融合至45％～55％时，更换完全培养基继续培养，收集培养上清液，得到iPSC上清液；
二、将PEG8000溶于无菌PBS中配制成溶液，消毒后得到PEG8000贮存液，向iPSC上清液中加入PEG8000贮存液，充分混匀后静置、离心，吸除上清液，沉降得到iPSC外泌体；
三、复苏第3-4代脐带间充质干细胞(MSC)，用完全培养基重悬细胞，然后加入iPSC外泌体，混匀后转移至培养瓶中，培养得到MSC上清液；
四、对步骤三得到的MSC上清液和iPSC上清液分别进行超滤、离心处理，分别得到MSC外泌体和iPSC外泌体；
五、将MSC外泌体和iPSC外泌体混合，得到用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物。
本发明用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物是由体积比为(1～2)：(1～2)的iPSC外泌体和MSC外泌体的混合物。
本发明通过脐带间充质干细胞和诱导性多能干细胞的外泌体制成的混合物的添加，通过验证多次iPSC分化胰岛素分泌细胞实验后发现，细胞分化效率及胰岛素释放量，细胞标志物表达均有提高，且该混合物制备方法简单，成本低，为促进iPSC成功分化成为胰岛素分泌细胞起到有效作用。
附图说明
图1为实施例中分化终止后对照组及实验组的细胞标志物PDX1的表达检测图；
图2为实施例中分化终止后对照组及实验组的细胞标志物NGN3的表达检测图；
图3为实施例中分化终止后对照组及实验组的细胞标志物NKX6.1的表达检测图；
图4为实施例中分化终止后对照组及实验组的细胞标志物胰岛素的表达检测图；
图5为实施例中分化第21天细胞受葡萄糖刺激前后胰岛素释放量检测图，其中A代表对照组，B代表实验组。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物的制备方法按照以下步骤实施：
一、培养第20-30代诱导性多能干细胞(iPSC)融合至45％～55％时，更换完全培养基继续培养，收集培养上清液，得到iPSC上清液；
二、将PEG8000溶于无菌PBS中配制成溶液，消毒后得到PEG8000贮存液，向iPSC上清液中加入PEG8000贮存液，充分混匀后静置、离心，吸除上清液，沉降得到iPSC外泌体；
三、复苏第3-4代脐带间充质干细胞(MSC)，用完全培养基重悬细胞，然后加入iPSC外泌体，混匀后转移至培养瓶中，培养得到MSC上清液；
四、对步骤三得到的MSC上清液和iPSC上清液分别进行超滤、离心处理，分别得到MSC外泌体和iPSC外泌体；
五、将MSC外泌体和iPSC外泌体混合，得到用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是步骤一所述的完全培养基为92vol％ncEpic Basal Medium+8vol％ncEpic Supplement。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是步骤一中更换完全培养基继续培养48小时。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是步骤二中PEG8000贮存液的质量浓度为50％。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是步骤二中所述的静置是在4℃下静置90min。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是步骤二中所述的离心是以1500×g离心30min。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是步骤三中iPSC外泌体的加入量按照每ml完全培养基加入20μg的iPSC外泌体。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是步骤三中是在37℃培养箱中培养72小时。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同的是步骤四中采用40μm细胞筛过滤。
具体实施方式十：本实施方式用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物是由体积比为(1～2)：(1～2)的iPSC外泌体和MSC外泌体的混合物。
实施例：本实施例用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物的制备方法按照以下步骤实施：
一、培养第20-30代诱导性多能干细胞(iPSC)融合至50％时，更换完全培养基(92％ncEpic Basal Medium+8％ncEpic Supplement)继续培养48小时，收集培养上清液，得到iPSC上清液；
二、将PEG8000溶于无菌PBS缓冲液中配制成质量浓度为50％溶液，高温高压消毒后得到PEG8000贮存液，向50ml iPSC上清液中加入12ml的PEG8000贮存液，充分混匀后于4℃静置90min，4℃下1500×g离心30min以沉降外泌体，吸除上清液，再次离心处理，吸除残余的液体得到iPSC外泌体；
三、复苏第3-4代脐带间充质干细胞(MSC)，用20ml完全培养基(95％MSCMB+5％clite+2IU/ml肝素钠)重悬细胞，然后加入iPSC外泌体20μg/ml，混匀后转移至T75培养瓶中，置于37℃培养箱中，培养72小时后得到MSC上清液；
四、对步骤三得到的MSC上清液和步骤一的iPSC上清液分别进行超滤、离心处理，超滤、离心处理过程如下：以4℃，4000×g，离心20min后，沉淀细胞残渣；用40μm细胞筛过滤，去除凝聚物；使用100kD MWCO无菌离心超滤管，4℃，4000×g，离心至原有细胞上清液体积的1/10，分别得到MSC外泌体和iPSC外泌体；
五、将MSC外泌体和iPSC外泌体混合，-80℃下无菌保存，得到用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物。
测试实验：
1、复苏培养第20-30代iPSC，当细胞融合达80％-90％时，用EDTA 37℃消化8min，吸弃消化液，加入胰岛素分泌细胞分化培养基Ⅰ(98％RPMI1640培养基+2％胎牛血清+100μg/L激活素A)使细胞脱离基质，获得细胞悬液后转移至低吸附6孔板中。实验组按分化培养基Ⅰ的10％添加制备好的外泌体混合物，悬浮培养3天，每天更换培养基。以未添加外泌体混合物培养的细胞为对照组。
2、3天后，更换胰岛素分泌细胞分化培养基Ⅱ(99％α-MEM+1％B27+2μmol/L视黄酸+10μmol/LSB431542+1μmol/L Dorsomorphin)，按分化培养基Ⅱ的5％添加外泌体混合物，培养7天，每2天更换一次培养基。
3、第11天，更换胰岛素分泌细胞分化培养基Ⅲ(99％α-MEM+1％B27+10μmol/L腺苷酸环化酶激活剂Forskolin+10μmol/L地塞米松+5μmol/L ALK5小分子抑制剂)，培养至第21天分化结束，每2天更换一次培养基。
4、分别对第3，10，21天细胞数量进行计算。结果如表1。
表1不同比例外泌体混合物添加对比研究结果
由上表可知，使用未添加外泌体混合物的分化培养基，分化终止后的细胞活率明显低于添加外泌体混合物后诱导分化的细胞活率，且MSC、iPSC外泌体按1:1比例混合后添加到分化培养基中诱导iPSC分化，分化终止后细胞活率最高达到56.7％。
5、分化完成后，收集细胞，分别提取RNA，逆转录获得cDNA，采用real-time PCR检测PDX1，NGN3，NKX6.1，胰岛素的表达。结果如图1-4。实验组PDX1的表达量是对照组的3.27倍，实验组NGN3的表达量是对照组的3.86倍，实验组NKX6.1的表达量是对照组的2.97倍，实验组胰岛素的表达量是对照组的5.78倍。
由图1-4可知，添加外泌体混合物后，诱导分化后的细胞标志物PDX1、NGN3、NKX6.1、胰岛素，均明显高于未添加混合物而诱导分化的细胞。
6、取对照组及实验组(MSC、iPSC外泌体体积比1：1混合)分化培养第21天的细胞，收集培养液，加入KRBB缓冲液预培养1h，用含低浓度和高浓度葡萄糖(2.5mmol/L和22.5mmol/L)KRBB缓冲液继续培1h，收集缓冲液，ELISA检测胰岛素释放浓度。分化第21天细胞受葡萄糖刺激前后胰岛素释放量的测试结果如图5。
由图5可知，实验组及对照组在葡萄糖刺激后，胰岛素表达均增加，且当葡萄糖浓度较低时胰岛素的释放量较低，葡萄糖浓度较高时胰岛素的释放量增多。对照组未刺激时，胰岛素释放量是3.177μg/L，低糖刺激后胰岛素释放量是6.307μg/L，高糖刺激后胰岛素释放量是7.558μg/L；实验组未刺激时，胰岛素释放量是4.36μg/L，低糖刺激后胰岛素释放量是7.161μg/L，高糖刺激后胰岛素释放量是8.461μg/L。
Claims (10)
1.用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物的制备方法，其特征在于该制备方法按照以下步骤实现：
一、培养第20-30代诱导性多能干细胞融合至45％～55％时，更换完全培养基继续培养，收集培养上清液，得到iPSC上清液；
二、将PEG8000溶于无菌PBS中配制成溶液，消毒后得到PEG8000贮存液，向iPSC上清液中加入PEG8000贮存液，充分混匀后静置、离心，吸除上清液，沉降得到iPSC外泌体；
三、复苏第3-4代脐带间充质干细胞，用完全培养基重悬细胞，然后加入iPSC外泌体，混匀后转移至培养瓶中，培养得到MSC上清液；
四、对步骤三得到的MSC上清液和iPSC上清液分别进行超滤、离心处理，分别得到MSC外泌体和iPSC外泌体；
五、将MSC外泌体和iPSC外泌体混合，得到用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物。
2.根据权利要求1所述的用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物的制备方法，其特征在于步骤一所述的完全培养基为92vol％ncEpic Basal Medium+8vol％ncEpicSupplement。
3.根据权利要求1所述的用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物的制备方法，其特征在于步骤一中更换完全培养基继续培养48小时。
4.根据权利要求1所述的用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物的制备方法，其特征在于步骤二中PEG8000贮存液的质量浓度为50％。
5.根据权利要求1所述的用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物的制备方法，其特征在于步骤二中所述的静置是在4℃下静置90min。
6.根据权利要求1所述的用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物的制备方法，其特征在于步骤二中所述的离心是以1500×g离心30min。
7.根据权利要求1所述的用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物的制备方法，其特征在于步骤三中iPSC外泌体的加入量按照每ml完全培养基加入20μg的iPSC外泌体。
8.根据权利要求1所述的用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物的制备方法，其特征在于步骤三中是在37℃培养箱中培养72小时。
9.根据权利要求1所述的用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物的制备方法，其特征在于步骤四中采用40μm细胞筛过滤。
10.用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物，其特征在于该用于促进iPSC分化为胰岛素分泌细胞的混合物是由体积比为(1～2)：(1～2)的iPSC外泌体和MSC外泌体的混合物。
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