CN113166811A - 用于诊断特发性自闭症谱系障碍患者亚型asd表型1的代谢谱分析 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种诊断自闭症谱系障碍(ASD)亚型，即所谓的ASD表型1的方法，通过在各种碳源和代谢因子存在的情况下评估患者特异性细胞系的能量产生能力或通过施用Nrf2抑制剂后能量产生能力的变化或缺乏。

Description

用于诊断特发性自闭症谱系障碍患者亚型ASD表型1的代谢谱 分析

技术领域

本发明涉及一种诊断自闭症谱系障碍(ASD)亚型，即所谓的ASD表型1的方法，通过在各种碳源的能量和代谢因子存在的情况下评估患者特异性细胞系的能量产生能力或通过施用Nrf2抑制剂后评估能量产生能力的变化或缺乏。

背景技术

ASD是最普遍且致残的神经发育障碍之一。目前估计ASD的患病率是世界人口的1％，并且，在美国，59个学龄儿童中有1个(37个男孩中1个和151个女孩中1个)(Baio etal.Prevalence of Autism Spectrum Disorder Among Children Aged 8Years-Autismand Developmental Disabilities Monitoring Network,11Sites,United States,2014.MMWR.Surveillance Summaries 67,no.6:1-23)。

自闭症谱系障碍(ASD)当前被认为是一个单一的诊断实体，其特征是1)社会互动和沟通方面的缺陷，包括社会情感互惠方面的缺陷，用于社会互动的非言语交往行为方面的缺陷以及发展、维持和理解关系方面的缺陷；2)受限制或重复性行为的子域，包括刻板或重复性运动，坚持相同或顽固坚持常规，高度受限，固定兴趣，对感官输入反应过度或反应迟钝，或对感官方面异常兴趣中的至少4个子域。(Baird G,et al.Neurodevelopmentaldisorders.American Psychiatric Association.Diagnostic and Statistical Manualof Mental Disorders-Fifth Edition(DSM-5).Washington,D.C.:American PsychiatricPublishing,2013:p.31-86)。

早在9至12个月就可以观察到核心症状的早期表现(Rogers SL et al.Autismtreatment in the first year of life:a pilot study of infant start,a parent-implemented intervention for symptomatic infants."J Autism Dev Disord.2014；44(12):2981-95)并可以在第14个月内建立稳定的诊断(Pierce K et al.Evaluation ofthe Diagnostic Stability of the Early Autism Spectrum Disorder Phenotype inthe General Population Starting at 12Months.JAMA Pediatr.2019；173(6):578-587)。但是，直到社会需求超出有限的能力，核心症状才可能完全显现出来，或者可能在以后的生活中被学到的策略所掩盖(Baird G.Classification of Diseases and theNeurodevelopmental Disorders:The Challenge for DSM-5and ICD-11."DevelopmentalMedicine&Child Neurology.2013；55(3):200-201)。为了诊断ASD，其临床表现必须引起临床上显着的缺陷，从而影响患者与他人(尤其是同龄患者)互动的能力。

环境或发育因素以及合并症(例如癫痫病)也可能导致症状恶化。ASD症状及其严重程度在核心症状和共同出现的症状之间差异很大。因此，患有ASD的每个人都有其自己的症状和功能水平的独特组合。对于处于频谱高端的人来说，这可能会带来相对温和的挑战。对于其他人，症状可能更严重，例如重复行为和口语或日常生活表达能力的缺乏。此外，虽然个体的症状和共同出现的病情是可以控制的，但它们的融合可能使个人及其家庭的生活衰弱，影响生活的改变(Hirvikoski T et al.High Self-Perceived Stress and PoorCoping in Intellectually Able Adults with Autism Spectrum Disorder."Autism.2016；19(6):752-57)。例如，无法沟通或无法充分交流可能会引起烦躁/躁动，并且联合作用可能会损害社交，并产生进一步的下游影响(例如，自杀意念或自残)。

科学界越来越多地认识到，当前基于行为的ASD诊断方法不能根据分子和遗传改变对患者进行有效分类，而是作为一个行为的总称来指代一大类不同病因的神经发育障碍。

虽然ASD可以通过核心区域的症状来定义，但在遗传、表型、临床表现和相关合并症中存在明显的异质性(Persico AM et al.Searching for ways out of the autismmaze:genetic,epigenetic and environmental clues；Trends Neurosci.20061；29(7):349-358)。然而，为进一步使问题复杂化，遗传和表观遗传因素与产前和终生动态环境因素交织在一起，以得出个体患者的发病机理。尽管如此，因果遗传因素只能在接受筛查的患者中识别出15％至20％，因此绝大多数ASD患者仍被认为是特发性的。尚未发现导致特发性ASD的特定基因，但已有1000多个基因与自闭症相关(SFARI database,https://gene.sfari.org/)。

最近积累的证据支持这一理论，即越来越多的ASD易感基因实际上可以收敛到有限数量的分子途径。这种不断增长的假设提供了重要的翻译机会，因为介导突触和电路形成的分子途径也参与了其他生理过程，包括调节适应性免疫反应和先天性免疫反应(EstesML et al.Immune mediators in the brain and peripheral tissues in autismspectrum disorder.Nature Reviews Neuroscience.2015；16(8):469-486)，细胞增殖，存活和蛋白质合成(Subramanian M et al.Characterizing autism spectrum disordersby key biochemical pathways.Front.Neurosci.2015；Tang G et al.Loss of mTOR-dependent macroautophagy causes autistic-like synaptic pruningdeficits.Neuron.2014；83(5):1131-1143)。

考虑到自闭症风险的复杂性，正在探索可能与遗传易感性相互作用的其他因素，以解释在症状的范围和严重性方面观察到的高度变异性。这种变异性证明，除了遗传背景的复杂性之外，还涉及环境因素。越来越多的证据还表明，免疫失调、小胶质细胞活化和神经炎症可能与自闭症表型的发病机理和严重程度有关(Ricci et al.Altered Cytokineand BDNF Levels in Autism Spectrum Disorder.Neurotoxicity Research.2013；24(4):491-501；Jyonouchi et al.Cytokine profiles by peripheral blood monocytesare associated with changes in behavioral symptoms following immune insultsin a subset of ASD subjects:an inflammatory subtype？.JNeuroinflammation.2014；11(187)；Mead et al.Evidence Supporting an Altered Immune Response inASD.Immunology Letters.2015；163(1):49-55；Patel et al.Social Impairments inAutism Spectrum Disorder Are Related to Maternal Immune HistoryProfile.Molecular Psychiatry.2018；23(8):1794-97)。对研究进行的荟萃分析(meta-analysis)比较了患有ASD的非药物参与者和健康对照组的血浆和血清中细胞因子的浓度。与健康对照相比，ASD参与者的细胞因子浓度发生了显着变化，从而增强了ASD中细胞因子谱异常的证据(Masi et al.Cytokine Aberrations in Autism Spectrum Disorder:ASystematic Review and Meta-Analysis.Molecular Psychiatry.2015；20(4):440-46)。此外，免疫介质水平的改变与行为障碍的增加有关(Ashwood et al.Elevated PlasmaCytokines in Autism Spectrum Disorders Provide Evidence of Immune Dysfunctionand Are Associated with Impaired Behavioral Outcome.Brain,Behavior.2011；25(1):40-45；Ashwood et al.Associations of Impaired Behaviors with ElevatedPlasma Chemokines in Autism Spectrum Disorders.Journal ofNeuroimmunology.2011；232(1-2):196-99；Grigorenko et al."Macrophage MigrationInhibitory Factor and Autism Spectrum Disorders."PEDIATRICS.2008；122(2):e438-45；Ning et al.Increased Serum Levels of Macrophage Migration InhibitoryFactor in Autism Spectrum Disorders.NeuroToxicology.2019；71:1-5)。现在也已经认识到，胎儿发育过程中的孕产妇免疫应答是自闭症的诱因之一(Ploeger et al.TheAssociation Between Autism and Errors in Early Embryogenesis:What Is theCausal Mechanism？"Biological Psychiatry.2010；67(7):602-7；Knuesel etal.Maternal Immune Activation and Abnormal Brain Development across CNSDisorders.Nature Reviews Neurology.2014；10(11):643-60)。在大多数患者中，ASD可能是遗传和环境因素之间的个体变量和复杂相互作用的结果(Etiological Heterogeneityin Autism Spectrum Disorders:More than 100Genetic and Genomic Disorders andStill Counting.Brain Research.2011；1380:42-77；Rossignol et al.EnvironmentalToxicants and Autism Spectrum Disorders:A Systematic Review.TranslationalPsychiatry.2014；4(2):e360-e360)。

目前尚无批准的治疗ASD核心症状的方法。抗精神病药已证明对某些相关的行为问题有效，尤其是与ASD相关的易怒性(Jobski,K.et al.Use of psychotropic drugs inpatients with autism spectrum disorders:a systematic review.Acta PsychiatrScand,2017.135(1):p.8-28)。例如，非典型的抗精神病药和兴奋剂分别对烦躁/破坏性行为和注意力缺乏/多动障碍(ADHD)症状相对有效(Fung,L.K.et al.PharmacologicTreatment of Severe Irritability and Problem Behaviors in Autism:A SystematicReview and Meta-analysis.Pediatrics,2016.137Suppl 2:p.S124-35)。在抗精神病药中，利培酮和阿立哌唑已被美国食品药品监督管理局批准用于治疗ASD青年的易怒性。尽管有证据表明抗精神病药物在ASD中具有相关功效，但治疗反应却变化很大，并且通常与副作用相关，例如镇静，锥体外系症状的风险和代谢异常。急需在ASD中开发新的药物治疗方法(Berry-Kravis,E.M.et al.Drug development for neurodevelopmental disorders:lessons learned from fragile X syndrome.Nat Rev Drug Discov,2018.17(4):p.280-299；Lacivita,E.et al.Targets for Drug Therapy for Autism Spectrum Disorder:Challenges and Future Directions.J Med Chem,2017.60(22):p.9114-9141)。但是，鉴于ASD的病因学异质性，确定“通用型”(one-size-fits-all)的治疗方法可能会继续失败。因此，更好的方法是从“通用型”转向理解分子和遗传异质性。因此，一个关键的挑战是确定那些可以从临床试验中的特定治疗中受益的个体(或个体的亚型)。

由于ASDs的潜在原因仍然难以捉摸，因此先前曾尝试通过利用特定的遗传特征将ASD患者分为更小，更同质的亚组(Bernier et al.Disruptive CHD8 mutations define asubtype of autism early in development；Cell 2014Jul 17；158(2):263-276.)或行为和临床内表型(Eapen V.and Clarke R.A.；Autism Spectrum Disorders:From genotypesto phenotypes；Front Hum Neurosci.2014；8:914)。但是，这些策略在涵盖ASD的遗传和表型异质性方面面临困难，并且可能无助于确定疾病背后的特定神经生物学途径。

在分子基础上的分析可能提供一种对ASD患者进行分类的方法。然而，由于ASD的内在复杂性，异质性以及遗传和环境因果因素的复杂交织，尚待确定可用于建立此类检测方法的ASD特定生物标记。此外，由于其特异性，此类生物标记物不能涵盖大批ASD患者。然而，此类测定法可能在短期内支持基因型、表型或治疗反应预先确定的亚组的表征。

我们之前曾报道过一种方法，用于识别特发性自闭症谱系障碍的一个亚型，即所谓的ASD表型1。可以根据临床体征和症状的同时出现来识别该患者亚型。除了这些临床症状和体征外，还可以通过如PCT/EP2018/080372中所述的向ASD患者施用Nrf2激活剂萝卜硫烷(sulforaphane)来鉴定ASD表型1，如果在施用Nrf2激活剂后患者显示阴性行为反应，则鉴定为ASD表型1。预测萝卜硫烷会导致表型1患者的行为症状恶化。由于这种测试的体内性质，允许诊断ASD表型1的体外实验室测试将具有极大的优势。

细胞核Nrf2的基础水平通常较低，因为该肽在翻译后靶向其细胞质中，以通过其抑制剂Keap1进行泛素介导降解，从而阻止其过渡到细胞核中。然而，响应氧化应激或Keap1的小分子抑制剂，Nrf2积累并转移到细胞核中，并与称为抗氧化反应元件(AREs)的基因组调控序列结合，并激活一系列抗氧化剂和排毒基因，例如GST(谷胱甘肽S-转移酶)，NQO1(NAD(P)H：醌氧化还原酶1)，HO-1(血红素加氧酶1)，GCS(谷氨酰半胱氨酸合酶)和编码自由基清除剂的基因，例如超氧化物歧化酶1(SOD1)和过氧化氢酶(Oreger,H.et al.Nrf2-dependent upregulation of antioxidative enzymes:a novel pathway forproteasome inhibitor-mediated cardioprotection.Cardiovasc Res,2009.83(2):p.354-61；Higgins,L.G.et al.Transcription factor Nrf2 mediates an adaptiveresponse to sulforaphane that protects fibroblasts in vitro against thecytotoxic effects of electrophiles,peroxides and redox-cycling agents.ToxicolAppl Pharmacol,2009.237(3):p.267-80；Shin,S.M.et al.Role of the Nrf2-AREpathway in liver diseases.Oxid Med Cell Longev,2013.2013:p.763257)。因此，Nrf2抗氧化剂活性的主要影响是对ROS和线粒体有氧代谢的影响。有氧代谢是真核细胞中最有效的能量途径，它基于作用于线粒体内膜上的呼吸链，将能量聚集到ATP分子的合成中。该途径产生能量，但也可能导致多余化合物(例如ROS)的潜在过量产生。为了防止ROS的积累，Nrf2促进了对氧化反应的抑制，从而导致在碳基能源存在的情况下，线粒体有氧代谢产生的能量减少。由于Nrf2信号途径的组成性激活，在表型1细胞中增加了细胞的抗氧化活性。

人体标本(即血浆，血清，尿液)的代谢组学分析最近已被用于进一步表征包括ASD在内的几种复杂疾病的致病机制((Rangel-Huerta O.D.et al.Metabolic profiling inchildren with autism spectrum disorder with and without mental regression:preliminary results from a cross-sectional case-controlstudy.Metabolomics.2019.15(7):99；Li K.et al.A robust,single-injection methodfor targeted,broad-spectrum plasma metabolomics.Metabolomics.2017.13(10):122)在这方面，几个小组基于特定代谢物的测定提出了改善自闭症诊断和/或提供早期诊断的方法，例如4-乙基苯基硫酸盐，吲哚丙酮酸(indolepyruvate)，乙醇酸或咪唑丙酸(imidazole proprionate)(Hsaio et al.,US20140065132A1),Gc球蛋白蛋白表达的改变(Horning et al.WO20133130953A2),分子量从约10道尔顿到约1500道尔顿的多种代谢物(Gebrin Cezar et al.EP2564194A1)，12-HETE和15-HETE以及包括鞘氨醇和胆碱中的一种(Srivastava eti al.US20170067884A1)，碳水化合物代谢酶蛋白的表达的改变(Lipkinet al.US20120207726A1)。最近，Donley等人报告的支持性证据表明氨基酸谷氨酰胺、甘氨酸和鸟氨酸与支链氨基酸的比例失调(Smith et al.Amino Acid DyregulationMetabotypes:Potential Biomarkers for Diagnosis and Individualized Treatmentfor Subtypes of Autism Spetrum Disorder.Biological Psychiatry,2019,85(4):345-354)。尽管这些方法可以为改善自闭症谱系障碍的诊断提供有效的替代方法，但它们不允许将患者分为可为其提供个性化治疗的亚组。此外，血浆和尿液的测量受多种因素影响，包括饮食，药物，昼夜节律和样品处理。在ASD的病因学异质性的背景下，所有这些参数都导致在检测ASD中一致的生物标志物方面可能存在困难。

先前的研究已经使用了淋巴母细胞样细胞系(LCLs)，并显示出新陈代谢受损。Rose和Frye(Rose S.et al.Clinical and Molecular Characteristics ofMitochondrial Dysfunction in Autism Spectrum Disorder.Mol Diagn Ther.2018.22(5):571-593)先前报道了ASD患者的线粒体功能未改变或不典型。非典型线粒体功能的特征在于更高的ATP关联呼吸作用和对糖酵解的更大依赖。然而，线粒体功能障碍的病因学及其在ASD中的定义尚不清楚。

Boccuto等观察到，与对照LCLs相比，ASD中色氨酸代谢异常。尽管这些结果提供了一种用于诊断自闭症患者早期的方法(US9164106B2，Boccuto et al.Mol Autism 4:16,2013)，但它没有提供机会来识别自闭症患者的亚型，也没有提供针对生物学定义的亚组量身定制的具体治疗方法。

因此，需要一种有效且简单的实验室方法来诊断具有特定ASD亚型的患者，这些患者可从针对其ASD亚组潜在分子功能障碍的靶向药物干预中受益。

要解决的客观问题

因此，要解决的问题是提供在特发性ASD人群中有效识别ASD患者特定亚组的方法，即所谓的ASD表型1。要解决的另一个问题是提供验证ASD表型1的特定细胞途径特征的改变并直接在ASD患者细胞上测试潜在的治疗候选物的方法，从而允许对该亚组的患者进行个性化的药物治疗。

发明内容

通过提供一种用于诊断ASD表型1的方法来解决上述问题，该方法包括以下步骤：

a)提供患者特异性细胞系；

b)评估在碳源和/或代谢因子存在的情况下获得的步骤a)中提供的患者特异性细胞系的能量产生能力，以及

c)如果患者特异性细胞系的能量产生能力与从典型发育对照(TDs)获得的相似细胞系中评估的能量产生能力明显不同(specifically different)，则诊断为ASD表型1。

在另一方面，本发明涉及一种用于诊断患者中ASD表型1的方法，包括以下步骤：

a)提供患者特异性细胞系；

b)评估在碳源和/或代谢因子存在的情况下，不存在Nrf2激活剂的情况下，获得的步骤a)中提供的患者特异性细胞系的能量产生能力，从而获得第一能量产生A，

c)评估在与步骤b)中相同的碳源和/或代谢因子存在的情况下且在Nrf2激活剂存在的情况下获得的步骤a)中提供的患者特异性细胞系的能量产生能力，从而获得第二能量产生能力B，以及

d)如果A实质上等于B，则诊断ASD表型1。

在另一方面，本发明涉及一种评估化合物治疗ASD表型1的功效的方法，其中该方法包括以下步骤：

a)将该化合物给予源自ASD表型1患者样品的细胞系；

b)在一种或多种能源和/或一种或多种代谢因子存在的情况下评估细胞系的能量产生能力；以及

c)评估所述细胞系的能量产生能力是否与从典型发育对照(TDs)获得的相似细胞系中所评估的能量产生能力明显不同。

在另一方面，本发明涉及源自ASD表型1患者的样品的细胞系在评估化合物治疗ASD表型1的功效中的用途，其中所述用途包括以下步骤：

a)将化合物给予细胞系；

b)在一种或多种能源和/或一种或多种代谢因子存在的情况下评估所述细胞系的能量产生能力；以及

c)评估所述细胞系的能量产生能力是否与从典型发育对照(TDs)获得的相似细胞系中所评估的能量产生能力明显不同。

附图说明

图1：通过比色法评估的能量产生能力的主成分分析(PCA)，在萝卜硫烷处理之前和之后的各种碳源存在的情况下，源自18个表型1(Ph1)，20个非表型1(非-Ph1)和20个对照淋巴母细胞系(LCLs)。A，相关图显示了每种化合物在尺寸1和尺寸2(dim.1and dim.2)中的可变性贡献。请注意，点越大和越黑，化合物对方差的贡献就越大。B，在没有萝卜硫烷的情况下PCA分析的双图表示。C，在萝卜硫烷存在下PCA分析的双图表示。

图2：显示在用萝卜硫烷处理之前和之后，在选定的碳源(即D-葡萄糖和麦芽糖)存在的情况下，来自18个表型1和20个对照细胞系的吸光度平均值的图形表示。

图3：显示了来自18个表型1(Ph1)、20个非表型1(非-Ph1)和20个对照细胞系(LCLs)的平均吸光度值的图形表示。存在于培养基中的碳源是D-葡萄糖。通过吸收值评估的能量产生能力是在基线上以及在缺乏(未处理)和存在(已处理)萝卜硫烷的情况下，在浓度不断增加的二丁酰cAMP(cAMP的渗透性类似物)存在下进行测量的。

图4：显示与图4相似的结果。对于每种细胞系，在不存在和存在Nrf2的情况下，响应于二丁酰cAMP浓度增加而产生的能量被标准化为基线时测得的值。

图5：显示了通过吸光度测量评估的能量产生能力的图形表示，是在缺乏选定的能源，D-葡聚糖酶和d-甘露糖的情况下，18个表型1、用异丁司特(ibudilast)处理的20个对照和18个表型1细胞系的平均值。在基线时，ASD Ph1的LCL的能量产生低于对照。用异丁司特预处理后，与未处理的ASD Ph1相比，ASD Ph1的能量产生能力增加，并达到与对照组相似的水平。

具体实施方式

根据本发明，可以通过以下方法在患者中诊断ASD表型1：

a)提供患者特定细胞系；

b)评估在碳源和/或代谢因子存在的情况下获得的步骤a)中提供的患者特异性细胞系的能量产生能力，以及

c)如果患者特异性细胞系的能量产生能力与从典型发育对照(TDs)获得的相似细胞系中评估的能量产生能力明显不同，则诊断为ASD表型1。

在一实施方案中，患者先前已被诊断出患有特发性ASD。

在本发明的另一方面，提供了一种用于在患者中诊断ASD表型1的方法，该方法包括以下步骤：

a)提供患者特定细胞系；

b)评估在碳源和/或代谢因子存在的情况下以及在Nrf2激活剂存在的情况下获得的步骤a)中提供的患者特异性细胞系的能量产生能力，从而获得第一能量产生能力A，

c)评估在与步骤b)中相同的碳源和/或代谢因子存在的情况下以及在缺乏Nrf2激活剂的情况下获得的步骤a)中提供的患者特异性细胞系的能量产生能力，从而获得第二能量产生能力B，以及

d)如果A实质上等于B，则诊断ASD表型1。

如本文所用，术语自闭症谱系障碍(ASD)被理解为涵盖神经发育障碍的家族，其特征在于社交沟通和互动中的缺陷以及行为，兴趣或活动的受限的，重复的模式。诊断为“特发性ASD”(idiopathic ASD)是基于缺乏明确的分子或遗传改变而导致所报告的体征和症状。因此，特发性ASD的诊断是排除诊断，必须排除自闭症的主要分子和遗传学已知原因。在下文中，术语“特发性自闭症谱系障碍”，“特发性孤独症”以及“特发性ASD”和“ASD”可互换使用。

在此，术语“ASD表型1”和“表型1”可互换使用。同样，术语“ASD非表型1”，“非表型1”和“其他ASD表型”可互换使用。术语“ASD患者”是指患有特发性ASD的患者，不仅涵盖诊断为特发性ASD的人群，还涵盖涉嫌患有ASD的人群，即具有ASD行为特征并显示ASD临床体征但尚未收到对其诊断的正式验证。

ASD表型1是最近描述的ASD患者亚群，由一组特定的遗传和分子变化定义，导致临床上可识别的ASD亚型，对Nrf2抑制剂的治疗显示出高响应率。更准确地说，ASD表型1患者表现出Nrf2的组成性激活，因此最终导致Nrf2调控的细胞内途径失调，包括PI3K，AKt，mTOR，ERK/JMH-P38和NF-κB。这些途径涉及对压力，细胞凋亡或细胞分化，细胞增殖，细胞周期进程，细胞分裂和分化，炎症和线粒体/代谢活性的适应。

值得注意的是，ASD表型1患者的概况与Singh等人报道的不同(Singh et al；Sulforaphane treatment of autism spectrum disorder(ASD).PNAS 2014；111:43,15550-5；Singh et al；Sulforaphane treatment of young men with autism spectrumdisorder.CNS&Neurological Disorders Drug Targets,2016；15；5:597-601)。在Singh等人治疗的患者中，用萝卜硫烷治疗可显着改善ASD的核心症状(通过ADOS 2进行测量)。Singh等人未能将此功效与任何潜在的分子和遗传改变联系起来。

与Singh等人治疗的患者相反，ASD表型1的萝卜硫烷患者进行简短的口服治疗(所谓的挑战试验)会引起不良行为反应，该反应可通过各种标准(例如ADI-r SI，ADI-r C或ADI-r RI)评估(在EP申请EP 17200185.1中进行了描述)，因为这些患者的基线Nrf2活性较高。

本领域技术人员很清楚如何可以诊断出患有ASD，特别是特发性ASD的患者。例如，技术人员可以遵循在“美国精神病学协会；精神疾病诊断和统计手册(DSM-5)第五版”中建立的标准为受试者提供对ASD的诊断。同样，可以根据标准化评估工具诊断ASD患者，包括但不限于DSM IV，ICD-9，ICD-10，DISCO，ADI-R，ADOS，CHAT。在其他情况下，患者可能具有对自闭症或未另行指明的广泛性发育障碍(PDD-NOS)进行了公认的DSM-IV诊断。

在本文中，术语“典型发育个体(TD)”是指既没有被诊断出患有ASD也没有显示出ASD的任何临床体征和症状的对象。因此，与ASD患者相比，TD可以作为对照。在此，术语TD和对照可互换使用。

在本文中，术语“ASD表型1细胞”或“ASD Ph-1细胞”是指源自ASD表型1患者的样品的细胞或细胞系，而术语“ASD非表型1细胞”或“ASD非-Ph1细胞”是指源自ASD非表型1患者的样品的细胞或细胞系。

本领域技术人员知道如何从样品中分离细胞以及如何无限期获得有限的细胞系。分离的细胞类型可以包括血细胞来源的细胞，例如来源于皮肤样品的淋巴细胞或成纤维细胞。

在本文中，术语“细胞系”是指有限的和永生化的细胞系。术语“相似细胞系”是指已经从不同样品，特别是从仍包含相同细胞类型并且已经以相似方式处理的对照样品(典型发育个体)获得的细胞系。术语“患者特异性细胞系”在本文中是指从某个患者的样品产生的细胞系。

在本发明的上下文中，术语“样品”是指任何人类生物样品。样品可以是皮肤样品，外周血样品或已经处理过的全血样品，例如通过纯化或分离单个化合物。

本领域技术人员非常了解如何评估细胞系的能量产生能力。细胞或细胞系的能量产生能力在本文中应理解为细胞或细胞系从碳水化合物产生ATP形式的能量的固有潜力。碳水化合物代谢产生ATP的过程是通过糖酵解作用发生在细胞质中，而通过氧化磷酸化作用发生在线粒体中。糖酵解产生独立于线粒体的ATP，但也以NADH的形式提供电子，该电子直接馈入呼吸链以推动线粒体ATP的合成。糖酵解和氧化磷酸化是产生能量的主要机制，因此是能量产生能力评估的重点。与细胞内糖酵解和氧化磷酸化调节相关的机制的激活状态决定了给定细胞能够将有机化合物代谢为ATP的效率如何。因此，通过测量能量产生能力，有可能获得关于细胞系中这些途径的激活状态的信息。

在ASD表型1中，Nrf2和Nrf2相关途径的较高活性预计会影响线粒体功能和能量代谢。Nrf2的失调和Nrf2调控途径通过增加糖酵解至乳酸和激活戊糖途径来调节代谢活性(Heiss et al.Glucose availability is a decisive factor for Nrf2-mediated geneexpression.Redox Biology.2013；1(1):359-365)。

衡量能量产生能力和/或能耗的方法包括直接和间接测量

·在基线和诱导细胞应激后，细胞溶质(cytosol)和线粒体中的ATP水平；

·免疫细胞中激活的分子标记，例如细胞膜上表达的不同CD簇，

·细胞溶质和/或特定细胞器中的pH值，

·丙酮酸/乳酸比，

·兴奋性细胞(即神经元或成神经细胞)中特定离子的膜电位和/或细胞内和细胞外水平，

·基线和细胞激活状态的组织学标记(即细胞形状，线粒体的数量和位置，特定细胞结构或膜受体的存在等)。

特别地，在细胞与这种能源一起温育期之后，存在或缺乏代谢效应子，可以通过减少或增加可测量水平的细胞标志物如NADH来确定代谢碳源的能力。

检测NADH的积累可以例如基于比色测定，荧光测定或放射性测定。在该测定中，通过修饰特定探针来检测NADH的增加。这样的探针可以是例如四唑(tetrazolium)，更特别地是四唑衍生的染料。通过细胞代谢能源后，培养基中的四唑染料被氧化，产生紫色，其强度与NAD+还原产生的NADH量成正比。然后，每个孔中颜色强度的测量可以用作能量产生能力的指标。强度的测量可以通过几种方法获得，包括通过特定波长读取吸光度以及通过终点和/或动力学评估获得光密度。

在一个优选的实施方案中，使用可商购的表型哺乳动物微阵列(PhenotypeMammalian MicroArrays)(PM-Ms，Biolog，Hayward，CA，USA)测量细胞系的能量产生能力。表型哺乳动物微阵列依赖于基于四唑基的测定，其中通过NADH含量评估的能量产生是通过培养基中存在的四唑染料的还原来测量的，该染料形成强烈的颜色。然后通过吸光度测量产生的颜色的强度。

本发明首次提供了用于诊断ASD表型1的离体测试。以前，仅报道了体内挑战测试(PCT/EP2018/080372)。根据本发明的方法提供的优点在于，患者不会被可能引起其症状恶化的物质触发。

根据本发明的方法的另一个优点是不需要特定生物标志物的确切知识，因此不需要建立新的测定法。相反，使用本领域技术人员可以常规检测的化合物的测量来实现对ASD表型1的诊断。

此外，因为本发明的方法测量复杂代谢途径下游端的事件，所以它允许对ASD患者进行分层，所述分层可能在各个生物标志物的表达上有所不同，但是与ASD非表型1相比，即其他特发性ASD患者和对照组，共有由Nrf2和/或Nrf2相关途径上调所定义的共同表型。因此，本发明的方法能够诊断ASD表型1的患者而无需依赖中间的生物标志物，所述中间的生物标志物在不同个体之间可能有很大的不同。

在一个实施方案中，用于评估能量产生能力的碳源选自糖，包括D-葡萄糖，D-葡萄糖6-磷酸盐，D-葡萄糖-1-磷酸盐，D-甘露糖，D-果糖，D-果糖-6-磷酸酯盐，D-半乳糖以及糊精。在一个优选的实施方案中，碳源选自由D-葡萄糖，D-甘露糖，D-果糖和糊精组成的组。最优选地，碳源为糊精，D-甘露糖或D-葡萄糖。

根据本发明，当源自ASD表型1患者的细胞与这些碳源一起存在时，与ASD非表型1或对照细胞系相比，它们代谢这些碳源以产生能量的能力较低。可以如上所述测量该较低的能量产生能力。例如，较低的能量产生能力可以由较低的吸光度值反映，这是由于用作NADH产生量的替代标记的染料的还原反应较低。

因此，在一个实施方案中，在选自由D-葡萄糖，D-葡萄糖6-磷酸盐，D-葡萄糖-1-磷酸盐，D-甘露糖，D-果糖，D-果糖6-磷酸盐，D-半乳糖和糊精组成的组中的碳源的存在下，与对照或ASD非Ph1细胞相比，ASD表型1可能被诊断为较低的能量产生能力。

在本发明的另一方面，碳源选自二糖和三糖，包括麦芽糖，松二糖(turanose)，D-海藻糖，蔗糖，麦芽三糖，核苷酸和肌苷。在一个优选的实施方案中，碳源选自麦芽三糖，麦芽糖和肌苷。与对照细胞或ASD非Ph1细胞相比，所有这些都允许ASD Ph1细胞产生更高的能量，因为在ASD Ph1患者中，Nrf2激活引起代谢转换，导致戊糖磷酸途径的激活增加，从而可以更好地利用这些替代能源。

因此，在一个实施方案中，与对照或ASD-非Ph1细胞相比，在选自麦芽糖，松二糖，海藻糖，蔗糖和麦芽三糖的组的碳源的存在下，可以通过增加的能量产生能力来诊断ASD表型1。

根据本发明，如果患者特异性细胞系的能量产生能力与来自典型发育对照(TDs)或不符合表型1标准(非表型1)的ASD患者获得的相似细胞系中评估的能量产生能力明显不同，则诊断为ASD表型1。

在一个实施方案中，“明显不同”是指细胞系的能量产生显示以下一项或多项标准：

-在至少一种碳源的存在下具有较低的能量产生能力，该碳源优选地选自由D-葡萄糖，L，D-葡萄糖-6-磷酸盐，D-葡萄糖-1-磷酸盐，D-甘露糖，D-果糖，D-果糖-6-磷酸盐，D-半乳糖和糊精组成的组；和/或

-在选自由麦芽糖，松二糖，海藻糖，蔗糖，麦芽三糖和肌苷组成的组的碳源的存在下，更高的能量产生能力；和/或

-在KCl，环状单磷酸腺苷(cAMP)类似物，磷酸二酯酶抑制剂和/或Nrf2抑制剂存在下，具有更高的能量产生能力。

本文中的“较高”或“较低”的能量产生能力是指与典型发育对照或ASD非表型1患者相比，明显更高或更低的能量产生能力。

根据本发明，如果满足上述标准中的1个，优选地上述标准中的2个，最优选地满足所有以上标准，则可以诊断出ASD表型1。

在又一个实施方案中，可以通过在cAMP水平增加的情况下能量产生能力的增加来诊断ASD表型1。cAMP通过其下游效应子PKA通过CREB的磷酸化控制NF-κB和Nrf2。此外，cAMP还能够调节AMPK(5'腺苷单磷酸激活的蛋白激酶)。所有这些事件都通过增加糖酵解和线粒体活性来恢复糖酵解和戊糖磷酸途径之间的平衡，从而逆转了在ASD表型1患者中观察到的Nrf2的病理激活。因此，在环状单磷酸腺苷(cAMP)类似物例如二丁酰cAMP抑制剂磷酸二酯酶的抑制剂，例如咖啡因，或Nrf2抑制剂的存在下，与这些化合物给药前的能量产生能力相比，可以通过更高的能量产生能力来诊断ASD表型1。

在一个优选的实施方案中，当向细胞提供选自由D-葡萄糖，D-甘露糖，D-果糖和糊精组成的组的碳源时，观察到在cAMP水平增加的情况下能量产生能力的增加。最优选地，碳源为糊精，D-甘露糖或D-葡萄糖。

在ASD表型1的患者中，Nrf2被组成性激活。Nrf2和受Nrf2调控的细胞内途径(包括PI3K，AKt，mTOR，ERK/JMH-P38，NF-κB)与压力，细胞凋亡或细胞分化，细胞增殖，细胞周期进程，细胞分裂和分化，炎症和线粒体/代谢活性，适应有关。Nrf2，Akt/mTOR和NF-κB途径的激活与有利于戊糖磷酸途径的代谢转换有关。直接通过使用Nrf2抑制剂降低Nrf2水平活性，或通过增加cAMP/PKA途径间接降低Nrf2水平活性，从而重建激活Nrf2调控途径的生理状态，包括能量产生能力。此外，增加的cAMP还能够通过激活AMPK将能量产生转向糖酵解。

因此，根据本发明，如果在不增加cAMP水平的情况下，源自该患者的细胞显示出明显不同的能量产生能力，但是与在cAMP水平升高情况下的对照相似的能量产生能力，则可以诊断具有ASD表型1的患者。

例如，可以在包括cAMP类似物(例如，二丁酰cAMP)在内的代谢因子的存在下测量能量产生能力。环状单磷酸腺苷(cAMP)类似物包括但不限于二丁酰cAMP，8-[(4-溴-2,3-二氧丁基)硫代]-腺苷3'，5'-环状单磷酸(8-[(4-bromo-2,3-dioxobutyl)thio]-adenosine3',5'-cyclic monophosphate)，(Sp)-腺苷-3'，5'-环-S-(4-溴-2,3-二氧代丁基)单硫代磷酸酯((Sp)-adenosine-3',5'-cyclic-S-(4-bromo-2,3-dioxobutyl)monophosphorothioate)，苯甲酰腺苷-3'，5'-环单磷酸酯(benzoyladenosine-3',5'-cyclic monophosphate)。在一个优选的实施方案中，cAMP类似物是二丁酰cAMP。

在本发明的一方面，增加二丁酰cAMP的浓度增加了ASD表型1细胞系的能量产生能力，而对ASD非表型1和对照细胞系没有影响。

在有代谢因子存在和不存在的情况下，测量能量产生能力的变化可以单独使用，也可以与上述方法结合使用，以诊断具有ASD表型1的特发性ASD患者。也可以作为如本文所述在特定碳源存在下的能量产生能力的测量结果的确认。

在一个实施方案中，在代谢效应子的几个浓度点测量患者特异性细胞系的能量产生能力。

在一个实施方案中，也可以通过施用能够抑制磷酸二酯酶的物质来实现cAMP水平的增加，所述物质选自异丁司特(ibudilast)，咖啡因，可可碱，茶碱，恩丙茶碱(enprofylline)，己酮可可碱(pentoxifylline)，二羟丙茶碱(dyphylline)，罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)，双嘧达莫，西洛他唑，依他唑酯，罗氟司特，十字花青素(crisaboroleresembrenone)，屈他维林(drotaverin)，阿普米拉，西洛司特，替托司特(tetomilast)，咯利普兰，(S)-咯利普兰，(R)-咯利普兰，氨力农，米力农，依诺西酮，达沙普兰(daxalipram)(R-甲磺普仑)，利莫尼司(lirimilast)，AWD-12-281，西潘茶碱(cipamfylline)，欧莱米特(oglemilast)，妥非司特(tofimilast)，CI-1044，HT-0712，MK-0873，阿洛茶碱，CI-1018，T-2585，YM-976，V-11294A，吡拉米司特(piclamilast)，阿替唑仑(atizoram)，非明司特(filaminast)，SCH351591，IC-485，D-4418，CDP-840，L-826,141，BPN14770和TDP101的组。能够抑制磷酸二酯酶的物质可防止cAMP在细胞内水解为AMP，从而增加细胞内cAMP的水平。

在另一个实施方案中，可以通过在Nrf2抑制剂存在的情况下增加能量产生能力来诊断ASD表型1，因为抑制过度活跃的Nrf2恢复了ASD表型1患者的生理状态。

在一个优选的实施方案中，当向细胞提供选自由D-葡萄糖，D-甘露糖，D-果糖和糊精组成的组的碳源时，观察到在Nrf2抑制剂存在的情况下能量产生能力的增加。最优选地，碳源为糊精，D-甘露糖或D-葡萄糖。

Nrf2抑制剂在本文中定义为下调转录因子Nrf2，也称为核因子(类胡萝卜素2)-样2(NFE2L2)表达的任何物质，其在人类中由NFE2L2基因编码。同时，术语Nrf2抑制剂还包括促进Nrf2降解或其他抑制Nrf2活性的物质。

Nrf2抑制剂可以选自以下组成的组：Kelch样ECH相关蛋白1(Nrf2，INRF2，Kelch样蛋白19，KIAA0132，KLHL19的胞质抑制剂)，Kelch样ECH相关蛋白1斑马鱼，Maft蛋白斑马鱼，Keap 1蛋白大鼠，葫芦巴碱(trigonelline)(N-甲基烟酸酯)，他米巴罗汀，全反式维甲酸(ATRA)，木犀草素(Lut)，芹菜素(APi)，白杨素(Chrysin)(Chry)，沃古明(Wogomin)(Wog)，4-甲氧基查耳酮，3’,4’,5’,5,7-五甲基甲氧黄酮(PMF)，表没食子儿茶素3-没食子酸酯(EGCG)，异烟肼(INH)；乙硫酰胺(ETH)，抗坏血酸(AA)，ARE表达调节剂(AEM1)，鸦胆子苦醇(Bru)，隐丹参酮(cryptoanshinone)(CryP)，IM3829(4-(2-环己基乙氧基)苯胺)，二甲双胍(Met)，霉菌毒素赭曲霉毒素A(mycotoxin ochratoxin A)(Ota)，雷公藤甲素(TPL)CBR-031-1，CBR-026-7，CBR-168-5，秋兰姆二硫化物，双硫仑，地塞米松，丙酸氯倍他索，贝沙罗汀，马拉巴酮-A(malabaricone-A)，霉菌毒素赭曲霉毒素(mycotoxin ochratoxin)，葫芦巴碱(trigonelline)，抗坏血酸，对乙酰氨基酚，ML385，卤夫酮(Halofuginone)，4MC，AEM1，ML385白杨素(ML385Chrysin)，芹黄素(Apigenin)，冬凌草素(Oridonin)，铃兰毒苷(Convallatoxin)，和厚朴酚(Honokiol)，黄连素(Berberine)，欧苷菊(Parthenolide)，次黄芩素(Wogonin)，异丁司特(Ibudilast)，Orita 13，ISO-1，Alam-4b，SCD-19，艾代拉利司(Idelalisib)，塞来昔布(Celecoxib)和DIF1-DIF 3。

在又一个实施方案中，如果在Nrf2激活剂例如萝卜硫烷存在的情况下，在各种能源或能量存在的情况下下或在cAMP水平增加的情况下的能量产生能力没有被改变，则可以诊断ASD表型1。

Nrf2激活剂在本文中定义为任何上调转录因子Nrf2，也称为核因子(类胡萝卜素2)-样2(NFE2L2)的表达的物质，其在人类中由NFE2L2基因编码。同时，术语“Nrf2激活剂”还包括抑制Nrf2降解或以其他方式增强Nrf2活性的物质。

本领域技术人员熟知可用作Nrf2激活剂的各种物质类别。这些物质包括但不限于增加活性氧(ROS)水平的物质；直接结合Keap1或Nrf2的分子，从而破坏Nrf2和Keap1之间的相互作用，从而诱导Nrf2的核积累和激活；谷胱甘肽过氧化物酶1模拟物；有机硒抗氧化剂；通过调节ARE和Nrf2的结合来增加抗氧化基因表达的分子；增强Nrf2核易位并激活Nrf2依赖的抗氧化反应以克服应激的分子(例如肉桂醛)；通过激活Nrf2和诱导下游II期酶(例如类黄酮)降低ROS水平的分子；通过线粒体氧化应激诱导(例如叔丁基对苯二酚)稳定Nrf2并诱导Nrf2活化的分子。

在一个实施方案中，Nrf2激活剂选自以下组成的组：异硫氰酸盐(例如，萝卜硫烷)；多酚分子(例如姜黄素)；多酚植物抗毒素，特别是对称二苯代乙烯(stilbene)的衍生物(例如白藜芦醇)；α-甲基肉桂醛；类黄酮(例如，白杨素，阿斯皮跟aspigen，木犀草素)；吡嗪(例如奥替普拉oltipraz)；丁基化羟基茴香醚，特别是叔丁基对苯二酚；富马酸二甲酯；富马酸单甲酯；谷胱甘肽；苯并硒唑(例如依布硒啉ebselen)。

在一个优选的实施方案中，Nrf2-激活剂可以是萝卜硫烷。萝卜硫烷(1-异硫氰酸根基-4R-(甲基亚磺酰基)丁烷)是衍生自西兰花的异硫氰酸酯。它的治疗潜力是基于其在转录上调基因中的有效活性，该上调基因控制机制，从而好氧细胞可以保护自身免受氧化应激，炎症，破坏DNA的亲电试剂和放射线的侵害。萝卜硫烷可以从诸如西兰花芽的植物中提取，但是也可以通过化学合成来生产。萝卜硫烷是一种饮食植物化学物质，源于其前身硫代葡萄糖苷(glucosinolate glucoraphanin)，在十字花科植物丰富的饮食中广泛食用。因此，萝卜硫烷有资格被视为食品，膳食补充剂或药物。萝卜硫烷被认为是低毒的，并且其对人类的给药具有良好的耐受性(Singh K et al.,PNAS October,2014；111(43)；15550-15555)。

在另一个实施方案中，Nrf2-激活剂可以选自萝卜硫烷，异硫氰酸，巴多索隆甲酯和富马酸酯(bardoxolone methyl and fumaric acid esters)，5-(2,2-diferuloylethen-1-yl)沙利度胺(5-(2,2-diferuloylethen-1-yl)thalidomide)，阿魏酸，白藜芦醇，(+)-α-葡萄素((+)-α-viniferin)，帕利多尔(pallidol)，二氢杨梅素B(ampelopsin B)，四边形素A(quadrangularin A)，白杨素(chrysin)，白杨素5,7-二甲基醚(chrysin 5,7-dimethyl ether)，6,8-二-(3,3-二甲基烯丙基)(6,8-di-(3,3-dimethylallyl))，白杨素(chrysin)，6-(3,3-二甲基烯丙基)白杨素(6-(3,3-dimethylallyl)chrysin)，6-香叶基白杨素(6-Geranylchrysin)，8-香叶基白杨素(8-Geranylchrysin)，8-(3,3-二甲基烯丙基)白杨素(8-(3,3-dimethylallyl)chrysin)，阿斯皮跟(aspigen)，木犀草素，6-C-α-L-阿拉伯吡喃糖基-8-C-β-D-葡萄糖基木犀草素(6-C-alpha-Larabinopyranosyl-8-C-beta-D-glucosylluteolin)，6-羟基木犀草素7-O-海带苷(6-hydroxyluteolin 7-O-laminaribioside)，6-羟基木犀草素(6-hydroxyluteolin)，木犀素-2(lucenin-2)，木犀草素7-O-β-葡糖苷(luteolin7-O-betaDglucoside)，木犀草素7-O-新橙皮苷(luteolin 7-O-neohesperidoside)，木犀草素-7-O-α-L-鼠李糖苷(luteolin-7-O-alpha-L-rhamnoside)，异荭草素(isoorientin)，刺苞菊甙(carlinoside)，7-O-[β-D-阿拉伯吡喃糖基-(1->6)-β-D-葡萄糖基]木犀草素(7-O-[beta-D-arabinopyranosyl-(1->6)-beta-D-glucosyl]luteolin)，木犀草素木糖苷(luteolin Oglucuronoside)，荭草苷(orientin)，4'，5,7-三羟基-3'-甲氧基黄酮(4',5,7-trihydroxy-3'-methoxyflavone)，5,3'-二-O-甲基木犀草素(5,3'-di-O-methylluteolin)，6-C-[2'-O-α-L-鼠李吡喃糖基-(1”->2')]-α-L-阿拉伯吡喃并木犀草素(6-C-[2'-O-alpha-L-rhamnopyranosyl-(1"->2')]-alpha-L-arabinopyranosylluteolin)，次黄素(hypolaetin)，木犀草素6-C-[β-D-葡萄糖基-(1->2)-α-L-阿拉伯糖苷](luteolin 6-C-[beta-D-glucosyl-(1->2)-alpha-L-arabinoside])，西决明子B(cassiaoccidentalin B)，6-甲氧基木犀草素7-α-L-鼠李糖苷(6-methoxyluteolin 7-alpha-L-rhamnoside)，木犀草素7-O-(6-O-丙二酰基-β-D-葡萄糖苷)(luteolin 7-O-(6-O-malonyl-beta-D-glucoside)，香叶木素(diosmetin)，木犀草素4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(luteolin-4'-O-beta-D-glucopyranoside)，6-C-[2-O-α-L-鼠李糖吡喃糖基-(1”->2')]-β-D-吡喃并吡喃木酮(6-C-[2-O-alpha-L-rhamnopyranosyl-(1">2')]-beta-D-xylopyranosylluteolin)，玉米的可凝性球蛋白(maysin)，奥替普拉(oltipraz)，富马酸二甲酯，富马酸，富马酸单甲酯(monomethyl fumarate)，谷胱甘肽，S-硫烷基谷胱甘肽，S-(2,4-二硝基苯基)谷胱甘肽，S-(2-羟乙基)谷胱甘肽，植物螯合素(phytochelatin)，14，15-白三烯C4(eoxin C4)，S-酰基谷胱甘肽，谷胱甘肽衍生物，依布硒啉，α-甲基肉桂醛和2-叔丁基对苯二酚。

由于Nrf2在ASD表型1的患者中被组成性激活，因此通过施用Nrf2激活剂进一步上调Nrf2途径而不会改变源自这些患者的细胞的能量产生能力。与此相反，Nrf2途径的上调激活了ASD非表型1患者和对照中先前失活的途径，导致在源自这些受试者的细胞中施用Nrf2激活剂后引起能量产生能力改变。

因此，在本发明的一方面，可以通过在碳源和/或代谢因子存在的情况下以及在Nrf2激活剂存在的情况下下评估患者特异性细胞系的能量产生能力来诊断ASD表型1，从而获得第一能量产生A；评估在相同碳源和/或代谢因子存在的情况下且在没有Nrf2激活剂的情况下获得的患者特异性细胞系的能量产生能力，从而获得第二能量产生能力B；比较两个值A和B，如果A基本上等于B，则诊断ASD表型1。

在又一个实施方案中，本发明涉及评估化合物治疗ASD表型1的功效的方法，其中该方法包括以下步骤：

a)将该化合物给予源自ASD表型1患者样品的细胞系；

b)在一种或多种能源和/或一种或多种代谢因子存在的情况下评估所述细胞系的能量产生能力；以及

c)评估所述细胞系的能量产生能力是否与施用化合物之前在相同细胞系中评估的能量产生能力明显不同。

在另一个实施方案中，本发明涉及源自ASD表型1患者的样品的细胞系在评估化合物治疗ASD表型1的功效中的用途，其中所述用途包括以下步骤：

a)将化合物施用于细胞或细胞系；

b)在一种或多种能源和/或一种或多种代谢因子存在的情况下，评估步骤a)中提供的细胞系的能量产生能力；以及

c)评估在施用化合物之前细胞系的能量产生能力是否与同一细胞系中的能量产生能力明显不同。

根据本发明，与施用化合物之前所述细胞系的能量产生能力相比，如果在所述化合物给药后所述细胞系的能量产生能力显示如下，则该化合物在治疗ASD表型1上有效：

-在选自由D-果糖，D-葡萄糖，D-甘露糖，D-半乳糖，D-葡萄糖-6-磷酸盐，D-葡萄糖-1-磷酸盐，D-甘露糖，D-果糖-6-磷酸盐，糊精组成的组的至少一种碳源存在的情况下具有更高的能量产生能力，最优选D-葡萄糖，D-甘露糖，糊精。

同样根据本发明，如果不满足上述标准或变化很小，则该化合物对ASD表型1的治疗无效。

如果在施用此类化合物后直至mM范围内的各种浓度下，细胞系的能量产生能力与对照和ASD非Ph1细胞系相比仍存在明显差异，则该化合物也被认为是无效的，它显示以下一个或多个标准：

-在至少一种碳源存在的情况下较低的能量产生能力，所述碳源优选地选自由D-果糖，D-葡萄糖，D-甘露糖，D-半乳糖，D-葡萄糖-6-磷酸盐，D-葡萄糖-1-磷酸盐，D-甘露糖，D-果糖-6-磷酸盐，糊精组成的组，最优选D-葡萄糖，D-甘露糖，D-果糖，和/或

-在环状单磷酸腺苷(cAMP)类似物，磷酸二酯酶抑制剂和/或Nrf2抑制剂存在的情况下具有更高的能量产生能力。

在一个实施方案中，根据上述方法或如实施例中所述，提供样品的患者可能已经被诊断出患有ASD表型1。

在另一个实施方案中，可以通过使用如PCT/EP2018/080372中所述的Nrf2-激活剂来实现对ASD表型1患者的鉴定。简而言之，如果在服用Nrf2激活剂后表现出不良行为反应，则可以识别ASD表型1的患者。

本领域技术人员知道，也可以通过评估临床体征和症状来鉴定ASD表型1患者。特别是，如果患者表现出以下则诊断为ASD表型1

·以下两个强制性标准中的至少一项：

ο头颅大小相对于对照人群的增加，其特征在于在生命的前24个月和/或正式大头畸形中，在平均头围(HC)以上至少有一个标准偏差(HC>97％的总人口)

和/或

ο感染事件，乳牙脱落，创伤后损伤，内源性和外源性温度变化可能会加剧核心自闭症症状的周期性加重

以及

·以下20个特征中的至少2个，最优选至少3个：

ο与对照人群相比，头发和指甲生长加快

ο与相同种族的个体相比，更倾向于呈现颜色较浅的皮肤和眼睛

ο睫毛比相同种族的对照对象长得多

ο至少5个色素沉着皮肤的非连续区域，特别是出现在患者背部

ο在传染事件，乳牙脱落，创伤后伤害或改变体温的内源性和外源性因素期间出现水肿迹象；更具体地说，面部水肿位于眶周和额头区域

ο与同龄和同种族的典型发育个体相比，γ-谷氨酰转肽酶(GGT)的血液水平升高

ο先天性泌尿生殖道畸形和/或开始排尿的功能受损

ο髌骨发育不全

ο经常腹泻发作，特别是在5岁之前

ο耳鸣的频繁发作

ο胼胝体(corpus callosum)变薄或缺失

ο血液恶性肿瘤的阳性家族史，尤其是但不限于骨髓瘤和急性早幼粒细胞白血病

ο类风湿关节炎的阳性家族史，即连续两个世代中至少有两个受影响的一级亲属

ο对乙酰水杨酸或其衍生物的不良反应

ο虹膜淋巴瘤，单侧或双侧

ο睡眠多汗症，尤其是婴儿，幼儿和少年(尤其是在婴儿和儿童时期夜间出汗增多-亲属经常报告说需要更换床单)

ο增加的Th1/Th2比率(即，白介素1β，白介素6，TNF-α，干扰素γ的水平升高)

ο先天性附件或脾脏重复

ο先天性乳糜池(cisterna chyli)缺乏

ο牙齿生长延迟

ο报告了母亲在怀孕期间遭受病毒或细菌感染和/或经生物学证实的孕期母亲免疫激活的病史

本发明还设想在测试特发性ASD患者的ASD表型1时，将本发明的方法与上述鉴定ASD表型1的患者的方法相结合。特别地，本发明的方法可以与PCT/EP2018/080372中所述的挑战试验或上述临床体征和症状的评估相结合。

实施例

实施例1

材料与方法

在对源自ASD表型1患者的淋巴母细胞细胞系进行代谢表征之前，将患者分类为ASD表型1或ASD非表型1或对照。

患有特发性ASD的个体如果表现出以下特征，则将其归类为ASD表型1：

·至少1个强制性标准：

ο头颅大小相对于对照人群的增加，其特征在于在前24个月和/或正式大头畸形中，在平均头围以上至少有一个标准偏差(HC>97％的总人口)

和/或

ο感染事件，乳牙脱落，创伤后损伤，内源性和外源性温度变化会加剧自闭症核心症状

以及

·以下20个特征中的至少2个，最优选至少3个：

ο与对照人群相比，头发和指甲生长加快

ο与相同种族的个体相比，更倾向于呈现颜色较浅的皮肤和眼睛

ο睫毛比相同种族的对照对象长得多

ο至少5个色素沉着皮肤的非连续区域，特别是出现在患者背部

ο在传染事件，乳牙脱落，创伤后伤害或改变体温的内源性和外源性因素期间出现水肿迹象；更具体地说，面部水肿位于眶周和额头区域

ο与同龄和同种族的典型发育个体相比，γ-谷氨酰转肽酶(GGT)的血液水平升高

ο先天性泌尿生殖道畸形和/或开始排尿的功能受损

ο髌骨发育不全

ο经常腹泻发作，特别是在5岁之前

ο耳鸣的频繁发作

ο胼胝体(corpus callosum)变薄或缺失

ο血液恶性肿瘤的阳性家族史，尤其是但不限于骨髓瘤和急性早幼粒细胞白血病

ο类风湿关节炎的阳性家族史，即连续两个世代中至少有两个受影响的一级亲属

ο对乙酰水杨酸或其衍生物的不良反应

ο虹膜淋巴瘤，单侧或双侧

ο睡眠多汗症，尤其是婴儿，幼儿和少年(尤其是在婴儿和儿童时期夜间出汗增多-亲属经常报告说需要更换床单)

ο增加的Th1/Th2比率(即，白介素1β，白介素6，TNF-α，干扰素γ的水平升高)

ο先天性附件或脾脏重复

ο先天性乳糜池(cisterna chyli)缺乏

ο牙齿生长延迟

ο报告了母亲在怀孕期间遭受病毒或细菌感染和/或经生物学证实的孕期母亲免疫激活的病史

如果患者不符合上述标准，则被视为ASD非表型1。对照患者是被鉴定为未检测到神经行为异常的体征或症状的个体，并因此被认为是典型发育个体(TDs)。

本专利中报道的数据是从外周血淋巴细胞产生的淋巴母细胞系(LCLs)产生的。装有抗凝柠檬酸右旋糖(ACD)的试管用于通过静脉穿刺收集血样，以确保血细胞保持代谢活性。将试管保持在室温下，并在24小时内进行处理。

通过使用爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)使血样中的淋巴细胞永生化来获得细胞系。在Sigma RPMI-1640中收获淋巴母细胞系，其中含75mL的胎牛血清来自亚特兰大生物公司(Lawrenceville，GA，USA)和5mL的L-谷氨酰胺和5mL的抗生素/抗真菌药来自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。

使用可商购的表型哺乳动物微阵列(PM-Ms，Biolog，Hayward，CA，USA)测量细胞的能量产生。

设计每个孔中的化合物以供细胞使用，作为唯一的能源或影响细胞悬浮液中添加的能源(D-葡萄糖)利用的代谢效应子。使用比色氧化还原染料化学方法监测每孔NADH的产量(Bochner et al.Assay of the multiple energy-producing pathways of mammaliancells.PLoS One 2011,6(3):e18147)。铺板前，利用BioRad细胞计数器和台盼蓝染料评估细胞活力和数量。铺板所需的活细胞浓度为4x10⁵细胞/mL，相当于每孔20,000个细胞，体积为50μL。仅将活度为55％或以上的细胞系用于实验，并且为了最大程度地减少由于对转化细胞进行长时间细胞培养而导致的伪影和偏差，如果LCLs已达到15代，则不使用。使用改良的Biolog IF-M1培养基，将细胞在5％CO₂中于37℃孵育48小时。

通过将以下物质添加到100mL Biolog IF-M1中，将Biolog IF-M1培养基用于PM-M1板：1.1mL 100×青霉素/链霉素溶液，0.16mL 200mM谷氨酰胺(终浓度0.3mM)，以及5.3mL胎牛血清(FBS，终浓度5％)。对于PM-M6板，添加5.5mMα-D-葡萄糖代替FBS。

在48小时的孵育过程中，细胞仅有的能源是添加到孔中的化合物。第一次孵育后，添加Biolog Redox染料混合物MB(10μL/孔)，并将板在相同条件下再孵育24小时。随着细胞代谢能量，培养基中的四唑染料减少，根据产生的NADH量产生紫色。

在实验的最后24小时，将板在Omnilog系统中孵育，该系统每15分钟收集一次光密度读数，每个孔产生96个数据点。该系统还绘制了每个孔中代谢反应的动力学曲线，并推算出参数，例如斜率，最高点，终点，曲线下面积(AUC)和滞后。该系统通过比较病例和对照组的动力学曲线(无论是作为单个样本还是作为一组)来进行参数分析。

在24小时孵育结束时，使用酶标仪对板进行分析，读数在590和750nm处。第一个值(A₅₉₀)表示氧化还原染料的最高吸收峰，第二个值(A₇₅₀)表示背景噪声的量度。每孔计算相对吸光度(A_590-750)。

结果

人口统计学：为了选择20个表型1和20个非表型1个样本，考虑了313名ASD患者的队列，这些患者在Greenwood遗传中心(GGC，SC，美国)数据库中具有完整的临床数据。

在GGC数据库中的这313名ASD患者中，有90名(28.8％)在出生后的头24个月中由受过训练的医师至少进行了两项有据可查的头围测量。在这90名患者中，有47名(52.2％)至少符合一项主要标准(即头围(HC))。

通过电话联系了HC>75的47位患者的家属，询问是否存在第二项ASD表型1强制性标准。GGC无法与47位患者中的5位(10.6％)的家属建立联系。其余42例有可能收集更多临床信息的患者中，有21例(50％)符合ASD表型标准。总体而言，排除5例无法随访的病例，在85例患者中有21例(24.7％)符合ASD表型1的标准，并显示了3到8个次要特征。

在90名患者中剩下的43名患者，在头24个月内头围已确定在第75个百分位以下，随机抽取20份样本，以构成非表型1队列。

选择用于体外实验的表型1队列(Ph1)由16位男性和4位女性(比例4：1)组成，年龄范围为2-17岁(平均7.7)。为了进行比较，非表型1(非-Ph1)队列由19位男性和1位女性(比率19：1)组成，年龄范围为2-20岁(平均5.25)，而TD队列由男性15例，女性5例(比例3：1)，样本采集时年龄为3至8岁(平均5.1)。

代谢物发现：图1提供了ASD表型1细胞中不同的能量产生曲线的清晰证据。在各种情况下，对从ASD Ph1，ASD非Ph1和对照患者收集的血细胞生成的淋巴母细胞样细胞系的代谢活性进行了评估，即存在各种能源的情况下。我们使用主成分分析(PCA)来确定不同的细胞群是否显示相似或不同的代谢特征。如图1所示，根据它们的表型，即ASD表型1，ASD非表型1和对照，将细胞分为三个簇(clusters)。该结果表明ASD表型1的代谢谱不同于对照和ASD-非表型1。

另外，我们然后使用PCA的结果来缩小精确条件或能源的范围，这些条件或能源在不同细胞群体之间产生最大的差异。在单糖或糊精存在的情况下，与ASD非表型1细胞和对照细胞相比，ASD表型1细胞的能量产生能力较低。相反，在多糖作为能源存在的情况下，ASD表型细胞的能量产生能力比其他细胞更高。图2提供了根据能源的不同，更高或更低的能量产生能力的典型示例。

如此高的NADH产生量是ASD表型1细胞中代谢补偿的结果：由于激活的Nrf2信号途径诱导的抗氧化活性升高，这些细胞无法从优先能源的典型有氧代谢中产生足够量的能量，例如果糖，葡萄糖，半乳糖和甘露糖等单糖。因此，它们具有激活的代谢途径，从而可以利用替代能源，例如复杂的二糖和三糖。在具有ASD表型1的患者中激活了这种途径，这一事实使他们的细胞比由例如麦芽糖，松二糖，D-海藻糖，蔗糖和麦芽三糖等二糖和三糖生成NADH的细胞比对照更有效率。

然后在刺激Nrf2信号途径后评估相同细胞系的代谢概况，目的是在对照和非Ph1细胞中再生在ASD Ph1中组成性发生的中枢的激活。为了实现对Nrf2途径的刺激，将细胞暴露于萝卜硫烷。萝卜硫烷与Keap1相互作用，破坏其抑制功能并允许Nrf2的核积累。

结果证实，在暴露于萝卜硫烷的对照和ASD非表型1细胞中，代谢谱与基线时的Ph1细胞相当。这在图1中突出显示，显示了ASD非表型1+S和对照+S聚类ASD表型1。这些结果与在表型1细胞中检测到的区别谱中的疑似更高的Nrf2激活相符。实际上，在对照细胞和非Ph1细胞中诱导的Nrf2激活在基线时在Ph1细胞系中检测到的相同的NADH产量降低，证实了Nrf2通过AREs调节的抗氧化途径对有氧代谢的限制是代谢环境中Ph1和其他细胞系之间NADH差异的主要机制，这可能导致高能量产生。

如图1和图2所示，在ASD表型1细胞系中激活Nrf2的另一证据是缺少萝卜硫烷对这些细胞的能量产生能力的影响。

实施例2

图3和图4显示了在D-葡萄糖存在的情况下，使用cAMP的渗透类似物二丁环-环腺苷一磷酸(dibutyril-cAMP)如何增加表型1细胞的能量产生能力；而对对照和非表型1细胞没有影响。

ASD表型1与Nrf2途径的组成型激活有关。cAMP通过调节其效应子(包括PKA，AMPK)与CREB，NfkB相互作用，并最终调节Nrf2和Nrf2相关途径。将表型1细胞暴露于cAMP会导致Nrf2促进的抗氧化活性降低，因此使氧化代谢增加，从而导致NADH的产量更高。

当所有细胞系都用萝卜硫烷(一种有效的Nrf2激活剂)处理时，这一点得到了进一步证明(图3和4)。在以基线Nrf2活性较高为特征的ASD Ph1中，用萝卜硫烷进一步激活Nrf2不会改变对二丁酰cAMP的反应，这是由二丁酰cAMP诱导的能量产生能力增加(与没有萝卜硫烷的情况相同)。相反，在ASD非Ph1和对照淋巴母细胞系中，Nrf2的激活在基线时较低，用萝卜硫烷预处理会降低能量产生能力(在葡萄糖存在下进行评估)，而且在这种Nrf2激活下，通过添加二丁酰cAMP恢复了能量产生能力(图3和4)。

这些结果进一步表明，Nrf2和Nrf2调控的途径激活是ASD Ph1细胞系的特有作用，而cAMP的增加允许恢复Nrf2诱导的较低的能量产生能力。

实施例3

图5显示了在D-葡萄糖和D-甘露糖存在的情况下，来自对照和ASD表型1的LCLs的能量产生能力。在基线条件下，ASD Ph1的LCLs的能量产生能力显着低于对照的LCLs。用异丁司特，10μM，PDE3/4/10抑制剂，已知会增加细胞内cAMP，进一步预处理调节cAMP下游效应子并最终调节Nrf2和Nrf2调节的途径，从而与未处理的ASD Ph1相比，显着提高ASD Ph1LCLs的能量产生能力，其水平与对照中观察到的水平相似。这些结果表明，异丁司特能够补偿ASD Ph1中改变的代谢途径，因此是有效治疗ASD表型1患者的化合物的候选药物。

Claims (18)

1.一种用于诊断患者的ASD表型1的方法，包括以下步骤：

a)提供患者特定细胞系；

b)评估在碳源和/或代谢因子存在的情况下获得的步骤a)中提供的患者特异性细胞系的能量产生能力，以及

c)如果患者特异性细胞系的能量产生能力与从典型发育对照(TDs)获得的相似细胞系中评估的能量产生能力明显不同，则诊断为ASD表型1。

2.一种用于诊断患者的ASD表型1的方法，包括以下步骤：

a)提供患者特定细胞系；

b)评估在碳源和/或代谢因子存在的情况下以及在Nrf2激活剂存在的情况下获得的步骤a)中提供的患者特异性细胞系的能量产生能力，从而获得第一能量产生A，

c)评估在与步骤b)中相同的碳源和/或代谢因子存在的情况下以及在没有Nrf2激活剂存在的情况下获得的步骤a)中提供的患者特异性细胞系的能量产生能力，从而获得第二能量产生能力B，以及

d)如果A实质上等于B，则诊断ASD表型1。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，患者先前已经被诊断患有特发性ASD。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述的碳源选自由单糖，二糖，三糖或多糖组成的组。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述的碳源是选自由D-果糖，D-葡萄糖，D-甘露糖，D-半乳糖，D-葡萄糖-6-磷酸盐，D-葡萄糖-1-磷酸盐，D-甘露糖，D-果糖-6-磷酸盐，糊精组成的组中的一种或多种，最优选D-葡萄糖，D-甘露糖，糊精。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述的碳源为选自由麦芽糖，松二糖，D-海藻糖，蔗糖，麦芽三糖，肌苷组成的组中的一种或多种，最优选麦芽三糖，麦芽糖和肌苷。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述的代谢因子是选自由cAMP类似物，能够抑制磷酸二酯酶的物质和Nrf2抑制剂组成的组中的一种或多种。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述的患者特异性细胞系的能量产生能力明显不同，因为显示出以下标准中的一个或多个：

-在选自由D-果糖，D-葡萄糖，D-甘露糖，D-半乳糖，D-葡萄糖-6-磷酸盐，D-葡萄糖-1-磷酸盐，D-甘露糖，D-果糖-6-磷酸盐，糊精组成的组的至少一种碳源存在的情况下，较低的能量产生能力；和/或

-在选自由麦芽糖，松二糖，D-海藻糖，蔗糖，麦芽三糖和肌苷组成的组的至少一种碳源存在的情况下，更高的能量产生能力；和/或

-在环状单磷酸腺苷(cAMP)类似物，磷酸二酯酶抑制剂和/或Nrf2抑制剂存在的情况下，更高的能量产生能力。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，满足2个或3个标准。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述的患者特异性细胞系获自所述的患者的外周血样品或皮肤样品。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其特征在于，所述的患者特异性细胞系的能量产生能力明显不同，因为在增加的环状单磷酸腺苷(cAMP)水平存在的情况下显示出更高的能量产生能力。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，通过施用cAMP类似物来提高cAMP水平，cAMP类似物选自由二丁酯cAMP，8-[(4-溴-2,3-二氧代丁基)硫代]-腺苷3'，5'-环单磷酸，(Sp)-腺苷-3'，5'-环-S-(4-溴-2,3-二氧丁基)单硫代磷酸酯，苯并腺苷-3'，5'-环单磷酸或能够抑制磷酸二酯酶的物质组成的组，能够抑制磷酸二酯酶的物质选自由异丁司特，咖啡因，可可碱，茶碱，恩丙茶碱，己酮可可碱，二羟丙茶碱，罗伊氏乳杆菌，双嘧达莫，西洛他唑，依他唑酯，罗氟司特，十字花青素，屈他维林，阿普米拉，西洛司特，替托司特，咯利普兰，(S)-咯利普兰，(R)-咯利普兰，氨力农，米力农，依诺西酮，达沙普兰(R-甲磺普仑)，利莫尼司，AWD-12-281，西潘茶碱，欧莱米特，妥非司特，CI-1044，HT-0712，MK-0873，阿洛茶碱，CI-1018，T-2585，YM-976，V-11294A，吡拉米司特，阿替唑仑，非明司特，SCH351591，IC-485，D-4418，CDP-840，L-826,141，BPN14770和TDP101组成的组。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的患者特异性细胞系的能量产生能力明显不同，因为在Nrf2抑制剂存在的情况下显示更高的能量产生能力。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的Nrf2-抑制物选自由Kelch样ECH相关蛋白1(Nrf2，INRF2，Kelch样蛋白19，KIAA0132，KLHL19的胞质抑制剂)，Kelch样ECH相关蛋白1斑马鱼，Maft蛋白斑马鱼，Keap 1蛋白大鼠，葫芦巴碱(N-甲基烟酸酯)，他米巴罗汀，全反式维甲酸(ATRA)，木犀草素(Lut)，芹菜素(APi)，白杨素(Chry)，沃古明(Wog)，4-甲氧基查耳酮，3’,4’,5’,5,7-五甲基甲氧黄酮(PMF)，表没食子儿茶素3-没食子酸酯(EGCG)，异烟肼(INH)；乙硫酰胺(ETH)，抗坏血酸(AA)，ARE表达调节剂(AEM1)，鸦胆子苦醇(Bru)，隐丹参酮(CryP)，IM3829(4-(2-环己基乙氧基)苯胺)，二甲双胍(Met)，霉菌毒素赭曲霉毒素A(Ota)，雷公藤甲素(TPL)CBR-031-1，CBR-026-7，CBR-168-5，秋兰姆二硫化物，双硫仑组成的组。

15.一种评估化合物治疗ASD表型1的功效的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

a)将所述的化合物给予源自ASD表型1患者样品的细胞系；

b)在一种或多种能源和/或一种或多种代谢因子存在的情况下评估所述的细胞系的能量产生能力；以及

c)评估所述的细胞系的能量产生能力是否与施用所述的化合物之前在同一细胞系中评估的能量产生能力明显不同。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，如果所述的细胞系的能量产生能力明显不同，所述的化合物为有效的，因此，与施用化合物之前所述的细胞系的能量产生能力相比，显示出：

-在选自由D-果糖，D-葡萄糖，D-甘露糖，D-半乳糖，D-葡萄糖-6-磷酸盐，D-葡萄糖-1-磷酸盐，D-甘露糖，D-果糖-6-磷酸盐和糊精组成的组的至少一种碳源存在的情况下更高的能量产生能力。

17.一种源自ASD表型1患者的样品的细胞系在评估化合物治疗ASD表型1的功效中的用途，其特征在于，所述的用途包括以下步骤：

a)将化合物给予细胞系；

b)在一种或多种能源和/或一种或多种代谢因子存在的情况下评估所述的细胞系的能量产生能力；以及

c)评估所述的细胞系的能量产生能力是否与所述的化合物给药前在所述的细胞系中评估的能量产生能力明显不同。

18.根据权利要求17所述的用途，其特征在于，如果所述的细胞系的能量产生能力明显不同，则所述的化合物用于治疗ASD表型1为有效的，因为，与施用所述的化合物之前所述的细胞系的能量产生能力相比，显示出：

-在选自由D-果糖，D-葡萄糖，D-甘露糖，D-半乳糖，D-葡萄糖-6-磷酸盐，D-葡萄糖-1-磷酸盐，D-甘露糖，D-果糖-6-磷酸盐，糊精组成的组中，最优选D-葡萄糖，D-甘露糖，D-果糖和糊精组成的组中，至少一种碳源存在下更高的能量产生能力。

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