CN113166777B - 含有AIMP2-DX2和miR-142的靶核酸的载体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包含AIMP2剪接变体和miR‑142靶核酸的重组载体及其多种应用。AIMP2变体可以在神经元细胞和脑组织中特异性表达，因此可以在相关工业中得到有益的应用。

Description

含有AIMP2-DX2和miR-142的靶核酸的载体及其用途

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技术领域

本文公开了包含AIMP2-DX2和miR-142的靶序列的载体及其用途。

背景技术

哺乳动物的脑在经历了一系列过程(包括神经元干细胞的分裂、分化、存活和死亡以及突触的形成等)之后，可以通过建立系统神经网络来执行复杂的功能。动物脑中的神经元不断产生大量神经生长所必需的物质，甚至在其成熟状态中也是如此，由此诱导轴突和树突的生长。而且，每当执行新的学习和记忆时，就会不断地进行神经网络的突触重塑和突触连接，因此可以说神经元在持续经历分化。如果神经元在细胞分化和突触形成过程中不能接收靶标来源的存活因子(如神经生长因子)，则其会发生凋亡，而压力和细胞毒性剂引起的凋亡成为退行性脑疾患的主要原因。与中枢神经系统不同，当动物的周围神经系统受到损伤时，轴突会在很长一段时间内再生。受损神经背侧的轴突通过称为Wallerian变性的过程进行变性，神经细胞体重新开始轴突再生长，同时雪旺氏细胞在经历再生过程后再生，包括在再次经历分裂和分化等后通过生存和消亡来确定靶神经。

在世界范围内，随着老年人口的迅速增加，神经退行性疾病的出现有每年持续增加的趋势。由于尚未发现明确的预防和治疗方法，因此在治疗此类疾病方面仍然没有具有出色疗效的药物。另外，用于这些疾患的现有药物和疗法经常显示出由于长期施用引起的副作用和毒性。此外，由于它们仅具有暂时减轻症状程度或延迟症状进展而非完全治疗疾病的作用，因此迫切需要挖掘和开发在减少副作用和毒性的同时具有决定性治疗效果的物质。

自1990年首次开始临床试验以来，直到2002年已经进行了约600例针对人类受试者的基因疗法的临床试验并且仍在进行中。在2003年完成人类基因组序列分析的基础上，未来通过挖掘各种基因将加快新基因疗法的开发。但是，迄今为止，已被批准的基因疗法中有75％靶向单基因疾病，例如癌症或囊性纤维化等，并且还没有活跃的用于神经疾患或再生的基因疗法药物的开发(Recombinant DNA consultation paper of NIH,USA(2002)；Gene Therapy Clinical Trials,J.Gene Med.(2002)www.wiley.co.uk/genmed)。但是，已经在尝试通过使用神经生长因子例如NT-3和神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)来开发在帕金森氏病中治疗和再生感觉神经元的基因疗法(GDNF family ligands activatemultiple events during axonal growth in mature sensory neurons(Mol.Cell.Neurosci.25:4453-4459(2004))。由于在与神经系统疾患相关的脑功能方面的整体神经科学研究进展缓慢，因此用于各种慢性神经系统疾患的治疗药物的开发也面临困难。

已知AIMP2-DX2作为AIMP2的可变剪接变体(AIMP2是在许多方面与凋亡相关的肿瘤抑制剂)，通过阻碍AIMP2的功能来抑制凋亡。这是通过控制TNF-a诱导的、由AIMP2/p38介导的TRAF2泛素化引起的凋亡来实现，AIMP2-DX2是AIMP2/p38的剪接变体，充当AIMP2的竞争性抑制剂，通过抑制TRAF2的泛素化和抑制炎性标记物Cox-2的表达来阻抑TNF-a诱导的凋亡，从而促进肿瘤生成。另外，已经报道，AIMP2-DX2已被证实为现有的肺癌诱导因子，并且在现有研究中已证实AIMP2-DX2(为AIMP2的变体)，广泛存在于癌细胞中，通过干扰AIMP2的癌症抑制功能，诱导癌症。此外，发现在正常细胞中AIMP2-DX2的出现使细胞癌变，而另一方面，对AIMP2-DX2出现的抑制，可以抑制癌症的生长，从而显示出治疗效果。

还已经确定AIMP2-DX2可用于治疗神经元疾病(KR10-2015-0140723(2017)和US2019/0298858(2019年10月23日公开)。

发明内容

包含miR-142靶向序列(例如miR-142-3p和/或miR-142-5p靶核酸)的重组载体可以选择性地控制AIMP2剪接变体在神经元和脑组织中的表达。

本文公开了包含外显子2缺失的AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因和miR-142靶核酸的重组载体。

载体可以进一步包含与AIMP2-DX2可操作连接的启动子。所述启动子可以是逆转录病毒(LTR)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、MT启动子、EF-1α启动子、UB6启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、CAG启动子、RPE65启动子或视蛋白启动子。

miR-142靶核酸可以在AIMP2-DX2基因的3’端。miR-142靶核酸可以在AIMP2-DX2基因的5'端。

AIMP2-DX2基因可以具有编码与SEQ ID NO：2至少90％相同的氨基酸序列的核苷酸序列。AIMP2-DX2基因可以具有编码氨基酸序列SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

AIMP2-DX2基因可以具有与SEQ ID NO：1的核苷酸序列至少90％相同的核苷酸序列。AIMP2-DX2基因可以具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

miR-142靶核酸可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含ACACTA。miR-142靶核酸可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含ACACTA和SEQ ID NO：5的1-17个另外的连续核苷酸。

miR-142靶核酸可包含与SEQ ID NO：5(TCCATAAAGTAGGAAACACTACA；miR-142-3p)的核苷酸序列至少50％相同的核苷酸序列。miR-142靶核酸可以包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列。

miR-142靶核酸可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含ACTTTA。miR-142靶核酸可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含ACTTTA和SEQ ID NO：7的1-15个另外的连续核苷酸。

miR-142靶核酸可包含与SEQ ID NO：7(AGTAGTGCTTTCTACTTTATG；miR-142-5p)的核苷酸序列至少50％相同的核苷酸序列。miR-142靶核酸可以包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列。

miR-142靶核酸可以重复2-10次。

载体可以是病毒载体。病毒载体可以是腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、MLV(鼠白血病病毒)、ASLV(禽肉瘤/白血病)、SNV(脾坏死病毒)、RSV(劳斯肉瘤病毒)、MMTV(小鼠乳腺肿瘤病毒)或单纯疱疹病毒载体。病毒载体可以是腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、痘苗病毒或单纯疱疹病毒载体。

本文还公开了在有需要的受试者中治疗神经元疾病的方法，其包括施用本文所述的任何载体。

神经元疾病可以是肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、阿尔茨海默病、帕金森氏病、视网膜变性、轻度认知障碍、多发性梗塞性痴呆、额颞痴呆、路易体痴呆、亨廷顿舞蹈病、变性神经疾病、代谢性脑疾患、抑郁症、癫痫症、多发性硬化症、皮质基底变性、多系统萎缩、进行性核上性麻痹、齿状红核苍白球路易体萎缩、脊髓小脑性共济失调、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩或中风。神经元疾病可以是ALS。

治疗可以改善运动活动或延长受试者的寿命。

可以将载体施用于脑或脊髓。载体可以通过立体定位注射施用至脑。

本发明的目的是提供含有miR-142-3p的靶序列的重组载体。

另外，本发明可以提供包括重组载体(recombinant vector)的基因运载体(genecarrier)，所述重组载体包含miR-142-3p的靶序列。

另外，本发明可以提供在神经元中递送和表达异源基因的方法，所述方法包括将重组载体引入个体的步骤。

另外，本发明可以提供1)启动子；2)与启动子可操作连接的编码靶蛋白的碱基序列；和3)表达盒，其中所述表达盒包括插入到所述碱基序列的3'UTR中的miR-142-3p的靶碱基序列。

另外，本发明可以提供用于神经退行性疾病的预防或治疗制剂，其包含编码外显子2缺失的AIMP-2剪接变体的碱基序列、和与该碱基序列的3'UTR连接的miR-142-3p的靶碱基序列。

为了实现上述目的，本发明提供了含有miR-142-3p的靶序列的重组载体。

另外，本发明提供了包含重组载体的基因运载体，所述重组载体包含miR-142-3p的靶序列。

另外，本发明提供了在神经元中递送和表达异源基因的方法，所述方法包括将重组载体递送至个体的步骤。

另外，本发明提供了1)启动子；2)与启动子可操作连接的编码靶蛋白的碱基序列；和3)表达盒，其中所述表达盒包括插入到所述碱基序列的3'UTR中的靶向miR-142-3p的碱基序列。

另外，本发明提供了用于神经退行性疾病的预防或治疗的制剂，其包含编码外显子2缺失的AIMP-2剪接变体的碱基序列、和与该碱基序列的3'UTR连接的靶向miR-142-3p的碱基序列。

本发明的重组载体具有如下效果：通过将miR-142-3p的靶序列插入到AIMP2末端，可以抑制其在CD45源细胞(CD45-derived cell)中，尤其是淋巴系统和白细胞中的表达，控制AIMP2剪接变体的肿瘤过表达的副作用。由于AIMP2剪接变体可以仅在神经元中特异性表达，并且在人体各个组织中仅在脑组织中选择性表达，因此，其可以在相关行业中得到有益的应用。

附图说明

图1描绘了本发明的重组载体。

图2显示了在体外环境下本发明的重组载体的神经细胞特异性表达效果。

图3显示了在体内环境下本发明的重组载体的神经细胞特异性表达效果。

图4显示了具有4个重复的miR142-3pT(下划线)的miR142-3p靶序列。

图5A显示了具有1x，2x和3x重复以及突变的miR142-3p靶序列的示意图。图5B显示了具有1x、2x和3x重复的miR142-3pT时miR142-3p对DX2表达的抑制。

图6显示了核心结合序列在DX2抑制中是重要的。具有Tseq x3重复的载体，其显示出对DX2的显著抑制(图5B)，DX2构建体用作对照。100pmol miR-142-3p处理显著抑制了Tseq x3载体，但DX2和突变序列不受抑制。

图7显示，鞘内注射scAAV2-DX2-miR142-3p后从脊髓提取的总RNA进行qRT-PCR。

图8显示了在体外环境下本发明的表达载体的神经细胞特异性表达效果。

具体实施方式

AIMP2-DX2是与细胞凋亡相关的肿瘤抑制因子AIMP2的可变剪接变体。已知AIMP2-DX2通过抑制AIMP2的功能来抑制肿瘤的凋亡。

KR 10-1067816(2011)描述了AIMP2-DX2的抑制剂可以治疗炎性疾病。KR 10-1067816(2011)还公开了AIMP2/p38促进TRAF2的泛素化以调节TNF-α诱导的凋亡，并且AIMP2-p38的剪接变体AIMP2-DX2作为AIMP2的竞争性抑制剂来抑制TRAF2的泛素化，从而抑制TNF-α诱导的凋亡，从而促进肿瘤生成并抑制炎性标记物Cox-2的表达。

另外，先前已将AIMP2-DX2鉴定为肺癌诱导因子。在该研究中，发现AIMP2的变体，AIMP2-DX2，在癌细胞中很常见，并且干扰AIMP2的癌症抑制功能，从而导致癌症。还发现AIMP2-DX2在正常细胞中的表达导致细胞癌变，而抑制AIMP2-DX2的形成则抑制癌细胞的生长，从而导致癌症的治疗效果。此外，研究还通过动物模型表明，对AIMP2-DX2靶标的抑制可产生对常规抗癌药物，例如紫杉醇和顺铂无反应的卵巢癌的治疗。但是，AIMP2-DX2本身不具有转化正常细胞的致癌能力。

还已经确定AIMP2-DX2可以治疗神经元疾病(US2019/0298858 A1)。

本文公开了包含外显子2缺失的AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因和miR-142靶核酸的重组载体。本文所述的载体可以在神经元细胞中特异性表达DX2，但在造血细胞如白细胞和淋巴样细胞中不表达。因此，本文所述的载体可用于特异性靶向神经元细胞以治疗神经元疾病。

AIMP2-DX2多肽(SEQ ID NO：2)是AIMP2(SEQ ID NO：3)的剪接变体，其中AIMP2的第二外显子(SEQ ID NO：4)缺失。特别地，AIMP2-DX2基因具有SEQ ID NO：1所示的碱基序列，AIMP2-DX2多肽具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，AIMP2-DX2基因可以具有核苷酸序列，所述核苷酸序列编码与SEQ ID No：2至少90％相同、至少93％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同、或具有任何居间范围的％同一性的氨基酸序列。AIMP2-DX2基因可以具有编码氨基酸序列SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

AIMP2-DX2基因可以具有与SEQ ID No：1的核苷酸序列至少90％相同、至少93％相同、至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同、或任何居间范围的％同一性的核苷酸序列。AIMP2-DX2基因可以具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

miR-142靶核酸可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含ACACTA。miR-142靶核酸可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含ACACTA和SEQ ID NO：5的1-17个另外的连续核苷酸。例如，miR-142靶核酸可包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含ACACTA和总共1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个另外的核苷酸，所述另外的核苷酸是在SEQID NO：5中所示的ACACTA的连续的5'或3’端。

miR-142靶核酸可包含与SEQ ID NO：5的核苷酸序列(TCCATAAAGTAGGAAACACTACA；miR-142-3p)至少50％相同、至少60％相同、至少70％相同、至少80％相同、至少90％相同或至少95％相同的核苷酸序列。miR-142靶核酸可以包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列。

miR-142靶核酸可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含ACTTTA。miR-142靶核酸可以包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含ACTTTA和SEQ ID NO：7的1-15个另外的连续核苷酸。例如，miR-142靶核酸可包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含ACTTTA和总共1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个另外的核苷酸，所述另外的核苷酸是SEQ ID NO：7中所示的ACTTTA的连续的5'或3’端。

miR-142靶核酸可包含与SEQ ID NO：7的核苷酸序列(AGTAGTGCTTTCTACTTTATG；miR-142-5p)至少50％相同、至少60％相同、至少70％相同、至少80％相同、至少90％相同或至少95％相同的核苷酸序列。miR-142靶核酸可以包含SEQ ID NO：7的核苷酸序列。

microRNA(miRNA)是一种非编码RNA分子，具有控制基因表达的功能。miRNA通过与mRNA分子内互补序列的碱基配对发挥作用。miRNA可以与蛋白质编码基因的靶信使RNA(mRNA)转录本结合，并负性控制其翻译或引起mRNA降解。目前，已经鉴定出2000多种人类miRNA，并且miRbase数据库是公众可获得的。许多miRNA以组织特异性方式表达，并在维持组织特异性功能和分化中起重要作用。

本文公开了重组载体，其通过将miR-142-3p和/或miR-142-5p的靶序列插入到AIMP2-DX2末端，抑制在CD45-细胞中，尤其是淋巴系统和白细胞中AIMP2-DX2表达，控制AIMP2-DX2变体的肿瘤过表达副作用。因此，AIMP2-DX2变体可以仅在神经元细胞中表达、或选择性地在脑组织中表达而不在其他类型的细胞或组织中表达。

本发明提供了含有miR-142-3p和/或miR-142-5p的靶序列的重组载体。本文公开了包含外显子2缺失的AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因和miR-142-3p和/或miR-142-5p靶核酸的重组载体。

术语“重组载体”是指可以在适当的宿主细胞中表达靶蛋白或RNA的载体，和含有可操作连接的必要控制元件以使插入的基因能够适当表达的基因构建体。

本发明中，术语“可操作连接”是指核酸表达控制序列和编码靶蛋白或RNA的核酸序列之间的功能性连接，以执行一般功能。例如，启动子可以与编码蛋白质或RNA的核酸序列可操作连接以影响编码核酸序列的表达。与重组载体的可操作连接可以通过使用本领域熟知的基因重组技术、以及使用在本领域通常已知的位点特异性DNA切割和连接酶来进行。

重组载体可以进一步包含与AIMP2-DX2可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，所述启动子是逆转录病毒(LTR)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、MT启动子、EF-1α启动子、UB6启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、CAG启动子、RPE65启动子或视蛋白启动子。

术语“microRNA(miRNA)”是由约20、21、22、23或24个核苷酸组成的非编码RNA，起着控制基因表达的作用。在哺乳动物的情况下，miRNA在基因的转录后阶段起作用，并且已知约60％的基因表达受miRNA控制。miRNA在生物体内的各种过程中起着重要作用，并且已被公开与癌症、心脏疾患和神经相关疾病有关。miRNA是单链RNA，只要miRNA的靶序列可以导致成熟前双链RNA中靶基因的表达可以被抑制，则该靶序列即可以使用。例如，miR-142-3p和miR-142-5p存在于miR-142中，其靶核酸都可用于本发明。“miR-142”涉及miR-142-3p和miR-142-5p两者，miR-142-3p可能是期望的。

miR-142靶核酸可以在AIMP2-DX2基因的5'或3’端。

“miR-142-3p”发现于侵袭性B细胞白血病中基因易位发生的区域，并且已知在造血组织(骨髓、脾脏和胸腺等)中表达。另外，已知miR-142-3p参与造血系统的分化，并证实了在胎鼠肝脏(小鼠的造血组织)中表达。

在一些实施方案中，将miR-142-3p和/或miR-142-5p靶核酸重复至少2-10次，至少2-8次，至少2-6次，至少4次或其间任何范围或次数。

作为实施本发明的一个例子，miR-142-3p可以包含以编号3表示的碱基序列。此外，miR-142-3p靶向的序列可以包含序列号为4的碱基序列，该序列与miR-142-3p互补结合。包含互补序列的本发明的miR-142-3p靶序列是用编号5表示的碱基序列，但不限于此。

重组载体可另外包含异源启动子和与该启动子可操作地连接的异源基因。

本发明中的“异源基因”可以包括靶产物的编码序列，例如具有生物学上合适活性的蛋白质或多肽、免疫原性或抗原性蛋白质或多肽、或治疗活性蛋白质或多肽。

多肽可以弥补宿主细胞中内源蛋白的表达缺陷或表达缺失。可以从多种来源产生基因序列，包括DNA、cDNA、合成的DNA、RNA或其组合。基因序列可以包括基因组DNA，可以含有或不含有天然内含子。另外，基因组DNA可与启动子序列或聚腺苷酸化序列一起获得。基因组DNA或cDNA可以通过各种方法获得。可以通过本领域中已知的方法从合适的细胞中提取和纯化基因组DNA。或者，可使用从细胞分离的mRNA，通过反转录或其他方法产生cDNA。或者，多核苷酸序列可以包含与该RNA序列互补的序列，例如反义RNA序列，并且可以将反义RNA施用于个体以抑制互补多核苷酸在个体细胞中的表达。

在本发明的目的下，异源基因是具有外显子2缺失的AIMP-2剪接变体，并且本发明的miR-142-3p靶序列可以与该异源基因的3'UTR连接。AIMP2蛋白的序列(312aa版本:AAC50391.1或GI:1215669；320aa版本:AAH13630.1,GI:15489023,BC0 13630.1)公开于文献中(312aa版本:Nicolaides,N.C.,Kinzler,K.W.and Vogelstein,B.Analysis of the5’region of PMS2 reveals heterogeneous transcripts and a novel overlappinggene,Genomics 29(2),329-334(1995)；320aa版本:Generation and initial analysisof more than 15,000full-length human and mouse cDNA sequences,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(26),16899-16903(2002))。

本发明中，术语“AIMP2剪接变体”是指由于外显子1至4中外显子2的部分或全部丧失而产生的变体。这样，该变体可以与AIMP2蛋白形成异二聚体而干扰AIMP2的正常功能。另外，当该AIMP2剪接变体在细胞或组织中过表达时，可能诱发癌症。因此，需要诱导组织特异性表达以抑制癌症的诱导。

本发明的重组载体可以包括SEQ ID NO：1和5。

与核苷酸或氨基酸序列有关的表述“序列同源性％”、“同一性％”或“％相同”，可以例如通过将2个最佳排列的序列在比较窗中进行比较而确定，与在两个序列的最佳排列上的参考序列(不包括添加或缺失)相比，比较窗中的一些碱基序列可以包括添加或缺失(即空位)。

在本发明范围内，本发明的蛋白质不仅包括具有天然氨基酸序列的蛋白质，而且包括具有变体氨基酸序列的蛋白质。

本发明的蛋白质的变体是指，由于缺失、插入、非保守或保守取代、或其组合，而在序列上与具有天然氨基酸序列的蛋白质有1个或多个氨基酸残基差异的蛋白质。在总体上不改变分子活性的蛋白质和肽中的氨基酸交换是本领域已知的(H.Neurath,R.L.Hill,TheProteins,Academic Press,New York,1979)。

可以通过天然提取或合成(Merrifield,J.Amer.Chem.Soc.85:2149-2156,1963)或基于DNA序列的基因重组方法(Sambrook等人，Molecular Cloning,Cold SpringHarbour Laboratory Press,New York,USA,第2版,1989)制造蛋白质或其变体。

可以基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，如亲水性、疏水性、电荷和大小等，进行氨基酸突变。根据对氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型的分析，可以辨别出精氨酸、赖氨酸和组氨酸是带正电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸具有相似的大小；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸具有相似的形状。因此，基于这些考虑，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸可被视为在生物学上的功能等同物。

在引入一个或多个突变时，可以考虑氨基酸的疏水指数。根据疏水性和电荷对每个氨基酸配置疏水指数：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。

在赋予蛋白质的相互作用生物学功能方面，疏水氨基酸指数非常重要。众所周知的事实是，只有当用具有相似疏水指数的氨基酸进行取代时，才可能具有相似的生物学活性。在参考疏水指数而引入突变的情况下，理想地在显示具有±2以内、更理想地在±1以内、甚至更理想地在±0.5以内的疏水指数差异的氨基酸之间进行取代。

另一方面，也已知具有相似亲水性值的氨基酸之间的取代导致具有等同生物学活性的蛋白质。如在美国专利号4,554,101中所指出的，以下亲水性值配置给各氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。

在参考亲水性值引入一个或多个突变的情况下，理想地在亲水性值差异在±2内、更理想地在±1内、甚至更理想地在±0.5内的氨基酸之间进行取代。

本领域已知在总体上不改变分子活性的蛋白质中的氨基酸交换(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常见的交换是以下氨基酸残基之间的交换，包括Ala/Ser,Val/Ile,Asp/Glu,Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val,Ser/Gly,Thy/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg,Asp/Asn,Leu/Ile,Leu/Val,Ala/Glu和Asp/Gly。可以通过本领域已知的多种方法构建本发明的载体系统。具体方法在Sambrook等人(2001),Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress中描述了，该文献并入本文作为参考。

通常，可以将本发明的载体构建为用于克隆或表达的载体。另外，可以用原核或真核细胞作为宿主构建本发明的载体。当本发明的载体是表达载体并且使用原核细胞作为宿主，其通常包括用于执行转录的强启动子(例如tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、1pp启动子、pLX启动子、pRX启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子和T7启动子等)，以及用于转录起始的核糖体结合位点和转录/翻译终止序列。在使用大肠杆菌(例如HB101、BL21、DH5a等)作为宿主细胞的情况下，可以将大肠杆菌色氨酸生物合成通路的启动子和操纵子位点(Yanofsky,C.(1984),J.Bacteriol.,158:1018-1024)和噬菌体λ的左侧启动子(pLλ启动子,Herskowitz,I.and Hagen,D.(1980),Ann.Rev.Genet.,14:399-445)用作控制位点。

同时，可用于本发明的载体可以是选自病毒载体、线性DNA和质粒DNA的至少一种。

本发明中，“病毒载体”是指能够将基因或遗传物质递送至所需细胞、组织和/或器官的病毒载体。

病毒载体可以包括选自以下的至少一种且不限于此：腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒、HIV(人免疫缺陷病毒)、MLV(鼠白血病病毒)、ASLV(禽肉瘤/白血病)、SNV(脾坏死病毒)、RSV(劳斯肉瘤病毒)、MMTV(小鼠乳腺肿瘤病毒)和单纯疱疹病毒。在一些实施方案中，病毒载体可以是腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、痘苗病毒或单纯疱疹病毒载体。

逆转录病毒具有在宿主细胞基因组中整合的功能并且对人体无害，逆转录病毒具有特征，包括：在整合时抑制正常细胞的功能，能感染多种细胞、易于增殖、容纳大约1-7kb的外部基因，并产生复制缺陷型病毒。然而，逆转录病毒具有缺点，包括：难以感染有丝分裂后的细胞、难于体内基因递送，并且需要体外增殖体细胞。此外，由于逆转录病毒可以整合到原癌基因中，其具有诱发突变的风险，从而存在细胞坏死的可能性。

另一方面，腺病毒作为克隆载体具有多种优势，包括：能在细胞核中复制、临床无毒、中等水平大小、即使在插入外部基因后也稳定，无基因重排或缺失发生、能转化真核生物、并且即使整合到宿主细胞染色体中时，也能以高水平进行稳定表达。腺病毒的良好宿主细胞是引起人造血、淋巴和骨髓瘤的细胞。然而，由于其是线性DNA，因此增殖困难，并且不容易回收感染的病毒，病毒感染率低。另外，递送基因的表达在1-2周内最广泛，表达仅在某些细胞中持续3-4周。另一个问题是它具有高的免疫抗原性。

由于腺相关病毒(AAV)可以弥补上述问题并且作为基因治疗剂具有许多优点，因此近年来被优选。它也被称为腺卫星病毒。腺相关病毒颗粒的直径为20nm，已知对人体几乎无害。因此，其在欧洲已被批准用作基因治疗产品销售。

AAV是一种单链前病毒(provirus)，需要辅助病毒进行复制，AAV基因组具有4,680bp，可以插入被感染细胞的19号染色体的特定区域。转基因插入质粒DNA中与2个反向末端重复序列(ITR)序列部分(分别为145bp)和信号序列部分连接。与表达AAV rep和cap部分的其它质粒DNA一起进行转染，并添加腺病毒作为辅助病毒。AAV的优点是可以递送基因的宿主细胞范围广，反复施用时免疫副作用小，基因表达期长。而且，即使AAV基因组与宿主细胞的染色体整合，其也是安全的，不改变或重排宿主的基因表达。

已知腺相关病毒共有4种血清型。在可以用于靶基因递送的许多腺相关病毒的血清型中，研究最广泛的载体是腺相关病毒血清型2，其目前被用于递送囊性纤维化、血友病和Canavan病的临床基因。此外，最近，重组腺相关病毒(rAAV)在癌症基因治疗领域的潜力正在增加[4]。在本发明中也使用了腺相关病毒血清型2。但是可以选择并应用合适的病毒载体，并不限于此。

另外，当本发明的载体是表达载体并且使用真核细胞作为宿主，则可以使用源自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如：金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如：腺病毒晚期动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒启动子和HSV的TK启动子)。具体而言，可以包括选自以下启动子的一种以上，且不限于此：逆转录病毒的LTR、巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、MT启动子、EF-1α启动子、UB6启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、CAG启动子、RPE65启动子和视蛋白启动子。此外，其通常具有聚腺苷酸化序列作为转录终止序列。

本发明的载体可以根据需要与其他序列融合，以使蛋白质的纯化更容易。例如，可以使用谷胱甘肽S-转移酶(Pharmacia,USA)、麦芽糖结合蛋白(NEB,USA)、FLAG(IBI,USA)和6xHis(六组氨酸；Quiagen,USA)等融合序列，但是不限于这些。另外，本发明的表达载体可以包括通常用于本领域中的抗生素耐受性基因作为选择性标记物，包括，例如，氨苄青霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素和四环素。

另外，本发明提供了基因运载体，其包括含有miR-142(例如miR-142-3p和/或miR-142-5p)的靶序列的重组载体。

本发明中，术语“基因转移”通常包括将遗传物质递送至细胞以进行转录和表达。其方法非常适合蛋白质表达和治疗目的。已知多种递送方法，例如DNA转染和病毒转导。提及病毒介导的基因转移，这是因为高的递送效率和所递送基因的高水平表达，以及如果需要，可以通过天然亲和性或假型，靶向特定受体和/或细胞类型。

基因运载体可以是已经转化了本发明的重组载体的转化体，并且转化可以包括将核酸引入生物体、细胞、组织或器官的任何方法，如在本领域已知的，可以根据宿主细胞选择适当的标准技术来实施。这些方法包括电穿孔、原生质体融合、磷酸钙(CaPO₄)沉淀、氯化钙(CaCl₂)沉淀、与碳化硅纤维的混合、农杆菌介导的转化、PEG、硫酸葡聚糖和脂质体转染等，但是不限于这些。

基因运载体的目的是为了在神经元中表达异源基因。由此，其在CD45源细胞中抑制异源基因的表达，并可以增加异源基因在脑组织中的表达。CD45是位于大多数造血细胞上的跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶。细胞可以根据位于细胞表面的分子定义，而CD45是所有白细胞群和B淋巴细胞的细胞标记物。本发明的基因运载体可以不在源自CD45的细胞中表达，特别是不在淋巴样和白细胞类细胞中表达。

基因运载体可以另外地包括药学可接受载体、赋形剂或稀释剂。

另外，本发明提供了在神经元中递送和表达异源基因的方法，所述方法包括将重组载体引入个体的步骤。

所述方法可以增加异源基因在脑组织中的表达，并可以控制异源基因在其他组织中的表达。

另外，本发明提供了1)启动子；2)与启动子可操作连接的编码靶蛋白的碱基序列；和3)表达盒，所述表达盒包括连接到所述碱基序列的3'UTR的靶向miR-142-3p的碱基序列。本发明提供了1)启动子；2)与启动子可操作连接的编码靶蛋白的碱基序列；和3)表达盒，所述表达盒包括连接到所述碱基序列的3'UTR的靶向miR-142-5p的碱基序列。

本发明中，术语“表达盒”是指单元盒，因为其包括编码靶蛋白的基因和编码启动子和信号肽的碱基序列，其可以执行表达以生产和分泌在信号肽的下游可操作地连接的靶蛋白。本发明的分泌表达盒可以与分泌系统互换使用。可以在表达盒内或外包括能够帮助有效生产靶蛋白的各种因子。

另外，本发明提供了用于神经退行性疾病的预防或治疗的制剂，其包含编码外显子2缺失的AIMP-2剪接变体的碱基序列、和与该碱基序列的3'UTR连接的靶向miR-142-3p的碱基序列。

因此，本文还公开了在有需要的受试者中治疗神经元疾病的方法，其包括施用本文所述的任何载体。神经退行性疾病可以是选自以下的一种或多种疾病，但不限于此：阿尔茨海默病、帕金森氏病、肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、视网膜变性、轻度认知障碍、多发性梗塞性痴呆、额颞痴呆、路易体痴呆、亨廷顿舞蹈病、变性神经疾病、代谢性脑疾患、抑郁症、癫痫症、多发性硬化症、皮质基底变性、多系统萎缩、进行性核上性麻痹、齿状核红核苍白球路易体萎缩、脊髓小脑性共济失调、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩和中风。在一些实施方案中，神经元疾病是ALS。治疗可以改善患有神经元疾病例如ALS、阿尔茨海默病或帕金森氏病的受试者的记忆力、运动障碍、运动活动和/或延长寿命。在一些实施方案中，治疗可以改善患有神经元疾病例如ALS的受试者的运动活动和/或延长其寿命。

本文公开的载体可以实现但不限于细胞凋亡抑制、运动障碍改善和/或氧化应激抑制，并因此预防或治疗神经元疾病。

作为向患有退行性脑疾患的个体应用根据本发明的药剂的结果，本发明中，术语“治疗”不仅包括神经退行性疾病的完全治疗，还包括部分治疗、改善和减轻神经退行性疾病的整体症状。

本发明中，术语“预防”表示通过向患有退行性脑疾患的个体应用根据本发明的药剂，通过抑制或阻断诸如认知障碍、行为障碍和脑神经破坏等症状或现象，从而预先防止神经退行性疾病的整体症状的出现。

除活性成分外，还可以在根据本发明的药剂中另外包含佐剂。尽管可以使用任何佐剂而没有限制，只要其在本领域中是已知的即可，但可以例如通过进一步包括完全和不完全弗氏佐剂来提高免疫力。

可以将活性成分与药学上可接受的载体混合的形式来制造根据本发明的药剂。本文中，药学上可接受的载体包括通常在药学领域中使用的载体、赋形剂和稀释剂。可用于根据本发明的药剂的药学上可接受的载体包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油，但不限于这些。

根据本发明的药剂可以根据相应的一般制备方法，制备成各种形式来使用，包括口服施用类型，例如粉剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、悬浮液、乳剂、糖浆和气雾剂等，以及外用、栓剂或无菌注射液等。

当制备成制剂时，在制备中可以使用通常可用的稀释剂或赋形剂，如填充剂、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂和表面活性剂等。用于口服施用的固体制剂包括丸剂、片剂、粉剂、颗粒剂和胶囊剂，这些固体制剂可以通过将一种或多种的赋形剂(如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖和明胶)与活性成分混合来制备。此外，除简单的赋形剂外，还可以使用润滑剂，例如硬脂酸镁和滑石粉。用于口服施用的液体制剂包括悬浮液、内用溶液、油和糖浆等，其中包括除通常用作稀释剂的水和石蜡以外的各种赋形剂，如湿润剂、甜味剂、调味剂和防腐剂等。用于非口服施用的制剂包括无菌水溶液、非水溶剂、悬浮剂、油、冻干剂和栓剂。可以使用植物油(例如丙二醇、聚乙二醇和橄榄油)和可注射酯(例如乙酯)作为非水溶剂和悬浮液。用于栓剂的试剂可以包括维比索尔、吐温61、可可油、月桂油和甘油明胶等。

可以通过多种途径将根据本发明的药剂施用于个体。可以考虑任何的施用形式，例如口服施用、静脉内、肌肉、皮下和腹膜内注射。

根据本发明的治疗剂的期望施用剂量根据各种因素而不同，这些因素包括制剂生产方法、施用形式、患者的年龄、体重和性别、疾病症状的程度、食物、施用期间、施用途径、排出速度和反应灵敏度等。尽管如此，其可以由相应的制造商适当地选择。

但是，对于治疗效果，熟练的医生可以针对目标治疗确定并开出有效剂量。例如，治疗剂包括静脉内、皮下和肌肉注射，以及通过使用微针向脑室或脊髓定向注射。可以多次注射和反复施用，例如，在载体的情况下，有效剂量为0.05至15mg/kg，在重组病毒的情况下，有效剂量为5X 10¹¹至3.3X 10¹⁴病毒颗粒(2.5X 10¹²至1.5X 10¹⁶IU)/kg，在细胞的情况下，为5X 10²至5X 10⁷细胞/kg。理想地，在载体的情况下，剂量为0.1至10mg/kg，在重组病毒的情况下为5X 10¹²至3.3X 10¹³颗粒(2.5X 10¹³至1.5X 10¹⁵IU)/kg，在细胞的情况下为5X10³至5X 10⁶细胞/kg，以每周2至3次的施用率。剂量没有严格限制。而是可以根据患者的状况和神经疾患的表现程度对其进行调整。用于其他皮下脂肪和肌肉注射以及直接施用到患处的有效剂量是9X 10¹⁰至3.3X 10¹⁴重组病毒颗粒，间隔10cm，每周次的施用率。剂量没有严格限制。而是可以根据患者的状况和神经疾患的表现程度对其进行修改。更具体地，根据本发明的药剂包括1×10¹⁰至1×10¹²vg(病毒基因组)/mL的重组腺相关病毒，并且通常建议2周内每2天注射一次1X 10¹²vg。它可以每天施用一次，或者也可以将剂量分开用于一天几次施用。

药物制剂可以以多种口服和非口服施用的形式生产。在一些实施方案中，本文公开的载体可以施用至脑或脊髓。在一些实施方案中，本文公开的载体可以通过立体定位注射施用至脑。

口服施用的试剂包括丸剂、片剂、硬和软胶囊剂、液体、悬浮液、油、糖浆和颗粒剂等。除活性成分外，这些试剂可包括稀释剂(例如：乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素和/或甘氨酸)和润滑剂(glydents)(例如：二氧化硅、滑石粉和硬脂酸及其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇)。另外，丸剂可以包含粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷，并且视情况而定，可以包含崩解剂例如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐或类似混合物和/或吸收剂、着色剂、调味剂和甜味剂。药剂可以通过常规的混合、制粒或包衣方法制备。

另外，注射剂是非口服施用制剂的代表性形式。用于这种注射剂的溶剂包括水、林格氏溶液、等渗生理盐水和悬浮液。可以将注射剂的无菌固定油用作溶剂或悬浮介质，并且可以将任何无刺激性的固定油包括甘油单酯和甘油二酯用于该目的。另外，注射剂可以使用脂肪酸，例如油酸。

以下是其他实施方案A-X。

A.包含miR-142-3p靶向序列的重组载体。

B.实施方案A的重组载体，其中miR-142-3p如碱基序列号3所示。

C.实施方案A的重组载体，其中miR-142-3p靶向序列是与miR-142-3p序列互补结合的序列。

D.实施方案A的重组载体，其中miR-142-3p靶向序列如碱基序列号4表示。

E.实施方案A的重组载体，其中miR-142-3p靶向序列如碱基序列号5表示。

F.实施方案A的重组载体，其中miR-142-3p靶向序列与碱基序列号4所示的碱基序列具有至少90％的同源性。

G.实施方案A的重组载体，其中miR-142-3p靶向序列与碱基序列号5所示的碱基序列具有至少90％的同源性。

H.实施方案A的重组载体，其中重组载体还包括异源启动子和与该启动子可操作地连接的异源基因。

I.实施方案H的重组载体，其中miR-142-3p靶向序列被插入到异源基因的3'UTR中。

J.实施方案H的重组载体，其中异源基因是具有外显子2缺失的AIMP2变体。

K.实施方案H的重组载体，其中异源启动子选自逆转录病毒(LTR)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、MT启动子、EF-1α启动子、UB6启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、CAG启动子、RPE65启动子和视蛋白启动子。

L.实施方案A的重组载体，其中重组载体为选自病毒载体、线性DNA和质粒DNA的一种或多种。

M.实施方案L的重组载体，其中病毒载体是源自选自以下的一种或多种的载体：腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、MLV(鼠白血病病毒)、ASLV(禽肉瘤/白血病)、SNV(脾坏死病毒)、RSV(劳斯肉瘤病毒)、MMTV(小鼠乳腺肿瘤病毒)和单纯疱疹病毒。

N.实施方案A的重组载体，其中重组载体包括序列号7所示的碱基序列。

O.基因运载体，其包含含有miR-142-3p的靶序列的重组载体。

P.实施方案O的基因运载体，其中基因运载体在神经元中表达异源基因。

Q.实施方案O的基因运载体，其中基因运载体抑制CD45源细胞中异源基因的表达。

R.实施方案O的基因运载体，其中基因运载体增加脑组织中异源基因的表达。

S.向神经元和在神经元中递送和表达异源基因的方法，所述方法包括将上述实施方案A的重组载体施用给个体的步骤。

T.实施方案S的方法，其中增加异源基因在神经元中表达和控制异源基因在其他组织中的表达。

U.实施方案，包括：

1)启动子；

2)编码可操作地与启动子连接的靶蛋白的碱基序列；和

3)表达盒，其包含插入到所述碱基序列的3'UTR中的miR-142-3p靶碱基序列。

V.实施方案U的表达盒，其中靶蛋白是具有外显子2缺失的AIMP-2变体蛋白。

W.用于神经退行性疾病的预防或治疗的制剂，其包括编码具有外显子2缺失的AIMP-2变体的碱基序列，并且包括插入到该碱基序列的3'UTR中的miR-142-3p靶碱基序列。

X.实施方案W的方法，其中神经退行性疾病是选自以下的一种或多种：阿尔茨海默病、帕金森氏病、楼格里格氏病(肌萎缩性侧索硬化症)、视网膜变性、轻度认知障碍、多发性梗塞性痴呆、额颞痴呆、路易体痴呆、亨廷顿舞蹈病、变性神经疾病、代谢性脑疾患、抑郁症、癫痫症、多发性硬化症、皮质基底变性、多系统萎缩、进行性核上性麻痹、齿状核红核苍白球路易体萎缩、脊髓小脑性共济失调、原发性侧索硬化、脊髓性肌萎缩和中风，且不限于这些疾病。

通过使用下面进行的实施例，将更详细地解释本发明。然而，以下进行的实施例仅出于举例说明本发明内容的目的，并且本发明的应用不受限于这些实施例。

实施例

实施例1重组载体的构建

CD45是大多数造血细胞的跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶，根据细胞表面上的该分子,CD45可用于定义细胞。CD45是所有白细胞群和B淋巴细胞的标记物。本发明人产生了重组载体，其不在CD45源细胞，特别是淋巴样和白细胞谱系细胞中表达，但特异性地且仅在神经元中表达。重组载体包含AIMP2的剪接变体(其中氨酰基tRNA合成酶复合物相互作用多功能蛋白2(AIMP2)的外显子2已缺失)，并且插入能够控制AIMP2剪接变体表达的miRNA。

证实了AIMP2剪接变体在肿瘤中过表达，由于AIMP2的剪接，该AIMP2剪接变体不具有降解与肿瘤信号传导相关的TRAF2(TNF受体相关因子2)的功能，其可以与AIMP2竞争结合TRAF2，从而阻碍AIMP2的功能，干扰AIMP2的肿瘤抑制作用。

因此，如上所述产生了本发明的重组载体，以便仅在神经元中诱导AIMP2剪接变体的特异性表达并抑制AIMP2剪接变体的肿瘤表达。

1-1AIMP2变体的产生

AIMP2是参与形成氨酰基tRNA合成酶(ARS)的蛋白质之一，并起着肿瘤抑制剂的作用。为了构建表达缺失了AIMP2外显子2的变体的质粒，用pcDNA3.1-myc克隆了AIMP2剪接变体的cDNA。通过使用具有连接至H322 cDNA的EcoR1和Xho 1接头的引物扩增AIMP2剪接变体后，通过使用EcoR1和Xho 1进行在pcDNA3.1-myc中的亚克隆。

本发明的AIMP2变体具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列和SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

1-2miRNA的分选及其靶序列的选择

如上所述，证实了本发明的AIMP2变体在肿瘤中过表达。这样，选择能够控制AIMP2变体表达的miRNA及其靶标，以抑制AIMP2变体在白细胞和淋巴样相关细胞中的表达，同时实现在神经元靶细胞中安全表达。

为此，选择仅在产生白细胞和淋巴样相关细胞的造血细胞中特异性表达的miR-142-3p作为靶标。为了产生仅靶向miR-142-3p的序列，使用小鼠B细胞的微阵列数据和miR-142-3p靶向基因的计算机编程(mirSVR评分)。miR-142-3p是序列号3所示的碱基序列。靶向miR-142-3p的序列以序列号4的碱基序列表示，该序列与miR-142-3p互补结合。MiR-142-3p靶序列可以具有SEQ ID NO：5的核苷酸序列。

本发明的miR-142-3p靶序列包括用于克隆的限制性酶(Nhe 1和Hind III，Bmt 1)位点序列(ccagaagcttgctagc)和限制性酶(Hind H)位点序列(aagcttgtag)。其包括SEQ IDNO：5的核苷酸序列，该核苷酸序列重复4次，彼此以接头(tcac和gatatc)连接(图4；SEQ IDNO：6)。

1-3重组载体的产生

为了产生本发明的重组载体，将miR-142-3p靶序列(SEQ ID NO：5)插入本发明的AIMP2变体(序列号为1)的3'UTR中。AIMP-2变体和miR-142-3p靶序列的连接以碱基序列号6表示，具体地，通过使用Nhe I和Hind III位点切割并插入。重组载体示于图1中。实施例2确认重组载体的神经细胞特异性表达

2-1确认体外条件下神经元特异性表达效果

因为miR142-3p仅在造血细胞中特异性表达，所以根据本发明重组载体表达的miR142-3p靶序列，敲低本发明的AIMP2变体，在特定细胞中确认了AIMP2变体的表达程度。

具体地，分组为未用本发明的重组载体处理的组(SHAM)、无效/对照载体处理的组(NC载体)、单独AIMP2变体载体处理的组(pscAAV_DX2)和用本发明的重组载体处理的组(pscAAV-DX2-miR142-3pT)。所有载体的浓度以ug/ul为单位计，每组用2.5ul(2.5ug)处理。在每个治疗组中，对THP-1细胞株(人白血病单核细胞)和SH-SY5Y细胞株(神经母细胞瘤)进行处理，确认AIMP2变体的敲低。使用在下表1中的引物进行qPCR(变性15秒，然后进行40个循环的退火和延伸，在60℃的温度下进行30秒)。

结果，证实了在SHAM和NC载体组中未表达AIMP2变体。另外，证实了单独AIMP2变体载体处理组(pscAAV-DX2)在THP-1细胞株和SH-SY5Y细胞株中均表达，从而证实未诱导神经细胞特异性表达。另一方面，证实了在用本发明的重组载体处理的组中，AIMP2变体仅在SH-SY5Y细胞株中特异性表达(图2)。

表1

AIMP2变体	引物	SEQ ID NO：
			正向	CTGGCCACGTGCAGGATTACGGGG(仅人)	8
反向	AAGTGAATCCCAGCTGATAG(仅人)	9

2-2在体内条件下确认神经细胞特异性表达效果

具体地，分组为无效/对照载体处理的组(NC载体)、单独AIMP2变体载体处理的组(pscAAV-DX2)和用本发明的重组载体处理的组(pscAAV-DX2-miR142-3pT)。使用浓度为10⁸vg/ul的每种病毒10ul(10⁹vg)进行实质内给药。在向每个处理组小鼠颅内注射后，1周后在大肠组织、肺组织、脑组织、肝组织、肾组织、胸腺组织、脾组织和外周血单核细胞(PBMC)中证实了AIMP2的表达。使用在下表1中的引物进行qPCR(变性15秒，然后进行40个循环的退火和延伸，在60℃的温度下进行30秒)。

结果证实，在用本发明的重组载体处理的组中，AIMP2变体的表达仅在具有高度浓缩的神经元的脑组织中特异性地增加(图3)。另一方面，证实了AIMP2变体的表达在除脑组织以外的组织中被阻断。

实施例3材料和方法

3-1.qRT-PCR

使用TRIzol(Invitrogen,Waltham,MA,USA)根据制造商的方案从脊髓中分离总RNA。通过用于定量的分光光度计(ASP-2680,ACTgene,USA)对提取的RNA进行定量。为了制备cDNA，使用SuperScriptⅢFirst-Strand(Invitrogen)按照制造商的规程进行了逆转录。使用SYBR green PCR预混液(ThermoFisher Scientific,USA)将所得cDNA用于实时PCR。将一式两份重复结果的表达数据用于2-ΔΔCt统计分析，并将GADPH表达用于归一化。

3-2动物

本研究中使用的hSOD1 G93A转基因小鼠(B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J)购自Jackson实验室(Bar Harbor,ME,USA)。还使用了年龄匹配的WT对照小鼠。在韩国首尔国立大学的动物设施中，将这些动物分别饲养在无特定病原体的条件和恒定环境条件(温度为21–23℃，湿度为50-60％，光照/黑暗周期为12小时)下的单个笼子中。所有实验程序均按照首尔国立大学机构动物护理和使用委员会的指导(SNUIACUC，2017年8月7日)进行，本研究已得到我们当地伦理委员会“SNUIACUC”的批准(批准号SNU-170807-1)。在症状发生前期,相同年龄的雌性小鼠注射AAV-GFP和DX2载体。通过直接腰椎穿刺在鞘内注射AAV-DX2转导。用Hamilton注射器(Hamilton,Switzerland)在两点缓慢注射(1μl/min)总量为8μl(4μl/点)的AAV-GFP或DX2载体，同时缓慢拔出针头以防止注射的载体丢失。

3-3.miR142-3p抑制实验

从x1 miR-142-3p靶序列可以观察到miR-142-3p对DX2表达的抑制。使用lipofectamine 2000(Invitrogen,US)，用具有x1、x2和x3重复的miR-142-3p靶序列的载体以及100pmol miR-142-3p瞬时转染HEK293细胞，然后孵育48小时。通过PCR分析DX2 mRNA的量。从Tseq x1重复的miR142-3p靶序列观察到miR142-3p对DX2表达的抑制(图5B)。

实施例4

4-1生成3种类型的载体用于核心结合序列的抑制作用

Tseq x1包含1个核心结合序列，Tseq x2包含2个核心结合序列，而Tseq x3包含3个核心结合序列(图5A)。

从x1重复的miR142-3p靶序列开始观察到miR142-3p(100pmol)对DX2表达的抑制。使用lipofectamine 2000(Invitrogen,US)，用x1、x2和x3重复的miR-142-3p靶序列载体以及100pmol miR-142-3p瞬时转染HEK293细胞，然后孵育48小时。通过PCR分析DX2 mRNA的量。当miR142-3p靶序列中核心结合序列数增加时，miR142-3p对DX2表达的抑制也增加。含有Tseq x3核心序列的载体显示出显著的抑制(图5B)。

4-2核心序列突变

使用小鼠B细胞微阵列数据和miR-142-3p靶基因的mirSVR评分，预测了核心序列。核心序列的四个区域进行替换如下：(5’-AACACTAC-3’→5’-CCACTGCA-3’)(原始序列参见图4，示意图参见图5A)。

4-3核心结合序列对DX2抑制是重要的

四个核心序列被取代(图5A)。使用lipofectamin 2000(Invitrogen，US),用DX2-miR-142-3p T seq x3重复载体(Tseq3x)或用核心序列突变载体(mut)以及100pmol miR-142-3p瞬时转染HEK293细胞，然后孵育48小时。通过PCR分析DX2 mRNA的表达。Tseq x3重复载体显示出DX2的显著抑制(图5B)，DX2构建体用作对照。100pmol的miR142-3p处理显著抑制Tseq x3载体，但DX2和mut序列未受到抑制(图6)。

4-4ALS小鼠模型中的组织分布数据

鞘内注射scAAV2-DX2-miR142-3p后，从脊髓中提取总RNA。进行qRT-PCR。DX2表达应仅限于局部注射部位，即脊髓。hSOD1 G93A转基因小鼠，鞘内注射表达scAAV-DX2-miR142-3p。对照溶媒注射显示仅在脊髓中表达，而在脑或坐骨神经中不表达(图7)。

实施例5

在实施例2中，用来自Oxgene,UK的三个质粒共转染HEK293T细胞，所述三个质粒编码产生重组AAV2颗粒所需的所有组分。

还仅用pSF-AAV-ITR-CMV-EGFP-ITR-KanR(Oxgene,UK)转染HEK293T细胞，载体中插入AIMP2-DX2或DX2-miR142靶核苷酸，作为表达载体而不用于产生AAV颗粒。

将DX2编码载体(2ug)和DX2-miR142靶序列编码载体(2ug)转染到THP-1细胞(人单核细胞，CD45+细胞)和SH-SY5Y(神经元细胞)中。48小时后，收获细胞并分离mRNA。利用合成的cDNA，通过实时PCR分析DX2的表达。

DX2编码载体和DX2-miR142靶序列编码载体转染的SH-SY5Y之间具有相似DX2表达水平，然而DX2-miR142靶序列编码载体转染的THP-1中DX2表达显著降低。因此，miR142-3p仅在THP-1细胞中起作用(图8)。

前述特定实施方案充分地揭示了本发明的一般性质，使得可以通过应用本领域技术范围内的知识容易地做出其他修改和/或改变，以进行各种应用，而不背离本发明的一般概念。因此，基于本文提出的教导和指导，这样的改变和修改旨在涵盖在所公开的实施方案的等同形式的含义和范围内。应当理解，本文的措词或术语是出于描述而非限制的目的，因此本说明书的术语或措辞将由技术人员根据教导和指导来解释。

本发明的保护范围不应受到任何上述示例性实施方案的限制，而应仅根据所附权利要求及其等同物来限定。

本文描述的所有各个方面、实施方案和选项可以以任何和所有变型进行组合。

本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地并单独地通过引用并入。

Claims (15)

1.一种重组载体，其包含外显子2缺失的AIMP2变体(AIMP2-DX2)基因和miR-142-3p靶核酸，其中所述AIMP2-DX2基因能够在神经细胞中表达，且其中所述AIMP2-DX2基因具有编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列的核苷酸序列，所述miR-142-3p靶核酸包含SEQ ID NO:5的核苷酸序列并位于所述AIMP2-DX2的3’。

2.根据权利要求1所述的载体，其进一步包含与所述AIMP2-DX2可操作地连接的启动子。

3.权利要求2所述的载体，其中所述启动子是逆转录病毒(LTR)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、MT启动子、EF-1α启动子、UB6启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、CAG启动子、RPE65启动子或视蛋白启动子。

4.根据权利要求1所述的载体，其中所述AIMP2-DX2基因具有核苷酸序列，所述核苷酸序列编码SEQ ID NO：2的氨基酸序列。

5.根据权利要求4所述的载体，其中所述AIMP2-DX2基因具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。

6.根据权利要求1所述的载体，其中所述miR-142-3p靶核酸包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含ACACTA。

7.根据权利要求1所述的载体，其中所述miR-142-3p靶核酸重复2-10次。

8.根据权利要求1所述的载体，其中所述载体是病毒载体。

9.权利要求8所述的载体，其中所述病毒载体是腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、逆转录病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、MLV(鼠白血病病毒)、ASLV(禽肉瘤/白血病病毒)、SNV(脾坏死病毒)、RSV(劳斯肉瘤病毒)、MMTV(小鼠乳腺肿瘤病毒)或单纯疱疹病毒载体。

10.根据权利要求8所述的载体，其中所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、痘苗病毒或单纯疱疹病毒载体。

11.权利要求1-10中任一项所述的载体在制备治疗肌萎缩性侧索硬化症(ALS)或帕金森氏病的药物中的用途。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述神经元疾病是ALS。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述治疗改善运动活动或延长受试者的寿命。

14.根据权利要求11所述的用途，其中所述药物被配制为用于将所述载体施用于脑或脊髓。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述药物被配制为用于将所述载体通过立体定位注射施用至脑。