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CN113122579B - 一种慢病毒转染免疫细胞的方法 - Google Patents

一种慢病毒转染免疫细胞的方法 Download PDF

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CN113122579B CN202110403031.1A CN202110403031A CN113122579B CN 113122579 B CN113122579 B CN 113122579B CN 202110403031 A CN202110403031 A CN 202110403031A CN 113122579 B CN113122579 B CN 113122579B
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Abstract

本发明公开了一种慢病毒转染免疫细胞的方法。该方法包括在含有前列腺素E2的转染体系中采用慢病毒转染免疫细胞，所述慢病毒包括嵌合抗原受体基因转录的RNA。该方法可应用于αβT细胞、γδT细胞和NK细胞的转染，转染效率高且能减小转染对免疫细胞的影响。

Description

一种慢病毒转染免疫细胞的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种慢病毒转染免疫细胞的方法。
背景技术
CAR-T，全称是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，是指通过基因修饰技术，将带有特异性抗原识别结构域及T细胞激活信号的遗传物质(CAR)转入T淋巴细胞，使T淋巴细胞直接与肿瘤细胞表面的特异性抗原相结合而被激活。T淋巴细胞被激活后，一方面通过释放穿孔素、颗粒酶素B等直接杀伤肿瘤细胞；另一方面通过释放细胞因子，募集人体内源性免疫细胞来杀伤肿瘤细胞，以达到治疗肿瘤的目的。同时，还可形成免疫记忆T细胞，从而获得特异性的抗肿瘤长效机制。CAR-T疗法在治疗急性白血病和非霍奇金淋巴瘤上具有显著的疗效，被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。
人的T淋巴细胞按照其表面T细胞抗原受体的不同，可以分为αβT细胞和γδT细胞两大类。αβT细胞占95％左右，即为常说的T细胞。γδT细胞占T细胞的1～10％，但它发挥作用不依赖MHC识别，从而可以抵抗肿瘤的逃逸。CAR-T疗法的关键，就是要给T淋巴细胞装备上能识别特定癌细胞的CAR分子，使其能够特异性识别并杀伤癌细胞，从而达到治疗癌症的效果。但是由于需转入免疫细胞的嵌合抗原受体(CAR)的基因序列较大，导致转染效率低下，从而影响了CAR-T细胞的功能。因此寻找可提高免疫细胞特别是难转染的γδT等细胞的转染效率的助转染试剂，对于临床治疗具有重要意义。
CAR-NK疗法是一种基于自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)的过继性细胞疗法，利用基因改造技术，将为T细胞定位导航的CAR(嵌合抗原受体)分子用于修饰NK细胞，形成CAR-NK杂交细胞。NK细胞是机体重要的免疫细胞，与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关。由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，因此称为自然杀伤活性，与γδT细胞的作用相似，且同样难以转染，
而传统的助转染试剂如Polybrene、PS(Protamine Sulfate)等在免疫细胞上不能获得高的转染效率，因此需要发现更有效的方法进行转染。
发明内容
本发明提供了一种慢病毒转染免疫细胞的方法，所述方法包括在含有前列腺素E2的转染体系中采用慢病毒转染免疫细胞，所述慢病毒包括嵌合抗原受体基因转录的RNA。
所述转染体系还可包括无血清培养基。所述无血清培养基由KBM581和IL-2组成。所述IL-2在所述无血清培养基中的含量为200IU/ml。
所述前列腺素E2在所述转染体系中的浓度例如为0.5-2μM。
可选地，所述免疫细胞的数量与所述转染体系比例为3×105个-5×105个：500μL。
所述慢病毒在所述免疫细胞表达所述嵌合抗原受体基因。嵌合抗原受体基因即为CAR基因。所述CAR基因表达嵌合抗原受体。该嵌合抗原受体靶向的抗原包括但不限于CD19、CD20、CD22、CD30、HER2、GD2、EGFR、EGFRvIII、EphA2、IL13Ra2、CD133、ROR1、IGF1R和/或L1CAM。
例如，所述CAR基因编码的蛋白质包括单链抗体、胞外铰链区(例如CD8a铰链区)、跨膜区(例如CD8a跨膜区)和胞内区(例如4-1BB、CD3ζ)。根据需要，所述CAR基因编码的蛋白质还可包括T2A肽、tEGFR蛋白。例如，所述CAR基因编码的蛋白质包括单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内区、T2A肽和tEGFR蛋白连接而成。进一步，所述CAR基因编码的蛋白质可由单链抗体、胞外铰链区、跨膜区、胞内区、T2A肽和tEGFR蛋白连接而成。在本发明的一个实施例中，所述CAR基因的序列如SEQ IDNo.1所示。
可选地，根据上述的方法，所述免疫细胞为NK细胞或T淋巴细胞；所述T淋巴细胞为αβT细胞或γδT细胞。
所述免疫细胞为NK细胞或γδT细胞，所述方法可包括如下步骤：
(1)活化培养：采用活化培养基在培养板上培养所述免疫细胞，所述活化培养基包括KBM581、OK432、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-21和10％自体血浆，所述培养板包被活化抗体。活化培养的时间可为2-8天，例如培养2、3、4、5、6、7、8天。所述免疫细胞为NK细胞，活化培养时间可为8天。所述免疫细胞为γδT细胞，活化培养时间可为6天。所述免疫细胞为NK细胞，所述抗体可为Anti-CD16单克隆抗体。
所述免疫细胞为γδT细胞，所述抗体可为抗γδTCR抗体，例如为Biolegend的Purifiedanti-human g/d TCR，货号为331204。
(2)转染：采用所述慢病毒转染所述活化培养后的免疫细胞。转染时间例如为1天。转染方法可为32-35℃，离心所述转染体系。所述慢病毒转染时用量为MOI＝2-50。所述免疫细胞为NK细胞或γδT细胞，慢病毒转染时用量可为MOI＝50。所述免疫细胞为αβT细胞，慢病毒转染时用量可为MOI＝2。
(3)扩增培养：采用扩增培养基培养转染后的免疫细胞，所述扩增培养基包括KBM581、IL-2和5％自体血浆。
所述活化培养基可由KBM581、OK432、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-21、10％自体血浆(灭活)组成。OK432在所述活化培养基中的含量可为80-120ng/mL(如100ng/ml)，IFN-γ在所述活化培养基中的含量可为800-1200IU/mL(如1000IU/mL)，IL-2在所述活化培养基中的含量可为500-1500IU/mL(如1000IU/mL)，IL-15在所述活化培养基中的含量可为80-120ng/mL(如100ng/mL)，IL-21在所述活化培养基中的含量可为80-120ng/mL(如100ng/mL)，自体血浆(灭活)在所述活化培养基中的含量可为10体积％。
所述扩增培养基可由KBM581、IL-2、5％自体血浆组成。IL-2在所述扩增培养基中的含量可为1000IU/mL，自体血浆(灭活)在所述扩增培养基中的含量可为5体积％。
前列腺素E2的应用也属于本发明的保护范围之内。该应用具体是指在如下A1)-A6)中至少一种中的应用，
A1)在提高慢病毒对免疫细胞的转染率中的应用；
A2)在制备提高慢病毒对免疫细胞的转染率的产品中的应用；
A3)在制各重组免疫细胞中的应用，所述重组免疫细胞为CAR-αβT细胞、CAR-γδT细胞和/或CAR-NK细胞；
A4)在制备所述重组免疫细胞的产品中的应用；
A5)在促进免疫细胞扩增中的应用；
A6)在制备促进免疫细胞扩增的产品中的应用。
可选地，在上述应用中，所述重组免疫细胞可包括嵌合抗原受体基因。该重组免疫细胞表达所述嵌合抗原受体基因编码的嵌合抗原受体。
可选地，在上述应用中，所述免疫细胞为NK细胞或T淋巴细胞；所述T淋巴细胞为αβT细胞或γδT细胞。
本发明采用4种化合物的使用来增强免疫细胞的转导，期望在一定数量外周血或者脐带血中能够制备出足够的CAR阳性细胞用于临床治疗。经过实验研究表明，PGE2可在减小转染对细胞状态影响的同时，又保证转染后细胞的阳性率。
综上所述，本发明提供了一种慢病毒转染免疫细胞的方法，可应用于αβT细胞、γδT细胞和NK细胞的转染，转染效率高且能减小转染对免疫细胞的影响。
附图说明
图1为实施例2使用四种助转染试剂在外周血来源αβT细胞上的代表性流式检测结果。
图2为实施例2使用四种助转染试剂转染率统计图。
图3为实施例2使用四种助转染试剂细胞活率统计图。
图4为实施例2PS组和PGE2组的细胞扩增曲线。
图5为实施例3使用四种助转染试剂在外周血来源γδT细胞上的代表性流式检测结果。
图6为实施例3使用四种助转染试剂转染率统计图。
图7为实施例3使用四种助转染试剂细胞活率统计图。
图8为实施例3PS组和PGE2组的细胞扩增曲线。
图9为实施例4使用四种助转染试剂在脐带血来源γδT细胞上的代表性流式检测结果。
图10为实施例4使用四种助转染试剂转染率统计图。
图11为实施例4使用四种助转染试剂细胞活率统计图。
图12为实施例4PS组和PGE2组的细胞扩增曲线。
图13A为实施例5NK细胞纯度变化代表性流式图。
图13B为实施例5NK细胞所占比例变化统计结果。
图14为实施例5使用四种助转染试剂在脐带血来源NK细胞上代表性流式图。
图15为实施例5使用四种助转染试剂转染率统计图。
图16为实施例5使用四种助转染试剂细胞活率统计图。
图17为实施例5PS组和PGE2组的细胞扩增曲线。
图18为实施例6脐带血来源γδT细胞转染时间优化实验结果图。
图19为实施例6脐带血来源NK细胞转染时间优化实验结果图。
其中，***为p＜0.001，**为p＜0.01，*为p＜0.05，ns为没有统计学差异。
具体实施方式
动物病毒：公众按照国家生物安全的有关规定可从申请人获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
采用GraphPad Prism8统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用ttest检验。
下述实施例所使用的试剂以及试剂盒具体如表1。
表1试剂以及试剂盒
Figure BDA0003019828100000051
下述实施例中使用的助转染试剂具体如下：
(1)PS生产厂家：悦康药业集团有限公司产品，货号为H11020246，全称ProtamineSuLfate injection，硫酸鱼精蛋白注射液；
(2)PGE2生产厂家：MedChemExpress，货号363-24-6，全称Prostaglandin E2，前列腺素E2；
(3)P407生产厂家：大连美仑生物技术有限公司，货号为HY-D1005，全称Poloxamer407，泊洛沙姆407；
(4)Stau生产厂家：MedChemExpress，货号为41248，全称Staurosporine，星孢菌素。
实施例1
材料与方法
1、PBMC(外周血单个核细胞)和CBMC(脐带血单个核细胞)的获得：
取健康人的外周血或脐带血，室温下，加入等体积的生理盐水稀释，缓慢地沿离心管壁加入淋巴细胞分离液中，使稀释血与淋巴细胞分离液的比例为2：1。2000rpm(相当于872g)，离心20min，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分液层、单个核细胞层、血浆层。吸出单个核细胞层放入新的离心管中，加入不少于单个核细胞层体积3倍的生理盐水洗涤细胞，2000rpm，5min，两次，细胞计数。获得PBMC或CBMC。
2、αβT细胞的分选及培养：
2.1使用MACS的CD3分选试剂盒进行αβT细胞的分选
(1)配置0.5％HSA缓冲液，配方为1.25mLHSA+48.75mLDPBS；
(2)将上述获得的CBMC或PBMC 2000r/min，离心5min，弃上清，加入80uL/1×107缓冲液重悬CBMC或PBMC；
(3)加入20uL/1×107CD3磁珠，混匀，4℃孵育15min，每5min摇匀一次；
(4)加入1-2mL/1×107缓冲液清洗细胞，2000r/min，离心5min，弃上清；
(5)细胞数量低于1×108加入500uL缓冲液，数量高于1×108，按比例增加缓冲液，重悬细胞。
(6)准备磁力分选柱，用3mL缓冲液润洗柱子1次，加入500uL细胞悬液分选细胞，再加入3mL缓冲液清洗柱子2次，分选阳性细胞即为αβT细胞。
(7)细胞计数：
将细胞混匀，取样进行台盼蓝染色计数。
2.2αβT细胞培养：
将上述分选出来的αβT细胞接种于24孔板上，接种浓度为3x105个/孔/500ul。在37℃5％C02培养箱中培养。
培养基由KBM581、IL-2组成。IL-2在所述培养基中的含量为200IU/mL。
3γδT细胞的分选及培养
3.1使用MACS的Human TCR γδ分选试剂盒进行γδT细胞的分选
(1)配置0.5％HSA缓冲液，配方为1.25mLHSA+48.75mLDPBS；
(2)将上述获得的CBMC或PBMC 2000r/min，离心5min，弃上清，加入80uL/1×107缓冲液重悬CBMC或PBMC；
(3)加入20uL/1×107Biotin-Antibody Cocktail，混匀，4℃孵育10min，每5min摇匀一次；
(4)加入1-2mL/1×107缓冲液清洗细胞，2000r/min，离心5min，弃上清；
(5)加入80uL/1×107缓冲液重悬细胞和20uL/1×107Anti-Biotin MicroBeads，混匀后，4℃孵育15min，每5min摇匀一次；
(6)加入1-2mL/1×107缓冲液清洗细胞，2000r/min，离心5min，弃上清；
(7)细胞数量低于1×108加入500uL缓冲液，数量高于1×108，按比例增加缓冲液，重悬细胞。
(8)准备磁力分选柱，用3mL缓冲液润洗柱子1次，加入500uL细胞悬液分选细胞，再加入3mL缓冲液清洗柱子2次，分选阴性细胞即为γδT细胞。
(9)细胞计数：
将细胞混匀，取样进行台盼蓝染色计数，取1x105个细胞进行流式检测，剩余细胞进行接种。
3.2γδT细胞的培养
采用抗体包被96孔板，具体包被方法为二抗包被；Anti-mouse 1gG工作浓度为10ug/mL，96孔板每孔100uL抗体稀释液，37℃孵育1h，弃掉二抗，加入DPBS清洗96孔板；一抗包被：Purified anti-human g/d TCR(BI)工作浓度为100ng/mL，96孔板每孔100uL抗体稀释液，室温孵育1h，弃掉一抗，加入200uL/孔DPBS浸泡96孔板备用。
将上述分选出来的γδT细胞接种于抗体包被的96孔板上，接种浓度为1.5x105个/孔/200ul。在37℃5％CO2培养箱中培养，培养前6天使用活化培养基，第7天以后全部使用扩增培养基。
活化培养基由KBM581、OK432、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-21、10％自体血浆(灭活)组成。OK432在所述活化培养基中的含量为100ng/mL，IFN-γ在所述活化培养基中的含量为1000IU/mL，IL-2在所述活化培养基中的含量为1000IU/mL，IL-15在所述活化培养基中的含量为100ng/mL，IL-21在所述活化培养基中的含量为100ng/mL，自体血浆(灭活)在所述活化培养基中的含量为10体积％。扩增培养基由KBM581、IL-2、5％自体血浆组成。IL-2在所述扩增培养基中的含量为1000IU/mL，自体血浆(灭活)在所述扩增培养基中的含量为5体积％。
4CD4-CD8-细胞的分选及培养
4.1使用MACS的CD4、CD8分选试剂盒进行CD4-CD8-细胞的分选
(1)配置0.5％HSA缓冲液，配方为1.25mLHSA+48.75mLDPBS；
(2)将CBMC或PBMC 2000r/min，离心5min，弃上清，加入80uL/1×107缓冲液重悬CBMC；
(3)加入20uL/1×107CD4和CD8磁珠，混匀，4℃孵育15min，每5min摇匀一次；
(4)加入1-2mL/1×107缓冲液清洗细胞，2000r/min，离心5min，弃上清；
(5)细胞数量低于1×108加入500uL缓冲液，数量高于1×108，按比例增加缓冲液，重悬细胞。
(6)准备磁力分选柱，用3mL缓冲液润洗柱子1次，加入500uL细胞悬液分选细胞，再加入3mL缓冲液清洗柱子2次，收集阴性细胞，即为CD4-CD8-细胞。
(7)细胞计数：
将细胞混匀，取样进行台盼蓝染色计数。接种浓度为2x106个/孔/1mL。
4.2CD4-CD8-细胞的培养
采用抗体包被24孔板，具体包被方法为；Anti-CD16，工作浓度为1ug/mL，24孔板每孔300uL抗体稀释液，37℃孵育1h，弃掉抗体，加入300uL/孔DPBS浸泡24孔板备用。
将上述分选出来的细胞接种于抗体包被的24孔板上，接种浓度为1x106个/孔/500ul。在37℃5％CO2培养箱中培养，培养前6天使用活化培养基，第7天以后全部使用扩增培养基。
活化培养基由KBM581、OK432、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-21、10％自体血浆(灭活)组成。OK432在所述活化培养基中的含量为100ng/mL，IFN-γ在所述活化培养基中的含量为1000IU/mL，IL-2在所述活化培养基中的含量为1000IU/mL，IL-15在所述活化培养基中的含量为100ng/mL，IL-21在所述活化培养基中的含量为100ng/mL，自体血浆(灭活)在所述活化培养基中的含量为10体积％。扩增培养基由KBM581、IL-2、5％自体血浆(灭活)组成。IL-2在所述扩增培养基中的含量为1000IU/mL，自体血浆(灭活)在所述扩增培养基中的含量为5体积％。
在CD16抗体和细胞因子的作用下使分选出的CD4-CD8-细胞向NK细胞转化，转染前采用流式法检测NK细胞的纯度比例，所用抗体为：7AAD、CD56-FITC、CD3-APC。
5、慢病毒包装：
(1)细胞铺板：
A.将含有10％胎牛血清的DMEM、PBS及TrypLETM EXPRESS放于37℃5％CO2的细胞培养箱中预热30min。
B.将已长到80％-90％的293FT，用PBS清洗细胞一次，每个T175的细胞培养瓶中加入2mL TrypLETM EXPRESS，让其充分平铺于细胞表面，盖好瓶盖，将其放在显微镜下观察，直至细胞变圆，加入4mL含有10％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，用移液管将瓶壁细胞吹下，将细胞液转移至15mL无菌离心管中，1500rpm离心5min，弃上清，重悬细胞并计数。
C.293FT细胞以9×106个/145mm平皿接种，每个145mm平皿加20mL DMEM完全培养基，摇晃均匀，放置37℃5％CO2的细胞培养箱中继续培养。
(2)质粒包装：铺板第二天进行质粒包装。
A.将
Figure BDA0003019828100000091
buffer、
Figure BDA0003019828100000092
四种质粒pMD2.G、pMDLg/pRRE、pRSV/REV、U6-SR8-MND1904质粒恢复室温。其中，pMD2.G、pMDLg/pRRE、pRSV/REV三种辅助质粒从武汉淼灵公司购买。U6-SR8-MND1904质粒按照如下方法构建得到：
将SEQ ID No.1所示的CAR基因，克隆到pLenti的载体(Addgene)的多克隆位点的限制性内切酶Cla I和Spe I的识别位点间，即得U6-SR8-MND1904质粒。SEQ ID No.1中，第1-249位是U6启动子的核苷酸序列，第252-310位是SRb2m-8编码基因的核苷酸序列，第311-710位是MND启动子的核苷酸序列，第711-718位为限制性酶切Pac I的识别位点序列，第719-724位为Kozak序列，第725-790位是集落刺激因子信号肽序列，第791-1525位是抗CD19的单链抗体(anti-CD19VH-linker-anti-CD19VL)的核苷酸序列，第1526-1735位是CD8a铰链区及跨膜区的核苷酸序列，第1736-1861位是4-1BB的核苷酸序列，第1862-2191位是CD3ζ的核苷酸序列，第2207-2260位是T2A的核苷酸序列，第2261-3334位是tEGFR的核苷酸序列。
B.按每个145mm平皿1.25mL
Figure BDA0003019828100000093
buffer、15μg U6-SR8-MND1904质粒、7.5μg psPAX2、3.75μg pMD2.G的量将以上溶液混合均匀。向混合液中加入
Figure BDA0003019828100000094
62.5μL/145mm平皿，再次混合均匀，室温静置10min。
C.将用于包装病毒的293FT细胞从37℃ 5％CO2的细胞培养箱中取出，先用75％的酒精喷洒于细胞培养皿表面，再放入安全柜中，将上述混合液平均分配到145mm平皿的培养基中，轻轻摇匀，放入37℃ 5％CO2培养箱中。
3、换液
包装4h后，弃旧培养基，加入5mL已预热的PBS清洗细胞，再加入20mL新鲜的已预热的含10％胎牛血清的DMEM培养基，放入37℃ 5％CO2培养箱中。
4、收集病毒
A.质粒包装后48h-72h收取病毒原液。将原液收集到50ml离心管中，1500rpm离心5min。
B.将上清留出1mL用于病毒相关检测。剩余用0.45μm滤器过滤到新的离心管中，4℃ 18300g高速离心2h。
C.尽可能将上清液弃干净，加入无血清培养基重悬病毒颗粒。加入的培养基体积∶病毒原液体积＝1∶500，获得病毒浓缩液。将浓缩液分装保存于-80℃冰箱。该病毒浓缩液即为慢病毒U6-SR8-MND1904。慢病毒U6-SR8-MND1904包括CAR基因(嵌合抗原受体基因)。慢病毒U6-SR8-MND1904在免疫细胞表达SEQ ID No.1所示的CAR基因。
实施例2慢病毒转染外周血来源的αβT细胞
采用实施例1中培养2天的外周血来源αβT细胞，分为PS组、PGE2组、P407组和Stau组。按照3×105个/孔接种于24孔板中，每孔加入无血清培养基(KBM581+200IU/ml IL-2)，按照MOI＝2的用量加入实施例1制备的病毒浓缩液U6-SR8-MND1904，PS组、PGE2组、P407组和Stau组分别按照PS 8μg/ml，PGE21μM，P407100μg/mL，Stau 200nM的浓度加入不同的助转染试剂，体系终体积为500ul/孔。35℃2000rpm离心2h，取出后放入37℃，5％CO2培养，培养基为KBM581+200IU/ml IL-2，96h后测试。
采用流式细胞仪检测转染效率，具体使用的抗体为EGFR-APC、CD3-APC-cy7、CD4-FITC、CD8-PB、7AAD、SA-PE。采用台盼蓝染色进行细胞计数。
实验结果参见图1-图4。图1为四种助转染试剂在外周血来源αβT细胞上代表性流式图，图中PS、PGE2、P407、Stau助转染试剂的转染率分别为：66.00％、85.10％、34.29％、60.00％。图2为为外周血来源的αβT细胞转染率统计结果，PS、PGE2、P407、Stau助转染试剂的平均转染率分别为：50.33％、77.33％、33.67％、60.00％。图3为为细胞活率统计结果，使用PS、PGE2、P407、Stau转染后细胞的平均活率分别为：97.13％、98.03％、81.33％、69.67％。图4为助转染试剂PS和PGE2转染后细胞的扩增曲线，PS转染后当天(D0)、第四天(D4)、第七天(D7)、第十天(D10)、第十二天(D12)、第十四天(D14)扩增倍数分别为1、3.01、29、72.67、101、94；PGE2转染后D0、D4、D7、D10、D12、D14扩增倍数分别为1、4.9、54、105.3、133、131。
本实施例说明助转染试剂PGE2和Stau可显著提升外周血来源的αβT细胞的转染效率，但加入Stau助转染试剂后细胞活率明显降低，提示该助转染试剂对细胞的毒性较大；而PGE2助转染试剂不仅没有降低细胞活率，而且更利于细胞生长。
实施例3慢病毒转染外周血来源的γδT细胞
采用实施例1中培养6天的外周血来源的γδT细胞，分为PS组、PGE2组、P407组和Stau组。按照1×106个/mL的浓度接种细胞，培养基为无血清培养基(KBM581+1000IU/mlIL-2)，按照MOI＝50的用量加入实施例1制各的病毒浓缩液U6-SR8-MND1904，PS组、PGE2组、P407组和Stau组分别按照PS 8μg/ml，PGE2 1μM，P407 100μg/mL，Stau 200nM的浓度加入不同的助转染试剂，体系终体积为500μl/孔。35℃离心2小时后继续培养。次日，将培养基更换为实施例1所述的扩增培养基。转染后96h，取样进行检测。
采用流式细胞仪检测转染效率，具体使用的抗体为CD3-APC-Cy7、TCR αβPE-cy7、EGFR-APC、7AAD。采用台盼蓝染色进行细胞计数。
实验结果如图5-图8。图5为其中一次转染率的流式检测结果，图中PS、PGE2、P407、Stau助转染试剂的转染率分别为：16.6％、23.8％、15.8％、23.3％。图6为外周血来源的γδT细胞转染率统计结果，PS、PGE2、P407、Stau助转染试剂的平均转染率分别为：17.2％、23.7％、13.05％、26.60％。图7为转染96h后，各组细胞活率统计结果，PS、PGE2、P407、Stau转染后细胞的平均活率分别为：94.78％、95.53％、88.50％、32.95％。图8为助转染试剂PS和PGE2转染后细胞的扩增曲线，PS转染后当天(D0)、第四天(D4)、第八天(D8)、第十二天(D12)、第十八天(D18)扩增倍数分别为1、9.23、25.79、25.59、21.63；PGE2转染后D0、D4、D8、D12、D18扩增倍数分别为1、13.80、39.80、48.63、38.33。
本实施例证明助转染试剂PGE2和Stau可显著提升外周血来源的γδT细胞的转染效率，但加入Stau助转染试剂后细胞活率明显降低，提示该助转染试剂对细胞的毒性较大；而PGE2助转染试剂不仅没有降低细胞活率，而且更利于细胞生长。
实施例4慢病毒转染脐带血来源的γδT细胞
采用实施例1中培养6天的脐带血来源的γδT细胞，分为PS组、PGE2组、P407组和Stau组。按照1×106个/mL的浓度接种细胞，培养基为无血清培养基(KBM581+1000IU/mlIL-2)，按照MOI＝50的用量加入实施例1制备的病毒浓缩液U6-SR8-MND1904，PS组、PGE2组、P407组和Stau组分别按照PS 8μg/ml，PGE2 1μM，P407 100μg/mL，Stau 200nM的浓度加入不同的助转染试剂，体系终体积为500μl/孔。35℃离心2小时后继续培养。次日，将培养基更换为实施例1所述的扩增培养基。转染后96h，取样进行检测。
采用流式细胞仪检测转染效率，具体使用的抗体为CD3-APC-Cy7、TCR αβPE-cy7、EGFR-APC、7AAD。采用台盼蓝染色进行细胞计数。
实验结果如图9-图12。图9为脐带血来源的γδT细胞转染率的代表性流式检测结果，图中PS、PGE2、P407、Stau助转染试剂的转染率分别为：46.0％、66.5％、48.8％、68.4％。图10为脐带血来源的γδT细胞转染率统计结果，PS、PGE2、P407、Stau助转染试剂的平均转染率分别为：45.47％、68.1％、48.27％、69.87％。图11为细胞活率统计结果，PS、PGE2、P407、Stau转染后细胞的平均活率分别为：98.75％、97.72％、79.33％、34.00％。图12为助转染试剂PS和PGE2转染后细胞的扩增曲线，PS转染后当天(D0)、第四天(D4)、第八天(D8)、第十二天(D12)、第十八天(D18)、第二十二天(D22)扩增倍数分别为1、10.20、24.50、50.73、92.00、120.33；PGE2转染后D0、D4、D8、D12、D18、D22扩增倍数分别为1、14.17、49.93、111.77、227.72、178.43。
脐带血来源的γδT的转染率整体高于外周血来源的γδT的转染率(实施例3)，但四种助转染试剂的转染效率与外周血趋势相同，同样显示了PGE2为更加合适的转染试剂。
实施例5慢病毒转染脐带血来源的NK细胞
采用实施例1中培养8天的脐带血来源的CD4和CD8分选阴性细胞，转染前检测NK细胞的纯度，转染时分为PS组、PGE2组、P407组和Stau组。按照1×106个/mL的浓度接种细胞，培养基为无血清培养基(KBM581+1000IU/ml IL-2)，按照MOI＝50的用量加入实施例1制备的病毒浓缩液U6-SR8-MND1904，PS组、PGE2组、P407组和Stau组分别按照PS 8μg/ml，PGE2 1μM，P407 100μg/mL，Stau 200nM的浓度加入不同的助转染试剂，体系终体积为500ul/孔。35℃离心2小时后继续培养。次日，将培养基更换为实施例1所述的扩增培养基。转染后96h，取样进行检测。
采用流式细胞仪检测转染效率，具体使用的抗体为CD3-APC-Cy7、CD56-PE、EGFR-APC、7AAD。采用台盼蓝染色进行细胞计数。
实验结果如图13A-图17。图13A为脐带血来源的CD4-CD8-细胞中NK细胞所占比例变化流式图，图中分别在培养当天(D0)、培养7天(D7)、培养14天(D14)、培养21天(D21)取细胞检测NK所占比例为28.2％、60.9％、87.6％、96.6％。图13B为脐带血来源的CD4-CD8-细胞中NK细胞所占比例变化统计结果，D0、D7、D14、D21检测细胞中NK所占平均比例为25.23％、61.83％、83.77％、96.47％。图14为脐带血来源的NK细胞转染率检测的代表性流式图，图中PS、PGE2、P407、Stau助转染试剂的转染率分别为：20.2％、45.0％、23.7％、45.7％。图15为脐带血来源的NK细胞转染率统计结果，PS、PGE2、P407、Stau助转染试剂的平均转染率分别为：21.20％、44.50％、23.07％、45.00％。图16为细胞活率统计结果，PS、PGE2、P407、Stau转染后细胞的平均活率分别为：96.77％、96.40％、79.10％、32.43％。图17为助转染试剂PS和PGE2转染后细胞的扩增曲线，PS转染后当天(D0)、第七天(D7)、第十四天(D14)、第二十一天(D21)、第二十八天(D28)扩增倍数分别为1、8.50、36.00、53.17、45.13；PGE2转染后D0、D7、D14、D21、D28扩增倍数分别为1、12.83、55.50、69.67、69.97。
该实施例说明PGE2对NK细胞的转染也存在促进作用。
实施例6转染时间优化
一、脐带血来源的γδT细胞转染时间的优化
分别收集实施例1培养5天(D5)、6天(D6)、7天(D7)、8天(D8)、9天(D9)的γδT细胞，更换为转染培养基(KBM581+200IU/ml IL-2)；按照1×106个/mL的浓度接种细胞，加入助转染试剂PGE2，使用浓度1μM，按照MOI＝50的用量加入实施例6制备的慢病毒PLV_M1904，32℃2000rpm离心2h；次日，将培养基更换为实施例1所述扩增培养基；转染后第四天进行采样流式检测转染率，检测所用抗体为CD3-APC-Cy7、TCR αβ PE-cy7、EGFR-APC、7AAD。
试验重复次数为3，数据处理为平均值±标准差。
结果如图18所示，γδT细胞分别在培养的D5、D6、D7、D8、D9进行转染，其平均转染率(平均值)分别为5.1％、34.2％、27.87％、22.03％、9.4％，故D6为γδT细胞转染的最适时间。
二、脐带血来源的NK细胞转染时间的优化
分别收集实施例1中培养5天(D5)、8天(D8)、11天(D11)的脐带血来源的CD4和CD8分选阴性细胞，转染前检测NK细胞的纯度。分别按照1×106个/mL的浓度接种细胞，培养基为无血清培养基(KBM581+1000IU/ml IL-2)，按照MOI＝50的用量加入实施例1制备的病毒浓缩液U6-SR8-MND1904，按照PGE2 1μM的浓度加入助转染试剂，体系终体积为500ul/孔。35℃离心2小时后继续培养。次日，将培养基更换为实施例1所述的扩增培养基。转染后96h，取样进行检测。
采用流式细胞仪检测转染效率，具体使用的抗体为CD3-APC-Cy7、CD56-PE、EGFR-APC、7AAD。
结果如图19所示，NK细胞分别在培养的D5、D8、D11进行转染，其平均转染率分别为18.83％、23.8％、16.10％，故D8为NK细胞转染的最适时间。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 河北森朗生物科技有限公司
<120> 一种慢病毒转染免疫细胞的方法
<130> 211274
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3337
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60
ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120
aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180
atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240
cgaaacaccg gcagcagaga atggaaagtc aactcgagtt gactttccat tctctgctgt 300
ttttgaattc ttttatttag tctccagaaa aaggggggaa tgaaagaccc cacctgtagg 360
tttggcaagc taggatcaag gttaggaaca gagagacagc agaatatggg ccaaacagga 420
tatctgtggt aagcagttcc tgccccggct cagggccaag aacagttgga acagcagaat 480
atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc cggctcaggg ccaagaacag 540
atggtcccca gatgcggtcc cgccctcagc agtttctaga gaaccatcag atgtttccag 600
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ctcgcttctg ttcgcgcgct tctgctcccc gagctcaata aaagagccca ttaattaagc 720
caccatgctg ctgctggtga ccagcctgct gctgtgcgag ctgccccacc ccgcctttct 780
gctgatcccc gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga 840
ccgggtgacc atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca 900
gcagaagccc gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg 960
cgtgcccagc cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa 1020
cctggaacag gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac 1080
ctttggcggc ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg 1140
cagcggcgag ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt 1200
ggcccccagc cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta 1260
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ctactactgc gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca 1500
gggcaccagc gtgaccgtga gcagcactac cccagcaccg cggccaccca ccccggctcc 1560
taccatcgcc tcccagcctc tgtccctgcg tccggaggca tgtagacccg cagctggtgg 1620
ggccgtgcat acccggggtc ttgacttcgc ctgcgatatc tacatttggg cccctctggc 1680
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ccaaaaggat aagatggcag aagcctatag cgagattggt atgaaagggg aacgcagaag 2100
aggcaaaggc cacgacggac tgtaccaggg actcagcacc gccaccaagg acacctatga 2160
cgctcttcac atgcaggccc tgccgcctcg gctcgagggc ggcggagagg gcagaggaag 2220
tcttctaaca tgcggtgacg tggaggagaa tcccggccct aggatgcttc tcctggtgac 2280
aagccttctg ctctgtgagt taccacaccc agcattcctc ctgatcccac gcaaagtgtg 2340
taacggaata ggtattggtg aatttaaaga ctcactctcc ataaatgcta cgaatattaa 2400
acacttcaaa aactgcacct ccatcagtgg cgatctccac atcctgccgg tggcatttag 2460
gggtgactcc ttcacacata ctcctcctct ggatccacag gaactggata ttctgaaaac 2520
cgtaaaggaa atcacagggt ttttgctgat tcaggcttgg cctgaaaaca ggacggacct 2580
ccatgccttt gagaacctag aaatcatacg cggcaggacc aagcaacatg gtcagttttc 2640
tcttgcagtc gtcagcctga acataacatc cttgggatta cgctccctca aggagataag 2700
tgatggagat gtgataattt ccggaaacaa aaatttgtgc tatgcaaata caataaactg 2760
gaaaaaactg tttgggacct ccggtcagaa aaccaaaatt ataagcaaca gaggtgaaaa 2820
cagctgcaag gccacaggcc aggtctgcca tgccttgtgc tcccccgagg gctgctgggg 2880
cccggagccc agggactgcg tctcttgccg gaatgtcagc cgaggcaggg aatgcgtgga 2940
caagtgcaac cttctggagg gtgagccaag ggagtttgtg gagaactctg agtgcataca 3000
gtgccaccca gagtgcctgc ctcaggccat gaacatcacc tgcacaggac ggggaccaga 3060
caactgtatc cagtgtgccc actacattga cggcccccac tgcgtcaaga cctgcccggc 3120
aggagtcatg ggagaaaaca acaccctggt ctggaagtac gcagacgccg gccatgtgtg 3180
ccacctgtgc catccaaact gcacctacgg atgcactggg ccaggtcttg aaggctgtcc 3240
aacgaatggg cctaagatcc cgtccatcgc cactgggatg gtgggggccc tcctcttgct 3300
gctggtggtg gccctgggga tcggcctctt catgtga 3337

Claims (9)

1.一种在体外的慢病毒转染免疫细胞的方法，其特征在于：所述方法包括在含有前列腺素E2的转染体系中采用慢病毒转染免疫细胞，所述慢病毒包括嵌合抗原受体基因转录的RNA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述免疫细胞为NK细胞或T淋巴细胞；所述T淋巴细胞为αβT细胞或γδT细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述免疫细胞为NK细胞或γδT细胞，所述方法包括如下步骤：
（1）活化培养：采用活化培养基在培养板上培养所述免疫细胞，所述活化培养基包括KBM581、OK432、IFN-γ、IL-2、IL-15、IL-21和10%自体血浆，所述培养板包被活化抗体；
（2）转染：采用所述慢病毒转染所述活化培养后的免疫细胞；
（3）扩增培养：采用扩增培养基培养转染后的免疫细胞，所述扩增培养基包括KBM581、IL-2和5%自体血浆。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（1）活化培养的时间为2-8天。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述前列腺素E2在所述转染体系中的浓度为0.5-2μM。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述慢病毒转染时用量为MOI=2-50。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述转染体系还包括无血清培养基，所述无血清培养基由KBM581和IL-2组成。
8.前列腺素E2在如下A1）或A2）中的应用，
A1）在提高在体外的慢病毒对免疫细胞的转染率中的应用；
A2）在制备提高慢病毒对免疫细胞的转染率的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述免疫细胞为NK细胞或T淋巴细胞；所述T淋巴细胞为αβT细胞或γδT细胞。
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