CN112877317A

CN112877317A - 一种嗜热栖热菌光裂合酶及其提取方法与应用

Info

Publication number: CN112877317A
Application number: CN202110103205.2A
Authority: CN
Inventors: 张齐; 肖巧学; 崔玉矫; 周帅印; 林冬明; 钟舜庆
Original assignee: Taiyuan Guangzhou Biotechnology Co ltd
Current assignee: Taiyuan Guangzhou Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-01-26
Filing date: 2021-01-26
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2041-01-26
Also published as: CN112877317B

Abstract

本发明属于生物活性酶提取技术领域，特别涉及一种嗜热栖热菌光裂合酶及其提取方法与应用。本发明将嗜热栖热菌菌体与磷酸盐缓冲液混合，然后采用高压均质机进行菌体破碎，其中，压力为400～800bar，均质1～2次，得到破碎液；然后将破碎液加入过滤介质过滤或者直接高速离心，得到清液；清液通过肝素柱进行进一步分离纯化，得到耐热栖热菌光裂合酶。本发明得到的耐热栖热菌光裂合酶纯度高，可达到95％，具有很好的热耐受性和稳定性，80℃高温48h依旧能保留大部分生物活性。

Description

一种嗜热栖热菌光裂合酶及其提取方法与应用

技术领域

本发明属于生物活性酶提取技术领域，特别涉及一种嗜热栖热菌光裂合酶及其提取方法与应用。

背景技术

随着人口老龄化进程的发展，光老化受到了越来越多人的关注。人体皮肤长时间暴露于太阳光下，会加速皮肤衰老，这当中最主要的因素便是紫外线。对人体皮肤造成实际危害的太阳紫外线主要是UVA与UVB。其中，UVA波长在400～315nm之间，它对衣物和人体皮肤的穿透性比UVB要强，可达到真皮深处，可诱导皮肤生成黑色素，起到了防御紫外线保护皮肤的作用。但过量的UVA，也可导致皮肤老化和损害。UVB波长在320～280nm之间，它对人体皮肤有一定的生理作用。此类紫外线的大部分都会被皮肤表皮所吸收，不能渗入皮肤内部。但由于其阶能较高，容易对DNA等核酸类遗传物质造成损伤，长久照射皮肤会出现红斑、炎症、皮肤老化，严重的甚至可引起皮肤癌。

光裂合酶(Photolyase)是一类具有DNA损伤修复功能的酶，广泛存在于原核和真核生物中。它通过吸收UVA的能量将其用于修复因UVB照射损伤而形成的嘧啶二聚体。光裂合酶与嘧啶二聚体以酶与底物相结合的方式进行结合，在电子传递链的参与下，经历光激发态与电子传递，对二聚体进行修复(Thiagarajan V.,et al.Kinetics of cyclobutanethymine dimer splitting by DNA photolyase directly monitored in theUV.PNAS.2011.108(23):9402-9407)。中国发明专利CN1297249C采用的光裂合酶来源于浮游生物提取物；中国发明专利CN103160488B将重组南极冰藻光修复酶应用于保健品、化妆品、生物医药等相关领域以主动修复由紫外线引起病症。以上光裂合酶稳定性较差，很容易失活，是这类产品应用的瓶颈问题。

嗜热栖热菌是一类能耐受高温的微生物，能在极端的条件下生存，如火山口、温泉等。在自然演变过程中，拥有一套抵御高温的存活机制。中国发明专利CN108553403B将嗜热栖热菌与酵母菌组合发酵物用于皮肤护理，但并未提及具体活性成分或有效成分，而且光裂合酶的含量很低，很难有针对性地发挥其应有的功效。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种嗜热栖热菌光裂合酶的提取方法。

本发明的另一目的在于提供上述提取方法提取得到的嗜热栖热菌光裂合酶。

本发明的再一目的在于提供上述嗜热栖热菌光裂合酶的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种嗜热栖热菌光裂合酶的提取方法，包含如下步骤：

(1)嗜热栖热菌菌体与磷酸盐缓冲液混合，然后采用高压均质机进行菌体破碎，其中，压力为400～800bar，均质1～2次，得到破碎液；

(2)将步骤(1)制得的破碎液加入过滤介质过滤或者直接高速离心，得到清液；

(3)将步骤(2)制得的清液通过肝素柱进行进一步分离纯化，得到耐热栖热菌光裂合酶；

步骤(1)中所述的嗜热栖热菌菌体，通过如下方法制得：

将嗜热栖热菌种子液接种至发酵培养基中进行培养，然后离心收集菌体，

得到嗜热栖热菌菌体；

所述的发酵培养基包含基础发酵培养基和结冷胶，其中，结冷胶用量为基础发酵培养基质量的0.1～0.5‰；

所述的基础发酵培养基中每升包含如下组分：0.9％(w/v)乳清粉、4g硫酸铵、10g氯化钠、15mg氯化钙、123mg七水硫酸镁、1.5g磷酸二氢钾、9g十二水磷酸氢二钠、6ml微量元素；

所述的基础发酵培养基中每升包含如下微量元素：2mL磷酸(市售)、56mg七水硫酸亚铁、29mg七水硫酸锌、22mg四水硫酸锰、2.5mg五水硫酸铜、3mg六水合硝酸钴、6mg硼酸；

步骤(1)中所述的磷酸盐缓冲液优选为含1mM EDTA、pH＝6.8的50mM磷酸盐缓冲液；

步骤(1)中所述的嗜热栖热菌菌体与磷酸盐缓冲液的质量体积比(kg：L)为1：(3～5)；

步骤(1)中所述的菌体破碎的条件优选为400bar均质2次；

步骤(2)中所述的过滤介质优选为硅藻土545；

步骤(2)中所述的高速离心的条件优选为20000rpm离心20min；

步骤(3)中所述的分离纯化的具体操作优选为：

1)采用pH＝6.8的20mM磷酸盐缓冲液平衡肝素柱；

2)柱子平衡后，将步骤(1)制得的清液上样；

3)上样后，采用pH＝6.8的20mM磷酸盐缓冲液平衡3～5个柱体积至基线走平，调零；

4)采用含0.2M NaCl、pH＝6.8的20mM磷酸盐缓冲液进行洗杂，至基线走平，然后采用含0.4M NaCl、pH＝6.8的20mM磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱液；

一种嗜热栖热菌光裂合酶，通过上述提取方法提取得到；

所述的嗜热栖热菌光裂合酶在制备光损伤修复产品中的应用；

所述的光损伤修复产品优选为可修复紫外高能射线造成损伤的药物、医疗器械、化妆品或保健品；

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明采用含有结冷胶的发酵培养基发酵培养耐热栖热菌，可大大提高菌体产量。

(2)本发明采用肝素柱进行蛋白精纯，得到的耐热栖热菌光裂合酶纯度高，可达到95％，应用范围更广泛。

(3)本发明提取得到的耐热栖热菌光裂合酶具有很好的热耐受性和稳定性，80℃高温48h依旧能保留大部分生物活性。

附图说明

图1发酵培养基中添加不同浓度结冷胶对菌体产量影响的结果分析图。

图2是肝素柱精纯获得的耐热栖热菌光裂合酶的聚丙烯酰氨凝胶电泳图。

图3是不同浓度耐热栖热菌光裂合酶与南极冰藻光修复酶分别在紫外光照下的细胞存活率结果比较分析图，其中，A：耐热栖热菌光裂合酶，B：南极冰藻光修复酶。

图4是在80℃条件下孵育不同时间的耐热栖热菌光裂合酶与南极冰藻光修复酶稳定性变化结果比较分析图，其中，A：耐热栖热菌光裂合酶，B：南极冰藻光修复酶。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中所用的嗜热栖热菌为Thermusthermophilusstrain HB8，购于ATCC。

实施例1嗜热栖热菌的培养

(1)将含有嗜热栖热菌(Thermusthermophilusstrain HB8)的甘油管接种于种子培养基中，然后置于摇床上进行培养，培养条件为65℃、200rpm培养24h，得到种子液；

(2)将种子液接种至发酵培养基(基础发酵培养基+结冷胶，结冷胶用量为基础发酵培养基质量的0、0.1‰、0.25‰、0.5‰、0.75‰)中进行扩培，培养条件为：65℃、溶氧不低于20％、氨水控制pH为7.2，培养2天至OD600不再增加为止，开始放罐；

(3)采用管式离心机收集菌体，其中，为使离心菌泥更结实易于收集，管式离心机相对离心力不低于8000RCF。

其中，种子培养基包含如下组分：0.3％(w/v)酵母粉、0.5％(w/v)蛋白胨、0.2％(w/v)氯化钠、2μM三氯化铁、0.2mM氯化钙、1mM氯化镁、0.1％(w/v)葡萄糖，NaOH调pH至7.2；

基础发酵培养基(每升含量)：0.9％(w/v)乳清(购于陕西泰克生物科技有限公司)、4g硫酸铵、10g氯化钠、15mg氯化钙、123mg七水硫酸镁、1.5g磷酸二氢钾、9g十二水磷酸氢二钠、6ml微量元素。

微量元素(每升基础发酵培养基含量)：2mL磷酸(市售)、56mg七水硫酸亚铁、29mg七水硫酸锌、22mg四水硫酸锰、2.5mg五水硫酸铜、3mg六水合硝酸钴、6mg硼酸。

发明人在栖热耐热菌培养过程中发现，在基础发酵培养基中添加一定量的结冷胶会对菌体生长产生较好的促进作用。基于此，本实施例分别在基础发酵培养基中额外添加一定比例的结冷胶，结果表明，结冷胶在0.1～0.5‰范围内均能提高菌体产量，结合成本考虑，添加0.5‰的结冷胶提升效果最为明显，与对照相比，菌体产量增加了50％(如图1所示)。

实施例2嗜热栖热菌光裂合酶的初纯

将实施例1离心获得的菌体按1:5(m/v)的比例加入pH＝6.8的50mM磷酸盐缓冲液(含1mM EDTA)进行重悬，重悬充分后，采用高压均质机进行菌体破碎，其中，压力为400bar，均质2次，得到破碎液；破碎液按5g/L的比例加入助滤剂硅藻土545，搅拌均匀后采用0.45μm的滤膜进行真空抽滤，得到澄清滤液用于下一步纯化。

或将实施例1离心获得的菌体按1:3(m/v)的比例加入pH＝6.8的50mM磷酸盐缓冲液(含1mM EDTA)进行重悬，重悬充分后，采用高压均质机进行菌体破碎，其中，压力为800bar，均质1次，得到破碎液；破碎液采用离心机进行离心分离(20000rpm离心20min)，收集上清用于下一步纯化。

实施例3嗜热栖热菌光裂合酶的精纯

本实施例采用不同分离纯化方法进行精纯，具体方法如下：

(1)肝素柱精纯

将实施例2获得的澄清过滤液或离心上清液采用肝素柱(HeparinSepharose6FastFlow，购自GE公司)进行分离纯化，检测器波长为280nm，灵敏度为0.5A，肝素柱纯化分离条件如下：

1)采用pH＝6.8的20mM磷酸盐缓冲液平衡肝素柱；

2)柱子平衡后，开始上样，流速符合层析柱要求(本实施例中流速为16ml/min)；

3)上样后，采用pH＝6.8的20mM磷酸盐缓冲液再次平衡3～5个柱体积至基线走平，调零；

4)采用含0.2M NaCl、pH＝6.8的20mM磷酸盐缓冲液进行洗杂，至基线走平后，采用含0.4M NaCl、pH＝6.8的20mM磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。

(2)CM阳离子交换柱精纯

通过酸碱滴定发现实施例2获得的嗜热栖热菌光裂合酶在pH＝8.5出现沉淀，推测其等电点在8.5附近，故将其采用阳离子交换进行精纯；将实施例2获得的澄清过滤液或离心上清液采用CM阳离子交换柱(CM Sepharose 6FastFlow，购自GE公司)进行分离纯化，检测器波长为280nm，灵敏度为0.5A，CM阳离子交换柱纯化分离条件如下：

1)采用pH＝6.8的20mM磷酸盐缓冲液平衡CM阳离子交换柱；

(3)SP阳离子交换柱精纯

将实施例2获得的澄清过滤液或离心上清液采用SP阳离子交换柱(SP Sepharose6FastFlow，购自GE公司)进行分离纯化，检测器波长为280nm，灵敏度为0.5A，SP阳离子交换柱纯化分离条件为如下：

1)采用pH＝6.8的20mM磷酸盐缓冲液平衡SP阳离子交换柱；

4)采用含0.4M NaCl、pH＝6.8的20mM磷酸盐缓冲液进行洗杂，至基线走平后，采用含0.6M NaCl、pH＝6.8的20mM磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。

按照常规方法分别检测肝素柱精纯、CM阳离子交换柱精纯和SP阳离子交换柱精纯收集得到的洗脱液中嗜热栖热菌光裂合酶的蛋白回收率和纯度，结果见表1，从表1中可以看出，与阳离子交换柱精纯和SP阳离子交换柱精纯相比，肝素柱精纯的嗜热栖热菌光裂合酶蛋白回收率、纯度均有较明显提升。其中，洗脱液中嗜热栖热菌光裂合酶的蛋白回收率达到82％，洗脱液中嗜热栖热菌光裂合酶的纯度可达到95％以上(其聚丙烯酰氨凝胶电泳结果如图2所示，通过灰度扫描分析，目的条带占比达到96.5％，分子量为48.0kDa)。

表1不同精纯结果比较

	目的蛋白回收率	目的蛋白纯度
			肝素柱精纯	82％	96.5％
CM阳离子交换柱	80％	86.3％
			SP阳离子交换柱	75％	79.8％

实施例4与南极冰藻光修复酶性能比较

(1)样品制备：采用PBS分别将实施例3肝素柱精纯后的嗜热栖热菌光裂合酶(分子量为48.0kDa)、南极冰藻光修复酶(分子量为64.3kDa，购于上海中翊有限公司)稀释至不同终浓度5、10、25、50、100ng/mL；

(2)取对数生长期的HaCaT细胞(人永生化角质形成细胞，购自Thermo公司)，融合度为80～90％，加入1mL胰酶(含0.25wt.％胰酶)，置于37℃消化50S，1000rpm离心5min，弃去上清，加入新鲜含10％(v/v)FBS(购于Gibco)的DMEM培养液(购于Gibco，下同)重悬并进行细胞计数，制备细胞悬浮液；

(3)将浓度为70000个/mL的细胞悬浮液接种于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬浮液，置于37℃、5％CO₂条件下培养24h；然后加入不同制备好的酶样品，孵育6h；孵育后1000rpm离心5min，弃去培养基，然后采用PBS洗板2次，再加入30μL PBS于96孔板中，进行UVB照射70s(辐射强度为11mW/cm²)，弃去PBS，加入新鲜DMEM培养基培养24h后，每孔中加入10μLCCK8试剂(购于MCE公司)，混匀后继续培养1小时，于450nm处检测其吸光度，记录测定结果。

结果如图3所示，不加耐热栖热菌光裂合酶的对照组细胞存活率只有49％，而加入耐热栖热菌光裂合酶(图3A)与南极冰藻光修复酶(图3B)稀释液的组别的细胞存活率均有所提升，且耐热栖热菌的光裂合酶对紫外B损伤的修复效果更好，最佳活性高出南极冰藻光修复酶30％以上。

(4)将浓度为15ng/mL的耐热栖热菌光裂合酶与南极冰藻光修复酶样品置于80℃金属浴中，分别控制不同水浴时间，然后按步骤(2)(3)的方法检测细胞存活率,，并计算UVB修复活性，计算公式如下：

相对酶活＝(孵育后样品的细胞存活率-空白细胞存活率)/(未孵育样品的细胞存活率-空白细胞存活率)

结果如图4显示，耐热栖热菌光裂合酶具有较好的耐热性能，80℃孵育48h，修复活性依旧保持在80％以上，明显优于重组获取的南极冰藻光修复酶的耐热性能。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种嗜热栖热菌光裂合酶的提取方法，其特征在于包含如下步骤：

(3)将步骤(2)制得的清液通过肝素柱进行进一步分离纯化，得到耐热栖热菌光裂合酶。

2.根据权利要求1所述的嗜热栖热菌光裂合酶的提取方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的嗜热栖热菌菌体，通过如下方法制得：

将嗜热栖热菌种子液接种至发酵培养基中进行培养，然后离心收集菌体，得到嗜热栖热菌菌体；

所述的发酵培养基包含基础发酵培养基和结冷胶，其中，结冷胶用量为基础发酵培养基质量的0.1～0.5‰。

3.根据权利要求1所述的嗜热栖热菌光裂合酶的提取方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的磷酸盐缓冲液为含1mM EDTA、pH＝6.8的50mM磷酸盐缓冲液。

4.根据权利要求1所述的嗜热栖热菌光裂合酶的提取方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的嗜热栖热菌菌体与磷酸盐缓冲液的质量体积比(kg：L)为1：(3～5)。

5.根据权利要求1所述的嗜热栖热菌光裂合酶的提取方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的过滤介质为硅藻土545。

6.根据权利要求1所述的嗜热栖热菌光裂合酶的提取方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的高速离心的条件为20000rpm离心20min。

7.根据权利要求1所述的嗜热栖热菌光裂合酶的提取方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的分离纯化的具体操作为：

1)采用pH＝6.8的20mM磷酸盐缓冲液平衡肝素柱；

2)柱子平衡后，将步骤(1)制得的清液上样；

4)采用含0.2M NaCl、pH＝6.8的20mM磷酸盐缓冲液进行洗杂，至基线走平，然后采用含0.4M NaCl、pH＝6.8的20mM磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。

8.一种嗜热栖热菌光裂合酶，其特征在于通过权利要求1～7任一项所述的提取方法提取得到。

9.权利要求8所述的嗜热栖热菌光裂合酶在制备光损伤修复产品中的应用。

10.根据权利要求9所述的嗜热栖热菌光裂合酶在制备光损伤修复产品中的应用，其特征在于：

所述的光损伤修复产品为可修复紫外高能射线造成损伤的药物、医疗器械、化妆品或保健品。