CN112816697A

CN112816697A - 抑制破骨细胞活性及治疗骨质疏松的试剂及其应用

Info

Publication number: CN112816697A
Application number: CN201911128528.6A
Authority: CN
Inventors: 邹卫国; 王丽君; 尤修玲; 张玲莉
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Cell Science of CAS
Priority date: 2019-11-18
Filing date: 2019-11-18
Publication date: 2021-05-18

Abstract

本发明提供了一种抑制破骨细胞活性及治疗骨质疏松的试剂及其应用。本发明揭示了一种新的与骨质疏松相关的信号通路，即PIEZO1/YAP/II或IX型胶原信号通路。该信号通路中，PIEZO1可以响应机械应力，通过促进YAP的核定位调节成骨细胞谱系细胞中基质蛋白，主要是II型胶原和IX型胶原的表达，II型胶原和IX型胶原的表达能够抑制破骨细胞分化。本发明还揭示了II型胶原和IX型胶原在制备缓解或治疗骨质疏松的药物组合物中的用途。

Description

抑制破骨细胞活性及治疗骨质疏松的试剂及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及抑制破骨细胞活性及治疗骨质疏松的试剂及其应用。

背景技术

骨组织处于不断重塑的状态，从而维持骨骼系统的稳态。骨重塑主要是指由破骨细胞通过骨吸收来移除衰老或损伤的骨，随后由成骨细胞形成新骨的动态过程。骨骼重塑过程主要涉及四种细胞类型：骨表面线性排列的细胞，骨细胞，破骨细胞和成骨细胞。骨表面线性排列的细胞隶属于成骨细胞。骨细胞是骨组织中最丰富的细胞类型，由成骨细胞分化而来，埋藏在骨基质中。骨细胞是最重要的应力感应细胞，能够为骨改建提供起始信号。破骨细胞是负责骨吸收的主要细胞，是由单核细胞受到巨噬细胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor 1，MCSF)和核因子κB受体活化因子配体(Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand，RANKL)刺激后分化形成的多核大细胞。目前，骨骼重塑的模式为：首先由骨细胞感受到骨形变或骨损伤，传递信号招募破骨前体细胞到骨基质上分化形成成熟的破骨细胞；破骨细胞降解骨基质释放TGF-β1/IGF-1等招募成骨细胞到骨吸收部位形成类骨质；同时破骨细胞自身也会分泌如SEMA4D(Semaphorin-4D)抑制成骨细胞分化，从而抑制成骨细胞分泌RANKL，最终抑制破骨细胞的形成，从而够成一个负反馈的调节；最后类骨质矿化完成一个骨骼重塑的循环。在正常的骨骼重塑过程中，骨量不会明显变化，但是骨骼重塑异常会导病理状态引起骨量和骨强度的改变，如骨质疏松和骨硬化症等。

骨的组成中约有10％的细胞，60％的矿物质(主要是羟基磷灰石)以及30％的有机物。在骨中有超过100种胞外基质蛋白，通过调控成骨细胞和破骨细胞，在骨重塑过程中发挥作用。胞外基质可以为无机盐的沉积提供支架，其中一型胶原是支架的主体，其他蛋白能够帮助结合无机盐等。胞外基质还为骨骼提供韧性，在机械应力响应和调控方面也起作用。

骨质疏松是一种由于骨骼重塑失衡，即骨形成减弱或骨吸收增强或骨骼干细胞减少而导致骨量下降，易发生骨折以及椎体前突等症状的疾病，严重影响了人类的生活质量。引起骨质疏松的原因有多种，主要分为原发性骨质疏松和继发性骨质疏松。原发性骨质疏松是指由于绝经后雌激素缺乏或衰老导致，而继发性骨质疏松主要是由于其身体活动的改变(废用性骨质疏松)或药物干扰(如糖皮质激素诱发的骨质疏松)。

骨骼重塑一个重要作用就是使骨骼能够适应机械应力的需求。一般来讲，骨骼系统从幼年发育，在人的一生中持续进行重塑，使骨骼能够有效支撑人的体重和身体运动。对于运动员等从事高强运动的人而言，身体的某一部分骨骼由于长期的运动，在骨改建过程中会形成更强壮的骨骼来适应更高的机械需求；相反对于长期的卧床休息、瘫痪导致的无法运动会导致骨骼对机械应力要求的降低，从而引起废用性骨质疏松。与激素、衰老等引起的骨质疏松不同，废用性骨质疏松是骨骼重塑对于降低的机械需求的适应性变化。除此之外由于衰老或激素相关的骨质疏松在临床上可以通过不同的策略来治疗，包括促进合成代谢治疗以增加骨形成或抑制分解代谢以减少骨吸收，但是由于微重力导致骨质流失，却缺乏相应的药物治疗手段。因此研究机械应力刺激如何影响骨骼重塑过程十分必要。

骨骼机械应力或者承受重力会导致骨骼承受形变(张力和压力)、剪切力和流体力。本领域目前认为骨细胞、成骨细胞、破骨细胞在该过程中都发挥作用，但还不完全清楚为了适应机械需求而调整的骨改建是如何在细胞和分子水平上进行调控的。

骨细胞是埋藏在骨基质中的终末分化的成骨细胞，在成人体内占据了骨骼细胞的85-90％，被认为是体内骨骼系统机械应力感受的主要细胞类群。成熟的骨骼主要是由皮质骨和骨小梁构成。骨细胞是由成骨细胞分化而来，埋藏在骨基质中，与周围细胞包括周围的骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、上皮细胞甚至骨髓腔中的细胞接触并且能够通树状突起与周围的骨小腔室体液进行物质交换。骨细胞通过间隙连接和分泌蛋白与周围细胞进行信息交流。这些特点使其成骨骼系统中感受机械应力的关键因子。骨细胞能够通过细胞体、树状突起和纤毛感受流体剪切力和负载重力刺激，并通过细胞树状突起和分泌蛋白传递信号调控成骨和破骨形成。

胶原是哺乳动物中最丰富的蛋白(约占蛋白总重的30％)，广泛存在于各种结缔组织的胞外基质中，在结构上起到重要作用。胶原家族的多样性丰富，胶原超家族中包含28个成员，以罗马数字依次命名(I-XXVIII)。骨基质中除占主要地位的I型胶原，还有少量的II型、III型、V型、IX和X胶原等，可以调控骨形成和胶原纤维的直径。II型胶原是纤维形成胶原亚家族的成员，是软骨中最丰富的胶原蛋白。II型胶原以原胶原的形式形成，带有一个N端原肽和C端原肽，这个原肽会被特定的蛋白酶切割，形成成熟的胶原分子整合到基质中的胶原纤维中。IX型胶原属于FACIT亚家族，由Col9a1、Col9a2、Col9a3基因分别编码的三个多肽链构。

力学感受体是指能够感受多种外部或者内部力的细胞结构，存在于几乎所有细胞类型中，为多种功能所必需。细胞感知外部机械信号需要力学感受体直接与外部环境接触或者能够通过检测中间介质的变化，比如压力、剪切力引起细胞膜的改变。多种细胞表面蛋白或膜结构，包括整合素(Integrins)、离子通道(Ion channels)、连接子(Connexons)、紧密连接(Gap junctions)以及初级纤毛(Primary cillia)都被认为潜在的机械应力感受结构。这些结果能够响应不同的力的形式，比如剪切力、流体势能、张力等，产生不同的下游信号途径，从而影响骨细胞的结构的功能。

离子通道蛋白PIEZO1(FAM38A)和PIEZO2(FAM38B)在2010年被鉴定(Coste，B.etal.，Science，2010.330(6000):p.55-60)，引发了很多领域关于PIEZO1/2介导的机械力感应的研究。目前在多种真核生物中鉴定出PIEZO的同源蛋白，大多数脊椎动物PIEZO蛋白家族含有两个成员：PIEZO1和PIEZO2。PIEZOs蛋白很大，其中鼠源PIEZO1含有2547个氨基酸并且与其它已知离子通道蛋白序列几乎没有同源性。通过冷冻电镜对鼠源PIEZO1蛋白结构解析发现PIEZO1通道为同源三聚体。PIEZO2的结构和PIEZO1较为类似。

PIEZOs在不同的生理过程中感受机械力刺激后会打开通道，引起阳离子内流，主要是钙离子，也可通透其他的阳离子。研究人员发现了多种能够激活PIEZOs通道的方式，并利用电生理或钙成像的方式记录PIEZOs引起的细胞生理活动。宏观上比如利用钝玻璃探针、原子力显微镜、高压灌注“戳”细胞，利用微流体系统提供流体剪切力、基质的形变、通过超声远程操控细胞的震动都可以引起细胞的形变，从而激活PIEZOs通道；微观上，可利用微纤毛引起细胞局部形变操控单个或少量的PIEZOs或利用次数干扰通道的功能；还可以利用小分子激动剂如Yoda1和Jedi1/2对PIEZO1通道激活。PIEZOs蛋白在不同组织细胞和生理过程中的作用被越来越多的认识，能够快速的将机械刺激转变成电信号或者化学信号，调控各种生物学过程，如身体感知、血管形成、血压调控、干细胞分化、淋巴管瓣膜形成、压力介导的胰腺炎发生等等。

Yes相关蛋白/转录共激活因子PDZ结合基序(YAP/TAZ)信号途径能够响应多种类型的机械刺激，其在进化上非常保守，在多种细胞类型中起到机械转导的作用。YAP/TAZ入核后通过调控基因转录发挥其生物学功能。

发明内容

本发明的目的在于提供抑制破骨细胞活性及治疗骨质疏松的试剂及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种筛选缓解或治疗骨质疏松的物质的方法，所述方法包括：(1)将候选物质与含有PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路的体系接触；(2)筛选出调节PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路的物质，所述物质是对于缓解或治疗骨质疏松有用的物质(潜在物质)；其中，所述的调节包括：提高PIEZO1表达或活性，促进YAP进入细胞核(促进YAP核定位或增加YAP表达)，提高II或IX型胶原的表达或活性。

在一个优选例中，所述的PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路含有：PIEZO1蛋白，YAP蛋白，II或IX型胶原。

在另一优选例中，所述的II型胶原由Col2α1基因编码；所述的IX型胶原由Col9α1、Col9α2和/或Col9α3编码。

在另一优选例中，所述的含有PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路的体系选自：细胞(培养物)体系、亚细胞(培养物)体系、组织(培养物)体系或动物体系。

在另一优选例中，步骤(1)之前或同时，还包括给予所述体系以应力(包括机械应力或加压)刺激，使得PIEZO1响应该应力刺激，从而促进YAP进入细胞核、提高II或IX型胶原的表达或活性；步骤(2)中，还包括：测定候选物质的作用，若其能够在统计学上进一步提高步骤(1)的促进YAP进入细胞核、提高II或IX型胶原的表达或活性的效应，则其是对于缓解或治疗骨质疏松有用的物质。

在另一优选例中，步骤(1)之前或同时，还包括抑制或敲除PIEZO1，从而降低YAP进入细胞核(降低YAP核定位)、降低II或IX型胶原的表达或活性；步骤(2)中，还包括：测定候选物质的作用，若其能够在统计学上逆转(或回复)由抑制或敲除PIEZO1而导致的YAP进入细胞核的降低及II或IX型胶原的表达或活性的降低(即：促进YAP进入细胞核，提高II或IX型胶原的表达或活性)，则其是对于缓解或治疗骨质疏松有用的物质。

在另一优选例中，步骤(1)包括：向含有PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路的体系中添加候选物质；和步骤(2)包括：检测PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路中各蛋白或基因的变化，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、含有PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路的体系；若候选物质提高PIEZO1表达或活性，促进YAP进入细胞核(促进YAP核定位)，提高II或IX型胶原的表达或活性，则该候选物质是对于缓解或治疗骨质疏松有用的物质。

在另一优选例中，所述的骨质疏松为破骨细胞活性或分化异常(破骨细胞过度活化或过度分化)导致的骨质疏松；或，所述的骨质疏松为废用性骨质疏松。

在另一优选例中，所述的含有PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路的体系是：细胞(培养物)体系，包括：成骨系细胞(成骨细胞、骨髓间充质干细胞)和骨髓单核细胞共同构成的成骨细胞和破骨细胞共培养体系；骨髓单核细胞在体外向破骨细胞分化的体系。

在另一优选例中，所述的提高或促进为统计学上的提高或促进，如与对照或基底相比，提高或促进10％或20％以上，较佳地提高或促进40％或50％以上，更佳地提高或促进80％或100％以上。

在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路、或其通路蛋白、或其上游或下游蛋白或基因设计的调控分子(如但不限于上调剂、干扰分子、核酸抑制物、结合分子(如抗体或配体))，CRISPR构建物，小分子化合物，或来自化合物库的化合物等。

在本发明的另一方面，提供PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路的用途，用于筛选缓解或治疗骨质疏松的物质；较佳地，所述的PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路含有：PIEZO1蛋白，YAP蛋白，II或IX型胶原。

在本发明的另一方面，提供II或IX型胶原或其上调剂的用途，用于制备缓解或治疗骨质疏松的药物组合物。

在一个优选例中，所述的II型胶原由Col2α1基因编码；所述的IX型胶原由Col9α1、Col9α2和/或Col9α3编码。

在另一优选例中，所述II或IX型胶原的上调剂包括：增强II或IX型胶原活性、表达、稳定性或有效作用时间的物质；促进YAP进入细胞核(促进YAP核定位或增加YAP表达)的物质。

在另一优选例中，所述II或IX型胶原的上调剂包括：II或IX型胶原的结合多肽，II或IX型胶原的化学上调剂，重组表达构建物(如表达载体或宿主细胞，其中含有II或IX型胶原的表达盒)，或其组合。

在另一优选例中，所述重组表达构建物包括COL2α1(或Flag-COL2α1)或COL9α2(或Flag-COL9α2)的表达盒。

在另一优选例中，所述的促进YAP进入细胞核的物质包括：XMU-MP-1。

在另一优选例中，所述述II或IX型胶原的上调剂为重组表达II或IX型胶原的构建物(如表达载体或宿主细胞)，II或IX型胶原编码基因的过表达多肽，促进II或IX型胶原编码基因的启动子驱动能力的上调剂，II或IX型胶原编码基因特异性microRNA的下调剂。

在另一优选例中，所述的II或IX型胶原或其上调剂通过抑制破骨细胞的活性或抑制破骨细胞的分化，从而缓解或治疗骨质疏松。

在另一优选例中，所述的骨质疏松为废用性骨质疏松。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、Piezo1小鼠的构建策略和敲除效率检测。

(A-C)在骨(Bone)、成骨细胞(OB)、破骨细胞(OC)、背根神经节(DRG)和皮肤(Skin)中通过RT-PCR检测Piezo1、Piezo2基因表达；(D)Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠构建策略；(E)Piezo1^fl/fl、WT和Piezo1^fl/+小鼠的基因型鉴定方法；(F)WT和Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠Piezo1的敲除效率检测；(G)WT和Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠成骨前体细胞中PIEZO1的免疫荧光；(H)WT和Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠成骨前体细胞在Yoda1(10μM)处理后钙离子内流随时间变化的记录(记录细胞数目>8个细胞)。

图2、Piezo1缺失小鼠表现出严重的骨量丢失和自发性骨折。

(A)6周雄性WT和Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠股骨μ-CT 3D图像；(B-G)6周雄性WT和Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠股骨定量分析：骨密度(BMD)(B)、骨体积/组织体积(BV/TV)(C)、骨小梁数目(Tb.N)(D)、骨小梁厚度(Tb.Th)(E)、骨小梁分离度(Tb.Sp)(F)和皮质骨厚度(Ct.Th)(G)。数据表示平均值±SD，采用非配对学生t检验*P<0.05，**P<0.01，n＝6；(H)6周雄性WT和Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠长骨的X-ray图像，图像为三组样品的代表性图片。

图3、Piezo1缺失小鼠在胚胎时期表型不明显。

(A-C)胚胎E17.5(A)、新生0天(B)和出生后三天(C)的WT和Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠阿尔新蓝-茜素红整体染色，图像为三组样品的代表性图片，标尺＝5mm；(D)出生3天的WT和Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠骨折部位和比例的统计，WT小鼠，n＝8；Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠，n＝9；(E)出生0天和出生3天的WT和Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠股骨μ-CT 3D图像。

图4、Piezo1缺失小鼠颅顶骨表型不明显。

(A)3周的WT和Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠颅顶骨μ-CT 3D图像，图像为三组样品的代表性图片。

图5、Piezo1对成骨细胞分化没有明显影响。

(A-B)流式分析6周的WT和Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠骨髓中的mSSCs，mBSCPs和mPre-BSCPs，数据表示平均值±SD，采用非配对学生t检验*P<0.05，**P<0.01，WT，n＝3，CKO，n＝6；(C)WT和Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠来源的骨髓干细胞向成骨分化过程中第七天的ALP染色和第21天的茜素红染色；(D)分化第七天ALP定量分析，数据表示平均值±SD，采用非配对学生t检验*P<0.05，**P<0.01，n＝4；(E)QPCR检测Piezo1敲除效率和成骨分化的标志基因：Col1α1、Alp、Runx2、Osx、Bglap和Bsp。

图6、Piezo1在成骨细胞中缺失后能够促进破骨细胞的活性。

(A)6周的WT和Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠Von Kossa染色；(B-E)6周的WT和Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠骨计量学分析：骨体积/组织体积(BV/TV)(B)，骨小梁数目(Tb.N)(C)，单位周长成骨细胞的数目(N.Ob/B.Pm)(D)，单位骨表面成骨细胞的面积(Ob.S/BS)(E)，WT：n＝4，CKO：n＝3；(F)6周的WT和Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠钙黄绿素茜素红双标实验，标尺＝20μm，n＝6；(G-I)6周的WT和Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠骨沉积速率(MAR)(G)、骨形成速率(BFR/BS)(H)和矿化面积(MS/BS)(I)定量，n＝6；(J)6周的WT和Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠血清中PINP的定量分析，WT：n＝6，CKO：n＝8；(K-M)6周的WT和Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠骨计量学分析，来自(A)：骨侵蚀面积(ES/BS)(K)、单位周长破骨细胞的数目(N.Oc/B.Pm)(L)和单位骨表面破骨细胞的面积(Oc.S/BS)(M)，WT：n＝4，CKO：n＝3；(N)6周的WT和Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠血清中CTX-I定量分析，WT：n＝6，CKO：n＝8；(O)6周的WT和Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠TRAP染色，标尺＝50μm。

图7、Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠破骨细胞在出生后的承重骨中增强。

(A)4周WT和Prx1^Cre，Piezo1^fl/fl小鼠颅顶骨的TRAP染色；(B-C)新生0天(B)和出生后3天(C)的WT和Prx1^Cre,Piezo1^fl/fl小鼠股骨TRAP染色，上图标尺＝5mm；下图标尺＝100μm；(D-E)新生0天(B)和出生后3天(C)的WT和Prx1^Cre,Piezo1^fl/fl小鼠股骨TRAP染色的定量，单位骨表面破骨细胞的面积(Oc.S/BS)，n＝3。

图8、Prx1^Cre,Piezo1^fl/fl小鼠不响应尾悬吊模拟的失重模型导致的骨量下降和破骨增强。

(A)6周雄性WT和Prx1^Cre,Piezo1^fl/fl小鼠股骨分别分为地面组和悬吊组，悬吊一周后的μ-CT 3D图像；(B-G)7周雄性WT和Prx1^Cre,Piezo1^fl/fl小鼠股骨定量分析：骨密度(BMD)(B)、骨体积/组织体积(BV/TV)(C)、骨小梁数目(Tb.N)(D)、骨小梁厚度(Tb.Th)(E)、骨小梁分离度(Tb.Sp)(F)，n≥6；(G)7周WT和Prx1^Cre,Piezo1^fl/fl小鼠地面组和悬吊组TRAP染色，标尺＝50μm；(H)7周WT和Prx1^Cre,Piezo1^fl/fl小鼠地面组和悬吊组TRAP染色的定量，单位骨表面破骨细胞的面积(Oc.S/BS)，n＝3。

图9、WT和Prx1^Cre,Piezo1^fl/fl小鼠皮质骨RNA-seq发现多个胶原在Piezo1缺失后下调。

(A-B)来源于WT和Prx1^Cre,Piezo1^fl/fl小鼠的骨髓干细胞和野生型骨髓单核细胞的共培养：(A)破骨细胞的TRAP染色，标尺＝500μm；(B)共培养上清的TRAP活性检测，n＝5；(C)WT和Prx1^Cre,Piezo1^fl/fl小鼠皮质骨基因表达分析；(D)3周WT和Prx1^Cre,Piezo1^fl/fl小鼠皮质骨RNA-seq基因热图(FoldChange>1.5，P.value<0.05)，每一列代表一个样品，n＝4；(E)下调基因的GO分析(FoldChange>1.5，p.value<0.05)；(F)3周WT和Prx1^Cre,Piezo1^fl/fl小鼠皮质骨RNA-seq基因中与下调的胶原和基质蛋白热图，n＝4；(G)WT and Prx1^Cre,Piezo1^fl/fl小鼠皮质骨基因表达分析。

图10、PIEZO1能够调控Col2α1和Col9α2的表达，并抑制破骨细胞分化。

(A-B)WT和Prx1^Cre,Piezo1^fl/fl小鼠股骨COL2α1(A)和COL9α2(B)免疫荧光分析；(C-D)Prx1^Cre,Piezo1^fl/fl小鼠的骨髓干细感染胞分别感染Gfp对照、Col2α1和Col9α2慢病毒以及WT小鼠的骨髓干细胞与野生型骨髓单核细胞的共培养：(C)破骨细胞的TRAP染；(D)共培养上清的TRAP活性检测，n＝3；(E-F)利用FlexCell压力系统对来源于WT和Prx1^Cre,Piezo1^fl/fl小鼠的骨髓干细胞加载1％强度，0.5赫兹压应力，处理4h后检测Col2α1(E)和Col9α2(F)的表达。

图11、COL2α1和COL9α2重组蛋白对破骨细胞的抑制作用依赖于整合素。

(A)从过表达COL2α1和COL9α2的293T细胞上清中富集COL2α1和COL9α2进行蛋白免疫印迹分析和考马斯亮蓝染色分析；(B-C)骨髓单核细胞种在96孔板中，用20ng/ml M-CSF和250ng/ml RANKL以及图中所示重组蛋白或对照处理6天后进行TRAP染色(B)及定量(C)，比例尺＝100μm；*P<0.05；**P<0.01.Ordinary one-way ANOVA.Data are mean±s.d.，n＝10.(D-G)骨髓单核细胞种在96孔板中，用20ng/ml M-CSF和250ng/ml RANKL以及图中所示处理6天后进行TRAP染色(D-E)及定量(F-G)，比例尺＝100μm；*P<0.05；**P<0.01.Ordinaryone-way ANOVA.Data are mean±s.d.，n＝4.

图12、PIEZO1能够通过调控YAP的核定位调控Col2α1和Col9α2的表达。

(A)WT和Prx1^Cre,Piezo1^fl/fl小鼠皮质骨中YAP的免疫荧光分析；(B)WT和Prx1^Cre,Piezo1^fl/fl小鼠皮质骨中YAP的核定位情况，n＝5个视野；(C-D)在C3H10感染对照和shYAP的慢病毒后，Western Blot检测YAP蛋白水平的变化(C)和相关基因的表达分析(D)；(E)在C3H10中处理DMSO和XMU-MP-1(10μM)24h后检测Col2α1和Col9α2；(F-G)在C3H10中会过表达YAP可以激活Col2α1(F)和Col9α2(G)的启动子；(H-I)Prx1^Cre,Piezo1^fl/fl和WT小鼠的骨髓干细胞与野生型骨髓单核细胞的共培养，按图中的处理方式进行药物处理；(H)破骨细胞的TRAP染；(I)共培养上清的TRAP活性检测，n＝4。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，首次揭示一种新的与骨质疏松相关的信号通路，即PIEZO1/YAP/II或IX型胶原信号通路。该信号通路中，PIEZO1可以响应机械应力，通过促进YAP的核定位调节成骨细胞谱系细胞中基质蛋白，主要是II型胶原和IX型胶原的表达，II型胶原和IX型胶原的表达能够抑制破骨细胞分化。本发明还揭示了II型胶原和IX型胶原在制备缓解或治疗骨质疏松的药物组合物中的用途。

PIEZO1/YAP/II或IX型胶原信号通路

人类的骨骼系统能够为整个身体提供机械框架。Wolff’s定律和后来的Utah骨骼生理学范式指出，骨骼结构能够适应机械应力并预测了力学调控系统的存在，将机械应力引起的应变程度与骨骼重塑联系起来。增加的负荷刺激，例如通过运动和剧烈的肌肉活动增强骨量和骨强度；在长时间卧床休息或暴露于微重力环境中会由于缺乏机械负荷导致骨量和骨强度的快速降低，引起废用性骨质疏松。宇航员在微重力环境中一个月骨丢失比绝经后妇女在一年内的骨丢失还要严重，约为每月下降1-2％。除此之外由于衰老或激素相关的骨质疏松可以通过不同的策略来治疗，包括促进合成代谢治疗以增加骨形成或抑制分解代谢以减少骨吸收，但是由于微重力导致骨质流失，缺乏相应的治疗手段。

本发明中，发现在成骨细胞谱系Prx1阳性细胞中敲除机械力敏感的阳离子非选择性离子通道PIEZO1后动物骨形成率正常，但是破骨细胞骨吸收能力明显增强，导致骨量降低和自发性骨折。利用后肢悬吊模拟失重模型发现PIEZO1缺陷动物对失重引起的破骨细胞活性增强和骨量的丢失不敏感。这些结果暗示PIEZO1可通过骨中的机械力转导影响成骨细胞-破骨细胞的交流，而PIEZO1的缺失会引起废用性骨质疏松。在机制上，本发明人揭示了PIEZO1可以响应机械应力，通过促进YAP的核定位调节成骨细胞谱系细胞中基质蛋白，主要是II型胶原和IX型胶原的表达。II型胶原和IX型胶原的表达能够抑制破骨细胞分化。因此，本发明提出II型胶原和IX型胶原是PIEZO1在成骨谱系细胞中感应机械应力后的响应蛋白，并能够调控破骨细胞的骨吸收作用，为废用骨质疏松症的治疗提供新的策略。

本发明中，所述的PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路含有：PIEZO1蛋白，YAP蛋白，II或IX型胶原，它们在下文中也被称为“通路蛋白”。所述的II型胶原由Col2α1基因编码；所述的IX型胶原由Col9α1、Col9α2和/或Col9α3编码。

所述的PIEZO1蛋白，人源PIEZO1蛋白可以具有GenBank登录号NP_001136336.2所示的氨基酸序列；鼠源PIEZO1蛋白可以具有GenBank登录号NP_001032375所示的氨基酸序列。

所述的YAP蛋白，人源YAP蛋白可以具有GenBank登录号NP_001123617.1所示的氨基酸序列；鼠源YAP蛋白可以具有GenBank登录号NP_001164618.1所示的氨基酸序列。

所述的II型胶原由Col2α1基因编码，人源COL2α1可以具有GenBank登录号NP_149162.2所示的氨基酸序列；鼠源COL2α1蛋白可以具有GenBank登录号NP_112440.2所示的氨基酸序列。

所述的IX型胶原由Col9α1和Col9α2基因编码，人源COL9α1可以具有GenBank登录号NP_001842.3所示的氨基酸序列；鼠源COL9α1蛋白可以具有GenBank登录号NP_031766.3所示的氨基酸序列。人源COL9α2可以具有GenBank登录号NP_001843.1所示的氨基酸序列；鼠源COL9α2蛋白可以具有GenBank登录号NP_031767.2所示的氨基酸序列。人源COL9α3可以具有GenBank登录号NP_001844.3所示的氨基酸序列；鼠源COL9α3蛋白可以具有GenBank登录号NP_034066.2所示的氨基酸序列。

在应用时，本发明的通路蛋白可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。本发明的通路蛋白可以是天然纯化的产物或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的通路蛋白可以是糖基化的或非糖基化的。本发明的通路蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括具有通路蛋白或通路蛋白活性的通路蛋白多肽片段和类似物。

此外，本发明还包括通路蛋白的衍生蛋白或变异形式，它们也被被应用于本发明的方法或应用中。本发明还包括与本发明的通路蛋白具有50％或以上(优选60％以上，70％以上，80％以上，更优选90％以上，更优选95％以上，最优选98％以上，如99％)同源性的具有相同或相似功能的多肽或蛋白。在蛋白质变体可以经过若干个(通常为1-60个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)取代、缺失或添加至少一个氨基酸所得的衍生序列，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在所述蛋白中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能，在C末端和/或末端添加一个或数个氨基酸通常不会改变蛋白质的功能。本发明包括通路蛋白类似物与天然通路蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差别，也可以是不影响序列的修饰形式上的差别，或者兼而有之。这些蛋白的类似物包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可以通过定点诱变法或其他已知分子生物学技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。

筛选方法

基于本发明人的新发现，对PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路的研究有着多方面的用途，所述的用途包括：筛选调节该信号通路的物质，以期用于缓解或治疗骨质疏松。其中，所述的调节包括：提高PIEZO1表达或活性，促进YAP进入细胞核(促进YAP核定位)，提高II或IX型胶原的表达或活性。

因此，本发明提供了一种筛选调节PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路的调节剂方法，通过向含有PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路的体系中添加待筛选的候选物，并观察PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路中各蛋白或基因的变化或相互作用来进行筛选。若候选物质提高PIEZO1表达或活性，促进YAP进入细胞核(促进YAP核定位)，提高II或IX型胶原的表达或活性，则该候选物质是对于抑制骨质疏松有用的物质。

如本文所用，所述的“抑制”、“提高”、“促进”均是指具有统计学意义的“抑制”、“提高”、“促进”。也即：显著地“抑制”、“提高”、“促进”。如与对照组的蛋白活性、蛋白表达、蛋白结合或甲基化程度相比，显著“抑制”、“提高”、“促进”20％以上，较佳的50％以上；更佳的80％以上。

所述的含有PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路的体系选自：细胞体系(或细胞培养物体系)、亚细胞体系(或亚细胞培养物体系)、溶液体系、动物体系或组织体系(或组织培养物体系)。作为本发明的优选方式，所述的含有PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路的体系包括(但不限于)：成骨系细胞(成骨细胞、骨髓间充质干细胞)和骨髓单核细胞共同构成的成骨细胞和破骨细胞共培养体系；骨髓单核细胞在体外向破骨细胞分化的体系。

作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于缓解或治疗骨质疏松有用的物质。

当进行筛选时，可以采用本领域熟知的各种技术来确定蛋白或其编码基因的变化情况以及相互作用情况。

可以采用多种常规的技术来鉴定系统中基因的转录或表达情况。这些技术包括但不限于：寡核苷酸杂交技术(如探针)，多聚酶链反应(PCR)，聚丙烯酰胺凝胶电泳等。检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人员熟知的技术，比如免疫共沉淀技术、GST沉降技术、噬菌体展示技术或酵母双杂交系统。蛋白的核定位也是本领域熟知的技术。

通过上述方法初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于缓解或治疗骨质疏松真正有用的物质。

本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于缓解或治疗骨质疏松的潜在物质。例如，XMU-MP-1可以作为一种有效物质加以研究。

本发明还提供了一种制备缓解或治疗骨质疏松(特别是抑制骨质疏松)的药物的方法，所述方法包括：合成和/或纯化前述筛选获得的对于缓解或治疗骨质疏松有用的物质，作为用于缓解或治疗骨质疏松的药物。

可将获得的对于缓解或治疗骨质疏松有用的物质用于制备药物组合物，如本发明的下文中所述。

II或IX型胶原及其上调剂及药物组合物

基于本发明的新发现，本发明还提供了II或IX型胶原或其上调剂的用途，用于制备缓解或治疗骨质疏松的药物组合物。

如本文所用，术语“II或IX型胶原或其上调剂”包括了促进剂、激动剂、激活剂。所述的“上调”、“促进”包括了蛋白活性的“上调”、“促进”或蛋白表达的“上调”、“促进”。任何可提高II或IX型胶原的活性、提高II或IX型胶原的稳定性、上调II或IX型胶原的表达、增加II或IX型胶原有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调II或IX型胶原有用的物质，从而可用于发挥调控作用或治疗疾病。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水平的。

II或IX型胶原的上调剂可包括：II或IX型胶原的结合蛋白、II或IX型胶原的化学上调剂、强II或IX型胶原与其上下游蛋白相互作用的蛋白、化合物或其组合。

II或IX型胶原的上调剂还可包括：促进YAP进入细胞核的物质。本发明的实施例中证明，促进YAP入核的物质可以上调II或IX型胶原的表达，从而抑制破骨细胞分化，有利于抑制骨质疏松。作为本发明的优选方式，所述的促进YAP进入细胞核的物质包括：XMU-MP-1。

如本文所用，术语“II或IX型胶原的上调剂”是指激活II或IX型胶原的编码基因复制或转录的物质，或增加II或IX型胶原的编码基因表达的物质。例如包括(但不限于)：促进II或IX型胶原的编码基因的启动子的上调剂、II或IX型胶原编码基因特异性的过表达蛋白、II或IX型胶原编码基因特异性microRNA的下调剂、促进相互作用的衍生蛋白、化合物或其组合。

本发明还提供了包含有II或IX型胶原或其上调剂，或前述筛选产物的药物组合物，用于缓解或治疗骨质疏松，特别是废用性骨质疏松。

本发明的药物组合物包含安全、有效量范围内的所述II或IX型胶原或其上调剂，或前述筛选产物，及药理上(药学上)可以接受的赋形剂或载体。

如本文所用，术语“安全、有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而物过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂与给药方式匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领有普通技术人员根据各因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括(但不限于)：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病严重程度、患者体重、患者的免疫状况、给药的途径等。

所述药物组合物可以单独用药，或者与其他药学上可接受的化合物联合用药。

所述的药学上可接受的载体可以包括(但不限于)：脂质体、纤维素、纳米凝胶、水、盐水、蛋白、肽类物质、蛋白-抗体缀合物、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域普通技术人员所熟知的。

基于本发明人的上述新发现，还可以将PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路或其中的通路蛋白作为骨质疏松诊断或预后评估的标志物：(i)进行骨质疏松的分型和/或鉴别诊断；(ii)评估相关人群的患病风险、药物疗效、预后，以及选择合适的治疗方法。比如，可分离出由基因表达异常的人群，从而可进行更有针对性地治疗。

根据本发明人的新发现，可以通过判断待评估样本中PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路或其通路蛋白的表达情况或活性情况，来预测提供该待评估样本的受试者的骨质疏松预后情况，选择合适的药物实施治疗。通常，可以规定一个PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路或其通路蛋白的表达或活性的阈值，当超出所规定的阈值时，考虑该通路异常，从而制定合适的方案进行治疗。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如《分子克隆实验指南》(第2版，冷泉港实验室出版社)所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

2.实验材料和方法

2.1.实验材料

2.1.1实验动物

实验小鼠背景均为C57BL/6J背景。不同品系小鼠来源如下：Piezo1^fl/fl小鼠，由上海南方模式动物生物科技有限公司构建；Prx1-Cre小鼠，购自Jackson Laboratory；Dmp1-Cre小鼠，获自南方科技大学；Col1-Cre-Ert2小鼠，获自营养科学研究所周斌实验室；Ctsk-Cre小鼠，获自University of Tokyo，Dr.S.Kato实验室。实验小鼠均饲养于中国科学院上海生化与细胞所SPF级实验动物中心，所有动物实验的操作符合《上海市实验动物管理办法》，操作流程均通过了上海生化细胞所动物管理和使用委员会的审批。

2.1.2哺乳动物细胞株

293T：购自美国ATCC保藏中心，来源于人胚肾上皮细胞，表达SV40T抗原，用于病毒包装、转染表达蛋白等。

C3H10T1/2：购自美国ATCC保藏中心，来源于小鼠胚胎，用于药物处理和荧光素酶报告实验。

2.1.3实验试剂

实验试剂如表1。

表1

2.1.4抗体

抗体及其来源如表2。

表2

2.1.5引物序列

引物序列如表3。

表3

2.2实验方法

2.2.1分子克隆

聚合酶链式反应，琼脂糖凝胶电泳，限制性内切酶反应，载体连接及感受态的转化，质粒抽提等分子克隆实验参考《分子克隆实验指南》(第2版，冷泉港实验室出版社)，并参照相关试剂盒说明书进行。

2.2.2RNA抽提、转录及荧光定量PCR

根据常规方法进行。

2.2.3蛋白免疫印迹

根据常规方法进行。

2.2.4慢病毒包装及细胞感染

1.表达质粒构建

Col2α1表达质粒：Col2α1运用GenBank CCDS37189.2号中第1～4464位核苷酸进行重新组构建，插入到pyr1.1质粒的位点NheI(4608)和NotI(5393)之间。

Col9α2表达质粒：Col9α2运用GenBank CCDS18599.1号中第1～2067位核苷酸进行重新组构建，插入到pyr1.1质粒的位点NheI(4608)和NotI(5393)之间。

2.准备293FT细胞

下午5～7时，按密度为2.5×10⁵/ml将293FT细胞接种至直径为10cm的培养皿中，于5％CO₂，37℃培养箱中培养过夜，次日上午9时左右更换新鲜1/10抗性培养液；

3.质粒转染

利用Effectene转染试剂盒进行；

4.收获病毒

转染后48小时，收取含有病毒的培养液，用0.45μm的滤膜过滤培养液，分装冻存于-80℃。

5.病毒感染细胞

将待感染的细胞铺板，24小时后，将融化的病毒溶液与新鲜培养基按1：4的比例加入到待感染细胞上，并按终浓度为5μg/ml加入polybrene以增加病毒感染效率。感染病毒24小时后更换为新鲜的培养基，感染48小时后观察荧光或用病毒所携带的抗性药物嘌呤霉素(终浓度为2μg/ml)筛选细胞，直至未感染病毒的对照组细胞死亡为止。

2.2.5小鼠骨髓干细胞成骨分化及检测

1.小鼠骨髓干细胞的分离和培养

手术器械(剪刀，镊子)，研钵等高压灭菌，取小鼠后肢股骨和胫骨，去除皮肤，肌肉，关节软骨，用吸入PBS的注射器冲出骨髓并收集，将得到的细胞悬液经1200rpm，离心3min，弃上清，用1ml培养基吹散细胞，用含有10％FBS，1％青霉素/链霉素双抗的α-MEM培养基于37℃培养；待细胞贴壁后，更换新鲜培养基继续培养至80％～90％汇合，消化铺板，进行后续实验。

2.细胞铺板

待细胞长至90％时，用胰酶消化计数，重悬成单个细胞，按照2×10⁵/ml的密度铺板于96孔板(每孔100μl)或12孔板(每孔1ml)，37℃培养过夜；

3.更换为成骨分化培养基

含有10％FBS，1％青霉素/链霉素双抗的α-MEM培养基，添加0.05mg/ml L-抗坏血酸和1.08mg/mlβ-甘油磷酸钠，每3天换一次液，更换为成骨分化培养基的第7天检测ALP活性和相关标志基因的表达，第21天检测钙结节形成情况；

4.成骨细胞Alamar Blue计数及ALP活性定量

在检测前1小时加入培养基体积1/10的Alamar Blue，37℃孵育2小时，用Envision读数(最大吸收波长540nm，最大发射波长590nm)；吸除含有Alamar Blue的培养基，PBS清洗一遍；96孔板每孔加入50μl底物反应液(配方如下)，室温避光反应30min，Envision读数(最大吸收波长405nm)；

5.成骨细胞ALP染色

将细胞培养孔中培基吸除，用PBS洗一遍。加预冷的10％中性福尔马林溶液静置固定5分钟后，吸除固定液，用PBS洗10min，吸干液体，按照碧云天BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒说明书加入反应底物，室温避光反应20分钟后，吸除反应底物，用ddH20洗一遍后吸干液体，晾干后倒置显微镜拍照；

6.成骨细胞茜素红染色

将细胞培养孔中培基吸除，用PBS洗一遍。加预冷的10％中性福尔马林溶液静置固定5分钟后，吸除固定液，用PBS洗10min，吸干液体，加入茜素红染液到每孔中，室温下孵育20分钟，吸除反应底物，用ddH20洗一遍后吸干液体，晾干后倒置显微镜拍照。

2.2.6小鼠原代骨髓单核细胞成破骨分化及检测

1.细胞分离与铺板

手术器械(剪刀，镊子)，研钵等高压灭菌，取小鼠后肢股骨和胫骨，去除皮肤，肌肉，关节软骨，用吸入PBS的注射器冲出骨髓并收集，将得到的细胞悬液经1200rpm，离心3min，弃上清，用1ml培养基吹散细胞，用含有10％FBS，1％青霉素/链霉素双抗的α-MEM培养基于37℃培养24h，待成纤维细胞贴壁后取上层未贴壁的悬浮细胞，离心计数，按3-5×10⁶/ml的密度铺板，用10ng/ml M-CSF的培养基重悬细胞；

2.加入破骨分化培养基

铺板后第3天，第5天，第6天分别更换为含有20ng/ml M-CSF，150ng/ml RANKL的培养基，同时收集30μl原培养上清，保存于-20℃；铺板后第7天，应可以看到融合的破骨细胞，进行TRAP染色，同时收集30μl原培养上清；

3.TRAP染色

利用Sigma的TRAP染色试剂盒进行染色。

4.TRAP活性定量

按以下配方准备0.33M酒石酸盐缓冲液：

0.33M L-tartaric acid 2mL

0.33M sodium tartrate dibasic dehydrate 48ml

混合后，微调pH至4.9

按以下配方准备760mM pNPP缓冲液：

用高浓度NaOH溶液调节pH值到10.4，补加ddH2O至200ml。取90μl pNPP缓冲液，加入25.4mg磷酸酶底物(Phosphatase substrate)，配制成760mM pNPP；

按以下配方配制反应底物：

将收集的30μl培养上清转移至96孔板中，每孔加入90μl的反应底物，37℃避光孵育2h，每孔加入30μl 3N NaOH终止反应，酶标仪读取405nm处的吸光值。

2.2.7小鼠原代骨髓干细胞和骨髓单核细胞共培养及破骨细胞形成程度的检测

1.小鼠原代骨髓干细胞的分离和培养

2.骨髓干细胞细胞铺板

待细胞长至90％时，用胰酶消化计数，重悬成单个细胞，按照3×10⁵/ml的密度铺板于24孔板(每孔500μl)或12孔板(每孔1ml)，37℃培养过夜；

3.小鼠骨髓单核细胞的分离方法

手术器械(剪刀，镊子)，研钵等高压灭菌，取小鼠后肢股骨和胫骨，去除皮肤，肌肉，关节软骨，用吸入PBS的注射器冲出骨髓并收集，将得到的细胞悬液经1200rpm，离心3min，弃上清，用1ml培养基吹散细胞，用含有10％FBS，1％青霉素/链霉素双抗的α-MEM培养基于37℃培养24h，待成纤维细胞贴壁后取上层未贴壁的悬浮细胞，离心计数；

4.骨髓干细胞和骨髓单核细胞的共培养

24孔板(每孔500μl)或12孔板(每孔1ml)的骨髓干细胞在37℃培养24h后，将培养24h后的骨髓单核细胞收集，即待成纤维细胞贴壁后取上层未贴壁的悬浮细胞，离心计数，按2×10⁷/ml的密度铺板，24孔板(每孔250μl)或12孔板(每孔500μl)，配制2×共培养培基，并按24孔板(每孔250μl)或12孔板(每孔500μl)加入，2×共培养培基配方如表4；

表4

10％FBS，1％双抗的α-MEM培养基	10ml
		PGE2(5mM)	4μl
1α,25-Dihydroxyvitamin D3(238μM)	0.84μl

在共培养的第2天、第4天、第六条换一半的2×共培养培基，并在第7-8天收集培养上清，进行破骨细胞的TRAP染色和培养上清的TRAP定量，方法见2.1.6的TRAP染色和上清定量的方法。

2.2.8流式细胞术

分离小鼠原代骨膜细胞，按照以下步骤进行免疫染色后，进行流式细胞分析：手术器械(剪刀，镊子)，研钵等高压灭菌，取小鼠后肢股骨和胫骨，去除皮肤，肌肉，关节软骨，用吸入PBS的注射器冲出骨髓并收集，1300g，4℃，离心5min后用2ml红细胞裂解液重悬并冰上静置5min，用流式缓冲液(含有2％FBS的PBS)中和后，1300g，4℃，离心5min后，用1ml流式缓冲液重悬，计数，调整细胞浓度，每管1×10⁶个细胞/100μl，根据抗体说明书建议浓度进行抗体的染色，冰上避光孵育30min；加1ml流式缓冲液洗细胞，1300g，4℃，离心5min后，弃上清；如一抗有biotin标记，则加Streptavidin偶联的二抗染料，冰上避光孵育20min后再次加1ml流式缓冲液洗细胞，1300g，4℃，离心5min后，弃上清；加100μl流式缓冲液重悬，冰上避光放置，等待流式细胞仪分析；

染色好的细胞，使用Beckman CytoFlex流式细胞仪分析，利用单阳对照管调整电压和调节补偿，并根据阴性对照管设置阳性门。

2.2.9小鼠骨组织X ray成像

小鼠麻醉后，利用Eagle III Microspot X-ray成像仪进行扫描，Faxitron SR数字成像系统进行图像处理。

2.1.10小鼠骨组织Micro-CT分析

小鼠CO₂安乐死后，取股骨样品或颅顶骨样品浸泡在70％的乙醇中保存。利用SkyScan 1276micro-CT仪器进行分析，股骨骨密度扫描精度为9μm。松质骨分析区域为据生长板末端以下0.7mm开始向下的2mm区域；灰度阈值为80-225。皮质骨分析区域为据生长板末端以下4.7mm开始向下的0.5mm区域，灰度阈值范围为120到225。原始图像经过重构后获得可分析的三维图像，利用CTAn软件进行定量分析，利用CTVox软件获得3D重构图像。

2.2.11小鼠胫骨骨计量学分析

1.样品准备

适龄小鼠腹腔注射20mg/kg钙黄绿素(1mg/ml溶于2％NaHCO₃溶液)，四天后腹腔注射40mg/kg茜素红(2mg/ml溶于水)，三天后将小鼠CO₂安乐死后，取胫骨于4％PFA中4℃固定48小时，PBS洗去PFA后于70％，95％，100％乙醇梯度脱水，每步6小时×2，丙酮浸泡6小时×2，1/2丙酮1/2树脂(Embed 812)2小时后，置于干燥箱内用纯树脂浸润过夜。将样品转移至合适大小的硅胶包埋模具中，加入纯树脂至浸没样品，60℃干燥箱内静置聚合48小时。样品用Leica RM2265钨钢刀片进行切片，切片厚度为5μm，室温干燥处保存样品。

2.Von Kossa染色

硬组织切片脱胶复水：5min×2，70％乙醇和ddH₂O各5min；染色：4％硝酸银浸染色5min，ddH₂O洗2min，5％甲醛钠5min，ddH₂O洗2min，5％硫代硫酸钠5min，ddH₂O洗2min；复染：酸性品红染色20min，1％乙酸5sec，ddH₂O 5sec，橙黄G 7min，1％乙酸5sec，ddH₂O 5sec，短暂风干，脱水封片。

酸性品红染液配方：

橙黄G染液配方：

磷钨酸(Phosphotungstic Acid) 8g

橙黄G(Orange G) 4g

ddH₂O 800ml

2.2.12石蜡切片

小鼠CO₂安乐死后，取腿骨在4％PFA中4℃固定48小时，PBS洗去PFA后于超声脱钙仪脱钙，PBS冲洗后于70％乙醇中4℃过夜，依次用95％，100％乙醇，二甲苯梯度脱水，每步1小时重复两次，再放入二分之一苯/石蜡中30min，石蜡I，1小时，石蜡II浸润过夜后包埋。切片厚度为7μm，42℃水浴展片，37℃烤片过夜，-20℃保存样品。

2.2.13H&E染色

按照常规方法进行。

2.2.14TRAP染色

按照常规方法进行。

2.2.15石蜡切片免疫荧光

按照常规方法进行。

2.2.16钙成像

细胞种在24孔细胞爬片(NEST)，在37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24h；弃掉培基，用1×HBSS洗涤三次，加入含Fluo-4-AM ester(2μM；赛默飞)的1×HBSS孵育30min后，用1×HBSS洗涤三次，并在在37℃，5％CO2的细胞培养箱孵育15min，使Fluo-4-AM充分酯化，然后将细胞爬片加载到蠕动泵流体装置上，加载含有Yoda1(5uM)的1×HBSS，利用活细胞高速激光共聚焦及全内反射多维图像工作站对细胞进行时序拍照，照片用Image J进行处理。

2.2.17细胞加压实验

细胞种到水凝胶中(2×10⁶个/孔)，铺到BioFlex加压板(Flexcell)中，周围为正常的含10％FBS的α-MEM培基，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24h后。将加压板加载到Flexcell FX-5000加压系统上，以1％的强度，0.5赫兹的正弦压力处理4h后收集细胞，对照组培养在同一环境，但不施加压力。

2.2.18小鼠阿尔新蓝-茜素红整体染色

1.样本准备：小鼠去皮、去内脏，剔除附着肌肉，剥离指头上的皮肤时要格外小心，避免扯掉指节；

2.固定：将小鼠骨架置于95％乙醇中，摇过夜；

3.脱水脱脂：将小鼠骨架置于丙酮中，摇过夜；

4.染色：将小鼠骨架置于阿尔新蓝-茜素红混合染液中，放于室温摇床，染色时间可根据小鼠发育情况具体调整；

阿尔新蓝-茜素红工作液(现配现用)：200ml

5.消化：染色结束后，用95％乙醇30分钟洗3次，之后置于1％KOH溶液中消化组织，待消化干净后依次换为75％(vol/vol)1％KOH/glycerol，50％(vol/vol)1％KOH/glycerol，25％(vol/vol)1％KOH/glycerol，最后置换为完全甘油；

6.拍照及保存。

2.2.19荧光素酶报告实验

除去细胞培养上清，PBS洗细胞2次，去PBS；加100ul EBC蛋白裂解液/well(12孔板)，室温摇床裂解1h；把裂解液转移到检测试管中，13000rpm，离心1min；取10ul裂解液，加入10ul底物，用枪混匀，避免产生气泡，检测firefly luciferase强度；再向检测管中加入10ul 1x Stop&Glo试剂，用枪混匀，检测renilla luciferase(内参)强度；计算：算出firefly luciferase/renilla luciferase比值，并针对比值做统计分析。

2.2.20统计方法

本文的图表中所有数据均由平均值±标准差(mean±SD)表示。统计学检验：两组数据间的检验使用Student’s t-test。在所有数据中，“ns”代表P≥0.05，表示差异不显著；“*”代表P<0.05，“**”代表P<0.01表示差异显著。

实施例1、在成骨系细胞中缺失Piezo1导致严重的骨质疏松

PIEZO家族作为机械力敏感的通道，在多种组织器官中能够转导机械刺激，并且前人的研究结果暗示了其在成骨方面的作用。

为了研究该家族在骨骼细胞中的作用，本发明人首先在检测了其两个成员Piezo1和Piezo2在骨、成骨细胞和破骨细胞中的表达丰度，发现Piezo2主要在背根神经元中表达，而Piezo1在骨、成骨细胞和破骨细胞中的表达量更高(图1A-C)，说明Piezo1在骨骼系统中可能发挥主要作用。为进一步研究Piezo1对骨骼系统的影响，本发明人构建了Piezo1的条件性敲除小鼠，即利用Prx1^Cre特异性在中胚层来源的间充质干细胞中敲除Piezo1(图1D-E)。Prx1^Cre在四肢、部分颅顶骨表达，但是在椎骨和其他器官中不表达。获得Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠后，本发明人通过荧光定量PCR的方法检测Piezo1在mRNA水平的敲除效率，发现在Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠中Piezo1的表达水平显著下降(图1F)；通过细胞学免疫荧光的方法检测WT和Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠中PIEZO1的蛋白变化，发现在Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠中PIEZO1蛋白减少(图1G)；使用PIEZO1的激动剂处理WT和Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠来源的成骨前体细胞，并通过钙成像的方法发现Piezo1缺失的小鼠成骨前体细胞对Yoda1(为Piezo1激动剂)的响应消失(图1H)。综上所述，本发明人构建了Piezo1在成骨谱系细胞系中敲除的小鼠。

为了研究PIEZO1在成骨谱系细胞中的作用，本发明人对WT和Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠股骨进行了μ-CT分析，发现Piezo1缺失的小鼠表现出骨小梁骨量的减少和皮质骨变薄(图2A)。定量分析结果进一步发现Prx1^Cre,Piezo1^fl/fl小鼠股骨骨密度(BMD)(图2B)、骨体积/组织体积(BV/TV)(图2C)、骨小梁数目(Tb.N)(图2D)、骨小梁分离度(Tb.Sp)(图2F)和皮质骨厚度(Ct.Th)(图2G)都显著下降，但是骨小梁厚度(Tb.Th)(图2E)变化不明显。除此之外，通过X-Ray，本发明人发现6周Prx1^Cre,Piezo1^fl/fl小鼠表现出承重骨多处自发性骨折(图2H)。

本发明人进一步分析了骨折最早发生的时期，通过小鼠阿尔新蓝-茜素红整体染色发现，在胚胎时期和新生0天Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠和WT小鼠类似，没有明显的骨折发生(图3A-B)，而第三天即可见Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠全身多处承重骨的骨折(图3C-D)。通过μ-CT扫描分析，发现新生3天的Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠的骨骼与WT相比表现得更加疏松多孔，但是在新生一天时，两者差异不明显(图3E)。本发明人推测，小鼠在母体羊水存在时，不需要承重，Piezo1缺失的表型不明显。

除此之外，3周大小的Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠颅顶骨也没有明显的差异(图4A)，机体中颅顶骨这一位置是受机械应力影响较小的位置。

上述结果暗示，成骨谱系细胞中PIEZO1能够感受机械应力，维持骨密度。

实施例2、在成骨系细胞中缺失Piezo1导致破骨细胞活性增强

骨质疏松一般为骨骼重塑异常所导致，即骨形成和骨吸收作用的失衡。成骨细胞来源于骨骼干细胞(skeletal stem cells，SSCs；CD31-CD45-Ter119-CD90-6C3-CD105-CD200+)，骨软骨和基质祖细胞前体细胞(pre-bone，cartilage and stroma progenitors，pre-BCSPs，CD31-CD45-Ter119-CD90-6C3-CD105-CD200-)和骨软骨基质祖细胞(bone，cartilage and stromal progenitors，BCSPs，CD31-CD45-Ter119-CD90-6C3-CD105+)，其谱系维持和分化都受到严格的调控。因此本发明人分离了WT和Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠骨髓细胞，通过流式分析发现Piezo1的缺失对骨骼干细胞、祖细胞和前体细胞的数目没有显著的影响(图5A-B)。本发明人推测PIEZO1会影响成骨细胞的分化。于是分离了WT和Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠骨髓干细胞，在体外进行成骨分化。通过对成骨分化碱性磷酸酶ALP染色(图5C-D)和钙结节的茜素红染色(图6C)以及成骨分化标志基因(图6E)的分析，发现PIEZO1对成骨分化的影响并不明显。

为了进一步寻找PIEZO1缺失是如何导致骨质疏松，本发明人对WT和Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠胫骨进行了骨形态计量分析其成骨细胞和破骨细胞的数量。首先，骨形态计量分析出BV/TV和Tb.N与与μ-CT定量分析结果一致，都明显下降(图6A-C)。其次与体外分化结果一致的是，骨形态计量分析出成骨细胞的数目和面积(图6D-E)都没有明显变化。通过钙黄绿素-茜素红双标实验检测矿物沉积速率和骨形成速率，发现WT和Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠之间的差异也不明显(图6F-I)，血清中的成骨标志基因PINP的含量差异也不明显(6J)。对破骨细胞数量和面积分析结果表明，Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠胫骨中骨侵蚀面积、破骨细胞的数量和面积显著增加(图6K-M)，并且血清中骨吸收的标志物CTX-I的含量显著升高(图6N)；对WT和Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠进行酸性酒石酸盐(TRAP)染色，也可以看到Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠中TRAP信号比WT小鼠更强(图6O)。综上所述，PIEZO1在成骨谱系细胞中缺失后，对成骨细胞的影响不明显，主要是增加了破骨细胞的数目和骨吸收的强度，从而导致骨质疏松的发生发展。

实施例3、PIEZO1能够感受承重引起的机械应力刺激

根据前述，在成骨谱系细胞中缺失Piezo1基因会导致长骨破骨细胞活性的增强，但是对颅顶骨的破骨活性并没有显著的影响(图7A)；同时对新生0天的WT和Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠破骨活性进行比较，并无显著变化(图7B和D)；但是出生3天后Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠破骨活性明显增强(图7C和E)。这些结果暗示，成骨细胞Piezo1缺失对破骨细胞活性的增强是依赖于出生后自身承重引起的小鼠骨骼感受机械刺激的变化。

为了进一步探究PIEZO1能否在成骨谱系细胞中起到机械刺激感应的作用，本发明人采用后肢悬吊模拟失重模型(Chowdhury,P.,et al.,Physiol Rep,2013.1(1):p.e00012；Sakai,A.and T.Nakamura,J Musculoskelet Neuronal Interact,2001.1(4):p.387-92)，对WT和Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠悬吊后，进行μ-CT分析。经验证悬吊模型能够诱导骨量的丢失(图8A-F)，并且通过μ-CT 3D图像和定量分析，发现Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠悬吊前后股骨骨密度(BMD)(图8B)、骨体积/组织体积(BV/TV)(图8C)、骨小梁数目(Tb.N)(图8D)、骨小梁厚度(Tb.Th)(图8E)和骨小梁分离度(Tb.Sp)(图8F)变化并不明显。除此之外，悬吊模型能够引起破骨细胞的增多，但是Piezo1缺失后，破骨细胞不能继续增多(图8G-H)。综上所述，本发明人得出结论，成骨谱系细胞中PIEZO1能够转导机械信号，并通过某种方式将信号传递给破骨细胞，促进骨的吸收作用。

实施例4、PIEZO1通过调控骨胶原的形成抑制破骨细胞分化

根据前面的结论，本发明人得知成骨谱系细胞中PIEZO1能够转导机械信号，并通过某种方式将信号传递给破骨细胞，促进骨的吸收作用。那么，PIEZO1是如何通过成骨细胞来影响破骨细胞呢？首先本发明人在体外利用骨髓干细胞和骨髓单核细胞共培养体系，分离WT和Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠的骨髓干细胞和WT小鼠的骨髓单核细胞进行共培养，通过破骨细胞TRAP染色和上清的TRAP定量发现Piezo1缺失的骨髓干细胞更能够促进破骨细胞的形成(图9A-B)。于是本发明人在WT和Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠皮质骨组织中利用RT-PCR筛选经典的成骨细胞分泌调控破骨细胞活性的分泌因子，包括RankL、Opg、Sost、Pthlh、Mcsf和Sema3a，但是PIEZO1似乎并没有对这几个基因的表达水平产生影响(图9C)。于是本发明人对WT和Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠皮质骨RNA进行RNA-seq。从热图上看，Piezo1缺失后皮质骨组织的基因表达谱发生显著变化，在测到的19201个基因中，560个基因上调，297个基因下调改变倍数>1.5，P.value<0.05)(图9D)。对下调的基因进行GO分析发现胞外基质成分被富集(图10E)。进一步分析该类富集的基因主要包括II型胶原(Col2α1)、IX型胶原(Col9α1和Col9α2)、X型胶原(Col10α1)(图9F)。由于I型胶原是骨基质的重要组成部分，但是在测序结果中并没有发现显著变化，本发明人将测序中发现的几种胶原类型和I型胶原在WT和Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠皮质骨RNA进行RT-PCR的验证，发现与测序结果一致，Col2α1、Col9α1和Col9α2的在Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠中表达下降，而Col1α1并没有发生明显变化(图9G)。综上所述，Piezo1缺失后，皮质骨中的II型胶原和IX型胶原的表达显著下降。

接下来，本发明人通过免疫荧光的方法进一步在WT和Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠骨骼组织切片中对COL2α1和COL9α2蛋白水平进行分析，发现COL2α1和COL9α2的分布在Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠比WT显著减少(图10A-B)。于是本发明人假设回补Col2α1或Col9α2能够抑制破骨细胞的分化。在Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠来源的骨髓干细胞中分别感染对照、Col2α1或Col9α2的慢病毒，并与野生型的骨髓单核细胞共培养后，本发明人发现Col2α1或Col9α2均可以抑制Piezo1缺失导致的破骨活性的增强(图10C-D)。这种破骨活性的抑制有利于抑制骨质疏松。

为了直接证明PIEZO1是否能够直接转导机械应力的刺激从而调控胶原的表达，本发明人分离了WT和Prx1^Cre；Piezo1^fl/fl小鼠骨髓干细胞，并利用FlexCelll细胞加压系统对其进行加压处理，发现在WT细胞中施压压力能够促进Col2α1或Col9α2的表达，而在Piezo1缺失的细胞中，Col2α1或Col9α2的表达水平也有微弱上调(图10E-F)。这些结果说明，Col2α1或Col9α2位于PIEZO1机械应力刺激转导的下游。

为了证明COL2α1或COL9α2能够抑制破骨细胞分化，本发明人利用293T细胞过表达COL2α1或COL9α2体系，从过表达Flag-COL2α1或Flag-COL9α2的293T上清中利用Flag-beads富集COL2α1或COL9α2(图11A)。将重组蛋白COL2α1或COL9α2处理骨髓单核细胞向破骨细胞分化，本发明人发现，COL2α1或COL9α2能够抑制破骨细胞的分化(图11B-C)。而使用整合素的抑制剂SB273005或RGD三肽，COL2α1或COL9α2对破骨细胞的无法进一步发挥抑制作用，暗示COL2α1或COL9α2是通过整合素途径起作用(图11D-G)。

实施例5、PIEZO1通过调控YAP入核促进胶原的表达，并抑制破骨细胞分化

那么PIEZO1是如何调控骨胶原的表达呢？本发明人通过免疫荧光的分析发现，Piezo1缺失小鼠中YAP的核定位降低(图12A-B)。本发明人在C3H10细胞(间充质细胞)中敲除YAP后，发现Col2α1和Col9α2的表达水平下降；而对C3H10细胞处理XMU-MP-1，一种MST1/2的抑制剂，能够促进YAP的入核(Fan,F.,et al.,Sci Transl Med,2016.8(352):p.352ra108)，使得Col2α1和Col9α2表达水平提高(图12C-D)。本发明人进一步构建了Col2α1和Col9α2的启动子-荧光素酶报告系统，在C3H10细胞中，发现YAP可以促进Col2α1和Col9α2的表达。综上所述，PIEZO1通过调控YAP入核促进胶原的表达。而在成骨细胞和破骨细胞的共培养系统中处理XMU-MP-1可以抑制由于PIEZO1缺失导致的增强的破骨细胞分化(图12H-I)，进一步证明了YAP作为PIEZO1的下游通路发挥作用。XMU-MP-1可以通过促进YAP的入核而抑制破骨细胞分化，说明其有利于抑制骨质疏松。

实施例6、筛选方法

设置：

测试组：间充质干细胞C3H10细胞(其中含有PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路)，并给予候选物质；

对照组：间充质干细胞C3H10细胞(其中含有PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路)，不给予候选物质。

分别检测测试组和对照组中PIEZO1蛋白，YAP蛋白，II或IX型胶原的相互作用情况，并进行比较。如果测试组中PIEZO1表达或活性提高，YAP进入细胞核(YAP核定位)增加，II或IX型胶原的表达或活性提高(如提高或增强20％或更高)对照组，就表明该候选物是对于缓解或治疗骨质疏松有用的潜在物质。

应用上述建立的体系，以MST1/2的抑制剂XMU-MP-1处理，可以发现YAP入核的增加，Col2α1和Col9α2表达水平提高，因此XMU-MP-1可以作为一种对于骨质疏松有效的物质。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 抑制破骨细胞活性及治疗骨质疏松的试剂及其应用

<130> 198480

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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Claims

1.一种筛选缓解或治疗骨质疏松的物质的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)将候选物质与含有PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路的体系接触；

(2)筛选出调节PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路的物质，所述物质是对于缓解或治疗骨质疏松有用的物质；

其中，所述的调节包括：提高PIEZO1表达或活性，促进YAP进入细胞核，提高II或IX型胶原的表达或活性。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路含有：PIEZO1蛋白，YAP蛋白，II或IX型胶原。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的II型胶原由Col2α1基因编码；所述的IX型胶原由Col9α1、Col9α2和/或Col9α3编码。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含有PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路的体系选自：细胞体系、亚细胞体系、组织体系或动物体系。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)之前或同时，还包括给予所述体系以应力刺激，使得PIEZO1响应该应力刺激，从而促进YAP进入细胞核、提高II或IX型胶原的表达或活性；

步骤(2)中，还包括：测定候选物质的作用，若其能够在统计学上进一步提高步骤(1)的促进YAP进入细胞核、提高II或IX型胶原的表达或活性的效应，则其是对于缓解或治疗骨质疏松有用的物质。

6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1)之前或同时，还包括抑制或敲除PIEZO1，从而降低YAP进入细胞核、降低II或IX型胶原的表达或活性；

步骤(2)中，还包括：测定候选物质的作用，若其能够在统计学上逆转由抑制或敲除PIEZO1而导致的YAP进入细胞核的降低及II或IX型胶原的表达或活性的降低，则其是对于缓解或治疗骨质疏松有用的物质。

7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：向含有PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路的体系中添加候选物质；和

步骤(2)包括：检测PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路中各蛋白或基因的变化，并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的、含有PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路的体系；

若候选物质提高PIEZO1表达或活性，促进YAP进入细胞核，提高II或IX型胶原的表达或活性，则该候选物质是对于缓解或治疗骨质疏松有用的物质。

8.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的骨质疏松为破骨细胞活性或分化异常导致的骨质疏松；或，所述的骨质疏松为废用性骨质疏松。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含有PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路的体系是：细胞体系，包括：成骨系细胞和骨髓单核细胞共同构成的成骨细胞和破骨细胞共培养体系；骨髓单核细胞在体外向破骨细胞分化的体系。

10.PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路的用途，用于筛选缓解或治疗骨质疏松的物质；较佳地，所述的PIEZO1/YAP/II或IX型胶原通路含有：PIEZO1蛋白，YAP蛋白，II或IX型胶原。

11.II或IX型胶原或其上调剂的用途，用于制备缓解或治疗骨质疏松的药物组合物。

12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的II型胶原由Col2α1基因编码；所述的IX型胶原由Col9α1、Col9α2和/或Col9α3编码。

13.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述II或IX型胶原的上调剂包括：

重组表达II或IX型胶原的构建物；

增强II或IX型胶原活性、表达、稳定性或有效作用时间的物质；

II或IX型胶原的结合多肽或化学上调剂；或

促进YAP进入细胞核的物质。

14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述重组表达II或IX型胶原的构建物包括COL2α1和/或Flag-COL9α2的表达盒；或

所述的促进YAP进入细胞核的物质包括：XMU-MP-1。

15.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的II或IX型胶原或其上调剂通过抑制破骨细胞的活性或抑制破骨细胞的分化，从而缓解或治疗骨质疏松。

16.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的骨质疏松为废用性骨质疏松。