CN112771169A - 从微生物生物质回收水不混溶性类异戊二烯化合物的方法 - Google Patents

Abstract

回收一种或多种水不混溶性化合物的方法，其包含：酸化和破坏所述微生物生物质；加热所述经酸化、破坏的微生物生物质，以形成经加热、酸化、破坏的微生物生物质；和使所述经加热、酸化、破坏的微生物生物质与二磺化表面活性剂接触，所述二磺化表面活性剂的量足以从所述微生物生物质释放至少30％的所述一种或多种水不混溶性化合物。

Description

从微生物生物质回收水不混溶性类异戊二烯化合物的方法

发明领域

本发明提供了用于从微生物生物质(microbial biomass)回收水不混溶性化合物的化合物、组合物和方法。所述化合物、组合物和方法可用于大规模且高效率生成水不混溶性化合物。

发明背景

合成生物学的出现带来了以工业规模和质量由可再生资源发酵微生物生成生物燃料、化学品和生物材料的希望。譬如，已在微生物宿主中成功构建了功能性非天然生物学途径，用于生成抗疟药青蒿素的前体类(参见例如Martin et al.,Nat Biotechnol 21：796-802(2003))；脂肪酸衍生的燃料类和化学品类(例如，脂肪酯类、脂肪醇类和蜡类；参见例如Steen et al.,Nature 463：559-562(2010))；制备降胆固醇药物的聚酮合酶类(参见例如Ma et al.,Science 326：589-592(2009))；和聚酮类化合物(参见例如Kodumal，ProcNatl Acad Sci USA 101：15573-15578(2004))。然而，合成生物学的商业成功在很大程度上将取决于可再生成品的生成成本是否可竞争或优于与其相应的不可再生成品的生成成本。

在诸如水不混溶性化合物之类的化合物发酵生成中，烃类脂质分子相与水相一同乳化以形成稳定的乳液，此稳定的乳液必须破坏稳定以便回收粗制的水不混溶性化合物并将其与发酵液的水相分离。在所述水不混溶性化合物法呢烯(倍半萜)的微生物生成过程中，已观察到两种截然不同的乳液：易于用表面活性剂破坏其稳定的轻质油包水型乳液，以及更致密的固体稳定型乳液，在本发明中称为“死细胞层(Dead Cell Layer)”。所述固体稳定型乳液的特征在于存在与全细胞和细胞碎片相关的水不混溶性化合物。典型的破乳技术，例如添加表面活性剂、加热、以及调节pH值，均对破开致密乳液层无效。此举导致产物大量损失至废物流中，在离心和从水相分离出水不混溶性化合物级分过程中，所述致密乳液在废物流中分层。需要能够从发酵培养基的死细胞层中回收水不混溶性化合物的组合物和方法。

发明摘要

本发明提供了用于从微生物生物质回收一种或多种水不混溶性化合物的组合物和方法。所述方法通常包含通过酸化微生物生物质和破坏微生物生物质来处理所述微生物生物质的步骤。所述酸化和破坏可以任何顺序进行。在某些实施方案，所述酸化在所述破坏之前。在某些实施方案，所述破坏在所述酸化之前。在某些实施方案，酸化和破坏是同时进行或在时间上是重叠的。本发明描述了酸化和破坏的技术。然后根据本发明所述的技术来加热所得经酸化的、破坏的微生物生物质。随后，使所得经加热、酸化、破坏的微生物生物质与表面活性剂接触，所述表面活性剂能够从所述微生物生物质释放一定量的所述一种或多种水不混溶性化合物。本发明详细描述了有用的表面活性剂。然后从所述表面活性剂组合物中回收所述一种或多种水不混溶性化合物。

所述方法和组合物可用于通过发酵来生成水不混溶性化合物。用于所述方法和组合物的特定水不混溶性化合物包括类异戊二烯类、聚酮类化合物和脂肪酸类。

附图简要说明

图1A提供了用于进行本发明提供的某些方法的示例性体系的示意图。图1B提供了用于进行本发明提供的某些方法的生产规模体系的示意图。图1C提供了用于进行本发明提供的某些方法的中试规模体系的示意图。

图2提供了来自均质化步骤的样品。

图3提供了来自表面活性剂步骤的样品。

图4提供了在表面活性剂步骤之后的样品，其中有机层中含71％的水不混溶性化合物，水层中含21％的水不混溶性化合物，以及死细胞层中仅剩余8％的水不混溶性化合物。

优选具体实施方式

定义

当提及本发明提供的组合物和方法时，除非另有说明，否则下列术语具有以下含义。除非另有定义，否则本发明使用的所有技术术语和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在本发明术语有多个定义的情况下，除非另有说明，否则以本章节中的定义为准。

除非另有说明，否则本发明使用的术语“烷基”是指饱和的直链或支链烃。在某些实施方案，所述烷基基团是伯烃、仲烃或叔烃。在某些实施方案，所述烷基基团包括1至10个碳原子，即C₁至C₁₀烷基。在某些实施方案，所述烷基基团是选自由以下组成的组：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、和2,3-二甲基丁基。在特定实施方案，所述烷基基团是未取代的。

就组合物而言，术语“基本上不含”或“基本上不存在”是指组合物包含至少85或90重量％，在某些实施方案，包含95、98、99或100重量％的所述化合物的指定对映异构体。在某些实施方案，在本发明提供的方法和化合物中，所述化合物基本上不含对映异构体。

同理，就组合物而言，术语“分离的”是指组合物包含至少85、90、95、98、99至100重量％的所述化合物，其余的包含其他化学物质或对映异构体。

本发明使用的术语“宿主细胞”是指任何单细胞或多细胞生物体。在某些实施方案，所述宿主细胞适于通过发酵生长。在某些实施方案，宿主细胞生成一种或多种水不混溶性化合物。在某些实施方案，所述宿主细胞是重组的，包含能够生成一种或多种水不混溶性化合物的一种或多种异源酶。在某些实施方案，所述宿主细胞是重组的，包含能够生成一种水不混溶性化合物的一种或多种异源酶。

本发明使用的术语“水不混溶性化合物”是指当与水混合时不形成溶液的目的化合物。所述水不混溶性化合物可与水形成第二层，或与水形成乳液，或其组合。在特定实施方案，所述水不混溶性化合物是由宿主细胞生成的水不混溶性化合物。

本发明使用的术语“天然的/原生的(native)”或“内源的/内源性/內源”是指可在宿主细胞中天然存在的物质或过程/方法。

本发明使用的术语“经遗传修饰的”表示包含异源核苷酸序列的宿主细胞。

本发明使用的术语“异源性/异源/异源的”是指通常在自然界中不存在的物质。譬如，当与核酸(DNA或RNA)或蛋白质关联使用时，术语“异源性/异源/异源的”是指作为生物体、细胞、基因组或存在于其中的DNA或RNA序列的一部分非天然存在的核酸或蛋白质，或存在于基因组或DNA或RNA序列中的细胞或位点上并与天然存在的那些区分开来的核酸或蛋白质。当与核酸(DNA)关联使用时，术语“异源性/异源/异源的”还可指与内源性启动子之外的启动子可操作地连接的核酸。术语“异源化合物”是指由通常不生成所述化合物的细胞生成的化合物，或者以通常由细胞不能生成的水平生成的化合物。

本发明使用的短语“异源性酶/异源酶”是指在自然界中通常不存在于给定细胞中的酶。所述术语包含的酶有：(a)对于给定细胞而言是外源的(即，由非天然存在于所述宿主细胞中或不在所述宿主细胞的给定环境中天然存在的核苷酸序列编码)；和(b)天然存在于所述宿主细胞中(例如，所述酶由对细胞而言是内源性的核苷酸序列编码)，但在所述宿主细胞中以非天然量(例如，大于或小于所述天然存在的量)生成。

本发明使用的术语“天然存在的”是指在自然界中发现存在的物质。相反，本发明使用的术语“天然不存在的”是指在自然界中未发现存在但可由人为干预生成的物质。

术语“氨基酸序列”、“肽”、“寡肽”、“多肽”和“蛋白质”在本发明中可交换使用，并且是指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以或不可以进行化学或生物化学修饰。

术语“多核苷酸”和“核酸”在本发明中可交换使用，是指任何长度的聚合形式，核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸两者。

术语“分离的核酸”当应用于DNA时，是指与在其起源的生物体的天然存在的基因组中紧邻的序列进行分离的DNA分子。“分离的核酸”还包括非基因组核酸，例如cDNA或其他非天然存在的核酸分子。

术语“cDNA”在本发明中定义为可通过由获自细胞的成熟的、剪接的mRNA分子逆转录而制得的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相应基因组DNA中的内含子序列。

本发明使用的短语“可操作地连接”是指核酸序列之间的功能性连接，使得所述连接的启动子和/或调控区功能性地控制所述编码序列的表达。

本发明使用的术语“生成量/产生量”通常是指由本发明提供的经遗传修饰的宿主细胞生成的水不混溶性化合物的量。在一些实施方案，生成量表示为由所述宿主细胞生成的所述水不混溶性化合物的产量。在其他实施方案，生成量表示为生成所述水不混溶性化合物时所述宿主细胞的生产率。

术语“产率/产量”是指由宿主细胞生成水不混溶性化合物的量，表示为由所述宿主细胞消耗的每碳源量生成的水不混溶性化合物的量，以重量计。在一些实施方案，术语“产率/产量”是指每加入到发酵容器或烧瓶中的总还原糖的量所生成的水不混溶性化合物的量(即非分解代谢生成的克数除以所加总还原糖的克数，以百分数表示)。所述总还原糖是以克计的糖的测量单位。还原糖是能够用作还原剂的任何糖，因为其具有游离的醛基基团或游离的酮基团。所有的单糖，如半乳糖、葡萄糖和果糖均是还原糖类。譬如，如果通过向宿主细胞中加入100克葡萄糖(即100克还原糖)生成10克水不混溶性化合物，则每还原糖的产物产率为10％。

本发明使用的术语“生产率”是指由宿主细胞生成水不混溶性化合物的量，表示为每单位量的发酵液或发酵培养基生成的水不混溶性化合物的量(以重量计)，在所述发酵液或发酵培养基中所述宿主细胞根据时间(每小时)进行培养(按体积计)。

术语“发酵”用于指培养利用碳源(例如糖)作为能源以生成所需产物的宿主细胞。

术语“培养基”是指使细胞生物量生长并由宿主细胞生成代谢物的培养基。其含有碳源，还可进一步含有氮源、磷源、维生素源，矿物质源等。

本发明使用的术语“发酵培养基”可与“培养基”同义使用。通常，术语“发酵培养基”可用于指适合长时间培养宿主细胞以生成所需化合物的培养基。

术语“培养基/媒介”是指培养基和/或发酵培养基。所述“培养基/媒介”可以是液体或半固体。给定的培养基/媒介可以是培养基和发酵培养基两者。

术语“全细胞发酵液/全细胞培养基(whole cellbroth)”是指容器(例如，烧瓶、板、发酵罐等)的全部内容物，包括细胞、水相、在烃相中生成的化合物、和/或乳液。因此，全细胞发酵液/全细胞培养基包括培养基的混合物，所述培养基包含水、碳源(例如糖)、矿物质类、维生素类、其他溶解或悬浮的物质、微生物类、代谢物类、和由宿主细胞生成的化合物类、以及保持在由宿主细胞制备水不混溶性化合物的容器中的物料的所有其他成分。

术语“发酵组合物”可与“全细胞发酵液/全细胞培养基”交换使用。如果所述发酵组合物是在发酵过程中加至发酵容器，则发酵组合物也可包括覆盖物。

术语“生物合成途径”是指采用合成代谢或分解代谢生物化学反应的集合的途径，用于将一种化学物质转化成另一种化学物质，从而生成分子的生物合成。如果基因产物平行或串联作用于相同的底物，生成相同的产物，或作用于或生成所述相同底物和代谢物终产物之间的代谢中间体(例如代谢物)，则所述基因产物属于相同的“生物合成途径”。

本发明使用的术语“启动子”是指能够赋予、激活或增强DNA编码序列表达的合成的或天然来源的核酸。启动子可包含一个或多个特异性转录调控序列以进一步增强表达和/或改变所述编码序列的空间表达和/或时间表达。启动子可位于其控制下的所述编码序列的5'位(上游)。所述启动子与待表达的编码序列之间的距离可与所述启动子和其控制的天然核酸序列之间的距离大致相同。如本领域所知，可适应所述距离的变化而不丧失启动子功能。

短语“菌株稳定性”通常是指通过本发明所述的经遗传修饰的宿主细胞在长时间的发酵过程中生成异源化合物的稳定性。具体而言，稳定性是指在延长培养时间例如约3至20天时，微生物维持非分解代谢发酵产物的有利生成特性(即，高产率(每克底物的化合物克数)和/或生产率(每升发酵液每小时的克数))的能力。遗传稳定性，是指所述生成微生物群倾向于随着时间的推移几乎不改变与产品生成相关的基因的预期等位基因频率，所述遗传稳定性在产品的持续生成中起主要作用。

除非另有说明，培养基或培养溶液中水不混溶性化合物或其他组分的浓度单位是重量/体积百分数。定义为溶质浓度(w/v％)＝(溶质重量(g)/溶液体积(mL))×100。

术语“转录调控因子”是指控制基因表达的蛋白质。

术语“转录激活因子”是指激活或正调控基因表达的转录调控因子。

术语“转录抑制因子”是指抑制或负调控基因表达的转录调控因子。

术语“影响细胞生长的基因”或“编码影响细胞生长的蛋白的核酸”是指编码影响细胞的细胞生长(例如，生长速率或细胞生物量)的蛋白的核酸。

术语“必需基因”是指在所有营养物均可用的最佳条件下维持生命所绝对需要的基因。

术语“条件性必需基因”是指仅在某些情况或生长条件下必需的基因。

术语“调节子”是指由相同调控蛋白(例如，转录调节子)进行调控的基因组或核酸组。调节子的基因具有调控结合位点或具有由共同转录调控因子进行调控的启动子。包含调节子的基因组或核酸组可相邻接地或不相邻接地位于宿主细胞的基因组中。

术语“诱导型启动子”是指被诱导物激活以诱导其控制的基因转录的启动子。

短语“组成型启动子”是指不需要存在诱导物来诱导其控制的基因转录的启动子。

除非另有说明，术语“表达”是指通过相关基因转录生成mRNA，和/或通过基因转录而后进行mRNA翻译生成蛋白质。

本发明使用的术语“分解代谢”是指分子分解或将大分子降解成更小分子的过程/方法。

术语“非分解代谢”是指从较小单元构建分子的过程/方法，并且所述这些反应通常需要能量。术语“水不混溶性化合物”是指通过非分解代谢过程/方法生成的化合物。

除非上下文另有明确指出，否则术语“一个”、“一种”和“所述”表示“至少一个”。

方法和组合物

本发明提供了用于从微生物生物质回收一种或多种水不混溶性化合物的组合物和方法。在某些实施方案，所述方法包含以下步骤：酸化所述微生物生物质，破坏所得组合物，加热所得组合物，使所得组合物与表面活性剂接触，所述表面活性剂能够从所述微生物生物质释放一种或多种水不混溶性化合物，以及回收所述一种或多种水不混溶性化合物。

本发明提供了用于从微生物生物质回收一种或多种水不混溶性化合物的组合物和方法。在某些实施方案，所述方法包含以下步骤：破坏所述微生物生物质，酸化所得组合物，加热所得组合物，使所得组合物与表面活性剂接触，所述表面活性剂能够从所述微生物生物质释放一种或多种水不混溶性化合物，以及回收所述一种或多种水不混溶性化合物。

在某些实施方案，采用技术人员认为合适的破乳化表面活性剂使所述微生物生物质破乳化。在一些实施方案，所述破乳化表面活性剂是非离子型表面活性剂。在一些实施方案，所述破乳化表面活性剂是仲醚多元醇。在一些实施方案，所述破乳化表面活性剂是TERGITOL L-62(陶氏化学公司(Dow Chemical Company))。在一些实施方案，所述破乳化表面活性剂的量足以从发酵液(fermentationbroth)或微生物生物质或两者中除去乳液。在某些实施方案，所述微生物生物质采用0.1-2.0％的破乳化表面活性剂进行破乳化。在某些实施方案，所述微生物生物质采用0.2-1.0％的破乳化表面活性剂进行破乳化。在某些实施方案，所述微生物生物质采用0.3-1.0％的破乳化表面活性剂进行破乳化。在某些实施方案，所述微生物生物质采用0.25-0.75％的破乳化表面活性剂进行破乳化。在某些实施方案，所述微生物生物质采用约0.6％的破乳化表面活性剂进行破乳化。在某些实施方案，所述微生物生物质采用约0.6±0.1％的破乳化表面活性剂进行破乳化。在某些实施方案，所述微生物生物质采用0.6％的破乳化表面活性剂进行破乳化。

在某些实施方案，所述方法包含以下步骤：酸化和破坏所述微生物生物质；加热所得组合物；使所得组合物与表面活性剂接触，所述表面活性剂能够从所述微生物生物质释放所述一种或多种水不混溶性化合物；以及回收所述一种或多种水不混溶性化合物。

所述微生物生物质可通过技术人员认为合适的任何技术得到。在典型的实施方案中，所述微生物生物质得自发酵培养基。示例性发酵技术在以下章节中进行描述。在特定实施方案，生成一种或多种水不混溶性化合物的细胞在发酵培养基中进行培养。在某些实施方案，通过例如离心或过滤将水性培养基与微生物生物质分离。所述一种或多种水不混溶性化合物的一部分可用水性发酵培养基乳化。所述一种或多种水不混溶性化合物的另一部分可保留在所述微生物生物质中。本发明提供的方法和组合物能够从此部分中回收一种或多种水不混溶性化合物。所述微生物生物质通常包含细胞和细胞碎片。在某些实施方案，所述微生物生物质还包含发酵培养基。

在所述方法中，通过酸化和破坏来处理所述微生物生物质。所述这些步骤可以任何顺序进行，或其可组合使用。在某些实施方案，将所述微生物生物质进行酸化然后进行破坏。在某些实施方案，将所述微生物生物质进行破坏然后进行酸化。在某些实施方案，将所述微生物生物质同时进行酸化和破坏。当每个步骤在时间上彼此重叠时，可同时进行酸化和破坏。

可通过本领域技术人员显而易见的任何技术来酸化所述微生物生物质。在某些实施方案，将所述微生物生物质酸化至pH值为1-4。在某些实施方案，将所述微生物生物质酸化至pH值为1.5-4。在某些实施方案，将所述微生物生物质酸化至pH值为2-4。在某些实施方案，将所述微生物生物质酸化至pH值为2–3.5。在某些实施方案，将所述微生物生物质酸化至pH值为2-3。在某些实施方案，将所述微生物生物质酸化至pH值为约2.5。在某些实施方案，将所述微生物生物质酸化至pH值为2.5±0.2。在某些实施方案，将所述微生物生物质酸化至pH值为2.5±0.1。在某些实施方案，将所述微生物生物质酸化至pH值为约2.5。在某些实施方案，将所述微生物生物质酸化至pH值为约2.5。

可采用任何pH调节剂来调节pH值。在某些实施方案，所述pH调节剂是无机酸。在某些实施方案，所述pH调节剂选自由盐酸、硝酸、硫酸、及其组合组成的组。在某些实施方案，所述pH调节剂是盐酸。在某些实施方案，所述pH调节剂是硝酸。在某些实施方案，所述pH调节剂是硫酸。

所述微生物生物质可通过本领域技术人员显而易见的任何技术进行破坏。有用的技术包括机械破坏、超声处理、冷冻和解冻、研磨、化学破坏、酶促破坏、和其组合。在某些实施方案，将所述微生物生物质与玻璃珠一同搅拌，例如在珠磨机中一同搅拌。在某些实施方案，将所述微生物生物质冷冻，例如在液氮中冷冻，然后粉碎。在某些实施方案，例如采用休斯压碎机(Hughes press)或法式压碎机(French press)使所述微生物生物质压碎。在某些实施方案，所述微生物生物质在气动压或液压作用下在物理细胞破碎器中进行破坏。在某些实施方案，所述微生物生物质通过压力循环技术进行破坏。在某些实施方案，所述微生物生物质采用微流化器进行破坏。在某些实施方案，所述微生物生物质通过超声进行破坏。在某些实施方案，所述微生物生物质通过热分解进行破坏。在某些实施方案，所述微生物生物质通过减压进行破坏。在某些实施方案，所述微生物生物质通过渗透压休克进行破坏。在某些实施方案，所述微生物生物质通过化学破坏进行破坏。有用的化学物质包括尿素、丁醇和异戊醇。在某些实施方案，所述破坏是通过酶促破坏进行。有用的酶包括溶菌酶、唇形蛋白酶(labiase)、无色肽酶(achromopeptidase)、纤维素酶、蜗牛酶、葡聚糖酶类、甘露聚糖酶类、和几丁质酶类。

在某些实施方案，使用高压均质器进行破坏。在某些实施方案，所述均质器压力是从600bar至1000bar。在某些实施方案，所述均质器压力是从700bar至1000bar。在某些实施方案，所述均质器压力是从800bar至1000bar。在某些实施方案，所述均质器压力是从800bar至900bar。在某些实施方案，所述均质器压力是在900±50bar。在某些实施方案，所述均质器压力是在900±25bar。在某些实施方案，所述均质器压力是在约900bar。在某些实施方案，所述均质器压力是在900bar。

在所述方法中，然后加热所述经酸化、破坏的微生物生物质。所述加热可通过技术人员显而易见的任何技术进行。在特定实施方案，将热量施加于所述微生物生物质。在某些实施方案，将所述微生物生物质加热至55-80℃。在某些实施方案，将所述微生物生物质加热至60-80℃。在某些实施方案，将所述微生物生物质加热至55-75℃。在某些实施方案，将所述微生物生物质加热至65-75℃。在某些实施方案，将所述微生物生物质加热至约70℃。在某些实施方案，将所述微生物生物质加热至约70±2.5℃。

使所述经加热的微生物生物质与表面活性剂接触。所述表面活性剂是能够从所述微生物生物质释放一定量的所述一种或多种水不混溶性化合物的表面活性剂。在某些实施方案，所述方法从所述微生物生物质释放至少10％的所述水不混溶性化合物。在某些实施方案，所述方法从所述微生物生物质释放至少20％的所述水不混溶性化合物。在某些实施方案，所述方法从所述微生物生物质释放至少25％的所述水不混溶性化合物。在某些实施方案，所述方法从所述微生物生物质释放至少30％的所述水不混溶性化合物。在某些实施方案，所述方法从所述微生物生物质释放至少40％的所述水不混溶性化合物。在某些实施方案，所述方法从所述微生物生物质释放至少50％的所述水不混溶性化合物。在某些实施方案，所述方法从所述微生物生物质释放至少60％的所述水不混溶性化合物。在某些实施方案，所述方法从所述微生物生物质释放至少70％的所述水不混溶性化合物。在某些实施方案，所述方法从所述微生物生物质释放至少75％的所述水不混溶性化合物。

表面活性剂可以是技术人员认为合适的任何表面活性剂。在某些实施方案，所述表面活性剂是离子型表面活性剂。在某些实施方案，所述表面活性剂是阴离子表面活性剂。在某些实施方案，所述表面活性剂是聚阴离子表面活性剂。在某些实施方案，所述表面活性剂是磺化表面活性剂。在某些实施方案，所述表面活性剂是磺化苯基醚洗涤剂。在某些实施方案，所述表面活性剂是二磺化苯基醚洗涤剂。在某些实施方案，所述表面活性剂是：

或其盐，其中R是C_6-16烷基。在某些实施方案，所述表面活性剂是选自由DOWFAXC6L、DOWFAX 3B2、DOWFAX C10L、DOWFAX 2A1、DOWFAX 8390、和DOWFAX 30599组成的组。在特定实施方案，所述表面活性剂具有上式所示结构，其中R是C₁₂烷基。在特定实施方案，所述表面活性剂具有上式所示结构，其中R是支链C₁₂烷基。在某些实施方案，所述盐是钠盐。在特定实施方案，所述表面活性剂是DOWFAX 2A1。

在某些实施方案，所述表面活性剂在1wt％活性物、25℃、pH 7或pH 12.5下具有30-40达因(dynes)/com的表面张力。在某些实施方案，所述表面活性剂在1wt％活性物、25℃和pH 7、在初始时间下具有120-160mm的Ross-Miles泡沫高度。在某些实施方案，所述表面活性剂在1wt％活性物、25℃、pH 7、5分钟下具有120-160mm的Ross-Miles泡沫高度。在某些实施方案，所述表面活性剂在1wt％活性物、25℃和pH 12.5、在初始时间下具有130-150mm的Ross-Miles泡沫高度。在某些实施方案，所述表面活性剂在1wt％活性物、25℃、pH12.5、5分钟下具有110-150mm的Ross-Miles泡沫高度。

使所述表面活性剂与所述微生物生物质接触，所述表面活性剂的量足以释放一定量的所述一种或多种水不混溶性化合物。在某些实施方案，使所述微生物生物质与0.02％至2.0％的表面活性剂接触。在某些实施方案，使所述微生物生物质与0.05％至2.0％的表面活性剂接触。在某些实施方案，使所述微生物生物质与0.1％至2.0％的表面活性剂接触。在某些实施方案，使所述微生物生物质与0.2％至2.0％的表面活性剂接触。在某些实施方案，使所述微生物生物质与0.2％至1.8％的表面活性剂接触。在某些实施方案，使所述微生物生物质与0.2％至1.7％的表面活性剂接触。在某些实施方案，使所述微生物生物质与0.2％至1.6％的表面活性剂接触。在某些实施方案，使所述微生物生物质与0.2％至1.5％的表面活性剂接触。在某些实施方案，使所述微生物生物质与0.2％至1.4％的表面活性剂接触。在某些实施方案，使所述微生物生物质与0.2％至1.3％的表面活性剂接触。在某些实施方案，使所述微生物生物质与0.2％至1.2％的表面活性剂接触。在某些实施方案，使所述微生物生物质与0.4％至1.2％的表面活性剂接触。在某些实施方案，使所述微生物生物质与0.6％至1.2％的表面活性剂接触。在某些实施方案，使所述微生物生物质与0.8％至1.2％的表面活性剂接触。在某些实施方案，使所述微生物生物质与约1.0％的表面活性剂接触。在某些实施方案，使所述微生物生物质与1.0±0.1％的表面活性剂接触。

一旦从微生物生物质释放出所述一种或多种水不混溶性化合物，便可使用本领域已知的任何合适的分离和纯化方法将其回收或分离以供后续使用。在一些实施方案，通过离心从发酵中分离出包含所述一种或多种水不混溶性化合物的有机相。在其他实施方案，包含一种或多种水不混溶性化合物的有机相自发地从发酵中分离。在其他实施方案，通过向发酵反应中加入破乳剂和/或成核剂，进而从发酵中分离出包含所述一种或多种水不混溶性化合物的有机相。破乳剂的示例性实例包括絮凝剂和凝结剂。成核剂的示例性实例包括所述水不混溶性化合物本身的液滴以及有机溶剂类如十二烷、肉豆蔻酸异丙酯和油酸甲酯。

在一些实施方案，将所述一种或多种水不混溶性化合物与有机相中可能存在的其他产物进行分离。在一些实施方案，使用吸附法、蒸馏法、气-液萃取法(汽提法)、液-液萃取法(溶剂萃取法)、超滤法和标准色谱技术来实现分离。

在某些实施方案，所述方法从所述微生物生物质回收至少10％的所述水不混溶性化合物。在某些实施方案，所述方法从所述微生物生物质回收至少20％的所述水不混溶性化合物。在某些实施方案，所述方法从所述微生物生物质回收至少25％的所述水不混溶性化合物。在某些实施方案，所述方法从所述微生物生物质回收至少30％的所述水不混溶性化合物。在某些实施方案，所述方法从所述微生物生物质回收至少40％的所述水不混溶性化合物。在某些实施方案，所述方法从所述微生物生物质回收至少50％的所述水不混溶性化合物。在某些实施方案，所述方法从所述微生物生物质回收至少60％的所述水不混溶性化合物。在某些实施方案，所述方法从所述微生物生物质回收至少70％的所述水不混溶性化合物。在某些实施方案，所述方法从所述微生物生物质回收至少75％的所述水不混溶性化合物。

在一些实施方案，至少一种水不混溶性化合物是纯的，例如，至少约40％纯，至少约50％纯，至少约60％纯，至少约70％纯，至少约80％纯，至少约90％纯，至少约95％纯，至少约98％纯，或大于98％纯，其中在水不混溶性化合物的背景下，“纯”是指不含其他水不混溶性化合物和/或污染物的水不混溶性化合物。

在某些实施方案，本发明提供了用于从微生物生物质回收水不混溶性化合物的方法，所述方法包含下列步骤：酸化所述微生物生物质至约pH 2.5，然后在均质器中于约900bar下破坏所述微生物生物质，以形成经酸化、破坏的微生物生物质；在约70℃下加热所述经酸化、破坏的微生物生物质以形成经加热、酸化、破坏的微生物生物质；使所述经加热、酸化、破坏的微生物生物质与约1％DOWFAX 2A1接触，以从所述微生物生物质释放所述一种或多种水不混溶性化合物；和回收所述一种或多种水不混溶性化合物。

在某些实施方案，本发明提供了用于从微生物生物质回收水不混溶性化合物的方法，所述方法包含下列步骤：在均质器中于约900bar下破坏所述微生物生物质，然后酸化所述微生物生物质至约pH 2.5，以形成经酸化、破坏的微生物生物质；在约70℃下加热所述经酸化、破坏的微生物生物质以形成经加热、酸化、破坏的微生物生物质；使所述经加热、酸化、破坏的微生物生物质与约1％DOWFAX 2A1接触，以从所述微生物生物质释放所述一种或多种水不混溶性化合物；和回收所述一种或多种水不混溶性化合物。

在某些实施方案，与缺少本发明提供的一个或多个步骤的类似方法相比，所消耗的表面活性剂的总量有所增加。在某些实施方案，添加第二表面活性剂(例如DOWFAX 2A1)增加了总的表面活性剂耗量。在某些实施方案，总的表面活性剂耗量增加了至少5％。在某些实施方案，总的表面活性剂耗量增加了5-10％。在某些实施方案，总的表面活性剂耗量增加了约7％。

宿主细胞、细胞培养和发酵

所述微生物生物质可通过技术人员显而易见的任何发酵技术得到。在某些实施方案，一种或多种宿主细胞的群体在包含碳源的培养基中生长。在某些实施方案，培养步骤进行至少约12、24、36、48、60、72、84、96小时或大于96小时的一段时间。在某些实施方案，培养步骤进行足以使所述细胞群达到约0.01和400之间的细胞密度(OD₆₀₀)的一段时间。在某些实施方案，将宿主细胞的群体或亚群培养约3至20天的时间。

所述宿主细胞可以是技术人员认为合适的任何宿主细胞。在某些实施方案，所述宿主细胞是天然存在的。在特定实施方案，所述宿主细胞是经遗传修饰的。在某些实施方案，对所述宿主细胞进行修饰以生成水不混溶性化合物。在某些实施方案，所述水不混溶性化合物选自由类异戊二烯、聚酮化合物、和脂肪酸、或其组合组成的组。

在一些实施方案，本发明提供的方法足以生成一种或多种水不混溶性化合物，其生成量为每千克发酵液大于约1、5、10、25、50或100克。在一些实施方案，所述重组生成的水不混溶性化合物的生成量为每千克发酵液约1至250克，约1至200克，约1至150克，约1至100克，约50至250克，约50至200克，约50至150克，大于约100克，或大于约150克。在一些实施方案，所述重组生成的水不混溶性化合物的生成量为每千克发酵液约160克。

在一些实施方案，本发明提供的方法足以生成一种或多种水不混溶性化合物，其生成量为每克干细胞重量大于约3克。在一些实施方案，所述重组生成的水不混溶性化合物的生成量为每克干细胞重量约0.01至约10克，约0.1至约10克，约0.5至约5克，约1至约5克，大于约0.2克，大于约0.3克，大于约0.4克，大于约0.5克，大于约1克，大于约2克，或大于约3克。

在某些实施方案，所述微生物生物质包含一种或多种经遗传修饰的宿主细胞。在某些实施方案，所述经遗传修饰的宿主细胞是包含异源核酸的微生物类(例如，经遗传修饰的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞)。

根据某些实施方案的经遗传修饰的宿主细胞可进行修饰以生成异源水不混溶性化合物(例如，乙酰基Co-A衍生的化合物)。例如，所述经遗传修饰的宿主细胞可进一步包含编码生物合成途径的一种或多种酶的异源核苷酸序列，所述生物合成途径可用于生成水不混溶性化合物。在所述这些实施方案中，与缺乏本发明所述的遗传修饰的亲本宿主细胞相比，所述经遗传修饰的宿主细胞生成更多量的由乙酰辅酶A生物合成的一种或多种化合物。

在某些实施方案，本发明提供了经遗传修饰的宿主细胞，其包含用于稳定生成异源水不混溶性化合物的稳定构建体。在某些实施方案，本发明提供的经遗传修饰的宿主细胞包含编码用于生成异源水不混溶性化合物的生物合成途径的一种或多种酶的一种或多种异源核酸，以及编码一种或多种影响细胞生长的蛋白质(cell-growth-affectingproteins)的一种或多种异源核酸，其中各个所述异源核酸可操作地连接至共同调控的启动子。

在某些实施方案，可将本发明所述的核酸和构建体的各种组合及亚组合引入经遗传修饰的宿主细胞中，以稳定异源核酸的表达，所述异源核酸编码用于生成水不混溶性化合物的生物合成酶。譬如，异源水不混溶性化合物生成宿主细胞可进一步进行修饰以包含本发明所述的稳定化构建体和融合蛋白。

可使用本发明所述的任何合适的载体或本领域已知的载体将本发明所述的异源核酸引入宿主细胞。使用表达载体或染色体整合构建体的经遗传修饰宿主细胞，从而例如在宿主细胞中增加一种或多种水不混溶性化合物的生成量的方法是本领域众所周知的。参见，例如Sherman,F.,et al.,Methods Yeast Genetics,Cold Spring HarborLaboratory,N.Y.(1978)；Guthrie,C.,et al.(Eds.)Guide To Yeast Genetics andMolecular Biology Vol.194,Academic Press,San Diego(1991)；Sambrook et al.,2001,Molecular Cloning--A Laboratory Manual,3^rdedition,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,NY；和Ausubel et al.,eds.,Current Edition,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and WileyInterscience,NY.；各文献公开内容均通过引用并入本发明。此外，可通过缺失、突变和/或基因重排来实现对基因表达的抑制，例如此举使得细胞中一种或多种水不混溶性化合物的生成量增加。其亦可采用反义RNA、siRNA、miRNA、核酶类、三链DNA、以及转录和/或翻译抑制剂来进行。另外，转座子可用于破坏基因表达，例如，通过将其插入所述启动子和所述编码区之间或两个相邻基因之间以使一个或两个基因失活。

在一些实施方案，通过使用表达载体来表达特定蛋白质，例如如上所述的生物合成途径中所涉及的蛋白质，来实现水不混溶性化合物在细胞中增加的生成量。通常，表达载体是重组多核苷酸分子，其包含与编码多肽的核苷酸序列可操作地连接的复制信号和表达控制序列，例如启动子和终止子。可用于表达编码多肽的核苷酸序列的表达载体包括病毒载体类(例如，逆转录病毒类、腺病毒类和腺相关病毒类)，质粒载体类，和粘粒类。适用于酵母细胞的表达载体的示例性实例包括但不限于CEN/ARS和2μ质粒类。适用于酵母细胞的启动子的示例性实例包括但不限于乳酸克鲁维酵母(K.lactis)的TEF1基因的启动子，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的PGK1基因的启动子，酿酒酵母的TDH3基因的启动子，阻抑型启动子类，例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的CTR3基因的启动子，以及诱导型启动子类，例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的半乳糖诱导型启动子类(例如GAL1、GAL7和GAL10基因的启动子)。

可通过本领域技术人员已知的任何方法，且不限于这些方法，将表达载体和染色体整合构建体引入宿主细胞。参见，例如Hinnen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1292-3(1978)；Cregg et al.,Mol.Cell.Biol.5:3376-3385(1985)；美国专利申请号5,272,065；Goeddel et al.,eds,1990,Methods in Enzymology,vol.185,Academic Press,Inc.,CA；Krieger,1990,Gene Transfer and Expression--A Laboratory Manual,Stockton Press,NY；Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning--A LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Laboratory,NY；和Ausubel et al.,eds.,CurrentEdition,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associatesand Wiley Interscience,NY。示例性技术包括但不限于原生质球法(spheroplasting)、电穿孔法、PEG1000介导的转化、和乙酸锂或氯化锂介导的转化。

可用于本发明提供的方法和组合物的细胞包括能够生成融合蛋白的任何细胞。在一些实施方案，细胞能够天然或重组生成水不混溶性化合物，例如类异戊二烯、聚酮化合物、脂肪酸等。在一些实施方案，所述细胞是原核细胞。在一些实施方案，所述细胞是细菌细胞。在一些实施方案，所述细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)细胞。在一些实施方案，所述细胞是真核细胞。在一些实施方案，所述细胞是酵母细胞。在一些实施方案，所述细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。在一些实施方案，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案，所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，COS-7细胞，小鼠成纤维细胞，小鼠胚胎癌细胞，或小鼠胚胎干细胞。在一些实施方案，所述细胞是昆虫细胞。在一些实施方案，所述细胞是S2细胞，施耐德(Schneider)细胞，S12细胞，5B1-4细胞，Tn5细胞，或Sf9细胞。在一些实施方案，所述细胞是单细胞真核生物细胞，例如微生物细胞。

在一些实施方案，所述细胞是菌丝细菌细胞。在一些实施方案，所述菌丝细菌细胞属于放线菌纲。在特定实施方案，所述菌丝细菌细胞属于链霉菌属(Streptomyces)，譬如，产二素链霉菌(Streptomyces ambofaciens)、阿佛曼链霉菌(Streptomycesavermitilis)、远青链霉菌(Streptomyces azureus)、肉桂地链霉菌(Streptomycescinnamonensis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、科腊链霉菌(Streptomycescuracoi)、红霉素链霉菌(Streptomyces erythraeus)、新霉素链霉菌(Streptomycesfradiae)、加利利链霉菌(Streptomyces galilaeus)、淡青链霉菌(Streptomycesglaucescens)、吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)、变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)、微小链霉菌(Streptomyces parvulus)、波塞链霉菌(Streptomycespeucetius)、龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)、玫瑰暗黄链霉菌(Streptomycesroseofulvus)、耐热链霉菌(Streptomyces thermotolerans)、紫红链霉菌(Streptomycesviolaceoruber)。

在另一实施方案，所述细胞是真菌细胞。在更具体的实施方案中，所述细胞是酵母细胞。可用于本发明提供的方法和组合物中的酵母包括已保藏在微生物保藏中心(例如，IFO、ATCC等)，且属于以下属的酵母：芽孢酵母属(Aciculoconidium)，神食酵母属(Ambrosiozyma)，节束酵母属(Arthroascus)，Arxiozyma，阿舒囊霉属(Ashbya)，Babjevia，本森顿酵母属(Bensingtonia)，葡萄藻属(Botryoascus)，Botryozyma，酒香酵母属(Brettanomyces)，布勒掷孢酵母属(Bullera)，布勒担孢酵母属(Bulleromyces)，假丝酵母属(Candida)，固囊酵母属(Citeromyces)，棒孢酵母属(Clavispora)，隐球酵母菌属(Cryptococcus)，产黑色素酵母属(Cystofilobasidium)，德巴利氏酵母属(Debaryomyces)，德克酵母属(Dekkara)，拟双足囊菌属(Dipodascopsis)，双足囊菌属(Dipodascus)，Eeniella，Endomycopsella，Eremascus，假囊酵母属(Eremothecium)，担孢酵母属(Erythrobasidium)，Fellomyces，线黑粉酵母属(Filobasidium)，耐碱酵母属(Galactomyces)，地丝菌属(Geotrichum)，季氏酵母属(Guilliermondella)，有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora)，汉逊酵母属(Hansenula)，Hasegawaea，胶珊瑚属(Holtermannia)，Hormoascus，生丝毕赤酵母属(Hyphopichia)，伊萨酵母属(Issatchenkia)，克勒克酵母属(Kloeckera)，孢克勒克酵母属(Kloeckeraspora)，克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)，Kondoa，Kuraishia，克氏担孢酵母属(Kurtzmanomyces)，白冬孢酵母属(Leucosporidium)，油脂酵母属(Lipomyces)，路德酵母属(Lodderomyces)，马拉色氏霉菌属(Malassezia)，梅奇酵母属(Metschnikowia)，木拉克酵母属(Mrakia)，油脂酵母属无性属(Myxozyma)，拿逊酵母属(Nadsonia)，Nakazawaea，针孢酵母属(Nematospora)，甲醇诱导型酵母属(Ogataea)，卵孢酵母属(Oosporidium)，管囊酵母属(Pachysolen)，厚壁孢酵母(Phachytichospora)，法夫酵母属(Phaffia)，毕赤酵母属(Pichia)，红冬孢酵母属(Rhodosporidium)，红酵母属(Rhodotorula)，酵母属(Saccharomyces)，类酵母属(Saccharomycodes)，覆膜孢酵母属(Saccharomycopsis)，齐藤酵母属(Saitoella)，Sakaguchia，Saturnospora，裂芽酵母孢子菌属(Schizoblastosporion)，裂殖酵母属(SchizoSaccharomyces)，许旺酵母属(Schwanniomyces)，锁掷酵母属(Sporidiobolus)，掷孢酵母属(Sporobolomyces)，原孢酵母属(Sporopachydermia)，冠孢酵母属(Stephanoascus)，梗孢酵母属(Sterigmatomyces)，拟梗抱酵母(Sterigmatosporidium)，Symbiotaphrina，合轴酵母属(Sympodiomyces)，Sympodiomycopsis，有孢圆酵母属(Torulaspora)，Trichosporiella，毛孢酵母属(Trichosporon)，三角酵母属(Trigonopsis)，Tsuchiyaea，Udeniomyces，Waltomyces，威克酵母属(Wickerhamia)，拟威克酵母属(Wickerhamiella)，拟威尔酵母属(Williopsis)，Yamadazyma，耶氏酵母属(Yarrowia)，接合囊酵母属(Zygoascus)，接合酵母属(ZygoSaccharomyces)，接合拟威尔酵母属(Zygowilliopsis)，和Zygozyma等等。

在特定实施方案，本发明提供的方法和组合物中有用的酵母包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，粟酒裂殖酵母(SchizoSaccharomyces pombe)，布鲁塞尔德克酵母(Dekkera bruxellensis)，乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis，此前称为乳酸酵母)，马克斯克鲁维酵母(Kluveromycesmarxianus)，食腺嘌呤芽生葡萄孢酵母(Arxula adeninivorans)，或多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)(现称为安格斯毕赤酵母(Pichia angusta))。在一些实施方案，所述微生物是假丝酵母属(Candida)的菌株，如解脂假丝酵母(Candida lipolytica)，吉利蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)，克鲁斯假丝酵母(Candida krusei)，假热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)，或产朊假丝酵母(Candida utilis)的菌株。

在特定实施方案，所述细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。在一些实施方案，所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞的菌株选自由贝克氏(Baker's)酵母、CBS 7959、CBS 7960、CBS 7961、CBS 7962、CBS 7963、CBS 7964、IZ-1904、TA、BG-1、CR-1、SA-1、M-26、Y-904、PE-2、PE-5、VR-1、BR-1、BR-2、ME-2、VR-2、MA-3、MA-4、CAT-1、CB-1、NR-1、BT-1和AL-1组成的组。在一些实施方案，所述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的菌株选自由PE-2、CAT-1、VR-1、BG-1、CR-1、和SA-1组成的组。在特定实施方案，所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株是PE-2。在另一特定实施方案，所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株是CAT-1。在另一特定实施方案，所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的菌株是BG-1。

在一些实施方案，所述细胞是单倍体微生物细胞。在其他实施方案，所述细胞是二倍体微生物细胞。在一些实施方案，所述细胞是杂合的。在其他实施方案，除了其交配型等位基因外，所述细胞是纯合的(即，如果细胞应形成孢子，则所得的四个单倍体微生物细胞除了它们的交配型等位基因外，其在遗传上是相同的，其中在两个单倍体细胞中将是交配型a，而在另外两个单倍体细胞中将是交配型α)。

在一些实施方案，所述细胞是适于工业发酵(例如，生物乙醇发酵)的细胞。在特定实施方案，所述细胞适应于在高溶剂浓度、高温、扩大的底物利用率、营养限制、由糖和盐引起的渗透应力、酸度、亚硫酸盐和细菌污染、或其组合下存活，所述这些均是公认的工业发酵环境的应激条件。

下文提供了示例性水不混溶性化合物生成细胞，例如，重组生成类异戊二烯类、聚酮类化合物和脂肪酸类的细胞，以及生成此类细胞的方法。

在某些实施方案，本发明方法提供的经遗传修饰的宿主细胞能够生成异源类异戊二烯，并包含编码类异戊二烯途径酶的至少一种异源核酸，所述类异戊二烯途径酶选自由以下组成的组：(a)使两分子乙酰辅酶A缩合形成乙酰乙酰辅酶A的酶；(b)使乙酰乙酰辅酶A与另一分子乙酰辅酶A缩合形成3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)的酶；(c)使HMG-CoA转化为甲羟戊酸的酶；(d)使甲羟戊酸转化为甲羟戊酸5-磷酸的酶；(e)使甲羟戊酸5-磷酸转化为甲羟戊酸5-焦磷酸的酶；(f)使甲羟戊酸5-焦磷酸转化为IPP的酶；(g)使IPP转化为DMAPP的酶；(h)可缩合IPP和/或DMAPP分子以形成含有五个以上碳原子的聚异戊二烯基化合物的聚异戊二烯基合酶；(i)使IPP与DMAPP缩合形成GPP的酶；(j)使两分子IPP与一分子DMAPP缩合的酶；(k)使IPP与GPP缩合形成FPP的酶；(l)使IPP与DMAPP缩合形成GGPP的酶；和(m)使IPP与FPP缩合形成GGPP的酶。

在某些实施方案，所述宿主细胞进一步包含编码修饰聚异戊二烯基的酶的异源核酸，所述酶选自由香叶醇合酶，芳樟醇合酶，柠檬烯合酶，月桂烯合酶，罗勒烯合成酶，α-蒎烯合酶，β-蒎烯合酶，桧烯合酶，γ-萜品烯合酶，萜品油烯合酶，紫穗槐二烯合酶，α-法呢烯合酶，β-法呢烯合酶，法呢醇合酶，橙花叔醇合酶，广藿香醇合酶，诺卡酮合酶，和松香二烯(abietadiene)合酶组成的组。

在某些实施方案，所述宿主细胞包含编码甲羟戊酸途径的所有酶的多种异源核酸。在一些实施方案，所述类异戊二烯是选自由半萜、单萜、二萜、三萜、四萜、和多萜组成的组。在一些实施方案，所述类异戊二烯是C₅-C₂₀类异戊二烯。在一些实施方案，所述类异戊二烯是倍半萜。在一些实施方案，所述类异戊二烯是选自由松香二烯(abietadiene)、紫穗槐二烯、蒈烯、α-法呢烯、β-法呢烯、法呢醇、香叶醇、香叶基香叶醇、异戊二烯、芳樟醇、柠檬烯、月桂烯、橙花叔醇、罗勒烯、广藿香醇、β-蒎烯、桧烯、γ-萜品烯、萜品油烯和瓦伦烯(valencene)组成的组。

在某些实施方案，所述宿主细胞能够生成聚酮化合物，并包含编码聚酮化合物合成酶的至少一种异源核酸，其中所述聚酮化合物合成酶是选自由以下组成的组：(a)使乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A中的至少一个与酰基载体蛋白缩合的酶；(b)使选自由乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A组成的组的第一反应物与选自由丙二酰辅酶A或甲基丙二酰辅酶A组成的组的第二反应物缩合以形成聚酮化合物产物的酶；(c)使聚酮化合物上的β-酮化学基团还原成β-羟基基团的酶；(d)使聚酮化合物中的烷烃化学基团脱水生成α,β-不饱和烯烃的酶；(e)使聚酮化合物中的α,β-双键还原成饱和烷烃的酶；和(f)从酰基载体蛋白水解聚酮化合物的酶。

在某些实施方案，所述聚酮化合物是具有抗生素、抗真菌和抗肿瘤活性中的至少一种的脂质。在一些实施方案，所述聚酮化合物是选自由大环内酯类化合物、抗生素类化合物、抗真菌化合物、抑制细胞生长化合物、抗胆甾醇血的化合物、抗寄生物化合物、抗球虫化合物、动物生长促进剂、和杀虫剂组成的组。

在某些实施方案，所述宿主细胞能够生成脂肪酸，并包含编码脂肪酸合成酶的至少一种异源核酸，其中所述脂肪酸合成酶是选自由以下组成的组：(a)使乙酰辅酶A与丙二酰辅酶A中的至少一个共价连接至酰基载体蛋白(ACP)的酶；(b)使乙酰-ACP和丙二酰-ACP缩合形成乙酰乙酰-ACP的酶；(c)采用NADPH使乙酰乙酰-ACP中的双键还原以在D-3-羟基丁酰羟化酶-ACP中形成羟基基团的酶；(d)使D-3-羟基丁酰羟化酶-ACP脱水以在β-碳和γ-碳之间生成双键而形成巴豆酰-ACP的酶；(e)采用NADPH使巴豆酰-ACP还原形成丁酰-ACP的酶；和(f)从酰基载体蛋白水解C16酰基化合物以形成棕榈酸的酶。在一些实施方案，所述脂肪酸是选自由棕榈酸、棕榈酰辅酶A、棕榈油酸、6(Z)-十六碳烯酸(sapienic acid)、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸、和二十二碳六烯酸组成的组。

在一些实施方案，本发明提供的方法足以生成一种或多种水不混溶性化合物，其以每升发酵培养基大于约10克的量生成。在一些此类实施方案中，所述水不混溶性化合物以每升细胞培养物约10至约50克，大于约15克，大于约20克，大于约25克，或大于约30克的量生成。

类异戊二烯类化合物

在一些实施方案，所述水不混溶性化合物是类异戊二烯。类异戊二烯衍生自异戊烯基焦磷酸(IPP)，其可通过甲羟戊酸依赖性(“MEV”)途径或1-脱氧-D-木酮糖5-二磷酸(“DXP”)途径的酶进行生物合成。

MEV途径

在本发明提供方法的一些实施方案中，经遗传修饰的微生物包含编码MEV途径的一种或多种酶的一种或多种异源核苷酸序列，与未经遗传修饰的亲本细胞相比，其增加了一种或多种类异戊二烯化合物的生成量。

在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码可缩合两分子乙酰辅酶A以形成乙酰乙酰辅酶A的酶(如乙酰辅酶A硫解酶)的异源核苷酸序列。编码此种酶的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(NC_000913REGION(区):2324131.2325315；大肠杆菌(Escherichia coli))，(D49362；脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans))，和(L20428；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))。

在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码可使乙酰乙酰辅酶A与另一分子乙酰辅酶A缩合以形成3-羟基-3-甲基戊二酰-辅酶A(HMG-CoA)的酶(如HMG-CoA合酶)的异源核苷酸序列。编码此种酶的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(NC_001145.补体19061.20536；酿酒酵母)，(X96617；酿酒酵母)，(X83882；拟南芥(Arabidopsisthaliana))，(AB037907；griseola北里孢菌(Kitasatospora griseola))，(BT007302；智人(Homo sapiens))，和(NC_002758，基因座标记SAV2546，基因ID 1122571；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))。

在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码可使HMG-CoA转化为甲羟戊酸的酶(如HMG-CoA还原酶)的异源核苷酸序列。编码此种酶的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(NM_206548；黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))，(NC_002758，基因座标记SAV2545，基因ID 1122570；金黄色葡萄球菌)，(NM_204485；原鸡(Gallus gallus))，(AB015627；链霉菌属(Streptomyces sp.)KO 3988)，(AF542543；野生烟草(Nicotianaattenuata))，(AB037907；griseola北里孢菌)，(AX128213，提供编码截短的HMGR的序列；酿酒酵母)，和(NC_001145：补体(115734.118898)；酿酒酵母)。

在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码可使甲羟戊酸转化为甲羟戊酸5-磷酸的酶(如甲羟戊酸激酶)的异源核苷酸序列。编码此种酶的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(L77688；拟南芥)，和(X55875；酿酒酵母)。

在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码可使甲羟戊酸5-磷酸转化为甲羟戊酸5-焦磷酸的酶(如磷酸甲羟戊酸激酶)的异源核苷酸序列。编码此种酶的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(AF429385；巴西橡胶树(Hevea brasiliensis))，(NM_006556；智人)，和(NC_001145.补体712315.713670；酿酒酵母)。

在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码可使甲羟戊酸5-焦磷酸转化为IPP的酶(如甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶)的异源核苷酸序列。编码此种酶的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(X97557；酿酒酵母)，(AF290095；屎肠球菌(Enterococcusfaecium))，和(U49260；智人)。

在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码MEV途径的多于一种酶的一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码MEV途径的两种酶的一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码可使HMG-CoA转化为甲羟戊酸的酶和编码可使甲羟戊酸转化为甲羟戊酸5-磷酸的酶的一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码MEV途径的三种酶的一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码MEV途径的四种酶的一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码MEV途径的五种酶的一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码MEV途径的六种酶的一种或多种异源核苷酸序列。

在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞还包含编码可使经由MEV途径生成的IPP转化为其异构体二甲基烯丙基焦磷酸(“DMAPP”)的酶的异源核苷酸序列。DMAPP可通过各种其他酶的作用进行缩合和修饰，以形成简单和更复杂的类异戊二烯(图2)。

DXP途径

在本发明所述方法的一些实施方案中，所述类异戊二烯生成细胞包含编码DXP途径的一种或多种酶的一种或多种异源核苷酸序列，与未经遗传修饰的亲本细胞相比，其增加了一种或多种类异戊二烯化合物的生成量。

在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码可缩合两分子乙酰辅酶A以形成乙酰乙酰辅酶A的酶(如乙酰辅酶A硫解酶)的异源核苷酸序列。编码此种酶的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(NC_000913 REGION:2324131.2325315；大肠杆菌(Escherichia coli))，(D49362；脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans))，和(L20428；酿酒酵母)。

在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码可使丙酮酸与D-甘油醛3-磷酸缩合以制备1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸的酶(如1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶)的异源核苷酸序列。编码此种酶的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(AF035440；大肠杆菌)，(NC_002947，基因座标记PP0527；恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440)，(CP000026，基因座标记SPA2301；甲型副伤寒沙门氏菌(Salmonella entericaParatyphi)，参见ATCC 9150)，(NC_007493，基因座标记RSP_0254；类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)2.4.1)，(NC_005296，基因座标记RPA0952；沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CGA009)，(NC_004556，基因座标记PD1293；特曼库拉木质部难养菌(Xylella fastidiosa Temecula1))，和(NC_003076，基因座标记AT5G11380；拟南芥)。

在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码酶如1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶的异源核苷酸序列，所述酶可使1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸转化为2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸。核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(AB013300；大肠杆菌)，(AF148852；拟南芥)，(NC_002947，基因座标记PP1597；恶臭假单胞菌KT2440)，(AL939124，基因座标记SCO5694；天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2))，(NC_007493，基因座标记RSP_2709；类球红细菌2.4.1)，和(NC_007492，基因座标记Pfl_1107；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)PfO-1)。

在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码可使2C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸转化为4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇的酶(如4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇合酶)的异源核苷酸序列。核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(AF230736；大肠杆菌)，(NC_007493，基因座标记RSP_2835；类球红细菌2.4.1)，(NC_003071，基因座标记AT2G02500；拟南芥)，和(NC_002947，基因座标记PP1614；恶臭假单胞菌KT2440)。

在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码酶如4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇激酶的异源核苷酸序列，所述酶可使4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇转化为4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇-2-磷酸。核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(AF216300；大肠杆菌)和(NC_007493，基因座标记RSP_1779；类球红细菌2.4.1)。

在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码酶如2C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸合酶的异源核苷酸序列，所述酶可使4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇-2-磷酸转化为2C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸。核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(AF230738；大肠杆菌)，(NC_007493，基因座标记RSP_6071；类球红细菌2.4.1)，和(NC_002947，基因座标记PP1618；恶臭假单胞菌KT2440)。

在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码酶如1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶的异源核苷酸序列，所述酶可使2C-甲基-D-赤藓糖醇2,4-环二磷酸转化为1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸。核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(AY033515；大肠杆菌)，(NC_002947，基因座标记PP0853；恶臭假单胞菌KT2440)，和(NC_007493，基因座标记RSP_2982；类球红细菌2.4.1)。

在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码可使1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸转化为IPP或其异构体DMAPP的酶(如异戊基/二甲基烯丙基二磷酸合酶)的异源核苷酸序列。核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(AY062212；大肠杆菌)和(NC_002947，基因座标记PP0606；恶臭假单胞菌KT2440)。

在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码DXP途径的多于一种酶的一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码DXP途径的两种酶的一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码DXP途径的三种酶的一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码DXP途径的四种酶的一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码DXP途径的五种酶的一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码DXP途径的六种酶的一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码DXP途径的五种酶的一种或多种异源核苷酸序列。在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码DXP途径的七种酶的一种或多种异源核苷酸序列。

在一些实施方案，所述宿主细胞自身的代谢过程与涉及生成IPP的那些过程之间的“串扰”(或干扰)被最小化或完全消除。譬如，当宿主微生物完全依赖于合成IPP的DXP途径，并且引入MEV途径以提供另外的IPP时，串扰被最小化或完全消除。此宿主生物体将不具备改变MEV途径酶的表达或处理与MEV途径相关的中间体的能力。完全或主要依靠DXP途径的生物体包括例如大肠杆菌(Escherichia coli)。

在一些实施方案，所述宿主细胞经由MEV途径唯一地或与DXP途径组合生成IPP。在其他实施方案，宿主的DXP途径被功能性禁用，使得所述宿主细胞仅通过异源引入的MEV途径生成IPP。通过使基因表达失活或使一种或多种DXP途径酶的功能失活，DXP途径可被功能性禁用。

在一些实施方案，由所述细胞生成的类异戊二烯是C₅类异戊二烯。所述这些化合物衍生自一个异戊二烯单元，也被称为半萜。半萜的示例性实例有异戊二烯。在其他实施方案，所述类异戊二烯是C₁₀类异戊二烯。所述这些化合物衍生自两个异戊二烯单元，也被称为单萜。单萜的示例性实例有柠檬烯、香茅醇(citranellol)、香叶醇、薄荷醇、紫苏醇、芳樟醇、侧柏酮(thujone)和月桂烯。在其他实施方案，所述类异戊二烯是C₁₅类异戊二烯。所述这些化合物衍生自三个异戊二烯单元，也被称为倍半萜。倍半萜的示例性实例有蜚蠊酮B、银杏苦内酯B、紫穗槐二烯、青蒿素、青蒿酸、瓦伦烯、诺卡酮、表-雪松醇、表-马兜铃烯、法呢醇、棉酚、sanonin、蜚蠊酮、毛喉素和广藿香醇(也被称为天竺薄荷醇)。在其他实施方案，所述类异戊二烯是C₂₀类异戊二烯。所述这些化合物衍生自四个异戊二烯单元，也被称为二萜。二萜的示例性实例有蓖麻烯、五加素、紫杉醇、prostratin、伪蕨素和紫杉二烯。在其他实施例，所述类异戊二烯是C₂₀₊类异戊二烯。所述这些化合物衍生自四个以上的异戊二烯单元，包括：三萜类(由6个异戊二烯单元衍生的C₃₀类异戊二烯化合物)，如阿布糖苷E(arbrusideE)、鸦胆丁、睾酮、黄体酮、可的松、洋地黄毒甙和角鲨烯；四萜类(衍生自8个类异戊二烯的C₄₀类异戊二烯化合物)，如β-胡萝卜素；和多萜类(衍生自多于8个异戊二烯单元的C₄₀₊类异戊二烯化合物)，如聚异戊二烯。在一些实施方案，所述类异戊二烯选自由以下组成的组：松香二烯(abietadiene)、紫穗槐二烯、蒈烯、α-法呢烯、β-法呢烯、法呢醇、香叶醇、香叶基香叶醇、异戊二烯、芳樟醇、柠檬烯、月桂烯、橙花叔醇、罗勒烯、广藿香醇、β-蒎烯、桧烯、γ-萜品烯、萜品油烯和瓦伦烯。类异戊二烯化合物还包括但不限于类胡萝卜素类(如番茄红素、α-和β-胡萝卜素、α-和β-隐黄素、胭脂素、玉米黄质、虾青素和叶黄素)，类固醇化合物类，和由其他化学基团如混合萜类生物碱和辅酶Q-10修饰的类异戊二烯组成的化合物类。

在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞还包含编码可使经由MEV途径生成的IPP转化成DMAPP的酶(如IPP异构酶)的异源核苷酸序列。编码此种酶的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(NC_000913，3031087.3031635；大肠杆菌)，和(AF082326；雨生红球藻(Haematococcus pluvialis))。

在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞还包含编码聚异戊二烯合酶的异源核苷酸序列，所述聚异戊二烯合酶可使IPP和/或DMAPP分子缩合以形成含有多于五个碳原子的聚异戊二烯基化合物。

在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码可使一分子IPP与一分子DMAPP缩合以形成一分子香叶基焦磷酸(“GPP”)的酶(如GPP合酶)的异源核苷酸序列。编码此种酶的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(AF513111；巨冷杉(Abies grandis))，(AF513112；巨冷杉)，(AF513113；巨冷杉)，(AY534686；金鱼草(Antirrhinum majus))，(AY534687；金鱼草)，(Y17376；拟南芥)，(AE016877，基因座AP11092；蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)；ATCC 14579)，(AJ243739；甜橙(Citrus sinensis))，(AY534745；仙女扇(Clarkia breweri))，(AY953508；齿小蠹(Ipspini))，(DQ286930；番茄(Lycopersiconesculentum))，(AF182828；胡椒薄荷(Mentha x piperita))，(AF182827；胡椒薄荷)，(MPI249453；胡椒薄荷)，(PZE431697，基因座CAD24425；产玉米素副球菌(Paracoccuszeaxanthinifaciens))，(AY866498；胡黄连(Picrorhiza kurrooa))，(AY351862；葡萄(Vitis vinifera))，和(AF203881，基因座AAF12843；运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis))。

在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞包含编码可使两分子IPP与一分子DMAPP缩合，或将IPP分子添加至GPP分子以形成法呢基焦磷酸(“FPP”)分子的酶(如FPP合酶)的异源核苷酸序列。编码此种酶的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(ATU80605；拟南芥)，(ATHFPS2R；拟南芥)，(AAU36376；黄花蒿(Artemisia annua))，(AF461050；普通牛(Bos taurus))，(D00694；大肠杆菌K-12)，(AE009951，基因座AAL95523；具核梭杆菌具核亚种(Fusobacterium nucleatum subsp.nucleatum)ATCC 25586)，(GFFPPSGEN；藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi))，(CP000009，基因座AAW60034；氧化葡糖杆菌(Gluconobacteroxydans)621H)，(AF019892；向日葵(Helianthus annuus))，(HUMFAPS；智人(Homosapiens))，(KLPFPSQCR；乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis))，(LAU15777；白羽扇豆(Lupinus albus))，(LAU20771；白羽扇豆)，(AF309508；小家鼠(Mus musculus))，(NCFPPSGEN；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa))，(PAFPS1；灰白银胶菊(Partheniumargentatum))，(PAFPS2；灰白银胶菊)，(RATFAPS；褐家鼠(Rattus norvegicus))，(YSCFPP；酿酒酵母)，(D89104；粟酒裂殖酵母(SchizoSaccharomyces pombe))，(CP000003，基因座AAT87386；酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes))，(CP000017，基因座AAZ51849；酿脓链球菌)，(NC_008022，基因座YP_598856；酿脓链球菌MGAS10270)，(NC_008023，基因座YP_600845；酿脓链球菌MGAS2096)，(NC_008024，基因座YP_602832；酿脓链球菌MGAS10750)，(MZEFPS；玉米(Zea mays))，(AE000657，基因座AAC06913；超嗜热菌(Aquifex aeolicus)VF5)，(NM_202836；拟南芥)，(D84432，基因座BAA12575；枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis))，(U12678，基因座AAC28894；慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)USDA 110)，(BACFDPS；嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus))，(NC_002940，基因座NP_873754；杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)35000HP)，(L42023，基因座AAC23087；流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)RdKW20)，(J05262；智人)，(YP_395294；沙克乳杆菌亚种.沙克(Lactobacillus sakei subsp.sakei)23K)，(NC_005823，基因座YP_000273；钩端螺旋体血清变型(Leptospira interrogans serovar)Copenhagenistr.Fiocruz L1-130)，(AB003187；藤黄微球菌(Micrococcus luteus))，(NC_002946，基因座YP_208768；淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)FA 1090)，(U00090，基因座AAB91752；根瘤菌属(Rhizobium sp.)NGR234)，(J05091；酿酒酵母)，(CP000031，基因座AAV93568；Silicibacter pomeroyiDSS-3)，(AE008481，基因座AAK99890；肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)R6)，和(NC_004556，基因座NP 779706；特曼库拉木质部难养菌(Xylella fastidiosa Temecula1))。

在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞进一步包含编码可使IPP与DMAPP或IPP与FPP结合以形成香叶基香叶基焦磷酸(“GGPP”)的酶的异源核苷酸序列。编码此种酶的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(ATHGERPYRS；拟南芥)，(BT005328；拟南芥)，(NM_119845；拟南芥)，(NZ_AAJM01000380，基因座ZP_00743052；以色列苏云金芽孢杆菌血清型(Bacillus thuringiensis serovar israelensis)，ATCC 35646 sq1563)，(CRGGPPS；长春花(Catharanthus roseus))，(NZ_AABF02000074，基因座ZP_00144509；具核梭杆菌文氏亚种(Fusobacterium nucleatum subsp.vincentii)，ATCC 49256)，(GFGGPPSGN；藤仓赤霉菌(Gibberella fujikuroi))，(AY371321；银杏(Ginkgo biloba))，(AB055496；巴西橡胶树)，(AB017971；智人)，(MCI276129；卷枝毛霉拉斯坦变种(Mucor circinelloidesf.lusitanicus))，(AB016044；小家鼠)，(AABX01000298，基因座NCU01427；粗糙脉孢菌)，(NCU20940；粗糙脉孢菌)，(NZ_AAKL01000008，基因座ZP_00943566；青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)UW551)，(AB118238；褐家鼠)，(SCU31632；酿酒酵母)，(AB016095；细长聚球藻(Synechococcus elongates))，(SAGGPS；白芥子(Sinapis alba))，(SSOGDS；嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius))，(NC_007759，基因座YP_461832；嗜酸互营菌属(Syntrophus aciditrophicus)SB)，(NC_006840，基因座YP_204095；费希尔氏弧菌(Vibrio fischeri)ES114)，(NM_112315；拟南芥)，(ERWCRTE；成团泛菌(Pantoea agglomerans))，(D90087，基因座BAA14124；菠萝泛菌(Pantoea ananatis))，(X52291，基因座CAA36538；荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus))，(AF195122，基因座AAF24294；类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides))，和(NC_004350，基因座NP_721015；变形链球菌(Streptococcus mutans)UA159)。

在一些实施方案，所述类异戊二烯生成细胞进一步包含编码可修饰聚异戊二烯以形成半萜、单萜、倍半萜、二萜、三萜、四萜、多萜、类固醇化合物、类胡萝卜素、或经修饰的类异戊二烯化合物的酶的异源核苷酸序列。

在一些实施方案，所述异源核苷酸编码蒈烯合酶。合适的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(AF461460，REGION 43.1926；挪威云杉(Picea abies))和(AF527416，REGION:78.1871；狭叶鼠尾草(Salvia stenophylla))。

在一些实施方案，所述异源核苷酸编码香叶醇合酶。合适的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(AJ457070；细毛樟(Cinnamomum tenuipilum))，(AY362553；罗勒(Ocimum basilicum))，(DQ234300；白苏子菌株(Perilla frutescens strain)1864)，(DQ234299；紫苏柠檬桉菌株(Perilla citriodora strain)1861)，(DQ234298；紫苏柠檬桉菌株(Perilla citriodora strain)4935)，和(DQ088667；紫苏柠檬桉(Perillacitriodora))。

在一些实施方案，所述异源核苷酸编码芳樟醇合酶。合适的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(AF497485；拟南芥)，(AC002294，基因座AAB71482；拟南芥)，(AY059757；拟南芥)，(NM_104793；拟南芥)，(AF154124；黄花蒿)，(AF067603；仙女扇)，(AF067602；山字草属植物黄果厚壳桂(Clarkia concinna))，(AF067601；仙女扇)，(U58314；仙女扇)，(AY840091；番茄)，(DQ263741；狭叶薰衣草(Lavandulaangustifolia))，(AY083653；薄荷柠檬酸(Mentha citrate))，(AY693647；罗勒(Ocimumbasilicum))，(XM_463918；稻(Oryza sativa))，(AP004078，基因座BAD07605；稻)，(XM_463918，基因座XP_463918；稻)，(AY917193；紫苏柠檬桉(Perilla citriodora))，(AF271259；白苏子(Perilla frutescens))，(AY473623；挪威云杉(Picea abies))，(DQ195274；北美云杉(Picea sitchensis))，和(AF444798；紫苏变种皱叶品种编号79(Perilla frutescens var.crispa cultivar No.79))。

在一些实施方案，所述异源核苷酸编码柠檬烯合酶。合适的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(+)-柠檬烯合酶(AF514287，REGION:47.1867；柠檬(Citrus limon))和(AY055214，REGION:48.1889；藿香(Agastache rugosa))和(-)-柠檬烯合酶(DQ195275，REGION:1.1905；北美云杉)，(AF006193，REGION:73.1986；巨冷杉(Abies grandis))，和(MHC4SLSP，REGION:29.1828；留兰香(Mentha spicata))。

在一些实施方案中，所述异源核苷酸编码月桂烯合酶。合适的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(U87908；巨冷杉)，(AY195609；金鱼草)，(AY195608；金鱼草)，(NM_127982；拟南芥TPS10)，(NM_113485；拟南芥ATTPS-CIN)，(NM_113483；拟南芥ATTPS-CIN)，(AF271259；白苏子)，(AY473626；挪威云杉)，(AF369919；挪威云杉)，和(AJ304839；冬青栎(Quercus ilex))。

在一些实施方案，所述异源核苷酸编码罗勒烯合酶。合适的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(AY195607；金鱼草)，(AY195609；金鱼草)，(AY195608；金鱼草)，(AK221024；拟南芥)，(NM_113485；拟南芥ATTPS-CIN)，(NM_113483；拟南芥ATTPS-CIN)，(NM_117775；拟南芥ATTPS03)，(NM_001036574；拟南芥ATTPS03)，(NM_127982；拟南芥TPS10)，(AB110642；温州蜜柑(Citrus unshiu)CitMTSL4)，和(AY575970；日本百脉根(Lotus corniculatus var.japonicus))。

在一些实施方案，所述异源核苷酸编码α-蒎烯合酶。合适的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(+)α-蒎烯合酶(AF543530，REGION:1.1887；火炬松(Pinus taeda))，(-)α-蒎烯合酶(AF543527，REGION:32.1921；火炬松)，和(+)/(-)α-蒎烯合酶(AGU87909，REGION:6111892；巨冷杉)。

在一些实施方案，所述异源核苷酸编码β-蒎烯合酶。合适的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(-)β-蒎烯合酶(AF276072，REGION:1.1749；黄花蒿)和(AF514288，REGION:26.1834；柠檬)。

在一些实施方案，所述异源核苷酸编码桧烯合酶。合适的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于源自药用鼠尾草(Salvia officinalis)的AF051901，REGION:26.1798。

在一些实施方案，所述异源核苷酸编码γ-萜品烯合酶。合适的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(源自柠檬(Citrus limon)的AF514286，REGION:30.1832)和(源自温州蜜柑(Citrus unshiu)的AB110640，REGION 1.1803)。

在一些实施方案，所述异源核苷酸编码萜品油烯合酶。合适的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(源自罗勒(Ocimum basilicum)的AY693650)和(源自花旗松(Pseudotsuga menziesii)的AY906866，REGION:10.1887)。

在一些实施方案，所述异源核苷酸编码紫穗槐二烯合酶。合适的核苷酸序列的示例性实例是美国专利公开号2004/0005678中的SEQ ID NO.37。

在一些实施方案，所述异源核苷酸编码α-法呢烯合酶。合适的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于源自西洋梨品种茹梨(Pyrus communis cultivar d'Anjou)(梨；基因名称AFS1)的DQ309034和源自苹果(Malus domestica)(苹果；基因AFS1)的AY182241。Pechouus et al.,Planta 219(1):84-94(2004)。

在一些实施方案，所述异源核苷酸编码β-法呢烯合酶。合适的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于源自胡椒薄荷(Mentha x piperita)(薄荷；基因Tspa11)的基因库(GenBank)登录号为AF024615，和源自黄花蒿(Artemisia annua)的基因库登录号为AY835398。Picaud et al.,Phytochemistry 66(9):961-967(2005)。

在一些实施方案，所述异源核苷酸编码法呢醇合酶。合适的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于源自玉米(Zea mays)的基因库登录号为AF529266和源自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(基因Pho8)的基因库登录号为YDR481C。参见Song,L.,Applied Biochemistry and Biotechnology 128:149-158(2006)。

在一些实施方案，所述异源核苷酸编码橙花叔醇合酶。合适的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于源自玉米(Zea mays)(玉米，基因tps1)的AF529266。

在一些实施方案，所述异源核苷酸编码广藿香醇合酶。合适的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于源自广藿香(Pogostemon cablin)的AY508730 REGION:1.1659。

在一些实施方案，所述异源核苷酸编码诺卡酮合酶。合适的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于源自甜橙(Citrus sinensis)的AF441124 REGION:1.1647和源自白苏子(Perilla frutescens)的AY917195 REGION:1.1653。

在一些实施方案，所述异源核苷酸编码松香二烯(abietadiene)合酶。合适的核苷酸序列的示例性实例包括但不限于：(U50768；巨冷杉(Abies grandis))和(AY473621；挪威云杉(Picea abies))。

培养基和培养条件

用于培养物的维持和生长的物料和方法是微生物学或发酵科学领域的技术人员所熟知的(参见，例如Bailey et al.,Biochemical Engineering Fundamentals,secondedition,McGraw Hill,New York,1986)。根据宿主细胞、发酵和过程/方法的特定要求，必须考虑适当的培养基，pH值，温度，以及需氧、微需氧或厌氧条件的要求。

本发明提供的生成水不混溶性化合物的方法可在合适的容器(包括但不限于细胞培养板、烧瓶或发酵罐)中在合适的培养基中进行。此外，所述方法可以本领域已知的任何发酵规模进行，以支持微生物产物的工业生产。可使用任何合适的发酵罐，包括搅拌槽发酵罐，气升式发酵罐，气泡发酵罐或其任何组合。在利用酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为宿主细胞的特定实施方案中，菌株可在发酵罐中生长，详细记载如Kosaric,et al,Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry,Sixth Edition,Volume 12,pages 398-473,Wiley-VCH Verlag GmbH&Co.KDaA,Weinheim,Germany中所述。此外，所述方法可以任何发酵体积进行，譬如，从实验室规模(例如约10mL至20L)发酵至中试规模(例如约20L至500L)发酵至工业规模(例如约500L至≥500,000L)发酵。

在一些实施方案，用于在本发明提供的生成水不混溶性化合物的方法中使用的培养基包括其中能够生成水不混溶性化合物的经遗传修饰的微生物可存活，即支持并维持生长和活力的任何培养基。在一些实施方案，所述培养基还促进生成所需水不混溶性化合物所必需的生物合成途径。

在一些实施方案，所述培养基是包含可同化的碳源、氮源和磷源的水性培养基。此类培养基还可包括适当的盐类、矿物质类、金属类和其他营养物类。在一些实施方案，将所述碳源和每种必需细胞营养物增量地或连续地添加至发酵培养基中，并将每种必须营养物基本上均保持在生长细胞有效同化所需的最低水平，譬如，根据预定细胞生长曲线，所述曲线基于细胞代谢或呼吸与细胞将碳源转化成生物质的关系。

用于培养微生物的合适条件和合适的培养基在本领域是众所周知的。在一些实施方案，合适的培养基补充有一种或多种附加试剂，例如诱导物(例如，当编码基因产物的一个或多个核苷酸序列受诱导型启动子的控制时)，阻抑物(例如，当编码基因产物的一个或多个核苷酸序列受阻抑型启动子的控制时)，或选择剂(例如，选择包含遗传修饰的微生物的抗生素)。

在一些实施方案，所述碳源是单糖(简单糖类)、二糖、多糖、不可发酵的碳源、或其一种或多种组合。合适的单糖的非限制性实例包括葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、核糖、和其组合。合适的二糖的非限制性实例包括蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、纤维二糖、和其组合。合适的多糖的非限制性实例包括淀粉、糖原、纤维素、几丁质、和其组合。合适的不可发酵碳源的非限制性实例包括乙酸盐和甘油。在一些实施方案，可使用包含碳源的不同组合的甘蔗糖浆。

培养基中的碳源(例如葡萄糖)的浓度应促进细胞生长，但不能高到抑制所用微生物的生长。通常，向培养物中添加一定水平的碳源(例如葡萄糖)以达到所需的生长水平和生物量水平，但达不到检测水平(检测限为约<0.1g/l)。在其他实施方案，培养基中的碳源(例如葡萄糖)的浓度大于约1g/L，典型地大于约2g/L，典型地大于约5g/L。此外，培养基中的碳源(例如葡萄糖)的浓度通常小于约100g/L，典型地小于约50g/L，和更典型地小于约20g/L。有时碳源的浓度在短时间内可大于100g/L，例如，当细胞初始添加至发酵罐时。应注意的是，提及培养物组分浓度可以指初始和/或正在进行的组分浓度。在一些情况下，可能需要在培养期间使培养基耗尽碳源。

可在合适的培养基中使用的可同化氮源包括但不限于简单氮源、有机氮源和复合氮源。此类氮源包括无水氨、铵盐类、以及动物、植物和/或微生物来源的物质。合适的氮源包括但不限于蛋白质水解产物类、微生物生物质水解产物类、蛋白胨、酵母提取物、硫酸铵、尿素和氨基酸类。可将任何合适量的氮源加至培养基中。此外，在一些实施例，可能需要在培养期间使培养基耗尽氮源。

有效的培养基可含有其他化合物，如无机盐类、维生素类、痕量金属类或生长促进剂类。此类其他化合物亦可存在于有效培养基中的碳源、氮源或矿物源中，或者可特定地加至培养基中。

所述培养基还可含有合适的磷源(phosphate source)。此类磷源包括无机磷源和有机磷源。优选的磷源包括但不限于磷酸盐类，例如单或二元磷酸钠和磷酸钾、磷酸铵、和其混合物。可将任何合适量的磷源加至培养基中。

合适的培养基还可包括镁源，优选以生理学上可接受的盐形式，如七水合硫酸镁，尽管也可使用浓度为贡献相似量的镁的其他镁源。可将任何合适量的镁源加至培养基中。此外，在一些实施例，可能需要在培养期间使培养基耗尽镁源。

在一些实施方案，所述培养基还可包含生物学上可接受的螯合剂，例如二水合柠檬酸三钠。任何合适量的螯合剂可加至培养基中。

所述培养基最初还可包含生物学上可接受的酸或碱以维持培养基的所需pH值。生物学上可接受的酸包括但不限于盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、及其混合物。生物学上可接受的碱包括但不限于氢氧化铵、氢氧化钠、氢氧化钾、及其混合物。在一些实施方案，所使用的碱是氢氧化铵。

在一些实施方案，所述培养基还可包含生物学上可接受的钙源，包括但不限于氯化钙。在一些实施方案，所述培养基还可包含氯化钠。在一些实施方案，所述培养基还可包含痕量金属。此类痕量金属可作为储备溶液加至培养基中，为了方便起见，可将其与其余培养基分开制备。可向培养基中加入任何合适量的钙源、氯化钠和痕量金属。

所述培养基可包括其他维生素类，如生物素、钙、泛酸盐、肌醇、吡哆醇-HCl和硫胺素-HCl。可将此类维生素作为储备溶液加至培养基中，为了方便起见，可将其与其余培养基分开制备。然而，向培养基中添加维生素类超过一定浓度对于微生物的生长是不利的。

本发明所述的发酵方法可以常规培养模式进行，所述培养模式包括但不限于分批、补料分批、细胞再循环、连续和半连续。在一些实施方案，所述发酵以补料分批模式进行。在此种情况下，所述培养基中的一些组分在发酵的生成阶段期间被耗尽。在一些实施方案，所述培养物可在开始时(例如，在生成阶段)补充相对高浓度的此类组分，使得在需要添加之前支持生长和/或水不混溶性化合物生成一段时间。所述这些组分的优选范围在整个培养过程中通过添加来维持，所述添加以培养物耗尽的水平进行添加。所述培养基中组分的水平可通过例如定期对培养基取样并测定浓度来进行监测。或者，一旦开发了标准培养程序，所述添加可在整个培养期间的特定时间以对应于已知水平的时间间隔进行。如本领域技术人员将认识到的，随着培养基的细胞密度增加，培养期间营养物的消耗速率亦将增加。此外，为了避免将外来微生物引入培养基中，可使用本领域已知的无菌添加方法进行添加。此外，在培养期间可加入少量消泡剂。

所述培养基的温度可以是适于经遗传修饰的细胞生长和/或水不混溶性化合物生成的任何温度。譬如，在用接种物接种培养基之前，所述培养基可置于并保持在约20℃至约45℃的温度范围，优选置于并保持在约25℃至约40℃的温度范围，更优选置于并保持在约28℃至约34℃的温度范围。

所述培养基的pH值可通过向培养基中加入酸或碱来控制。在此种情况下，当使用氨来控制pH值时，其在所述培养基中也可方便地作为氮源。优选地，所述pH值保持在约3.0至约8.0，典型地保持在约3.5至约7.0，更典型地保持在约4.0至约6.5。

在一些实施方案，在培养期间监测所述培养基的碳源浓度，例如葡萄糖浓度。可使用已知技术监测所述培养基的葡萄糖浓度，譬如，采用葡萄糖氧化酶试验或高压液相色谱，其可用于监测上清液中(例如，所述培养基的无细胞组分)的葡萄糖浓度。如前所述，所述碳源浓度应保持在发生细胞生长抑制的水平以下。尽管此浓度可能会因生物体而异，但对于作为碳源的葡萄糖，在葡萄糖浓度大于约60g/L时可能发生细胞生长抑制，并且可通过试验容易地确定。因此，当使用葡萄糖作为碳源时，优选将葡萄糖进料至发酵罐并维持在检测限以下。或者，所述培养基中的葡萄糖浓度保持在约1g/L至约100g/L的范围内，典型地在约2g/L至约50g/L的范围内，和有时在约5g/L至约20g/L的范围内。尽管通过添加例如基本上纯的葡萄糖溶液可将碳源浓度保持在所需水平内，但亦可通过添加原始培养基的等份试样来维持培养基的碳源浓度。原始培养基的等分试样的使用可能是合乎需要的，因为可同时维持培养基中其他营养物(例如，氮源和磷源)的浓度。同样，通过添加痕量金属溶液的等份试样，亦可在所述培养基中维持所述痕量金属浓度。

实施例

如本发明使用的，无论是否具体定义了特定缩写，在所述这些方法、方案和实施例中使用的符号和惯例均与当代科学文献，例如《美国化学学会杂志》和《生物化学杂志》中所使用的符号和惯例一致。具体而言，但不限于，在实施例和整个说明书中可使用以下缩写：g(克)；mg(毫克)；mL(毫升)；μL(微升)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；Hz(赫兹)；MHz(兆赫)；mmol(毫摩尔)；hr.或hrs.(小时)；min(分钟)；MS(质谱)；ESI(电喷雾电离)；TLC(薄层色谱)；HPLC(高压液相色谱)；THF(四氢呋喃)；CDCl₃(氘代氯仿)；AcOH(乙酸)；DCM(二氯甲烷)；DMSO(二甲基亚砜)；DMSO-d₆(氘代二甲亚砜)；EtOAc(乙酸乙酯)；MeOH(甲醇)；和BOC(叔丁氧羰基)。

对于下列所有实施例，可使用本领域技术人员已知的标准后处理和纯化方法。除非另有说明，否则所有温度均以℃(摄氏度)表示。除非另有说明，所有反应均在室温下进行。本发明所示的合成方法旨在通过使用具体实施例来举例说明可适用的化学，并不指示本发明的范围。

实施例1

本实施例示出了从死细胞层有效释放水不混溶性化合物。

针对死细胞层乳液来评估均质化效率。采用Niro Panda高压均质器在900BAR下使所述死细胞层乳液均质化。每次谨慎进行均质化后均抽取1mL样品，进行离心以确定是否形成球粒沉淀。在900BAR下进行2次后，观察到球粒沉淀，表明均质器正在使碎屑转变为球粒沉淀。进行2次后，球粒沉淀尺寸似乎没有明显增加。参见图2。

使用50％硝酸溶液将所得浆液滴定至pH 2.5。阴离子洗涤剂Dowfax 2A1以0.2％v/v增量进行添加，直至达到1％v/v浓度。混合等分试样，在8500G下离心2分钟。如图3所示，当Dowfax 2A1的浓度为1％时，释放出的游离油留在顶相中，而固体则沉淀到离心管的底部。

实施例2

进行了4个实验室规模的回收以确定来自死细胞层的粗制法呢烯油的回收产率，并对不同相中的法呢烯含量和纯度进行了表征。

对于每个试验，将约100mL的死细胞层浆液用50％硝酸滴定至pH 2.5，并在900BAR下进行均质化处理2次。添加DOWFAX 2A1使其达到1％v/v浓度，并等分分装至50mL离心管中。将试管于70℃水浴中加热约15分钟，然后于70℃下以5000x G离心7分钟。离心后，观察到澄清的法呢烯漏出相，同时在其下方有碎布层相、水相以及底部有碎屑球粒沉淀。参见图4。

通过注射器谨慎地对澄清相、粗产物相和水相取样以测定法呢烯滴度。通过倾析分离碎片球粒沉淀，称重，并直接取样以通过气相色谱分析来确定法呢烯滴度。气相色谱数据列于下表。

4个实验的每个步骤的回收产率如下表所示。

进料说明	试验#1	试验#2	试验#3	试验#4
					DCL浆液浓缩产率	63％	48％	71％	64％
均质化DCL澄清产率	95％	88％	74％	81％
					粗制法呢烯产率	41％	48％	79％	83％
综合产率	24％	20％	41％	43％

在对所述经均质化处理的死细胞层进行化学处理之后，观察到平均约71％的粗制法呢烯漏出。从本试验中取样的粗制法呢烯的纯度分析列于下表。

如本实施例所示，可通过施加细胞破碎、低pH值和添加表面活性剂并随后离心的组合来破坏死细胞层乳液，并回收水不混溶性化合物。

实施例3

采用常规方法生成较大体积量的粗制法呢烯，随后使用法呢烯蒸发条件(＜1托(torr)，120℃)进行蒸馏。测定蒸馏出的法呢烯的纯度，发现其符合现有标准。结果如下表所示。

实施例4

本实施例示出了从300L发酵罐运行中回收水不混溶性化合物。

将生成法呢烯的细胞于300L发酵罐中进行培养。液-液重质相的全部体积在900BAR压力下通过NIRO NS3006L Panther均质器运行1次。用硝酸将裂解液酸化至pH 2.5，并添加表面活性剂(DOWFAX 2A1)至浓度为0.6％。将经处理的裂解液加热至70℃。死细胞层固体脱落并释放出可通过液-液离心回收的捕获的法呢烯。对经处理和经加热的裂解液进行澄清离心，从而澄清死细胞层固体，并浓缩释放出的法呢烯。将回收的轻质相(“澄清的经处理的裂解液”或“CTL”)重新加至随后提取回收的澄清的经浓缩培养基(ClarifiedConcentrated Broth，“CCB”)中。以此种方式，将经处理的液-液重质相和相关的损失物重新加至法呢烯的主要回收工艺流程中。图1B和图1C示出了生产规模和中试规模工艺流程的示意图。

在中试规模体系中，生成法呢烯的菌株采用甘蔗糖浆进料进行发酵162小时。如此可进行2次提取和1次收获(FAD 0、FAD 1和FAD 2)。将CCB用0.6％Tergitol L-62表面活性剂于70℃下加热处理，得到第一次提取(FAD 0)的粗产物。将液-液重质相的全部体积在900Bar下进行均质化处理1次，然后使用硝酸将其滴定至pH 2.5。然后将所得组合物与0.6％v/v浓度的DOWFAX 2A1表面活性剂混合。将经处理的裂解液加热至70℃，并采用DX-203进行离心以除去死细胞层固体。这便是CTL流。

将在下一次提取(FAD 1)中回收的CCB分为2个相等的等份试样。将由FAD 0得到的CTL重新加至由FAD1得到的CCB等分试样之一中，并采用0.6％L-62表面活性剂进行液-液步骤。将第二个等分试样作为对照液-液流进行处理。如上所述，再次处理来自浓缩的CTL条件下的液-液重质相，将所得CTL重新加至由FAD 2得到的CCB等分试样中。这便是此次发酵运行的最后一次提取。

总体而言，通过将液-液重质相进行处理并将其循环回CCB，与对照相比，粗制法呢烯的捕获量增加了4％。有趣的是，将CTL重新加至CCB中可将L-62所需的破乳量降低一个数量级以上；然而，当考虑在工艺流程中添加0.6％2A1时，表面活性剂的总耗量(L-62+2A1)增加了7％。

来自3种液-固分离(FAD 0、FAD 1、FAD 2)的回收产率如下表所示。

将得自FAD 1和FAD 2的CCB分成2个相等的等份试样。其中一个等分试样富含从先前FAD中回收的CTL，另一等分试样作为对照进行处理。液-液单元的两种操作均采用相同的离心机配置和流速进行，以最大程度减少设备性能差异。以从CCB回收的粗产物量进行衡量，第一次提取(FAD 0)的液-液回收产率为75％。当仅考虑由进料浓度减去法呢烯损失时，通过损失衡量的回收产率为82％。

将CTL加至CCB后，破坏CCB乳液的L-62需求量降低了一个数量级。采用浓缩的(Enriched)CCB，可回收34.44kg水不混溶性化合物粗产物，相比之下，对照的粗产物为33.23kg。此举使得粗产物体积量增加了约4％。在浓缩体系中，经处理的CCB的质量略低，而粗产物/CCB的比例略高，为22.5％比21.6％。在浓缩体系中，表面活性剂的总耗量(L-62和2A1)增加了约7％。

本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本发明，如同每个单独的出版物或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入。尽管已根据各种实施方案/实施例描述了所要求保护的主题，但本领域技术人员将理解，可在不脱离本发明精神的情况下进行各种修改/修饰、替换/置换、省略、以及改变/变化。因此，本发明旨在本发明主题范围仅受所附权利要求书(包括其等同形式)的范围限制。

Claims (36)

1.从微生物生物质(microbialbiomass)回收一种或多种水不混溶性化合物的方法，其包含下列步骤：

a.通过以下方式处理所述微生物生物质：

i.酸化所述微生物生物质；和

ii.破坏所述微生物生物质；

以形成经酸化、破坏的微生物生物质；

b.加热所述经酸化、破坏的微生物生物质，以形成经加热、酸化、破坏的微生物生物质；

c.使所述经加热、酸化、破坏的微生物生物质与二磺化表面活性剂接触，所述二磺化表面活性剂的量足以从所述微生物生物质释放至少30％的所述一种或多种水不混溶性化合物；

d.回收所述一种或多种水不混溶性化合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酸化步骤在所述破坏步骤之前。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述破坏步骤在所述酸化步骤之前。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述破坏步骤和所述酸化步骤同时进行。

5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述酸化步骤的pH值是2-4。

6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述酸化步骤的pH值是约2.5。

7.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述破坏步骤包括机械破坏、超声处理、冷冻/解冻、研磨、化学破坏、酶促破坏、或其组合。

8.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述破坏步骤是在高压下的均质化。

9.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述破坏步骤包含使用均质器在600bar至1000bar下进行一次或多次均质化处理。

10.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述破坏步骤包含使用均质器在约900bar下进行一次或多次均质化处理。

11.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述加热步骤是在60℃-80℃下进行。

12.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述加热步骤是在约70℃下进行。

13.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述二磺化表面活性剂是二磺化苯基醚洗涤剂。

14.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述二磺化表面活性剂包含：

或其盐，其中R是C_6-16烷基。

15.根据权利要求14所述的方法，其中R是C₁₂烷基。

16.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述二磺化表面活性剂是月桂基苯基醚二磺酸二钠(DOWFAX 2A1)。

17.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述经加热、酸化、破坏的微生物生物质与0.2％至1.5％二磺化表面活性剂接触。

18.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述经加热、酸化、破坏的微生物生物质与约1.0％二磺化表面活性剂接触。

19.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述回收步骤包含离心、溶剂萃取、色谱法、或其组合。

20.根据前述权利要求任一项所述的方法，其从所述微生物生物质释放至少40％、50％、60％、70％、或75％的所述一种或多种水不混溶性化合物。

21.根据前述权利要求任一项所述的方法，其包含下列步骤：

a.通过以下方式处理所述微生物生物质：

i.酸化所述微生物生物质至约pH 2.5；然后

ii.在均质器中于约900bar下，破坏所述微生物生物质；

以形成经酸化、破坏的微生物生物质；

b.在约70℃下，加热所述经酸化、破坏的微生物生物质，以形成经加热、酸化、破坏的微生物生物质；

c.使所述经加热、酸化、破坏的微生物生物质与约1％DOWFAX2A1接触，以从所述微生物生物质释放所述一种或多种水不混溶性化合物；和

d.回收所述一种或多种水不混溶性化合物。

22.根据权利要求1-20任一项所述的方法，其包含下列步骤：

a.通过以下方式处理所述微生物生物质：

i.在均质器中于约900bar下，破坏所述微生物生物质；然后

ii.酸化所述微生物生物质至约pH 2.5；

以形成经酸化、破坏的微生物生物质；

b.在约70℃下，加热所述经酸化、破坏的微生物生物质，以形成经加热、酸化、破坏的微生物生物质；

c.使所述经加热、酸化、破坏的微生物生物质与约1％DOWFAX2A1接触，以从所述微生物生物质释放所述一种或多种水不混溶性化合物；和

d.回收所述一种或多种水不混溶性化合物。

23.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微生物生物质在步骤a之前已采用破乳化表面活性剂进行破乳化。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述破乳化表面活性剂是TERGITOL L-62。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所消耗的表面活性剂的量与缺少至少步骤c的类似方法中所用的量相比有所增加。

26.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微生物生物质是重组酵母。

27.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微生物生物质是重组酿酒酵母(S.cerevisiae)。

28.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述微生物生物质包含微生物细胞，所述微生物细胞重组表达生成所述一种或多种水不混溶性化合物的酶。

29.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述水不混溶性化合物是类异戊二烯、聚酮化合物、或脂肪酸。

30.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述水不混溶性化合物是类异戊二烯。

31.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述水不混溶性化合物是C₅至C₄₀萜烯。

32.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述水不混溶性化合物是C₅至C₂₀萜烯。

33.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述水不混溶性化合物是C₁₅萜烯。

34.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述水不混溶性化合物是松香二烯(abietadiene)、紫穗槐二烯(amorphadiene)、蒈烯(carene)、α-法呢烯(α-farnesene)、β-法呢烯(β-farnesene)、法呢醇(farnesol)、香叶醇(geraniol)、香叶基香叶醇(geranylgeraniol)、异戊二烯(isoprene)、芳樟醇(linalool)、柠檬烯(limonene)、月桂烯(myrcene)、橙花叔醇(nerolidol)、罗勒烯(ocimene)、广藿香醇(patchoulol)、β-蒎烯(β-pinene)、桧烯(sabinene)、γ-萜品烯(γ-terpinene)、萜品油烯(terpinolene)、和瓦伦烯(valencene)。

35.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述水不混溶性化合物是α-法呢烯。

36.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中所述水不混溶性化合物是β-法呢烯。

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