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CN112771155A - 肿瘤超反应性免疫细胞(turic)的制备和选择 - Google Patents

肿瘤超反应性免疫细胞(turic)的制备和选择 Download PDF

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CN112771155A CN201980064200.4A CN201980064200A CN112771155A CN 112771155 A CN112771155 A CN 112771155A CN 201980064200 A CN201980064200 A CN 201980064200A CN 112771155 A CN112771155 A CN 112771155A
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厄内斯特·多杜
马库斯·莫伊雷尔
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Poly Bisobert Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一种制备包含肿瘤超反应性免疫细胞(TURIC)的T细胞产品的方法以及一种用于癌症患者治疗的包含至少一种具有TURIC的T细胞产品的组合物。

Description

肿瘤超反应性免疫细胞(TURIC)的制备和选择
技术领域
本发明涉及一种制备包含肿瘤超反应性免疫细胞(TURIC)的T细胞产品的方法和一种用于癌症患者治疗的包含至少一种具有TURIC的T细胞产品的组合物。
背景技术
世界卫生组织(WHO)报告说，2012年胰腺癌夺去了超过330,000人的生命，其中68％的死亡发生在具有高至非常高的人类发展指数(HDI)的国家(WHO，2014年)。由于大多数患者在诊断时都出现肿瘤转移性疾病，因此5年生存率仅为5％。这些统计数据与胰腺癌患者有限的治疗选择相对应，其中包括经典手术(只有10-20％的患者符合此选择)或化学疗法。
一种称为过继细胞治疗(ACT)的相对较新的方法是现代肿瘤学中一个日益发展的学科。这种细胞疗法依赖于输送机体自身的淋巴细胞，从而刺激患者的免疫系统以意图增强抗原特异性抗肿瘤作用。使用针对肿瘤的T细胞(肿瘤反应性T细胞)已经实现了晚期癌症患者的持久的临床响应。这些方法通常依赖于从外周血中收集T细胞(例如外周血单个核细胞(PBMC))或从肿瘤病灶中收集肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。
自从在1980年代使用来自患者血液中的经白介素(IL)2调节的自体淋巴细胞，基于免疫的转移性黑色素瘤治疗取得最初结果以来(Lotze等，1986；Rosenberg等，1985；Rosenberg等，1988；Topalian&Rosenberg，1987)，ACT得到了进一步发展，并已应用于各种类型的癌症。之前，已有报道说可以从胰腺癌病灶中可靠并成功地分离T细胞并在体外使用IL-2、IL-15和IL-21的混合物进行扩增(Meng等，2016)。目前正在寻求其他几种基于T细胞治疗胰腺癌的方法。NCI目前正在进行在转移性胰腺癌患者体内输注经IL-2刺激的TIL的临床研究(ClinicalTrials.gov(美国临床实验数据库)标识符：NCT01174121)。另一项研究正在评估EGFR定向的双特异性抗体表达的T细胞(BAT)在已经接受1-2轮化疗的局部晚期或转移性胰腺癌患者中的安全性和有效性(ClinicalTrials.gov标识符：NCT03269526)，但是T细胞本身将从血液中采集。靶向转移性癌症患者中个体突变的基于T细胞的特化疗法已产生了显著的临床响应(Tran等，2015；Tran等，2016；Tran等，2014)。与此相符，将来的临床研究可能会受益于将胰腺癌中抗肿瘤T细胞与特定的个体突变的识别相关联的翻译数据，从而改善存活率，如最近针对转移性乳腺癌患者所显示的那样(Zacharakis等人，2018年)。激活具有特异性识别突变的宿主分子(即，新表位)的T细胞受体(TCR)的T细胞群体代表了趋向改善基于T细胞的免疫疗法和癌症疫苗的重要临床步骤。
因此，本发明的目的是改善和进一步开发用于治疗肿瘤疾病的个体化ACT。
发明内容
发明人确定了具有提高的肿瘤反应性的TURIC的概念。机体样品中存在驻留在前体T细胞库中的未经刺激的T细胞群体，其被用作常规T细胞来源。这些未经刺激的T细胞的频数是如此之低，以致于它们还不能大量增殖，并且新鲜分离的细胞在用肿瘤特异性肽或代表肿瘤突变的合成肽刺激后，不表现出可检测的量的经典抗肿瘤活性，例如细胞因子的产生。发明人进一步发现，可以通过本发明的方法容易地培养和选择这些未经刺激的前体T细胞。如实施例中所示，当在存在肿瘤特异性肽或自体肿瘤细胞的情况下共培养时，产生高度集中的免疫细胞(highly focused immune cells，TURIC)，其针对这些特定类型的肿瘤细胞或肿瘤特异性肽表现出强烈的抗肿瘤活性。如此产生的TURIC显示出高度特异性的肿瘤反应性，从而得到高于通过已知方法分离和增殖的T细胞的平均值的抗肿瘤应答。
因此，在第一方面，本发明提供了一种产生包含肿瘤超反应性免疫细胞(TURIC)的T细胞产品的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供含有患者T细胞的机体样品；
b)可选地从机体样品中分离T细胞；
c)在体外在存在有包括细胞因子白介素2(IL-2)、白介素15(IL-15)和白介素21(IL-21)的细胞因子混合物与刺激肽或一组刺激肽的情况下，刺激所述T细胞；
d)测定所述T细胞样品中的反应性因子，其中所述反应性因子指示是否存在靶向所述刺激肽或所述一组刺激肽中的至少一种肽的T细胞；
e)如果反应性因子为阳性，则将所述T细胞样品鉴定为肿瘤反应性T细胞样品；
否则将所述T细胞样品鉴定为非反应性T细胞样品；
f)在体外在存在有包括IL-2、IL-15和IL-21的细胞因子混合物与一种自体肿瘤细胞或者所述刺激肽或一组刺激肽的情况下，培养所述非反应性样品以形成T-细胞产品；
g)可选地在体外在存在有包括IL-2、IL-15和IL-21的细胞因子混合物与所述刺激肽或一组刺激肽的情况下，刺激所述T细胞产品；
h)测定所述T细胞产品中的反应性因子；以及
i)如果反应性因子为阳性，则选择所述T细胞产品作为包含TURICS的T细胞产品。
在第二方面，本发明还提供了一种用于癌症患者治疗的包含至少一种具有TURIC的T细胞产品的组合物，所述治疗包括：执行根据本发明第一方面的方法以获得具有TURIC的T细胞产品，并且向患者施用所述具有TURIC的T细胞产品。
附图说明
图1显示了来自患者PanTT26的TIL的流式细胞术分析的结果。(A)TIL包括60％的CD8+T细胞。在用自体肿瘤细胞系对TIL进行3x刺激后，CD8+T细胞频数增加到99％。标准的四小时铬-51释放试验的结果显示在(B)中。将TIL与自体肿瘤细胞系以12:1的比例(TIL:肿瘤细胞；表示为效应子(E)与靶(T)细胞的比例)共同孵育。将具有TIL:肿瘤细胞共培养物的平行孔与抗HLA I类抗体或抗HLA II类抗体(抗HLA-DR)一起孵育，以利用阻断抗体测试降低的肿瘤细胞杀伤力。HLA II类抗原呈递的阻断部分降低了TIL的细胞毒性，而HLA I类限制性抗原呈递的阻断完全消除了自体TIL对肿瘤的杀伤力。
图2显示了来自患者PanTT39的T细胞产品的表征结果。(A)从患者PanTT39获取的经IL-2、IL-15和IL-21刺激后的T细胞产品针对TCR Vβ9进行染色。与自体肿瘤细胞系一起孵育后，针对表面CD107a表达的诱导对T细胞产品进行分析。与基线相比，针对自体肿瘤细胞系的细胞毒性活性增大了22％。(B)HLA类别的结果。在存在抗HLA I类抗体(克隆W6/32)或抗HLA II类抗体(克隆L243)的情况下，将T细胞产品与示例性的肿瘤特异性K7N7A8衍生肽GLLRYWRTERLF共培养。IFN-γ的产生被HLA II类抗体阻断，而抗HLA I对抗原呈递没有影响。(C)通过滴定示例性肿瘤特异性肽(和相应的野生型肽)来测量T细胞产品的剂量依赖性活性。突变的肽处于较低浓度时，靶向活性(基于肽驱动的IFN-γ的产生)受到差异化的调节。对于突变型和野生型肽，高浓度的肽，即5μg肽/孔/105个细胞，导致接近的IFN-γ产量。当肽浓度为0.3至2.5μg肽/孔/105个细胞时，IFN-γ产量存在显著差异。
图3显示了来自PanTT77的TIL的流式细胞术分析的结果。(A)TIL包含将近84％的CD4+T细胞和14％的CD8+T细胞。发现CD4+TIL在其表面表达CXCR3蛋白(98.8％)。(B)基于来自患者PanTT77的肿瘤组织的全外显子组测序数据而产生的新表位与自体PBMC或TIL共孵育三天，之后测量培养上清液中的IFN-γ的产量。发现PBMC对5种突变的肽有反应，而TIL对9种突变的肽有反应。然而，六种突变的肽在PBMC和TIL中引起T细胞反应性。
图4示出了来自胰腺癌病灶的扩增的TIL的流式细胞术分析的结果。(A)确立了40个个体化的TIL系，并且它们显示出不同的组成。一些TIL主要是CD3+CD4+，其他是CD3+CD8+；每个点代表来自单个患者的TIL系。(B)+(C)基于CD45RA和CCR7表达，对CD3+CD4+和CD3+CD8+TIL进行门控，以定义其分化和成熟状态。大多数TIL驻留在由CCR7+CD45RA-表达定义的中央记忆T细胞亚群中。
图5显示了来自患者PanTT39的TIL的流式细胞术分析的结果。TIL是几乎100％(99.1％)的CD4+T细胞，几乎所有细胞都在表面表达CXCR3蛋白(99.7％)，这对于组织的侵袭/穿透至关重要。
图6显示了PBMC对于肽库的IFN-γ应答，所述肽库被鉴定为在初始刺激步骤中在PBMC(肽库A；A)、TIL(肽库B；B)或PBMC与TIL两者(肽库C；C)中触发细胞因子的产生。在存在或不存在OKT3的情况下，将PBMC与相应的肽库共同培养。在不存在OKT3的情况下共培养7天(第14天)后，测量了IFN-γ应答。在存在或不存在OKT3的情况下，在培养的第21天，用相应的肽库再次刺激3天后进行了附加的IFN-γ应答的测量。培养物A是指在刺激之前与肽库A一起培养的PBMC；培养物B是指在刺激之前用肽库B培养的PBMC；培养物C是指在刺激之前与肽库C一起培养的PBMC。肽的注释：1：ZNF343；2：ANKS1B；3：PES1；4：ZNF716；5：ATM；6：VCX3A；7：PPP1R15B；8：NBEAL1；9：ANKS1B；10：C2orf62；11：CACNA 15；12：PRRT1；13：ULBP3；14：TMPRSS13；15：ABCC9；16：SFMBT2
发明的详细说明
定义
根据本发明的术语“肿瘤疾病”是指组织的一种异常和过度生长。本文使用的术语包括原发性肿瘤和继发性肿瘤以及转移瘤。
根据本申请的“原发性肿瘤”是在其中肿瘤进程开始并进行到产生癌性肿块的解剖部位处生长的肿瘤。
根据本发明的“转移瘤”是指在其原发部位发展但随后转移或扩散到身体其他部位的肿瘤。这些进一步的肿瘤也称为“继发性肿瘤”。
本文所用的“肽”可以包括任何类型的任何数目的氨基酸，优选天然存在的氨基酸，其优选地通过肽键连接。特别地，肽包含至少3个氨基酸，优选包含至少5个、至少7个、至少9个氨基酸。此外，肽的长度没有上限。然而，优选地，根据本发明的肽的长度不超过100个氨基酸，更优选地，其长度不超过75个氨基酸；甚至更优选地，其不长于50个氨基酸。
因此，术语“肽”包括“寡肽”(其通常指长度为2至10个氨基酸的肽)和“多肽”(其通常指长度大于10个氨基酸的肽)。
如本文所用，“肿瘤特异性肽”是指仅由肿瘤细胞表达的肽，因此其发现于肿瘤细胞中和/或肿瘤细胞上，而非健康组织的细胞中和/或细胞上。当肿瘤特异性肽仅存在于肿瘤细胞的表面时，其也被称为“肿瘤特异性抗原”。根据本发明的肿瘤特异性肽包含这样的氨基酸序列，其具有或不具有如在肿瘤细胞中而非健康组织的细胞中发现的突变。因此，本文所用的肿瘤特异性肽被称为突变或非突变的肿瘤特异性肽。
如本文所用，“抗原”是任何结构的物质，其分别作为适应性免疫应答的受体、T细胞受体或抗体的靶标。抗原特别是蛋白质、多糖、脂质以及它们的亚结构，例如肽。当与蛋白质或多糖结合时，脂质和核酸特别具有抗原性。
“疾病相关抗原”是与疾病有关的抗原。因此，临床相关抗原可以是肿瘤相关抗原(TAA)。
根据本发明的“肿瘤相关抗原”或“TAA”是肿瘤细胞表面上由MHC I或MHC II分子或非经典MHC分子呈递的抗原。如本文所用，TAA包括“肿瘤特异性抗原”。
根据本发明的“表位”是能够刺激免疫应答的抗原的一部分。表位是抗原的一部分，其结合到特定的抗原受体(例如在免疫细胞的表面上)。两种或多种不同的抗原可能有共同的表位。在这些情况下，各自的免疫受体能够与带有相同表位的所有抗原反应。这样的抗原被称为交叉反应抗原。如本文所用，“新表位”是新近鉴定的表位，特别是肿瘤相关蛋白的表位。由于每种肿瘤都带有各自的个体化突变，因此新表位可能仅存在于一名患者体内(个体化“突变组”)，从而给出高度个体化的抗原标记。
如本文所用，术语“刺激”是指在体外由一种或更多种刺激剂引起的临床上相关的淋巴细胞(例如T细胞)的活化。这种刺激剂可以是例如刺激性的肽。临床相关淋巴细胞的活化意味着这些细胞的抗肿瘤应答的启动。
如本文所用，“刺激肽”涉及用于刺激T细胞的肽。刺激肽可以是例如肿瘤特异性肽、已知TAA的表位或新表位。
如本文所用，“扩增”或“克隆扩增”是指产生全部来源于单个细胞的子细胞。在T细胞的克隆扩增中，所有子代都具有相同的抗原特异性。
与本领域的一般理解一致，“T细胞”或“T淋巴细胞”是在细胞介导的免疫中起核心作用的一种淋巴细胞(白细胞的亚型)。通过细胞表面上存在的T细胞受体，可以将T细胞与其他淋巴细胞(例如B细胞和自然杀伤细胞)区分开。之所以称为T细胞，是因为它们是在胸腺中由胸腺细胞发育成熟的。
如本文所用，“PBMC”是指外周血单个核细胞，其可以从外周血获得。PBMC主要由淋巴细胞(即T细胞、B细胞和NK细胞)和单核细胞组成。“PBMC”还涉及前体外周血单个核细胞和经遗传修饰的细胞。
根据本发明的“TIL”是指肿瘤浸润淋巴细胞。这些是主要在肿瘤中发现的淋巴细胞、特别是T细胞。来源于肿瘤的淋巴细胞样品也称为TIL。分别地，TIL还涉及位于肿瘤中、肿瘤上或肿瘤周围的任何种类的淋巴细胞，或者是已与肿瘤组织或肿瘤细胞接触过的淋巴细胞。TIL也涉及前体(predecessor)TIL和遗传修饰的TIL。
如本文所用，“T细胞产品”是指在免疫治疗中使用的T细胞群。“T细胞产品”可以通过T细胞的(克隆)扩增获得。T细胞可以是自体的、同种异体的或遗传修饰的T细胞。
术语“自体”是指供体和接受者都是同一个人。术语“同种异体”是指供体和受体是不同的人。
IL-2、IL-15和IL-21是细胞因子家族的成员，它们各自具有四个α螺旋束。如本文所用，“白介素2”或“IL-2”是指人IL-2及其功能等同物。IL-2的功能等同物包括仍保持IL-2功能的IL-2的相关亚结构或融合蛋白。类似地，“白介素15”或“IL-15”是指人IL-15及其功能等同物。IL-15的功能等同物包括仍保持IL-15功能的IL-15的相关亚结构或融合蛋白。“白介素21”或“IL-21”是指人IL-21及其功能等同物。IL-21的功能等同物包括仍保持IL-21功能的IL-21的相关亚结构或融合蛋白。
如本文所用，术语“肿瘤反应性”涉及T细胞提供以下至少一项的能力：肿瘤细胞的遏制、肿瘤细胞的破坏、防止肿瘤转移、增殖停止、细胞活性的停止、细胞向恶性转化的进展停止、预防肿瘤转移和/或肿瘤复发(包括将恶性细胞重编程为非恶性状态)；防止和/或阻止与癌症相关的不良临床因素(例如营养不良或免疫抑制)，导致免疫逃逸和疾病进展的突变(包括表观遗传学改变)的积累停止，诱导长期免疫记忆以防止疾病扩散或未来的恶性转化影响到靶标(潜在的肿瘤细胞)，所述靶标包括结缔组织和未转化的有利于肿瘤疾病的细胞。对于ACT，肿瘤反应性T细胞具有特别的临床/生物学相关性。相反，不提供上述能力之一的T细胞是非反应性的。
如本文所用的表述“肿瘤超反应性免疫细胞”和“TURIC”是指特别地从未经刺激的前体T细胞扩增的免疫细胞、特别是T细胞。TURIC识别肿瘤特异性肽，但不能识别来自健康组织的靶标。与相应的非突变肽相比，TURIC对突变肽显示出更强的T细胞反应性。它们对T细胞受体拥有高亲和力，因此表现出更敏锐的肿瘤特异性，这还导致与来自相同来源的其他T细胞或可以通过本领域已知的方法获得的T细胞产品相比，其抗肿瘤活性也大大增强。
如本文所用，“反应性因子”是指通过直接测量T细胞的细胞毒性作用或间接通过测量在用肿瘤细胞/肽处理时的典型的T细胞应答来评估T细胞的肿瘤反应性而获得的值。
与“包括”、“含有”或“特征在于”同义的过渡性术语“包含”是包含性的或开放性的，并且不排除其他未列出的要素或方法步骤。过渡性短语“由……组成”排除了权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分，除了通常与之相关的杂质之外。由于由“包含”定义的主题可以含有但不一定含有其他未列出的要素或方法步骤，因此本文中由“包含”定义的任何主题可以限于“由……组成”。
制备含有TURIC的T细胞产品的方法
根据本发明的第一方面的方法提供了用于制备TURIC的方案。本发明人可以表明，在存在肿瘤特异性肽或自体肿瘤细胞的情况下用包括IL-2、IL-15和IL-21的细胞因子混合物培养后得到的淋巴细胞群体包含有利于临床应用的淋巴细胞组成。
根据第一方面，本发明提供了一种用于制备包含肿瘤超反应性免疫细胞(TURICS)的T细胞产品的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供含有患者T细胞的机体样品；
b)可选地从机体样品中分离T细胞；
c)在体外在存在有包括细胞因子白介素2(IL-2)、白介素15(IL-15)和白介素21(IL-21)的细胞因子混合物与刺激肽或一组刺激肽的情况下，刺激所述T细胞；
d)测定所述T细胞样品中的反应性因子，其中所述反应性因子指示是否存在靶向所述刺激肽或所述一组刺激肽中的至少一种肽的T细胞；
e)如果反应性因子为阳性，则将所述T细胞样品鉴定为肿瘤反应性T细胞样品；
否则将所述T细胞样品鉴定为非反应性T细胞样品；
f)在体外在存在有包括IL-2、IL-15和IL-21的细胞因子混合物与一种自体肿瘤细胞或者所述刺激肽或一组刺激肽的情况下，培养所述非反应性样品以形成T-细胞产品；
g)可选地在体外在存在有包括IL-2、IL-15和IL-21的细胞因子混合物与所述刺激肽或一组刺激肽的情况下，刺激所述T细胞产品；
h)测定所述T细胞产品中的反应性因子；以及
i)如果反应性因子为阳性，则选择所述T细胞产品作为包含TURICS的T细胞产品。
根据机体样品中未经刺激的T细胞数量低，可能有必要将刺激步骤c)重复数次以提高TURIC的肿瘤反应性，可以重复最初的刺激步骤c)数次，以丰富根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤d)中测定反应性因子之前，执行步骤c)高达3次，优选地，执行步骤c)两次。
当在本发明的方法中使用刺激肽或一组刺激肽时，这意味着应用一种特定种类的刺激肽或一组不同种类的刺激肽。这没有将刺激肽限定为特定数量的分子。可以从给定的浓度计算出所应用的肽的确切数量。因此，在本发明的一个实施方案中，步骤c)、步骤f)和步骤g)中的培养基包含一种刺激肽的多个拷贝。刺激肽的拷贝数增多导致T细胞的扩增速率增大。
在本发明的另一实施方案中，步骤c)、步骤f)和步骤g)中的培养基包含一组刺激肽。使用一种或更多种刺激肽导致淋巴细胞的多种集合，特别是对名义(nominal)临床相关抗原具有反应性的T细胞。
在根据本发明的方法中，可以应用一种刺激肽或一组不同种类的刺激肽来刺激T细胞或与T细胞共培养。然而，当增加不同种类的刺激肽的数量时，这也增大了所谓的“克隆性膨胀(clonal inflation)”的风险，这可能导致不期望的副作用，例如所得T细胞产品的抗肿瘤活性降低。发明人已经发现，在根据本发明的方法中，在不会显著影响该方法的结果的情况下，可以同时应用至多20种不同种类的刺激肽。因此，在本发明的一个实施方案中，一组刺激肽由至多20种不同的刺激肽组成，优选由至多10种不同的刺激肽组成，更优选由至多五种不同的刺激肽组成。一组刺激肽可以由例如两种、三种、四种或五种不同的刺激肽组成。
在根据第一方面的方法中使用的T细胞/T细胞产品显示出集中识别从肿瘤组织中鉴定出的几种靶标肽。有趣的是，相比于对未突变的肽的识别，对突变的肿瘤特异性肽的识别引发了更明显的抗肿瘤应答。因此，在本发明的一个实施方案中，所述刺激肽是突变的或非突变的肿瘤特异性肽，其中所述突变的肿瘤特异性肽包含这样的氨基酸序列，其具有在患者的肿瘤细胞中发现而非在患者健康组织的细胞中发现的突变。
除了使用肿瘤特异性肽或单独使用如同肽的相应的肿瘤特异性肽表位(即新表位)以外，还可以以各种方式向T细胞呈递刺激肽。此类方式包括但不限于在人工支架上呈递表位，如具有或不具有共刺激分子的肽，产生或不产生细胞因子的肿瘤细胞或其他抗原呈递细胞，或自体或同种异体的非专职细胞或专职细胞，其以转基因形式或在冲击下(uponpulsing)呈递肿瘤表位。
根据本发明的方法使用肿瘤特异性肽刺激T细胞，导致针对该特定的肽的免疫细胞的扩增和富集。因此，这导致所得的T细胞产品对呈递所述肽的肿瘤细胞更精确和集中的抗肿瘤活性。肿瘤疾病的类型显然没有限制。因此，本发明的方法可以用于产生包含针对多种肿瘤疾病的TURIC的T细胞产品，是因为可以使用多种肿瘤的特异性肽，诸如脑癌，胰腺癌，起源于神经嵴的肿瘤例如神经母细胞瘤、节细胞神经瘤、节细胞性神经母细胞瘤和嗜铬细胞瘤，上皮(例如皮肤、肺、胰腺、结肠或乳腺)以及间充质来源的(例如脂肪性、软骨性、纤维性、成纤维细胞性、肌成纤维细胞性、骨性或血管性)肿瘤，以及例如血液、骨髓、淋巴或淋巴系统的造血系统肿瘤(hematopoietic tumors)。
根据本发明的一个实施方案，所述肿瘤疾病选自脑癌，胰腺癌，造血系统肿瘤，源自神经嵴的肿瘤以及上皮或间充质来源的肿瘤。
可以使用一种或更多种刺激肽直接在机体样品上或对分离的T细胞进行T细胞刺激。由于不存在潜在的残余自体刺激剂，在刺激之前分离T细胞以提供更具选择性的肿瘤应答可以是有益的。
目前正在使用几种表位鉴定方法，这些方法可以用于鉴定新的肿瘤相关抗原，即新表位。对于从来源于肿瘤细胞的人白细胞抗原(HLA)分子中洗脱的肽进行基于质谱的测序旨在破译以天然方式加工和呈递的肽。此外，编码TAA的cDNA文库的筛选已被广泛使用。这种基于肽的筛选方法通过全外显子组测序然后利用计算机分析，基于预测主要组织相容性复合物(MHC)-肽复合物的肽结合能力的算法来鉴别突变。另一种方法是串联短基因(tandem minigene，TMG)方法，其中使用全外显子组测序鉴别患者的“个体”突变，以便随后构建编码突变表位(例如新表位)的个体化基因序列文库。在TMG设置中，仅合成了突变周围的一小部分基因，并测试了其与自体T细胞的反应，以基于替代性抗原呈递细胞以与肿瘤细胞相比类似的方式来加工和呈递新表位的假设，来确认预测的新表位是否以天然方式加工并呈递给免疫系统。本文所述的肿瘤特异性肽可以通过任何上述方法或其组合来鉴定，如示例2中所述。
肿瘤抗原主要经由MHC I或II类复合物呈递于肿瘤细胞的表面。由于MHC II类肽主要由15个氨基酸组成，而大多数MHC I类肽则由9个氨基酸组成、极少由8个氨基酸或10个氨基酸组成，因此应选择肽的长度使得免疫细胞可以决定将肽修整至所需的长度。因此，在本发明的一个实施方案中，刺激肽的长度在5至31个氨基酸范围内。刺激肽的长度可以是例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个氨基酸。在本发明的另一实施方案中，刺激肽的长度在7至25个氨基酸范围内。优选地，刺激肽的长度在9至21个氨基酸范围内。
在本发明的一个实施方案中，肿瘤特异性突变位于肽的中部。为了实现从肽的两端均等的修整，在中部带有突变的肽优选由奇数个氨基酸组成。因此，刺激肽的长度可以是例如5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29或31个氨基酸。
在刺激和培养步骤中，另外还可以将细胞与饲养细胞和/或抗CD3的抗体一起孵育。在现有技术中已经描述了与饲养细胞和抗CD3的抗体的共培养。饲养细胞被认为导致细胞生长的改善。饲养细胞是经辐射的细胞，其不增殖或仅少量增殖。饲养细胞使培养物中细胞接触的量增多，并且还饲养了增殖和扩增的细胞培养物。
抗CD3的抗体优选是被定义为OKT3的抗体。OKT3是免疫球蛋白IgG2a同种型的鼠源性单克隆抗体。OKT3的靶标CD3是一种仅在成熟T细胞上发现的多分子复合物。在体外T细胞、OKT3和单核细胞之间的相互作用导致T细胞在体外活化。
对于细胞因子的产生和其他抗肿瘤反应性测定，以限定的细胞密度进行T细胞的刺激。据报道，在高细胞密度(例如102至108个细胞/μg肽)下的短期刺激使来自PBMC的人T细胞对可溶性肿瘤肽呈现完全的反应性。相反，在低于102的低细胞密度的培养物中进行T细胞的刺激常常不能刺激T细胞。因此，在本发明的一个实施方案中，针对例如102至108个细胞进行T细胞和/或T细胞产品的刺激。可以针对1×102个细胞、5×102个细胞、1×103个细胞、5×103个细胞、1×104个细胞、5×104个细胞、1×105个细胞、5×105个细胞、1×106个细胞、5×106个细胞、1×107个细胞、5×107个细胞或1×108个细胞进行所述刺激。根据本发明的另一实施方案，针对103至106个细胞、优选针对104至105个细胞进行所述刺激。
T细胞或T细胞产品的刺激和/或培养的时间范围为6小时至180天。时间范围较大是由于来自不同供体的样品的表现可能有很大不同。结果表明，来自不同机体样品的淋巴细胞具有非常不同的生长速率。例如，直接来源于胶质母细胞瘤或胰腺癌的肿瘤的淋巴细胞生长非常不同。来源于胰腺癌的淋巴细胞在二至五天内已经可以被检测到。来源于胶质母细胞瘤的淋巴细胞仅在一至两周后才可以被检测到。因此，来自其他机体样品的淋巴细胞可能需要更长的时间才变得可以被检测到。
由于是为了评估T细胞的肿瘤反应性而执行所述刺激步骤，因此不需要细胞长时间增殖。相反，为了获得用于肿瘤反应性分析的可靠结果，需要在存在刺激肽的情况下刺激的持续时间最小。该最小的刺激时间取决于用于测定肿瘤反应性的方法，并且可以在几小时至几天之间变化。同样，刺激T细胞的最长时间是高度可变的。已经观察到，根据测定方法，在1小时至10天之间可以获得T细胞的肿瘤反应性测定的可靠结果。因此，根据本发明的一个实施方案，将T细胞和/或T细胞产品刺激1小时至10天。例如，细胞刺激可以进行1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。在本发明的一个实施方案中，将T细胞和/或T细胞产品刺激3小时至5天。在本发明的另一实施方案中，将T细胞和/或T细胞产品刺激1天至3天。
本发明的方法包括：在包含自体肿瘤细胞或刺激肽(例如肿瘤特异性肽)的培养基中的培养步骤。
由于与自体肿瘤细胞共培养，肿瘤特异性T细胞的扩增更有效率。尽管培养步骤可能相当短，但是它导致扩增的临床相关T细胞的产量显著提高，特别是对于从外周血扩增的临床相关T细胞。
结果表明，利用外周血细胞，大约7天的培养时间对于其他的培养的结果特别有利。但是，如上所述，根据样品的不同，仅扩增4天就足够了。鉴于人体样品中的T细胞数量较少，共培养可能需要大约10天或更长时间。因此，培养步骤进行1至10天。在本发明的一个实施方案中，非反应性T细胞样品与自体肿瘤细胞或刺激肽一起培养1至10天。T细胞样品可以培养例如1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。优选地，非反应性T细胞样品培养3至9天，更优选地非反应性T细胞样品培养6至8天。
在根据本发明的方法的刺激和/或培养步骤中，细胞可以经历几轮扩增以扩增更多的细胞和/或从具有其他反应性的其他细胞中胜出。已经观察到，单一一轮扩增就已经足够刺激和/或扩增T细胞。但是，已经确认：为了可靠的刺激/培养结果，高达5轮的扩增适用于产生T细胞。因此，在本发明的一个实施方案中，在步骤c)、步骤f)和/或步骤g)中，细胞经历1至5轮的扩增。细胞可以扩增例如1轮、2轮、3轮、4轮或5轮。
在存在IL-2、IL-15和IL-21的情况下培养和/或刺激T细胞和T细胞产品。根据本发明的另一实施方案，液体组合物中IL-2的浓度在10至6000U/ml的范围内。国际单位(U)是IL-2的量的标准度量。它是由其诱导CTLL-2细胞增殖的能力决定的。IL-2的浓度优选在500至2000U/ml范围内。更优选地，IL-2的浓度在800至1100U/ml范围内。根据一个实施方案，IL-15的浓度在0.1至100ng/ml范围内。优选地，IL-15的浓度在2至50ng/ml范围内，更优选在5至20ng/ml范围内。最优选的浓度是约10ng/ml。在本发明的另一实施方案中，IL-21的浓度在0.1ng/ml的范围内，优选在2至50ng/ml的范围内，更优选在5至20ng/ml的范围内。
高浓度的肽，例如5μg肽/孔/105个细胞，导致可检测到对于突变型和野生型肽的抗肿瘤应答(参见图2C)。然而，当暴露于从1pg/105个细胞至1mg/105个细胞的低得多的肽浓度时，可以在培养物中选出具有优先识别个体化突变的TCR的T细胞亚群。
因此，在一个实施方案中，在该方法的步骤c)、步骤f)和/或步骤g)中，刺激肽或一组刺激肽中的每种肽以1pg/105个细胞至1mg/105个细胞的浓度存在。因此，刺激肽可以例如以1pg/105个细胞、10pg/105个细胞、100pg/105个细胞、1ng/105个细胞、10ng/105个细胞、100ng/105个细胞、1μg/105个细胞、10μg/105个细胞、100μg/105个细胞或1mg/105个细胞的浓度存在。在本发明的另一实施方案中，刺激肽的浓度为1ng/105个细胞至100μg/105个细胞，优选浓度为1μg/105个细胞至10μg/105个细胞。
由于一个肿瘤细胞足以在共培养过程中刺激多个T细胞，因此自体肿瘤细胞的数目与T细胞数目相比相当低。然而，为了使在培养物中所有T细胞可以与肿瘤细胞接触，与T细胞数目相比，使用高数目的肿瘤细胞也可能是有利的。特别地，T细胞与自体肿瘤细胞的比例在1000:1至1:1000范围内。发现如果T细胞与自体癌细胞的比例在10:1至1:10的范围内，则可获得最佳结果。该比例可以是例如10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。优选的比例是7:1至3:1。因此，在本发明的一个实施方案中，非反应性T细胞样品与自体肿瘤细胞以1000:1至1:1000范围内的比例、优选以10:1至1:10范围内的比例、更优选以7:1至3:1范围内的比例进行培养。
重复暴露于特定的抗原靶标会富集某些能够具有持续的抗肿瘤应答的T细胞群(请参见示例)。这是基于对由重要的驱动突变(driver mutation)产生的突变肽(与野生型/天然形式相对)的差异化识别。因此，在本发明的一个实施例中，步骤f)执行高达五次。步骤f)可以例如执行一次、两次、三次、四次或五次。优选地，步骤f)执行四次，更优选地，步骤f)执行三次。
由于在存在自体肿瘤细胞或刺激肽的情况下共培养T细胞以生产T细胞产品也会触发特定的T细胞抗肿瘤应答，因此可以在根据本发明的方法的共培养步骤之后直接测量细胞的抗肿瘤活性。该直接测量允许省略在所述方法的步骤h)中测定反应性因子之前的额外的刺激步骤，这减少了该方法鉴定和选择TURIC的总时间。然而，在共培养步骤之后直接执行对获得的T细胞产品的刺激步骤可能导致更集中的肿瘤反应性，从而在测定反应性因子时得到更精确并因此更可靠的读数。因此，本发明的方法可以容易地适应从业者的需求。
指示是否存在临床相关淋巴细胞的参数的测定在本领域中是已知的并且已在示例中举例说明。根据一个实施方案，反应性因子选自T细胞增殖，细胞因子产生，细胞毒性，例如杀伤患病机体样品的细胞，脱粒，特别是通过CD107a阳性定义的，成熟和/或分化，特别是通过CD45RA与CCR7的组合定义的，T细胞活化标志物的表达，特别是选自MHC II类分子的CD25、CD56、CD69；耗尽和/或活化标志物，选自Foxp3、LAG-3、TIM-3、4-1BB、PD-1、CD127(IL-7R)、IL-21受体，或T细胞信号传导，特别是选自ζ链磷酸化的。
这些参数的测试可以与流式细胞术和细胞分选相结合。因此，也可以从扩增的淋巴细胞群中分离出临床相关的淋巴细胞群，特别是TURIC群。分离的TURIC可以进一步培养或直接用于免疫疗法。
一种已确立的测定免疫细胞抗肿瘤活性的方法是在用相应的刺激肽进行刺激后测量细胞因子的产生。刺激后免疫细胞产生的典型细胞因子例如是IFN-γ、TNFα、IL-2、IL-17、IL-4、IL-5、GM-CSF，颗粒酶B、穿孔素的释放，活化标志物的上调，例如CD25、HLA-DR、CD69、4-1BB。在刺激后，T细胞可以同时产生一种以上的细胞因子，可以对其单独进行测量，以整体上测定细胞的肿瘤反应性。指示是否存在临床相关淋巴细胞的优选参数是例如一种或更多种细胞因子的产生，特别是IFN-γ或TNFα的产生。因此，在本发明的一个实施方案中，反应性因子为IFN-γ的浓度，并且如果IFN-γ的浓度高于预定的IFN-γ阈值，则反应性因子为阳性。所使用的IFN-γ阈值高度可变，是因为它取决于实验设置和培养条件。该阈值反映了细胞因子产量的生物学相关性，所述细胞因子产量(如离体测量的)必须与特定的对照实验(例如有或没有刺激肽的培养基对照)进行比较。
在一个实施方案中，IFN-γ阈值在10pg每105个T细胞(用1μg肽刺激)至150pg/105个T细胞/1μg肽之间。因此，阈值可以定义为例如10pg/105个T细胞/1μg肽，20pg/105个T细胞/1μg肽，30pg/105个T细胞/1μg肽，40pg/105个T细胞/1μg肽，50pg/105个T细胞/1μg肽，60pg/105个T细胞/1μg肽，70pg/105个T细胞/1μg肽，80pg/105个T细胞/1μg肽，90pg/105个T细胞/1μg肽，100pg/105个T细胞/1μg肽，110pg/105个T细胞/1μg肽，120pg/105个T-细胞/1μg肽，130pg/105个T细胞/1μg肽，140pg/105个T细胞/1μg肽或150pg/105个T细胞/1μg肽。
在一个实施方案中，反应性因子是CD107a阳性，如果T细胞是CD107a阳性，则反应性因子是阳性。
在另一实施方案中，反应性因子是T细胞增殖，当增殖是培养基对照的标准偏差的两倍以上时，其被认为是阳性的。
直接测量T细胞主动杀伤和破坏(自体)肿瘤细胞的能力体现了确定T细胞是否表现出抗肿瘤活性的最可靠的分析。因此，在另一实施方案中，反应性因子是杀伤肿瘤细胞的能力，其可以通过铬-51释放试验来测定。
为了测试T细胞/T细胞产品是否仅对肿瘤特异性肽的个体突变有反应性或者是否也识别未突变的肿瘤特异性肽并因此可以代表常规的肿瘤特异性靶标，还用与突变的肿瘤特异性肽相对应的非突变序列的肽(所谓的比较肽)测试了抗肿瘤活性。因此，在本发明的一个实施方案中，另外用比较肽或一组比较肽作为所述刺激肽或一组刺激肽来进行步骤c)和步骤d)，其中比较肽包含与肿瘤特异性肽序列相对应的非突变序列。
在本发明的一个实施方案中，另外用比较肽或一组比较肽作为所述刺激肽或一组刺激肽来进行步骤g)和步骤h)，其中比较肽包含与突变的肿瘤特异性肽序列相对应的未突变的氨基酸序列，并且其中在用比较肽或一组比较肽刺激T细胞产品时的反应性因子等于或高于用突变的肿瘤特异性肽或一组肿瘤特异性肽刺激T细胞产品时的反应性因子的情况下，取消选择所述T细胞产品。
由于刺激肽(例如，突变的肿瘤特异性肽或相应的非突变肽)的浓度对于用于确定肿瘤反应性的测定法的结果传达起着至关重要的作用(参见图2C)，所以两种肽以相似的浓度应用。因此，在本发明的一个实施方案中，每种比较肽以与相应的肿瘤特异性肽相似的浓度施用。
可以从含有T细胞的机体的任何部位获取机体样品，诸如原发性肿瘤组织、转移瘤和外周血，例如PBMC。用于本发明方法目的的机体样品的获得可能是不足的，因为手术主要是针对诊断时呈现无转移的患者进行的。因此，使用PBMC筛选新表位的识别也是开发个体化细胞疗法的可行方法。因此，在本发明的一个优选实施方案中，机体样品是全血，特别地机体样品是PBMC。
此外，发现一些刺激肽被来自PBMC的T细胞和来自TIL的T细胞两者识别，但是也有些肿瘤特异性肽，它们或是被PBMC T细胞或是被TIL T细胞排他性地识别(见图3B)。有趣的是，在将PBMC T细胞(其对于在TIL T细胞中触发了抗肿瘤应答的刺激肽无反应)与自体肿瘤细胞共培养之后，所得的PBMC T细胞产品对最初不识别的肽产生强烈反应。共培养之后的T细胞对于肽(共培养前的T细胞对其无反应)的这种反应，表明存在未被刺激的T细胞群体，因此本文所述的TURIC的概念不限于一种特定的机体样品。这意味着，如果针对一种类型的机体样品的T细胞不能检测到较高的抗肿瘤应答，则可以对来自同一患者的其他类型的机体样品执行根据本发明的方法，以便鉴定和选择TURIC。
因此，在本发明的一个实施例中，实际上可以针对不限数量的机体样品执行所述方法。优选地，可以针对至少2个、至少3个、至少4个、至少5个或至少6个机体样品执行所述方法。特别地，可以针对1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个机体样品执行所述方法。
本发明的一个优点是不需要提供来自肿瘤组织的T细胞。这是特别有用的，因为它使从业者能够从非肿瘤样品中获得T细胞。这些机体样品无需进行手术即可容易地获得，从而避免了与此类医疗干预措施有关的风险。因此，在本发明的一个实施方案中，机体样品不是肿瘤样品。
在另一个实施方案中，机体样品选自全血，血清，血浆，尿液，泪液，精液，唾液，滑液，脐带，胎盘组织，骨髓，呼气，灌洗物例如支气管肺泡灌洗液，脑脊液(CSF)，原发性、继发性淋巴组织，肠腔样品，腹膜腔样品，移植物，移植细胞，移植组织或器官。
获得T细胞的方法是本领域已知的。例如，可以在外科干预例如活检期间分离T细胞。还可以通过从组织和/或器官中抽吸单一细胞来分离T细胞。
可以将T细胞在从机体样品中分离之后直接在存在IL-2、IL-15和IL-21的情况下进行刺激。此外，还可以例如通过冷冻将新分离的T细胞或获得的T细胞产品储存直至使用。
治疗用组合物
发明人观察到通过根据第一方面的方法获得的T细胞产品表现出提高的治疗效果。因此，在第二方面，本发明提供了用于癌症患者治疗的包含至少一种具有TURIC的T细胞产品的组合物，所述治疗包括：执行根据第一方面的方法以获得具有TURIC的T细胞产品，并且向患者施用具有TURIC的T细胞产品。
由于TURIC被认为是具有严加集中的抗肿瘤活性的免疫细胞，因此不限于任何特定类型的癌症，所以它们可以用于治疗几乎任何肿瘤疾病。结果，根据第二方面的组合物可以用于治疗多种肿瘤疾病，诸如脑癌，胰腺癌，起源于神经嵴的肿瘤例如神经母细胞瘤、节细胞神经瘤、节细胞性神经母细胞瘤和嗜铬细胞瘤，上皮(例如皮肤、结肠或乳腺)以及间充质来源的(例如脂肪性、软骨性、纤维性、成纤维细胞性、肌成纤维细胞性、骨性或血管性)肿瘤，以及例如血液、骨髓、淋巴或淋巴系统的造血系统肿瘤。
根据本发明的一个实施方案，所述肿瘤疾病选自脑癌，胰腺癌，造血系统肿瘤，源自神经嵴的肿瘤，以及上皮或间充质来源的肿瘤。
T细胞产品具有低的调节性T细胞百分比。已知调节性T细胞可抑制淋巴细胞群的治疗功能。根据第二方面的一个实施方案，T细胞产品中基于T细胞总数的Treg百分比低于5％，优选低于3％。
可以经由合适的途径(例如，静脉内施用)向需要治疗的患者施用有效量的含有TURIC的T细胞产品或其组合物。可以通过注射或导管等引入细胞。如果需要的话，还可以共同引入或顺序地引入其他药物(例如细胞因子)。任何细胞或其组合物可以以有效量施用于受试者。如本文所用，有效量是指施用后赋予受试者所期望的治疗效果的相应试剂(例如细胞或其组合物)的量。确定本文所述的细胞或组合物的量是否达到期望的治疗效果对于本领域技术人员而言将是显而易见的。
可以通过使用本领域已知的施用途径来递送含有所述T细胞产品的组合物。合适的施用途径是例如静脉内施用、皮下施用、动脉内施用、皮内施用、鞘内施用。
优选地，含有T细胞产品的组合物经由静脉内途径、动脉内途径、鞘内途径或腹膜内途径施用，或者经由导管直接施用到组织中、直接施用到骨髓中或脑脊液中。
本领域技术人员知道含有要施用的T细胞产品的组合物的不同配方。这样，示例性配方可以包含聚乙二醇(PEG)或者支持和/或促进组合物施用的其他物质。
此外，可以通过众所周知的方法获得所施用的复合物。这样的方法可以是例如通过重组方式产生蛋白质。另外，可以在已经适应于产生重组蛋白的多种细胞类型中产生重组蛋白。可以通过本领域已知的方法(例如逆转录病毒、非逆转录病毒载体或基于CRISP-Cas9的方法)用要生产的相应的蛋白质的基因构建体来转染那些细胞。
根据本发明的一个实施方案，给患者施用的TURIC剂量为每kg体重107至108个细胞。TURIC的剂量可以是例如每千克体重1×107、1.5×107、2×107、2.5×107、3×107、3.5×107、4×107、4.5×107、5×107、5.5×107、6×107、6.5×107、7×107、7.5×107、8×107、8.5×107、9×107、9.5×107或1×108个细胞。
通过以下非限制性实施例进一步定义本发明。
实施例
示例1–T细胞和自体肿瘤细胞的分离和生成
从三名胰腺癌患者获得了胰腺癌TIL和自体肿瘤细胞系。
1.1TIL的生成
将个体的单个肿瘤碎片(1-2mm3)与补充了IL-2 1000IU/ml、IL-15 10ng/ml，IL-2110ng/ml(Prospec，以色列内斯-齐奥纳(Ness-Ziona))的含有5％人AB血清(InnovativeResearch，美国密歇根州)的TIL培养基(即，Cellgro GMP无血清培养基(CellGenix，德国弗莱堡))一起置于24孔组织培养板的每个孔中。在第7天，以1(饲养细胞):10(TIL)的比例加入经辐照(55Gry)的饲养细胞(同种异体PBMC)。当TIL覆盖24孔的表面超过70％时，将它们转移至6孔板中，然后用30ng OKT3/mL和以1(饲养细胞):5(TIL)比例的经辐照(55Gry)的同种异体饲养细胞在G-Rex烧瓶(Wilson Wolf，目录号：800400S)中进一步将它们扩增。
1.2自体肿瘤细胞的生成
手术或活检后，用手术剪和手术刀切开肿瘤组织。将单个肿瘤碎片(1-2mm3)与补充了抗生素(青霉素(100IU/mL)和链霉素(10mg/mL))(Life Technologies，美国卡尔斯巴德(Carlsbad))和两性霉素B(2.5mg/L，Sigma-Aldrich，美国密歇根州)的、含有20％FBS(Life Technologies，美国加利福尼亚州)、表皮生长因子(20ng/ml，ImmunoTools，德国弗里索伊特(friesoythe))的1ml肿瘤培养基(即，RPMI 1640)一起置于24孔组织培养板中。然后培养肿瘤细胞系，并在无EGF的情况下传代。细胞毒性实验所需的肿瘤细胞是在第十五代至第二十代期间获得的。
1.3 PBMC的分离
经Ficoll-Hypaque gradient(密度梯度离心)(GE Healthcare，瑞典乌普萨拉(Uppsala))从全血中分离出外周血单个核细胞(PBMC)，并在无菌PBS中洗涤两次，然后再用于实验。
示例2–DNA分离、全基因组测序、突变组学(mutanome)分析和新表位合成
如以下简要描述的，进行基因组DNA的分离和纯化、文库构建、所有编码基因的外显子组捕获以及肿瘤组织和对照患者样品的下一代测序。将来自患者样品(肿瘤组织和TIL)的基因组DNA片段化，以构建Illumina DNA文库(Illumina，加利福尼亚圣迭戈)。按照制造商的说明(Agilent，加利福尼亚圣克拉拉)，使用Agilent SureSelect 50Mb试剂盒第3版在溶液中捕获与外显子相对应的DNA区域。使用HiSeq 2000基因组分析仪(Illumina，加利福尼亚圣迭戈)进行双末端测序，从每个片段的每个末端得到100个碱基。测序数据的结果被映射到人类基因组参考序列。通过对来自非恶性病变的肿瘤DNA的超过5000万个碱基的比较来确定测序数据中的改变。发现对每个样品获得的序列的很大一部分出现在所捕获的编码区内。在肿瘤和正常样品中分析了目标DNA的超过4,300万个碱基；对于这两种样品类型，达到每个碱基平均读取42到51次。使用CASAVA 1.6软件(Illumina，加利福尼亚圣迭戈)的Eland算法，将所述标签与人类基因组参考序列(hg18)进行比对。使用Illumina的BaseCall软件的chastity过滤器来选择序列读数以进行后续分析。应用CASAVA 1.6软件(Illumina，加利福尼亚圣迭戈)的ELANDv2算法来鉴别所获得的序列中的点突变、小的插入、缺失或终止密码子。分析中排除了单核苷酸多态性数据库(dbSNP)中记录的突变多态性。如先前所述，潜在的体细胞突变被滤出(Jones等，2010)，同时在Excel电子表格中仅分别列出了非同义的单核苷酸和二核苷酸替代，以进行下游工作。
选择候选肽的筛选标准是肿瘤组织中突变基因的表达水平超过5％。另外，具有终止密码子的剪接产物或突变序列可能造成比用于筛选免疫原性的标准15-mer肽短的表位。将得到的肽序列的长度设定为15-mer，以包括由HLA I类(8-10个氨基酸)和HLA II类(11-20个氨基酸)分子呈递的所有可能的表位。
在通过全外显子组测序随后进行计算机分析鉴别突变后，通过将突变置于15个氨基酸的序列的中央位置来构建15-mer肽(Peptide&Elephants，德国柏林)。还合成了相应的野生型表位，以在免疫学分析中比较所述匹配的突变序列与野生型序列(肽对)。
示例3–T细胞对新表位的免疫反应性的评价
3.1 IFN-γ的产生
将例如来自TIL或PBMC的T细胞(1.0×105个细胞)在圆底96孔微量滴定板中的含有1μg个体野生型肽或突变肽的200μl T细胞培养基中进行培养。阴性对照仅包含测定培养基，而阳性对照则包含30ng/mL的抗人CD3抗体克隆OKT3(Biolegend，加利福尼亚圣迭戈)以实现最大的TCR刺激。将细胞于37℃在5％的CO2下孵育3天，然后使用标准的三明治酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(Mabtech，瑞典斯德哥尔摩)收集上清液用于IFN-γ的产生。从表位(肽)特异性反应中减去阴性对照(培养基)的值，并且反映IFN-γ产量(以pg/3天/1.0×105个T细胞为单位)的报告数据表示来自T细胞群体的IFN-γ的净产量。必要时，将单克隆抗体(mAbs)w6/32(抗MHC I类，HLA-A，B和-C)和L243(抗HLA-DR)用作阻断抗体以评估MHCI类或MHC I类限制性。
3.2 CD107a的诱导的分析
将T细胞(2×105)与4×104个自体肿瘤细胞在含有200μl测定培养基/孔(RPMI1640，含10％的FBS和青霉素/链霉素；均来自Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)的96孔组织培养板中于37℃(和5％CO2)共培养5小时。在孵育期间，添加了1.3μg/ml莫能菌素(Merck KGaA，德国达姆施塔特)和4μl抗人CD107a-Alexa Fluor 700抗体(克隆H4A3；BD Biosciences，新泽西州Franklin Lakes)。PMA用作阳性对照，无肿瘤细胞的测定培养基独自用作阴性对照。孵育5小时后，将细胞用抗人CD3-PE/Cy7(克隆HIT3A；BioLegend，加利福尼亚圣迭戈)、抗人CD4-V450(克隆RPA-T4)和抗人CD8-APC/Cy7(克隆SK1)(两者均来自BD Biosciences，新泽西州FranklinLakes)进行染色，并通过流式细胞仪进行分析。
3.3铬51释放试验
在标准的铬51(Cr51)释放试验中测定特异性细胞毒性。自体或对照肿瘤细胞系(‘靶细胞’，T)用100μCi Na2 51CrO4标记2小时。将T细胞与自体肿瘤细胞系以12:1的比例(T细胞:肿瘤细胞；表示为效应子(E)与靶(T)细胞的比例)共同孵育。将具有T细胞:肿瘤细胞共培养物的平行孔与抗HLA I类抗体(克隆W6/32)或抗HLA II类抗体(克隆L243，抗HLA-DR)一起孵育，以利用阻断抗体(干扰MHC I类或MHC II类抗原呈递)测试减少的肿瘤细胞的杀伤力。测定上清液中铬51的释放，并通过标准方法计算特异性细胞毒性活性。
3.4用自体肿瘤细胞系重复刺激
为了用自体肿瘤细胞系重复刺激，将T细胞与肿瘤细胞在含有T细胞培养基的六孔组织培养板(5×106个TILs:1×106个肿瘤细胞)中共培养7天，之后再用肿瘤细胞刺激TIL两次以上，从而形成T细胞产品。
在用肿瘤细胞重复刺激后，所得T细胞产品的免疫反应性的评估直接在与肿瘤细胞共培养7天后或在存在突变肽的情况下的上述刺激后进行。
示例4–T细胞产品中T细胞的表型分析
4.1流式细胞术和分析
所有流式细胞术实验均在BD FACS Aria流式细胞仪上进行，同时使用FlowJo软件版本7进行数据分析(两者均来自BD Biosciences，新泽西州FranklinLakes)。
4.2 T细胞表型
T细胞用抗CD3 Brilliant violet570、抗CD4 Brilliant violet 510、抗CXCR3FITC(均来自Biolegend，加利福尼亚圣迭戈)和抗CD8a APC-Cy7(BD Biosciences，新泽西州Franklin Lakes)染色。15分钟后，将细胞在PBS-0.1％FBS中洗涤，并通过流式细胞仪进行分析。如前所述(Liu et al，2016)基于所表达的CD45RA和CCR7进行了分化和成熟标志物的分析。
示例1至示例4的结果
为了更好地便利与本研究相关的数据的呈现，结果部分已被组织为反映与每个患者个人相关的结果。图4显示了使用IL-2、IL-15和IL-21对来自胰腺癌组织的CD4+和CD8+TIL进行了可靠扩增，特别是在中央记忆和效应记忆区室(compartment)内。
患者PanTT26
从患者PanTT26建立了TIL和相应的肿瘤细胞系。流式细胞术分析显示，自体肿瘤细胞刺激前的TIL(“年轻”TIL)包含约59％的CD8+T细胞和22％的CD4+T细胞(图1A)。然后用PanTT26肿瘤细胞系(自体)刺激TIL 3次，以观察经IL-2/IL-15/IL-21调节的TIL反复暴露于肿瘤是否会导致肿瘤表位-反应性T细胞的富集。所得的TIL富含CD8+TIL(几乎100％)，而CD4+T细胞完全不存在。
在Cr51释放试验中使用W6/32(抗HLA-I)和L243(抗HLA-DR)抗体，发现在用自体肿瘤细胞系3×刺激之前的TIL表现出减弱的细胞毒性作用与HLA II类抑制，同时W6/32(抗MHC I类)抗体则完全消除了肿瘤识别(图1B)。该观察结果表明PanTT26TIL的细胞毒性作用主要是受HLA I类抗原呈递的限制。
进行了来自患者PanTT26的胰腺肿瘤组织的全外显子测序，以鉴别可能产生突变抗原(新抗原)的与癌症相关的突变。合成鉴别出的肽序列与相应的野生型序列，并通过测量抗原特异性的IFN-γ的产量来测试T细胞反应性。总共鉴定了298种肽(分别为149种野生型和149种突变型)，并测试了在用自体肿瘤细胞进行3×刺激之前(“年轻TIL”)和之后的两种TIL。如表1所示，发现作为随后暴露于野生型肽或突变肽的响应，年轻TIL或经肿瘤细胞刺激的TIL产生了超过150pg的IFN-γ(每105个T细胞/1微克肽)。
表1：在用自体肿瘤细胞系重复刺激之前和之后的PanTT26 TIL针对所有预测的个体突变靶标(和相应的野生型序列)所产生的IFN-γ。注释：WT＝野生型；Mut＝突变体
Figure BDA0002996823820000201
Figure BDA0002996823820000211
Figure BDA0002996823820000221
Figure BDA0002996823820000231
例如，观察到与年轻TIL相比，用自体肿瘤细胞3×刺激之后的TIL，对于突变的KRAS肽KLVVVGAVGVGKSAL的IFN-γ产量增大(表1)。该发现的临床相关性是由已建立的知识表明的，即致癌突变体KRAS通常在PDAC发病机制中起关键作用(Eser等，2014)。观察到在暴露于来自NCOR1的突变肽(KLKKKQVKVFA，突变：N99K)后，PanTT26的年轻TIL和经肿瘤细胞刺激的TIL具有最强IFN-γ应答。响应于突变的NCOR1，年轻TIL产生327pg IFN-γ/10e5 TIL，而经肿瘤细胞刺激的TIL显示为710pg IFN-γ/10e5 TIL(表1)。
PanTT26 TIL还显示出针对源自WDFY4的突变肽(RKFISLHKKALESDF)的强烈IFN-γ应答，其是可能与自身免疫性疾病(例如系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎)相关的蛋白质。PanTT26中的17％的突变(25/149突变)与锌指蛋白(ZNF)相关，锌指蛋白显示出多种生物学功能(Cassandri等人，2017)。用自体肿瘤细胞刺激PanTT26TIL后，对ZNF730衍生肽的识别就很明显，尽管还识别了其他四种野生型ZNF肽(表1)。可能是由于使用了用于检测肿瘤样品中的突变(最小值为5％突变负荷)的过滤器而获得了大量野生型ZNF靶标。然而，ZNF作为细胞免疫应答靶标在胰腺癌中的作用和免疫学意义因此值得进一步探索。
患者PanTT39
从该患者分离的TIL通过流式细胞术进行表征，发现仅包含CD4+T细胞(>99％)(图5)。使用PanTT39肿瘤组织的DNA进行了全外显子组测序，揭示突变型以及相应的野生型肽序列，以测定T细胞的反应性。经过突变分析，与PanTT26肿瘤中的149个突变相比，发现了1447个突变，这反映出患者PanTT39体内的突变负荷高了10倍。还鉴别了BRCA1基因产物(R600L)中的突变。这是值得注意的，因为BRCA1突变被认为是与胰腺癌中体细胞突变负荷相关的关键贡献因素(Waddell等人，2015)。在HLA-A等位基因中发现了7个点突变，在HLA-B等位基因中发现了2个点突变，并且在HLA-C等位基因中发现了8个点突变，最终在所得的蛋白质产物中导致与HLA I类抗原加工和呈递途径相关的氨基酸变化(表2)。
表2：通过对患者PanTT26和PanTT39的肿瘤组织进行全外显子组测序鉴别出的HLAI类和II类分子中的突变列表
Figure BDA0002996823820000241
Figure BDA0002996823820000251
WT＝野生型；Mut＝突变型
由于来自PanTT39的TIL仅由CD4+T细胞组成，而没有CD8+T细胞，因此分析集中在可以结合HLA II类分子的肽上。在表3中，示出了利用小于或等于1.0的预测共有排序(consensus rank)鉴别的十四个HLA II类结合靶标。值得一提的是，PanTT39肿瘤中HLA-DRB1等位基因之间的突变负荷计算为8.8％。尽管纳入了会与HLA-DRB1结合的肽，仍认为足够多的肿瘤细胞仍然能够通过HLA-DRB1呈递抗原的可能性大于90％。然后，如对于PanTT26TIL所述，在三天的96孔共培养试验中针对肽的识别对该患者的TIL进行筛选。
表3：用于来自患者PanTT39的TIL的刺激试验的预测HLA II类结合肽列表
Figure BDA0002996823820000252
表4显示，与PanTT26 TIL相比，PanTT39 TIL响应于突变肽而产生较低的IFN-γ/105TIL。人们认为PanTT39 TIL中的CD4+T细胞可能包含不同T细胞子集例如Th1、Th2和Th17的混合物。
表4：来自患者PanTT39的‘年轻’TIL针对突变型和相应的野生型靶标产生的抗原特异性IFN-γ。注释：WT＝野生型；Mut＝突变体。
Figure BDA0002996823820000261
为了更好地定义TIL PanTT39的反应性，如上所述，通过培养TIL获得了T细胞产品。流式细胞术分析显示T细胞产品呈TCR Vβ9+阳性(见图2A)。为了测试T细胞产品是否能够识别早先在筛选试验中测试的任何突变肽，将细胞与同一组(panel)HLA II类结合肽共孵育三天，之后通过ELISA检测上清液中的IFN-γ的产量。T细胞产品强烈识别单个突变的肽，即GLLRYWRTERLF(野生型序列：GLLRDWRTERLF)，其来源于由K7N7A8基因编码的具有449个氨基酸的未表征的蛋白质产物。T细胞产品产生了针对自体肿瘤细胞系的细胞毒性反应，在标准的CD107a诱导试验中对该反应进行了评估，其结果如图2A所示。此外，与用自体肿瘤细胞3×刺激之前的TIL产生的极少的6pg IFN-γ/105TIL相比，T细胞产品还响应于GLLRYWRTERLF产生了480mg/ml的IFN-γ。T细胞产品针对突变肽GLLRYWRTERLF的反应性可以被L243抗体(抗HLA II类，DR)以剂量依赖的方式阻断(见图2B)。在存在W6/32抗体(抗HLA-I)的情况下，观察到T细胞产品的肽反应性无差异，进一步证实GLLRYWRTERLF包含名义的(nominal)HLA II类新表位。使用肽滴定法观察到，即使在低的肽浓度下，GLLRYWRTERLF突变肽也能诱导来自患者PanTT39的T细胞产品的稳固的IFN-γ产生，表明存在高亲和力的TCR(见图2C)。野生型肽也能够以5μg肽/孔的高浓度激活T细胞。
患者PanTT77
图3A显示PanTT77 TIL包含约84％的CD4+T细胞和14％的CD8+T细胞。评估了该患者的PBMC和TIL对一组突变型和野生型肽序列的免疫反应性。在图3B中，在PBMC(5个突变的肽)和TIL(9个突变的肽)中观察到了以IFN-γ产生为特征的独特的肽的识别谱，表明在没有进行体外重复刺激的情况下，来自患者PanTT77的PBMC对个体新表位具有相当宽泛的识别。图6显示了一组仅被TIL识别的突变肽，例如蛋白磷酸酶1调节亚基15B(PPP1R15B)，其为一种可响应于应激将真核翻译起始因子2A(参与将RNA翻译为蛋白质的调节)去磷酸化的酶的一部分，并在乳腺癌中具有促癌特性(Shahmoradgoli等人，2013)；激酶锚定样蛋白(neurobeachin-like protein)1(NBEAL1)，其在脑、睾丸和肾脏中表达而在神经胶质瘤中过表达(Chen等，2004)；Ankyrin Repeat And Sterile Alpha Motif Domain Containing1B(ANKS1B)，其在正常脑组织中表达，并且是发育所必需的，但也与阿尔茨海默氏病的发病机制有关，并在与吸烟有关的肾透明细胞癌中下调(Eckel-Passow等人，2014年；Ghersi等人，2004年)；与纤毛发生相关的TTC17相互作用蛋白(CATIP/C2orf62)，一种通过诱导肌动蛋白聚合而参与纤毛发生的蛋白(Bontems等，2014)；电压门控钙通道亚基α1S(CalciumVoltage-Gated Channel Subunit Alpha1，CACNA1S)，其是电压门控钙通道的亚基，在肌肉细胞中的ryanodine受体的相互作用以实现兴奋收缩耦联方面起着重要的作用(Wu等，2015)。
如图3B和图6所示，某些突变肽被TIL和PBMC识别(六个突变肽)，并且在PBMC中触发了与TIL(最高为141pg IFN-γ/105TIL)相比更强的IFN-γ产生(最高为IFN-γ350pg/105PBMC)。源自富含脯氨酸的跨膜蛋白1(PRRT1，也称为SynDIG4)的单个突变的肽，诱导了PBMC和TIL的强烈的IFN-γ。PRRT1是α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(AMPAR)复合物的一部分，该复合物参与中枢神经系统中的谷氨酸转运，并对突触传递非常重要(Kirk等，2016；von Engelhardt等，2010)。在该患者肿瘤中未发现HLA I类和II类通路中的突变。
表5示出了PBMC T细胞的IFN-γ的产生，该PBMC T细胞与在初始刺激步骤中在TILT细胞而非PBMC中触发了应答的新表位共培养并经其刺激。在存在或不存在OKT3的情况下，将PBMC T细胞与所述肽中的一种共培养一或两次，然后通过使用相应的肽进行刺激来测试IFN-γ的产生。从表5中可以看出，所有六个新表位在第一次共培养后已经被PBMC T细胞识别。有趣的是，在不存在OKT3的情况下，第二个共培养步骤导致不识别WT表位，而用突变的表位刺激后的IFN-γ的产量增大。当在存在OKT3的情况下进行共培养时，所述应答进一步增强。
表5：在不存在OKT3的情况下与刺激肽的第一次共培养之后的以及在存在和不存在OKT3的情况下与刺激肽的第二次共培养之后的PanTT77 PBMC针对个体突变靶标(和相应的野生型序列)的IFN-γ的产生。注释：WT＝野生型；Mut＝突变体
Figure BDA0002996823820000281
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<213> 智人
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Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Ser Gly Gly Tyr Gly Gly Gly Ser
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<213> 智人
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Asp Val Gly Pro Asp Gly Arg Phe Leu Arg Gly Tyr Gln Gln Asp Ala
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<213> 智人
<400> 371
Pro Leu Ser Gln Glu Ser Glu Val Glu Glu Pro Leu Ser Gln Glu
1 5 10 15
<210> 372
<211> 15
<212> PRT
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<400> 372
Pro Leu Ser Gln Glu Ser Glu Met Glu Glu Pro Leu Ser Gln Glu
1 5 10 15
<210> 373
<211> 15
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Gly Phe Gln Thr Leu Thr Pro Glu Ser Ser Cys Leu Arg Glu Asp
1 5 10 15
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Gly Phe Gln Thr Leu Thr Pro Asp Ser Ser Cys Leu Arg Glu Asp
1 5 10 15
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Glu Pro Phe Thr Thr Leu His Ile Gln Leu Gln Ser Gly Arg Phe
1 5 10 15
<210> 376
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Glu Pro Phe Thr Thr Leu His Thr Gln Leu Gln Ser Gly Arg Phe
1 5 10 15
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Asp Asp Leu Ser Arg Gln Asp Asp Asn Asp Pro Pro Lys Glu Tyr
1 5 10 15
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Asp Asp Leu Ser Arg Gln Asp Gly Asn Asp Pro Pro Lys Glu Tyr
1 5 10 15
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Phe Ile Val Glu Gln Thr Val His Ala Glu Glu Gly Ile Pro Met
1 5 10 15
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Ile Val Glu Gln Thr Val Gln Ala Glu Glu Gly Ile Pro Met
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Leu Ala Val Tyr Leu Pro Met Pro Glu Asp Asp Asn Asn Ser Leu
1 5 10 15
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<211> 15
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Leu Ala Val Tyr Leu Pro Met Ser Glu Asp Asp Asn Asn Ser Leu
1 5 10 15

Claims (15)

1.一种制备包含肿瘤超反应性免疫细胞(TURICS)的T细胞产品的方法，其包括以下步骤：
a)提供含有患者T细胞的机体样品；
b)可选地从所述机体样品中分离所述T细胞；
c)在体外在存在有包括细胞因子白介素2(IL-2)、白介素15(IL-15)和白介素21(IL-21)的细胞因子混合物与刺激肽或一组刺激肽的情况下，刺激所述T细胞；
d)确定T细胞样品中的反应性因子，其中所述反应性因子指示是否存在靶向所述刺激肽或所述一组刺激肽中的至少一种肽的T细胞；
e)如果所述反应性因子为阳性，则将所述T细胞样品鉴定为肿瘤反应性T细胞样品；否则将所述T细胞样品鉴定为非反应性T细胞样品；
f)在体外在存在有包括IL-2、IL-15和IL-21的细胞因子混合物与一种自体肿瘤细胞或者所述刺激肽或所述一组刺激肽的情况下，培养所述非反应性样品以形成T-细胞产品；
g)可选地在体外在存在有包括IL-2、IL-15和IL-21的细胞因子混合物与所述刺激肽或所述一组刺激肽的情况下，刺激所述T细胞产品；
h)测定所述T细胞产品中的反应性因子；以及
i)如果所述反应性因子为阳性，则选择所述T细胞产品作为所述包含TURICS的T细胞产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述一组刺激肽由至多20种不同的刺激肽组成，优选由至多10种不同的刺激肽组成，更优选由至多五种不同的刺激肽组成。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述刺激肽是突变的或非突变的肿瘤特异性肽，其中，所述突变的肿瘤特异性肽包含这样的氨基酸序列，其具有在患者的肿瘤细胞而非在患者健康组织的细胞中发现的突变。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述突变位于所述肽的中部。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述刺激肽的长度在5至31个氨基酸、优选7至25个氨基酸、更优选9至21个氨基酸的范围内。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述T细胞和/或所述T细胞产品的刺激是针对102至108个细胞、优选103至106个细胞、更优选104至105个细胞进行的。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，将所述T细胞和/或所述T细胞产品刺激1小时至10天，优选3小时至5天，更优选1天至3天。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述非反应性T细胞样品被培养1至10天，优选3至9天，更优选6至8天。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤c)和步骤g)中，所述刺激肽或所述一组刺激肽中的每种肽以1pg/105个细胞至1mg/105个细胞的浓度、优选以1ng/105个细胞至100μg/105个细胞的浓度、更优选以1μg/105个细胞至10μg/105个细胞的浓度存在。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述非反应性T细胞样品与所述自体肿瘤细胞以1000:1至1:1000的比例、优选以10:1至1:10的比例、更优选以7:1至3:1的比例进行培养。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述反应性因子选自T细胞增殖，细胞因子产生，细胞毒性，例如杀伤病体样品中的细胞，脱粒，特别是通过CD107a阳性定义的，成熟和/或分化，特别是通过CD45RA与CCR7的组合定义的，T细胞活化标志物特别是选自MHCII类分子中的CD25、CD56、CD69的表达；耗尽和/或活化选自Foxp3、LAG-3、TIM-3、4-1BB、PD-1、CD127(IL-7R)、IL-21受体的标志物，或T细胞信号传导，特别是选自ζ链磷酸化的，优选地，所述反应性因子为IFNγ的浓度，并且如果IFNγ的浓度高于预定的IFNγ阈值，则所述反应性因子为阳性。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，
·利用比较肽或一组比较肽作为刺激肽或一组刺激肽来额外进行步骤c)和步骤d)，其中，当突变的肿瘤特异性肽被用作刺激肽时，所述比较肽包含与所述突变的肿瘤特异性肽序列对应的非突变序列，和/或
·使用比较肽或一组比较肽作为刺激肽或一组刺激肽来额外进行步骤g)和步骤h)，其中，当突变的肿瘤特异性肽被用作刺激肽时，所述比较肽包含与所述突变的肿瘤特异性肽序列对应的非突变序列，并且其中，在用所述比较肽或所述一组比较肽刺激所述T细胞产品时的反应性因子等于或高于用所述突变的肿瘤特异性肽或一组肿瘤特异性肽刺激所述T细胞产品时的反应性因子的情况下，取消选择所述T细胞产品。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述机体样品不是肿瘤样品，优选地，所述肿瘤样品选自：全血，血清，血浆，尿液，泪液，精液，唾液，滑液，脐带，胎盘组织，骨髓，呼气，灌洗物例如支气管肺泡灌洗液，脑脊液(CSF)，原发性、继发性淋巴组织，肠腔样品，腹膜腔样品，移植物，移植细胞，移植组织或器官。
14.根据权利要求12所述的方法，其中，每种比较肽以与相对应的肿瘤特异性肽相似的浓度施用。
15.一种用于癌症患者治疗的包含至少一种具有TURIC的T细胞产品的组合物，所述治疗包括：执行根据权利要求1至14中任一项所述的方法以获得具有TURIC的T细胞产品，并且向所述患者施用所述具有TURIC的T细胞产品。
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