CN112725471A

CN112725471A - 野化培训大熊猫免疫适应的分子标记评估方法

Info

Publication number: CN112725471A
Application number: CN202110272777.3A
Authority: CN
Inventors: 黄炎; 杨苗; 凌珊珊; 沈海波; 吴虹林; 何鸣; 张修月
Original assignee: China Conservation And Research Center For Giant Panda
Current assignee: China Conservation And Research Center For Giant Panda
Priority date: 2021-03-12
Filing date: 2021-03-12
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2041-03-12
Also published as: CN112725471B

Abstract

本发明提供了一种野化培训大熊猫免疫适应的分子标记评估方法，利用适应良好的野化培训大熊猫和圈养大熊猫之间显著差异表达的先天性免疫和适应性免疫基因作为Marker，通过实时荧光定量PCR，对待测样品中的Marker进行定量检测。从分子生物学层面上评估野化培训大熊猫培训期间的免疫适应情况。

Description

野化培训大熊猫免疫适应的分子标记评估方法

技术领域

本发明涉及大熊猫野化培训免疫适应评估方法，具体涉及野化培训大熊猫免疫适应的分子标记评估方法。

背景技术

大熊猫（Ailuropoda melanoleuca）是中国珍稀保护动物，同时也是世界生物多样性保护的旗舰物种。随着圈养大熊猫放归野外的时机逐步成熟，野化培训与放归工作被提上日程。根据以往经验，圈养的大型兽类个体直接放归野外的存活率低。在放归前对放归动物进行必要的野化培训，恢复其对野生环境的适应能力。中国大熊猫保护研究中心从2003年起正式开始了圈养大熊猫的野化培训与放归项目。在野外建立可监测的野化培训圈，希望能够培训出具有适应野外环境的圈养大熊猫个体，进行野外放归以复壮野生大熊猫小种群或者在大熊猫的历史分布区进行重引入。

野化培训的目的是增加大熊猫对野外环境的适应能力，包括免疫适应或增强对疾病的抵抗能力。但由于缺乏培训大熊猫免疫特性的基本信息，缺乏监测手段和评估方法，无法对培训大熊猫免疫健康进行评价和动态监测。虽然野化培训大熊猫也有定期的健康体检，但常规的体检，不但指标少，而且反应的结果也相对滞后，不能及时准确全面地反应个体的免疫状态，因此不能准确评估野化培训大熊猫免疫状态及其动态变化。

发明内容：

本发明为了评估野化培训大熊猫的免疫适应状态，提供了一种野化培训大熊猫免疫适应的分子标记评估方法，从分子生物学层面上评估野化培训大熊猫培训期间的免疫适应情况。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种野化培训大熊猫免疫适应的分子标记评估方法，利用适应良好的野化培训大熊猫和圈养大熊猫之间显著差异表达的先天性免疫和适应性免疫基因作为Marker，通过实时荧光定量PCR，对待测样品中的Marker进行定量检测。

本发明所述PCR扩增用到的专用引物：

Marker1：正向引物 5’-GTGCAAGGGGACAGACGAAC-3’

反向引物 5’-CTTGAGTGTTTGCAGCCTTGGA-3’；

Marker2：正向引物 5’-GATAGACCCACGACTGCACC-3’

反向引物 5’-GGTCTCGCCTCTTTCACAGG-3’；

Marker3：正向引物 5’-CTGGCTGTTGCTCTCTTGGC-3’

反向引物 5’-ATGGTTTCTGTTTCTCAGCCCTCTT-3’；

Marker4：正向引物 5’-GAAGGTAAAAGTCGGGCCTGG-3’

反向引物 5’-GGCAGTTTTCTGCAGCTACTGTATG-3’

Marker5：正向引物 5’-CTACGACACGTCCACCGACA-3’

反向引物 5’-CCAAAGCCGCTGTTCTGGATG-3’；

Marker6：正向引物 5’-CGAGTCACCTACCAGGGCTA-3’

反向引物 5’-TCCGTGAACTCTGACTCCGT-3’。

本发明所述实时荧光定量PCR扩增的内参基因的引物为：

正向引物 5’-GGTATGACAACGAATTTGGCTACA-3’

反向引物 5’-GATGGAAACAGTGGAGGTCAGGA-3’。

本发明野化培训大熊猫免疫适应的分子标记评估方法，包括以下步骤：

A、取待测野化培训大熊猫的血液组织样本与圈养大熊猫组的血液组织样本，分离出外周血单核细胞；

B、提取总RNA,再将提取的RNA反转录为cDNA；

C、然后向cDNA中添加qPCR Mix、专用引物、去离子水配置成qPCR反应体系，qPCR反应使用使用荧光PCR操作平台；

D、使用2^−∆∆Ct方法计算每个Marker基因的表达水平；

E、基于T检验获得圈养大熊猫组每个Marker基因的2^−∆∆Ct置信区间；

F、将待测野化培训大熊猫样本的每个Marker基因的2^−∆∆Ct值，与圈养大熊猫组对应的置信区间进行比较，若所有Marker基因的2^−∆∆Ct值大于置信区间的上限值，则认为免疫适应良好。

优选地，所述样本基因的2^−∆∆Ct的计算方法为：

D1、每个样本按步骤B和C进行三次，取平均值，待测Marker基因平均值—内参基因的平均值获得待测Marker基因表达量ΔCt；

D2、计算每个样品中待测Marker基因的2^−∆Ct值；

D3、计算圈养大熊猫组的2^−∆Ct的均值，用样本2^−∆Ct值/圈养组2^−∆Ct均值，得到每个样本待测Marker基因的2^−∆∆Ct值。

本发明的有益效果在于：

1、本发明的鉴定方法是依据筛选的Marker基因序列，设计最优引物，通过实时荧光定量PCR（qPCR）有效分析Marker基因在每个待测样本中的表达量，评估野化培训大熊猫的免疫适应状态。

2、本发明采用DNA序列作为分子标记，可以准确快速评估野化培训大熊猫的Marker基因表达量。qPCR与转录组分析结果趋势一致，其结果更加可靠，重复性强，实验快捷，操作简便，无需测序，丰富了大熊猫常规体检指标。

附图说明

图1是基于转录组的野化培训大熊猫和圈养大熊猫6个免疫基因表达量比较。

图2是6个免疫基因和内参基因引物优化电泳图。

具体实施方法

为了更加清楚、详细地说明本发明的技术方案，下面通过相关实施例对本发明进行进一步描述。以下实施例仅为具体说明本发明的实施方法，并不限定本发明的保护范围。

本发明开展了野化培训大熊猫血液免疫通路及相关免疫功能基因表达特征及其动态变化研究，通过与圈养大熊猫血液转录组进行比较分析，对免疫相关基因表达特征进行比较，了解不同环境条件下大熊猫的免疫应答特性，筛选出适应良好的培训大熊猫先天性免疫和适应性免疫中一些关键基因作为免疫适应的分子Markers，为野化培训大熊猫免疫状态的监测和评价提供技术方法，丰富和完善野化培训大熊猫免疫适应的监测内容。

本发明通过前期转录组学数据分析发现，野化培训大熊猫相比圈养大熊猫具有增强的先天性免疫和细胞免疫，先天免疫和细胞免疫显著高表达（见图1），我们挑选4个关键的先天性免疫基因CXCL8(Marker2)、IL1R2(Marker4)、 ISG20(Marker5)、NFKBIA(Marker6)和2个关键的细胞免疫基因 CD3D（Marker1）和CD8A(Marker 3)作为监测Marker基因进一步优化。使用引物设计软件Primer5.0设计引物，通过不同退火温度条件下做PCR，优化获得稳定扩增的引物，筛选出6个免疫监测Marker基因和其最优引物，同时提供了一个内参基因引物（内参基因为GAPDH，见图2），作为野化培训大熊猫免疫监测的分子标记。通过实时荧光定量PCR，鉴定野化培训大熊猫的免疫适应。

实施例1

实施例2

本实施例在实施例1的基础上：

PCR扩增用到的专用引物：

Marker1：正向引物 5’-GTGCAAGGGGACAGACGAAC-3’

反向引物 5’-CTTGAGTGTTTGCAGCCTTGGA-3’；

Marker2：正向引物 5’-GATAGACCCACGACTGCACC-3’

反向引物 5’-GGTCTCGCCTCTTTCACAGG-3’；

Marker3：正向引物 5’-CTGGCTGTTGCTCTCTTGGC-3’

反向引物 5’-ATGGTTTCTGTTTCTCAGCCCTCTT-3’；

Marker4：正向引物 5’-GAAGGTAAAAGTCGGGCCTGG-3’

反向引物 5’-GGCAGTTTTCTGCAGCTACTGTATG-3’

Marker5：正向引物 5’-CTACGACACGTCCACCGACA-3’

反向引物 5’-CCAAAGCCGCTGTTCTGGATG-3’；

Marker6：正向引物 5’-CGAGTCACCTACCAGGGCTA-3’

反向引物 5’-TCCGTGAACTCTGACTCCGT-3’。

实施例3

本实施例在实施例1的基础上：

实时荧光定量PCR扩增的内参基因的引物为：

正向引物 5’-GGTATGACAACGAATTTGGCTACA-3’

反向引物 5’-GATGGAAACAGTGGAGGTCAGGA-3’。

实施例4

B、提取总RNA,再将提取的RNA反转录为cDNA;

D、使用2^−∆∆Ct方法计算每个Marker基因的表达水平；

实施例5

本实施例在实施例4的基础上：

所述样本基因的2^−∆∆Ct的计算方法为：

D1、每个样本按步骤B和C进行三次，取平均值，待测Marker基因平均值-内参基因的平均值获得待测Marker基因表达量ΔCt；

D2、计算每个样品中待测Marker基因的2^−∆Ct值；

D3、计算圈养大熊猫组的2^−∆Ct的均值，用样本2^−∆Ct值/圈养组2^−∆Ct均值，得到每个样本待测Marker基因的2^−∆∆Ct值；

实施例6

一种野化培训大熊猫免疫适应的分子标记评估方法，具体包括以下步骤：

A、样本的收集与处理。取待测野化培训大熊猫的血液组织样本与圈养大熊猫组血液组组织样本，其中的圈养大熊猫组10只大熊猫，分离出外周血单核细胞（PBMC）。

具体步骤如下：新鲜的血液样本储存于Paxgene RNA血液试管（Qiagen Inc.,Valencia, CA）中，将三倍红细胞裂解缓冲液（TIANGEN, Beijing, China）添加到一体积的血液样本中，并在室温下混合约10分钟，直到红细胞完全裂解。8000rpm离心6分钟，倒掉上清液，从外周血中分离出外周血单核细胞（PBMC）；

B、总RNA的提取。按照RNA提取试剂盒制造商的规程，从PBMC中提取总RNA，具体步骤如下：

1)向沉淀物中加入600μl的裂解液RLT后电动彻底匀浆20-40秒；

2）将匀浆后裂解物13,000rpm离心3分钟，沉淀可能存在的裂解困难的碎片或者不溶物，将裂解物上清小心转到一个新离心管；

3）精确估计裂解物(上清)体积,加入等体积的70%乙醇,此时可能出现沉淀,但是不影响提取过程,立即吹打混匀,不要离心；

4）立刻将混合物(每次小于700μl,多可以分两次加入)加入到一个吸附柱RA中，13,000rpm离心60秒，弃掉废液；

5）加700μl去蛋白液RW1，室温放置30秒，12,000rpm离心30秒，弃掉废液。如果DNA残留明显,可在加入RW1后室温放置5分钟再离心；

6）加入500μl漂洗液RW，12,000rpm离心30秒，弃掉废液，再加入500μl漂洗液RW,重复一遍；

7）将吸附柱RA重新放回收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；

8）取出吸附柱RA，放入一个RNase free干净离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μl RNase-Free H₂O，室温放置1分钟，12,000rpm离心1分钟；

9）如果预期RNA产量>30μg,使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤7一遍；

C、RNA逆转录。提取的RNA使用反转录试剂盒反转录为cDNA，具体步骤如下：

1）根据以下表格在冰上配制反应体系，总体积为10μl。将反应液轻轻搅拌均匀，短暂离心使管壁上的溶液收集到管底，42℃温育2分钟，然后置于冰上冷却；

2）接着在冰上加入下列成分（可根据需要，扩大反应体系），进行反转录反应。轻轻混匀，短暂离心；37℃孵育，15min；85℃加热5秒钟使酶失活；反转录后得到的cDNA置于-20℃保存。

方法。

1）向cDNA中添加设计好的Marker基因和内参基因专用引物配置成qPCR反应体系，具体包括：5ul 2xTaq SYBRGreen qPCR Mix，1ul cDNA，正反引物各1ul，再加去离子水至10ul，其中，Marker基因分别为：先天性免疫基因（CXCL8、IL1R2、ISG20、NFKBIA）和适应性免疫基因（CD3D、CD8A），内参基因为：GAPDH;

2）qPCR反应使用Bio-Rad CFX ConnetTM Real-Time System平台，程序设定为95℃运行30s，再执行95℃运行10 s，60℃运行15 s，40个循环，最后执行72℃运行10 s；

3）使用2^−∆∆Ct方法计算每个Marker基因的表达水平，具体如下：

3.1）所有样品均进行三次技术重复取平均值计算，待测Marker基因相对于内参基因的表达量ΔCt；

3.2）计算每个样品中待测Marker基因的2^−∆Ct值；

3.3）计算圈养大熊猫组的2^−∆Ct的均值，用样本2^−∆Ct值/圈养组2^−∆Ct均值，得到每个样本待测Marker基因的2^−∆∆Ct值；

3.4）基于T检验获得圈养大熊猫组10只大熊猫的每个Marker基因2^−∆∆Ct的置信区间；得出：CXCL8：2^−∆Ct均值0.0059，2^−∆∆Ct置信区间0.2493-1.7507；NFKBIA：2^−∆Ct均值0.0157，2^−∆∆Ct置信区间0.8370-1.1630；ISG20：2^−∆Ct均值0.0002，2^−∆∆Ct置信区间0-2.2520；IL1R2：2^−∆Ct均值0.0002，2^−∆∆Ct置信区间0-2.0522；CD8A：2^−∆Ct均值0.0003，2^−∆∆Ct置信区间0.3715-1.6285；CD3D：2^−∆Ct均值0.0450，2^−∆∆Ct置信区间0.3928-1.6072；

3.5）将待测野化培训大熊猫样本的每个Marker基因的2^−∆∆Ct值，与圈养大熊猫组对应的置信区间进行比较，若所有Marker基因的2^−∆∆Ct值均大于置信区间的上限值，则认为免疫适应良好。

以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国大熊猫保护研究中心

<120> 野化培训大熊猫免疫适应的分子标记评估方法

<130> 2021

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 细胞免疫基因 CD3D正向引物(CD3D)

<400> 1

gtgcaagggg acagacgaac 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 细胞免疫基因 CD3D反向引物(CD3D)

<400> 2

cttgagtgtt tgcagccttg ga 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 先天性免疫基因CXCL8正向引物(CXCL8)

<400> 3

gatagaccca cgactgcacc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 先天性免疫基因CXCL8反向引物(CXCL8)

<400> 4

ggtctcgcct ctttcacagg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 细胞免疫基因CD8A正向引物(CD8A)

<400> 5

ctggctgttg ctctcttggc 20

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 细胞免疫基因CD8A反向引物(CD8A)

<400> 6

atggtttctg tttctcagcc ctctt 25

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 先天性免疫基因IL1R2正向引物(IL1R2)

<400> 7

gaaggtaaaa gtcgggcctg g 21

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 先天性免疫基因IL1R2反向引物(IL1R2)

<400> 8

ggcagttttc tgcagctact gtatg 25

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 先天性免疫基因ISG20正向引物(ISG20)

<400> 9

ctacgacacg tccaccgaca 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 先天性免疫基因ISG20反向引物(ISG20)

<400> 10

ccaaagccgc tgttctggat g 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 先天性免疫基因NFKBIA正向引物(NFKBIA)

<400> 11

cgagtcacct accagggcta 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 先天性免疫基因NFKBIA反向引物(NFKBIA)

<400> 12

tccgtgaact ctgactccgt 20

Claims

1.一种野化培训大熊猫免疫适应的分子标记评估方法，其特征在于，利用适应良好的野化培训大熊猫和圈养大熊猫之间显著差异表达的先天性免疫和适应性免疫基因作为Marker，通过实时荧光定量PCR，对待测样品中的Marker进行定量检测。

2.根据权利要求1所述野化培训大熊猫免疫适应的分子标记评估方法，其特征在于，PCR扩增用到的专用引物：

Marker1：正向引物 5’-GTGCAAGGGGACAGACGAAC-3’

反向引物 5’-CTTGAGTGTTTGCAGCCTTGGA-3’；

Marker2：正向引物 5’-GATAGACCCACGACTGCACC-3’

反向引物 5’-GGTCTCGCCTCTTTCACAGG-3’；

Marker3：正向引物 5’-CTGGCTGTTGCTCTCTTGGC-3’

反向引物 5’-ATGGTTTCTGTTTCTCAGCCCTCTT-3’；

Marker4：正向引物 5’-GAAGGTAAAAGTCGGGCCTGG-3’

反向引物 5’-GGCAGTTTTCTGCAGCTACTGTATG-3’

Marker5：正向引物 5’-CTACGACACGTCCACCGACA-3’

反向引物 5’-CCAAAGCCGCTGTTCTGGATG-3’；

Marker6：正向引物 5’-CGAGTCACCTACCAGGGCTA-3’

反向引物 5’-TCCGTGAACTCTGACTCCGT-3’。

3.根据权利要求1所述野化培训大熊猫免疫适应的分子标记评估方法，其特征在于，实时荧光定量PCR扩增的内参基因的引物为：

正向引物 5’-GGTATGACAACGAATTTGGCTACA-3’

反向引物 5’-GATGGAAACAGTGGAGGTCAGGA-3’。

4.根据权利要求1所述野化培训大熊猫免疫适应的分子标记评估方法，其特征在于，包括以下步骤：

B、提取总RNA,再将提取的RNA反转录为cDNA;

C、然后向cDNA中添加qPCR Mix、专用引物、去离子水配置成qPCR反应体系，qPCR反应使用荧光PCR操作平台；

D、使用2^−∆∆Ct方法计算每个Marker基因的表达水平；

5.根据权利要求4所述野化培训大熊猫免疫适应的分子标记评估方法，其特征在于，所述样本基因的2^−∆∆Ct的计算方法为：

D2、计算每个样品中待测Marker基因的2^−∆Ct值；