CN112684076A - 一种白芍提取物及其指纹图谱的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明具体涉及一种白芍提取物及其指纹图谱的构建方法。传统颈痛颗粒中白芍与其他药材混合加水提取，通过水提醇沉的方式制备得到清膏。发明人认为上述提取工艺中芍药总苷的提取率受温度、粉碎程度等多种因素的影响具有较大波动性。本发明提供了一种白芍提取物，首先通过酶解使药材中的有效成分充分释放，再通过碱性醇溶液对芍药总苷进行提取。根据检测结果，本发明方法制备的白芍提取物包含芍药中的关键活性成分，并且提高了在水中的溶解度，进一步的，本发明还提供的所述白芍提取物的指纹图谱构建方法，为上述白芍提取物的应用提供了稳定可靠的质量控制方法。

Description

一种白芍提取物及其指纹图谱的构建方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种白芍提取物及所述白芍提取物的指纹图谱构建方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

白芍是毛茛科白芍属植物，是毛莨科植物芍药的干燥根，其性味苦、酸，归肝、脾经，具有平肝止痛、养血调经、敛阴止汗的功效。常用于头痛眩晕、腹痛、四肢挛痛、血虚萎黄、月经不调、自汗、盗汗等病症的治疗。白芍总苷是从传统中药白芍干燥根提取的有效部位，具有抗炎、免疫调节、保肝等作用，目前剂型主要有片剂、胶囊等，常用于慢性肝炎、风湿性关节炎等的治疗。发明人以往的研究中，提供一种用于治疗颈椎病的药物制剂，包括三七、川芎、延胡索、白芍、威灵仙、葛根及羌活。经研究证实，白芍总苷的提取效果对于上述药物制剂总体效果具有重要的影响。根据专利CN03112032.6的记载，上述制备方法中，白芍与其他药材采用水提醇沉的方式提取清膏。发明人发现，工业化生产过程中，白芍作为一种根部药材，具有质地较硬的韧皮部，与其他药材混合提取其提取效率波动较大。发明人认为，首先对白芍进行提取制备一种白芍提取物，获取其中的白芍总苷成分可直接作为临床药物加以应用，还可以直接将其应用于白芍相关的多种药物制品，并且有利于提高药物中有效成分的质量控制。

现有技术中针对白芍制剂的质量控制研究方法较多，发明专利《一种白芍配方颗粒及其制备方法和质量控制方法》(专利公布号CN101474263B)公开了一种白芍配方颗粒的制备和质控的方法，其用傅里叶变换红外光谱仪、DTGS检测器，进行红外指纹图谱测定。

发明专利《一种白芍制剂的质量检测方法》(CN102138985B)公开了一种白芍制剂的质量检测方法，其用乙腈-0.1％磷酸水溶液(12:88)为流动相，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱，进行芍药苷和芍药内酯苷的含量测定；该专利中的指纹图谱确定6个特征峰，但未对特征峰的成分进行指认。

发明专利《一种建立白芍的药物制剂的指纹图谱的方法》(CN105866296A)公开了一种白芍药物制剂的指纹图谱方法，选用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，乙腈-0.1％磷酸为流动相(梯度洗脱)，建立白芍药物制剂的指纹图谱。确定共有特征峰4个，并对其中三种成分进行指认：分别为羟基芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷。该发明指纹图谱中特征峰较少，且峰形不好，个别峰拖尾。

发明专利《白芍的指纹图谱检测方法》(CN109490437A)公开了一种白芍指纹图谱的检测方法，其选用Merck C18色谱柱，乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相(梯度洗脱)，建立白芍的指纹图谱检测方法。选用不同批次白芍色谱图中的共有峰为特征峰，确定特征峰的个数为8个，且均可指认：1-8分别为没食子酸、没食子甲酯、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、苯甲酸、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷，但该方法色谱图中4、5、6、8号特征峰存在拖尾，峰形不好。

发明内容

针对上述研究背景，本发明目的在于提供一种白芍提取物，所述白芍提取物旨在对白芍中的白芍总苷进行保留，进一步的，本发明还提供了针对上述白芍提取物的指纹图谱建立方法，为所述白芍提取物在药物制剂中的应用提供稳定可靠的质量控制方法。

基于上述技术效果，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供一种白芍提取物，所述白芍提取物制备方法如下：向白芍药材中加入酶的水溶液保温一段时间得到水提取液；向所述水提取液中依次加入碱及醇待沉淀不再增多，过滤并保留溶液部分，加酸调节所述溶液的pH至中性，去除溶剂得到药物浸膏即为所述白芍提取物。

现有技术中针对芍药中芍药总苷的提取工艺研究较多，现有技术通常采用醇液、萃取及酶解均为本领域常用的白芍总苷提取方式。本发明设计的提取思路中，通过酶解首先使白芍药材中的活性成分充分溶出，通过加碱的方式使酶及药材中原本的蛋白变性，再继续加入醇液改变溶液粒子特性从而接近蛋白等电点，使溶液中的蛋白质及多糖类杂质充分沉淀。基于本发明思路制备的白芍提取物，能够充分的保留芍药总苷等活性成分，并且提取过程中无需采用高温加热等条件。相比传统的水提醇沉方法制备的白芍浸膏，本发明方法制备的白芍提取物去除了传统浸膏中的蛋白及纤维类成分，有效降低了药物浸膏的黏腻程度，提高了水溶性，方便后续加工。另外，水溶性的提高还意味着药物进入人体内后有望实现更高的生物利用度。进一步的，本发明为了验证所述白芍提取物中各活性成分，还提供了所述白芍提取物指纹图谱构建方法。

本发明第二方面，提供第一方面所述白芍提取物的指纹图谱构建方法，所述构建方法以芍药苷、没食子甲酯、没食子酸、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖为混合对照品。

现有技术白芍指纹图谱构建方法中，存在峰形状不佳、拖尾，针对多样品分析时，存在样品分离度不佳等技术问题。本发明针对白芍提取物提供了一种指纹图谱构建方法，能够确定7种主要的芍药总苷活性成分，并且该指纹图谱各对照样品分离效果良好，具有良好的稳定性，可作为一种质量控制方法，对于所述白芍提取物在制药用途中的应用具有重要的意义。

本发明第三方面，提供第一方面所述白芍提取物的质量控制方法，所述质量控制方法包括采用第二方面所述指纹图谱构建方法对待测样品中的芍药苷、没食子甲酯、没食子酸、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷及1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖含量进行检测。

以上一个或多个技术方案的有益效果是：

1、本发明提供的白芍提取物，制备工艺简单，无需高温高压及有毒有机试剂的加入。该制备方法制备得到的白芍提取物中植物蛋白及纤维素类杂质更少，能够充分提取白芍中的活性成分。另外，该方法制备的白芍提取物相比传统的药物浸膏具有更好的水溶性，这意味着所述白芍提取物能够具有更好的加工性能及生物利用度。

2、为了实现上述白芍提取物在制药领域的应用，本发明还提供了上述白芍提取物的指纹图谱构建方法，实现白芍提取物在制药领域的质量控制。所述该方法具有重复性好、特征性明显等特点，运用指纹图谱技术和中药相似度评价系统更利于体现白芍药材整体的专属性，有助于全面、准确、客观的评价白芍药材的特点。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例4中所述白芍提取物的指纹图谱。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，为了获取一种白芍总苷的白芍提取物，本发明提出了一种白芍提取物及所述白芍提取物的指纹图谱构建方法。

本发明第一方面，提供一种白芍提取物，所述白芍提取物制备方法如下：向白芍药材中加入酶的水溶液保温一段时间得到水提取液；向所述水提取液中依次加入碱及醇待沉淀不再增多，过滤并保留溶液部分，加酸调节所述溶液的pH至中性，去除溶剂得到药物浸膏即为所述白芍提取物。

优选的，所述白芍药材粉碎至30～50目。

优选的，所述水溶液为白芍药材体积的2～4倍。

优选的，所述酶为包括但不限于纤维素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶中的一种或几种的混合。

优选的，所述酶的添加量为底物重量的0.5～2.5％。

优选的，所述酶活力为30～40u/mg。

本发明效果较好的实施方式中，所述酶为纤维素酶或纤维素酶及果胶酶的复合酶，采用上述酶进行酶解时，所述水提液的pH为酸性，可以有效提高酶解的效率，另外，本发明研究还发现，在35～50℃下保温1～2h也能够有效的提高酶解效率。

优选的，向水提液中加入碱液至所述水溶液的pH为9～10。

优选的，所述向水提液中加醇，所述醇优选为甲醇或乙醇；更为优选的方案中，所述

上述技术方案中，一些效果较好的实施方式中，所述碱液为NaOH，所述酸液为盐酸。

本发明第二方面，提供第一方面所述白芍提取物的指纹图谱构建方法，所述构建方法以芍药苷、没食子甲酯、没食子酸、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖为混合对照品。

优选的，所述指纹图谱构建方法包括以下步骤：(1)配制供试品及对照品溶液，所述供试品为第一方面所述白芍提取物；(2)测定所述供试品及对照品，所述测定过程包括以下步骤：采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈-三氟乙酸为流动相，通过梯度洗脱进行分离。

进一步的，所述步骤(1)中，供试品及对照品采用醇溶液配制。

具体的实施方式中，所述白芍提取物及对照品采用70％甲醇溶液进行配制。

优选的，所述流动相参数如下：流动相A为乙腈，流动相B为0.04～0.06％三氟乙酸。

优选的，所述梯度洗脱程序如下：0～10min，9％A→11％A；10～28min，11％A→23％A；28～43min，23％A→50％A；44～55min，90％A→90％，55～56min，90％A→9％A；56～66min，9％A→9％。

优选的，所述检测波长为260nm～280nm。

优选的，所述流速为0.8～1.2ml/min。

本发明第三方面，提供第一方面所述白芍提取物的质量控制方法，所述质量控制方法包括采用第二方面所述指纹图谱构建方法对待测样品中的芍药苷、没食子甲酯、没食子酸、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖含量进行检测。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

本实施例中，提供一种白芍提取物的制备方法，将所述白芍药材粉碎至60目，加入2倍体积的水中，加入纤维素酶及果胶酶30u/mg，pH为6.5；水浴加热上述反应体系至温度为40℃，加热1h，过滤获取水提取液。

在磁力搅拌条件下向上述水提取液中缓慢加入1M NaOH至pH达到9.0，继续加乙醇至醇浓度达到70％，所述转速为100转/min。当乙醇全部加入后，将所述溶液体系至于4℃静置保存24h至底部絮状物不再增多，过滤所述溶液体系获得上清液部分加入盐酸至pH为中性，再次过滤保留上清液进行减压浓缩得到浸膏，将所述浸膏置于干燥箱中完全烘干，即为所述白芍提取物。

实施例2

本实施例中，提供又一种白芍提取物的制备方法，所述制备方法步骤如下：将所述白芍药材粉碎至30目，加入3倍体积的水中，加入纤维素酶至35u/mg，pH为6.0；水浴加热上述反应体系至温度为50℃，加热0.5h，过滤获取水提取液。

在磁力搅拌条件下向上述水提取液中加入0.8M NaOH至pH达到10.0，继续加乙醇至醇浓度达到65％，所述转速为80转/min。当乙醇全部加入后，将所述溶液体系至于4℃静置保存48h至底部絮状物不再增多，过滤所述溶液体系获得上清液部分加入盐酸至pH为中性，再次过滤保留上清液进行减压浓缩得到浸膏，将所述浸膏置于干燥箱中完全烘干，即为所述白芍提取物。

实施例3

本实施例中，提供一种白芍提取物的制备方法，所述制备方法步骤如下：将所述白芍药材粉碎至50目，加入倍体积的水中，加入果胶酶至40u/mg，pH为6.0；水浴加热上述反应体系至温度为35℃，加热2h，过滤获取水提取液。

在磁力搅拌条件下向上述水提取液中加入1.2M NaOH至pH达到9.5，继续加乙醇至醇浓度达到75％，所述转速为150转/min。当乙醇全部加入后，将所述溶液体系至于4℃静置保存30h至底部絮状物不再增多，过滤所述溶液体系获得上清液部分加入盐酸至pH为中性，再次过滤保留上清液进行减压浓缩得到浸膏，将所述浸膏置于干燥箱中完全烘干，即为所述白芍提取物。

本发明中，还针对上述实施例1-3所述白芍提取物的溶解度进行了检测，对照组采用专利CN03112032.6中记载的方法获取白芍浸膏，所述制备方法如下：白芍加水煎煮两次，第一次2小时，第二次1小时，滤液与上述两水溶液合并、浓缩、醇沉，回收乙醇，浓缩后成为相对密度1.25-1.30(50℃)的清膏(对照组)。本发明针对实施例1-3及对照组中药物浸膏在水中及在有机溶剂中的溶解度进行了检测，检测结果如下表1所示：

表1白芍药物浸膏溶解率检测结果(％)

	水	有机试剂(乙醇)	芍药苷含量(％)
				对照组	12％	69％	2.1
实施例1	85％	97％	8.8
				实施例2	80％	93％	8.9
实施例3	79％	91％	7.4

从浸膏的状态来看，本发明中提供的所述白芍提取物在干燥后呈疏松的粉末状，而对照组制备方法制备得到的药物浸膏则呈现一种结合较为紧密的块状。将实施例1制备的白芍提取物加入水中后能够较快的溶解，而对照组制备的清膏由于质地较为黏腻，在水中、有机溶剂中的溶解速度均较慢。从上述溶解率也可以看出，采用本发明方法制备的白芍提取物，其在水中的溶解度相比传统的浸膏有明显的提升。

实施例4所述白芍提取物的指纹图谱构建方法

为了进一步明确所述白芍提取物中是否能够充分保留白芍中的活性部位，并且为所述白芍提取物在制药中的应用提供稳定的质量控制方法。本实施例针对上述白芍提取物的检测构建了相应的指纹图谱，本实施例中，提供了一种白芍提取物的指纹图谱构建方法。

一、实验材料

1、仪器、试药和供试样品

仪器：高效液相色谱仪：安捷伦1260，G1311C输液泵，G1329B自动进样系统，G1315D二极管阵列检测器，Waters Empower3工作站；METTLER TOLEDO XPE205电子天平KQ5200DA型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；。

试剂：甲醇(色谱纯，天津康科德医药化工有限公司)，乙腈(色谱纯，天津康科德医药化工有限公司)，三氟乙酸(分析纯，阿拉丁试剂)，纯净水(娃哈哈矿泉水)。

15个不同批次的白芍药材分别购自安徽亳州、浙江宁波、浙江磐安三个产地，按照实施例1所述方法制备白芍提取物。

(1)色谱条件

照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部0512高效液相色谱法)测定。以WatersSun Fire C18(4.6mm×250mm，5μm)为色谱柱；以乙腈-0.05三氟乙酸为流动相，按下表进行梯度洗脱，检测波长为274nm，流速1.0mL/min。

线性梯度表

时间(min)	乙腈(％)	三氟乙酸(％)
			0	9	91
10	11	89
			28	23	77
43	50	50
			44	90	10
55	90	10
			56	9	91
66	9	91

(2)对照品溶液的制备

分别称取芍药苷、没食子甲酯、没食子酸、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖对照品各8mg，精密称定；置同一25mL容量瓶中，加70％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

(3)供试品溶液制备

取白芍药材过筛细粉3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇溶液50mL，称量，超声处理(功率250W，频率53kHz)60min，再称量，用70％甲醇溶液补足减失的量，摇匀，过0.22μm微米微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

(4)高效液相色谱法测定白芍提取物的指纹图谱

将按步骤(1)和(2)方法制备得到的15个批次的白芍提取物供试品溶液和混合对照品溶液分别注入高效液相色谱仪，色谱条件为：色谱柱为Waters Sun Fire C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：A相为乙腈，B相为含0.05％体积三氟乙酸的水溶液；梯度洗脱(0～10min，9％～11％A；10至28min，11～23％A；28～43min，23％～50％A；44～55min，90％A；56～66min，9％A)；体积流量：1.0mL/min-1，柱温：35℃，进样量10μL，检测波长：230nm)测定指纹图谱；确定特征峰数量为7个，分别为没食子酸、没食子甲酯、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷。

将步骤(4)中获得的15批白芍提取物供试品溶液的指纹图谱导出，并用中药指纹图谱相似度评价系统对15批白芍提取物供试品中的共有峰进行选择，用平均值计算法生成白芍的对照指纹图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，对照指纹图谱中有20个共有指纹峰，(15批次白芍提取物供试品溶液的指纹图谱相识度均大于0.92)。

二、所述指纹图谱稳定性考察

1、系统适用性试验及阴性干扰试验

在上述色谱条件下，分别精密量取对照品溶液、供试品溶液及空白溶剂各20uL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，供试品色谱图中各待测成分与相邻峰之间的分离度大于1.5，且空白溶剂无干扰。

2、精密度试验

取同一份白芍提取物，按上述实施例4的步骤(2)方法制备白芍提取物供试品溶液，步骤(4)色谱条件重复进样6次，以芍药苷为参照峰，采用国家药典委员会“相似度评价软件(2004A)”进行评价，相似度为0.99，记录共有峰峰面积及相对保留时间，并计算相对标准偏差，各组分RSD均小于2％。结果表明，仪器精密度良好。

3、稳定性试验

按上述实施例1的步骤(2)制备供试品溶液，供试品溶液制备完成后，精密吸取10ul，注入液相色谱仪，记录色谱峰面积，以后每隔2小时测定一次，考察48小时，计算各共有峰相对保留时间、相对峰面积相对标准偏差，RSD均小于2％，相似度为0.99。结果表明，供试品中各共有组分在48小时内溶液稳定性良好。

4、重复性试验

取本品，按上述实施例1的步骤(2)制备供试品溶液，重复测定6次，计算样品中各组分的含量。结果表明各共有峰相对保留时间、相对峰面积RSD均小于2％，相似度为0.99，表明该方法重复性良好。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种白芍提取物，其特征在于，所述白芍提取物制备方法如下：向白芍药材中加入酶的水溶液保温一段时间得到水提取液；向所述水提取液中依次加入碱及醇待沉淀不再增多，过滤并保留溶液部分，加酸调节所述溶液的pH至中性，去除溶剂得到药物浸膏即为所述白芍提取物。

2.如权利要求1所述白芍提取物，其特征在于，所述白芍药材粉碎至30～50目；或，所述水溶液为白芍药材体积的2～4倍。

3.如权利要求1所述白芍提取物，其特征在于，所述酶为包括但不限于纤维素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、果胶酶中的一种或几种的混合；

或，所述酶的添加量为底物重量的0.5～2.5％；

或，所述酶活力为30～40u/mg。

4.如权利要求3所述白芍提取物，其特征在于，所述酶为纤维素酶或纤维素酶及果胶酶的复合酶；

或，所述水提液的pH为酸性；

或，加入酶的水溶液后在35～50℃下保温1～2h。

5.如权利要求1所述白芍提取物，其特征在于，向水提液中加入碱液至所述水溶液的pH为9～10；

优选的，所述向水提液中加醇，所述醇优选为甲醇或乙醇；更为优选的方案中，所述碱液为NaOH，所述酸液为盐酸。

6.权利要求1-5任一项所述白芍提取物的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述构建方法以芍药苷、没食子甲酯、没食子酸、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖为混合对照品。

7.权利要求6所述白芍提取物的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述指纹图谱构建方法包括以下步骤：(1)配制供试品及对照品溶液，所述供试品为权利要求1-5任一项所述白芍提取物；(2)测定所述供试品及对照品，所述测定过程包括以下步骤：采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈-三氟乙酸为流动相，通过梯度洗脱进行分离。

8.权利要求7所述白芍提取物的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述步骤(1)中，供试品及对照品采用醇溶液配制；进一步的，所述白芍提取物及对照品采用70％甲醇溶液进行配制。

9.权利要求7所述白芍提取物的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述流动相参数如下：流动相A为乙腈，流动相B为0.04～0.06％三氟乙酸；

或，所述梯度洗脱程序如下：0～10min，9％A→11％A；10～28min，11％A→23％A；28～43min，23％A→50％A；44～55min，90％A→90％，55～56min，90％A→9％A；56～66min，9％A→9％；

或，所述检测波长为260nm～280nm；

或，所述流速为0.8～1.2ml/min。

10.权利要求1-5任一项所述白芍提取物的质量控制方法，其特征在于，所述质量控制方法包括采用权利要求6-9任一项所述指纹图谱构建方法对待测样品中的芍药苷、没食子甲酯、没食子酸、苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖含量进行检测。

Images