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CN112673102A - 发夹型单链rna分子的制备方法 - Google Patents

发夹型单链rna分子的制备方法 Download PDF

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CN112673102A
CN112673102A CN201980061140.0A CN201980061140A CN112673102A CN 112673102 A CN112673102 A CN 112673102A CN 201980061140 A CN201980061140 A CN 201980061140A CN 112673102 A CN112673102 A CN 112673102A
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dehydration condensation
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CN201980061140.0A
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越本恭平
伊关克彦
稻田英朗
藤田达也
冲村庆一
国嶋崇隆
大木忠明
青木绘里子
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Original Assignee
Toray Industries Inc
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Abstract

本发明涉及抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的制备方法，该制备方法包括下述的步骤：在脱水缩合剂的存在下，在包含缓冲液和亲水性有机溶剂的混合溶剂中，使下述式(I)所表示的第1单链寡RNA分子与下述式(II)所表示的第2单链寡RNA分子进行反应，5’‑Xc‑Lx1・・・(I)Lx2‑X‑Y‑Ly‑Yc‑3’・・・(II)上述脱水缩合剂选自三嗪型脱水缩合剂、包含N‑羟基含氮芳香环结构的脲鎓型脱水缩合剂、碳二亚胺型脱水缩合剂、2‑卤代吡啶鎓型脱水缩合剂、和甲脒鎓型脱水缩合剂。

Description

发夹型单链RNA分子的制备方法
技术领域
本发明涉及发夹型单链RNA分子的制备方法。
背景技术
作为抑制基因表达的技术，例如已知有RNA干扰(RNAi) (非专利文献1)。在基于RNA干扰的基因表达抑制中，大多利用了使用被称为siRNA (小干扰RNA，smallinterferingRNA)的短的双链RNA分子的方法。另外，还报道了：使用通过分子内退火而部分地形成了双链的环状RNA分子的基因表达抑制技术(专利文献1)。
然而，由于siRNA在体内的稳定性低，容易解离成单链RNA，所以难以稳定地抑制基因表达。专利文献2报道了：利用使用氨基酸衍生物形成的1个或2个接头将siRNA的有义链和反义链连接成单链而得的发夹型单链长链RNA分子，可使siRNA稳定化。作为该单链长链RNA分子的制备方法，在专利文献2中记载了基于亚磷酰胺法的固相合成法。
作为长链DNA分子的制备方法，非专利文献2中报道了：将相对短链的2个寡DNA分子对、即分割成末端具有羧基的第1寡DNA分子和末端具有氨基的第2寡DNA分子的2个并合成，将它们在包含三嗪型脱水缩合剂的缓冲液中，通过酰胺化连接，由此进行制备的技术，但没有关于RNA分子的记载。
另一方面，例如，非专利文献3中报道了在水系溶剂中的酰胺化反应，但没有关于RNA分子的记载。
HATU被例示为：在固相合成时，在5’末端含有羧酸的低聚物的羧酸与标记物(例如菁蓝、氨基酸、肽之类的含氨基的物质)形成酰胺键时所使用的肽偶联剂(非专利文献4)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：美国专利申请公开第2004/058886号；
专利文献2：国际公开WO2012/017919；
非专利文献
非专利文献1：Fire等人、Nature、1998年、第391卷、806-811页；
非专利文献2：Liu等人、Tetrahedron、2008年、第64卷、8417-8422页；
非专利文献3：Badland等人、Tetrahedron Letters、2017年、第58卷、4391-4394页；
非专利文献4：Guidebook for the Synthesis of Oligonucleotides ProductGuide 2015/16、Link Technologies Ltd.、2017年、第58卷、49-51页。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于：提供抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的有效的制备方法。
用于解决课题的手段
抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的以往的制备方法是利用亚磷酰胺法使核苷一个单元一个单元地延伸的方法，不能说是有效的方法。
于是，本发明人以开发抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的有效的制备方法为目的，将非专利文献2的合成技术应用于发夹型单链RNA分子的合成，但在RNA分子中由于存在很多在酰胺化反应中成为副反应的原因的羟基，因此生成大量杂质，显示出无法以高的收率得到目标物。
为了解决上述课题，本发明人反复进行了深入研究，结果发现了：在包含缓冲液和二甲基亚砜等亲水性有机溶剂的混合溶剂中，通过使用规定类型的脱水缩合剂，使2个单链寡RNA分子的末端进行酰胺化反应，能够以高的收率有效地制备发夹型单链RNA分子，从而完成了本发明。
在文献(Nuclear acid research、1990年、第391卷、4953页、基础分子生物学 第4版 田村等人著、2016年、东京化学同人等)中记载了二甲基亚砜等有机溶剂被用作核酸的变性剂，已知这样的有机溶剂使核酸的退火变得不稳定。考虑到这一点，本发明人发现的上述见解是令人惊讶的。
即，本发明包含以下内容。
[1] 发夹型单链RNA分子的制备方法，其是抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的制备方法，包括下述的步骤：
在脱水缩合剂的存在下，在包含缓冲液和亲水性有机溶剂的混合溶剂中，使下述式(I)所表示的第1单链寡RNA分子与下述式(II)所表示的第2单链寡RNA分子进行反应，
5’-Xc-Lx1　・・・(I)
Lx2-X-Y-Ly-Yc-3’　・・・(II)
式(I)和式(II)中，X、Xc、Y和Yc由核糖核苷酸残基构成，Xc与X互补，Yc与Y互补，Ly为非核苷酸性接头，Lx1为具有氨基的非核苷酸性接头，Lx2为具有羧基的非核苷酸性接头，X-Y包含针对上述靶基因的基因表达抑制序列，
上述脱水缩合剂选自三嗪型脱水缩合剂、包含N-羟基含氮芳香环结构的脲鎓型脱水缩合剂、碳二亚胺型脱水缩合剂、2-卤代吡啶鎓型脱水缩合剂、和甲脒鎓型脱水缩合剂，
在上述脱水缩合剂为碳二亚胺型脱水缩合剂的情况下，该脱水缩合剂与N-羟基含氮芳香族化合物或氰基(羟基亚氨基)乙酸酯组合使用，
在上述脱水缩合剂为2-卤代吡啶鎓型脱水缩合剂的情况下，该脱水缩合剂与N-羟基含氮芳香族化合物组合使用，
在上述脱水缩合剂为甲脒鎓型脱水缩合剂的情况下，该脱水缩合剂与N-羟基含氮芳香族化合物或N-烃取代咪唑衍生物组合使用。
[2] [1]所述的制备方法，其中，上述接头Ly为具有氨基酸骨架或氨基醇骨架的非核苷酸性接头，上述接头Lx2为具有氨基酸骨架的非核苷酸性接头。
[3] [1]或[2]所述的制备方法，其中，上述Ly为包含吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少一者的非核苷酸性接头、或包含-NHCH2COO-的非核苷酸性接头，上述Lx2为包含具有羧基的吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少一者的非核苷酸性接头、或包含-NHCH2COOH的非核苷酸性接头。
[4] [1]～[3]中任一项所述的制备方法，其中，Lx1由下述式(III)表示，Lx2由下述式(IV)或下述式(IV’)表示：
[化学式1]
Figure 212324DEST_PATH_IMAGE001
・・・(III)
式(III)中，R1为可被取代的亚烷基链，-OR1经由磷酸二酯键与Xc的3’末端结合，
[化学式2]
Figure 843157DEST_PATH_IMAGE002
・・・（(IV)　或　
Figure 576758DEST_PATH_IMAGE003
・・・(IV’)
式(IV)中，R2为可被取代的亚烷基链，p为1或2，-OR2经由磷酸二酯键与X的5’末端结合，式(IV’)中，R2为可被取代的亚烷基链，-OR2经由磷酸二酯键与X的5’末端结合。
[5] [1]～[4]中任一项所述的制备方法，其中，
(i) 上述包含N-羟基含氮芳香环结构的脲鎓型脱水缩合剂为苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂，
(ii) 上述N-羟基含氮芳香族化合物为羟基苯并三唑或其衍生物，
(iii) 上述氰基(羟基亚氨基)乙酸酯为氰基(羟基亚氨基)乙酸烷基酯，和/或
(iv) 上述N-烃取代咪唑衍生物为N-烷基咪唑衍生物。
[6] [1]～[5]所述的制备方法，其中，上述亲水性有机溶剂为亲水性的非质子性有机溶剂。
[7] [6]所述的制备方法，其中，上述亲水性的非质子性有机溶剂为二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N’-二甲基亚乙基脲、或乙腈。
[8] [1]～[7]中任一项所述的制备方法，其中，上述脱水缩合剂为4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、N-(3’-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐、2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物、或氯-N,N,N’,N’-四甲基甲脒鎓六氟磷酸盐，
上述N-羟基含氮芳香族化合物为1-羟基-7-氮杂苯并三唑，
上述氰基(羟基亚氨基)乙酸酯为氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯，
上述N-烃取代咪唑衍生物为N-甲基咪唑。
[9] [7]或[8]中任一项所述的制备方法，其中，上述脱水缩合剂与上述亲水性的非质子性有机溶剂的组合为O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐与二甲基亚砜的组合、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐与N,N-二甲基甲酰胺的组合、N-(3’-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐与1-羟基-7-氮杂苯并三唑与二甲基亚砜的组合、或氯-N,N,N’,N’-四甲基甲脒鎓六氟磷酸盐与1-羟基-7-氮杂苯并三唑与二甲基亚砜的组合。
[10] [1]～[9]中任一项所述的制备方法，其中，上述缓冲液的pH为6.5～7.5。
[11] [1]～[10]中任一项所述的制备方法，其中，Ly为包含吡咯烷骨架或哌啶骨架的非核苷酸性接头，Lx1为具有氨基的非核苷酸性接头，Lx2为包含具有羧基的吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少一者的非核苷酸性接头。
[12] [1]～[11]中任一项所述的制备方法，其中，Ly由下述式(V)表示：
[化学式3]
Figure 392267DEST_PATH_IMAGE004
・・・(V)。
[13] [1]～[12]中任一项所述的制备方法，其中，Lx1由下述式(VI)表示，Lx2由下述式(VII)表示：
[化学式4]
Figure 804794DEST_PATH_IMAGE005
・・・(VI)
[化学式5]
Figure 504896DEST_PATH_IMAGE006
・・・(VII)。
[14] [1]～[13]中任一项所述的制备方法，其中，上述靶基因为TGF-β1基因。
[15] [1]～[14]中任一项所述的制备方法，其中，上述发夹型单链RNA分子由SEQID NO: 1所表示的核苷酸序列构成。
[16] 单链寡RNA分子，其为以下的(a)或(b)：
(a) 由SEQ ID NO: 3所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第1位的核糖核苷酸残基与Lx2进行连接、第26位和第27位的核糖核苷酸残基经由Ly进行连接；
(b) 由SEQ ID NO: 6所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第1位的核糖核苷酸残基与Lx2进行连接、第26位和第27位的核糖核苷酸残基经由Ly进行连接。
[17] 用于抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的制备用试剂盒，该试剂盒包含以下(1)或(2)的单链寡RNA分子的组合：
(1) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 2所表示的核苷酸序列构成，其中第24位的核糖核苷酸残基与Lx1进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 3所表示的核苷酸序列构成，其中第1位的核糖核苷酸残基与Lx2进行连接、第26位和第27位的核糖核苷酸残基经由Ly进行连接；
(2) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 5所表示的核苷酸序列构成，其中第22位的核糖核苷酸残基与Lx1进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 6所表示的核苷酸序列构成，其中第1位的核糖核苷酸残基与Lx2进行连接、第26位和第27位的核糖核苷酸残基经由Ly进行连接。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请号2018-187767号的公开内容。
发明效果
根据本发明，可有效地制备包含针对靶基因的表达抑制序列的发夹型单链RNA分子。
附图说明
[图1] 图1是本发明的制备方法的概略图。图中的表示X、Xc、Y、Yc序列的线上方的垂直线(实线)示意性地表示序列是互补性的，但不限定性表示与各自的核糖核苷酸残基或其对应的残基的互补性。用垂直线(虚线)示意性地表示图中的序列X与序列Y的边界。
[图2] 图2是ssTbRNA分子(SEQ ID NO: 1)的示意图。Lx1表示具有氨基的非核苷酸性接头，Ly表示非核苷酸性接头，Lx2表示具有羧基的非核苷酸性接头。SEQ ID NO: 1的29位(Ｕ)～47位(C)相当于活性序列(针对TGF-β1基因的基因表达抑制序列)。
具体实施方式
以下，详细地说明本发明。
本发明涉及抑制基因表达的发夹型单链RNA分子的制备方法。利用本发明的方法制备的发夹型单链RNA分子具有如下的单链结构：包含基因表达抑制序列的双链RNA的有义链的3’末端和反义链的5’末端经由包含非核苷酸性接头的序列进行连接，且在其反义链的3’末端进一步经由包含另外的非核苷酸性接头的序列连接有核糖核苷酸。利用本发明的方法制备的发夹型单链RNA分子的5’末端与3’末端没有结合。在本说明书中，“发夹型”是指，单链RNA分子通过分子内退火(自身退火)形成1个以上的双链结构。关于利用本发明的方法制备的发夹型单链RNA分子，其包含5’末端的5’侧区域和包含3’末端的3’侧区域分别分开进行分子内退火，由此形成至少2个双链结构。在本说明书中，“RNA”、“RNA分子”、“核酸分子”和“核酸”可仅由核苷酸构成，也可由核苷酸和非核苷酸物质(例如，脯氨酸衍生物、甘氨酸衍生物等氨基酸衍生物)构成。
本发明中，可分割成(i)在3’侧具有含有氨基的非核苷酸性接头(Lx1)的第1单链寡RNA分子和(ii)在5’侧具有含有羧基的非核苷酸性接头(Lx2)、在3’侧包含非核苷酸性接头(Ly)的第2单链寡RNA分子的2个片段并合成，将它们利用酰胺化反应进行连接，由此来制备包含基因表达抑制序列的发夹型单链RNA分子。在此，羧基也称为羧酸基。将本发明的方法的概略图示于图1中。图1中，Lx1为具有氨基的非核苷酸性接头，Lx2为具有羧基的非核苷酸性接头，Ly为非核苷酸性接头。在本发明的方法中，通过连接链较短的单链RNA分子的对来制备链较长的发夹型单链RNA分子，由此可实现高生产效率。
更具体而言，本发明所涉及的包含基因表达抑制序列的发夹型单链RNA分子的制备方法包括下述的步骤：在脱水缩合剂的存在下，使下述式(I)所表示的第1单链寡RNA分子与下述式(II)所表示的第2单链寡RNA分子进行反应。
5’-Xc-Lx1　・・・(I)
Lx2-X-Y-Ly-Yc-3’　・・・(II)
需要说明的是，如后所述，上述方法中，在使用碳二亚胺型脱水缩合剂作为脱水缩合剂的情况下，碳二亚胺型脱水缩合剂与N-羟基含氮芳香族化合物(例如羟基苯并三唑或其衍生物)或氰基(羟基亚氨基)乙酸酯组合使用。在使用2-卤代吡啶鎓型脱水缩合剂作为脱水缩合剂的情况下，2-卤代吡啶鎓型脱水缩合剂与N-羟基含氮芳香族化合物组合使用。在使用甲脒鎓型脱水缩合剂作为脱水缩合剂的情况下，甲脒鎓型脱水缩合剂与N-羟基含氮芳香族化合物或N-烃取代咪唑衍生物组合使用。
第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的反应是酰胺化反应。利用第1单链寡RNA分子(具体而言，该分子的末端的Lx1处的氨基)与第2单链寡RNA分子(具体而言，该分子的末端的Lx2处的羧基)的酰胺化反应(脱水缩合反应)，可在第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子之间形成酰胺键。本发明的制备方法中的该酰胺化反应可在反应溶剂中、特别是在包含缓冲液和亲水性有机溶剂的混合溶剂中实施。
本发明中，“寡RNA”和“寡RNA分子”是指，具有49个核苷酸长度以下(非核苷酸性接头的残基数不计算在内)的核苷酸序列的RNA分子。本发明中，术语“寡RNA”和“寡RNA分子”通常可互换使用。本发明所涉及的单链寡RNA分子有时还称为单链寡RNA、寡核酸、单链核酸分子、寡RNA、或寡RNA分子。
式(I)表示序列Xc与接头Lx1从5’末端侧起以Xc-Lx1的顺序连接而得的结构。式(II)表示序列X、Y和Yc以及接头Lx2和Ly从5’末端侧起以Lx2-X-Y-Ly-Yc的顺序连接而得的结构。
式(I)和式(II)中，X、Xc、Y和Yc由核糖核苷酸残基(1个或其以上的核糖核苷酸残基)构成。核糖核苷酸残基可以是具有选自腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤或胞嘧啶的任一种核酸碱基的残基。核糖核苷酸残基还可以是修饰核糖核苷酸残基，例如可具有被修饰的核酸碱基(修饰碱基)。作为修饰，可举出：荧光色素标记、甲基化、卤化、假尿苷化、氨基化、脱氨基化、硫醇化、二羟基化等，但并不限于这些。X、Xc、Y和Yc分别独立为仅由非修饰核糖核苷酸残基构成，也可以是除非修饰核糖核苷酸残基以外还包含修饰核糖核苷酸残基，还可以是仅由修饰核糖核苷酸残基构成。
本发明中，Xc与X互补。Xc优选为由与X的全部区域或其部分区域完全互补的序列(互补序列)构成。在Xc为与X的全部区域完全互补的情况下，Xc由从X的5’末端到3’末端的全部区域的互补序列构成，Xc与X的核苷酸数相同。另外，在Xc为与X的部分区域完全互补的情况下，Xc由X的部分区域的互补序列构成，Xc具有比X少1个核苷酸以上、例如1～4个核苷酸或1～2个核苷酸的核苷酸数。该部分区域优选为由从X中的Lx2侧的末端核苷酸连续的核苷酸序列构成的区域。
X例如可以是19～39个核苷酸长度、优选为19～30个核苷酸长度、更优选为19～25个核苷酸长度。
Xc例如可以是19～39个核苷酸长度、优选为19～30个核苷酸长度、更优选为19～25个核苷酸长度。
本发明中，Yc和Y具有相同的核苷酸长度。本发明中，Yc与Y互补。Yc优选为由与Y的全部区域完全互补的序列(互补序列)构成。在Yc为与Y全部区域完全互补的情况下，Yc由从Y的5’末端到3’末端的全部区域的互补序列构成，Yc与Y的核苷酸数相同。
Y例如可以是1～5个核苷酸长度、优选为1～3个核苷酸长度、更优选为1或2个核苷酸长度。
Yc例如可以是1～5个核苷酸长度、优选为1～3个核苷酸长度、更优选为1或2个核苷酸长度。
对X和Y的核苷酸数(核苷酸长度)的总计[(X＋Y)]、与Xc和Yc的核苷酸数(核苷酸长度)的总计[(Xc＋Yc)]之差[(X＋Y)－(Xc＋Yc)]没有特别限定，例如为0～4个核苷酸(核苷酸长度)、优选为0、1、或2个核苷酸(核苷酸长度)。
在式(II)所表示的第2单链寡RNA分子中，X、Y和Yc的总计核苷酸数例如为21～49个核苷酸、优选为21～30个核苷酸、更优选为25～30个核苷酸。
上述式(I)中的接头Lx1是具有氨基、优选为伯氨基或仲氨基的非核苷酸性接头。上述氨基可存在于接头Lx1的末端、也可存在于内部，但优选存在于末端。
接头Lx1例如由下述式(III)表示。
[化学式6]
Figure 686479DEST_PATH_IMAGE007
・・・(III)
式(III)中，R1是碳数为m的亚烷基链。在此，亚烷基链R1的碳原子上的任意的氢原子可被任意的取代基取代，也可不被取代。对m没有特别限制，可根据接头Lx1的所期望的长度进行适当设定，例如，从制备成本和收率等角度考虑，m优选为1～30的整数、更优选为1～20的整数、进一步优选为1～10的整数。式(III)中的-OR1经由磷酸二酯键与Xc的3’末端结合。即，接头Lx1中的-OR1经由磷酸二酯键与Xc的3’末端的糖(核糖)的3’位结合。
接头Lx1优选具有直链结构。在优选的实施方式中，接头Lx1可以是下述式(VI)所表示的接头。
[化学式7]
Figure 407310DEST_PATH_IMAGE008
・・・(VI)
上述式(II)中的接头Lx2是具有羧基的非核苷酸性接头。
上述接头Lx2具有羧基，只要不阻碍酰胺化反应则可以是任意的结构。上述羧基可存在于接头Lx2的末端、也可存在于内部，但优选存在于末端。
作为上述接头Lx2，例如可举出：具有氨基酸骨架的非核苷酸性接头。这样的接头Lx2可以是衍生自氨基酸、且在末端包含具有羧基的结构的接头。
在本说明书中，”氨基酸骨架”是指，在分子中分别包含1个以上氨基和羧基的任意的有机化合物或其结构。在此，氨基是指，从氨、伯胺、或仲胺中去除1个以上氢原子而得的官能团。构成氨基酸骨架的氨基和/或羧基可形成酰胺键、酯键等任意的化学键。来自氨基酸骨架的氨基酸例如可以是天然氨基酸、也可以是人工氨基酸。需要说明的是，天然氨基酸是指，天然中存在的结构的氨基酸或其光学异构体。另外，人工氨基酸是指，天然中不存在的结构的氨基酸。即，人工氨基酸是氨基酸、即包含氨基的羧酸衍生物(在分子中分别包含1个以上氨基和羧基的有机化合物)，是指天然中不存在的结构的羧酸衍生物。人工氨基酸优选例如不包含杂环。氨基酸例如可以是甘氨酸、α-丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、羟基赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脯氨酸、4-羟基脯氨酸、色氨酸、β-丙氨酸、1-氨基-2-羧基环戊烷、氨基苯甲酸、氨基吡啶羧酸、哌啶酸、异哌啶酸、哌可酸、3-吡咯烷羧酸、γ-氨基丁酸、或肌氨酸，并且可具有或不具有取代基或保护基。作为取代基，不限于以下的取代基，例如可举出：卤素、羟基、烷氧基、氨基、羧基、磺基、硝基、氨基甲酰基、氨磺酰基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基(cyclyl)烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、甲硅烷基、甲硅烷基氧基烷基、吡咯基、咪唑基等。保护基例如可以是将反应性高的官能团转换成惰性的官能团，可举出公知的保护基等。对于保护基，例如可采用文献(Protective Groups in Organic Synthesis 第4版、Greene等人著、2007年、John Wiley & Sons, Inc.)的记载。对保护基没有特别限制，例如可举出：叔丁基二甲基甲硅烷基、双(2-乙酰氧基乙基氧基)甲基、三异丙基甲硅烷基氧基甲基、1-(2-氰基乙氧基)乙基、2-氰基乙氧基甲基、2-氰乙基、甲苯磺酰基乙氧基甲基、三苯甲基和二甲氧基三苯甲基等。另外，在存在光学异构体、几何异构体、立体异构体等异构体的情况下，氨基酸可以是任意的异构体。这些可以是单一的异构体，也可以是混合物。
作为上述接头Lx2的优选实例，可举出：包含具有羧基的吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少一者的非核苷酸性接头、或包含-NHCH2COOH的非核苷酸性接头。在一个实施方式中，上述接头Lx2例如由下述式(IV)或下述式(IV’)表示，更优选由下述式(IV)表示。
[化学式8]
Figure 307133DEST_PATH_IMAGE009
・・・(IV)　或　
Figure 545348DEST_PATH_IMAGE010
・・・(IV’)
式(IV)和式(IV’)中，R2是碳数为n的亚烷基链。在此，亚烷基链R2的碳原子上的任意的氢原子可被任意的取代基取代，也可不被取代。对n没有特别限制，可根据接头Lx2的所期望的长度进行适当设定，例如从制备成本和收率等的角度考虑，n优选为1～30的整数、更优选为1～20的整数、进一步优选为1～10的整数。
式(IV)中，p为1或2、优选为1。
式(IV)和式(IV’)中的-OR2经由磷酸二酯键与X的5’末端结合。即，接头Lx2中的-OR2经由磷酸二酯键与X的5’末端的糖(核糖)的5’位结合。
在此，R1的m和R2的n的总计例如为2～31的整数、优选为2～21的整数、更优选为2～15的整数。
式(IV)中，接头Lx2具有如吡咯烷骨架或哌啶骨架的环状结构。
在优选的实施方式中，接头Lx2可以是下述式(VII)所表示的接头。
[化学式9]
Figure 847016DEST_PATH_IMAGE011
・・・(VII)
式(VII)所表示的接头可以是下述式(VII-1)或下述式(VII-2)所表示的光学活性体。
[化学式10]
Figure 870905DEST_PATH_IMAGE012
・・・(VII-1)
[化学式11]
Figure 258024DEST_PATH_IMAGE013
・・・(VII-2)
在另一个实施方式中，接头Lx2可以是下述式(VII’)所表示的接头。
[化学式12]
Figure 627825DEST_PATH_IMAGE014
・・・(VII’)
式(II)中的接头Ly是非核苷酸性接头。上述接头Ly只要不阻碍酰胺化反应则可以是任意的结构。作为接头Ly，可举出：具有氨基酸骨架或氨基醇骨架的非核苷酸性接头。这样的接头Ly可以是包含衍生自氨基酸的结构的接头。该“氨基酸骨架”为如上所述。但是，构成接头Ly的氨基酸骨架的氨基和/或羧基可形成酰胺键、酯键等任意的化学键。
在此，“氨基醇骨架”是指，在分子中分别包含1个以上氨基和羟基的任意的有机化合物或其结构。“氨基”为如上所述。构成接头Ly的氨基醇骨架的氨基和/或羟基可形成酰胺键、酯键、醚键等任意的化学键。氨基醇例如可举出将上述氨基酸的羧基进行转换而得到的氨基醇。氨基醇例如可以是氨基乙醇、氨基丙醇、缬氨醇、脯氨醇、或哌啶甲醇，并且可具有或不具有取代基或保护基。作为取代基，不限于以下的取代基，例如可举出：卤素、羟基、烷氧基、氨基、羧基、磺基、硝基、氨基甲酰基、氨磺酰基、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、芳基烷基、烷基芳基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、甲硅烷基、甲硅烷基氧基烷基、吡咯基、咪唑基等。保护基例如可以是将反应性高的官能团转换成惰性的官能团，可举出公知的保护基等。对于保护基，例如可采用文献(Protective Groups in Organic Synthesis 第4版、Greene等人著、2007年、John Wiley& Sons, Inc.)的记载。对保护基没有特别限制，例如可举出：叔丁基二甲基甲硅烷基、双(2-乙酰氧基乙基氧基)甲基、三异丙基甲硅烷基氧基甲基、1-(2-氰基乙氧基)乙基、2-氰基乙氧基甲基、2-氰乙基、甲苯磺酰基乙氧基甲基、三苯甲基和二甲氧基三苯甲基等。另外，在存在光学异构体、几何异构体、立体异构体等异构体的情况下，氨基醇可以是任意的异构体。这些可以是单一的异构体，也可以是混合物。
接头Ly优选为包含吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少一者的非核苷酸性接头、或包含-NHCH2COO-的非核苷酸性接头。更优选的是，接头Ly具有可在2个以上的位置被取代的环状结构。接头Ly可具有1个或2个以上n元环(例如n＝5或6)，在具有2个以上环的情况下，它们可形成稠环、螺环或双环等。接头Ly可具有1个或2个以上的取代基。接头Ly经由其任意的2个基团(例如构成n元环的2个原子上的取代基)，连接上述的Y和Yc。利用本发明的方法制备的发夹型单链RNA分子由于用这样的接头连接有义链和反义链，因此核酸酶抗性优异。
在一个实施方式中，接头Ly为包含吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少一者的非核苷酸性接头、优选为包含吡咯烷骨架或哌啶骨架的非核苷酸性接头。上述吡咯烷骨架可以是例如构成吡咯烷的5元环的碳原子的1个以上被取代而得的吡咯烷衍生物的骨架，在被取代的情况下，优选例如除了2位的碳原子(C-2)以外的碳原子被取代。上述碳原子可被例如氮原子、氧原子或硫原子取代。上述吡咯烷骨架例如在吡咯烷的5元环内可包含碳-碳双键或碳-氮双键。上述吡咯烷骨架中，在构成吡咯烷的5元环的碳原子和氮原子上，例如可结合氢原子，也可结合后述的取代基。接头Ly例如可经由上述吡咯烷骨架的任意的基团连接Y和Yc。它们可经由构成上述5元环的任意1个的碳原子和氮原子、优选为经由上述5元环的2位的碳原子(C-2)和氮原子进行连接。作为上述吡咯烷骨架，例如可举出：脯氨酸骨架、脯氨醇骨架等。
在一个实施方式中，本发明中，式(I)和式(II)中，Ly为包含吡咯烷骨架或哌啶骨架的非核苷酸性接头，Lx1为具有氨基的非核苷酸性接头，Lx2为包含具有羧基的吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少一者的非核苷酸性接头。
上述哌啶骨架可以是例如构成哌啶的6元环的碳原子的1个以上被取代而得的哌啶衍生物的骨架，在被取代的情况下，优选为例如除了2位的碳原子(C-2)以外的碳原子被取代。上述碳原子可被例如氮原子、氧原子或硫原子取代。上述哌啶骨架在例如哌啶的6元环内可包含碳-碳双键或碳-氮双键。在上述哌啶骨架中，构成哌啶的6元环的碳原子和氮原子例如可结合氢原子，也可结合后述的取代基。接头Ly可经由例如上述哌啶骨架的任意的基团连接Y和Yc。它们可经由构成上述6元环的任意1个的碳原子和氮原子、优选为上述6元环的2位的碳原子(C-2)和氮原子进行连接。
上述接头Ly例如由下述式(VIII)表示。
[化学式13]
Figure 49580DEST_PATH_IMAGE015
・・・(VIII)
式(VIII)中，X1和X2分别独立为H2、O、S或NH，
Y1和Y2分别独立为单键、CH2、NH、O或S，
Z为与环A上的C-3、C-4、C-5或C-6结合的氢原子或取代基，
L1是碳数为r的亚烷基链，在此，亚烷基链的碳原子上的氢原子可被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，也可不被取代，或者
L1是上述亚烷基链的一个以上的碳原子被氧原子取代而得的聚醚链，
在此，在Y1为NH、O或S的情况下，与Y1结合的L1的原子为碳，与O结合的L1的原子为碳，氧原子彼此不相邻，
L2是碳数为s的亚烷基链，在此，亚烷基链的碳原子上的氢原子可被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，也可不被取代，或者
L2是上述亚烷基链的一个以上的碳原子被氧原子取代而得的聚醚链，
在此，在Y2为NH、O或S的情况下，与Y2结合的L2的原子为碳，与O结合的L2的原子为碳，氧原子彼此不相邻，
Ra和Rb分别独立为取代基或保护基；
q为1或2，
r为0～30的范围的整数，
s为0～30的范围的整数，
环A中，环A上的除了C-2以外的1个碳原子可被氮原子、氧原子、硫原子取代，在环A内可包含碳-碳双键或碳-氮双键。
Y和Yc经由式(VIII)中的-OL1或-OL2与接头Ly连接。在一个实施方式中，Y经由-OL1、Yc经由-OL2可与接头Ly连接。在另一个实施方式中，Y经由-OL2、Yc经由-OL1可与接头Ly连接。
式(VIII)中，X1和X2例如分别独立为H2、O、S或NH。式(VIII)中，X1为H2是指，X1和X1所结合的碳原子一起形成CH2。关于X2也同样。
式(VIII)中，Y1和Y2分别独立为单键、CH2、NH、O或S。
式(VIII)中，环A中，q为1或2。在q为1的情况下，环A为5元环，例如为上述吡咯烷骨架。上述吡咯烷骨架例如可举出脯氨酸骨架、脯氨醇骨架等，可示例它们的二价结构。在q为2的情况下，环A为6元环，例如为上述哌啶骨架。环A中，环A上的C-2以外的1个碳原子可被氮原子、氧原子或硫原子取代。另外，环A可在环A内包含碳-碳双键或碳-氮双键。环A例如可为L型和D型的任一种。
式(VIII)中，Z为与环A上的C-3、C-4、C-5或C-6结合的氢原子或取代基。在Z为取代基的情况下，取代基Z可为1也可为多个，还可以不存在，在为多个的情况下可相同也可不同。
取代基Z例如为卤素、OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH、SRa或氧代基(＝O)等。
Ra和Rb例如分别独立为取代基或保护基，可相同也可不同。上述取代基例如可举出：卤素、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基(cyclyl)烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、杂环基烯基、杂环基烷基、杂芳基烷基、甲硅烷基、甲硅烷基氧基烷基等。以下也同样。取代基Z可以是列举的这些取代基。
上述保护基例如是将反应性高的官能团转换成惰性的官能团，可举出公知的保护基等。对于上述保护基，例如可采用文献(Protective Groups in Organic Synthesis 第4版、Greene等人著、2007年、John Wiley & Sons, Inc.)的记载。对上述保护基没有特别限制，例如可举出：叔丁基二甲基甲硅烷基(以下、TBDMS基)、双(2-乙酰氧基乙基氧基)甲基(以下、ACE基)、三异丙基甲硅烷基氧基甲基(以下、TOM基)、1-(2-氰基乙氧基)乙基(以下、CEE基)、2-氰基乙氧基甲基(以下、CEM基)、2-氰乙基(以下、CE基)、甲苯磺酰基乙氧基甲基(以下、TEM基)、三苯甲基(以下、Tr基)和二甲氧基三苯甲基(以下、DMTr基)等。在Z为ORａ的情况下，上述保护基例如可举出：TBDMS基、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基和TEM基等。此外，还可举出：含甲硅烷基的基团。以下也同样。
式(VIII)中，L1是碳数为r的亚烷基链。上述亚烷基碳原子上的氢原子例如可被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，也可不被取代。或者，L1可以是上述亚烷基链的1个以上的碳原子被氧原子取代而得的聚醚链。上述聚醚链例如为聚乙二醇。需要说明的是，在Y1为NH、O或S的情况下，与Y1结合的L1的原子为碳，与O结合的L1的原子为碳，氧原子彼此不相邻。
式(VIII)中，L2是碳数为s的亚烷基链。上述亚烷基链的碳原子上的氢原子例如可被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，也可不被取代。或者，L2可以是上述亚烷基链的1个以上碳原子被氧原子取代而得的聚醚链。需要说明的是，在Y2为NH、O或S的情况下，与Y2结合的L2的原子为碳，与O结合的L2的原子为碳，氧原子彼此不相邻。
对L1的r和L2的s没有特别限制，下限例如分别为0，对上限也没有特别限制。r和s例如可根据接头Ly的所期望的长度进行适当设定。例如，从制备成本和收率等角度考虑，r和s分别独立优选为0～30的整数、更优选为0～20的整数、进一步优选为0～15的整数。r和s可相同也可不同。
Ra和Rb与上述同样。
式(VIII)中，氢原子例如分别独立可被取代成Cl、Br、F和I等卤素。
在优选的实施方式中，上述接头Ly可以是下述式(VIII-1)～(VIII-9)的任一个所表示的接头。在下述式(VIII-1)～(VIII-9)中，t为0～10的整数，r和s与上述式(VIII)相同。作为具体例，可举出：式(VIII-1)中r＝8、式(VIII-2)中r＝3、式(VIII-3)中r＝4或8、式(VIII-4)中r＝7或8、式(VIII-5)中r＝3和s＝4、式(VIII-6)中r＝8和s＝4、式(VIII-7)中r＝8和s＝4、式(VIII-8)中r＝5和s＝4、式(VIII-9)中t＝1和s＝4。
[化学式14]
Figure 846634DEST_PATH_IMAGE016
在一个实施方式中，上述接头Ly可以是下述式(V)或下述式(IX)所表示的接头。
[化学式15]
Figure 127574DEST_PATH_IMAGE017
・・・(V)
[化学式16]
Figure 301066DEST_PATH_IMAGE018
・・・(IX)
式(V)所表示的接头可以是下述式(V-1)或下述式(V-2)所表示的光学活性体。
[化学式17]
Figure 718272DEST_PATH_IMAGE019
・・・(V-1)
[化学式18]
Figure 686228DEST_PATH_IMAGE020
・・・(V-2)
在另一个实施方式中，接头Ly为包含-NHCH2COO-的非核苷酸性接头，这样的接头例如由下述式(XXI)表示。该接头Ly基本上与上述式(VIII)所表示的接头Ly对应，关于上述式(VIII)所表示的接头的说明也应用于下述式(XXI)所表示的接头。
[化学式19]
Figure 579098DEST_PATH_IMAGE021
・・・(XXI)
式(XXI)中，X1和X2分别独立为H2、O、S或NH，
Y1和Y2分别独立为单键、CH2、NH、O或S，
L1是碳数为r的亚烷基链，在此，亚烷基链的碳原子上的氢原子可被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，也可不被取代，或者，
L1是上述亚烷基链的一个以上的碳原子被氧原子取代而得的聚醚链，
在此，在Y1为NH、O或S的情况下，与Y1结合的L1的原子为碳，与O结合的L1的原子为碳，氧原子彼此不相邻，
L2是碳数为s的亚烷基链，在此，亚烷基链的碳原子上的氢原子可被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，也可不被取代，或者，
L2是上述亚烷基链的一个以上的碳原子被氧原子取代而得的聚醚链，
在此，在Y2为NH、O或S的情况下，与Y2结合的L2的原子为碳，与O结合的L2的原子为碳，氧原子彼此不相邻，
Ra和Rb分别独立为取代基或保护基,
r为0～30的范围的整数，
s为0～30的范围的整数。
Y和Yc经由式(XXI)中的-OL1或-OL2与接头Ly进行连接。在一个实施方式中，Y可经由-OL1、Yc可经由-OL2与接头Ly进行连接。在另一个实施方式中，Y可经由-OL2、Yc可经由-OL1与接头Ly进行连接。
式(XXI)中，X1和X2例如分别独立为H2、O、S或NH。式(XXI)中，X1为H2是指，X1和X1所结合的碳原子一起形成CH2。关于X2也同样。
式(XXI)中，Y1和Y2分别独立为单键、CH2、NH、O或S。
Ra和Rb例如分别独立为取代基或保护基，可相同也可不同。上述取代基，例如可举出：卤素、烷基、烯基、炔基、卤代烷基、芳基、杂芳基、芳基烷基、环烷基、环烯基、环烷基烷基、环基烷基、羟基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、杂环基烯基、杂环基烷基、杂芳基烷基、甲硅烷基、甲硅烷基氧基烷基等。以下也同样。
上述保护基例如是将反应性高的官能团转换成惰性的官能团，可举出公知的保护基等。对于上述保护基，例如可采用文献(Protective Groups in Organic Synthesis 第4版、Greene等人著、2007年、John Wiley & Sons, Inc.)的记载。对上述保护基没有特别限制，例如可举出：TBDMS基、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基、CE基、TEM基、Tr基和、DMTr基等。以下也同样。
式(XXI)中，L1是碳数为r的亚烷基链。上述亚烷基碳原子上的氢原子例如可被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，也可不被取代。或者，L1可以是上述亚烷基链的1个以上的碳原子被氧原子取代而得的聚醚链。上述聚醚链例如为聚乙二醇。需要说明的是，在Y1为NH、O或S的情况下，与Y1结合的L1的原子为碳，与O结合的L1的原子为碳，氧原子彼此不相邻。
式(XXI)中，L2是碳数为s的亚烷基链。上述亚烷基链的碳原子上的氢原子例如可被OH、ORa、NH2、NHRa、NRaRb、SH或SRa取代，也可不被取代。或者，L2可以是上述亚烷基链的1个以上的碳原子被氧原子取代而得的聚醚链。需要说明的是，在Y2为NH、O或S的情况下，与Y2结合的L2的原子为碳，与O结合的L2的原子为碳，氧原子彼此不相邻。
对L1的r和L2的s没有特别限制，各自的下限例如为0，对上限也没有特别限制。r和s可根据例如接头Ly的所期望的长度来适当设定。例如从制备成本和收率等角度考虑，r和s分别独立优选为0～30的整数、更优选为0～20的整数、进一步优选为0～15的整数。r和s可相同也可不同。
Ra和Rb与上述同样。
式(XXI)中，氢原子例如分别独立可取代成Cl、Br、F和I等卤素。
在优选的实施方式中，上述接头Ly可以是下述式(XXII)所表示的接头。
[化学式20]
Figure 290702DEST_PATH_IMAGE022
・・・(XXII)
第1和第2单链寡RNA分子可使用本领域技术人员所公知的RNA合成法进行制作。作为本领域技术人员所公知的RNA合成法，例如可举出：亚磷酰胺法或H-膦酸酯法等。在亚磷酰胺法中，通过与RNA Amidite (核糖核苷亚磷酰胺)的缩合反应使与载体的疏水性基团结合的核糖核苷延伸，经过氧化和脱保护，再重复进行与RNA Amidite的缩合反应，由此即可进行RNA合成。
式(I)所表示的第1单链寡RNA分子可通过一般的RNA合成法、例如亚磷酰胺法进行制作。在一个实施方式中，可预先使用相当于接头Lx1的结构的氨基醇经由氨基而结合的固相载体(例如，后述的3’-PT Amino-Modifier C4 CPG; Link Technologies)，如常规方法那样，可通过自3’末端侧固相合成Xc进行制作。合成中可使用任意的RNA Amidite，例如也可使用在2’位的羟基上具有TBDMS基、TOM基、ACE基、CEE基、CEM基、TEM基、DMTr基等各种保护基的通用型RNA Amidite。另外，作为固相载体，可使用聚苯乙烯系载体、丙烯酰胺系载体、或玻璃载体等任意的固相载体。载体可以是珠、板、碎片、管等任意的形态。作为氨基醇所结合的载体的实例，例如可举出：3’-PT Amino-Modiffier C3 CPG，或C7 CPG (LinkTechnologies)等，但不限于这些。
式(II)所表示的第2单链寡RNA分子也同样地可通过一般的RNA合成法、例如亚磷酰胺法进行制作。在一个实施方式中，在固相载体上，如常规方法那样，自3’末端侧固相合成Yc之后，将接头Ly与Yc的5’末端连接。接着，自该末端进一步进行固相合成，将接头Lx2与X的5’末端连接，由此可制作第2单链寡RNA分子。合成中可使用任意的RNA Amidite，例如也可使用在2’位的羟基上具有BDMS基、TOM基、ACE基、CEE基、CEM基、TEM基、DMTr基等各种保护基的通用型RNA Amidite。另外，作为固相载体，可使用聚苯乙烯系载体、丙烯酰胺系载体、或玻璃载体等任意的固相载体。载体可以是珠、板、碎片、管等任意的形态。作为载体的实例，例如可举出：NittoPhase(R) HL rG (ibu)、或rU (KINOVATE)等，但不限于这些。
在接头Lx2与X的5’末端的连接中，可使用适合该连接的的任意的RNA合成用单体，例如可使用下述式(X)所表示的RNA合成用的单体。该单体基本上与上述式(IV)所表示的接头对应，对于上述式(IV)所表示的接头的说明也适用于下述式(X)所表示的单体。下述式(X)所表示的单体例如可用作自动核酸合成用的Amidite，例如可用于一般的核酸自动合成装置。本发明还提供下述式(X)所表示的RNA合成用的单体(Amidite)。
[化学式21]
Figure 155890DEST_PATH_IMAGE023
・・・(X)
式(X)中，对于与上述式(IV)相同位置，可适用式(IV)的说明。具体而言，式(X)中，R2是碳数为n的亚烷基链。在此，亚烷基链R2的碳原子上的任意的氢原子可被任意的取代基取代，也可不被取代。对n没有特别限制，可根据接头Lx2的所期望的长度适当设定，例如从制备成本和收率等的角度考虑，n优选为1～30的整数、更优选为1～20的整数、进一步优选为1～15的整数。式(X)中，p为1或2、优选为1。式(X)中，R3为羧酸保护基。对于羧酸保护基，例如可适用文献(Protective Groups in Organic Synthesis 第4版、Greene等人著、2007年、John Wiley & Sons, Inc.)的记载。作为羧酸保护基的具体例，例如可举出：DMTr基、Tr基、TBDMS基、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基、CE基、TEM基和2,4-二甲氧基苄基，但优选CE基或2,4-二甲氧基苄基。
R4是被吸电子基团取代而得的烷基，具体而言，例如可举出：2-氰乙基(CE基)、硝基苯乙基等，但优选2-氰乙基(CE基)。
R5和R6分别独立为烷基，可相同也可不同。-NR5R6，具体而言，例如可举出：二异丙基氨基、二乙基氨基、乙基甲基氨基等，但优选二异丙基氨基。
在优选的实施方式中，式(X)所表示的单体可以是下述式(XI)或下述式(XVIII)所表示的单体。
[化学式22]
Figure 701272DEST_PATH_IMAGE024
・・・(XI)
[化学式23]
Figure 284700DEST_PATH_IMAGE025
・・・(XVIII)
式(XI)所表示的单体可以是下述式(XI-1)或下述式(XI-2)所表示的光学活性体。
[化学式24]
Figure 206520DEST_PATH_IMAGE026
・・・(XI-1)
[化学式25]
Figure 191793DEST_PATH_IMAGE027
・・・(XI-2)
式(XVIII)所表示的单体可以是下述式(XVIII-1)或下述式(XVIII-2)所表示的光学活性体。
[化学式26]
Figure 501552DEST_PATH_IMAGE028
・・・(XVIII-1)
[化学式27]
Figure 103434DEST_PATH_IMAGE029
・・・(XVIII-2)
以下，对式(X)所表示的单体的合成法的实例进行说明，合成所使用的起始物质和试剂可直接利用市售品，也可通过公知的方法进行合成。
例如，如以下的图解(scheme) 1所示，式(X)所表示的单体可利用式(XII)所表示的醇衍生物的、基于式(XIII)所表示的磷酸化试剂的磷酸化反应进行合成。
[化学式28]
Figure 156841DEST_PATH_IMAGE030
式中，X为卤素或NR5R6，R2、R3、R4、R5、R6、p与上述的定义相同。
作为式(XIII)所表示的磷酸化试剂的具体例，例如可举出：2-氰乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺、硝基苯乙基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺、甲基-N,N-二异丙基氯亚磷酰胺、或2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基亚磷酰二胺等。
相对于式(XII)所表示的醇衍生物，式(XIII)所表示的磷酸化试剂的当量优选1～10当量、更优选1.1～1.5当量。
作为用于磷酸化反应的活化剂，可举出：四唑或二异丙胺四唑盐等，但优选二异丙胺四唑盐。
相对于式(XII)所表示的醇衍生物，上述活化剂的当量优选1～10当量、更优选1.1～1.5当量。
用于磷酸化反应的溶剂可举出：四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿、二乙醚或乙腈等，但优选乙腈。
磷酸化反应的反应温度优选20～50℃、更优选20～30℃。另外，磷酸化反应的反应时间优选1～48小时、更优选2～5小时。
例如，如以下的图解2所示，式(XII)所表示的醇衍生物可通过式(XIV)所表示的胺衍生物与式(XV)所表示的羧酸衍生物的缩合反应进行合成。
[化学式29]
Figure 668725DEST_PATH_IMAGE031
式中，R2、R3、p与上述的定义相同。
相对于式(XIV)所表示的胺衍生物，用于缩合反应的、式(XV)所表示的羧酸衍生物的当量优选1～3当量、更优选1.1～1.5当量。
作为用于缩合反应的缩合剂，例如可举出：环己基碳二亚胺、N-(3’-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐、苯并三唑-1-基氧基-三(二甲基氨基)磷鎓盐、O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、或O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐等，但优选N-(3’-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐。
相对于式(XV)所表示的羧酸衍生物，上述缩合剂的当量优选1～10当量、更优选1.1～1.5当量。
作为用于缩合反应的碱，例如可举出：二异丙基乙胺、三乙胺、吡啶或N-甲基吗啉等有机碱或碳酸钾、碳酸钠或碳酸氢钠等有机酸盐，但优选二异丙基乙胺或三乙胺。
相对于式(XV)所表示的羧酸衍生物，上述碱的当量优选0～10当量、更优选1～3当量。
作为用于缩合反应的溶剂，例如可举出：N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿或二乙醚等，但优选二氯甲烷。
缩合反应的反应温度优选0～50℃、更优选0～30℃。另外，缩合反应的反应时间优选1～48小时、更优选2～5小时。
关于式(XIV)所表示的胺衍生物，例如，如以下的图解3所示可通过对式(XVI)所表示的氨基酸衍生物的羧酸导入保护基的反应、和所得的式(XVII)所表示的氨基酸衍生物的脱Boc化反应；或如图解4所示对式(XIX)所表示的氨基酸衍生物的羧酸导入保护基的反应、和所得的式(XX)所表示的氨基酸衍生物的脱Fmoc化反应来进行合成。
[化学式30]
Figure 149385DEST_PATH_IMAGE032
式中，R3、p与上述的定义相同。
[化学式31]
Figure 113930DEST_PATH_IMAGE033
式中、R3、p与上述的定义相同。
上述向羧酸导入保护基的反应例如可利用文献(Protective Groups in OrganicSynthesis 第4版、Greene等人著、2007年、John Wiley & Sons, Inc.)等中记载的公知方法进行实施。
脱Boc化反应或脱Fmoc化反应例如通过文献(Protective Groups in OrganicSynthesis 第4版、Greene等人著、2007年、John Wiley & Sons, Inc.)等中记载的公知方法来进行。
式(XVI)或式(XIX)所表示的氨基酸衍生物可购买、或者利用公知的方法或基于该公知方法的方法进行制备。
在另一个实施方式中，下述式(X’)所表示的RNA合成用的单体也可用于接头Lx2与X的5’末端的连接。该单体基本上与上述式(IV’)所表示的接头对应，对于上述式(IV’)所表示的接头的说明也适用于下述式(X’)所表示的单体。本发明还提供下述式(X’)所表示的RNA合成用的单体(Amidite)。
[化学式32]
Figure 971027DEST_PATH_IMAGE034
・・・(X’)
式(X’)中，对于与上述式(IV’)相同的部位，可适用式(IV’)的说明。具体而言，式(X’)中，R2是碳数为n的亚烷基链。在此，亚烷基链R2的碳原子上的任意的氢原子可被任意的取代基取代、也可不被取代。对n没有特别限制，可根据接头Lx2的所期望的长度进行适当设定，例如从制备成本和收率等角度考虑，n优选为1～30的整数、更优选为1～20的整数、进一步优选为1～15的整数。式(X’)中，R3为羧酸保护基。对于羧酸保护基，例如可适用文献(Protective Groups in Organic Synthesis 第4版、Greene等人著、2007年、John Wiley& Sons, Inc.)的记载。作为羧酸保护基的具体例，例如可举出：DMTr基、Tr基、TBDMS基、ACE基、TOM基、CEE基、CEM基、CE基、TEM基和2,4-二甲氧基苄基，但优选CE基。
R4为可被吸电子基团取代的烷基，具体而言，例如可举出：2-氰乙基(CE基)、硝基苯乙基等，但优选2-氰乙基(CE基)。
R5和R6分别独立为烷基，可相同也可不同。关于-NR5R6，具体而言，例如可举出：二异丙基氨基、二乙基氨基、乙基甲基氨基等，但优选二异丙基氨基。
在优选的实施方式中，式(X’)所表示的单体可以是下述式(XXIII)所表示的单体。
[化学式33]
Figure 665314DEST_PATH_IMAGE035
・・・(XXIII)
式(X’)所表示的单体例如可使用式(XVI’)所表示的氨基酸衍生物代替式(XVI)所表示的氨基衍生物，通过与上述图解1～3同样的方法进行制备。
[化学式34]
Figure 848034DEST_PATH_IMAGE036
式(XVI’)所表示的氨基酸衍生物可购买、或者利用公知的方法或基于该公知方法的方法进行制备。
另外，在上述接头Ly与Yc的5’末端的连接中，可使用适合于该连接的任意的RNA合成用单体、例如记载于文献(日本专利第5261677号说明书或日本专利第5876890号说明书)中的公知的RNA合成用单体。
在通过本发明的方法制备的发夹型单链RNA分子中，X-Y包含针对靶基因的基因表达抑制序列。基因表达抑制序列可仅包含在X或仅包含在Y中。基因表达抑制序列优选为从靶基因转录的mRNA的全部或部分的有义序列或反义序列。
上述发夹型单链RNA分子可包含1个基因表达抑制序列、也可包含2个以上。上述发夹型单链RNA分子例如可具有针对相同靶基因的2个以上相同表达抑制序列、也可具有针对相同靶的2个以上不同的表达抑制序列、还可具有针对不同的靶基因的2个以上不同的表达抑制序列。具有针对不同的靶基因的2个以上基因表达抑制序列的发夹型单链RNA分子对2种以上不同的靶基因的表达抑制有效。本发明中，“基因”是指转录成mRNA的基因组区，可为蛋白质编码区，但也可为RNA编码区。
本发明所涉及的发夹型单链RNA分子具有经由基因表达抑制序列而抑制靶基因表达的能力。基于本发明所涉及的发夹型单链RNA分子的靶基因表达抑制，优选为基于RNA干扰的靶基因表达抑制，但不限于此。RNA干扰一般而言是下述的现象：长双链RNA (dsRNA)在细胞内被Dicer (核糖核酸内切酶)切断成3’末端突出的19～21个核苷酸对左右的短双链RNA (siRNA：small interfering RNA)，其中一个单链RNA与靶mRNA结合，降解靶mRNA，而抑制靶mRNA的翻译，由此抑制来自靶mRNA的靶基因表达的现象。与靶mRNA结合的siRNA所含的单链RNA的序列，例如已报道根据靶基因的种类而有各种各样的种类。本发明例如可将siRNA所含的单链RNA的序列用作基因表达抑制序列。通过本发明的方法制备的发夹型单链RNA分子，在体内被切断而生成siRNA，由此抑制靶基因的表达。本发明所涉及的发夹型单链RNA分子可用于与靶基因表达或表达增加相关的疾病或障碍的治疗或预防。
基因表达抑制序列优选为19～30核苷酸长度、更优选为19～27核苷酸长度，例如可以是19、20、21、22、或23核苷酸长度。基因表达抑制序列优选由与靶基因的mRNA的至少一部分序列完全相同或完全互补的RNA序列构成。
作为靶基因，没有特别限定，例如可举出：TGF-β1基因、GAPDH基因、LAMA1基因、LMNA基因。在靶基因为TGF-β1基因的情况下，利用本发明的方法制备的发夹型单链RNA分子，在体内抑制TGF-β1基因的表达。这样的发夹型单链RNA分子通过TGF-β1基因的基因表达抑制，可用于与TGF-β1基因的表达或表达增加相关的疾病或障碍、例如肺纤维化或急性肺疾病的治疗或预防。
利用本发明的方法制备的包含基因表达抑制序列的发夹型单链RNA分子的1个实例，通过具有SEQ ID NO: 1所表示的核苷酸序列、具有SEQ ID NO: 2所表示的核苷酸序列的第1单链寡RNA分子(链A)与具有SEQ ID NO: 3所表示的核苷酸序列的第2单链寡RNA分子(链B)的组合而得到。SEQ ID NO: 1所表示的核苷酸序列包含作为靶基因的针对TGF-β1基因的基因表达抑制序列。SEQ ID NO: 1所表示的核苷酸序列的29位～47位的序列相当于基因表达抑制序列(活性序列) (图2)。
另外，作为其他例子，通过具有SEQ ID NO: 4所表示的核苷酸序列、具有SEQ IDNO: 5所表示的核苷酸序列的第1单链寡RNA分子(链C)与具有SEQ ID NO: 6所表示的核苷酸序列的第2单链寡RNA分子(链D)的组合而得到。SEQ ID NO: 4所表示的核苷酸序列包含作为靶基因的针对GAPDH基因的基因表达抑制序列。SEQ ID NO: 4所表示的核苷酸序列的27位～45位的序列相当于基因表达抑制序列(活性序列)。
本发明中，使上述式(I)所表示的第1单链寡RNA分子和上述式(II)所表示的第2单链寡RNA分子在反应溶剂中、在脱水缩合剂(也称为缩合剂)的存在下进行反应，在接头Lx1与接头Lx2之间形成酰胺键，由此可制备上述发夹型单链RNA分子。反应溶剂是包含缓冲液和亲水性有机溶剂的混合溶剂。
作为上述缓冲液，可举出：2-(N-吗啉代)乙磺酸缓冲液(以下，MES缓冲液)、3-(N-吗啉代)-2-羟基丙磺酸缓冲液(以下，MOPSO缓冲液)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)缓冲液(以下，PIPES缓冲液)、3-(N-吗啉代)丙磺酸缓冲液(以下，MOPS缓冲液)、N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸缓冲液(以下，BES缓冲液)、3-[N,N-双(2-羟基乙基)氨基]-2-羟基丙磺酸缓冲液(以下，DIPSO缓冲液)、2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸缓冲液(以下，HEPES缓冲液)、哌嗪-1,4-双(2-羟基丙磺酸)缓冲液(以下，POPSO缓冲液)、4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-(2-羟基丙烷-3-磺酸缓冲液(以下，HEPPSO缓冲液)、4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪丙磺酸缓冲液(以下，HEPPS缓冲液)等，但不限于这些。优选使用MES缓冲液或MOPS缓冲液等。
缓冲液的pH可适当调整，但优选为6.5～7.5、更优选为6.9～7.5，例如为6.5～7.0、6.9～7.1、或7.0～7.5。
本发明中，作为上述反应溶剂的成分，可使用亲水性有机溶剂。亲水性有机溶剂例如可以是亲水性的非质子性有机溶剂。
亲水性有机溶剂是指，可与水以任意比率混合的有机溶剂，可举出：环丁砜等砜系溶剂，二甲基亚砜等亚砜系溶剂，N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺系溶剂，N,N'-二甲基亚乙基脲等脲系溶剂，乙腈等腈系溶剂，四氢呋喃、1,2-二甲氧基乙烷等醚系溶剂，乙醇、叔丁醇等醇系溶剂。另外，”非质子性”有机溶剂是指，不具有质子供给性的有机溶剂，作为亲水性的非质子性有机溶剂，可举出：环丁砜等砜系溶剂，二甲基亚砜等亚砜系溶剂，N,N-二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮等酰胺系溶剂，N,N'-二甲基亚乙基脲等脲系溶剂，乙腈等腈系溶剂，四氢呋喃、1,2-二甲氧基乙烷等醚系溶剂，但优选二甲基亚砜(以下，DMSO)，N,N-二甲基甲酰胺(以下，DMF)，N,N'-二甲基亚乙基脲(以下，DMEU)、或乙腈，更优选DMSO或DMF。
需要说明的是，在将脱水缩合剂或N-羟基含氮芳香族化合物(例如羟基苯并三唑或其衍生物)、氰基(羟基亚氨基)乙酸酯、或N-烃取代咪唑衍生物溶解或悬浮于有机溶剂中进行添加的情况下，该有机溶剂应包括在混合溶剂中的”有机溶剂”中。有机溶剂可使用1种，也可将2种以上组合使用。
在一个实施方式中，作为反应溶剂的混合溶剂中的有机溶剂的比率可为溶剂总量(包含缓冲液和有机溶剂的混合溶剂的总量)的、15～70体积％(v/v％)，例如可为20～70体积％、20～65体积％、35～60体积％、35～55体积％、或50～55体积％。本发明中，在将脱水缩合剂或N-羟基含氮芳香族化合物(例如羟基苯并三唑或其衍生物)或氰基(羟基亚氨基)乙酸酯或N-烃取代咪唑衍生物溶解或悬浮于水、缓冲液或有机溶剂等溶液中进行添加的情况下，溶剂总量包括包含脱水缩合剂或N-羟基含氮芳香族化合物(例如羟基苯并三唑或其衍生物)或氰基(羟基亚氨基)乙酸酯或N-烃取代咪唑衍生物的溶液的量。另外，在混合溶剂中的有机溶剂的比率的计算中，在将脱水缩合剂或N-羟基含氮芳香族化合物(例如羟基苯并三唑或其衍生物)、氰基(羟基亚氨基)乙酸酯、或N-烃取代咪唑衍生物溶解或悬浮于有机溶剂中进行添加的情况下，该有机溶剂的量应包括在混合溶剂中的有机溶剂的总量中。
在亲水性有机溶剂为DMSO的情况下，混合溶剂中的DMSO的比率优选为溶剂总量的20～65体积％、优选为35～60体积％、更优选为50～55或50～60体积％。在亲水性有机溶剂为DMSO、脱水缩合剂为包含N-羟基含氮芳香环结构的脲鎓型脱水缩合剂、例如HATU等苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂的情况下，混合溶剂中的DMSO的比率优选为溶剂总量的35～65体积％、更优选为50～65体积％，例如可为50～60体积％。在亲水性有机溶剂为DMSO、脱水缩合剂为三嗪型脱水缩合剂、例如DMT-MM等三嗪型季吗啉鎓衍生物的情况下，混合溶剂中的DMSO的比率优选为溶剂总量的35～65体积％、更优选为35～60体积％，例如可为50～60体积％、或50～55体积％。这些情况下，反应溶剂(混合溶剂)的pH不限于以下，但优选为6.5～7.5、更优选为6.9～7.5，例如可为6.5～7.0、6.9～7.1、或7.0～7.5。
在亲水性有机溶剂为DMF的情况下，混合溶剂中的DMF的比率优选为溶剂总量的20～65体积％、优选为35～65体积％、更优选为50～65体积％。在亲水性有机溶剂为DMF、脱水缩合剂为包含N-羟基含氮芳香环结构的脲鎓型脱水缩合剂、例如HATU等苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂的情况下，混合溶剂中的DMF的比率优选为溶剂总量的35～65体积％、更优选为50～65体积％，例如可为50～60体积％。这些情况下，反应溶剂(混合溶剂)的pH不限于以下，但优选为6.5～7.5、更优选为6.9～7.5，例如可为6.5～7.0、6.9～7.1、或7.0～7.5。
在亲水性有机溶剂为DMEU的情况下，混合溶剂中的DMEU的比率优选为溶剂总量的20～65体积％、优选为35～65体积％、更优选为50～60体积％。在亲水性有机溶剂为DMEU、脱水缩合剂为包含N-羟基含氮芳香环结构的脲鎓型脱水缩合剂、例如HATU等苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂的情况下，混合溶剂中的DMEU的比率优选为溶剂总量的35～65体积％、更优选为50～65体积％，例如可为50～60体积％。这些情况下，反应溶剂(混合溶剂)的pH不限于以下，但优选为6.5～7.5、更优选为6.9～7.5，例如可为6.5～7.0、6.9～7.1、或7.0～7.5。
在亲水性有机溶剂为乙腈的情况下，混合溶剂中的乙腈的比率优选为溶剂总量的20～65体积％、优选为35～65体积％、更优选为50～65体积％。在亲水性有机溶剂为乙腈、脱水缩合剂为包含N-羟基含氮芳香环结构的脲鎓型脱水缩合剂、例如HATU等苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂的情况下，混合溶剂中的乙腈的比率优选为溶剂总量的35～65体积％、更优选为50～65体积％，例如可为50～60体积％。这些情况下，反应溶剂(混合溶剂)的pH不限于以下，但优选为6.5～7.5、更优选为6.9～7.5，例如可为6.5～7.0、6.9～7.1、或7.0～7.5。
对缓冲液和亲水性有机溶剂的添加顺序没有特别限制，可将第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子溶解于缓冲液中之后再加入亲水性有机溶剂，或者可将第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子添加到亲水性有机溶剂中之后再加入缓冲液。或者，还可将预先混合有缓冲液和亲水性有机溶剂的溶剂与第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子进行混合。通常，优选将第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子溶解于缓冲液中之后再加入亲水性有机溶剂。
将第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子溶解于缓冲液中之后，可静置一定时间(例如，1～15分钟)、也可不静置而直接添加亲水性有机溶剂。另外，可在缓冲液中进行第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的热变性(例如，在90℃以上的温度下进行加热之后，再冷却至室温)，也可不进行。
作为本发明的制备方法中使用的脱水缩合剂，可使用(i)三嗪型脱水缩合剂、(ii)包含N-羟基含氮芳环结构的脲鎓型脱水缩合剂(例如苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂)、(iii)碳二亚胺型脱水缩合剂、(iv) 2-卤代吡啶鎓型脱水缩合剂、或(v)甲脒鎓型脱水缩合剂。在使用(iii)碳二亚胺型脱水缩合剂作为脱水缩合剂的情况下，可将碳二亚胺型脱水缩合剂与N-羟基含氮芳香族化合物(例如羟基苯并三唑或其衍生物)或氰基(羟基亚氨基)乙酸酯组合使用，在使用(iv)2-卤代吡啶鎓型脱水缩合剂的情况下，可将2-卤代吡啶鎓型脱水缩合剂与N-羟基含氮芳香族化合物组合使用，在使用(v)甲脒鎓型脱水缩合剂的情况下，可将甲脒鎓型脱水缩合剂与N-羟基含氮芳香族化合物或N-烃取代咪唑衍生物组合使用。在本发明的制备方法中，适合使用经由N-酰氧基含氮芳香族化合物型活性中间体(例如苯并三唑基型活性中间体)、氰基(酰氧基亚氨基)乙酸酯型活性中间体或N'-酰基-N-烃取代咪唑型活性中间体而引起酰胺化的反应条件。脱水缩合剂可以是游离体或盐的形态，优选为盐的形态。
在一个实施方式中，本发明的制备方法可满足以下(i)～(iv)中的至少一个或它们的任意的组合(例如，全部)的条件：
(i) 使用包含N-羟基含氮芳香环结构的脲鎓型脱水缩合剂，其为苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂，
(ii) 使用N-羟基含氮芳香族化合物，其为羟基苯并三唑或其衍生物，
(iii) 使用氰基(羟基亚氨基)乙酸酯，其为氰基(羟基亚氨基)乙酸烷基酯，
(iv) 使用N-烃取代咪唑衍生物，其为N-烷基咪唑衍生物。
三嗪型脱水缩合剂是指，具有三嗪的至少1个碳原子被季铵或卤素等可脱离的官能团取代而得的结构的化合物(例如游离体或盐)。作为三嗪型脱水缩合剂，例如可使用文献(Kunishima等人、Tetrahedron、2001年，第57卷、1551-1558页；Kunishima等人、Chemistry A European Journal、2012年、第18卷、15856-15867页；日本专利第4349749号说明书、日本特开2008-214473号公报、日本特开2016-141618号公报、日本特开2016-141619号公报、日本特开2017-149876号公报等)中记载的脱水缩合剂。更具体而言，三嗪型脱水缩合剂是三嗪型季吗啉鎓，例如可举出：4-[4,6-双(2,6-二甲苯基)-1,3,5-三嗪-2-基]-4-甲基吗啉鎓、4-[4-甲氧基-6-(2,6-二甲苯基)-1,3,5-三嗪-2-基]-4-甲基吗啉鎓、4-(4-叔丁基-6-甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)4-甲氧基吗啉鎓、4-(4,6-二-叔丁基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓、N-[4-甲氧基-6-(N'-苯基乙酰胺)-1,3,5-三嗪-2-基]-4-甲基吗啉鎓、N-[4-甲氧基-6-(N'-甲基乙酰胺)-1,3,5-三嗪-2-基]-4-甲基吗啉鎓、N-[4-甲氧基-6-(N'-苯基苯甲酰胺)-1,3,5-三嗪-2-基]-4-甲基吗啉鎓、N-[4-甲氧基-6-(N'-甲基苯甲酰胺)-1,3,5-三嗪-2-基]-4-甲基吗啉鎓、N-[4-甲氧基-6-(2,5-二氧代吡咯基)-1,3,5-三嗪-2-基]-4-甲基吗啉鎓、N-[4-甲氧基-6-(2-哌啶酮-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基]-4-甲基吗啉鎓、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓、和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓、以及其衍生物。作为衍生物的实例，可举出：高氯酸盐、三氟甲磺酸盐、氯化物、六氟磷酸盐等盐。三嗪型脱水缩合剂例如可为4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓盐。
作为三嗪型脱水缩合剂即三嗪型季吗啉鎓衍生物，例如优选4-[4,6-双(2,6-二甲苯基)-1,3,5-三嗪-2-基]-4-甲基吗啉鎓高氯酸盐、4-[4-甲氧基-6-(2,6-二甲苯基)-1,3,5-三嗪-2-基]-4-甲基吗啉鎓高氯酸盐、4-(4-叔丁基-6-甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)4-甲氧基吗啉鎓三氟甲磺酸盐、4-(4,6-二-叔丁基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物、N-[4-甲氧基-6-(N'-苯基乙酰胺)-1,3,5-三嗪-2-基]-4-甲基吗啉鎓高氯酸盐、N-[4-甲氧基-6-(N'-甲基乙酰胺)-1,3,5-三嗪-2-基]-4-甲基吗啉鎓高氯酸盐、N-[4-甲氧基-6-(N'-苯基苯甲酰胺)-1,3,5-三嗪-2-基]-4-甲基吗啉鎓氯化物、N-[4-甲氧基-6-(N'-甲基苯甲酰胺)-1,3,5-三嗪-2-基]-4-甲基吗啉鎓氯化物、N-[4-甲氧基-6-(2,5-二氧代吡咯基)-1,3,5-三嗪-2-基]-4-甲基吗啉鎓氯化物、N-[4-甲氧基-6-(2-哌啶酮-1-基)-1,3,5-三嗪-2-基]-4-甲基吗啉鎓氯化物、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓三氟甲磺酸盐等，更优选4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(以下，DMT-MM)。
作为三嗪型脱水缩合剂的当量，相对于第1单链寡RNA分子，优选10～100当量、更优选20～40当量。
包含N-羟基含氮芳香环结构的脲鎓型脱水缩合剂是指，在N-羟基含氮芳香环结构中加成四烷基脒鎓结构而得的化合物。作为包含N-羟基含氮芳香环结构的脲鎓型脱水缩合剂，例如优选苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂(包含1-羟基苯并三唑结构的脲鎓型脱水缩合剂)、包含N-羟基-2-吡啶酮结构的脲鎓型脱水缩合剂、包含3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪结构的脲鎓型脱水缩合剂、包含N-羟基咪唑结构的脲鎓型脱水缩合剂、或包含N-羟基吡啶结构的脲鎓型脱水缩合剂等，更优选苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂、包含N-羟基-2-吡啶酮结构的脲鎓型脱水缩合剂、或包含3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪结构的脲鎓型脱水缩合剂，更优选苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂、或包含3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪结构的脲鎓型脱水缩合剂。
苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂是指，在1-羟基苯并三唑结构上加成四烷基脒鎓结构而得的化合物。脒鎓结构的二个氮原子上的4个取代基只要不阻碍酰胺化反应，则没有特别限制，可与氮原子一起形成环。上述1-羟基苯并三唑结构只要不阻碍酰胺化反应，则没有特别限制，可在苯环上具有取代基，或者苯环中的一部分碳原子可取代成氮原子。
在文献(Carpino等人., Angewandte Chemie International Edition、2002年、第41卷、441-445页)中已知苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂通常采取O-酰基型(脲鎓型)和N-酰基型(胺鎓型)的2种形式，本发明中，“苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂”包含O-酰基型(脲鎓型)和N-酰基型(胺鎓型)的两种形式。
[化学式35]
Figure 893350DEST_PATH_IMAGE037
作为苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂，例如可使用文献(Knorr等人、TetrahedronLetters、1989年、第30卷、927-1930页；Carpino等人、Organic Letters、2001年、第3卷、2793-2795页；El-Faham等人、The Journal of Organic Chemistry、2008年、第73卷、2731-2737页；国际公开第1994/007910号、国际公开第2002/094822号等)中记载的脱水缩合剂。更具体而言，苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂可举出：苯并三唑基脲鎓，例如O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓、[(苯并三唑-1-基氧基)哌啶-1-基亚甲基]哌啶鎓等、以及其衍生物；或者，氮杂苯并三唑基脲鎓，例如O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四乙基脲鎓、[(7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)-4-吗啉代亚甲基]二甲基铵、[(7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)哌啶-1-基亚甲基]哌啶鎓、[(7-氮杂苯并三唑-1-基氧基)吡咯烷-1-基亚甲基]吡咯烷鎓等、以及其衍生物。作为衍生物的实例，可举出：高氯酸盐、三氟甲磺酸盐、氯化物、六氟磷酸盐等盐。苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂例如可以是O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓盐或O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓盐。
作为苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂的优选实例，可举出：O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐或O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(以下，HATU)。
包含N-羟基-2-吡啶酮结构的脲鎓型脱水缩合剂是指，在N-羟基-2-吡啶酮结构上加成四烷基脒鎓结构而得的化合物。脒鎓结构的二个氮原子上的4个取代基只要不阻碍酰胺化反应，则没有特别限制，可与氮原子一起形成环。上述N-羟基-2-吡啶酮结构只要不阻碍酰胺化反应，则没有特别限制，在吡啶酮环上可具有取代基。作为包含N-羟基-2-吡啶酮结构的脲鎓型脱水缩合剂，例如可举出：O-(1,2-二氢-2-氧代-1-吡啶基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓、O-(1,2-二氢-2-氧代-1-吡啶基)-N,N,N',N'-双(四亚甲基)脲鎓、和O-(1,2-二氢-2-氧代-1-吡啶基)-N,N,N',N'-双(五亚甲基)脲鎓等、以及其衍生物。作为衍生物的实例，可举出：氯化物、溴化物、碘化物、高氯酸盐、三氟甲磺酸盐、四氟硼酸盐、六氟磷酸盐等盐。包含N-羟基-2-吡啶酮结构的脲鎓型脱水缩合剂可以是O-(1,2-二氢-2-氧代-1-吡啶基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓盐。
作为包含N-羟基-2-吡啶酮结构的脲鎓型脱水缩合剂的优选实例，可举出：O-(1,2-二氢-2-氧代-1-吡啶基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(以下，TPTU)。
包含3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪结构的脲鎓型脱水缩合剂是指，在3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪结构上加成四烷基脒鎓结构而得的化合物。脒鎓结构的二个氮原子上的4个取代基只要不阻碍酰胺化反应，则没有特别限制，可与氮原子一起形成环。上述3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪结构只要不阻碍酰胺化反应，则没有特别限制，在4-氧代-1,2,3-苯并三嗪环上可具有取代基。作为包含3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪结构的脲鎓型脱水缩合剂，例如可举出：O-(3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪-3-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓、O-(3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪-3-基)-N,N,N',N'-双(四亚甲基)脲鎓、O-(3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪-3-基)-N,N,N',N'-双(五亚甲基)脲鎓等、以及其衍生物。作为衍生物的实例，可举出：氯化物、溴化物、碘化物、高氯酸盐、三氟甲磺酸盐、四氟硼酸盐、六氟磷酸盐等盐。包含3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪结构的脲鎓型脱水缩合剂可以是O-(3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪-3-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓盐。
作为包含3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪结构的脲鎓型脱水缩合剂的优选实例，可举出：O-(3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪-3-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓四氟硼酸盐(以下，TDBTU)。
包含N-羟基咪唑结构的脲鎓型脱水缩合剂是指，在N-羟基咪唑结构上加成四烷基脒鎓结构而得的化合物。脒鎓结构的二个氮原子上的4个取代基只要不阻碍酰胺化反应，则没有特别限制，可与氮原子一起形成环。上述N-羟基咪唑结构只要不阻碍酰胺化反应，则没有特别限制，在N-羟基咪唑环上可具有取代基。作为包含N-羟基咪唑结构的脲鎓型脱水缩合剂，例如可举出：O-(咪唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓、O-(咪唑-1-基)-N,N,N',N'-双(四亚甲基)脲鎓、O-(咪唑-1-基)-N,N,N',N'-双(五亚甲基)脲鎓等、以及其衍生物。作为衍生物的实例，可举出：氯化物、溴化物、碘化物、高氯酸盐、三氟甲磺酸盐、四氟硼酸盐、六氟磷酸盐等盐。包含N-羟基咪唑结构的脲鎓型脱水缩合剂可以是O-(咪唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓盐。
作为包含N-羟基咪唑结构的脲鎓型脱水缩合剂的优选实例，可举出：O-(咪唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐。
包含N-羟基吡啶结构的脲鎓型脱水缩合剂是指，在N-羟基吡啶结构上加成四烷基脒鎓结构而得的化合物。脒鎓结构的二个氮原子上的4个取代基只要不阻碍酰胺化反应，则没有特别限制，可与氮原子一起形成环。上述N-羟基吡啶结构只要不阻碍酰胺化反应，则没有特别限制，在N-羟基吡啶环上可具有取代基。作为包含N-羟基吡啶结构的脲鎓型脱水缩合剂，例如可举出：O-吡啶基-N,N,N',N'-四甲基脲鎓、O-吡啶基-N,N,N',N'-双(四亚甲基)脲鎓、O-吡啶基-N,N,N',N'-双(五亚甲基)脲鎓、O-(4-二甲基氨基-吡啶基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓、O-(4-二甲基氨基-吡啶基)-N,N,N',N'-双(四亚甲基)脲鎓、O-(4-二甲基氨基-吡啶基)-N,N,N',N'-双(五亚甲基)脲鎓等、以及其衍生物。作为衍生物的实例，可举出：氯化物、溴化物、碘化物、高氯酸盐、三氟甲磺酸盐、四氟硼酸盐、六氟磷酸盐等盐。包含N-羟基吡啶结构的脲鎓型脱水缩合剂可以是O-吡啶基-N,N,N',N'-四甲基脲鎓盐或O-4-二甲基氨基-吡啶基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓盐。
作为包含N-羟基吡啶结构的脲鎓型脱水缩合剂的优选实例，可举出：O-(4-二甲基氨基-吡啶基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐。
作为包含N-羟基含氮芳香环结构的脲鎓型脱水缩合剂(例如苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂)的当量，相对于第1单链寡RNA分子，优选10～100当量、更优选20～40当量。
碳二亚胺型脱水缩合剂是指，具有N＝C＝N所表示的碳二亚胺结构的化合物。N上的取代基只要不阻碍酰胺化反应，则没有特别限制。作为碳二亚胺型脱水缩合剂，例如可使用：N,N'-二甲基碳二亚胺、N,N'-二乙基碳二亚胺、N,N'-二丙基碳二亚胺、N,N'-二异丙基碳二亚胺、N-叔丁基-N'-甲基碳二亚胺、N,N'-二环己基碳二亚胺、N-苄基-N'-甲基碳二亚胺、N-苄基-N'-乙基碳二亚胺、N-苄基-N'-丙基碳二亚胺、N-(3’-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺、N,N'-双(3’-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、3-(乙基亚氨基次甲基氨基)丙基三甲基铵、3-(异丙基亚氨基次甲基氨基)丙基三甲基铵等碳二亚胺衍生物、以及其盐(包含酸加成盐)。作为盐的实例，可举出：高氯酸盐、三氟甲磺酸盐、氯化物、六氟磷酸盐、盐酸盐、溴酸盐、三氟甲磺酸盐、高氯酸盐等。更优选包含叔胺结构或季铵结构的碳二亚胺衍生物，例如可举出：N-(3’-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺及其酸加成盐等盐、N,N'-双(3’-二甲基氨基丙基)碳二亚胺及其酸加成盐等盐、3-(乙基亚氨基次甲基氨基)丙基三甲基铵盐、3-(异丙基亚氨基次甲基氨基)丙基三甲基铵盐。特别优选的碳二亚胺型脱水缩合剂的实例为N-(3’-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐(以下，EDCI盐酸盐)。
作为N-羟基含氮芳香族化合物，例如优选：羟基苯并三唑或其衍生物、N-羟基三唑或其衍生物、N-羟基苯并咪唑或其衍生物、N-羟基咪唑或其衍生物、N-羟基-2-吡啶酮或其衍生物、3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪或其衍生物、或N-羟基吡啶或其衍生物，更优选羟基苯并三唑或其衍生物、N-羟基三唑或其衍生物、N-羟基-2-吡啶酮或其衍生物、3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪或其衍生物、或N-羟基吡啶或其衍生物。
羟基苯并三唑或其衍生物只要不阻碍酰胺化反应，则没有特别限制，可在苯环上具有取代基，或者苯环中的一部分碳原子可取代成氮原子。作为羟基苯并三唑或其衍生物，可使用1-羟基苯并三唑、1-羟基-6-氯-苯并三唑、1-羟基-6-三氟甲基苯并三唑、1-羟基-4-硝基-6-三氟甲基苯并三唑、1-羟基-7-氮杂苯并三唑、1-羟基-4-甲基-7-氮杂苯并三唑、1-羟基-4-甲氧基-7-氮杂苯并三唑、1-羟基-4-叔丁基-7-氮杂苯并三唑、1-羟基-4,5,6-三甲基-7-氮杂苯并三唑、1-羟基-6-氮杂苯并三唑、1-羟基-5-氮杂苯并三唑或1-羟基-4-氮杂苯并三唑等，优选为1-羟基-7-氮杂苯并三唑、1-羟基-4-甲基-7-氮杂苯并三唑、1-羟基-4-甲氧基-7-氮杂苯并三唑、1-羟基-4-叔丁基-7-氮杂苯并三唑、1-羟基-4,5,6-三甲基-7-氮杂苯并三唑、1-羟基-6-氮杂苯并三唑、1-羟基-5-氮杂苯并三唑或1-羟基-4-氮杂苯并三唑等羟基氮杂苯并三唑或其衍生物，更优选为1-羟基-7-氮杂苯并三唑(以下，HOAt)。
N-羟基三唑或其衍生物只要不阻碍酰胺化反应，则没有特别限制，可在三唑环的4或5位上具有取代基。N-羟基三唑或其衍生物，例如可举出：1-羟基-1,2,3-三唑-4-甲酸乙酯。
N-羟基苯并咪唑或其衍生物只要不阻碍酰胺化反应，则没有特别限制，可在苯环上具有取代基，或者苯环中的一部分碳原子可取代成氮原子。N-羟基苯并咪唑或其衍生物，例如可举出：N-羟基苯并咪唑、N-羟基-7-氮杂苯并咪唑。
N-羟基咪唑或其衍生物只要不阻碍酰胺化反应，则没有特别限制，可在咪唑环上具有取代基。N-羟基咪唑或其衍生物，例如可举出：N-羟基咪唑。
N-羟基-2-吡啶酮或其衍生物只要不阻碍酰胺化反应，则没有特别限制，可在吡啶酮环的3～6位上具有取代基。N-羟基-2-吡啶酮或其衍生物，例如可举出：N-羟基-2-吡啶酮(以下，HOPO)。
3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪或其衍生物只要不阻碍酰胺化反应，则没有特别限制，可在苯环上具有取代基。3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪或其衍生物，例如可举出：3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪、7-氯-3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪、3,4-二氢-3-羟基-7-硝基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪、3,4-二氢-3-羟基-6,7-二甲氧基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪。
N-羟基吡啶或其衍生物只要不阻碍酰胺化反应，则没有特别限制，可在吡啶环上具有取代基。N-羟基吡啶或其衍生物，例如可举出：N-羟基吡啶、4-(二甲基氨基)吡啶-N-氧化物。
氰基(羟基亚氨基)乙酸酯可具有不阻碍酰胺化反应的取代基作为酯基。作为氰基(羟基亚氨基)乙酸酯，例如可举出：氰基(羟基亚氨基)乙酸烷基酯、氰基(羟基亚氨基)乙酸芳基酯。
在氰基(羟基亚氨基)乙酸烷基酯中，烷基酯基部分可为直链状、支链状、环状的任一者，优选为碳数1～10的烷基。作为氰基(羟基亚氨基)乙酸烷基酯，例如为氰基(羟基亚氨基)乙酸甲酯、氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯、氰基(羟基亚氨基)乙酸丙酯、氰基(羟基亚氨基)乙酸叔丁酯、氰基(羟基亚氨基)乙酸苄酯、氰基(羟基亚氨基)乙酸环己酯、氰基(羟基亚氨基)乙酸(2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊烷-4-基)甲酯，更优选为氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯。
在氰基(羟基亚氨基)乙酸芳基酯中，芳基酯基部分可在苯环上具有取代基，或者苯环中的一部分碳原子可取代成氮原子。作为氰基(羟基亚氨基)乙酸芳基酯，例如可举出：氰基(羟基亚氨基)乙酸苯酯、氰基(羟基亚氨基)乙酸-1-萘酯。
作为碳二亚胺型脱水缩合剂的当量，相对于第1单链寡RNA分子，优选10～100当量、更优选20～40当量。另外，作为N-羟基含氮芳香族化合物(例如羟基苯并三唑或其衍生物)或氰基(羟基亚氨基)乙酸酯的当量，相对于各自的第1单链寡RNA分子，优选10～100当量、更优选20～40当量。
2-卤代吡啶鎓型脱水缩合剂是指，在吡啶环上的氮原子上具有烃取代基的吡啶鎓盐，且在吡啶环的2位上具有卤素的化合物。上述吡啶环可在吡啶环的3～6位上具有取代基。上述氮原子上的烃取代基和吡啶环的3～6位上的取代基只要不阻碍酰胺化反应，则没有特别限制。作为2-卤代吡啶鎓型脱水缩合剂，例如可举出：2-氯-1-甲基吡啶鎓、2-溴-1-甲基吡啶鎓、2-氟-1-甲基吡啶鎓、2-氯-1-乙基吡啶鎓、2-溴-1-乙基吡啶鎓、2-氟-1-乙基吡啶鎓、2-氟-1,3-二甲基吡啶鎓、2-氯-1-甲基喹啉鎓、2-碘-1-甲基喹啉鎓、2-氯-1-(2-氧代-2-苯乙基)吡啶鎓、2-溴-1-(2-氧代-2-苯乙基)吡啶鎓、2-氯-1-[2-(3-硝基苯基)-2-氧代乙基]吡啶鎓、2-氯-1-[2-(4-氟苯基)-2-氧代乙基]吡啶鎓、2-氯-1-[2-(4-氯苯基)-2-氧代乙基]吡啶鎓、2-溴-1-[2-(4-联苯基)-2-氧代乙基]吡啶鎓、2-溴-1-[2-(3-硝基苯基)-2-氧代乙基]吡啶鎓、2-溴-1-[2-(4-甲氧基苯基)-2-氧代乙基]吡啶鎓、2-氯-1-苄基吡啶鎓、2-碘-1-乙基-6-甲氧基喹啉鎓等、以及其衍生物。作为衍生物的实例，可举出：氯化物、溴化物、碘化物、高氯酸盐、三氟甲磺酸盐、四氟硼酸盐、六氟磷酸盐等盐。2-卤代吡啶鎓型脱水缩合剂可以是2-氯-1-甲基吡啶鎓盐。
作为2-卤代吡啶鎓型脱水缩合剂的优选实例，可举出：2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物。
作为2-卤代吡啶鎓型脱水缩合剂的当量，相对于第1单链寡RNA分子，优选10～100当量、更优选20～40当量。另外，作为N-羟基含氮芳香族化合物(例如羟基苯并三唑或其衍生物)的当量，相对于第1单链寡RNA分子，优选10～100当量、更优选20～40当量。
甲脒鎓型脱水缩合剂的二个氮原子上的4个取代基只要不阻碍酰胺化反应，则没有特别限制，可与氮原子一起形成环。作为甲脒鎓型脱水缩合剂，可举出：氯-N,N,N',N'-四甲基甲脒鎓、2-氯-1,3-二甲基咪唑啉鎓、氯-N,N,N',N'-双(四亚甲基)甲脒鎓、氯-N,N,N',N'-双(五亚甲基)甲脒鎓、2-氯-1,3-二甲基-4,5-二氢嘧啶鎓、氟-N,N,N',N'-四甲基甲脒鎓、2-氟-1,3-二甲基咪唑啉鎓、氟-N,N,N',N'-双(四亚甲基)甲脒鎓等、以及其衍生物。作为衍生物的实例，可举出：氯化物、溴化物、碘化物、高氯酸盐、三氟甲磺酸盐、四氟硼酸盐、六氟磷酸盐等盐。甲脒鎓型脱水缩合剂可以是氯-N,N,N',N'-四甲基甲脒鎓盐。
作为甲脒鎓型脱水缩合剂的优选实例，可举出：氯-N,N,N',N'-四甲基甲脒鎓六氟磷酸盐(以下，TCFH)。
N-烃取代咪唑衍生物是指，在咪唑结构的氮原子上具有烃取代基的化合物。上述咪唑结构可在咪唑环的2位、4位或5位上具有取代基。上述烃取代基和咪唑环的2位、4位或5位上的取代基只要不阻碍酰胺化反应，则没有特别限制。作为N-烃取代咪唑衍生物，例如可举出：N-烷基咪唑衍生物、N-芳基咪唑衍生物。
N-烷基咪唑衍生物只要不阻碍酰胺化反应，则没有特别限制，可在咪唑环上具有取代基。作为N-烷基咪唑衍生物，例如可举出：N-甲基咪唑(以下，NMI)、1,2-二甲基咪唑。
N-芳基咪唑衍生物只要不阻碍酰胺化反应，则没有特别限制，可在咪唑环上具有取代基。作为N-芳基咪唑衍生物，例如可举出：N-苯基咪唑、1-苯基-2-甲基咪唑。
作为甲脒鎓型脱水缩合剂的当量，相对于第1单链寡RNA分子，优选10～100当量、更优选20～40当量。另外，作为N-羟基含氮芳香族化合物(例如羟基苯并三唑或其衍生物)或N-烃取代咪唑衍生物的当量，相对于各自的第1单链寡RNA分子，优选10～100当量、更优选20～40当量。
上述脱水缩合剂以及上述N-羟基含氮芳香族化合物、上述氰基(羟基亚氨基)乙酸酯和上述N-烃取代咪唑衍生物可使用市售品，也可利用公知的方法或基于其的方法进行合成。
在一个实施方式中，相对于第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子，可以以固体形式添加脱水缩合剂，具体而言，可以以固体形式添加三嗪型脱水缩合剂、包含N-羟基含氮芳香环结构的脲鎓型脱水缩合剂(例如苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂)、碳二亚胺型脱水缩合剂、2-卤代吡啶鎓型脱水缩合剂或甲脒鎓型脱水缩合剂，也可溶解或悬浮于水、缓冲液、亲水性有机溶剂或它们的混合溶剂等溶液中进行添加。在将碳二亚胺型脱水缩合剂与N-羟基含氮芳香族化合物(例如羟基苯并三唑或其衍生物)或氰基(羟基亚氨基)乙酸酯组合使用的情况下，可预先添加碳二亚胺型脱水缩合剂和N-羟基含氮芳香族化合物(例如羟基苯并三唑或其衍生物)或氰基(羟基亚氨基)乙酸酯的任一者，也可同时添加两者。在将2-卤代吡啶鎓型脱水缩合剂与N-羟基含氮芳香族化合物组合使用的情况下，可预先添加2-卤代吡啶鎓型脱水缩合剂和N-羟基含氮芳香族化合物的任一者，也可同时添加两者。在将甲脒鎓型脱水缩合剂与N-羟基含氮芳香族化合物或N-烃取代咪唑衍生物组合使用的情况下，可预先添加甲脒鎓型脱水缩合剂和N-羟基含氮芳香族化合物或N-烃取代咪唑衍生物的任一者，也可同时添加两者。
另外，可相对于脱水缩合剂，具体而言，可相对于三嗪型脱水缩合剂、包含N-羟基含氮芳香环结构的脲鎓型脱水缩合剂(例如苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂)、碳二亚胺型脱水缩合剂、2-卤代吡啶鎓型脱水缩合剂或甲脒鎓型脱水缩合剂，添加第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子。此时，可预先添加第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的任一者，也可同时添加两者。可以以固体形式添加第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子，也可溶解或悬浮于水、缓冲液、亲水性有机溶剂或它们的混合溶剂等中进行添加，通常，优选在第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的溶液中加入脱水缩合剂。在将碳二亚胺型脱水缩合剂与N-羟基含氮芳香族化合物或氰基(羟基亚氨基)乙酸酯组合使用的情况下，也可相对于碳二亚胺型脱水缩合剂和N-羟基含氮芳香族化合物或氰基(羟基亚氨基)乙酸酯，添加第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子。此时，可预先添加第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的任一者，也可同时添加两者。可以以固体形式添加第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子，也可溶解或悬浮于水、缓冲液、亲水性有机溶剂或它们的混合溶剂等中进行添加，通常，优选在第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的溶液中加入脱水缩合剂。在将2-卤代吡啶鎓型脱水缩合剂与N-羟基含氮芳香族化合物组合使用的情况下，也可相对于2-卤代吡啶鎓型脱水缩合剂和N-羟基含氮芳香族化合物，添加第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子。此时，可预先添加第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的任一者，也可同时添加两者。可以以固体形式添加第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子，也可溶解或悬浮于水、缓冲液、亲水性有机溶剂或它们的混合溶剂等中进行添加，通常，优选在第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的溶液中加入脱水缩合剂。在将甲脒鎓型脱水缩合剂与N-羟基含氮芳香族化合物或N-烃取代咪唑衍生物组合使用的情况下，也可相对于甲脒鎓型脱水缩合剂和N-羟基含氮芳香族化合物或N-烃取代咪唑衍生物，添加第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子。此时，可预先添加第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的任一者，也可同时添加两者。可以以固体形式添加第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子，也可溶解或悬浮于水、缓冲液、亲水性有机溶剂或它们的混合溶剂等中进行添加，通常，优选在第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的溶液中加入脱水缩合剂。
本发明中，作为脱水缩合剂，优选4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓盐、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基脲鎓盐、N-(3’-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺或其盐、2-氯-1-甲基吡啶鎓盐或氯-N,N,N’,N’-四甲基甲脒鎓盐，更优选4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、N-(3’-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐、2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物、或氯-N,N,N’,N’-四甲基甲脒鎓六氟磷酸盐。
作为与作为脱水缩合剂的碳二亚胺型脱水缩合剂或2-卤代吡啶鎓型脱水缩合剂或甲脒鎓型脱水缩合剂一同使用的N-羟基含氮芳香族化合物，优选羟基苯并三唑或其衍生物，更优选羟基氮杂苯并三唑或其衍生物，更优选1-羟基-7-氮杂苯并三唑。
作为与作为脱水缩合剂的碳二亚胺型脱水缩合剂一同使用的氰基(羟基亚氨基)乙酸酯，优选氰基(羟基亚氨基)乙酸烷基酯，更优选氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯。
作为与作为脱水缩合剂的甲脒鎓型脱水缩合剂一同使用的N-烃取代咪唑衍生物，优选N-烷基咪唑衍生物，更优选N-甲基咪唑。
本发明中，脱水缩合剂只要至少包括三嗪型脱水缩合剂、包含N-羟基含氮芳香环结构的脲鎓型脱水缩合剂(例如苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂)、碳二亚胺型脱水缩合剂、2-卤代吡啶鎓型脱水缩合剂或甲脒鎓型脱水缩合剂即可，也可将2种以上混合。本发明中，在将脱水缩合剂或N-羟基含氮芳香族化合物(例如羟基苯并三唑或其衍生物)或氰基(羟基亚氨基)乙酸酯或N-烃取代咪唑衍生物溶解或悬浮于水、缓冲液或亲水性有机溶剂等溶液中进行添加的情况下，包含脱水缩合剂或N-羟基含氮芳香族化合物(例如羟基苯并三唑或其衍生物)或氰基(羟基亚氨基)乙酸酯或N-烃取代咪唑衍生物的溶液，构成反应溶剂(混合溶剂)的一部分。
上述脱水缩合剂的优选方案、上述N-羟基含氮芳香族化合物(例如羟基苯并三唑或其衍生物)、氰基(羟基亚氨基)乙酸酯或N-烃取代咪唑衍生物的优选方案、上述亲水性有机溶剂的优选方案，可任意地组合。例如可举出：DMT-MM与DMSO的组合、HATU与DMSO的组合、HATU与DMF的组合、EDCI盐酸盐与HOAt与DMSO的组合、EDCI盐酸盐与氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯与DMSO的组合、2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物与HOAt与DMSO的组合、氯-N,N,N’,N’-四甲基甲脒鎓六氟磷酸盐与HOAt与DMSO的组合、氯-N,N,N’,N’-四甲基甲脒鎓六氟磷酸盐与N-甲基咪唑与DMSO的组合，特别优选的组合方案可举出：HATU与DMSO的组合、HATU与DMF的组合、EDCI盐酸盐与HOAt与DMSO的组合、氯-N,N,N’,N’-四甲基甲脒鎓六氟磷酸盐与HOAt与DMSO的组合。
反应溶剂(混合溶剂)的pH可适当调节，但优选为6.5～7.5、更优选为6.9～7.5，例如为6.5～7.0、6.9～7.1、或7.0～7.5。
用于第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子的反应(酰胺化反应)的时间可适当设定，但代表性的是1小时以上，例如可以是1～48小时、或1～24小时。
在一个实施方式中，可将第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子以等摩尔量进行混合。本发明中，“以等摩尔量进行混合”是指，将第1单链寡RNA分子和第2单链寡RNA分子以1：1.1～1.1：1的摩尔比进行混合。在酰胺化反应液(反应溶剂)中形成的本发明所涉及的包含基因表达抑制序列的发夹型单链RNA分子，可通过本领域技术人员所公知的方法进行纯化。作为纯化技术，可举出：反相层析、反相高效液相层析(RP-HPLC)、超高效液相层析(UHPLC)、离子交换层析等层析法、凝胶过滤、柱纯化、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)等、或它们的任意组合，但不限于这些。
在专利文献2所记载的方法中，由于因在极短链时延伸反应停止所致的短链核酸杂质或缺损体等核酸杂质的生成，而引起反应液中的目标产物的纯度降低。另一方面，本发明的方法在可减少核酸杂质的角度是有利的。在优选的实施方式中，本发明的方法可制备减少核酸杂质的生成，同时使用通用型RNA Amidite而稳定性高的基因表达抑制性单链RNA分子。
通过本发明的方法制备的发夹型单链RNA分子，可通过常规方法，给予至活体内或细胞内，由此用于抑制靶基因的表达。
需要说明的是，本发明中的上述的优选方案、例如第1单链寡RNA分子、第2单链寡RNA分子、缓冲液、有机溶剂、脱水缩合剂、pH、有机溶剂的比率、反应时间、使用量、其他的反应条件等可任意地组合。
本发明提供单链寡RNA分子，其可用作按照本发明的方法用于制备发夹型单链RNA分子的第2单链寡RNA分子。
在一个实施方式中，作为用于制备抑制作为靶基因的TGF-β1基因或GAPDH基因的表达的发夹型单链RNA分子的单链寡RNA分子的实例，可举出：下述(a)或(b)，但不限于这些：
(a) 由SEQ ID NO: 3所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第1位的核糖核苷酸残基与Lx2进行连接、第26位和第27位的核糖核苷酸残基经由Ly进行连接；
(b) 由SEQ ID NO: 6所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第1位的核糖核苷酸残基与Lx2进行连接、第26位和第27位的核糖核苷酸残基经由Ly进行连接。
而且，本发明还涉及用于抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的制备用试剂盒，该试剂盒包含本发明所涉及的单链寡RNA分子的组合(对)。这样的试剂盒可适合用于用以实施抑制本发明所涉及的靶基因表达的发夹型单链RNA分子的制备方法。
在一个实施方式中，作为试剂盒的实例，可举出：用于抑制TGF-β1基因或GAPDH基因的表达的发夹型单链RNA分子的制备用试剂盒，该试剂盒包含以下的(1)或(2)所记载的单链寡RNA分子的组合，但不限于这些：
(1) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 2所表示的核苷酸序列构成，其中第24位的核糖核苷酸残基与Lx1进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 3所表示的核苷酸序列构成，其中第1位的核糖核苷酸残基与Lx2进行连接、第26位和第27位的核糖核苷酸残基经由Ly进行连接；
(2) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 5所表示的核苷酸序列构成，其中第22位的核糖核苷酸残基与Lx1进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 6所表示的核苷酸序列构成，其中第1位的核糖核苷酸残基与Lx2进行连接、第26位和第27位的核糖核苷酸残基经由Ly进行连接。
实施例
以下，使用实施例，对本发明进一步具体地进行说明。但是，本发明的技术范围不限于这些实施例。
(参考例1)
脯氨酸二酰胺型Amidite的合成
脯氨酸二酰胺型Amidite例如可按照国际公开WO2012/017919的记载进行合成。具体的合成例如下所示，但合成方法不受此限定。
[化学式36]
Figure 960663DEST_PATH_IMAGE038
(1) Fmoc-羟基酰胺-L-脯氨酸(化合物1)
将Fmoc-L-脯氨酸(10.00g、29.64mmol)、4-氨基-1-丁醇(3.18g、35.56mmol)和1-羟基苯并三唑(10.90g、70.72mmol)混合，对于该混合物，在减压下脱气，并填充氩气。在所得的混合物中，在室温下加入无水乙腈(140mL)，进一步添加二环己基碳二亚胺(7.34g、35.56mmol)的无水乙腈溶液(70mL)之后，在氩环境下、在室温下搅拌15小时。反应结束后，滤出所生成的沉淀，对于所回收的滤液，在减压下馏去溶剂。在所得的残余物中加入二氯甲烷(200mL)，用饱和碳酸氢钠溶液(200mL)进行洗涤。然后，回收有机层，用硫酸镁干燥之后，进行过滤。对于所得的滤液，在减压下馏去溶剂，在该残余物中加入二乙醚(200mL)，并制成粉末。通过滤取所产生的粉末，得到了作为无色粉末状物质的Fmoc-羟基酰胺-L-脯氨酸。Fmoc为9-芴基甲氧基羰基。
(2) DMTr-酰胺-L-脯氨酸(化合物2)
将Fmoc-羟基酰胺-L-脯氨酸(7.80g、19.09mmol)与无水吡啶(5mL)混合，在室温下共沸干燥2次。在所得的残留物中加入4,4’-二甲氧基三苯甲基氯化物(8.20g、24.20mmol)、4-二甲基氨基吡啶(23mg、0.19mmol)和无水吡啶(39mL)。将该混合物在室温下搅拌1小时之后，加入甲醇(7.8mL)，在室温下搅拌30分钟。将该混合物用二氯甲烷(100mL)稀释，用饱和碳酸氢钠溶液(150mL)洗涤后，分离有机层。将该有机层用硫酸钠干燥之后，进行过滤。对于所得的滤液，在减压下馏去溶剂。在所得的未纯化的残余物中加入无水N,N-二甲基甲酰胺(39mL)和哌啶(18.7mL、189mmol)，在室温下搅拌1小时。反应结束后，从该混合液中在减压下、室温下馏去溶剂。将所得的残余物供于硅胶柱层析(商品名Wakogel C-300、展开溶剂二氯甲烷：甲醇＝9：1、含0.05％吡啶)，由此得到了作为淡黄色油状物质的DMTr-酰胺-L-脯氨酸。DMTr为4,4’-二甲氧基三苯甲基。
(3) DMTr-羟基二酰胺-L-脯氨酸(化合物3)
将所得的DMTr-酰胺-L-脯氨酸(6.01g、12.28mmol)、N-(3’-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺(2.83g、14.74mmol)、1-羟基苯并三唑(3.98g、29.47mmol)和三乙胺(4.47g、44.21mmol)的无水二氯甲烷溶液(120mL)混合。在氩环境下、室温下，在该混合液中进一步加入6-羟基己酸(1.95g、14.47mmol)，其后，在氩环境下、室温下，搅拌1小时。将所得的混合液用二氯甲烷(600mL)稀释，用饱和盐水(800mL)洗涤3次。回收有机层，用硫酸钠干燥之后，进行过滤。对于所得的滤液，在减压下馏去溶剂。由此得到了作为淡黄色泡状物质的DMTr-羟基二酰胺-L-脯氨酸。
(4) DMTr-二酰胺-L-脯氨酸Amidite (化合物4)
将所得的DMTr-羟基二酰胺-L-脯氨酸(8.55g、14.18mmol)与无水乙腈混合，在室温下共沸干燥3次。在所得的残留物中加入二异丙基铵盐四氮唑(2.91g、17.02mmol)，在减压下脱气，并填充氩气。在该混合物中加入无水乙腈(10mL)，进一步加入2-氰基乙氧基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(5.13g、17.02mmol)的无水乙腈溶液(7mL)。将该混合物在氩环境下、室温下搅拌2小时。将所得的混合物用二氯甲烷稀释，用饱和碳酸氢钠溶液(200mL)洗涤3次之后，用饱和盐水(200mL)进行洗涤。回收有机层，用硫酸钠干燥之后，进行过滤。对于所得的滤液，在减压下馏去溶剂。将所得的残余物供于使用氨基硅胶作为填充剂的柱层析(展开溶剂 己烷：乙酸乙酯＝1：3、含0.05％吡啶)，由此得到了作为无色糖浆状物质的DMTr-二酰胺-L-脯氨酸Amidite。
(实施例1)
1. 脯氨酸酯型Amidite的合成(氰乙基保护)
[化学式37]
Figure 509456DEST_PATH_IMAGE039
(1) Boc-L-脯氨酸-氰基乙酯(化合物5)
将Boc-L-脯氨酸(10.00g、46.46mmol)、2-氰基乙醇(3.96g、55.75mmol)混合，对于该混合物，在室温下加入二氯甲烷(100mL)，用冰浴进行冷却。添加N-(3’-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(9.80g、51.10mmol)、4-二甲基氨基吡啶(1.12g、9.29mmol)之后，移除冰浴，在氩环境下、室温下搅拌3小时。将所得的混合液用蒸馏水(100mL)进行洗涤。回收有机层，用硫酸钠干燥之后，进行过滤。对于所得的滤液，在减压下馏去溶剂。将所得的残余物供于硅胶柱层析(展开溶剂 氯仿：甲醇＝19：1)，由此得到了作为油状物质的Boc-L-脯氨酸-氰基乙酯(12.47g、收率100％)。Boc为丁氧羰基。
(2) N-酰胺-L-脯氨酸-氰基乙酯(化合物6)
将Boc-L-脯氨酸-氰基乙酯(12.47g、46.46mmol)与二氧六环(29mL)混合。在所得的混合物中加入4M氯化氢二氧六环溶液(44mL)，将该混合物在室温下搅拌2小时之后，在减压下馏去溶剂。在所得的未纯化的残余物中加入二氯甲烷(90mL)。在该混合物中加入6-羟基己酸(8.09g、61.20mmol)和三乙胺(9.40g、92.91mmol)，用冰浴进行冷却。添加EDCI盐酸盐(9.80g、51.10mmol)之后，移除冰浴，在室温下搅拌4小时。将所得的混合液用蒸馏水(100mL)进行洗涤。回收有机层，用硫酸钠干燥之后，进行过滤。对于所得的滤液，在减压下馏去溶剂。将所得的残余物供于硅胶柱层析(展开溶剂 氯仿：甲醇＝9：1)，由此得到了作为油状物质的N-酰胺-L-脯氨酸-氰基乙酯(10.16g、收率77％)。
(3) 氰乙基-L-脯氨酸Amidite (化合物7)
将所得的N-酰胺-L-脯氨酸-氰基乙酯(5.00g、17.71mmol)与无水乙腈(40mL)混合，在减压下脱气，并填充氩气。对于该混合物，加入四唑(1.49g、21.25mmol)和二异丙胺(2.15g、21.25mmol)，进一步加入2-氰基乙氧基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(6.41g、21.25mmol)的无水乙腈溶液(10mL)。将该混合物在氩环境下、室温下搅拌3小时。将所得的混合物用二氯甲烷(100mL)稀释，用5％碳酸氢钠水溶液(100mL)进行洗涤。回收有机层，用硫酸钠干燥之后，进行过滤。对于所得的滤液，在减压下馏去溶剂。将所得的残余物供于使用氨基硅胶作为填充剂的柱层析(展开溶剂 己烷：乙酸乙酯＝1：4)，由此得到了作为油状物质的氰乙基-L-脯氨酸Amidite (7.03g、收率82％)。
2. 脯氨酸酯型Amidite的合成(2,4-二甲氧基苄基保护)
[化学式38]
Figure 128656DEST_PATH_IMAGE040
(1) Fmoc-L-脯氨酸-(2,4-二甲氧基)苄酯(化合物8)
将Fmoc-L-脯氨酸(12.04g、35.67mmol)、2,4-二甲氧基苄基醇(5.00g、29.73mmol)混合，对于该混合物，在室温下加入二氯甲烷(100mL)。添加EDCI盐酸盐(6.84g、35.67mmol)、4-二甲基氨基吡啶(0.36g、2.97mmol)之后，在室温下搅拌3小时。将所得的混合液用蒸馏水(100mL)进行洗涤。回收有机层，用硫酸钠干燥之后，进行过滤。对于所得的滤液，在减压下馏去溶剂。将所得的残余物供于硅胶柱层析(展开溶剂 己烷：乙酸乙酯＝3：2)，由此得到了Fmoc-L-脯氨酸-(2,4-二甲氧基)苄酯(13.24g、收率91％)。Fmoc为芴基甲氧基羰基。
(2) L-脯氨酸-(2,4-二甲氧基)苄酯(化合物9)
将Fmoc-L-脯氨酸-(2,4-二甲氧基)苄酯(13.24g、27.16mmol)与二氯甲烷(130mL)混合。在所得的混合物中加入二氮杂双环十一碳烯(4.96g、32.59mmol)，将该混合物在室温下搅拌1小时之后，在减压下馏去溶剂。将所得的残余物供于硅胶柱层析(展开溶剂 氯仿：甲醇＝9：1)，由此得到了作为油状物质的L-脯氨酸-(2,4-二甲氧基)苄酯(6.39g、收率89％)。
(3) N-酰胺-L-脯氨酸-(2,4-二甲氧基)苄酯(化合物10)
将L-脯氨酸-(2,4-二甲氧基)苄酯(6.39g、24.09mmol)与二氯甲烷(120mL)混合。在该混合物中加入6-羟基己酸(3.82g、28.90mmol)和三乙胺(4.87g、48.17mmol)。添加EDCI盐酸盐(5.54g、28.90mmol)之后，在室温下搅拌16小时。将所得的混合液用蒸馏水(100mL)进行洗涤。回收有机层，用硫酸钠干燥之后，进行过滤。对于所得的滤液，在减压下馏去溶剂。将所得的残余物供于硅胶柱层析(展开溶剂 乙酸乙酯：甲醇＝9：1)，由此得到了作为油状物质的N-酰胺-L-脯氨酸-(2,4-二甲氧基)苄酯(5.22g、收率57％)。
(4) (2,4-二甲氧基)苄基-L-脯氨酸Amidite (化合物11)
将N-酰胺-L-脯氨酸-(2,4-二甲氧基)苄酯(2.00g、5.27mmol)与无水乙腈(27mL)混合，在减压下脱气，并填充氩气。对于该混合物，加入四唑(0.44g、6.32mmol)和二异丙胺(0.64g、6.32mmol)，进一步加入2-氰基乙氧基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(1.91g、6.32mmol)。将该混合物在氩环境下、室温下搅拌23小时。将所得的混合物用氯仿(60mL)稀释，用5％碳酸氢钠水溶液(60mL)进行洗涤。回收有机层，用硫酸钠干燥之后，进行过滤。对于所得的滤液，在减压下馏去溶剂。将所得的残余物供于使用氨基硅胶作为填充剂的柱层析(展开溶剂 己烷：乙酸乙酯＝1：4)，由此得到了作为油状物质的(2,4-二甲氧基)苄基-L-脯氨酸Amidite (2.27g、收率74％)。
(参考例2)
甘氨酸二酰胺型Amidite的合成
甘氨酸二酰胺型Amidite例如可按照国际公开WO2013/103146的记载进行合成。具体的合成例如下所示，但合成方法不受此限定。
[化学式39]
Figure 395690DEST_PATH_IMAGE041
(1) Fmoc-羟基酰胺-甘氨酸(化合物12)
在Fmoc-甘氨酸(4.00g、13.45mmol)、二环己基碳二亚胺(3.33g、16.15mmol)和1-羟基苯并三唑1水和物(4.94g、32.29mmol)的无水N,N-二甲基甲酰胺溶液(100mL)中加入4-氨基丁醇(1.44g、16.15mmol)的无水N,N-二甲基甲酰胺溶液(30mL)，在氩环境下、室温下搅拌过夜。滤出所生成的沉淀，将滤液在减压下进行浓缩。在所得的残余物中加入二氯甲烷(200mL)，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次。进一步用饱和盐水进行洗涤。用硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。将所得的残余物供于硅胶柱层析(展开溶剂：二氯甲烷-甲醇(95：5)，得到了Fmoc-羟基酰胺-甘氨酸(4.30g、87％)。
(2) Fmoc-DMTr-酰胺-甘氨酸(化合物13)
对于化合物12 (4.20g、11.40mmol)，使用无水吡啶共沸干燥3次。在该共沸残余物中加入4,4’-二甲氧基三苯甲基氯化物(5.80g、17.10mmol)和无水吡啶(80mL)，在室温下搅拌过夜。在所得的反应混合物中加入甲醇(20mL)，在室温下搅拌30分钟之后，在减压下馏去溶剂。其后，加入二氯甲烷(200mL)，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，进一步用饱和盐水进行洗涤。用硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。得到了未纯化的Fmoc-DMTr-酰胺-甘氨酸(11.40g)。
(3) DMTr-酰胺-甘氨酸(化合物14)
在未纯化的化合物13 (11.40g、16.99mmol)中，在室温下加入N,N-二甲基甲酰胺(45mL)和哌啶(11.7mL)，在室温下搅拌过夜。将反应混合物在减压下馏去溶剂，将所得的残余物供于硅胶柱层析(展开溶剂：二氯甲烷-甲醇(9：1)＋0.05％吡啶)，得到了DMTr-酰胺-甘氨酸(4.90g、96％、2步骤)。
(4) DMTr-羟基二酰胺-甘氨酸(化合物15)
将化合物14 (4.80g、10.70mmol)用无水吡啶共沸干燥3次后，在氩环境下、室温下加入6-羟基己酸(1.70g、12.84mmol)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(2.46g、12.84mmol)、1-羟基苯并三唑1水和物(3.93g、25.69mmol)、和无水二氯甲烷(60mL)，搅拌10分钟。在由此所得的混合物中加入三乙胺(3.90g、38.53mmol)，在氩环境下、室温下搅拌过夜。在所得的反应混合物中加入二氯甲烷(200mL)，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，进一步用饱和盐水洗涤1次。分取有机层，用硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。将所得的残余物供于硅胶柱层析(展开溶剂：二氯甲烷-甲醇(95：5)＋0.05％吡啶)，得到了DMTr-羟基二酰胺-甘氨酸(4.80g、80％)。
(5) DMTr-二酰胺-甘氨酸Amidite (化合物16)
将化合物15 (4.70g、8.35mmol)用无水吡啶共沸干燥3次。然后，加入二异丙基铵盐四氮唑(1.72g、10.02mmol)，在减压下脱气，并填充氩气，加入无水乙腈(5mL)。进一步加入2-氰基乙氧基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(3.02g、10.02mmol)的无水乙腈二氯甲烷混合溶液(1：1) (4mL)，将混合物在氩环境下、室温下搅拌4小时。在所得的反应混合物中加入二氯甲烷(150mL)，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤2次，进一步用饱和盐水洗涤1次。分取有机层，用硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。将残余物供于使用氨基硅的柱层析(展开溶剂：正己烷-丙酮(3：2)＋0.1％三乙胺)，得到了DMTr-二酰胺-甘氨酸Amidite (4.50g、71％、HPLC98.2％)。
(实施例2)
甘氨酸酯型Amidite的合成(氰乙基保护)
[化学式40]
Figure 594590DEST_PATH_IMAGE042
(1) Boc-甘氨酸-氰基乙酯(化合物17)
将Boc-甘氨酸(5.00g、28.54mmol)、2-氰基乙醇(2.40g、33.76mmol)混合，对于该混合物，在室温下加入二氯甲烷(50mL)，用冰浴进行冷却。添加N-(3’-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC) (6.00g、31.30mmol)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP) (0.70g、5.73mmol)之后，移除冰浴，在氩环境下、室温下搅拌3小时。将所得的混合液用蒸馏水和饱和盐水进行洗涤。回收有机层，用硫酸钠干燥之后，进行过滤。对于所得的滤液，在减压下馏去溶剂。将所得的残余物供于硅胶柱层析(展开溶剂 己烷：乙酸乙酯＝3：2)，由此得到了Boc-甘氨酸-氰基乙酯(5.70g、收率88％)。
(2) 甘氨酸-氰基乙酯(化合物18)
将Boc-甘氨酸-氰基乙酯(2.80g、12.27mmol)与二氧六环(7.5mL)混合。在所得的混合物中加入4M氯化氢二氧六环溶液(20mL)，将该混合物在室温下搅拌3小时之后，在减压下馏去溶剂。将所得的白色固体用乙酸乙酯进行洗涤。进行真空干燥，得到了甘氨酸-氰基乙酯(1.90g)。
(3) 6-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)己酸(化合物21)
在经共沸干燥的6-羟基己酸(1.2g、9.08mmol)和DMAP(113mg、0.92mmol)的吡啶溶液(30mL)中加入4,4-二甲氧基三苯甲基氯化物(3.1g、9.15mmol)，在室温下搅拌5小时之后，加入甲醇(5mL)，搅拌30分钟。将混合液减压浓缩之后，加入二氯甲烷，而将溶液稀释。该溶液用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤3次，用饱和盐水洗涤1次。回收有机层，用硫酸钠干燥之后，进行过滤。对于所得的滤液，在减压下馏去溶剂。进行减压干燥，得到了未纯化的6-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)己酸(6.2g)。
(4) N-酰胺-甘氨酸-氰基乙酯(化合物19)
将甘氨酸-氰基乙酯(0.85g、6.70mmol)溶解于N,N-二甲基甲酰胺(15mL)中。在该混合物中加入6-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)己酸(6.2g)和三乙胺(1.35g、13.34mmol)，在冰冷下进行搅拌。添加EDC (2.55g、13.30mmol)之后，移除冰浴，在室温下搅拌15小时。将所得的混合液减压浓缩，加入二氯甲烷，而将溶液稀释。用饱和碳酸氢钠水溶液、然后用饱和盐水进行洗涤。回收有机层，用硫酸钠干燥之后，进行过滤。对于所得的滤液，在减压下馏去溶剂。将所得的残余物供于硅胶柱层析(展开溶剂 己烷：乙酸乙酯＝1：1、含0.05％吡啶)，由此得到了白色固体(2.50g、收率69％)。将所得的白色固体(2.50g、4.59mmol)加入80％乙酸水溶液(30mL)中，在室温搅拌3小时。将反应溶液装入分液漏斗中，通过己烷洗涤直至从水层中可去除经脱保护的4,4-二甲氧基三苯甲基为止。在水层中加入甲苯，进行3次共沸。进行真空干燥，由此得到了作为白色固体的N-酰胺-甘氨酸-氰基乙酯(0.80g、收率72％)。
(5) 氰乙基-甘氨酸Amidite (化合物20)
将N-酰胺-甘氨酸-氰基乙酯(0.80g、3.30mmol)用无水乙腈共沸2次。加入二异丙基铵盐四氮唑(0.68g、3.97mmol)，进行真空干燥。在该混合物中加入无水乙腈(3mL)。加入2-氰乙基-N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰二胺(1.20g、3.98mmol)的无水乙腈溶液(1mL)。将该混合物在氩环境下、室温下搅拌3小时。将所得的混合物用二氯甲烷稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液和饱和盐水进行洗涤。回收有机层，用硫酸钠干燥之后，进行过滤。对于所得的滤液，在减压下馏去溶剂。得到了作为油状物质的氰乙基-甘氨酸Amidite (1.4g)。
(实施例3)
在后述的实施例4中，具有TGF-β1基因表达抑制序列的发夹型单链RNA分子(以下，也称为ssTbRNA)，通过酰胺化反应连接作为其两个分割片段的、末端具有氨基的第1单链寡RNA分子(以下，链A)与末端具有羧基的第2单链寡RNA分子(链B)来制作(参照图1)。
于是，本实施例中，进行了Ly、Lx1和Lx2为以下所示结构的链A和链B-1的合成。
[化学式41]
Figure 667063DEST_PATH_IMAGE043
链A和链B-1通过亚磷酰胺法，使用核酸自动合成装置(AKTA oligopilot plus10, GE Healthcare Life Sciences)进行合成。该合成中使用TBDMS Amidite作为RNAAmidite。在链B-1的3’末端，使用结合有保护鸟苷的核酸合成用聚合物珠NittoPhase (注册商标；日东电工株式会社) HL rG(ibu)，为了Ly的连接，使用DMTr-二酰胺-L-脯氨酸Amidite (化合物4)作为特殊Amidite，为了Lx2的连接，使用氰乙基-L-脯氨酸Amidite (化合物7)或(2,4-二甲氧基)苄基-L-脯氨酸Amidite (化合物11)。另外，在链A的3’末端，使用3’-PT Amino-Modifier C4 CPG (化合物名称：N-(4-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)-丁基)-(2-羧基酰胺基)-苯邻二酰亚胺基-lcaa-CPG；Link Technologies)。核酸的固相合成和合成后的脱保护反应按照常规方法来进行。在此，氰乙基的脱保护是在自固相载体的切出时来进行。(2,4-二甲氧基)苄基的脱保护是通过将合成结束后的固相载体在3％三氯乙酸/甲苯溶液中静置1小时之后，去除溶液来进行。即使在化合物7或化合物11的任一者的情况下，也得到相同的链B-1。
在核酸合成后的反应溶液中，加入氯化钠水溶液和2-丙醇进行离心分离，去除了上清。使所得的沉淀物溶解于注射用水中，通过反相层析(Inertsil ODS-3, GL Sciences；流动相A：50mM TEAB缓冲液、5％乙腈；流动相B：50mM TEAB缓冲液、50％乙腈)进行纯化。在目标馏分中加入氯化钠水溶液和乙醇进行离心分离，回收沉淀物。通过质谱分析确认到与目标物的分子量一致。所回收的目标物是在3’末端具有具氨基的非核苷酸性接头Lx1的链A和在5’末端具有具羧基的非核苷酸性接头Lx2的链B-1。链B-1的Ly和Lx2具有吡咯烷骨架。
在下述的实施例中，通过酰胺键将链A的末端的氨基与链B-1的末端的羧基连接，来制作发夹型单链RNA分子(ssTbRNA)。
(实施例4)
使用实施例3中合成的链A和链B-1，使用下述的操作A～C中的任一种方法，在各种反应条件下进行酰胺化反应，将链A和链B-1连接，通过HPLC分析确定了反应收率。
・操作A：将380μL链A的5.3mM水溶液和360μL链B-1的5.6mM水溶液混合，加入水，定容至2mL，自所得溶液中测量30μL，通过减压蒸发器和真空泵，馏去溶剂，使之干燥。在室温下在所得的残余物中添加缓冲液使之溶解。其后，加入有机溶剂和脱水缩合剂的0.4M水溶液，在室温下进行搅拌。
・操作B：将380μL链A的5.3mM水溶液和360μL链B-1的5.6mM水溶液混合，加入水，定容至2mL，自所得溶液中测量30μL，通过减压蒸发器和真空泵，馏去溶剂，使之干燥。在室温下在所得的残余物中添加缓冲液使之溶解。其后，加入有机溶剂和脱水缩合剂的0.4M有机溶剂溶液，在室温下进行搅拌。需要说明的是，该脱水缩合剂溶液使用与其混合的有机溶剂(记载于下述表中)相同种类的有机溶剂进行调制。
・操作C：将380μL链A的5.3mM水溶液和360μL链B-1的5.6mM水溶液混合，加入水，定容至2mL，自所得的溶液中测量30μL，通过减压蒸发器和真空泵，馏去溶剂，使之干燥。在室温下在所得的残余物中添加缓冲液使之溶解。其后，以固体形式加入脱水缩合剂，在室温下进行搅拌。
・操作D：将170μL链A的4.8mM水溶液和170μL链B-1的4.8mM水溶液混合，加入水，定容至1mL，自所得溶液中测量38μL，通过减压蒸发器和真空泵，馏去溶液，使之干燥。在室温下在所得的残余物中添加缓冲液使之溶解。其后，加入有机溶剂和脱水缩合剂的0.4M有机溶剂溶液，在室温下进行搅拌。需要说明的是，该脱水缩合剂溶液使用与其混合的有机溶剂(记载于下述表中)相同种类的有机溶剂进行调制。
・操作E：将170μL链A的4.8mM水溶液和170μL链B-1的4.8mM水溶液混合，加入水，定容至1mL，自所得溶液中测量38μL，通过减压蒸发器和真空泵，馏去溶液，使之干燥。在室温下在所得的残余物中添加缓冲液使之溶解。其后，以固体形式加入脱水缩合剂，在室温下进行搅拌。
・操作F：将170μL链A的4.8mM水溶液和170μL链B-1的4.8mM水溶液混合，加入水，定容至1mL，自所得溶液中测量38μL，通过减压蒸发器和真空泵，馏去溶液，使之干燥。在室温下在所得的残余物中添加缓冲液使之溶解。其后，加入有机溶剂和脱水缩合剂的1.6M有机溶剂溶液，在室温下进行搅拌。需要说明的是，该脱水缩合剂溶液使用与其混合的有机溶剂(记载于下述表中)相同种类的有机溶剂进行调制。
・操作G：将170μL链A的4.8mM水溶液和170μL链B-1的4.8mM水溶液混合，加入水，定容至1mL，自所得溶液中测量38μL，通过减压蒸发器和真空泵，馏去溶液，使之干燥。在室温下在所得的残余物中添加缓冲液使之溶解。其后，加入有机溶剂和脱水缩合剂的0.2M溶液(注射用水与乙腈的体积比为1：1的混合溶液)，在室温下进行搅拌。
在自添加脱水缩合剂起1、3、5、8、和23小时后进行采样，进行反应液的HPLC分析，确定了反应收率。HPLC分析条件如下。
・柱：XBridge Oligonucleotide BEH C18 (Waters) 4.6×50mm、2.5μm
・柱温度：60℃
・流动相A：200mM TEAA水溶液(pH7.0)/乙腈＝95/5
・流动相B：200mM TEAA水溶液(pH7.0)/乙腈＝50/50
・展开条件：A/B＝100/0 (0-3分钟)、100/0→70/30 (3-23分钟、线性梯度)、70/30(23-33分钟)、70/30→100/0 (33-33.1分钟、线性梯度)、100/0 (33.1-45分钟)
・流速：1.0mL/分钟
・检测：PDA检测器(254nm)
・注入量：10μL
反应收率(％)是根据HPLC分析结果利用下式进行计算。
反应收率(％)＝(ssTbRNA的峰面积)/(层析图中的总峰面积)×100
1) 脱水缩合剂的研究
为了研究脱水缩合剂，利用上述的方法，对试验例1～4、21～32和比较例1～9、12～22进行酰胺化反应。试验例1～4、21～32和比较例1～9、12～22中的操作、所添加的缓冲液的种类和添加量、所添加的有机溶剂的种类和添加量、以及所添加的脱水缩合剂的种类和添加量见表1、表2、和表3。
[表1]
Figure 926006DEST_PATH_IMAGE044
关于MOPS、DMT-MM、HATU、EDCI、HOAt的含义，如上所述。
HBTU为O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐。TSTU为N,N,N’,N’-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲鎓四氟硼酸盐。TFFH为氟-N,N,N’,N’-四甲基甲脒鎓六氟磷酸盐。COMU (注册商标；Luxembourg Bio Technologies Ltd.)为1-[(1-(氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基吗啉代)]脲鎓六氟磷酸盐。PyBOP为(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷基磷鎓六氟磷酸盐。DPPA为二苯基磷酰基叠氮化物。CDI为羰基二咪唑。
[表2]
Figure 86860DEST_PATH_IMAGE045
HCTU为O-(6-氯苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐。TPTU为O-(1,2-二氢-2-氧代-1-吡啶基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐。TDBTU为O-(3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪-3-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓四氟硼酸盐。HOBt为1-羟基苯并三唑。HOPO为2-羟基吡啶-N-氧化物。TCFH为氯-N,N,N’,N’-四甲基甲脒鎓六氟磷酸盐。NMI为N-甲基咪唑。化合物22为1-羟基-1,2,3-三唑-4-甲酸乙酯。化合物23为氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯。化合物24为3,4-二氢-3-羟基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪。化合物25为4-(二甲基氨基)吡啶-N-氧化物。化合物26为2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物。
[表3]
Figure 823872DEST_PATH_IMAGE046
HOTT为N,N,N’,N’-四甲基-S-(1-氧化物-2-吡啶基)硫脲鎓六氟磷酸盐。DEPBT为磷酸二乙基3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪-3-基酯。DMAP为4-二甲基氨基吡啶。DIC为二异丙基碳二亚胺。化合物27为3-硝基-1-甲苯磺酰基-1,2,4-三唑。化合物28为N-叔丁基-5-甲基异噁唑鎓高氯酸盐。化合物29为2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三磷杂环己烷。
基于脱水缩合剂的反应性差异见表4、表5、和表6。
[表4]
Figure 143995DEST_PATH_IMAGE047
如表4所示，在将作为脱水缩合剂的DMT-MM、HATU、HBTU、或EDCI盐酸盐与HOAt组合使用的情况下，得到了高的收率(试验例1～4)。另一方面，即使是与HATU、HBTU相同包含苯并三唑基结构的脱水缩合剂，PyBOP等的磷鎓型脱水缩合剂也未得到高的收率(比较例5)。另外，即使在脲鎓型脱水缩合剂中，未包含N-羟基含氮芳香环结构的TSTU、TFFH、COMU (注册商标；Luxembourg Bio Technologies Ltd.)也未得到高的收率(比较例2～4)。
[表5]
Figure 573840DEST_PATH_IMAGE048
另外，如表5所示，在作为脱水缩合剂的HCTU、TPTU或TDBTU单独的情况下，在EDCI盐酸盐与HOBt、化合物22、HOPO、化合物23、化合物24或化合物25组合的情况下，在TCFH与HOAt或NMI组合的情况下，或者在化合物26与HOAt组合的情况下，均得到了高的收率(试验例21～32)。
[表6]
Figure 956410DEST_PATH_IMAGE049
如表6所示，在使用注射用水代替缓冲液时，得到了收率变低的结果(比较例21、22)。
由以上的结果显示出：在包含N-羟基含氮芳香环结构(例如1-羟基苯并三唑结构)的脲鎓型脱水缩合剂(例如苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂)或EDCI盐酸盐与N-羟基含氮芳香族化合物组合的情况下，可得到高的收率。另一方面，在使用DPPA或CDI作为脱水缩合剂的情况下，各自的单独或即使与HOAt组合均无法得到高的收率(比较例6～9)。
2) 使用三嗪型脱水缩合剂的酰胺化反应
为了研究使用三嗪型脱水缩合剂的酰胺化反应的反应条件，将DMT-MM用于脱水缩合剂，通过上述的方法，进行了试验例1、5～14和比较例10的酰胺化反应。试验例1、5～14和比较例10中的操作、添加的缓冲液的种类和添加量、添加的有机溶剂的种类和添加量、以及脱水缩合剂的种类和添加量见表7。
[表7]
Figure 497113DEST_PATH_IMAGE050
在表8～10中示出有机溶剂的添加效果、有机溶剂比率的影响、缓冲液pH的影响。表中的有机溶剂比率是将用于酰胺化的脱水缩合剂溶液所含的有机溶剂的量也包含在有机溶剂的总量中进行计算。
[表8]
Figure 140584DEST_PATH_IMAGE051
如表8所示，与不添加有机溶剂的情况下(比较例10)相比，通过添加有机溶剂，得到了提高目标物收率的结果。特别是，在添加DMSO的情况下，得到了高的效果(试验例1)。
[表9]
Figure 147854DEST_PATH_IMAGE052
如表9所示，在将DMSO的比率设为溶剂全体的35～60体积％时，以高的收率得到了目标物(试验例1、9～11)。
[表10]
Figure 876776DEST_PATH_IMAGE053
如表10所示，在pH6.5～7.5的范围内得到了特别高的收率。若将pH降低至6.0，则由于反应速度的降低而见到收率变低的倾向。
3) 使用苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂的酰胺化反应
为了研究使用苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂的酰胺化反应的反应条件，将HATU用于脱水缩合剂，通过上述的方法，对于试验例2、15～20、33～38和比较例11进行了酰胺化反应。试验例2、15～20、33～38和比较例11中的操作、添加的缓冲液的种类和添加量、添加的有机溶剂的种类和添加量、以及添加的脱水缩合剂的种类和添加量见表11。
[表11]
Figure 752328DEST_PATH_IMAGE054
在表12、13中示出有机溶剂的添加效果、有机溶剂比率的影响。
[表12]
Figure 250306DEST_PATH_IMAGE055
如表12所示，与未添加有机溶剂的情况下(比较例11)相比，通过添加有机溶剂，得到了提高目标物收率的结果(试验例2、16～20、38)。特别是在添加非质子性的亲水性有机溶剂的情况下，得到了高的效果。
[表13]
Figure 756373DEST_PATH_IMAGE056
如表13所示，在将DMSO的比率设为溶剂全体的20～65体积％时，以高的收率得到了目标物(试验例2、15、33、34)。另外，在将DMF、DMEU、乙腈的比率设为溶剂全体的50～65体积％时，也以高的收率得到了目标物(试验例16，17，19、35～37)。
(实施例5)
ssTbRNA的分离纯化
1) 使用DMT-MM的酰胺化反应
自链A水溶液和链B-1水溶液测量各1μmol并混合，通过离心浓缩机馏去溶剂，并使之干燥。在所得的残余物中添加80μL的1M MOPS缓冲液而使之溶解，将溶液加热至95℃后，放置冷却至室温。添加80μL的1M DMT-MM水溶液、100μL的DMSO并搅拌后，在室温下静置6小时。在上述反应溶液中加入20μL的2M氯化钠水溶液和800μL的乙醇并搅拌，在-30℃下静置后进行离心分离，去除上清，使获取的沉淀物干燥。使沉淀物溶解于注射用水中，通过强阴离子交换层析(DNAPac PA100、Thermo Fisher Scientific；流动相A：25mM Tris-HCl缓冲液、10％乙腈；流动相B：25mM Tris-HCl缓冲液、10％乙腈、700mM NaClO4)进行纯化，分取了目标物。通过乙醇沉淀回收目标馏分，得到了11.7mg的白色固体(RP-HPLC纯度：90％、收率：69％)。通过质谱分析确认到与目标物的分子量一致。
2) 使用HATU的酰胺化反应
自链A水溶液和链B-1水溶液测量各1μmol并混合，通过离心浓缩机馏去溶剂，并使之干燥。在所得的残余物中添加100μL的1M MOPS缓冲液而使之溶解，将溶液加热至95℃后，放置冷却至室温。添加100μL的HATU的0.2M DMSO溶液并搅拌后，在室温下静置4小时。在上述反应溶液中加入20μL的2M氯化钠水溶液和800μL的乙醇并搅拌，在-30℃下静置后进行离心分离，去除上清，使获取的沉淀物干燥。使沉淀物溶解于注射用水中，通过强阴离子交换层析(DNAPac PA100、Thermo Fisher Scientific；流动相A：25mM Tris-HCl缓冲液、10％乙腈；流动相B：25mM Tris-HCl缓冲液、10％乙腈、700mM NaClO4)进行纯化，分取了目标物。通过乙醇沉淀回收目标馏分，得到了14.1mg的白色固体(AEX-HPLC纯度：96％，收率83％)。通过质谱分析确认到与目标物的分子量一致。
将上述方法中所得的ssTbRNA的纯度通过RP-UPLC (reversed phase ultraperformance liquid chromatography；反相超高效液相层析)进行分析，将与通过使用专利文献2所记载的亚磷酰胺法的固相合成所合成的ssTbRNA进行比较的结果示于表14中。分析条件和解析条件如下所述。
分析条件：
・柱：ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH C18 130Å (Waters)、2.1×100mm、1.7μm
・柱温度：80℃
・流动相A：50mM TEAA・1mM EDTA水溶液(pH7.3)
・流动相B：50mM TEAA・1mM EDTA水溶液/甲醇＝20/80
・展开条件：A/B＝100/0→75/25 (0-10分钟、线性梯度)、75/25→0/100 (10-10.5分钟、线性梯度)、0/100 (10.5-15分钟)、0/100→100/0 (15-15.5分钟、线性梯度)
・流速：0.2mL/分钟
・检测：PDA检测器(260nm)
・注入量：10μL
解析条件：
・宽度：2秒
・斜率：4000μV/分钟
・偏移：0μV/分钟
・T. DBL：1000分钟
・最小面积：500计数
[表14]
Figure 379116DEST_PATH_IMAGE057
表14中，链A、链B-1和ssTbRNA分子的值表示基于层析图的各自的峰面积比率，使用上述的解析条件进行计算。另外，作为ssTbRNA分子的峰附近的核酸(主要包含ssTbRNA分子及其缺损体)的相对量，针对包含ssTbRNA分子的峰的RRT (相对保留时间(Revertiveretention time)；这里是指以ssTbRNA分子的峰的保持时间为1的情况下的相对保持时间)＝0.98～1.07的范围，计算峰面积％的总计值。需要说明的是，链A和链B-1的峰保持时间充分地远离ssTbRNA分子的峰，不包含在RRT＝0.98～1.07的范围内。
如表14所示，利用本发明的方法合成的ssTbRNA分子中所含的核酸杂质的量为微量，在ssTbRNA分子的峰附近出现的缺损体(缺失了ssTbRNA分子的一部分序列的分子)的量也较少。另一方面，在通过使用亚磷酰胺法的固相合成进行合成的情况下(专利文献2)，含有较多的ssTbRNA分子以外的短链核酸杂质(合成在短链时停止的RNA分子等)，在ssTbRNA分子的峰附近出现的缺损体也较多。在本发明的方法中，显示出能够以高纯度制备目标的发夹型单链RNA分子。
(实施例6)
作为具有TGF-β1基因表达抑制序列的发夹型单链RNA分子的两个分割片段，进行了Ly、Lx1和Lx2为以下所示结构的链A和链B-2的合成。
[化学式42]
Figure 261621DEST_PATH_IMAGE058
链A和链B-2通过亚磷酰胺法，使用核酸自动合成装置(ABI3900；AppliedBiosystems)进行合成。该合成中使用TBDMS Amidite作为RNA Amidite。在链B-2的3’末端，使用2’-O-TBDMS-鸟苷(N-iBu)-3’-lcaa-CPG (ChemGenes)，为了Ly的连接，使用DMTr-二酰胺-L-脯氨酸Amidite (化合物4)作为特殊Amidite，为了Lx2的连接，使用氰乙基-甘氨酸Amidite (化合物20)。另外，在链A的3’末端，使用3’-PT Amino-Modifier C4 CPG (化合物名称：N-(4-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)-丁基)-(2-羧基酰胺基)-苯邻二酰亚胺基-lcaa-CPG；ChemGenes)。核酸的固相合成和合成后的脱保护反应按照常规方法来进行。
在各链的脱保护反应结束后的反应溶液中，加入氯化钠水溶液和2-丙醇进行离心分离，去除了上清。使所得的沉淀物溶解于注射用水中。通过质谱分析确认到与目标物的分子量一致。所回收的目标物是在3’末端具有具氨基的非核苷酸性接头Lx1的链A (质谱分析测定值：7817.3、理论值：7816.8)和在5’末端具有具羧基的非核苷酸性接头Lx2的链B-2(质谱分析测定值：9195.0、理论值：9194.6)。
自链A水溶液和链B-2水溶液测量各100nmol并混合，通过离心浓缩机馏去溶剂，并使之干燥。在所得的残余物中添加10μL的1M MOPS缓冲液使之溶解，将溶液加热至95℃后，放置冷却至室温。添加10μL的HATU的0.2M DMSO溶液并搅拌后，在室温下静置4小时。在上述反应溶液中加入2μL的2M氯化钠水溶液和50μL的乙醇并搅拌，在-30℃下静置后进行离心分离，去除上清，使获取的沉淀物干燥。通过质谱分析确认到与目标物的分子量一致(测定值：16993.9、理论值16993.3)。
(实施例7)
作为具有TGF-β1基因表达抑制序列的发夹型单链RNA分子的两个分割片段，进行了Ly、Lx1和Lx2为以下所示结构的链A和链B-3的合成。
[化学式43]
Figure 286209DEST_PATH_IMAGE059
链A和链B-3通过亚磷酰胺法，使用核酸自动合成装置(ABI3900；AppliedBiosystems)进行合成。该合成中使用TBDMS Amidite作为RNA Amidite。在链B-3的3’末端，使用2’-O-TBDMS-鸟苷(N-iBu)-3’-lcaa-CPG (ChemGenes)，为了Ly的连接，使用DMTr-二酰胺-甘氨酸Amidite (化合物16)作为特殊Amidite，为了Lx2的连接，使用氰乙基-甘氨酸Amidite (化合物20)。另外，在链A的3’末端，使用3’-PT Amino-Modifier C4 CPG (化合物名称：N-(4-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)-丁基)-(2-羧基酰胺基)-苯邻二酰亚胺基-lcaa-CPG；ChemGenes)。核酸的固相合成和合成后的脱保护反应按照常规方法来进行。
在各链的脱保护反应结束后的反应溶液中，加入氯化钠水溶液和2-丙醇进行离心分离，去除了上清。使所得的沉淀物溶解于注射用水中。通过质谱分析确认到与目标物的分子量一致。所回收的目标物是在3’末端具有氨基的非核苷酸性接头为具有Lx1的链A (质谱分析测定值：7817.3、理论值：7816.8)和5’末端具有羧基的非核苷酸性接头为具有Lx2的链B-3 (质谱分析测定值：9155.0、理论值：9154.5)。
自链A水溶液和链B-3水溶液测量各100nmol并混合，通过离心浓缩机馏去溶剂，并使之干燥。在所得的残余物中添加10μL的1M MOPS缓冲液使之溶解，将溶液加热至95℃后，放置冷却至室温。添加10μL的HATU的0.2M DMSO溶液并搅拌后，在室温下静置4小时。在上述反应溶液中加入2μL的2M氯化钠水溶液和50μL的乙醇并搅拌，在-30℃下静置后进行离心分离，去除上清，使获取的沉淀物干燥。通过质谱分析确认到与目标物的分子量一致(测定值：16954.1、理论值：16953.3)。
(实施例8)
在本实施例中，通过将作为其两个分割片段的、末端具有氨基的第1单链寡RNA分子(以下，链C)和末端具有羧基的第2单链寡RNA分子(链D)利用酰胺化反应进行连接，制作了具有GAPDH基因表达抑制序列的发夹型单链RNA分子。
首先，进行了Ly、Lx1和Lx2为以下所示结构的链C和链D-1的合成。
[化学式44]
Figure 228757DEST_PATH_IMAGE060
链C和链D-1通过亚磷酰胺法，使用核酸自动合成装置(ABI3900；AppliedBiosystems)进行合成。该合成中使用TBDMS Amidite作为RNA Amidite。在链D-1的3’末端，使用2’-O-TBDMS-腺苷(N-Bz)-3’-lcaa-CPG (ChemGenes)，为了Ly的连接，使用DMTr-二酰胺-L-脯氨酸Amidite (化合物4)作为特殊Amidite，为了Lx2的连接，使用氰乙基-L-脯氨酸Amidite (化合物7)。另外，在链C的3’末端，使用3’-PT Amino-Modifier C4 CPG (化合物名称：N-(4-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)-丁基)-(2-羧基酰胺基)-苯邻二酰亚胺基-lcaa-CPG；ChemGenes)。核酸的固相合成和合成后的脱保护反应按照常规方法来进行。
在各链的脱保护反应结束后的反应溶液中，加入氯化钠水溶液和2-丙醇进行离心分离，去除了上清。使所得的沉淀物溶解于注射用水中。通过质谱分析确认到与目标物的分子量一致。所回收的目标物是在3’末端具有具氨基的非核苷酸性接头Lx1的链C (质谱分析测定值：7222.9、理论值：7222.4)和在5’末端具有具羧基的非核苷酸性接头Lx2的链D-1(质谱分析测定值：9853.5、理论值：9853.0)。
自链C水溶液和链D-1水溶液测量各100nmol并混合，通过离心浓缩机馏去溶剂，并使之干燥。在所得的残余物中添加10μL的1M MOPS缓冲液使之溶解，将溶液加热至95℃后，放置冷却至室温。添加10μL的HATU的0.2M DMSO溶液并搅拌后，在室温下静置4小时。在上述反应溶液中加入2μL的2M氯化钠水溶液和50μL的乙醇并搅拌，在-30℃下静置后进行离心分离，去除上清，使获取的沉淀物干燥。通过质谱分析确认到与目标物的分子量一致(测定值17057.9、理论值：17057.4)。
(实施例9)
作为具有GAPDH基因表达抑制序列的发夹型单链RNA分子的两个分割片段，进行了Ly、Lx1和Lx2为以下所示结构的链C和链D-2的合成。
[化学式45]
Figure 197850DEST_PATH_IMAGE061
链C和链D-2通过亚磷酰胺法，使用核酸自动合成装置(ABI3900；AppliedBiosystems)进行合成。该合成中使用TBDMS Amidite作为RNA Amidite。在链D-2的3’末端使用2’-O-TBDMS-腺苷(N-Bz)-3’-lcaa-CPG (ChemGenes)，为了Ly的连接，使用DMTr-二酰胺-甘氨酸Amidite (化合物16)作为特殊Amidite，为了Lx2的连接，使用氰乙基甘氨酸Amidite (化合物20)。另外，在链C的3’末端使用3’-PT Amino-Modifier C4 CPG (化合物名称：N-(4-(4,4’-二甲氧基三苯甲基氧基)-丁基)-(2-羧基酰胺基)-苯邻二酰亚胺基-lcaa-CPG；ChemGenes)。核酸的固相合成和合成后的脱保护反应按照常规方法来进行。
在各链的脱保护反应结束后的反应溶液中，加入氯化钠水溶液和2-丙醇进行离心分离，去除了上清。使所得的沉淀物溶解于注射用水中。通过质谱分析确认到与目标物的分子量一致。所回收的目标物是在3’末端具有具氨基的非核苷酸性接头Lx1的链C (质谱分析测定值：7222.9、理论值：7222.4)和在5’末端具有具羧基的非核苷酸性接头Lx2的链D-2(质谱分析测定值：9773.3、理论值：9772.9)。
自链C水溶液和链D-2水溶液测量各100nmol并混合，通过离心浓缩机馏去溶剂，并使之干燥。在所得的残余物中添加10μL的1M MOPS缓冲液使之溶解，将溶液加热至95℃后，放置冷却至室温。添加10μL的HATU的0.2M DMSO溶液并搅拌后，在室温下静置4小时。在上述反应溶液中加入2μL的2M氯化钠水溶液和50μL的乙醇并搅拌，在-30℃下静置后进行离心分离，去除上清，使获取的沉淀物干燥。通过质谱分析确认到与目标物的分子量一致(测定值：16977.6、理论值16977.3)。
产业实用性
本发明可有效地制备包含针对靶基因的表达抑制序列的发夹型单链RNA分子。
序列表自由文本
SEQ ID NO: 1～6：合成RNA
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过直接引用而纳入本说明书中。
<110> 东丽株式会社
株式会社博纳克
<120> Method for producing hairpin single-stranded RNA molecules
<130> PH-8071-PCT
<150> JP 2018-187767
<151> 2018-10-02
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)..(25)
<223> 第24位和第25位的核苷酸经由接头进行连接
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (50)..(51)
<223> 第50位和第51位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 1
agcagaguac acacagcaua uaccgguaua ugcugugugu acucugcuuc g 51
<210> 2
<211> 24
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (24)
<223> 第24位的核苷酸与接头进行连接
<400> 2
agcagaguac acacagcaua uacc 24
<210> 3
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (1)
<223> 第1位的核苷酸与接头进行连接
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (26)..(27)
<223> 第26位和第27位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 3
gguauaugcu guguguacuc ugcuucg 27
<210> 4
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (22)..(23)
<223> 第22位和第23位的核苷酸经由接头进行连接
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (48)..(49)
<223> 第48位和第49位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 4
caugagaagu augacaacag ccggcuguug ucauacuucu caugguucga a 51
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (22)
<223> 第22位的核苷酸与接头进行连接
<400> 5
caugagaagu augacaacag cc 22
<210> 6
<211> 29
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (1)
<223> 第1位的核苷酸与接头进行连接
<220>
<221> 修饰碱基
<222> (26)..(27)
<223> 第26位和第27位的核苷酸经由接头进行连接
<400> 6
ggcuguuguc auacuucuca ugguucgaa 29

Claims (17)

1.发夹型单链RNA分子的制备方法，其是抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的制备方法，包括下述的步骤：
在脱水缩合剂的存在下，在包含缓冲液和亲水性有机溶剂的混合溶剂中，使下述式(I)所表示的第1单链寡RNA分子与下述式(II)所表示的第2单链寡RNA分子进行反应，
5’-Xc-Lx1　・・・(I)
Lx2-X-Y-Ly-Yc-3’　・・・(II)
式(I)和式(II)中，X、Xc、Y和Yc由核糖核苷酸残基构成，Xc与X互补，Yc与Y互补，Ly为非核苷酸性接头，Lx1为具有氨基的非核苷酸性接头，Lx2为具有羧基的非核苷酸性接头，X-Y包含针对上述靶基因的基因表达抑制序列，
上述脱水缩合剂选自三嗪型脱水缩合剂、包含N-羟基含氮芳香环结构的脲鎓型脱水缩合剂、碳二亚胺型脱水缩合剂、2-卤代吡啶鎓型脱水缩合剂、和甲脒鎓型脱水缩合剂，
在上述脱水缩合剂为碳二亚胺型脱水缩合剂的情况下，该脱水缩合剂与N-羟基含氮芳香族化合物或氰基(羟基亚氨基)乙酸酯组合使用，
在上述脱水缩合剂为2-卤代吡啶鎓型脱水缩合剂的情况下，该脱水缩合剂与N-羟基含氮芳香族化合物组合使用，
在上述脱水缩合剂为甲脒鎓型脱水缩合剂的情况下，该脱水缩合剂与N-羟基含氮芳香族化合物或N-烃取代咪唑衍生物组合使用。
2.权利要求1所述的制备方法，其中，上述接头Ly为具有氨基酸骨架或氨基醇骨架的非核苷酸性接头，上述接头Lx2为具有氨基酸骨架的非核苷酸性接头。
3.权利要求1或2所述的制备方法，其中，上述Ly为包含吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少一者的非核苷酸性接头、或包含-NHCH2COO-的非核苷酸性接头，上述Lx2为包含具有羧基的吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少一者的非核苷酸性接头、或包含-NHCH2COOH的非核苷酸性接头。
4.权利要求1～3中任一项所述的制备方法，其中，Lx1由下述式(III)表示，Lx2由下述式(IV)或下述式(IV’)表示，
[化学式1]
Figure 346630DEST_PATH_IMAGE002
・・・(III)
式(III)中，R1为可被取代的亚烷基链，-OR1经由磷酸二酯键与Xc的3’末端结合，
[化学式2]
Figure 732612DEST_PATH_IMAGE004
・・・(IV)　或　
Figure 512349DEST_PATH_IMAGE006
・・・(IV’)
式(IV)中，R2为可被取代的亚烷基链，p为1或2，-OR2经由磷酸二酯键与X的5’末端结合，式(IV’)中，R2为可被取代的亚烷基链，-OR2经由磷酸二酯键与X的5’末端结合。
5.权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其中，
(i) 上述包含N-羟基含氮芳香环结构的脲鎓型脱水缩合剂为苯并三唑基脲鎓型脱水缩合剂，
(ii) 上述N-羟基含氮芳香族化合物为羟基苯并三唑或其衍生物，
(iii) 上述氰基(羟基亚氨基)乙酸酯为氰基(羟基亚氨基)乙酸烷基酯，和/或
(iv) 上述N-烃取代咪唑衍生物为N-烷基咪唑衍生物。
6.权利要求1～5中任一项所述的制备方法，其中，上述亲水性有机溶剂为亲水性的非质子性有机溶剂。
7.权利要求6所述的制备方法，其中，上述亲水性的非质子性有机溶剂为二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N’-二甲基亚乙基脲、或乙腈。
8.权利要求1～7中任一项所述的制备方法，其中，上述脱水缩合剂为4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、N-(3’-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐、2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物、或氯-N,N,N’,N’-四甲基甲脒鎓六氟磷酸盐，
上述N-羟基含氮芳香族化合物为1-羟基-7-氮杂苯并三唑，
上述氰基(羟基亚氨基)乙酸酯为氰基(羟基亚氨基)乙酸乙酯，
上述N-烃取代咪唑衍生物为N-甲基咪唑。
9.权利要求7或8中任一项所述的制备方法，其中，上述脱水缩合剂与上述亲水性的非质子性有机溶剂的组合为O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐与二甲基亚砜的组合、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N’,N’-四甲基脲鎓六氟磷酸盐与N,N-二甲基甲酰胺的组合、N-(3’-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐与1-羟基-7-氮杂苯并三唑与二甲基亚砜的组合、或氯-N,N,N’,N’-四甲基甲脒鎓六氟磷酸盐与1-羟基-7-氮杂苯并三唑与二甲基亚砜的组合。
10.权利要求1～9中任一项所述的制备方法，其中，上述缓冲液的pH为6.5～7.5。
11.权利要求1～10中任一项所述的制备方法，其中，Ly为包含吡咯烷骨架或哌啶骨架的非核苷酸性接头，Lx1为具有氨基的非核苷酸性接头，Lx2为包含具有羧基的吡咯烷骨架和哌啶骨架的至少一者的非核苷酸性接头。
12.权利要求1～11中任一项所述的制备方法，其中，Ly由下述式(V)表示，
[化学式3]
Figure 641979DEST_PATH_IMAGE008
・・・(V)。
13.权利要求1～12中任一项所述的制备方法，其中，Lx1由下述式(VI)表示，Lx2由下述式(VII)表示，
[化学式4]
Figure 456352DEST_PATH_IMAGE010
・・・(VI)
[化学式5]
Figure 747656DEST_PATH_IMAGE012
・・・(VII)。
14.权利要求1～13中任一项所述的制备方法，其中，上述靶基因为TGF-β1基因。
15.权利要求1～14中任一项所述的制备方法，其中，上述发夹型单链RNA分子由SEQ IDNO: 1所表示的核苷酸序列构成。
16.单链寡RNA分子，其为以下的(a)或(b)：
(a) 由SEQ ID NO: 3所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第1位的核糖核苷酸残基与Lx2进行连接、第26位和第27位的核糖核苷酸残基经由Ly进行连接；
(b) 由SEQ ID NO: 6所表示的核苷酸序列构成的单链寡RNA分子，其中第1位的核糖核苷酸残基与Lx2进行连接、第26位和第27位的核糖核苷酸残基经由Ly进行连接。
17.用于抑制靶基因表达的发夹型单链RNA分子的制备用试剂盒，该试剂盒包含以下(1)或(2)的单链寡RNA分子的组合：
(1) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 2所表示的核苷酸序列构成，其中第24位的核糖核苷酸残基与Lx1进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 3所表示的核苷酸序列构成，其中第1位的核糖核苷酸残基与Lx2进行连接、第26位和第27位的核糖核苷酸残基经由Ly进行连接；
(2) 第1单链寡RNA分子与第2单链寡RNA分子的组合，所述第1单链寡RNA分子由SEQ IDNO: 5所表示的核苷酸序列构成，其中第22位的核糖核苷酸残基与Lx1进行连接，所述第2单链寡RNA分子由SEQ ID NO: 6所表示的核苷酸序列构成，其中第1位的核糖核苷酸残基与Lx2进行连接、第26位和第27位的核糖核苷酸残基经由Ly进行连接。
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