CN112662735B - 一种抗凝血酶ⅲ活性测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及临床检验领域，特别涉及一种抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒及其制备方法。该试剂盒的制备原料包括稀释缓冲液、凝血酶试剂和发色底物试剂；稀释缓冲液为含有苯扎溴铵的生理盐水；凝血酶试剂包括凝血酶、肝素钠、海藻糖、氯化钠和缓冲液；发色底物试剂包括发色底物、乳糖、海藻糖和缓冲液。本发明中稀释缓冲液添加苯扎溴铵，能改变血浆中纤维蛋白原的结构或状态，避免纤维蛋白原干扰凝血酶裂解底物的反应速率，提高检测抗凝血酶III活性的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及临床检验领域，特别涉及一种抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒及 其制备方法。
背景技术
正常人体内血液凝固过程的促进与抑制，二者处于动态平衡状态。作为 人体内最重要的抗凝物质，抗凝血酶Ⅲ(以下简称AT-III)控制着血液凝固 和纤维蛋白溶解的过程，从而维持机体的凝血平衡，因此AT-III活性的变化 是诊断弥漫性血管内凝血(DIC)、肝硬化、败血症、血栓形成性疾病(心肌 梗塞，静脉血栓形成等)、先天性AT-Ⅲ缺陷、血友病、再生障碍性贫血的 重要指标。
AT-III是一种球蛋白，在肝内合成。研究表明抗凝血酶Ⅲ的含量或者活 性低既有遗传性的也有获得性的。先天性遗传引起的血液中抗凝血酶Ⅲ缺乏 又分为I型和II型，I型抗凝血酶Ⅲ缺乏的特征是抗凝血酶Ⅲ合成的降低，血 液中抗凝血酶Ⅲ含量和活性均降低。II型抗凝血酶Ⅲ缺乏的特征是抗凝血酶 Ⅲ合成正常，血液中抗凝血酶Ⅲ含量正常，但由于部分抗凝血酶Ⅲ功能丧失， 表现出抗凝血酶Ⅲ活性降低。获得性的抗凝血酶Ⅲ含量或者活性低的原因有 多种，例如肝病引起的抗凝血酶Ⅲ合成减少；肾病引起的抗凝血酶Ⅲ流失；肝素等药物引起的抗凝血酶Ⅲ损失，以及弥散性血管内凝血引起的抗凝血酶 Ⅲ消耗。无论是遗传性的还是获得性的抗凝血酶Ⅲ缺失症都给患者带来血栓 的风险，给他们的健康和生命带来难以预测的威胁。抗凝血酶Ⅲ活性的检测 在先天性抗凝血酶Ⅲ缺陷或异常的临床诊断具有非常重要的意义。
目前检测抗凝血酶Ⅲ的方法有两种，一种为检测抗凝血酶Ⅲ抗原的含量， 如免疫分析法，此法方法比较特异和灵敏，但是操作繁琐、耗时，而且无法 测定II型抗凝血酶Ⅲ缺乏；另一种为检测抗凝血酶Ⅲ的活性，如凝固法和发 色底物法，凝固法是通过血浆凝固时间来测定样本中AT-Ⅲ活性，由于受影 响的因素较多，因此特异性，准确度较差，而且操作繁琐。目前，在市场销 售的试剂盒中，底物发色法是测定血浆中抗凝血酶Ⅲ活性的通用方法，此法 具有灵敏度高、准确性好、检测时间短等特点，且能够适用于多种自动化分 析仪器，临床上已被广泛应用。
底物发色法的原理：抗凝血酶Ⅲ(AT-III)是一种多功能的丝氨酸蛋白酶 抑制物，是凝血酶(FⅡa)与活化的凝血因子Ⅶ、Ⅺ、Ⅹ等蛋白酶的抑制剂。 在过量的丝氨酸蛋白酶存在下，血浆中的抗凝血酶Ⅲ与丝氨酸蛋白酶形成1： 1的复合物从而抑制此蛋白酶的活性，剩余的没有和抗凝血酶Ⅲ形成复合物的 蛋白酶作用于特异的发色底物，将底物裂解产生4-硝基苯胺(4-nitroaniline， pNA)显色基团，4-硝基苯胺的浓度和其在405nm处的吸光度的变化呈正相关， 而产生的4-硝基苯胺的量与抗凝血酶Ⅲ的活性成反比。因此，通过检测405nm 处吸光度的变化，可计算出血浆中抗凝血酶Ⅲ的活性水平。
美国专利US5546007和中国专利CN102690862A公开了一种以凝血酶为 基础的发色底物法检测抗凝血酶Ⅲ活性的试剂盒，两者分别对离子浓度的优 化和肝素衍生物的筛选，达到降低肝素辅因子Ⅱ(HCⅡ)干扰抗凝血酶Ⅲ活 性测定的影响，但是凝血酶与发色底物在水溶液下不稳定，不宜久存。此外， 中国专利CN106153612A发表了一种以活化因子X(FXa)为基础的发色底物 法测定抗凝血酶Ⅲ活性的试剂盒，此法避免了样本中肝素辅因子以及药物水 蛭素、阿加曲班、达比加群等抗凝血因素的干扰。然而活化因子X(FXa)极 易失活，价格昂贵，增加试剂盒制作成本。
无论是以凝血酶为基础的，还是以活化因子X(FXa)为基础的底物发色 法，都要求过量的凝血酶或FXa存在，根据凝血瀑布学说，血浆中其他凝血 因子或多或少均能消耗或灭活凝血酶和活化因子X的活性，从而干扰抗凝血 酶Ⅲ活性的检测。
目前的发色底物法检测抗凝血酶III活性的手段仍有待改进。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒及其制备方法。 本发明通过优化条件和筛选特定添加剂，提供一种基于凝血酶与显色基质相 互作用的抗凝血酶III活性检测试剂盒，此试剂盒具有稳定性好，灵敏度高， 抗干扰性强，批间差小以及使用方便等诸多优点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒，该试剂盒的制备原料包 括稀释缓冲液、凝血酶试剂和发色底物试剂；
稀释缓冲液为含有苯扎溴铵的生理盐水；
凝血酶试剂包括凝血酶、肝素钠、海藻糖、氯化钠和缓冲液；
发色底物试剂包括发色底物、乳糖、海藻糖和缓冲液。
血浆样本中肝素辅因子Ⅱ或抗凝血酶Ⅲ能捕获凝血酶的催化活性位点， 从而抑制凝血酶催化纤维蛋白原转化为纤维蛋白，起到抗凝作用。然而，基 于凝血酶与其发色底物的相互反应的原理，肝素通过增强抗凝血酶III活性， 形成1:1抗凝血酶III-凝血酶复合物而抑制凝血酶的活性，剩余的凝血酶作用 于底物，解离出发色基团。相比于底物，血浆样本中存在大量的纤维蛋白原， 而纤维蛋白原同样能与凝血酶相互作用，从而消耗凝血酶的活性，导致检测 抗凝血酶III活性的结果偏高。
为了避免血浆样本中纤维蛋白原干扰抗凝血酶III活性的检测的影响，本 发明稀释缓冲液，一方面能够稀释样本，降低样本中微量的、能影响凝血酶 活性的其他凝血因子(如HCⅡ)的干扰，降低对凝血酶的抑制作用，并且减 少试剂盒中凝血酶和底物的浓度，节约生产成本；另一方面，稀释缓冲液包 含表面活性剂苯扎溴铵，能与纤维蛋白原形成络合物，使其构象发生变化， 无法捕获凝血酶的催化活性位点，从而消除干扰抗凝血酶III活性检测的影响。 而且对凝血酶活性无影响，从而提高了检测抗凝血酶III活性的准确度。
作为优选，稀释缓冲液中苯扎溴铵的浓度为0.01w/v％～0.2w/v％。
作为优选，凝血酶试剂中各组分浓度为：凝血酶3～6U/mL、肝素钠 2～5U/mL、海藻糖8w/v％～16w/v％、氯化钠0.9w/v％～w/v3％、缓冲液余量。
作为优选，凝血酶试剂还包括赖氨酸盐酸盐、蛋白质稳定剂Ⅱ和
作为优选，凝血酶试剂中各组分浓度为：凝血酶3～6U/mL、肝素钠 2～5U/mL、海藻糖8w/v％～16w/v％、氯化钠0.9w/v％～3w/v％、赖氨酸盐酸盐 0.05w/v％～0.5w/v％、蛋白质稳定剂Ⅱ0.05v/v％～0.8v/v％、
0.1 v/v％～2v/v％、缓冲液余量。
作为优选，凝血酶为牛凝血酶。
作为优选，发色底物试剂中各组分浓度为：发色底物0.4～2mmol/L、硫柳 汞钠0.06w/v％～0.2w/v％、乳糖2w/v％～8w/v％、海藻糖4w/v％～10w/v％、缓 冲液余量。
作为优选，防腐剂为硫柳汞钠。
作为优选，发色底物选自H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl(S2238)、 CH3OCO-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH、H-D-CHG-Ala-Arg-pNA·AcOH(PA2493)中 的一种或几种。
作为优选，缓冲液为25～100mmol/L、pH 7.4～8.4的Tris-HCl缓冲液。
本发明还提供了该试剂盒的制备方法，分别配制稀释缓冲液、凝血酶试 剂和发色底物试剂，将凝血酶试剂和发色底物试剂冷冻干燥。
本发明提供了一种抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒及其制备方法。该试剂盒 的制备原料包括稀释缓冲液、凝血酶试剂和发色底物试剂；稀释缓冲液为含 有苯扎溴铵的生理盐水；凝血酶试剂包括凝血酶、肝素钠、海藻糖、氯化钠 和缓冲液；发色底物试剂包括发色底物、乳糖、海藻糖和缓冲液。本发明的 优点如下：
本发明中稀释缓冲液添加苯扎溴铵，能改变血浆中纤维蛋白原的结构或 状态，避免纤维蛋白原干扰凝血酶裂解底物的反应速率，提高检测抗凝血酶III 活性的准确性；
本发明中，在凝血酶试剂中还可以进一步优化添加剂赖氨酸盐酸盐、蛋 白质稳定剂Ⅱ和
不仅可提高凝血酶水溶液的稳定性，还可以增强用 于检测抗凝血酶III活性的精密度；
针对凝血酶和发色底物在水溶液中通常不稳定，不能长时间保存的问题， 采用特定的添加剂，能够有效地提高凝血酶和发色底物在水溶液中的稳定性， 并且以干粉型外观形态存在，将更有利于增强其稳定性；
试验表明，本发明AT-III活性测定试剂盒具有优异的性能，在2-8℃下稳 定18个月，相对偏差在-4.8％～+5.2％，精密度CV值：6.3％；瓶间差一致性好， 其CV值：3.6％；线性范围[3.6％，130％]，其相关性R2>0.99；试剂盒复溶后在 37℃下能稳定维持24h，在25℃下能够稳定保存55天，在2℃～8℃下至少稳定 保存90天；稳定性高。
附图说明
图1-1不同浓度表面活性剂对纤维蛋白原的影响；
图1-2实施例1和实施例2的定标曲线；
图2抗凝血酶III活性的标准曲线；
图3抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒的相关性；
图4抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒的线性；
图5抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒的机型差图。
具体实施方式
本发明公开了一种抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒及其制备方法，本领域技 术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所 有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包 括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人 员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行 改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒及其制备方法中所用制备原料 药或仪器均可由市场购得。其中，蛋白质稳定剂Ⅱ购自湖州英创生物科技有 限公司。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
稀释缓冲液的制备：称取0.075g苯扎溴铵，溶于100mL生理盐水。
凝血酶试剂的制备：其各组分配比为4.5U/mL牛凝血酶，3.5U/mL肝素 钠，12％(w/v)海藻糖，0.25％(w/v)赖氨酸盐酸盐，2％(w/v)氯化钠， 0.4％(v/v)蛋白质稳定剂Ⅱ，1％(v/v)
60mmol/L、pH8.0三羟甲 基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
底物试剂的制备：配制含0.1％(w/v)硫柳汞钠、5％(w/v)乳糖、7％ (w/v)海藻糖的75mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.0；最后，加入凝血酶底物 PA2493，搅拌混匀，至浓度为1.2mmol/L。
上述的凝血酶试剂和底物试剂配制完成后，经分装、冷冻干燥，制成冻 干粉。
实施例2
稀释缓冲液的制备：100mL生理盐水。
凝血酶试剂的制备：其各组分配比为4.5U/mL牛凝血酶，3.5U/mL肝素 钠，12％(w/v)海藻糖，0.25％(w/v)赖氨酸盐酸盐，2％(w/v)氯化钠， 0.4％(v/v)蛋白质稳定剂Ⅱ，1％(v/v)
60mmol/L、pH8.0三羟甲 基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
底物试剂的制备：配制含0.1％(w/v)硫柳汞钠、5％(w/v)乳糖、7％ (w/v)海藻糖的75mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.0；最后，加入凝血酶底物 PA2493，搅拌混匀，至浓度为1.2mmol/L。
上述的凝血酶试剂和底物试剂配制完成后，经分装、冷冻干燥，制成冻 干粉。
实施例3
稀释缓冲液的制备：称取0.075g苯扎溴铵，溶于100mL生理盐水。
凝血酶试剂的制备：其各组分配比为4.5U/mL牛凝血酶，3.5U/mL肝素 钠，12％(w/v)海藻糖，0.25％(w/v)氯化钠，60mmol/L、pH8.0三羟甲基 氨基甲烷-盐酸缓冲液。
底物试剂的制备：配制含0.1％(w/v)硫柳汞钠、5％(w/v)乳糖、7％ (w/v)海藻糖的75mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.0；最后，加入凝血酶底物 PA2493，搅拌混匀，至浓度为1.2mmol/L。
上述的凝血酶试剂和底物试剂配制完成后，经分装、冷冻干燥，制成冻 干粉。
实施例4
稀释缓冲液的制备：称取0.025g苯扎溴铵，溶于100mL生理盐水。
凝血酶试剂的制备：其各组分配比为3U/mL牛凝血酶，2U/mL肝素钠， 8％(w/v)海藻糖，0.05％(w/v)赖氨酸盐酸盐，0.9％(w/v)氯化钠，0.05％(v/v)蛋白质稳定剂Ⅱ，0.1％(v/v)
25mmol/L、pH7.4三羟甲基 氨基甲烷-盐酸缓冲液。
底物试剂的制备：配制含0.06％(w/v)硫柳汞钠、2％(w/v)乳糖、4％ (w/v)海藻糖的50mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.4；最后，加入凝血酶底物 PA2493，搅拌混匀，至浓度为0.4mmol/L。
上述的凝血酶试剂和底物试剂配制完成后，经分装、冷冻干燥，制成冻 干粉。
实施例5
稀释缓冲液的制备：称取0.05g苯扎溴铵，溶于100mL生理盐水。
凝血酶试剂的制备：其各组分配比为6U/mL牛凝血酶，5U/mL肝素钠， 16％(w/v)海藻糖，0.5％(w/v)赖氨酸盐酸盐，3％(w/v)氯化钠，0.8％ (v/v)蛋白质稳定剂Ⅱ，2％(v/v)
100mmol/L、pH8.4三羟甲基氨 基甲烷-盐酸缓冲液。
底物试剂的制备：配制含0.2％(w/v)硫柳汞钠、8％(w/v)乳糖、10％ (w/v)海藻糖的100mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH8.4；最后，加入凝血酶底 物PA2493，搅拌混匀，至浓度为2mmol/L。
上述的凝血酶试剂和底物试剂配制完成后，经分装、冷冻干燥，制成冻 干粉。
实施例6
稀释缓冲液的制备：称取0.1g苯扎溴铵，溶于100mL生理盐水。
凝血酶试剂的制备：其各组分配比为5.0U/mL牛凝血酶，2.7U/mL肝素 钠，10.3％(w/v)海藻糖，0.17％(w/v)赖氨酸盐酸盐，2.1％(w/v)氯化钠， 0.30％(v/v)蛋白质稳定剂Ⅱ，0.7％(v/v)
39mmol/L、pH8.1三羟 甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。
底物试剂的制备：配制含0.12％(w/v)硫柳汞钠、5.5％(w/v)乳糖、 6％(w/v)海藻糖的68mmol/L Tris-HCl缓冲液，pH7.8；最后，加入凝血酶底 物PA2493，搅拌混匀，至浓度为1.5mmol/L。
上述的凝血酶试剂和底物试剂配制完成后，经分装、冷冻干燥，制成冻 干粉。
实施例7抗凝血酶Ⅲ活性测定的操作
本发明所述的抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒，复溶，采用TECO 1800全自 动凝血分析仪，按照制造商所提供的说明书进行参数设置：样本(校准品、 质控品或血浆)与稀释缓冲液试剂按1:40混合，并取出一定体积的混合液， 加入等体积的凝血酶试剂混合并孵育2min，再加入凝血酶底物试剂混合并孵 育25s，在405nm波长照射下，读取待测样品中发色底物的信号强度(吸光 度OD值)；最后通过计算信号强度并和已知浓度标准品的标准曲线比对得 到血液中抗凝血酶Ⅲ的活性。
试验例1本发明所述的抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒的性能评价
1.干扰物纤维蛋白原的影响
将已知AT-Ⅲ活性为104％的德国TECO公司通用校准品，用生理盐水等 比例稀释一系列浓度(104％、52％、26％、13％)，并且该校准品含有266mg/mL 纤维蛋白原，从而也获得了含有纤维蛋白原一系列浓度(266mg/mL、133 mg/mL、66.5mg/mL和33.25mg/mL)样本，配制一系列浓度表面活性剂如实 施例1、实施例2、实施例4、实施例5和实施例6试剂盒检测上述样本AT- Ⅲ活性所对应的吸光度OD值，每个样本重复测试3次求平均值，绘制各实 施例的定标曲线，结果见附件图1-1，随表面活性剂浓度的增加，定标曲线 R2更趋向于1。
选择实施例1和实施例2检测的数值绘制其实施例的定标曲线结果如图 1-2，而且以此实施例的定标曲线为依据，实施例1和实施例2试剂检测定值 血浆，每个样本重复测试3次求平均值，其结果如表1。
表1实施例1和实施例2检测定值血浆
由图1-1、图1-2所示，实施例1定标曲线的线性R2＝0.998，明显优于实 施例2，并且随着稀释倍数的增加，样本中纤维蛋白原的浓度随着减少，实 施例1和实施例2的吸光度高度吻合一致，即可优化样本的稀释倍数以及在 稀释液中添加纤维蛋白原的表面活性剂，能消除纤维蛋白原影响凝血酶裂解 底物的反应速率，从而提高试剂盒检测血浆样本AT-III活性的准确度，由表 1可看出，实施例1检测正常、异常血浆AT-III活性结果的相对偏差分别为 0.4％和-2.54％，明显优于实施例2。由此表明该表面活性剂能使本发明试剂 盒检测AT-III活性不受纤维蛋白原的干扰。
2.稳定凝血酶组合物对凝血酶稳定性的影响
将实施例1和实施例3的试剂盒分别分成三组，复溶，分别放置在2℃ ～8℃、25℃和37℃条件下，间隔一定时间，按照抗凝血酶Ⅲ活性测定的操作 方法，由同一个或一组操作者在同一台仪器上进行，对正常质控血浆和异常 质控血浆进行检测，记录检测结果吸光度OD值的变化，判断试剂盒的凝血 酶活性是否降低，如表2：
表2-1抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒在2℃～8℃的稳定性
表2-2抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒在25℃的稳定性
表2-3抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒在37℃的稳定性
表2结果分别表明，实施例1试剂复溶后在2℃～8℃下凝血酶活性至少 90天以上无明显丧失；在25℃下能够稳定保存55天；在37℃下能稳定维持 活性20h，明显优于实施例3试剂盒的凝血酶的稳定性，说明本发明所提供的 的组合物(赖氨酸盐酸盐、蛋白质稳定剂Ⅱ和
)能长期地维持凝血酶 的稳定性。
试验例2本发明试剂盒的分析性能评估
1.实施例1定标标准曲线的绘制
将校准品用生理盐水稀释一系列浓度(104％、52％、26％、13％)，用实 施例1所述的抗凝血酶III活性检测试剂盒，在TECO 1800凝血分析仪上检测 校准品溶液的OD值，以OD值为纵坐标，以相应的抗凝血酶Ⅲ活性值为横坐 标，绘制标准曲线，如图2所示。
由图2所示，本发明试剂盒以凝血酶的发色底物法基础，其检测的吸光 度OD值与相应的抗凝血酶Ⅲ活性呈现良好的线性关系，线性关系用函数定 义为Y＝-0.0029X+0.0375，R2＝0.9985。
2.实施例1精密度的检测
按照抗凝血酶Ⅲ活性测定的操作方法，由同一个或一组操作者在同一台 仪器上进行，对正常质控血浆和异常质控血浆重复侧定10次，计算测定值的 均数、标准差和变异系数CV，如下：
表3抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒的精密度
变异系数CV通常用于衡量一项测定方法的精密度，CV值越小，表示该 测定方法的结果精密度越好。表3结果所示，本发明试剂盒检测正常质控血 浆抗凝血酶Ⅲ活性时其CV值为3.25％；异常质控血浆抗凝血酶Ⅲ活性时其 CV为5.91％，表明本发明试剂盒具有优良的精密度。
3.实施例1批间差的检测
取出三个批号的本发明试剂盒，复溶，按照抗凝血酶Ⅲ活性测定的操作 方法，由同一个或一组操作者在同一台仪器上进行，分别对正常质控血浆和 异常质控血浆AT-Ⅲ活性进行10次检测，计算测定值的均数、标准差和变异 系数CV，如下：
表4-1抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒检测正常质控血浆的批间差
表4-2抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒检测异常质控血浆的批间差
变异系数CV通常用于衡量一项测定方法的精密度，CV值越小，表示该 测定方法的结果精密度越好。表4结果所示本发明试剂盒检测正常值质控血 浆和异常值质控血浆的精密度(CV％)值分别为4.69％和6.38％，表明本发明 试剂盒具有优良的批间差。
4.实施例1批内差的检测
用10盒同一批次本发明试剂盒，复溶，按照抗凝血酶Ⅲ活性测定的操作 方法，由同一个或一组操作者在同一台仪器上进行，分别对正常质控血浆和 异常质控血浆进行测定，即：任选一盒对质控血浆测定10次，同时每盒都对 质控血浆检测1次，计算测定值的均数、标准差和变异系数CV，如下：
表5-1抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒检测正常值质控血浆的批内差
表5-2抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒检测异常值质控血浆的批内差
表5结果所示本发明试剂盒检测正常值质控血浆和异常值质控血浆的精 密度(CV％)值分别为2.96％和7.81％，表明本发明试剂盒具有优良的批内差。
5.实施例1与市售进口试剂盒的相关性的检测
本发明试剂盒与市售试剂盒分别在TECO1800全自动生化分析仪上，对 170份新鲜血浆样本(包含正常和异常样本)进行AT-III活性的检测，并对测定 值进行相关分析(结果见图，X轴表示市售试剂盒A的测定值，Y轴表示本发 明试剂盒的测定值)。
图3表明，本发明试剂盒与市售试剂盒相关线性方程为：y＝0.949x+ 5.5011，相关系数：R2＝0.944，虽然个别正常值样本偏差稍大以及异常值血浆 样本较少，造成整体相关系数不好，但是检测结果的阴、阳性基本符合，结 果表明本发明试剂盒与市售试剂盒A相关性良好。
6.实施例1线性范围的检测
将活性为144％的AT-III样本稀释如下：129.6％、115.2％、100.8％、86.4％、72％、57.6％、43.2％、28.8％、14.4％、7.2％和3.6％，每个稀释样本重复测试 4次，分别求出测定结果的均值。以稀释度为自变量，测定结果均值为因变量 求出线性回归方程和相关系数R，如图4。
由图4所示，线性回归方程y＝136.5x+3.3683，R＝0.992，故本发明试剂的 线性范围：3.6％～140％。
7.实施例1试剂盒抗干扰性的检测
取4份混合血浆，其中一份作为对照，其他三份分别加入3种潜在干扰 物：胆红素(Db)、血红蛋白(Hb)、甘油三酯(乳糜)，每种干扰物配制 两个或三个浓度梯度，用实施例1试剂盒对血浆样本AT-Ⅲ活性进行重复测 定4次，求均值，结果如表6所示：
表6抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒的抗干扰性
由表6所示，在分别含有30mg/dL胆红素、200mg/dL血红蛋白和5000 mg/dL乳糜的各个血浆样本中，本发明试剂盒检测血浆样本AT-Ⅲ活性与空白 血浆样本的结果对比，其相对偏差分别为1.81％、-0.55％和-3.15％，即均无抑 制效果，表明该试剂盒有良好特异性。
8.实施例1试剂盒机型差的检测
用实施例1试剂盒分别在TOP 700和TECO 1800上完成定标，并以各自 仪器上的定标曲线为依据，检测22个血浆样本，并且该血浆样本AT-Ⅲ活性 范围[66％，128％]，其检测的结果如表7。为了分析本发明试剂盒在上述两种 仪器上检测血浆样本AT-Ⅲ活性的机型差，以TOP 700仪器检测AT-Ⅲ活性 的结果为横坐标，TECO 1800仪器检测的结果为纵坐标，绘制机型差曲线图5。
表7抗凝血酶Ⅲ活性检测试剂盒的机型差
表7表明，本发明试剂盒分别在TOP 700和TECO 1800仪器上检测血浆样 本AT-Ⅲ活性结果相对比，其相对偏差基本上均在±5％之间，而且图5反映出 本发明试剂盒在此两种仪器上检测血浆样本AT-Ⅲ活性的相关性R2＝0.9765， 故本发明试剂盒的机型差较小。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种抗凝血酶Ⅲ活性测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括稀释缓冲液、凝血酶试剂和发色底物试剂；
所述稀释缓冲液为含有苯扎溴铵的生理盐水；所述稀释缓冲液中苯扎溴铵的浓度为0.01 w/v %~0.2 w/v %；
所述凝血酶试剂包括凝血酶、肝素钠、海藻糖、氯化钠和缓冲液；所述凝血酶试剂中各组分浓度为：凝血酶3~6U/mL、肝素钠2~5U/mL、海藻糖8 w/v%~16 w/v %、氯化钠0.9w/v%~3w/v%、缓冲液余量；
所述发色底物试剂包括发色底物、防腐剂、乳糖、海藻糖和缓冲液；所述发色底物试剂中各组分浓度为：发色底物0.4~2mmol/L、防腐剂0.06 w/v %~0.2 w/v %、乳糖2w/v%~8w/v%、海藻糖4w/v%~10w/v%、缓冲液余量。
2.根据权利要求1项所述的试剂盒，其特征在于，所述凝血酶试剂还包括赖氨酸盐酸盐、蛋白质稳定剂Ⅱ和prionex®；
其中，所述蛋白质稳定剂Ⅱ购自湖州英创生物科技有限公司；
所述凝血酶试剂中各组分浓度为：凝血酶3~6U/mL、肝素钠2~5U/mL、海藻糖8 w/v%~16w/v %、氯化钠0.9w/v%~3w/v%、赖氨酸盐酸盐0.05 w/v %~0.5 w/v %、蛋白质稳定剂Ⅱ0.05v/v %~0.8v/v %、prionex® 0.1 v/v %~2 v/v %、缓冲液余量。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述凝血酶为牛凝血酶。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述发色底物选自H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl、CH3OCO-Gly-Pro-Arg-pNA·AcOH、H-D-CHG-Ala-Arg-pNA·AcOH中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述底物试剂中，所述缓冲液为25~100mmol/L、pH 7.4~8.4的Tris-HCl缓冲液。
6.权利要求1至5中任一项所述试剂盒的制备方法，其特征在于，分别配制稀释缓冲液、凝血酶试剂和发色底物试剂，将凝血酶试剂和发色底物试剂冷冻干燥。
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