CN112649605A - 一种基于NaBiF4上转换纳米粒子的ECL生物传感器 - Google Patents
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Abstract
用于致病细菌检测的ECL生物传感器具体涉及NaBiF4：Yb3+/Er3+UCNPs的制备，ECL免疫传感器的构建及大肠杆菌O157：H7的ECL检测，属于生物/传感器技术领域。本发明要解决的是用于ECL检测的上转换纳米材料合成条件苛刻，成本高，灵敏度差及容易引起环境污染的问题。将可以在室温、温和条件合成的NaBiF4：Yb3+/Er3+上转换纳米粒子用于致病细菌(大肠杆菌O157：H7)的ECL检测。在NaBiF4：Yb3+/Er3+UCNPs的表面上依次组装了金纳米粒子、大肠杆菌O157：H7抗体，并对生物传感器进行优化以构建用于检测大肠杆菌O157：H7的新型ECL免疫传感器。本发明所制备的ECL免疫传感器在200至100 000CFU mL‑1的线性范围内表现出对大肠杆菌O157：H7的高灵敏度响应，最低检测限是138CFU mL‑1。
Description
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域；用于致病细菌检测的ECL生物传感器具体涉及NaBiF4：Yb3+/Er3+UCNPs的制备，ECL免疫传感器的构建及大肠杆菌O157：H7的ECL检测。
背景技术
食源性病原体污染食物和饮用水，对人类和动物健康构成巨大威胁。为了快速应对由食源性或水源性病原体引起的疾病暴发，迫切需要开发能够在任何地方快速廉价地检测病原体的新技术。但是，由于实际样品中细菌浓度低，许多传统的病原体检测方法需要细菌培养和富集步骤，预处理时间超过18小时。诸如聚合酶链反应(PCR)，表面等离振子共振(SPR)，免疫分析等现代检测方法要快得多，但是，这些方法要么需要昂贵的设备，要么不够灵敏，这严重限制了它们在现场的应用。
电致化学发光(ECL)是一种受电极电位控制的电化学发光反应，具有灵敏度高，成本低，信噪比低，易于控制的优点。它被广泛用于药物和食品分析，临床诊断，环境污染物监测，免疫检测等领域。ECL发光体在ECL系统中起着重要的作用。到目前为止，早期出现了各种荧光物质，如钌(II)配合物和鲁米诺，以及各种纳米材料，如贵金属纳米簇，半导体量子点，石墨烯量子点(GQD)，碳纳米点已应用于ECL系统探索和研究，新颖有效的ECL材料是大势所趋。稀土掺杂上转换纳米粒子(UCNPs)具有抗斯托克斯光学特性，可以吸收两个或多个低能光子并发射高能光子，具有生物相容性好，发射稳定性好，光漂白少，组织渗透更深等优点。它们被越来越广泛地应用于生物医学领域，例如生物分析和体内成像。UCNPs作为一种有前途的发光材料，近年来被报道为新一代的ECL发光试剂，具有稳定的阴极信号，高的发光强度，理想的ECL发射信号和长的荧光寿命等一系列潜在优势，将扩大ECL的应用范围。
发明内容
本发明要解决的是用于ECL检测的上转换纳米材料合成条件苛刻，成本高，灵敏度差及容易引起环境污染的问题。铋是一种低成本的环保金属，因此新型的NaBiF4型上转换纳米粒子有望取代NaYF4型UCNPs，从而成为潜在的新型ECL发光体。
为解决上述问题，本发明的用于致病细菌检测的ECL生物传感器，涉及NaBiF4：Yb3 +/Er3+UCNPs的制备，ECL免疫传感器的构建及大肠杆菌O157：H7的ECL检测，具体是按下述步骤进行的：
步骤一、在10毫升乙二醇(EG)溶液中，完全溶解Bi(NO3)3·5H2O(0.78mmol)，Yb(NO3)3·5H2O(0.2mmol)，Er(NO3)3·5H2O(0.02mmol)和NaNO3(2mmol)制备透明的溶液1。将NH4F(14mmol)添加到25mL EG溶液中制备溶液2；
步骤二、在剧烈搅拌下将溶液1缓慢滴加到溶液2中，并在室温下伴随剧烈磁力搅拌反应10分钟，得到白色乳液；
步骤三、将上述白色乳液经过几次离心清洗后，在60℃下真空干燥，得到白色粉末；
步骤四、将一定量的UCNPs分散到Nafion，异丙醇和水的混合溶液中(体积比为2:49:49)，最终浓度为0.5mg mL-1；
步骤五、用1.0、0.3和0.05μm的氧化铝浆料对裸露的玻碳电极进行连续抛光，使其表面光滑，然后用去离子水洗涤；
步骤六、在1mmol L-1K3[Fe(CN)6](包括0.2mol L-1KNO3)中测试循环伏安法，直到峰电位差小于80mV；
步骤七、将10μL的UCNPs溶液(0.5mgmL-1)滴加到GCE电极的表面上，并在室温下干燥后获得UCNPs修饰的电极(UCNPs/GCE)；
步骤八、将10μL金纳米颗粒溶液滴在UCNPs/GCE的表面上，室温干燥后，在表面再滴加10μL大肠杆菌O157：H7多克隆抗体(10μg·mL-1)并于4℃孵育过夜；
步骤九、用PBS洗涤后，将抗体修饰的电极与BSA溶液(1％，w/w)孵育1小时以封闭非特异性位点。然后将准备好的免疫传感器存储在4℃以便进一步使用；
步骤十、将10μL的O157：H7大肠杆菌悬浮液(浓度范围从0到500000CFU ml-1)分别与准备好的生物传感器在37℃下孵育40分钟，以将细菌固定在免疫传感器的表面；
步骤十一、用PBS溶液仔细冲洗以除去未捕获的细菌后，将生物传感器在ECL检测池中进行ECL检测，电解液为0.1mol L-1PBS中包含0.1mol L-1K2S2O8(pH 7.4)；
进一步地限定，步骤十一中扫描电势的范围为0至-2.5V，扫描速率为100mV s-1。光电倍增管(PMT)的电压设置为800V。
本发明在室温下通过快速且环境友好的方法合成的NaBiF4：Yb3+/Er3+上转换纳米粒子(UCNPs)可用于检测病原菌，具有较高的ECL强度，快速的响应和极好的稳定性。
本发明中NaBiF4：Yb3+/Er3+UCNP在K2S2O8存在下表现出高ECL强度和稳定的阴极信号。
本发明优化了基于NaBiF4：Yb3+/Er3+UCNP的ECL生物传感器的条件，得出最佳的UCNPs浓度是0.5mg mL-1，理想的孵育时间是45分钟。
本发明中ECL对大肠杆菌O157：H7具有高灵敏度，检测范围在200至100000CFU mL-1范围内，最低检测限是138CFU mL-1。
附图说明
图1是NaBiF4：Yb3+/Er3+UCNPs的SEM图；
图2是NaBiF4：Yb3+/Er3+UCNPs的XRD图谱与六方晶系NaBiF4的标准峰相比。
图3是NaBiF4：Yb3+/Er3+UCNPs/GCE在含有0.1M K2S2O8的0.1M PBS(pH 7.4)中的扫描电势为100mV s-1和PMT电压为800V时的ECL电位曲线。
图4在含有0.1M K2S2O8的0.1M PBS(pH＝7.4)中，AuNPs/NaBiF4：Yb3+/Er3+UCNPs/GCE电极连续20个循环的ECL信号稳定性。
图5是在连续循环伏安法下，在含有0.1M K2S2O8的0.1M PBS(pH＝7.4)中，从AuNPs/NaBiF4：Yb3+/Er3+UCNPs/GCE电极发出ECL，连续循环20次。扫描速率为100mV s-1，PMT电压为800V。
图6是UCNPs溶液浓度对NaBiF4：Yb3+/Er3+UCNPs/GCE的ECL强度的影响
图7是孵育时间对大肠杆菌O157：H7 20抗体/Au/NaBiF4：Yb3+/Er3+UCNPs/GCE的ECL强度的影响。
图8是所构建的ECL生物传感器的检测标准曲线。误差棒＝RSD(n＝5)。
图9是ECL峰值强度与用大肠杆菌Top 10孵育的抗大肠杆菌O157：H7/Au/NaBiF4：Yb3+/Er3+UCNPs/GCE的大肠杆菌Top 10浓度的对数之间的关系。
具体实施方式
实施1:
步骤一、在10毫升乙二醇(EG)溶液中，完全溶解Bi(NO3)3·5H2O(0.78mmol)，Yb(NO3)3·5H2O(0.2mmol)，Er(NO3)3·5H2O(0.02mmol)和NaNO3(2mmol)制备透明的溶液1。将NH4F(14mmol)添加到25mL EG溶液中制备溶液2；
步骤二、在剧烈搅拌下将溶液1缓慢滴加到溶液2中，并在室温下伴随剧烈磁力搅拌反应10分钟，得到白色乳液；
步骤三、将上述白色乳液经过几次离心清洗后，在60℃下真空干燥，得到白色粉末；
步骤四、将一定量的UCNPs分散到Nafion，异丙醇和水的混合溶液中(体积比为2:49:49)，最终浓度为0.5mg mL-1；
步骤五、用1.0、0.3和0.05μm的氧化铝浆料对裸露的玻碳电极进行连续抛光，使其表面光滑，然后用去离子水洗涤；
步骤六、在1mmol L-1K3[Fe(CN)6](包括0.2mol L-1KNO3)中测试循环伏安法，直到峰电位差小于80mV；
步骤七、将10μL的UCNPs溶液(0.5mgmL-1)滴加到GCE电极的表面上，并在室温下干燥后获得UCNPs修饰的电极(UCNPs/GCE)；
步骤八、将10μL金纳米颗粒溶液滴在UCNPs/GCE的表面上，室温干燥后，在表面再滴加10μL大肠杆菌O157：H7多克隆抗体(10μg·mL-1)并于4℃孵育过夜；
步骤九、用PBS洗涤后，将抗体修饰的电极与BSA溶液(1％，w/w)孵育1小时以封闭非特异性位点。然后将准备好的免疫传感器存储在4℃以便进一步使用；
步骤十、将10μL的O157：H7大肠杆菌悬浮液(浓度范围从0到500000CFU ml-1)分别与准备好的生物传感器在37℃下孵育40分钟，以将细菌固定在免疫传感器的表面；
步骤十一、用PBS溶液仔细冲洗以除去未捕获的细菌后，将生物传感器在ECL检测池中进行ECL检测，电解液为0.1mol L-1PBS中包含0.1molL-1K2S2O8(pH 7.4)；
进一步地限定，步骤十一中扫描电势的范围为0至-2.5V，扫描速率为100mV s-1。光电倍增管(PMT)的电压设置为800V。
采用下述试验验证发明效果：
1.NaBiF4：Yb3+/Er3+UCNPs的表征
从SEM中观察到，制备的NaBiF4：Yb3+/Er3+UPNC具有均匀的粒径和良好的分散性，且粒径为约300nm(图1)。NaBiF4：Yb3+/Er3+UPNCs的元素组成通过元素扫描分析确定，所有元素的分布均匀。Yb和Er元素的存在直接证明了NaBiF4：Yb3+/Er3+UPNC中掺杂剂的成功掺杂。由于系统中掺杂的Er3+较少，元素扫描图像中的元素分布稀疏。
XRD技术用于分析NaBiF4：Yb3+/Er3+UCNPs的晶相结构。所制备样品的XRD谱图与NaBiF4：Yb3+/Er3+(JCPDS 41-0796)一致，并且没有其他杂质的衍射峰，这证实我们已获得具有六角晶系结构NaBiF4(图2)。由于掺杂的Er3+含量低(稀土元素中Er仅占2％)，因此Er3+的衍射峰通常无法区分。结合元素图谱结果，证实了通过该简单方法成功制备出纯相NaBiF4：Yb3+/Er3+上转换发光纳米颗粒。
研究了NaBiF4：Yb3+/Er3+涂覆的GCE电极在0.1M PBS溶液(pH 7.4，含有0.1M K2S2O8作为共反应剂)中的ECL行为。(图3)当电势在0和-2.5V之间负向循环时，NaBiF4：Yb3+/Er3+UCNPs在-2.5V处显示出很强的ECL发射信号，在大约-1.3V处具有起始电势。
对于ECL过程，电子首先在负电势下注入UCNPs，然后将NaBiF4：Yb，Er还原为带负电的自由基。同时，将共反应剂S2O8 2-电化学还原为强氧化剂-硫酸根阴离子(SO4-·)，进一步与NaBiF4：Yb，Er-·反应生成激发态NaBiF4：Yb，Er*。NaBiF4：Yb，Er*返回基态并释放光子，从而产生强ECL信号。基于氧化还原(Ox-red)途径，NaBiF4：Yb，Er UCNP的ECL机制为：
NaBiF4:Yb,Er+e-→NaBiF4:Yb,Er-· (1)
S2O8 2-+e-→SO4 2-+SO4 -· (2)
NaBiF4:Yb,Er-·+SO4 -·→NaBiF4:Yb,Er*+SO4 2- (3)
NaBiF4:Yb,Er*→NaBiF4:Yb,Er+hv (4)
2.ECL生物传感器构建的表征
裸GCE的ECL信号很小，当NaBiF4：Yb3+/Er3+UCNPs在GCE表面成功修饰后，ECL强度急剧增加至约16250a。由于金纳米颗粒可以改善修饰电极的电导率并促进ECL反应中NaBiF4：Yb3+/Er3+的电荷转移，因此金纳米颗粒沉积后观察到ECL强度的进一步提高。在大肠杆菌O157：H7抗体通过与金纳米颗粒的强相互作用固定在电极表面后，ECL强度降低至约14600，表明连接上的抗体的电子传递动力学阻力大，从而降低了ECL试剂在电极界面的扩散速率。通过抗原抗体结合力将大肠杆菌O157：H7成功固定在生物传感器上后，ECL强度也显著降低。所有这些结果清楚地表明了生物传感器的构建步骤。
通过材料和生物分子的逐步修饰过程中ECL信号的变化，也证实了ECL生物传感器的构建步骤。(图4)裸GCE的ECL信号很小(曲线a)。当NaBiF4：Yb3+/Er3+UCNPs在GCE表面成功修饰后，ECL强度急剧增加至约16250a。(曲线b)。由于金纳米颗粒可以改善修饰电极的电导率并促进ECL反应中NaBiF4：Yb3+/Er3+的电荷转移，因此金纳米颗粒沉积后(17618au，曲线c)进一步观察到ECL强度的进一步提高。ECL强度显著降低至约14600a。(曲线d)大肠杆菌O157：H7抗体通过与金纳米颗粒的胺基团的强相互作用固定在电极表面，表明蛋白质膜的电子传递动力学阻力降低了ECL试剂在电极界面的扩散速率。通过抗原抗体结合力将3000CFU mL-1大肠杆菌O157：H7成功固定在生物传感器上后，ECL强度也显着降低。所有这些结果清楚地表明了生物传感器的成功制造。
AuNPs/NaBiF4：Yb3+/Er3+UCNPs功能化玻璃碳电极在负电位-2.5至0V范围内连续扫描20个周期，ECL信号无明显下降(图5)。因此，所制备的ECL生物传感器表现出优异的稳定性，并且将是进一步ECL检测的有希望的候选者。
3.大肠杆菌O157：H7的检测
为了获得最佳的ECL性能，研究了孵育时间和UCNPs浓度对ECL信号的影响。ECL强度随着溶液浓度从0.1到0.5mg mL-1的增加而增加，然后在UCNPs溶液浓度大于0.5mg mL-1时降低(图6)。因此，选择0.5mg mL-1的UCNPs浓度来制备生物传感器。对于孵育时间，将准备好的传感器暴露于10000CFU mL-1大肠杆菌O157：H7悬浮液中不同的时间，以研究孵育时间对ECL信号的影响。可以观察到随着孵育时间从0分钟增加到45分钟，ECL信号首先下降，然后在45分钟和60分钟时开始趋于平稳，这表明45分钟的孵育时间下，组装在电极表面的大肠杆菌O157：H7达到饱和状态(图7)。因此，45分钟是理想的孵育时间。
在优化条件下，研究了所构建的生物传感器检测大肠杆菌O157：H7的情况，大肠杆菌O157：H7浓度与ECL强度之间的关系(图8)。生物传感器的ECL强度随着细菌浓度的增加而逐渐降低，并且在200-100000CFU mL-1区间，ECL强度与细菌浓度有很好的线性关系，R＝0.995，回归方程为IECL＝22645.8-3621.7log(Cbacteria)，其中IECL代表ECL强度，Cbacteria代表大肠杆菌O157：H7的浓度。最低检出限为138CFU mL-1。当大肠杆菌O157：H7的浓度达到100000CFU mL-1以上时，传感器的ECL强度下降趋于平坦，因为传感器上所有结合位点都被大肠杆菌O157：H7占据。
为了评估所制备生物传感器的可重复性，分别连续四次对浓度为3000、5000和100000CFU mL-1的大肠杆菌O157：H7进行了检测。RSD分别为2.2％，1.5％和0.8％，表明ECL生物传感器具有出色的重现性。还研究了免疫传感器可长时间保存的稳定性。在4℃的冰箱中存放两周后，所存储生物传感器的ECL强度仍保持为初始强度的93.5％，这表明其长期稳定性良好。
在开发的大肠杆菌O157：H7生物传感器的选择性评估中，将18个E.coli Top 10用作对比评估，因为它没有O157和H7抗原。对于浓度在1000至10000CFU mL-1之间的大肠杆菌Top10，该传感器几乎没有表现出明显的ECL响应，没有明显减弱的ECL强度变化。随着浓度的进一步增加，在10000-500000CFU mL-1范围内，大肠杆菌Top 10的ECL强度由于物理粘附而略有下降(图9)。
以上结果表明，基于NaBiF4：Yb3+/Er3+上转换纳米颗粒的功能化生物传感器具有良好的选择性和出色的稳定性，因此在检测O157：H7大肠杆菌方面具有巨大潜力。
Claims (5)
1.用于致病细菌检测的ECL生物传感器，其特征在于制备和检测方法是按下述步骤进行的：
步骤一、用1.0、0.3和0.05μm的氧化铝浆料对裸露的玻碳电极进行连续抛光，使其表面光滑，然后用去离子水洗涤；
步骤二、在1mmol L-1K3[Fe(CN)6](包括0.2mol L-1KNO3)中测试循环伏安法，直到峰电位差小于80mV；
步骤三、将10μL的UCNPs溶液(0.1-1.0mg mL-1)滴加到GCE电极的表面上，并在室温下干燥后获得UCNPs修饰的电极(UCNPs/GCE)；
步骤四、将10μL金纳米颗粒溶液滴在UCNPs/GCE的表面上，室温干燥后，在表面再滴加10μL大肠杆菌O157：H7多克隆抗体(10μg·mL-1)并于4℃孵育过夜；
步骤五、用PBS洗涤后，将抗体修饰的电极与BSA溶液(1％，w/w)孵育1小时以封闭非特异性位点。然后将准备好的免疫传感器存储在4℃以便进一步使用；
步骤六、将10μL的O157：H7大肠杆菌悬浮液(浓度范围从0到500000CFU ml-1)分别与准备好的生物传感器在37℃下孵育15-60分钟，以将细菌固定在免疫传感器的表面；
步骤七、用PBS溶液仔细冲洗以除去未捕获的细菌后，将生物传感器在ECL检测池中进行ECL检测，电解液为0.1mol L-1PBS中包含0.1mol L-1K2S2O8(pH 7.4)。
2.根据权利要求1所述的用于致病细菌检测的ECL生物传感器的制备方法，其特征在于步骤三中NaBiF4：Yb3+/Er3+UCNP在生物传感器中最优的浓度是0.5mg mL-1。
3.根据权利要求1所述的用于致病细菌检测的ECL生物传感器的制备方法，其特征在于步骤四AuNPs/NaBiF4：Yb3+/Er3+UCNPs功能化玻碳电极在负电位-2.5至0V范围内连续扫描20个周期，其ECL信号保持稳定。
4.根据权利要求1所述的用于致病细菌检测的ECL生物传感器的制备和检测方法，其特征在于步骤六研究了孵育时间对ECL信号的影响，45分钟是最理想的孵育时间。
5.根据权利要求1所述的用于致病细菌检测的ECL生物传感器的制备和检测方法，其特征在于步骤七研究了生物传感器的ECL强度与细菌浓度之间的关系，在200至100 000CFUmL-1的线性范围内表现出对大肠杆菌O157：H7的高灵敏度响应，最低检测限是138CFU mL-1。
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