CN112646735B - 一种鳞腮绿僵菌、微生物杀虫剂、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鳞腮绿僵菌、微生物杀虫剂、制备方法及应用。其包括一株鳞腮绿僵菌，保藏名称为鳞腮绿僵菌(Metarhizium lepidiotae)MN114915，保藏编号为GDMCC61330，保藏时间为2020年12月1日，保藏地址为广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，分类名称为Metarhizium lepidiotae。发明人从土壤中分离获得一株新的鳞腮绿僵菌，该菌株具有高毒力杀虫功能，且培养方法简单，生长迅速，产孢量大。不会破坏生态、也不易产生抗药性，生物安全性高，可广泛用于蝗虫的防治中。
Description
技术领域
本发明涉及生物防治技术领域，具体而言，涉及一种鳞腮绿僵菌、微生物杀虫剂、制备方法及应用。
背景技术
绿僵菌(Metarhizium)是一类重要的虫生真菌，全世界约有200多种害虫能被这种真菌感染致死。绿僵菌的孢子可以附着在害虫表皮，穿透表皮入侵到害虫体内，利用害虫营养生长繁殖并分泌毒素直至害虫得病死亡。害虫死亡后的尸体又可以释放新的孢子，经传播感染其他害虫。此外，绿僵菌也是土壤中常见的一种腐生菌，可以从根际土壤中分离得到，与植物生长具有一定的关系。
目前，绿僵菌属在全世界范围内拥有约30个物种(Kepler et al.2014)，不同的绿僵菌属物种能侵染致死的害虫的范围不同，毒性也存在一定的差异性。鳞腮绿僵菌(Metarhizium lepidiotae)(Driver&Milner)属于绿僵菌属(Metarhizium)的其中一个物种，最早分离自田间采集的鳞翅目害虫Lepidiota consobrina的尸体，最初被当成是金龟子绿僵菌的变种(Driver et al.2000)，后经过多基因的比对及鉴定，发现鳞腮绿僵菌是一个独特的物种(Bischoff et al.2009)。
目前存在化学农药毒性大，农作物中农药残留，害虫抗药性等问题。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种鳞腮绿僵菌、微生物杀虫剂、制备方法及应用以解决上述技术问题。
针对目前存在的技术问题，发明人从土壤中分离获得两株新的鳞腮绿僵菌，该菌株具有高毒力杀虫功能，且培养方法简单，生长迅速，产孢量大。尤其是对蝗虫的致死率高，且无毒无污染，不会破坏生态、也不易产生抗药性，生物安全性高，可广泛用于蝗虫的防治中。
本发明是这样实现的：
一种鳞腮绿僵菌，其包括鳞腮绿僵菌；
鳞腮绿僵菌的内部编号为MN114915，保藏编号为GDMCC NO：61330，保藏时间为2020年12月1日，保藏地址为广东省微生物菌种保藏中心，地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；广东省微生物研究所，分类学名称为Metarhizium lepidiotae。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述鳞腮绿僵菌的菌落培养特征为：在真菌培养基上初期为白色，有絮状或绒毛状突起，培养5天后菌落直径为2.63-2.93cm，培养10天后菌落直径为4.33～5.77cm，培养15天后菌落直径为6.65～7.95cm；产孢时由里向外长绿色分生孢子，颜色由嫩绿色至暗绿色；菌丝具有分枝分隔，直径1.9-3.1μm；分生孢子单细胞，柱状，大小为5.7～9.3μm×2.5～3.1μm；鳞腮绿僵菌的最适生长温度25～30℃。
优选地，真菌培养基选自SDAY培养基、液体沙氏培养基(liquid sabourandmedium，SDB)、改良马丁培养基(martin broth modified)、马铃薯葡萄糖肉汤(potatodextrose broth PDB)、麦芽提取物(malt extract，BD)、玉米粉琼脂(corn meal medium)、高盐察氏培养基(salt czapek dox agar medium)、孟加拉红培养基(rose Bengalmedium)或马铃薯葡萄糖琼脂(potato dextrose agar，PDA)。
在一种实施方式中，上述真菌培养基还可以是沙氏琼脂培养基(sabourand’sagar medium，SDA)，上述的培养基可以是自主配制而成也可以是选自市售的商品。
在一种实施方式中，真菌培养基并不限于上述的范围内，只要能实现鳞腮绿僵菌的培养的培养基质，均可用于鳞腮绿僵菌的富集培养。
上述鳞腮绿僵菌在制备微生物杀虫剂中的应用。
上述鳞腮绿僵菌可以用于制备微生物杀虫剂，从而在农业害虫和/或卫生害虫防治中发挥其功效。
由上述鳞腮绿僵菌制备的微生物杀虫剂。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述微生物杀虫剂的有效成分是：含有鳞腮绿僵菌1或鳞腮绿僵菌2的水剂，鳞腮绿僵菌1或鳞腮绿僵菌2的菌株浓度为105～1010cfu/ml。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述微生物杀虫剂的有效成分是：含有鳞腮绿僵菌1或鳞腮绿僵菌2的粉剂，鳞腮绿僵菌1或鳞腮绿僵菌2的菌株浓度为105～1010cfu/ml。
在本发明应用较佳的实施方式中，上述微生物杀虫剂还包括下述载体中的至少一种：防腐剂、乳化剂或紫外保护剂。在其他实施方式中，上述的微生物杀虫剂可以配置为农药上允许的任意一种的剂型，并不限于上述的水剂或粉剂。
上述的防腐剂用于抑制微生物的活动，可以是选自酸性防腐剂、脂型防腐剂、无机盐防腐剂、生物防腐剂等。
酸性防腐剂可以是苯甲酸、山梨酸、丙酸及其盐。脂型防腐剂可以是尼泊金脂类、没食子酸脂等。无机盐防腐剂可以是含硫的亚硫酸盐，焦盐酸等。生物防腐剂可以是溶菌酶等物质。
上述的乳化剂可以是选自白蛋白、大豆磷脂、卵磷脂、脂肪酸山梨坦和硬酯酸单甘油酯中的一种。
需要说明的是，上述作为微生物杀虫剂的有效成分可以是主要有效成分，也可以是次要的有效成分，即上述的鳞腮绿僵菌可以与其他具有杀虫功效的微生物组合使用，以发挥协同杀虫功效。
一种微生物杀虫剂在防治农业害虫和/或卫生害虫中的应用，农业害虫选自鳞翅目害虫、半翅目害虫、直翅目害虫和鞘翅目害虫中的至少一种；卫生害虫包括双翅目昆虫和蛛形纲害虫中的至少一种；
优选地，鳞翅目害虫选自草地贪夜蛾、甜菜夜蛾、二化螟、三化螟、小菜蛾和茶尺蠖中的至少一种；半翅目害虫选自飞虱、粉虱、蚜虫、叶蝉和柑橘木虱中的至少一种；双翅目昆虫选自黑腹果蝇、家蝇、柑橘小实蝇和蚊中的至少一种；直翅目害虫选自蝗虫、螽斯和蝼蛄中的至少一种；蛛形纲害虫选自二斑叶螨、柑橘全爪螨中的至少一种；
优选地，蝗虫选自东亚飞蝗。
在其他实施方式中，上述卫生害虫还可以选自虻、蠓、蚋、白蛉、蝇、蟑螂(蜚蠊)、跳蚤、虱、臭虫和蛛形纲蜱螨亚纲的蜱类、革螨、恙螨、疥螨、蠕形螨、粉螨、蒲螨等。
需要说明的是，上述的微生物杀虫剂可以同时对上述的一种、两种或者三种及以上的害虫进行防治，上述的防治并不限于直接致使害虫死亡，也包括降低害虫的活动能力，从而间接减少农业减产的发生。
一种微生物杀虫剂的制备方法，其包括如下步骤：
利用液体深层发酵方法在培养基中进行鳞腮绿僵菌的菌株发酵，得到发酵液；发酵时控制温度为25-30℃，pH值为6，发酵时间为5天；然后将发酵液调制成水剂或粉剂。
上述的液体深层发酵方法为本领域技术人员熟练掌握的技术。
一种鳞腮绿僵菌在促进植物生长中的应用；优选地，植物为玉米；优选地，玉米品种为郑单958。在其他实施方式中，上述的植物品种包括并不限于水稻、高粱、大麦、棉花、油菜、豆科植物。
应用是指：将植物种子置于鳞腮绿僵菌的孢子悬浮液中处理。
本发明具有以下有益效果：
本发明分离获得两株新的鳞腮绿僵菌，该菌株具有高毒力杀虫功能，且培养方法简单，生长迅速，产孢量大。尤其是对蝗虫的致死率高，且无毒无污染，不会破坏生态、也不易产生抗药性，生物安全性高，可广泛用于农业害虫的防治中。此外，本发明提供的鳞腮绿僵菌具有开发为微生物杀虫剂的潜力。鳞腮绿僵菌还具有一定的促进植物生长的作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为接种4～5天后挑取白色菌丝制片后的显微图；
图2为接种10～12天后挑取分生孢子制片后的显微图；
图3为接种15天后MN113832菌株的菌落形态正面图；
图4为接种15天后MN113832菌株的菌落形态背面图；
图5为接种15天后MN114915菌株的菌落形态正面图；
图6为接种15天后MN114915菌株的菌落形态背面图；
图7为培养基上的僵虫；
图8为基于测序结果建立的系统发育树；
图9为温度对菌株生长的影响结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例中的鳞腮绿僵菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏名称为鳞腮绿僵菌(Metarhizium lepidiotae)MN114915，保藏编号为GDMCC NO：61330，保藏时间为2020年12月1日，保藏地址为广东省微生物菌种保藏中心，地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；广东省微生物研究所，分类名称为Metarhizium lepidiotae。
上述菌株的分离、纯化方法包括如下依次进行的步骤：
称土：采集广西的农业土壤，晾干后，将土壤样品过筛去除杂质，称取干土10g装入过滤装置中。
洗土：用自来水洗土10min，使土壤颗粒通过1mm黄铜网和两个聚丙烯过滤器向下流动。收集最底层的土壤微粒，将其放入无菌的50mL离心管中，加入50mL无菌水，涡旋混合器使其悬浮。然后在10000rpm条件下离心6min，倒掉上清，用无菌水清洗，再次离心，重复离心清洗3次。
然后稀释沉淀：按水/颗粒的20:1(v/v)的比例加入无菌的羧甲基纤维素钠溶液。
涂布：用无菌水稀释10倍的上述沉淀悬浮液，用移液器吸取100μL上述稀释液至PDA(含有氯霉素和盐酸四环素)平板上涂布均匀，然后将平板置于28℃下黑暗培养2～7天。在其他实施方式中，也可根据需要选自其他的抗生素平板进行涂布。
真菌纯化：当培养基上长出单个白色絮状的菌落，用无菌牙签挑取少量的菌丝至SDAY平板中继续培养得到纯化菌株。
实施例2
将实施例1分离获得的菌株分别进行形态学鉴定和分子生物学鉴定。
形态学鉴定：
将分离到的鳞腮绿僵菌接种在SDAY培养基平板上28℃培养15天观察菌落形态特征、产孢结构和孢子形态大小。在4～5天后挑取白色菌丝做成制片，在显微镜下观察菌丝及分生孢子梗形态；10～12天挑取分生孢子做成制片观察分生孢子的大小及形态。15天观察记录菌落形态特征。
图1所示的是接种4～5天后挑取白色菌丝制片后的显微图，放大倍数为400倍。图2为接种10～12天后挑取分生孢子制片后的显微图，放大倍数为400倍。图3为接种15天后MN113832菌株的菌落形态正面图，图4为接种15天后MN113832菌株的菌落形态背面图。图5为接种15天后MN114915菌株的菌落形态正面图，图6为接种15天后MN114915菌株的菌落形态背面图。
菌株在SDAY培养基上初期为白色，有絮状或绒毛状突起，从中心位置开始产生孢子，分生孢子嫩绿色至暗绿色。菌丝有隔，直径1.9-3.1μm；分生孢子单细胞，柱状，大小为(5.7～9.3)μm×(2.5～3.1)μm。
分子生物学鉴定：
取上述生长15天的鳞腮绿僵菌提取基因组DNA，作为基因扩增的模板，并使用如下的引物进行多基因扩增及测序。
ITS:ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)
BenA:Bt1F(5’-GGTCCCTTCGGTCAGCTCTTCC-3’)和Bt1R(5’-CAGCCATCATGTTCTTAGGGTC-3’)
EF:983F(5’-GCYCCYGGHCAYCGTGAYTTYAT-3’)和2218R(5’-ATGACACCRACRGCRACRGTYTG-3’)
RPB1:Mz1F1(5’-CGRACMYTRCCYCATTTCACAA-3’)和Mz1R1(5’-TTGAGCGGAAGYTGCATCATCTCC-3’)
RPB2:5F(5’-GAYGAYMGWGATCAYTTYGG-3’)和7CR(5’-CCCATRGCTTGYTTRCCCAT-3’)
以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
模板DNA提取：根据Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit(BioFlux,Bioer Technology Co.,Ltd.)进行基因组DNA提取。
基因扩增反应体系：在PCR管配制反应体系：
2×Taq PCR Master Mix 12μL，DMSO 1μL，上下游引物(10μmol/L)各0.6μL，ddH2O10.8μL，模板DNA 2μL。
PCR扩增条件如下：预变性94℃4min；变性94℃40s，退火55℃40s，延伸72℃1min，变性至延伸进行35个循环；延伸72℃10min，10℃保温5min。PCR后的样品送金唯智测序。
其中，菌株MN113832的ITS、BenA、EF、RPB1和RPB2序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，菌株MN114915的ITS、BenA、EF、RPB1和RPB2序列分别如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
基于多基因(ITS,BenA,EF,RPB1,RPB2)的测序序列建立的系统发育树参照图8所示，由进化树可知分离出的菌株MN113832,MN114915属于鳞腮绿僵菌(Metarhiziumlepidiotae)。
实验例1
本实验例对实施例2分离出的菌株MN113832,MN114915分别进行生物学测定，探究温度对菌株MN113832,MN114915的影响，同时对菌落生长速率、产孢量、孢子萌发率进行测定。
(1)温度对菌株生长的影响。
将培养好的鳞腮绿僵菌孢子用0.1％Tween80洗下，吸取10μl接种到新的SDAY培养基上，分别在20℃、25℃、28℃、30℃和37℃五个不同的温度下进行恒温培养，每天测量菌落的直径，每个温度处理组设置3个重复。
(2)菌落生长速率的测定。
将培养好的鳞腮绿僵菌孢子用0.1％Tween80洗下，吸取10μl接种到新的SDAY培养基上，做3个重复，每天定时测定其直径并记录数据，直到菌落长满培养基为止。
(3)产孢量的测定。
将100μl鳞腮绿僵菌的孢子悬浮液涂布于SDAY上，在28℃条件下培养12天后，用打孔器从平板上截取直径8mm的菌片，在超声波破碎仪上将菌片上的分生孢子振动洗入10ml0.1％Tween80中，用血球计数板计数测定孢子浓度，再换算为每cm2平板上的产孢量。每个平板打3个孔进行孢子含量测定取其平均值，作为1个重复的孢子数。各菌株重复测定3次。
(4)孢子萌发率的测定。
将培养10～15天的鳞腮绿僵菌平板，用打孔器取直径4mm的菌片，在超声波破碎仪上将菌片上的分生孢子振动洗入2ml 0.1％Tween80中，各取20μl孢子悬浮液加到带有凹槽的载玻片上，把载玻片放在含有湿润滤纸的平皿中，置于相同条件的培养箱内培养24h，用400倍的倒置生物显微镜随机观察载玻片3个视野，以孢子的芽管长度大于或等于孢子短轴直径为标准，统计孢子萌发率。
温度对菌株生长的影响结果参照图9所示，由图9可知，温度在25～30℃时，MN113832和MN114915的生长速率最快，而在低温(20℃)或高温(37℃)都有效抑制菌株的生长。从上述实验结果可知，鳞腮绿僵菌的最适生长温度为25～30℃。
菌落生长速率的测定结果显示，菌株MN113832和菌株MN114915在SDAY平板上培养从第二天开始菌株开始快速生长，并在第四天达到最快，第5天后，由于开始产孢菌落的生长速度也相应下降，但仍然每天生长0.40～0.61cm,表面菌株的生长快。
产孢量和孢子萌发率的测定结果显示：在SDAY培养基上培养至第15天产孢量可达0.8～1.1×108孢子/cm2。此时产孢量较高。24小时孢子的萌发率可达90％以上。上述结果均说明该菌株营养要求简单、生长繁殖较快、产孢快，生物学特性良好。
实验例2
本实验例对实施例2分离获得的菌株MN113832和菌株MN114915对东亚飞蝗的致病力进行测定。
实验方法如下：
将供菌株MN113832和菌株MN114915从-80℃取出，在SDAY平板上活化，28℃培养7～15天，直到产孢。用0.1％Tween80将绿僵菌孢子洗下，用血球计数板计数，获得具体浓度的孢子悬浮液，再经过稀释或浓缩配制成1×105cfu/ml、1×106cfu/ml、1×107cfu/ml、1×108cfu/ml、1×109cfu/ml的悬浮液。
挑选大小、活性一致的3龄蝗蝻。用移液枪取10μl的孢子悬浮液点在蝗虫的前胸背板上，继续饲养，每日喂新鲜小麦苗。每个处理3个重复，每个重复15只蝗蝻。以无菌的0.1％Tween80水作为空白对照。置于28℃～30℃，RH 55％±5％，16L:8D条件下培养，连续观察10天，记录死亡情况。蝗虫死亡判断，以镊子轻轻触碰蝗虫，不动则为死亡。
死亡蝗虫回接：此步骤验证蝗虫是否由鳞腮绿僵菌侵染致死。对死亡蝗虫进行表面消毒，具体方法为75％酒精15s，0.05％次氯酸钠1min，无菌水1min清洗两次，然后在灭菌滤纸上晾干，最后把蝗虫放入SDAY培养基(含氯霉素和盐酸四环素)上，观察蝗虫表面是否长出鳞腮绿僵菌。培养基上的僵虫参照图7所示。
数据的计算公式如下：
实验结果参照表1-表8所示，表1为MN113832的校正死亡率(％)，表2为MN114915的校正死亡率(％)，表3和表4分别为MN113832和MN114915的LC50回归方程及LC50，表5和表6分别为MN113832和MN114915的LT50回归方程及LT50，表7和表8分别为MN113832和MN114915的菌落直径的生长速度统计表(28℃)。
实验结果显示，鳞腮绿僵菌MN113832和MN114915均对蝗虫有显著的致病效果。在不同浓度鳞腮绿僵菌孢子悬浮液处理下，第10天的致死中浓度(LC50)为0.783×106～1.94×106cfu/ml；在1×108cfu/ml浓度下，第10天时鳞腮绿僵菌对蝗虫的累计校正致死率为100％，致死中时的(LT50)为1.41～2.55天，侵染蝗虫致死率为95.24％～100.00％，死亡蝗虫回接僵虫率为100％。上述实验结果表明，鳞腮绿僵菌菌株具有开发为防治蝗虫的微生物农药的潜力。
表1 MN113832的校正死亡率(％)。
表2 MN114915的校正死亡率(％)。
表3 MN113832的LC50回归方程及LC50。
表4 MN114915的LC50回归方程及LC50。
表5 MN113832的LT50回归方程及LT50。
表6 MN114915的LT50回归方程及LT50。
表7 MN113832的菌落直径的生长速度统计表(28℃)。
表8 MN114915的菌落直径的生长速度统计表(28℃)。
实验例3
本实验例进行鳞腮绿僵菌对植物促生作用测定。
选取健康且大小一致的玉米种子(郑单958)进行表面消毒后，将种子置于1×107cfu/ml的鳞腮绿僵菌孢子悬液中浸泡半小时，然后进行播种，每盆播种5颗种子，共播种3盆，播种后向每颗种子浇灌1mL处理液。以无菌水浸泡0.5h作为对照组，置于25℃温室下，以12L:12D的光周期进行培育，实验期间定期往育苗盆及底盘补充水，保证水分充足。盆栽培育20天后，收获植株洗净后放入65℃烘箱中烘至恒重后测量植物干重。(实验组-对照组)/对照组*100％。
表9干重生长指标。
上述的表9结果显示：相比于对照组(CK)，鳞腮绿僵菌处理组的玉米植株干重分别提高了25.00％和62.50％，说明该种菌株对植物生长具明显的促生作用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 慕恩（广州）生物科技有限公司
<120> 一种鳞腮绿僵菌、微生物杀虫剂、制备方法及应用
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 538
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
agggacatta tcgagttctg aaaaaactcc caacccctgt gaactatacc tgtaactgtt 60
gcttcggcgg gacttgtgcc cgccggggga cccaaacctt ctgaattttt taagtatctt 120
ctgagtggta aaaaaaaatg aatcaaaact ttcaacaacg gatctcttgg ttctggcatc 180
gatgaagaac gcagcgaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg 240
aatctttgaa cgcacattgc gcccgccagt attctggcgg gcatgcctgt tcgagcgtca 300
ttacgcccct caagtcccct gcggacttgg tgttggggat cggcgagcgc tgtttgctca 360
gcacgccgtc cccgaaattc attggcggtc tcgccgtggc cctcctctgc gcagtagtaa 420
aacactcgca acaggagccc ggtgaggtcc actgccgtaa aacccccgac tttttacagt 480
tgacctcgaa tcaggtagga ctacccgctg aacttaagca tatcaataag cggaggaa 538
<210> 2
<211> 649
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgtcagctct tccgtcccga caacttcgtc tttggtcagt ctggtgctgg caacaactgg 60
gccaagggtc actacactga gggtgctgag cttgtcgaca atgtccttga tgttgtccgt 120
cgcgaggcgg aaggttgtga ctgcctccag ggcttccaga tcacccactc tctcggtggt 180
ggtaccggtg ccggtatggg tactctgttg atctccaaga tccgtgaaga gtttcccgac 240
cgaatgatgg ccactttctc cgtcgttccc tctcccaagg tttccgacac cgttgtcgag 300
ccctacaacg ccactctctc cgtccatcag ctcgttgaga actctgacga gactttctgc 360
atcgacaacg aggctctgta cgacatctgc atgcgcactc tcaagctgtc taacccttcg 420
tacggtgacc tgaactatct cgtctctgcc gtcatgtctg gcgtcaccac atgcttgcgt 480
ttccccggtc agttgaactc tgatctgcgt aagctggctg tcaacatggt ccccttccct 540
cgtctgcact ttttcatggt cggcttcgcc cccctgacca gccgtggtgc tcactctttc 600
cgcgctgtca gcgtacctga gctcacccag cagatgttcg accctaaga 649
<210> 3
<211> 768
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tccgaggccc gttaccagga aatcatcaag gagacttcca acttcatcaa gaaggtcggc 60
tacaacccca agaccgtcgc cttcgtcccc atctccggtt tccacggtga caacatgctt 120
caggcctcta ccaactgccc ctggtacaag ggttgggaga aggagaccaa ggctggcaag 180
tccaccggca agaccctcct tgaggccatt gacgccattg agccccccaa gcgtcccacc 240
gacaagcccc tccgtcttcc cctccaggat gtgtacaaga tcggcggtat tggaactgtc 300
cctgtcggcc gtatcgagac tggtgtcctc aagcccggta tggtcgttac cttcgctccc 360
tccaacgtca ccactgaagt caagtccgtg gaaatgcacc acgagcagct tactgagggt 420
gtccccggcg acaacgttgg tttcaacgtg aagaacgttt ccgtcaagga aatccgccgt 480
ggtaacgttg ctggtgactc caagaacgac cccccctctg gtgccgcttc cttcgatgcc 540
caggtcatcg ttctcaacca ccccggccag gtcggtgctg gttacgctcc cgtcctcgat 600
tgccacaccg cccacattgc ctgcaagttc tctgagatca aagagaagat tgaccgacgt 660
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<211> 511
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
catttcacaa aggatgacta ctctcccgaa gcacgtggct ttgtcgagaa ctcttacctc 60
cgtggtctca caccctctga attcttcttc cacgccatgg ctggtagaga aggtctcatt 120
gatactgctg tcaagactgc agagacaggt tatattcagc gacgacttgt gaaggctctt 180
gaagacttga gcgctcggta cgatggcact gtacgaaact cgttgggtga catcgtccag 240
tttctctatg gagaagatgg tctcgatgcc atgtgcattg agaagcagaa gctcggtatc 300
ctcaaaatgt cagatcctgc gttcgagaaa aagtatcgtc tggacttggc caacccacct 360
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aataagtcta agatgggaga ggagatgatg c 511
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aatgaatacg gaattgtcca attatttgcg aagatgcgtt gaaggtaacc ggcatttcaa 60
cttggcagtt ggtatcaagc ccggaacact ttccaacggt ttgaaatatt cccttgccac 120
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ggaagtggta gaagagtacg agccgctgag atatccccat gccaccaaga tctttgtcaa 480
tggtgtttgg gttggtgtac accaagatcc taagcacctg gtcagtcaag tcttggatac 540
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aggattgatt cgtgccggcg ccgtcgagta cctcgatgcc gaagaagaag agacatcaat 840
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tgatgacgac attggagatg acctgaataa gcgtctcaag accaagacca accccacaac 960
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggaggacatt accgagtttt caactcccaa acccactgtg aacatatacc tttgttttcg 60
ttgcctcggc ggttcacgcc gccgggtgac acctaaaccc tgattttaat tacagaagtc 120
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gtcatttcaa ccctcaagac cccttcgggg gacttggtgt tggggaccgg cataggggcc 360
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gagga 545
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<213> 人工序列
<400> 7
cgtcagctct tccgtcccga caacttcgtc tttggtcagt ctggtgctgg caacaactgg 60
gccaagggtc actacactga gggtgctgag cttgtcgaca atgtccttga tgttgtccgt 120
cgcgaggcgg aaggttgtga ctgcctccag ggcttccaga tcacccactc tctcggtggt 180
ggtaccggtg ccggtatggg tactctgttg atctccaaga ttcgtgaaga gtttcccgac 240
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ccctacaacg ccactctctc cgtccatcag ctcgttgaga actctgacga gactttctgc 360
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cgtctgcact ttttcatggt cggcttcgcc cccctgacca gccgtggtgc tcactctttc 600
cgcgctgtca gcgtacctga gctcacccag cagatgttcg accctaaga 649
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<212> DNA
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<400> 8
caagcagctc attgtcgcca tcaacaagat ggacaccacc aagtggtccg aggcccgtta 60
ccaggaaatc atcaaggaga cttccaactt catcaagaag gtcggctaca accccaagac 120
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<400> 9
atttcacaaa ggatgactac tctcccgaag cacgtggctt tgtcgagaac tcttacctcc 60
gtggtctcac accctctgaa ttcttcttcc acgccatggc tggtagagaa ggtctcattg 120
atactgctgt caagactgca gagacaggtt atattcagcg acgacttgtg aaggctcttg 180
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cgcagaatga atacggaatt gtccaattat ttgcgaagat gcgttgaagg taacaggcat 60
ttcaacttgg cagttggtat caagcccgga acactttcca acggtttgaa atattccctt 120
gccactggca actggggaga ccagaagaag gccatgagtt cgactgccgg cgtgtcccaa 180
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agtattattc cgtttcccga tcacaatcag gtaagcagc 1059
Claims (12)
1.一种鳞腮绿僵菌(Metarhizium lepidiotae)，其特征在于，
所述鳞腮绿僵菌的内部编号为MN114915，保藏编号为GDMCC NO：61330，保藏时间为2020年12月1日，保藏地址为广东省微生物菌种保藏中心，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，分类学名称为Metarhizium lepidiotae。
2.如权利要求1所述的鳞腮绿僵菌在制备微生物杀虫剂中的应用。
3.权利要求1所述的鳞腮绿僵菌制备的微生物杀虫剂。
4.根据权利要求3所述的微生物杀虫剂，其特征在于，所述微生物杀虫剂的有效成分是：含有鳞腮绿僵菌的水剂，所述鳞腮绿僵菌的菌株浓度为105～1010孢cfu/ml。
5.根据权利要求3所述的微生物杀虫剂，其特征在于，所述微生物杀虫剂的有效成分是：含有鳞腮绿僵菌的粉剂，所述鳞腮绿僵菌的菌株浓度为105～1010cfu/ml。
6.根据权利要求3所述的微生物杀虫剂，其特征在于，所述微生物杀虫剂还包括下述载体中的至少一种：防腐剂、乳化剂或紫外保护剂。
7.一种如权利要求3-6任一项所述的微生物杀虫剂在防治农业害虫中的应用，其特征在于，所述农业害虫选自蝗虫。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述蝗虫选自东亚飞蝗。
9.一种如权利要求3-6任一项所述的微生物杀虫剂的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
利用液体深层发酵方法在培养基中进行鳞腮绿僵菌的菌株发酵，得到发酵液；发酵时控制温度为25-30℃，pH值为6，发酵时间为5天；然后将发酵液调制成水剂或粉剂。
10.一种如权利要求1所述的鳞腮绿僵菌在促进玉米生长中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述玉米品种为郑单958。
12.根据权利要求10或11所述的应用，其特征在于，所述应用是指：将植物种子置于鳞腮绿僵菌的孢子悬浮液中处理。
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