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CN112601814A - 包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块及其制备方法 - Google Patents

包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块及其制备方法 Download PDF

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CN112601814A
CN112601814A CN201980055406.0A CN201980055406A CN112601814A CN 112601814 A CN112601814 A CN 112601814A CN 201980055406 A CN201980055406 A CN 201980055406A CN 112601814 A CN112601814 A CN 112601814A
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cell
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transduction pathway
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中野德重
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Sumitomo Chemical Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Chemical Co Ltd
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Abstract

包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备方法，所述方法包括下述步骤(1)～(3)，步骤(1)，将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，形成细胞聚集体，步骤(2)，在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养所述步骤(1)中得到的细胞聚集体，步骤(3)，将所述步骤(2)中得到的细胞聚集体进行悬浮培养，得到所述细胞团块，其中，该步骤(3)包含选自由下列步骤组成的组中的至少一个步骤：步骤(3a)，在FGF信号转导途径作用物质的存在下进行悬浮培养，步骤(3b)，在BMP信号转导途径抑制物质的存在下进行悬浮培养，及步骤(3c)，在FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质的存在下进行培养。

Description

包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块及其制备方法
技术领域
本发明涉及在体外的包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块，及其制备方法。进一步，涉及包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块，其中，在细胞团块中同时包含神经系统细胞和非神经上皮组织。
背景技术
在Int J Clin Exp Pathol 2017；10(7)：8072-8081(非专利文献1)中报告，通过将由小鼠iPS细胞形成的胚状体与由小鼠收集的嗅上皮或嗅球的初代培养细胞进行共培养，诱导分化为一部分表达嗅神经细胞标记的神经细胞。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Int J Clin Exp Pathol 2017；10(7)：8072-8081
发明概述
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供由多潜能干细胞有效地制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的办法。尤其是提供有效地制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的办法，其以无饲养细胞培养的多潜能干细胞作为起始材料，且不使用从生物体分离的嗅上皮或嗅球的初代培养细胞。
用于解决问题的手段
本发明人在为解决上述问题进行反复研究时，发现通过将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，一次添加BMP信号转导途径作用物质并培养给定时期后，进一步添加FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质中的至少一种，可有效地制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块。此外，通过将BMP信号转导途径作用物质，FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质的添加条件最优化，从而将最适添加时期确定为将BMP信号转导途径作用物质在从多潜能干细胞的悬浮培养开始起72小时以内添加，接着将FGF信号转导途径作用物质或者BMP信号转导途径抑制物质在从BMP信号转导途径作用物质的添加起96小时以内添加，由此成功地更有效地制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块。此外发现，通过将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，利用选自由TGFβ家族信号转导途径抑制物质及sonic hedgehog信号转导途径作用物质组成的组中的至少1个进行前培养，从而能够改善包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备效率。即，本发明涉及以下例示的内容。
[1]包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备方法，所述方法包括下述步骤(1)～(3)，
步骤(1)，将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，形成细胞聚集体，
步骤(2)，在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养上述步骤(1)中得到的细胞聚集体，
步骤(3)，将上述步骤(2)中得到的细胞聚集体进行悬浮培养，而得到上述细胞团块，
其中，该步骤(3)包含选自由下列步骤组成的组中的至少一个步骤，
步骤(3a)，在FGF信号转导途径作用物质的存在下进行悬浮培养，
步骤(3b)，在BMP信号转导途径抑制物质的存在下进行悬浮培养，及
步骤(3c)，在FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质的存在下进行悬浮培养。
[2]根据[1]所述的制备方法，其中，上述步骤(3)包含上述步骤(3a)，在上述步骤(3a)后进一步包含上述步骤(3c)。
[3]根据[1]或[2]所述的制备方法，其中，在上述步骤(1)中，上述多潜能干细胞分散为单一细胞。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的制备方法，其中，上述步骤(3)包含上述步骤(3b)或上述步骤(3c)，在上述步骤(3b)或上述步骤(3c)后进一步包含在不存在BMP信号转导途径抑制物质的条件下进行悬浮培养的步骤(3d)。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的制备方法，其中，在上述步骤(3)中，还存在EGF信号转导途径作用物质。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的制备方法，其中，在上述步骤(1)前，进一步包含步骤(a)，所述步骤(a)为将上述多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，以包含1)选自TGFβ家族信号转导途径抑制物质及sonic hedgehog信号转导途径作用物质中的至少1个，和2)未分化维持因子的培养基进行培养的步骤。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的制备方法，其中，上述步骤(2)的开始时期为从上述步骤(1)的多潜能干细胞的悬浮培养开始起0.5小时以后到72小时以内。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的制备方法，其中，上述步骤(2)的开始时期为上述步骤(1)中形成的上述细胞聚集体的表层中，有1成以上的细胞互相形成紧密连接的时期。
[9]根据[1]～[8]中任一项所述的制备方法，其中，上述BMP信号转导途径作用物质包含选自由BMP2，BMP4，BMP7，BMP13及GDF7组成的组中的至少1个蛋白质。
[10]根据[1]～[9]中任一项所述的制备方法，其中，上述BMP信号转导途径作用物质包含BMP4，在上述BMP4的浓度为25pM～5nM的培养基中开始上述步骤(2)的培养。
[11]根据[1]～[10]中任一项所述的制备方法，其中，上述步骤(3)包含选自由上述步骤(3a)及上述步骤(3c)组成的组中的至少1个步骤，上述FGF信号转导途径作用物质包含选自由FGF2及FGF8，以及它们的变体组成的组中的至少一种。
[12]根据[1]～[11]中任一项所述的制备方法，其中，上述步骤(3)的开始时期为从添加上述步骤(2)的BMP信号转导途径作用物质起12小时以后到72小时以内。
[13]根据[1]～[12]中任一项所述的制备方法，其中，在选自由上述步骤(2)及上述步骤(3)组成的组中的至少1个步骤中，存在上述第一Wnt信号转导途径抑制物质。
[14]根据[1]～[13]中任一项所述的制备方法，其中，上述第一Wnt信号转导途径抑制物质包含具有对于非经典的Wnt途径的抑制活性的物质。
[15]根据[1]～[14]中任一项所述的制备方法，其中，上述第一Wnt信号转导途径抑制物质包含PORCN抑制剂。
[16]根据[15]所述的制备方法，其中，上述PORCN抑制剂包含选自由IWP-2，IWP-3，IWP-4，IWP-L6，IWP-12，LGK-974，Wnt-C59，ETC-159及GNF-6231组成的组中的至少一种。
[17]根据[15]或[16]所述的制备方法，其中，上述PORCN抑制剂包含IWP-2，在上述IWP-2的浓度为10nM～50μM的培养基中开始上述步骤(1)的培养。
[18]根据[1]～[17]中任一项所述的制备方法，其中，上述第一Wnt信号转导途径抑制物质包含选自由KY02111及KY03-I组成的组中的至少一种。
[19]根据[1]～[18]中任一项所述的制备方法，其中，上述第一Wnt信号转导途径抑制物质包含KY02111，在上述KY02111的浓度为10nM～50μM的培养基中开始上述步骤(1)的培养。
[20]根据[1]～[19]中任一项所述的制备方法，其中，上述步骤(3)包含选自由上述步骤(3b)及上述步骤(3c)中的至少1个步骤，上述BMP信号转导途径抑制物质包含I型BMP受体抑制剂。
[21]根据[20]所述的制备方法，其中，上述I型BMP受体抑制剂包含选自由K02288，Dorsomorphin，LDN-193189，LDN-212854，LDN-214117，ML347，DMH1及DMH2组成的组中的至少一种。
[22]根据[20]或[21]所述的制备方法，其中，上述I型BMP受体抑制剂包含K02288，在上述K02288的浓度为10nM～50μM的培养基中开始上述步骤(3)。
[23]根据[1]～[22]中任一项所述的制备方法，其中，在选自由上述步骤(1)，上述步骤(2)及上述步骤(3)组成的组中的至少1个步骤中还存在TGFβ信号转导途径抑制物质。
[24]根据[23]所述的制备方法，其中，上述TGFβ信号转导途径抑制物质包含Alk5/TGFβR1抑制剂。
[25]根据[24]所述的制备方法，其中，上述Alk5/TGFβR1抑制剂包含选自由SB431542，SB505124，SB525334，LY2157299，GW788388，LY364947，SD-208，EW-7197，A83-01，RepSox组成的组中的至少一种。
[26]根据[24]或[25]所述的制备方法，其中，上述Alk5/TGFβR1抑制剂包含SB431542，在培养基中上述SB431542的浓度为10nM～100μM。
[27]根据[6]所述的制备方法，其中，上述sonic hedgehog信号转导途径作用物质包含选自由SAG，嘌吗啡胺及GSA-10组成的组中至少一种。
[28]根据[6]或[27]所述的制备方法，其中，上述sonic hedgehog信号转导途径作用物质的浓度为具有相当于10nM至700nM的SAG的sonic hedgehog信号传导促进活性的浓度。
[29]根据[1]～[28]中任一项所述的制备方法，其中，在选自由上述步骤(1)，上述步骤(2)及上述步骤(3)组成的组中的至少1个步骤中还存在Wnt信号转导途径作用物质。
[30]根据[29]所述的制备方法，其中，上述Wnt信号转导途径作用物质作用于上述第一Wnt信号转导途径抑制物质的作用点的下游的信号转导因子。
[31]根据[29]或[30]所述的制备方法，其中，上述Wnt信号转导途径作用物质包含使Wm经典途径活化的物质。
[32]根据[31]所述的制备方法，其中，上述使Wnt经典途径活化的物质抑制β连环蛋白的分解或促进β连环蛋白的稳定。
[33]根据[29]～[32]中任一项所述的制备方法，其中，上述Wnt信号转导途径作用物质包含GSK3抑制剂。
[34]根据[29]～[33]中任一项所述的制备方法，其中，上述第一Wnt信号转导途径抑制物质包含PORCN抑制剂，上述Wnt信号转导途径作用物质包含GSK3抑制剂。
[35]根据[33]或[34]所述的制备方法，其中，上述GSK3抑制剂包含选自由CHIR99021，CHIR98014，TWS119，SB216763，SB415286，BIO，AZD2858，AZD1080，AR-A014418，TDZD-8，LY2090314，IM-12，靛玉红(Indirubin)，Bikinin，A 1070722，3F8，Kenpaullone，10Z-Hymenialdisine，靛玉红-3’-肟，NSC 693868，TC-G 24，TCS 2002，TCS 21311，CP21R7及这些化合物的衍生物组成的组中的至少一种。
[36]根据[33]～[35]中任一项所述的制备方法，其中，上述GSK3抑制剂包含CHIR99021，培养基中上述CHIR99021的浓度为10nM～50μM。
[37]根据[29]～[36]中任一项所述的制备方法，其中，上述Wnt信号转导途径作用物质包含选自由BML-284、SKL2001组成的组中的至少一种。
[38]根据[1]～[37]中任一项所述的制备方法，其中，在上述步骤(3)中还存在TAK1抑制物质。
[39]根据[38]所述的制备方法，其中，上述TAK1抑制物质包含选自由(5Z)-7-Oxozeaenol，N-Des(氨基羰基)AZ-TAK1抑制剂，Takinib，NG25及这些化合物的衍生物组成的组中的至少一种。
[40]根据[38]或[39]所述的制备方法，其中，上述TAK1抑制物质包含(5Z)-7-Oxozeaenol，培养基中上述(5Z)-7-Oxozeaenol的浓度为10nM～50μM。
[41]根据[1]～[40]中任一项所述的制备方法，其中，上述步骤(3)在上述步骤(3a)，上述步骤(3b)或上述步骤(3c)后，进一步包含进行培养的步骤(3e)。
[42]根据[41]所述的制备方法，其中，在上述步骤(3e)中，存在选自由BMP信号转导途径抑制物质，TGFβ信号转导途径抑制物质，Wnt信号转导途径作用物质，FGF信号转导途径作用物质及EGF信号转导途径作用物质组成的组中的至少1个。
[43]根据[41]或[42]所述的制备方法，其中，在上述步骤(3e)中还存在视黄酸转导途径作用物质。
[44]根据[43]所述的制备方法，其中，上述视黄酸转导途径作用物质包含选自由全反式视黄酸，异维甲酸(isotretinoin)，9-顺式视黄酸，TTNPB，Ch55，EC19，EC23，芬维A胺(Fenretinide)，阿维A(Acitretin)，曲法罗汀(Trifarotene)，阿达帕林(Adapalene)组成的组中的至少一种。
[45]根据[43]或[44]所述的制备方法，其中，上述视黄酸转导途径作用物质包含EC23，培养基中上述EC23的浓度为10pM～10μM，。
[46]根据[41]～[45]中任一项所述的制备方法，其中，在上述步骤(3e)中还存在血清。
[47]根据[46]所述的制备方法，其中，培养基中上述血清的浓度为1％～20％。
[48]根据[41]～[47]中任一项所述的制备方法，其中，在上述步骤(3e)中，还存在胰岛素样生长因子受体作用物质。
[49]根据[41]～[48]中任一项所述的制备方法，在上述步骤(3e)中还存在神经营养因子受体作用物质。
[50]根据[41]～[49]中任一项所述的制备方法，其中，上述步骤(3e)在含有增稠剂的培养基中进行。
[51]根据[50]所述的制备方法，其中，上述含有增稠剂的培养基具有100mPa·s以上的粘度。
[52]根据[50]或[51]所述的制备方法，其中，上述增稠剂包含选自由甲基纤维素，果胶，瓜尔胶，黄原胶，罗望子胶，卡拉胶，刺槐豆胶，结冷胶，糊精，定优胶(diutan gum)，淀粉，塔拉胶，藻酸，可德兰多糖(curdlan)，酪蛋白钠，角豆胶，几丁质，壳聚糖，葡糖胺，支链淀粉(pullulan)，琼脂糖，膳食纤维及它们的化学修饰的物质或衍生物组成的组中的至少一种。
[53]根据[50]～[52]中任一项所述的制备方法，其中，上述增稠剂包含甲基纤维素，培养基中上述甲基纤维素的浓度为1％以上。
[54]根据[41]～[53]中任一项所述的制备方法，其中，在上述步骤(3e)中进行贴壁培养。
[55]根据[54]所述的制备方法，其中，在涂布有选自由细胞外基质，基底膜制品及合成细胞粘附分子组成的组中的至少1个的培养器材上进行上述贴壁培养。
[56]根据[41]～[55]中任一项所述的制备方法，其中，在上述步骤(3e)中，在细胞培养插件(cell culture inserts)或多孔膜上进行培养。
[57]根据权利要求[41]～[56]中任一项所述的制备方法，其中，在上述步骤(3e)中，通过气相液相界面培养法进行培养。
[58]根据[1]～[57]中任一项所述的制备方法，其中，在上述步骤(3)中，包含将细胞聚集体包埋在凝胶中进行培养的步骤。
[59]根据[58]所述的制备方法，其中，上述凝胶为基质胶。
[60]根据[1]～[59]中任一项所述的制备方法，其中，在上述步骤(3)中包含在含有基底膜制品的培养基中进行悬浮培养的步骤。
[61]根据[60]所述的制备方法，其中，上述基底膜制品为基质胶，培养基中的上述基质胶的浓度为0.5％～4％。
[62]根据[1]～[61]中任一项所述的制备方法，其中，在上述步骤(3)中，还存在与上述第一Wnt信号转导途径抑制物质不同的第二Wnt信号转导途径抑制物质。
[63]根据[62]所述的制备方法，其中，上述第二Wnt信号转导途径抑制物质包含具有对于经典Wnt途径的抑制活性的物质。
[64]根据[62]或[63]所述的制备方法，其中，上述第二Wnt信号转导途径抑制物质包含端锚聚合酶(Tankyrase)抑制剂。
[65]根据[64]所述的制备方法，其中，上述端锚聚合酶抑制剂包含选自由XAV939，IWR1-endo，MN-64，WIKI4，TC-E 5001，JW 55及AZ6102组成的组中的至少一种。
[66]根据[64]或[65]所述的制备方法，其中，上述端锚聚合酶抑制剂包含XAV939，培养基中上述XAV939的浓度为10nM～50μM。
[67]根据[62]～[66]中任一项所述的制备方法，其中，上述第二Wnt信号转导途径抑制物质在从上述步骤(1)中悬浮培养开始28天以内添加到培养基中。
[68]根据[1]～[58]中任一项所述的制备方法，其中，选自由上述步骤(1)，上述步骤(2)及上述步骤(3)组成的组中的至少1个步骤，在不存在基质胶的条件下进行。
[69]细胞团块，其包含根据[1]～[68]中任一项所述的制备方法得到的嗅神经细胞或其前体细胞。
[70]细胞团块，其包含1)包含嗅神经细胞或其前体细胞的非神经上皮组织部，及，2)包含神经系统细胞或其前体细胞的神经组织部，
其中，上述神经系统细胞或其前体细胞包含构成中枢神经系统的神经系统细胞或其前体细胞，上述神经组织部的表面的至少一部分包覆有上述非神经上皮组织部。
[71]根据[70]所述的细胞团块，其中上述嗅神经细胞或其前体细胞表达Tuj1，EpCAM及Lhx2。
[72]根据[70]或[71]所述的细胞团块，其中，非神经上皮组织部还包含基底膜样结构，上述基底膜样结构形成于上述非神经上皮组织部与上述神经组织部之间。
[73]根据[70]所述的细胞团块，其中，上述非神经上皮组织部形成假复层上皮或复层上皮。
[74]根据[70]～[73]中任一项所述的细胞团块，其中，上述非神经上皮组织部包含嗅上皮样组织，上述嗅上皮样组织中包含上述嗅神经细胞或其前体细胞。
[75]根据[74]所述的细胞团块，其中，上述嗅上皮样组织还包含选自由支持细胞，基底细胞及鲍曼氏腺细胞，以及它们的前体细胞组成的组中的至少两种细胞。
[76]根据[74]或[75]所述的细胞团块，其中，上述嗅上皮样组织包含基底细胞或其前体细胞。
[77]根据[74]～[76]中任一项所述的细胞团块，其中，上述嗅上皮样组织具有与上述神经组织部对向的基底面，及位于与上述基底面相反侧的顶端面，
上述基底面面向基底膜，
上述顶端面为PKCζ阳性。
[78]根据[74]～[77]中任一项所述的细胞团块，其中，上述嗅上皮样组织包含嗅上皮内侧部，及设在上述嗅上皮内侧部的周围的嗅上皮周缘部，
上述嗅上皮内侧部包含Sox2，Tuj1及Ascl1阳性细胞，
上述嗅上皮周缘部包含Pax6及Pbx阳性细胞。
[79]根据[74]～[79]中任一项所述的细胞团块，其中，上述嗅上皮样组织还包含嗅神经鞘细胞或其前体细胞。
[80]根据[74]～[79]中任一项所述的细胞团块，其中，上述非神经上皮组织部还包含除了上述嗅上皮样组织以外的非神经上皮组织。
[81]根据[80]所述的细胞团块，其中，上述非神经上皮组织包含呼吸器官上皮细胞。
[82]根据[70]～[81]中任一项所述的细胞团块，其中，上述神经组织部形成上皮结构。
[83]根据[70]～[82]中任一项所述的细胞团块，其中，上述神经系统细胞或其前体细胞还包含构成视网膜的细胞或其前体细胞。
[84]根据[70]～[83]中任一项所述的细胞团块，其中，上述神经系统细胞或其前体细胞包含大脑。
[85]根据[84]所述的细胞团块，其中，上述大脑包含嗅球。
[86]根据[70]～[85]中任一项所述的细胞团块，其不包含骨组织。
[87]由于嗅觉系统的障碍导致的疾病的治疗药物，其包含[69]～[86]中任一项所述的细胞团块中包含的细胞或组织。
[88]由于神经组织的障碍引起的疾病的治疗药物，其包含[69]～[86]中任一项所述的细胞团块中包含的细胞或组织。
[89]神经毒性或药效评价用试剂盒，其包含[69]～[86]中任一项所述的细胞团块中包含的神经细胞或神经组织。
[90]嗅觉受体的筛选试剂盒，其包含[69]～[86]中任一项所述的细胞团块中包含的嗅神经细胞或嗅上皮样组织。
发明效果
根据本发明，能够由多潜能干细胞有效地制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块。
附图简述
[图1]A为示意地示出包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的结构的图。B为将A中用虚线圈住的部分放大得到的示意图。C～E为示意地示出本发明的细胞团块的另外的样式的图。
[图2]上部分显示在预备实验1中，培养第28天的细胞团块的冷冻切片的基于抗Lhx2抗体的荧光免疫染色结果。下部分为将上部分的线段A-A’所示的感兴趣区域的线形的荧光强度曲线输出的图。
[图3]上部分为示意地示出在比较实验1中，从人ES细胞制备包含神经细胞的细胞聚集体时的顺序的图。下部分A为示出在比较实验1中，悬浮培养开始28天后的细胞聚集体的倒置显微镜的明场观察图像的图。下部分B～G为示出将悬浮培养开始28天后的聚集体中各细胞标记的表达情况通过荧光免疫染色进行检查的结果的图。B～E分别示出Dlx5，Sox1，PanCK的染色图像和其核染色图像。F及G分别示出Tuj1的染色图像和其核染色图像。A中的比例尺表示500μm，B中的比例尺表示200μm，F中的比例尺表示100μm。H为示意地示出培养第28天的细胞聚集体的结构的图。
[图4]上部分为示意地示出在比较实验2中，从人ES细胞制备包含神经组织及非神经上皮组织的细胞聚集体时的顺序的图。下部分A为示出在比较实验2中，悬浮培养开始28天后的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图。下部B～M为示出将在悬浮培养开始28天后的细胞团块中的各细胞标记的表达情况通过荧光免疫染色进行检查的结果的图。B～E分别示出Tuj1，Sox2，PanCK的染色图像和其核染色图像。F～I分别示出Six1，Sp8，N-钙黏着蛋白的染色图像和其核染色图像。J～M分别示出EpCAM，Pax6，Chx10的染色图像和其核染色图像。在A，B，F，J中的比例尺表示200μm。
[图5]O～U为示出将在比较实验2中，悬浮培养开始28天后的细胞聚集体中各细胞标记的表达情况通过荧光免疫染色进行检查的结果的图。O及P分别示出晶状体蛋白αA的染色图像和其核染色图像。Q及R分别示出Prox1的染色图像和其核染色图像。S～U分别示出C-Maf，Sox1的染色图像和其核染色图像。在O，S中的比例尺表示100μm。下部分V为示意地示出培养第28天的细胞聚集体的结构的图。
[图6]上部分为示意地示出在实验1中，从人ES细胞制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块时的顺序的图。下部分A为示出实验1中悬浮培养开始13天后的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图。B～L为示出将实验1中悬浮培养开始13天后的细胞团块中各细胞标记的表达情况通过荧光免疫染色进行检查的结果的图。B～E分别示出Dlx5，Sox1，PanCK的染色图像和其核染色图像。F～I分别示出Pax6，AP2α，E-钙黏着蛋白的染色图像和其核染色图像。J～L分别示出Otx2，Sox2的染色图像和其核染色图像。在A中的比例尺表示500μm。在B中的比例尺表示100μm，F，J中的比例尺表示200μm。
[图7]M～R为示出实验1中悬浮培养开始13天后的细胞聚集体中各细胞标记的表达情况通过荧光免疫染色进行检查的结果的图。M～O分别示出Six1，Sp8的染色图像和其核染色图像。P～R分别示出Sox3，N-钙黏着蛋白的染色图像和其核染色图像。在M，P中的比例尺表示200μm。下部分S为示意地示出培养第13天的包含源自基板(placode)的组织的细胞聚集体的结构的图。
[图8]上部分为示意地示出在实验2中，从人ES细胞制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块时的顺序的图。下部分A为示出的实验2中悬浮培养开始28天后的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像图。B～M为示出将实验2中悬浮培养开始28天后的细胞团块中各细胞标记的表达情况通过荧光免疫染色进行检查的结果的图。B～E分别示出Bf1，Sp8，Sox2的染色图像和其核染色图像。F～1分别示出Six1，Ebf2，NCAM的染色图像和其核染色图像。J～M分别示出Otx2，NeuroD，Tuj1的染色图像和其核染色图像。在A中的比例尺表示500μm，B，F，J中的比例尺表示100μm。
[图9]N～AI为示出将实验2中悬浮培养开始28天后的细胞团块中各细胞标记的表达情况通过荧光免疫染色进行检查的结果的图。N～Q分别示出Pax6，Pbx1/2/3/4，E-钙黏着蛋白的染色图像和其核染色图像。R～U分别示出Dlx5，Emx2，PanCK的染色图像和其核染色图像。V～X分别示出Chx10，N-钙黏着蛋白的染色图像和其核染色图像。Y～AA分别示出Lhx2，钙网膜蛋白(Calretinin)的染色图像和其核染色图像。AB～AE分别示出将图8的F～I的一部分放大得到的图。AF～AL分别示出将图8的J～M的一部分放大得到的图。在N，R，V，Y中的比例尺表示100μm，AB，AF中的比例尺表示50μm。
[图10]A为示意地示出培养第28天的包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的结构的图。B为将A中用虚线圈住的部分放大得到的示意图。
[图11]上部分为示意地示出在实验3中，从人iPS细胞制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块时的顺序的图。下部分A及B为示出实验3中悬浮培养开始21天后的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图。C～N为示出将实验3中悬浮培养开始28天后的细胞团块中各细胞标记的表达情况通过荧光免疫染色进行检查的结果的图。C～F分别示出Tuj1，Sox2，PanCK的染色图像和其核染色图像。G～J分别示出Six1，Sp8，N-钙黏着蛋白的染色图像和其核染色图像。K～N分别示出Pax6，Chx10，EpCAM的染色图像和其核染色图像。在A，B中的比例尺表示500μm，C，G，K中的比例尺表示100μm。
[图12]O～Z为示出将实验3中悬浮培养开始21天后的细胞团块中各细胞标记的表达情况通过荧光免疫染色进行检查的结果的图。O～R分别示出Otx2，NCAM，E-钙黏着蛋白的染色图像和其核染色图像。S～V分别示出Tuj1，Ebf1，PanCK的染色图像和其核染色图像。W～Z分别示出Six1，Ebf2，NCAM的染色图像和其核染色图像。在O中的比例尺表示100μm，S，W中的比例尺表示50μm。下部分AA为示意地示出培养第21天的包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的结构的图。
[图13]上部分为示意地示出在实验4中，从人iPS细胞制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块时的顺序的图。下部分A为示出实验3中悬浮培养开始28天后的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图。B～M示出将实验3中悬浮培养开始28天后的细胞团块中各细胞标记的表达情况通过荧光免疫染色进行检查的结果的图。B～E分别示出Dlx5，NeuroD1，NCAM的染色图像和其核染色图像。F～I分别示出p63，Sox2，E-钙黏着蛋白的染色图像和其核染色图像。J～M分别示出Pax6，Chx10，N-钙黏着蛋白的染色图像和其核染色图像。在A中的比例尺表示500μm，B，F中的比例尺表示100μm，J中的比例尺表示50μm。
[图14]N～U为示出将实验4中悬浮培养开始28天后的细胞团块中各细胞标记的表达情况通过荧光免疫染色进行检查的结果的图。N～Q分别示出Six1，Sp8，EpCAM的染色图像和其核染色图像。R～U分别示出Tuj1，Ebf2，PanCK的染色图像和其核染色图像。在N，R中的比例尺表示100μm。V为示意地示出根据实验4中记载的方法制备的，培养第28天的包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的结构的图。
[图15]上部分为示意地示出在实验5中，从人iPS细胞制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块时的顺序的图。下部分A为示出实验5中悬浮培养开始28天后的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图。B～M为示出将实验5中悬浮培养开始28天后的细胞团块中各细胞标记的表达情况通过荧光免疫染色进行检查的结果的图。B～E分别示出Dlx5，NeuroD1，NCAM的染色图像和其核染色图像。F～I分别示出p63，Sox2，E-钙黏着蛋白的染色图像和其核染色图像。J～M分别示出Pax6，Chx10，N-钙黏着蛋白的染色图像和其核染色图像。在A中的比例尺表示500μm，B，F，J中的比例尺表示100μm。
[图16]N～U为示出将实验5中悬浮培养开始28天后的细胞团块中各细胞标记的表达情况通过荧光免疫染色进行检查的结果的图。N～Q分别示出Six1，Sp8，EpCAM的染色图像和其核染色图像。R～U分别示出Tuj1，Ebf2，PanCK的染色图像和其核染色图像。在N，R中的比例尺表示100μm。
[图17]上部分为示意地示出在实验6中，从人iPS细胞制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块时的顺序的图。下部分A为示出实验6中悬浮培养开始28天后的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图。B～M为示出将实验6中悬浮培养开始28天后的细胞团块中各细胞标记的表达情况通过荧光免疫染色进行检查的结果的图。B～E分别示出Dlx5，NeuroD1，NCAM的染色图像和其核染色图像。F～I分别示出p63，Sox2，E-钙黏着蛋白的染色图像和其核染色图像。J～M分别示出Pax6，Chx10，N-钙黏着蛋白的染色图像和其核染色图像。在A中的比例尺表示500μm，B中的比例尺表示100μm。
[图18]N～AE为示出实验6中悬浮培养开始28天后的细胞团块中各细胞标记的表达情况通过荧光免疫染色进行检查的结果的图。N～Q分别示出Six1，Sp8，EpCAM的染色图像和其核染色图像。R～U分别示出Tuj1，Ebf2，PanCK的染色图像和其核染色图像。V～Y分别示出巢蛋白，Islet，β-连环蛋白(Catenin)的染色图像和其核染色图像。Z～AB分别示出PKCζ，层粘连蛋白的染色图像和其核染色图像。AC～AE分别示出Lhx2，钙网膜蛋白的染色图像和其核染色图像。N，R，V，Z，AC中的比例尺表示100μm。
[图19]AF～AJ为示出将实验6中悬浮培养开始28天后的细胞团块中各细胞标记的表达情况通过荧光免疫染色进行检查的结果的图。AF～AH分别示出Otx2，CK8的染色图像和其核染色图像。AI，AJ分别示出Eya2的染色图像和其核染色图像。AK示意地示出根据实验6中记载的方法制备的，培养第28天的包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的结构的图。AF，AI中的比例尺表示100μm。
[图20]上部分的A～D为示出实验7中从人ES细胞制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块时，使BMP4的添加浓度变化时的悬浮培养开始28天后的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图。A为第1级的细胞团块，B为第2级的细胞团块，C为第3级的细胞团块，第4级的细胞团块的例子。E为将在各BMP4浓度下形成的细胞团块的品质评价结果进行图表化后。
[图21]上部分示意地示出在实验8中，检查在从人iPS细胞制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块时，对进行诱导分化的人iPS细胞的化合物前处理的效果的顺序的图。下部分A～G为示出实验8中悬浮培养开始13天后的聚集体的倒置显微镜的明场观察图像的图。其为从人iPS细胞形成的悬浮培养开始后第13天的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图，A至D示出作为前处理仅添加了作为溶剂的DMSO的对照的，E～G为以分别不同的条件进行了前处理的。A及E中的比例尺表示500μm。H为将在各前处理条件下形成的细胞团块的品质评价结果进行图表化后。
[图22]上部分为示意地示出在实验9中，检查从人iPS细胞制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块时，各第一Wnt信号转导途径抑制物质的效果的顺序的图。下部分A～F为示出实验9中悬浮培养开始28天后的聚集体的倒置显微镜的明场观察图像的图。A示出没有添加第一Wnt信号转导途径抑制物质的对照，B～F示出在悬浮培养开始时改变第一Wnt信号转导途径抑制物质其种类进行添加时，悬浮培养开始后第28天的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图。A中的比例尺表示500μm。
[图23]G为示出实验9中，将悬浮培养开始后28天的细胞团块中各细胞标记的表达情况通过荧光免疫染色进行检查的结果的图。图样的行分别示出第一Wnt信号转导途径抑制物质的条件，图样的列从左起按顺序分别示出Six1，Sox2，泛细胞角蛋白(PanCK)和其核染色图像。左上的图样中的比例尺表示100μm。
[图24]上部分为在实验10中，三维培养器使用从人iPS细胞制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块顺序示意地示出的图。下部分A及B为示出实验10中悬浮培养开始21天后的聚集体的倒置显微镜的明场观察图像的图。A中的比例尺表示500μm，B中的比例尺表示200μm。
[图25]上部分为示意地示出在实验11中，检查从人iPS细胞制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块时，由BMP信号转导途径作用物质的添加时期的差异导致的效果的顺序的图。下部分A～E为示出实验11中悬浮培养开始13天后的细胞聚集体的倒置显微镜的明场观察图像的图。A及D中的比例尺表示500μm。
[图26]上部分为示意地示出在实验12中，检查从人iPS细胞制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块时，BMP信号转导途径作用物质的最适添加时期的顺序的图。下部分A～D为示出实验12中从悬浮培养开始2天起到6天后的聚集体的倒置显微镜的明场观察图像的图。E～H示出从悬浮培养开始2天起到6天后的细胞聚集体的ZO-1染色图像，I～L示出各自的核的对比染色图像的图。A中的比例尺表示500μm，E及I中的比例尺表示100μm。
[图27]A～P为在实验13中，制备大鼠胎生14，5日龄胚的冠状切片，通过免疫染色对各标记的表达进行分析的结果。A为低倍率的核染色的染色图。B～S为相当于A的虚线部的区域的区域的连续切片在高倍率的染色图。B～E为示出Tuj1，Ebf2，PanCK的染色图像和其核染色图像，F～I为示出Otx2，Ebf1，β-连环蛋白的染色图像和其核染色图像，J～L为示出E-钙黏着蛋白，Sox2的染色图像和其核染色图像，M和N为示出Dlx5的染色图像和其核染色图像，O和P为示出PKCζ的染色图像和其核染色图像，Q～S为示出层粘连蛋白，EpCAM的染色图像和其核染色图像的图。A中的比例尺表示500μm，B，F，J，M，Q中的比例尺表示100μm。
[图28]上部分为示意地示出在实验14中，从人iPS细胞制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块时，Wnt信号转导途径抑制物质与Wnt信号转导途径作用物质的组合使用条件的图。下部分A，B为示出实验14中悬浮培养开始第21天的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图。A中的比例尺表示500μm，B中的比例尺表示200μm。
[图29]上部分为示意地示出在实验15中，从人iPS细胞制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块时，TAK1抑制物质的使用条件的图。下部分A，B为示出实验15中悬浮培养开始第21天的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图。A中的比例尺表示500μm，B中的比例尺表示200μm。
[图30]上部分为表示在实验16中，将从人iPS细胞制备的包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块在具有粘性的培养基中培养的顺序图。下部分A为示出实验16中悬浮培养开始第45天的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图。A中的比例尺表示200μm。
[图31]上部分为示意地示出在实验17中，从人iPS细胞制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块时，基底膜制品的添加条件的图。下部分A～D为示出实验17中悬浮培养开始第21天的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图。A中的比例尺表示500μm。
[图32]上部分为示意地示出在实验18中，将来自人iPS细胞的包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块包埋在基底膜制品中，进行培养的顺序的图。下部分A为示出实验18中悬浮培养开始第21天的细胞团块的倒置显微镜的明场观察图像的图。A中的比例尺表示500μm。
具体实施方式
[1.定义]
“干细胞”意指具有分化潜能和增殖能力(特别是自我更新的能力)的未分化的细胞。在干细胞中，根据分化潜能而包括多潜能干细胞(pluripotent stem cell)，多能干细胞(multipotent stem cell)，单能干细胞(unipotent stem cell)等亚群。多潜能干细胞意指能够在体外培养，并且具有可能分化为构成生物体的全部的细胞(源自三胚层(外胚层，中胚层，内胚层)的组织的潜能(分化多潜能性(pluripotency))的干细胞。多能干细胞意指具有分化成多种类型的组织或细胞、但不是所有种类的组织或细胞的潜能的干细胞。单能性干细胞意指具有分化成特定的组织、细胞的潜能的干细胞。
多潜能干细胞可以由受精卵、克隆胚胎、生殖干细胞、组织中的干细胞、体细胞等诱导。作为多潜能干细胞，可列举：胚胎干细胞(ES细胞：Embryonic stem cell)，EG细胞(Embryonic germ cell)，人工多潜能干细胞(iPS细胞：induced pluripotent stem cell)等。由间充质干细胞(mesenchymal stem cell：MSC)得到的Muse细胞(Multi-lineagedifferentiating Stress Enduring cell)、由生殖细胞(例如睾丸)制备的GS细胞也包括在多潜能干细胞中。
胚胎干细胞最先在1981年建立，并且自1989年起还已经用于产生敲除小鼠。在1998年，建立了人胚胎干细胞，其也用于再生医学中。可通过在饲养细胞上或在含有白血病抑制因子(LIF)的培养基中培养内细胞团而产生ES细胞。ES细胞的制备方法记载于例如国际公开第96/22362号，国际公开第02/101057号，美国专利第5,843,780号说明书，美国专利第6,200,806号说明书，美国专利第6,280,718号说明书等中。胚胎干细胞可从给定的机构得到，或也可以购买市售品。例如，作为人胚胎干细胞的KhES-1，KhES-2和KhES-3可从京都大学再生医科学研究所得到。均作为小鼠胚胎干细胞的EB5可从国立研究开发法人理化学研究所得到，D3细胞株可从ATCC得到。不破坏人胚地提供人胚胎干细胞培养(细胞株)的方法，记载于例如Cell Stem Cell，2008：2(2)：113-117，国际公开第03/046141号中。作为一种ES细胞的核移植ES细胞(ntES细胞)可从将体细胞的细胞核移植到去除了细胞株的卵细胞制备的克隆胚胎建立。
EG细胞可通过在含有mSCF、LIF和bFGF的培养基中培养原始生殖细胞而产生(Cell，70：841-847，1992)。
“人工多潜能干细胞”意指通过公知的方法等将体细胞重编程(reprogramming)而被诱导具有多潜能性的细胞。具体而言，可列举将成纤维细胞、外周血单核细胞等分化成的体细胞通过表达选自由Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc(c-Myc、N-Myc、L-Myc)、Glis1、Nanog、Sall4、lin28、Esrrb等组成的组中的重编程基因组中的多个基因的组合中的任一种而进行重编程，从而被诱导具有多潜能性的细胞。2006年，由山中等以小鼠细胞建立了人工多潜能干细胞(Cell，2006，126(4)663-676)。在2007年还从人成纤维细胞中建立了人工多潜能干细胞，与胚胎干细胞同样具有多潜能性和自我更新能力(Cell，2007，131(5)pp.861-872；Science 2007，318(5858)pp.1917-1920；Nat.Biotechnol.2008，26(1)pp.101-106)。作为人工多潜能干细胞，除了利用基因表达的直接重编程而制备的方法以外，也可以通过化合物的添加等由体细胞诱导人工多潜能干细胞(Science，2013，341pp.651-654)。
用于获得人工多潜能干细胞的体细胞没有特别限制，可列举组织来源的成纤维细胞、血液谱系细胞(例如，外周血单核细胞、T细胞)、肝细胞、胰腺细胞、肠上皮细胞、平滑肌细胞等。
当通过表达一些种类的基因(例如，Oct3/4，Sox2，Klf4，及Myc这4种因子)进行重编程而产生人工多潜能干细胞时，对用于基因表达的方式没有特别限制。作为前述方式，可列举使用病毒载体(例如，逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒(Sendai virus)载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体)的感染法，使用质粒载体(例如，质粒载体、附加体载体)的基因导入法(例如，磷酸钙法、脂质转染法、RetroNectin法、电穿孔法)，使用RNA载体的基因导入法(例如，磷酸钙法、脂质转染法、电穿孔法)，直接注射蛋白的方式，等等。
人工多潜能干细胞可从给定的机构得到，或也可以购买市售品。例如人类人工多潜能干细胞株201B7株可从京都大学，HC-6#10株可从国立研发法人理化学研究所获取。
用于本发明的多潜能干细胞优选为胚胎干细胞或人工多潜能干细胞。
作为多能干细胞，可列举组织干细胞(也称为组织中的干细胞、组织特异性干细胞或体干细胞)，诸如造血干细胞、神经干细胞、视网膜干细胞、间充质干细胞等。
可以例如，通过使用同源重组技术产生遗传上改变的多潜能干细胞。作为被改变的染色体上的基因，可列举例如：细胞标记基因、组织相容性抗原的基因、与由神经系统细胞的障碍导致的疾病相关的基因等。染色体上的靶基因可以使用以下各项中记载的方法进行改变：Manipulating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual(操作小鼠胚胎，实验室手册)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994)，Gene Targeting，APracticalApproach(基因靶向，实践方法)，IRL Press at Oxford University Press(1993)，Biomanual Series 8，Gene Targeting，Making of Mutant Mouse using ES cell(基因靶向，使用ES细胞产生突变体小鼠)，YODOSHA CO.，LTD.(1995)；等等。
具体而言，例如，分离要改变的靶基因(例如，细胞标记基因、组织相容性抗原基因、疾病相关的基因等)的基因组遗传子，并使用该分离的基因组遗传子制备用于将该靶基因进行同源重组的靶向载体。将所产生的靶向载体引入到干细胞中，并选择在所述靶基因与所述靶向载体之间发生了同源重组的细胞，由此，能够制备染色体上的基因得到了所述改变的干细胞。
作为用于分离靶基因的基因组基因的方法，可列举以下各项中记载的已知的方法：Molecular Cloning，A Laboratory Manual(分子克隆，实验室手册)，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学流程)，John Wiley Sons(1987-1997)等。对靶基因的基因组基因而言，也可以使用基因组DNA文库筛选系统(由Genome Systems制造)、通用基因组步量试剂盒(Universal Genome Walker试剂盒(由CLONTECH制造))等分离。
用于靶基因同源重组的靶向载体的产生和同源重组子的有效选择可以按照以下各项中记载的方法进行：Gene Targeting，A Practical Approach(基因靶向，实践方法)，IRL Press at Oxford University Press(1993)，Biomanual Series 8，Gene Targeting，Making of Mutant Mouse using ES cell(基因靶向，使用ES细胞产生突变体小鼠)，YODOSHA CO.，LTD.(1995)等等。作为所述靶向载体，可以使用替换型或插入型中的任一种。作为所述筛选方法，可以使用诸如正向选择、启动子选择、负向选择、聚腺苷酸(polyA)选择等方法。
作为用于从所选的细胞株中选择需要的同源重组子的方法，可列举用于基因组DNA的DNA杂交法(Southern hybridization method)、PCR法等。
“哺乳动物”包括啮齿类、有蹄类、食肉目、灵长类动物等。啮齿类包括小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等。有蹄类包括猪、牛、山羊、马、绵羊等。在食肉目中，包括犬、猫等。“灵长类”是指属于灵长目的哺乳动物，并且灵长类包括诸如狐猴，懒猴，树鼩等的原猴亚目(Strepsirrhini)，和诸如猴，猿，人等的类人猿亚目(Anthropoidea)。
本发明使用的多潜能干细胞为哺乳动物的多潜能干细胞，优选为啮齿类(例如，小鼠，大鼠)或灵长类(例如，人，猴)的多潜能干细胞，最优选为人的多潜能干细胞。
“细胞黏着(Cell adhesion)”是指细胞和细胞之间的黏着，及细胞与细胞外基质的黏着。在体外的人工培养环境中产生的细胞与培养器材等的黏着也包含在细胞黏着中。作为细胞黏着的种类，可列举锚定连接(anchoring junction)，通讯连接(communicatingjunction)，封闭连接(occluding junction)。
“紧密连接(Tight junction)”是指在细胞间的黏着中，在脊椎动物及脊索动物中可见的封闭连接。紧密连接在上皮细胞之间形成。在源自生物体的组织中以及用本发明的制备方法等制备的细胞团块中是否存在紧密连接，可以通过利用使用例如针对紧密连接的构成成分的抗体(抗紧密连接蛋白抗体，抗ZO-1抗体等)的免疫组织化学等手段来检测。
本发明中的“悬浮培养”是指将细胞，细胞聚集体或细胞团块维持在培养液中悬浮存在的状态下培养。即，悬浮培养为细胞、细胞聚集体或细胞团块在与培养器材等不黏着的条件下进行的培养，而在与培养器材等黏着的条件下进行的培养(贴壁培养)不包括在悬浮培养的范畴中。在该情况下，细胞发生黏着是指细胞，细胞聚集体或细胞团块与培养器材之间，形成了作为细胞黏着的一种的牢固的细胞-基质间连接(cell-substratum junction)。更具体而言，悬浮培养意指在细胞，细胞聚集体或细胞团块与培养器材等之间未形成强的细胞-基质间连接的条件下的培养，贴壁培养意指在细胞，细胞聚集体或细胞团块与培养器材等之间形成强的细胞-基质间连接的条件下的培养。
在悬浮培养中的细胞聚集体或细胞团块中，细胞和细胞为面黏着。在悬浮培养中的细胞聚集体或细胞团块中，细胞与培养器材等之间几乎不形成细胞-基质间连接、或即使形成，其贡献也是小的。在一些实施方式中，在悬浮培养中的细胞聚集体或细胞团块中，在聚集体或细胞团块的内部存在内源的细胞-基质间连接，但是细胞与培养器材等之间几乎不形成细胞-基质间连接、或即使形成，其贡献也是小的。
细胞和细胞发生面黏着(面连接)，意指一个细胞以面与另一个细胞连接。更具体地，细胞和细胞发生面黏着意指例如，在一个细胞的表面积中，与另一个细胞的表面发生黏着的比例为例如1％以上，优选3％以上，更优选5％以上。细胞的表面可通过利用将膜染色的试剂(例如DiI)的染色、细胞粘附分子(例如，E-钙黏着蛋白，N-钙黏着蛋白)的免疫染色等进行观察。
进行悬浮培养时使用的培养容器没有特别限制，只要其能够实现“悬浮培养”即可，并且本领域普通技术人员能够适当确定此类培养容器。作为这样的培养容器，可列举例如烧瓶、组织培养瓶、平皿、皮氏培养皿、组织培养皿、多联培养皿、微量平板、微孔平板、微孔、多联平板、多孔平板、室载玻片、碗、管、托盘、培养袋、旋转烧瓶或转瓶。为了能够实现悬浮培养，这些培养容器优选为非细胞黏着性的。作为非细胞黏着性的培养容器，可以使用培养容器的表面没有出于提高与细胞的黏着性的目的而进行了人工处理(例如：用基底膜制品，层粘连蛋白，entactin，胶原蛋白，明胶等细胞外基质，或聚赖氨酸，多聚鸟氨酸等高分子进行的包被处理，或正电荷处理等的表面加工)的那些等。作为非细胞黏着性的培养容器，可以使用培养容器的表面出于降低与细胞的黏着性的目的而进行了人工处理(例如：2-甲丙烯酰基羟乙基磷酸胆碱(2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine，MPC)聚合物等超亲水性处理，蛋白低吸附处理等)的那些等。可以使用旋转烧瓶、摇瓶等进行转管培养。培养容器的培养表面可以是平底的或可以具有凹陷和凸出。
出于保护细胞聚集体免受进行悬浮培养时产生的剪切力等物理应力，另外从提高细胞分泌的生长因子、细胞因子类的局部浓度，促进组织的发展的目的考虑，也可以在将细胞聚集体包埋在凝胶中，或封入具有物质透过性的胶囊实施悬浮培养(Nature，2013，501.7467：373)。包埋中使用的凝胶或胶囊为可以为源自生物体的或合成高分子制的中的任一种。作为用于这样的目的的凝胶或胶囊，可列举例如基质胶(Corning公司制)，PuraMatrix(3D Matrix公司制)，VitroGel 3D(TheWell Bioscience公司制)，胶原蛋白凝胶(新田明胶股份有限公司制)，藻酸凝胶(PG研究股份有限公司制)，Cell-in-a-Box(Austrianova公司制)等。
用于培养细胞的培养基可以由通常用于培养动物细胞的培养基作为基础培养基而制备。作为基础培养基，可列举例如Basal Medium Eagle(BME)，BGJb培养基，CMRL 1066培养基，格拉斯哥最低必须培养基(Glasgow MEM)，改良的MEM Zinc Option，Iscove’sModified Dulbecco’s培养基(IMDM)，Medium 199，Eagle最低必须培养基(Eagle MEM)，Alpha Modified Eagle最低必须培养基(αMEM)，Dulbecco’s Modified Eagle培养基(DMEM)，F-12培养基，DMEM/F12，IMDM/F12，Ham′s培养基，RPMI 1640，Fischer’s培养基或它们的混合培养基等。
多潜能干细胞的培养中，可以使用以上述基础培养基作为基础的多潜能干细胞培养的培养基，优选为为公知的胚胎干细胞或人工多功能性干细胞用的培养基，用于在无饲养细胞下培养多潜能干细胞的培养基(无饲养细胞培养基)等。作为无饲养细胞培养基，可列举例如Essential 8培养基，TeSR培养基，mTeSR培养基，mTeSR-E8培养基，StemFit培养基等。
本发明中的“无血清培养基”意指不包含无调整或未纯化的血清的培养基。在本发明中，将混入经纯化的血液来源的组分和动物组织来源的组分(例如，生长因子)的培养基也包括在无血清培养基中，除非其中含有无调整的或未纯化的血清。
无血清培养基中可以含有血清代替物。作为血清代替物，可列举适当含例如白蛋白、转铁蛋白、脂肪酸、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇，3’硫代甘油或它们的等效物等的那些。此种血清代替物可以通过例如：WO98/30679中记载的方法制备。作为血清代替物，也可以利用市售品。作为市售的血清代替物，可列举例如Knockout血清替代品(ThermoFisher Scientific公司制：下文中有时也被称为KSR)，化学成分确定的脂质浓缩物(Thermo Fisher Scientific公司制)，Glutamax(Thermo Fisher Scientific公司制)，B27补充物(Thermo Fisher Scientific公司制)，N2补充物(Thermo Fisher Scientific公司制)等。
用于悬浮培养的无血清培养基可以适当地含有脂肪酸或脂质，氨基酸(例如，非必需氨基酸)，维生素，生长因子，细胞因子，抗氧化剂，2-巯基乙醇，丙酮酸，缓冲剂，无机盐等。
为避免复杂的制备，作为此种无血清培养基，可以使用添加有适量(例如约0.5％～约30％、优选为约1％～约20％)的市售的KSR(由Thermo Fisher Scientific公司制)的无血清培养基(例如在F-12培养基和IMDM培养基的1∶1混合液中添加了1×化学成分确定的脂质浓缩物、5％KSR及450μM 1-一硫代甘油的培养基)。另外，作为与KSR相当的产品，可列举在日本特表2001-508302中公开的培养基。
本发明中的“血清培养基”是指含有无调整或未纯化的血清的培养基。所述培养基可以含有脂肪酸、脂质、氨基酸(例如、非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂、2-巯基乙醇、1-一硫代甘油、丙酮酸、缓冲剂、无机盐等。例如在使用基质胶等基底膜制品而将多潜能干细胞诱导分化为视网膜组织等的情况下，可使用血清培养基(Cell StemCell 10(6)，771-775(2012))。
在本发明中，培养优选在无外源物质(xeno-free)的条件下进行。“无外源物质”是指已将与培养对象的细胞的生物种类不同的生物种类来源的成分排除的条件。
从避免化学上不确定的成分的混入的观点出发，本发明使用的培养基优选为所含成分经化学上确定的培养基(限定化学成分培养基，Chemically defined medium；CDM)。
“基底膜(Basement membrane)样结构”是指由细胞外基质构成的薄的膜状结构。在生物体中，基底膜在上皮细胞的基底侧(basal)形成。作为基底膜的成分，可列举：IV型胶原蛋白，层粘连蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白多糖(串珠素，perlecan)，entactin/nidogen，细胞因子，生长因子等。在源自生物体的组织中以及用本发明的制备方法等制备的细胞团块中是否存在基底膜，可以通过利用使用例如PAM染色等组织染色，以及针对基底膜的构成成分的抗体(抗层粘连蛋白抗体，抗IV型胶原蛋白抗体等)的免疫组织化学等手段来检测。
“基底膜制品”是指包含具有以下功能的基底膜构成成分的制剂：当在其上接种并培养具有基底膜形成能力的期望的细胞的情况下，控制上皮细胞样的细胞形态，分化，增殖，运动，功能表达等。例如当将通过本发明制备的细胞及和组织分散并贴壁培养时，可以在存在基底膜制品的条件下培养。此处，“基底膜构成成分”是指在动物组织中的上皮细胞层与间质细胞层等之间存在的薄膜形式的细胞外基质分子。基底膜制品可以通过例如以下操作而制备：将经由基底膜而黏着于支撑体上的具有基底膜形成能力的细胞，使用具有该细胞的脂质溶解能力的溶液、碱溶液等从支撑体除去。作为基底膜制品，可列举作为基底膜制备物而市售的商品(例如Matrigel(Corning公司制：以下有时称为基质胶))、Geltrex(Thermo Fisher Scientific公司制)，作为基底膜成分包含公知的细胞外基质分子(例如层粘连蛋白，IV型胶原，硫酸乙酰肝素蛋白多糖，巢蛋白等)的那些。
在本发明中，可以将从Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤等组织或细胞提取、并使其可溶的基质胶(Corning公司制)等基底膜制品用于细胞或组织的培养。同样地，作为细胞培养中使用的基底膜成分，也可使用人可溶化羊膜(生物资源应用研究所制)，在HEK293细胞中产生的人重组层粘连蛋白(BioLamina公司制)，人重组层粘连蛋白片断(Nippi公司制)，人重组玻连蛋白(Thermo Fisher公司制)等，但从避免源自不同的生物种类的成分的混入的观点，及避免传染病的风险的观点出发，优选成分明确的重组蛋白质。
在本发明中，“含有物质X的培养基”和“在存在物质X的条件下”表示补充有外源物质X的培养基或含有外源物质X的培养基，或在存在外源物质X的条件下。即，即使在该培养基中存在的细胞或组织内在地(endogenous)表达、分泌或产生该物质X，也应理解为将内在的物质X与外源性的物质X相区别，不包含外源性的物质X培养基不属于“包含物质X的培养基”的范畴。另外，培养基中的物质X也可以发生由物质X的分解或培养基的蒸发引起的微量的浓度的变化。
例如“包含sonic hedgehog信号转导途径作用物质的培养基”是指添加了外源性的sonic hedgehog信号转导途径作用物质的培养基或包含外源性的sonic hedgehog信号转导途径作用物质的培养基。
对在物质X的浓度为Y的培养基中的培养开始时而言，优选是指培养基中物质X的浓度在Y处变为均匀的时刻，但当培养容器充分小(例如96孔板，培养液为200μL以下时的培养)的情况下，则将以使浓度为Y的方式进行后述的培养基添加操作，半量培养基交换操作或总量培养基交换操作的时刻解释为在浓度Y下的培养开始时。另外，对培养基中物质X的浓度为Y而言，包括经历一定的培养时期的X的平均的浓度为Y的情况，物质X的含量为Y的浓度的时期占培养时期的50％以上的情况，物质X的含量为Y的浓度的时期在各步骤中所假设的培养时期中最短的时期以上的情况等。
在本发明中，“不存在物质X的条件下”是指不添加外源性(exogenous)的物质X的培养基或者不包含外源性的物质X的培养基，或不存在外源性的物质X的状态。
在本发明中，“A小时(A天)以后”是指包含A小时(A天)，且从A小时(A天)起后。“B小时(B天)以内”是指包含B小时(B天)，且从B小时(B天)起前。
在本发明中，饲养细胞是指在培养干细胞时共存的除干细胞之外的细胞。用于培养多能干细胞同时保持未分化状态的饲养细胞的实例包括小鼠成纤维细胞(MEF等)、人成纤维细胞、SNL细胞等。对于饲养细胞，优选经历增殖抑制处理的饲养细胞。作为增殖抑制处理，可列举增殖抑制剂(例如：丝裂霉素C)处理或UV照射等。对用于培养多潜能干细胞同时维持未分化状态的饲养细胞而言，通过分泌体液因子(优选为未分化维持因子)，或产生用于细胞黏着的构架(细胞外基质)而有助于维持多潜能干细胞的未分化。
在本发明中，不存在饲养细胞(无饲养细胞)意指在不存在饲养细胞的条件下培养。不存在饲养细胞意指例如，不添加饲养细胞的条件，或实质上不含饲养细胞的条件(例如，饲养细胞数目相对于细胞总数的比例在3％以下)。
在本发明中，“细胞聚集体”(cell aggregate)是指由分散在培养基中的细胞聚集形成的团块，所述团块中细胞之间彼此粘附。胚状体(Embryoid body)，球体(Sphere)，球状体(Spheroid)，类器官(Organoid)也包括在细胞聚集体中。优选在细胞聚集体中细胞彼此为面黏着。在一些实施方式中，在聚集体的一部分或全部中，有时细胞彼此形成了细胞-细胞间连接(cell-cell junction或细胞黏着(cell adhesion)例如黏着连接(adherencejunction)。作为本发明中的“细胞聚集体”，具体而言可列举在后述的“2.包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备方法”中的步骤(1)中生成的，在悬浮培养开始时处于分散的细胞形成的聚集体。
在本发明中，“均一聚集体”意指在培养多个聚集体时，各聚集体的尺寸一致，并且在通过最大直径的长度评价所述聚集体的尺寸时，作为均一聚集体，最大直径的长度变化小。更具体而言，是指全部聚集体的群体中的75％以上的聚集体在该聚集体的群体中最大直径的平均值±100％、优选为平均值±50％的范围内，更优选为平均值±20％的范围内。
在本发明中，“形成均一细胞聚集体”意指当细胞聚集而形成细胞聚集体进行悬浮培养时，通过使给定数量的分散的细胞迅速聚集由此形成大小均一的细胞聚集体。
分散意指将细胞、组织通过酶处理、物理处理等分散处理而分离成小的细胞块(2个细胞以上且100个细胞以下，优选为50个细胞以下)或单个细胞。给定数量的经分散的细胞是指细胞块或特定数量的单个细胞的聚集。
作为使多潜能干细胞的分散方法，可列举：机械分散处理、细胞分散液处理和添加细胞保护剂的处理。这些处理可以联合进行。优选地进行细胞分散液处理，然后进行机械分散处理。
作为机械分散处理的方法，可列举吹打处理，利用刮刀的刮片操作等。
关于用于细胞分散处理的细胞分散液，可列举包含例如：胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、链霉蛋白酶、DNA酶、木瓜蛋白酶等和诸如乙二胺四乙酸等螯合剂中的任一种的溶液。也可以使用市售的细胞分散液，例如Accumax(Innovative celltechnologies公司制)、TripLE Select(Thermo Fisher Scientific公司制)。
作为用于添加细胞保护剂的处理的细胞保护剂，可列举：FGF信号转导途径作用物质，肝素，Rho-相关蛋白激酶(ROCK)抑制物质，血清，血清代替物等。关于优选的细胞保护剂，可列举ROCK抑制物质。
作为使多潜能干细胞分散的方法，可列举例如将多潜能干细胞的集落(colony)在ROCK抑制物质的存在下用细胞分散液(Accumax)处理，进一步通过吹打使其分散的方法。
在本发明的制备方法中，优选地通过迅速汇集多潜能干细胞而形成多潜能干细胞的聚集体。当以这样的方式形成多潜能干细胞的聚集体时，可以以良好的重现性在由所形成的聚集体诱导和分化的细胞中形成上皮样结构。作为形成细胞的聚集体的实验操作，可列举例如使用孔小的板(例如，孔的底面积用平底换算时为0.1～2.0cm2左右的板)、微孔等将细胞控制在小空间中的方法，通过使用小的离心管进行短时间离心而使细胞聚集的方法。作为孔小的板，可列举例如：24孔板(面积用平底换算时为1.88cm2左右)、48孔板(面积用平底换算时为1.0cm2左右)、96孔板(面积用平底换算时为0.35cm2左右，内径6～8mm左右)、384孔板。优选可列举96孔板。关于孔小的板的形状，从上方看孔时底表面的形状可列举多边形、长方形、椭圆形、正圆形，优选可列举正圆形。作为孔小的板的形状，从侧面看孔时的底表面的形状优选为外周部高而内凹部低的下凹结构，可列举为例如：U型底，V型底，M型底、优选为U型底或V型底，最优选可列举V型底。作为孔小的板，也可以使用细胞培养皿(例如：60mm～150mm平皿，培养瓶)的底表面具有凹凸或齿状的那些。孔小的板的底表面优选使用非细胞黏着性底表面，优选前述经非细胞黏着性包被的底表面。
对多潜能干细胞的聚集体的形成，和在形成凝集体的各细胞中形成了上皮样结构而言，可以基于聚集体的尺寸及细胞数目，宏观形态，采用组织染色分析的微观形态及其均一性、分化及未分化标记的表达以及其均一性、分化标记的表达控制及其同步性、聚集体间的分化效率的再现性等而判断。
“组织”意指具有以下结构的细胞群体的结构体，在所述结构中，形态、性质不同的多种类的细胞以一定模式在空间上配置。
“神经组织”是指由神经系统细胞构成的组织，包括发育阶段或成体阶段的大脑，中脑，小脑，脊髓，视网膜，感觉神经、外周神经等。
在本发明中，“神经上皮组织”是指神经组织形成的具有层结构的上皮结构，神经组织中神经上皮组织可以使用光学显微镜通过明场观察等评估存在量。
“中枢神经系统”表示神经组织积累，成为信息处理的中心的区域。在脊椎动物中，脑和脊髓包含在中枢神经系统中。
“神经系统细胞(Neural cell)”是指来源于外胚层的组织中除表皮谱系细胞之外的细胞。即，神经系统细胞包括：神经系统前体细胞，神经元(神经细胞)，胶质细胞，神经干细胞，神经元前体细胞，神经胶质前体细胞等细胞。神经系统细胞还包括下文提及的构成视网膜组织的细胞(视网膜细胞)、视网膜前体细胞、视网膜层特异性神经细胞、神经视网膜细胞和视网膜色素上皮细胞。神经系统细胞可以用巢蛋白、βIII微管蛋白(βIII tubulin)(Tuj1)，PSA-NCAM、N-钙黏着蛋白等作为标记进行鉴定。
神经元是形成神经回路并对信号转导有贡献的功能细胞，可以通过将TuJ1，Dcx，HuC/D等不成熟神经细胞标记，和/或Map2，NeuN等成熟神经细胞标记的表达作为指标进行鉴定。
关于神经胶质细胞(glia cell)，可以提及星形胶质细胞(astrocyte)、少突胶质细胞(oligodendrocyte)、米勒胶质细胞等。作为星形胶质细胞的标记，可列举GFAP，作为少突胶质细胞的标记可列举O4，作为米勒胶质细胞的标记可列举CRALBP等。
神经干细胞是具有向神经细胞和胶质细胞的分化潜能(多分化潜能性)和维持多分化潜能性的增殖能力(有时称为自我更新能力)的细胞。关于神经干细胞标记，可列举：巢蛋白、Sox2、Musashi、Hes家族、CD133等；然而，这些标记是关于前体细胞全体的标记，而不被认为是神经干细胞特异性的标记。神经干细胞的数量可以通过神经球测定、克隆测定等评估。
神经元前体细胞是具有增殖能力的细胞，其产生神经细胞，并且不产生神经胶质细胞。作为神经元前体细胞的标记，可列举Tbr2，Tα1等。或者，也可以将不成熟神经细胞标记(TuJ1，Dcx，HuC/D)阳性且增殖标记(Ki67，pH3，MCM)阳性的细胞鉴定为神经元前体细胞。
神经胶质前体细胞是具有增殖能力的细胞，其产生神经胶质细胞，并且不产生神经元。
神经系统前体细胞(Neural Precursor cell)为包括神经干细胞，神经元前体细胞及神经胶质前体细胞的前体细胞的聚集体，具有增殖能力和神经元及神经胶质产生能力。神经系统前体细胞可以用巢蛋白，GLAST，Sox2，Sox1，Musashi，Pax6等作为标记鉴定。也可以将神经系统细胞的标记阳性且增殖标记(Ki67，pH3，MCM)阳性的细胞鉴定为神经系统前体细胞。
“视网膜组织”意指在生物体视网膜中构成各视网膜层的视细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞、它们的前体细胞、或视网膜前体细胞等细胞中的至少多种类型以层状形式在空间上排列的视网膜组织。可采用公知的方法，通过例如有无细胞标记的表达，其水平等确认各种细胞是否为构成任一种视网膜层的细胞。
“视网膜前体细胞”是指能够分化成：视细胞，水平细胞，双极细胞，无长突细胞，视网膜神经节细胞，视网膜色素上皮细胞中的任意成熟的视网膜细胞的前体细胞。
对视细胞前体细胞、水平细胞前体细胞、双极细胞前体细胞、无长突细胞前体细胞、视网膜节细胞前体细胞、视网膜色素上皮前体细胞而言，分别意指确定分化成视细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、视网膜神经节细胞、视网膜色素上皮细胞的前体细胞。
“视网膜层特异性神经细胞”是指构成视网膜层的细胞，且为视网膜层特异性的神经细胞。作为视网膜层特异性神经细胞，可列举：双极细胞，视网膜神经节细胞，无长突细胞，水平细胞，视细胞，视网膜色素上皮细胞，视杆细胞及视锥细胞。
“视网膜细胞”包括前述视网膜前体细胞和视网膜层特异性神经细胞。
作为视网膜细胞标记，可列举在视网膜前体细胞中表达的Rx(也称为Rax)，Aldh1a3，及Pax6，在下丘脑神经元的前体细胞中表达而在视网膜前体细胞中不表达的Nkx2.1，在下丘脑神经上皮中表达而在视网膜中不表达的Sox1，在视细胞的前体细胞中表达的Crx，Blimp1等。作为视网膜层特异性神经细胞的标记，可列举在双极细胞中表达的Chx10，PKCα及L7，在视网膜神经节细胞中表达的TuJ1及Brn3，在无长突细胞中表达的钙视网膜蛋白(钙网膜蛋白)，在水平细胞中表达的钙结合蛋白(Calbindin)，在成熟视细胞中表达的视紫质(Rhodopsin)及恢复蛋白(Recoverin)，在视杆细胞中表达的Nrl，在视锥细胞中表达的Rxr-gamma，在视网膜色素上皮细胞中表达的RPE65及Miff等。
“大脑组织”是指构成胎儿期或成体的大脑的细胞(例如，大脑神经系统前体细胞(cortical neural precursor cell)，背侧大脑神经系统前体细胞，腹侧大脑神经系统前体细胞，大脑层结构特异性的神经细胞(神经元)，第一层神经元，第二层神经元，第三层神经元，第四层神经元，第五层神经元，第六层神经元，神经胶质细胞(星形胶质细胞及少突胶质细胞)，它们的前体细胞等)中的一种或多种，以层状形式在空间上排列的组织。胎儿期的大脑也称为前脑或端脑。可采用公知的方法，通过例如有无细胞标记的表达，其水平等确认各种细胞的存在。
“大脑层”是指构成成体大脑或胎儿期大脑的各层，具体而言，可列举分子层，外核层，外视锥细胞层，内核层，神经细胞层(内视锥细胞层)，多型细胞层，第一层，第二层，第三层，第四层，第五层，第六层，皮质带，中间带，脑室下带及脑室带(ventricular zone)。
作为“大脑神经系统前体细胞”，可列举神经元前体细胞，第一层神经元前体细胞，第二层神经元前体细胞，第三层神经元前体细胞，第四层神经元前体细胞，第五层神经元前体细胞，第六层神经元前体细胞，星形胶质细胞前体细胞，少突胶质细胞前体细胞等。各种细胞为赋予了决定分化为第一层神经元，第二层神经元，第三层神经元，第四层神经元，第五层神经元，第六层神经元，星形胶质细胞，及少突胶质细胞的前体细胞。
“大脑神经系统前体细胞”为包含具有分化为第一层神经元，第二层神经元，第三层神经元，第四层神经元，第五层神经元，第六层神经元，星形胶质细胞，及少突胶质细胞中的至少多个分化体系谱的分化潜能(多能性)的多能性干细胞(多能性神经干细胞，multi-potent neural stem cell)。
“大脑层特异性神经细胞”是指构成大脑层的细胞，且为大脑层特异性的神经细胞。作为大脑层特异性神经细胞，可列举第一层神经元，第二层神经元，第三层神经元，第四层神经元，第五层神经元，第六层神经元，大脑兴奋性神经元，大脑抑制性神经元等。
作为大脑细胞标记，可列举在大脑细胞中表达的FoxG1(别名Bf1)，大脑神经系统前体细胞中表达的Sox2及巢蛋白，背侧大脑神经系统前体细胞中表达的Pax6及Emx2，腹侧大脑神经系统前体细胞中表达的Dlx1，Dlx2及Nkx 2.1，神经元前体细胞中表达的Tbr2，Nex，Svet1，第六层神经元中表达的Tbr1，第五层神经元中表达的Ctip2，第四层神经元中表达的RORβ，第三层神经元或第二层神经元中表达的Cux1或Brn2，第一层神经元中表达的Reelin等。
“嗅皮质”是指接受来自嗅球的单突触(synapse)性输入，参与嗅觉信息的处理的大脑的一个区域。
作为嗅皮质中表达的基因及标记，可列举Tbr1，FoxP2，Ctip2，Nor1(NR4a3)，DAARP-32，CUX1，Brn2，CART等。
“大脑基底核”是指存在于大脑的一个区域的神经核的聚集体。作为大脑基底核中包含的神经核，可列举纹状体(striatum)、苍白球(pallidum)、丘脑下核(subthalamicnucleus)、黑质(substantia nigra)等。
“大脑基底核原基”是指发育中的胚胎的脑室内形成的包含神经系统细胞的结构。大脑基底核原基除了为成体的大脑基底核的基础以外，也产生多种神经细胞，这些细胞在发育中迁移到中枢神经系统的各个位置。
“吻侧移动途径(rostral migratory stream)”是指从脑室下带的神经干细胞产生的新生神经元迁移到嗅球的现象及其途径。在吻侧移动途径中移动的神经元，可以使用例如PSA-NCAM，Dcx等迁移中的神经细胞标记检测。
“嗅球”是指存在于大脑的前端部，接受来自存在于嗅上皮的嗅觉受体细胞的输入，参与嗅觉信息的处理的中枢神经系统的一个区域。存在于嗅球的细胞形成层结构，从表层按顺序称为，嗅神经层(olfactory nerve layer)，嗅球小球层(glomerular layer)，外网织层(external plexiform layer)，僧帽细胞层(mitral cell layer)，内网织层(internal plexiform layer)，颗粒细胞层(granule cell layer)。在嗅球的神经细胞中，存在作为兴奋性神经元的僧帽细胞(mitral cell)和毛丛状细胞(tufted cell)，作为抑制性神经元(中介神经元)的嗅丝球旁体细胞(periglomerular cell)和颗粒细胞(granulecell)。
作为嗅球中表达的基因及标记，可列举Arx，Tbr1，Tbr2/EOMES，Tbx21，Iba1等。
“非神经上皮组织”是指在具有上皮结构的组织中除了神经上皮组织以外的组织。上皮组织可由外胚层，中胚层，内胚层，营养外胚层中的任意胚层形成。在上皮组织中包括上皮，中皮，内皮。作为非神经上皮组织中包含的组织的例子，可列举：表皮，角膜上皮，鼻腔上皮(包含嗅上皮)，口腔上皮，气管上皮，支气管上皮，气管上皮，肾上皮，肾皮质上皮，胎盘上皮等。
对上皮组织而言，通常利用各种细胞间连接而连接，形成具有单层或复层化的层结构的组织。这些上皮组织的有无的确认，存在量的定量能够通过利用光学显微镜的观察、或使用针对上皮细胞标记的抗体(抗E-钙黏着蛋白抗体，抗N-钙黏着蛋白抗体，抗EpCAM抗体等)的免疫组织化学等手段进行。
“基板(placode)”主要表示在脊椎动物的发育过程中，表皮外胚层的一部分肥大而形成的器官的原基(primordial organ)。作为源自于基板的组织，可列举：晶状体，嗅上皮，内耳，三叉神经、垂体等。作为基板或为其前体组织的前基板区域(preplacode region)的标记，可列举Six1，Six4，Dlx5，Eya2等。
“嗅上皮”表示鼻腔中的上皮组织，为生物体感知味道的信息的嗅觉器官。嗅上皮为源自基板的组织之一，表达嗅觉受体，由感知空气中的挥发性分子的嗅神经细胞和，支持嗅神经细胞的支持细胞，为嗅上皮的干细胞及前体细胞的基底细胞，分泌粘液的鲍曼氏腺(Bowman′s gland)细胞等细胞构成。嗅上皮在形态上分类为表层、中间层、基底层，在表层中存在支持细胞，中间层中存在嗅神经细胞，基底层中存在基底细胞。鲍曼氏腺在嗅上皮内形成分支管状的胞状腺，点样分布。
“嗅上皮的前体组织”包含嗅上皮基板。作为嗅上皮及嗅上皮基板中表达的基因及标记，除了上述的基板区域及前基板区域的标记以外，还可列举Pax6，Otx2，FoxG1(别名Bf1)，Sox2，Pou2f1，Sp8，Chd7，N-钙黏着蛋白，E-钙黏着蛋白，EpCAM，CK18，PDGFRβ等。
梨鼻器为嗅觉系统组织的一种，生物体除了嗅上皮以外具有的嗅觉器官。梨鼻器也称为“雅各布逊氏器(Jacobson′s organ)”。哺乳类中的梨鼻器与感知一般挥发性物质的嗅上皮的功能不同，存在更多接受信息素样物质的神经细胞。
“嗅觉系统组织”是指胎儿期或成体的嗅觉系统组织，例如构成嗅上皮的细胞(例如嗅神经细胞，支持细胞，基底细胞，鲍曼氏腺细胞，嗅神经鞘细胞及它们的前体细胞等)，构成嗅球的细胞，构成嗅皮质的细胞等中的一种或至少多种类型以层状形式在空间上排列的组织。可采用公知的方法，通过例如有无细胞的特异性基因的表达，其水平等确认各种细胞的存在。
“嗅神经细胞”(olfactory receptor neuron：ORN)是指位于鼻腔粘膜的嗅上皮中间层的接受嗅觉的神经细胞。嗅神经细胞利用表面的纤毛存在的嗅觉受体捕获空气中的挥发性分子。嗅神经细胞为双极性的感觉细胞，利用在末梢侧表达的嗅觉受体捕获到的嗅觉信息被传送到作为中枢侧的称为嗅丝的神经轴突。嗅丝以每数十本聚集形成一个束，嗅神经指这些束的全部。嗅丝通过位于头骨的筛骨筛板上的筛骨孔而到达脑的嗅球，在该处与僧帽细胞等进行突触结合，向脑内的嗅觉中枢传递嗅觉信息。
作为在嗅神经细胞及前体细胞中表达的基因及标记，可列举环状核苷酸敏感性途径α2亚单元(CNGA2)，环状核苷酸敏感性途径α4亚单元(CNGA4)，环状核苷酸敏感性途径β1b亚单元，嗅觉特异性G蛋白质(Golf)腺苷酸环化酶，嗅觉标记蛋白(OMP)，NCAM，OCAM(NCAM-2)，Ebf1，Ebf2，Ebf3，NeuroD，PGP9.5，神经元特异性烯醇化酶(NSE)，生长相关蛋白43(GAP-43/B50)，波形蛋白，Lhx2，Id3，β-微管蛋白III(Tuj)，钙网膜蛋白，TrkB，Ctip2，Uncx及嗅觉受体(olfactory receptor：OR)等。
“支持细胞”(Supporting Cell)是指在嗅上皮的最顶端面侧存在的多列圆柱上皮样的细胞。支持细胞参与嗅神经细胞等其它细胞的功能的发挥，生存、上皮结构的保持等。嗅上皮的支持细胞由支持细胞(Sustentacular Cell)及微绒毛细胞(Microvillar cell)这二种细胞构成。
作为支持细胞中表达的基因及标记，可列举Notch2，Notch3，羰基还原酶2(Cbr2)，仲100，Ezrin，Reep6，Sox2，Tyro3，CYP2A6，SUS-1，SUS-4，EPAS1等。
“基底细胞”(basal cell)是指存在于嗅上皮的基底层的细胞。基底细胞在形态上被分为球状基底细胞(globose basal cell：GBC)和水平基底细胞(horizontal basalcell：HBC)。这二种细胞中，球状基底细胞为恒常地发生细胞分裂，供给新的嗅神经细胞的为处于活动中一种前体细胞，干细胞。另一方面，水平基底细胞为通常处于细胞分裂的细胞周期停止的状态，是在发生嗅上皮的大规模损伤等时才被活化的一种休眠状态的干细胞。
作为在水平基底细胞中表达的基因及标记，可列举p63，细胞角蛋白5，细胞角蛋白14，ICAM-1等。
作为在球状基底细胞中表达的基因及标记，可列举GAP43，GBC-1，Lgr5，Ascl1，LSD1，SEC8等。
“鲍曼氏腺细胞”(Bowman’s gland cell)是指构成鲍曼氏腺(嗅腺)的细胞。鲍曼氏腺为存在于嗅上皮的分支的细管上的组织，具有分泌保护嗅上皮的粘液等的功能。
作为鲍曼氏腺细胞中表达的基因及标记，可列举Sox9，E-钙黏着蛋白，Aquaporin5，Ascl3，细胞角蛋白18等。
“嗅神经鞘细胞”(olfactory ensheating glia：OEG)是指存在于嗅上皮及嗅球的胶质细胞的一种。嗅神经鞘细胞放出BDNF，NGF等神经营养因子，为参与嗅神经的恒常的再生细胞。
作为嗅神经鞘细胞中表达的基因及标记，可列举p75NTR，S100β，Sox10，GFAP，BLBP，水通道蛋白(Aquaporin1)，整合素(Integrin)α7等。
“嗅上皮周缘部”(lateral olfactory epithelium)是指嗅上皮的周缘的区域，表示与除了嗅上皮以外的非神经上皮连续的区域。在本发明中“嗅上皮内侧部”(medialolfactory epithelium)是指围着嗅上皮周缘部的嗅上皮的中心区域。已知在嗅上皮周缘部和嗅上皮内侧部中，构成的细胞的比例不同(Development，2010，137：2471-2481)。作为在嗅上皮周缘部中表达高的基因，可列举Pbx1/2/3，Meis1，βIVTubulin。作为在嗅上皮内侧部中表达高的基因，可列举Tuj1，Ascl1，Sox2。
“促性腺激素释放激素阳性神经细胞”是指主要存在于中枢神经系统的下斤脑的，分泌参与生殖系统的器官的控制的促性腺激素释放激素(gonadotropin releasinghormone：GnRH)的神经细胞。促性腺激素释放激素阳性神经细胞在胚胎阶段在嗅上皮产生后，移动到中枢神经系统。
作为促性腺激素释放激素阳性神经细胞中表达的基因及标记，可列举促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone：GnRH)等。
“骨组织”是指，骨构成细胞和，磷酸钙，I型胶原等从构成的骨基质表示。骨构成细胞中包含骨细胞，破骨细胞，成骨细胞等。
“头骨”是指存在于头部的骨组织。头骨具有保持脸部及头部的形态及结构，保护中枢神经系统等功能。
“筛骨”是指构成头骨的骨组织之一。人的筛骨为存在于两眼窝之间。
作为构成包含头骨的骨的细胞中表达的基因及标记，可列举Msx2，Runx2，Osterix，骨钙素，骨桥蛋白(Osteopontin)等。此外，通过茜素红染色，碱性磷酸酶染色等办法，可以辨别组织中是否存在骨组织。
“受体蛋白质”是指位于细胞膜，细胞质或核内的蛋白质，与激素，细胞因子，细胞生长因子，化合物等物质结合，诱发各种细胞反应的蛋白质。
“嗅觉受体”是指在嗅神经细胞及其它细胞中表达，参与化合物等的感知的受体蛋白质。
[2.包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备方法]
本发明提供包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备方法。以下，也称为本发明的制备方法。
本发明的制备方法的一种实施方式为包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备方法，所述方法包含下述步骤。
步骤(1)，将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，形成细胞聚集体，
步骤(2)，将步骤(1)中得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，
步骤(3a)，将步骤(2)中得到的细胞聚集体在FGF信号转导途径作用物质的存在下进行悬浮培养，得到上述细胞团块。
本发明的制备方法的优选一种实施方式为包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备方法，所述方法包含下述步骤。
步骤(a)，在步骤(1)前将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，以包含1)选自TGFβ家族信号转导途径抑制物质及sonic hedgehog信号转导途径作用物质中的至少1个，和2)未分化维持因子的培养基进行培养，
步骤(1)，将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，形成细胞聚集体，
步骤(2)，将步骤(1)中得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，
步骤(3a)，将步骤(2)中得到的细胞聚集体在FGF信号转导途径作用物质的存在下进行悬浮培养，得到上述细胞团块。
本发明的制备方法的优选一种实施方式为包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备方法，所述方法包含下述步骤。
步骤(1)，将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，形成细胞聚集体，
步骤(2)，将步骤(1)中得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，
步骤(3a)，将步骤(2)中得到的细胞聚集体在FGF信号转导途径作用物质的存在下进行悬浮培养，
步骤(3c)，将步骤(3a)中得到的细胞聚集体在FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质的存在下培养，得到上述细胞团块。
本发明的制备方法的优选一种实施方式为包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备方法，所述方法包含下述步骤。
步骤(a)，在步骤(1)前将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，以包含1)选自TGFβ家族信号转导途径抑制物质及sonic hedgehog信号转导途径作用物质中的至少1个，和2)未分化维持因子的培养基进行培养，
步骤(1)，将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，形成细胞聚集体，
步骤(2)，将步骤(1)中得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，
步骤(3a)，将步骤(2)中得到的细胞聚集体在FGF信号转导途径作用物质的存在下进行悬浮培养，
步骤(3c)，将步骤(3a)中得到的细胞聚集体在FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质的存在下培养，得到上述细胞团块。
本发明的制备方法的进一步一种实施方式为包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备方法，所述方法包含下述步骤。
步骤(1)，将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，形成细胞聚集体，
步骤(2)，将步骤(1)中得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，
步骤(3b)，将步骤(2)中得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径抑制物质的存在下进行悬浮培养，得到上述细胞团块。
本发明的制备方法的优选一种实施方式为包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备方法，所述方法包含下述步骤。
步骤(1)，将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，形成细胞聚集体，
步骤(2)，将步骤(1)中得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，
步骤(3b)，将步骤(2)中得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径抑制物质的存在下进行悬浮培养，
步骤(3d)，将步骤(3b)中得到的细胞聚集体在不存在BMP信号转导途径抑制物质的条件下进行悬浮培养，得到上述细胞团块。
本发明的制备方法的更优选一种实施方式为包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备方法，所述方法包含下述步骤。
步骤(a)，在步骤(1)前将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，以包含1)选自TGFβ家族信号转导途径抑制物质及sonic hedgehog信号转导途径作用物质中的至少1个，和2)未分化维持因子的培养基进行培养，
步骤(1)，将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，形成细胞聚集体，
步骤(2)，将步骤(1)中得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，
步骤(3b)，将步骤(2)中得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径抑制物质的存在下进行悬浮培养，得到上述细胞团块。
本发明的制备方法的进一步优选一种实施方式为包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备方法，所述方法包含下述步骤。
步骤(a)，在步骤(1)前将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，以包含1)选自TGFβ家族信号转导途径抑制物质及sonic hedgehog信号转导途径作用物质中的至少1个，和2)未分化维持因子的培养基进行培养，
步骤(1)，将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，形成细胞聚集体，
步骤(2)，将步骤(1)中得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，
步骤(3b)，将步骤(2)中得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径抑制物质的存在下进行悬浮培养，
步骤(3d)，将步骤(3b)中得到的细胞聚集体在不存在BMP信号转导途径抑制物质的条件下进行悬浮培养，得到上述细胞团块。
本发明的制备方法的进一步一种实施方式为包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备方法，所述方法包含下述步骤。
步骤(1)，将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，形成细胞聚集体，
步骤(2)，将步骤(1)中得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，
步骤(3c)，将步骤(2)中得到的细胞聚集体在FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，得到上述细胞团块。
本发明的制备方法的优选一种实施方式为包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备方法，所述方法包含下述步骤。
步骤(1)，将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，形成细胞聚集体，
步骤(2)，将步骤(1)中得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，
步骤(3c)，将步骤(2)中得到的细胞聚集体在FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质的存在下进行悬浮培养，
步骤(3d)，将步骤(3c)中得到的细胞聚集体在不存在BMP信号转导途径抑制物质的条件下进行悬浮培养，得到上述细胞团块。
本发明的制备方法的更优选一种实施方式为包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备方法，所述方法包含下述步骤。
步骤(a)，在步骤(1)前将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，以包含1)选自TGFβ家族信号转导途径抑制物质及sonic hedgehog信号转导途径作用物质中的至少1个，和2)未分化维持因子的培养基进行培养，
步骤(1)，将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，形成细胞聚集体，
步骤(2)，将步骤(1)中得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，
步骤(3c)，将步骤(2)中得到的细胞聚集体在FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，得到上述细胞团块。
本发明的制备方法的进一步优选一种实施方式为包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备方法，所述方法包含下述步骤。
步骤(a)，在步骤(1)前将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，以包含1)选自TGFβ家族信号转导途径抑制物质及sonic hedgehog信号转导途径作用物质中的至少1个，和2)未分化维持因子的培养基进行培养，
步骤(1)，将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，形成细胞聚集体，
步骤(2)，将步骤(1)中得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养，
步骤(3c)，将步骤(2)中得到的细胞聚集体在FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质的存在下进行悬浮培养，
步骤(3d)，将步骤(3c)中得到的细胞聚集体在不存在BMP信号转导途径抑制物质的条件下进行悬浮培养，得到上述细胞团块。
通过上述制备方法制备的细胞团块为如后述“3.包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块”中记载所述。
<步骤(a)>
对将多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，以包含1)选自TGFβ家族信号转导途径抑制物质及sonic hedgehog信号转导途径作用物质中的至少1个，和2)未分化维持因子的培养基进行培养的步骤(a)进行说明。
步骤(a)中，通过将多潜能干细胞在选自由TGFβ家族信号转导途径抑制物质及sonic hedgehog信号转导途径作用物质组成的组中的至少1个的存在下培养后，进行步骤(1)的悬浮培养，由此可以高效率地制备细胞聚集体，所述细胞聚集体中多潜能干细胞的状态改变，非神经上皮组织的形成效率改善，聚集体的品质提高，容易分化，不易产生细胞死亡，聚集体的内部保持紧密的未分化性。
步骤(a)在不存在饲养细胞的条件下实施。本发明中的不存在饲养细胞的条件下(无饲养细胞)是指实质上不含饲养细胞(例如：相对于总细胞数，饲养细胞数的比例为3％以下)的条件。
对步骤(a)中使用的培养基而言，只要是在无饲养细胞条件下能够实现多潜能干细胞的未分化维持培养的培养基(无饲养细胞培养基)即可，没有特别限定。
关于无饲养细胞的培养基，已经开发且已市售了多种合成的培养基，例如，可列举Essential 8培养基。Essential 8培养基为在DMEM/F12培养基中作为添加剂包含L-抗坏血酸-2-磷酸镁(64mg/l)，硒酸钠(14μg/1)，胰岛素(19.4mg/l)，NaHCO3(543mg/l)，转铁蛋白(10.7mg/l)，bFGF(100ng/mL)，及TGFβ家族信号转导途径作用物质(TGFβ1(2ng/mL)或Nodal(100ng/mL))(Nature Methods，8，424-429(2011))。作为市售的无饲养细胞培养基，可列举例如Essential 8(Thermo Fisher Scientific公司制)，S-medium(DS Pharma Biomedical股份有限公司制)，StemPro(Thermo Fisher Scientific公司制)，hESF9，mTeSR1(STEMCELLTechnologies公司制)，mTeSR2(STEMCELL Technologies公司制)，TeSR-E8(STEMCELLTechnologies公司制)，StemFit(Ajinomoto Co.，Inc.股份有限公司制)等。可在步骤(a)中通过使用它们而简便地实施本发明。StemFit培养基作为未分化保持成分含有bFGF(Scientific Reports(2014)4，3594)。
步骤(a)中使用的培养基可以为血清培养基也可以为无血清培养基。从避免化学未确定的成分的混入的观点出发，步骤(a)中使用的培养基优选为无血清培养基。培养基也可以包含“血清替代物”。
步骤(a)中使用的培养基为了能够实现未分化维持培养而包含未分化维持因子。用于维持未分化的因子没有特别限制，只要是具有抑制多潜能干细胞的分化的作用的物质即可。作为本领域普通技术人员广泛应用的未分化维持因子，在起始的(primed)多潜能干细胞(例如人ES细胞，人iPS细胞)的情况下，可列举FGF信号转导途径作用物质、TGFβ家族信号转导途径作用物质、胰岛素等。作为FGF信号转导途径作用物质，具体而言可列举：成纤维细胞生长因子(例如bFGF、FGF4、FGF8)。另外，作为TGFβ家族信号转导途径作用物质，可列举TGFβ信号转导途径作用物质、Nodal/激活蛋白信号转导途径作用物质。作为TGFβ信号转导途径作用物质，可列举例如：TGFβ1、TGFβ2。作为Nodal/激活蛋白信号转导途径作用物质，可列举例如：Nodal、激活蛋白A、激活蛋白B。这些物质可以单独或组合使用。培养人多潜能干细胞(人ES细胞，人iPS细胞)时，步骤(a)中的培养基优选为作为未分化维持因子而包含bFGF。
用于本发明的未分化维持因子通常是维持哺乳动物未分化状态的因子。关于哺乳动物，可列举上文提及的那些。由于未分化维持因子可以在哺乳动物物种之间具有交叉反应性，因此也可以使用用于维持任何哺乳动物的未分化状态的因子，只要能够维持要培养的多潜能干细胞的未分化状态即可。用于本发明的未分化维持因子优选为与要培养的细胞为同一种哺乳动物的维持未分化状态因子。例如，对于人多潜能干细胞的培养，可使用人的未分化维持因子(例如，bFGF，FGF4，FGF8，EGF，Nodal，激活蛋白A，激活蛋白B，TGFβ1，TGFβ2等)。在此“人蛋白质X”是指蛋白质X(未分化维持因子等)具有在人生物体内天然表达的蛋白质X的氨基酸序列。
在本发明中使用的保持未分化因子优选是被分离的。
“分离”是指进行除去作为目标的成分、细胞以外的因子的操作而脱离了天然存在的状态。因此，在“经分离的蛋白质X”中，不包括由培养对象的细胞、组织产生的细胞、在组织及培养基中包含的内源性的蛋白质X。“经分离的蛋白质X”的纯度(蛋白质X的重量占总蛋白质重量的百分率)通常为70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上，进一步优选为99％以上，最优选为100％。
在一种实施方式中，本发明包括提供经分离的未分化维持因子的步骤。另外，在一种实施方式中，包括向步骤(a)中使用的培养基中外来地(或外因地)添加经分离的未分化维持因子的步骤。或者，也可以在步骤(a)中使用的培养基中预先添加未分化维持因子。
步骤(a)中使用的培养基中的未分化维持因子浓度为能够维持所培养的多潜能干细胞的未分化状态的浓度，对于本领域技术人员而言可以适当设定。例如，在不存在饲养细胞的条件下作为未分化保持因素使用bFGF的情况下，其浓度通常为约4ng/mL～约500ng/mL、优选为约10ng/mL～约200ng/mL，更优选为约30ng/mL～约150ng/mL。
步骤(a)的多潜能干细胞的培养可以在悬浮培养及贴壁培养中的任一个条件下进行，优选为利用贴壁培养进行。
在步骤(a)中无饲养细胞条件下的多潜能干细胞的培养中，可以使用适当的基质作为构架，用于给多潜能干细胞提供替代饲养细胞的构架。通过作为构架的基质而在表面进行了包被的细胞容器中贴壁培养多潜能干细胞。
关于可以用作构架的基质，可列举：层粘连蛋白(Nat Biotechnol.28，611-615(2010))，层粘连蛋白片段(Nat Commun 3，1236(2012))，基底膜制品(Nat Biotechnol 19，971-974(2001))，明胶，胶原蛋白，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖，entactin，玻连蛋白等。
“层粘连蛋白”是指包含α，β，γ链的杂三聚物分子，为存在亚单元链的组成不同的亚型的细胞外基质蛋白质。具体而言，层粘连蛋白以5种α链、4种β链及3种γ链的杂三聚物的组合计，有约15种亚型。层粘连蛋白的名称通过将α链(α1-α5)、β链(β1-β4)和γ链(γ1-γ4)各自的数目进行组合而确定。例如，具有α5链、β1链、γ1链的组合的层粘连蛋白称为层粘连蛋白511。在本发明中优选使用层粘连蛋白511(Nat Biotechnol 28，611-615(2010))。
本发明中使用的层粘连蛋白片段没有特别限制，只要其具有与多潜能干细胞的黏着性并且允许在无饲养细胞的条件下维持培养多潜能干细胞即可，并且其优选是E8片段。在通过用弹性蛋白酶消化层粘连蛋白511得到的多个片段中，层粘连蛋白E8片段被鉴定为具有强细胞黏着活性的片段(EMBO J.，3：1463-1468，1984，J.Cell Biol.，105：589-598，1987)。在本发明中，优选使用层粘连蛋白511的E8片段(Nat Commun 3，1236(2012)，Scientific Reports 4，3549(2014))。用于本发明的层粘连蛋白E8片段不需要是层粘连蛋白的弹性蛋白酶消化产物，也可以是重组体。或可以为在基因重组动物(蚕等)中产生的那些。为了避免未确定成分的混入，在本发明中优选使用重组体的层粘连蛋白片段。层粘连蛋白511的E8片段已经市售，并可以从例如Nippi，Inc.等购买。
从避免未确定成分的混入的观点出发，在本发明中使用的层粘连蛋白或层粘连蛋白片段优选经过分离。
在步骤(a)中无饲养细胞条件下的多潜能干细胞的培养中，在优选为利用分离的层粘连蛋白511或层粘连蛋白511的E8片段，更优选为层粘连蛋白511的E8片段对表面进行包被的细胞容器中，将多潜能干细胞贴壁培养。
步骤(a)中多潜能干细胞的培养时间没有特别限定，在可实现继续提高步骤(1)中形成的聚集体的品质的效果的范围内即可，通常为0.5～144小时、优选为2～96小时，更优选为6～48小时，进一步优选为12～48小时，特别优选为18～28小时，例如24小时。
即，在步骤(1)开始的0.5～144小时、优选为18～28小时前开始步骤(a)，在步骤(a)完毕后接着进行步骤(1)。
步骤(a)中的培养温度，CO2浓度等培养条件可以适当设定。例如，培养温度为约30℃至约40℃，优选约37℃。另外，CO2浓度例如为约1％～约10％、优选为约5％。
在优选一种实施方式中，将人多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，在含有bFGF的无血清培养基中贴壁培养。该贴壁培养优选为在用层粘连蛋白511、层粘连蛋白511的E8片段或玻连蛋白对表面进行包被的细胞容器中实施。对该贴壁培养而言，优选地，作为无饲养细胞培养基使用StemFit实施。
在优选一种实施方式中，将人多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，在含有bFGF的无血清培养基中悬浮培养。在悬浮培养中，人多潜能干细胞可以形成人多潜能干细胞聚集体。
sonic hedgehog信号(下文中有时记作“Shh”)转导途径作用物质是指可增强由Shh介导的信号转导的物质。作为Shh信号转导途径作用物质，可列举例如属于Hedgehog家族的蛋白质(例如Shh、Ihh)，Shh受体，Shh受体激动剂，Smo激动剂，嘌吗啡胺(Purmorphamine)(9-环己基-N-[4-(吗啉基)苯基]-2-(1-萘氧基)-9H-嘌呤-6-胺)，GSA-10(4-(1-己基-4-羟基-2-氧基-1，2-二氢喹啉-3-甲酰胺基)苯甲酸丙酯)，Hh-Ag 1.5，20(S)-羟基胆固醇，SAG(Smoothened Agonist：N-甲基-N’-(3-吡啶基苄基)-N’-(3-氯苯[b]噻吩-2-羰基)-1，4-二氨基环己烷)等。这些物质可以单独或组合使用。
Shh信号转导途径作用物质优选包含由SAG，嘌吗啡胺，GSA-10组成的组中包含的至少一种，更优选包含SAG。培养基中的Shh信号转导途径作用物质的浓度可在能够实现上述效果的范围内适当设定。SAG在步骤(a)中通常以约1nM～约2000nM、优选为约10nM～约1000nM更优选为约10nM～约700nM，进一步优选为约50nM～约700nM，特别优选为约100nM～约600nM，最优选为约100nM～约500nM的浓度使用。当使用除了SAG以外的Shh信号转导途径作用物质时，优选地以赋予与上文提及的浓度的SAG的活性等同的Shh信号转导增强活性的浓度使用。sonic hedgehog信号转导增强活性可以以本领域技术人员众所周知的方法，例如通过关注Gli1基因的表达的报告基因检测来确定(Oncogene(2007)26，5163-5168)。
TGFβ家族信号转导途径(即TGFβ超家族信号转导途径)是指以转化生长因子β(TGFβ)，Nodal/激活蛋白，或BMP为配体，在细胞内由Smad家族转导的信号转导途径。
TGFβ家族信号转导途径抑制物质表示抑制GFβ家族信号转导途径，即由Smad家族转导的信号转导途径的物质，具体而言可列举：TGFβ信号转导途径抑制物质、Nodal/激活蛋白信号转导途径抑制物质和BMP信号转导途径抑制物质。作为TGFβ家族信号转导途径抑制物质，优选TGFβ信号转导途径抑制物质。
作为TGFβ信号转导途径抑制物质没有特别限定，只要为抑制TGFβ引起的信号转导途径的物质即可，可为核酸、蛋白质、低分子有机化合物中的任一种。作为该物质，可列举例如：直接作用于TGFβ的物质(例如，蛋白质、抗体、适体等)、抑制编码TGFβ的基因的表达的物质(例如，反义寡核苷酸、siRNA等)、抑制TGFβ受体与TGFβ的结合的物质、抑制由TGFp受体的信号转导而引起的生理活性的物质(例如，TGFβ受体的抑制剂、Smad的抑制剂等)。作为TGFβ信号转导途径抑制物质而为人所知的蛋白质，可列举Lefty等。
作为TGFβ信号转导途径抑制物质，可以使用本领域技术人员众所周知的化合物。具体而言，可列举SB431542(本说明书及附图中，有时简称为SB431)(4-[4-(3，4-亚甲二氧基苯基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺)，SB505124(2-[4-(1，3-苯并二氧杂环戊烯-5-基)-2-(1，1-二甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-6-甲基吡啶)，SB525334(6-[2-(1，1-二甲基乙基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-1H-咪唑-4-基]喹噁啉)，LY2157299(4-[5，6-二氢-2-(6-甲基-2-吡啶基)-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-3-基]-6-喹啉羧酰胺)，LY2109761(4-[5，6-二氢-2-(2-吡啶基)-4H-吡咯并[1，2-b]吡唑-3-基]-7-[2-(4-吗啉基)乙氧基]-喹啉)，GW788388(4-{4-[3-(吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]-吡啶-2-基}-N-(四氢-2H-吡喃-4-基)苯甲酰胺)，LY364947(4-[3-(2-吡啶基)-1H-吡唑-4-基]喹啉)，SD-208(2-(5-氯-2-氟苯基)蝶呤-4-基)吡啶-4-基胺)，EW-7197(N-(2-氟苯基)-5-(6-甲基-2-吡啶基)-4-[1，2，4]三唑[1，5-a]吡啶-6-基-1H-咪唑-2-甲胺)，A83-01(3-(6-甲基吡啶-2-基)-4-(4-喹啉基)-1-苯基硫代氨基甲酰基-1H-吡唑)，RepSox(2-[5-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基]-1，5-二氮耐)等Alk5/TGFβR1抑制剂，SIS3(1-(3，4-二氢-6，7-二甲氧基-2(1H)-异喹啉基)-3-(1-甲基-2-苯基-1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-3-基)-2-丙烯-1-酮)等SMAD3抑制剂。这些物质可以单独或组合使用。在此，SB431542为作为TGFβ受体(ALK5)及激活蛋白受体(ALK4/7)的抑制剂(即TGFβR抑制剂)而公知的化合物。SIS3为TGFβ信号转导途径抑制物质，其抑制处于TGFβ受体的控制下并作为细胞内信号转导因子的SMAD3的磷酸化。
本发明中使用的TGFβ信号转导途径抑制物质优选包含Alk5/TGFβR1抑制剂。Alk5/TGFβR1抑制剂优选为包含选自由SB431542，SB505124，SB525334，LY2157299，GW788388，LY364947，SD-208，EW-7197，A83-01，RepSox组成的组中的至少一种，进一步优选为包含SB431542或A83-01。
培养基中的TGFβ信号转导途径抑制物质的浓度在能实现上述效果的范围内可以适当设定。作为步骤(a)中的TGFβ转导途径抑制物质而使用SB431542的情况下，通常以约1nM～约100μM、优选为约10nM～100μM，更优选为约10nM～约50μM，进一步优选为约100nM～约50μM，特别优选为约1μM～约10μM的浓度使用。另外，在使用除了SB431542以外的TGFβ信号转导途径抑制物质的情况下，优选地以赋予与上述浓度的SB431542等同的TGFβ信号转导途径抑制活性的浓度使用。
步骤(a)及下述步骤(1)～(3)中的培养温度，CO2浓度等培养条件可以适当设定。例如，培养温度为约30℃至约40℃，优选约37℃。CO2浓度例如为约1％～约10％、优选为约5％。
<步骤(1)>
对将保持为未分化的多潜能干细胞、优选为步骤(a)中培养的多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，形成细胞聚集体的步骤(1)进行说明。
本发明中，为了与后文所述的第二Wnt信号转导途径抑制物质区别，将步骤(1)中添加的Wnt信号转导途径抑制物质也称为第一Wnt信号转导途径抑制物质。
Wnt信号转导途径是指以Wnt家族蛋白质为配体，主要以Frizzled作为受体的信号转导途径。作为该信号途径，除了由β连环蛋白转导的经典Wnt途径(Canonical Wntpathway)之外，还可列举非经典Wnt途径(Non-Canonical Wnt pathway)等。作为非经典Wnt途径，可列举：平面细胞极化(PCP)途径，Wnt/钙离子途径，Wnt-RAP1途径，Wnt-Ror2途径，Wnt-PKA途径，Wnt-GSK3MT途径，Wnt-aPKC途径，Wnt-RYK途径，Wnt-mTOR途径等。在非经典Wnt途径中，即使在除了Wnt以外的其它信号转导途径中也存在着被活化的共用的信号转导因子，但在本发明中将这些因子也作为Wnt信号转导途径的构成因子，将针对这些因子的抑制物质也包括在Wnt信号转导途径抑制物质中。
在本发明中，Wnt信号转导途径抑制物质没有限制，只要能抑制由Wnt家族蛋白质诱发的信号转导即可。抑制物质可以为核酸，蛋白质，低分子有机化合物中的任一种。作为该物质，可列举例如：抑制Wnt的加工和向胞外的分泌的物质，直接作用于Wnt的物质(例如：蛋白质，抗体，适体等)，抑制编码Wnt的基因的表达的物质(例如反义寡核苷酸，siRNA等)，抑制Wnt受体和Wnt的结合的物质，抑制经由Wnt受体的信号转导引起的生理活性的物质。
对于作为Wnt信号转导途径抑制物质为人所知的蛋白质，可列举属于分泌型卷曲相关蛋白(secreted Frizzled Related Protein，sFRP)类的蛋白质(sFRP1～5，Wnt抑制因子-1(WIF-1)，Cerberus)，属于Dickkopf(Dkk)类的蛋白质(Dkk1～4，Kremen)等。
作为Wnt信号转导途径抑制物质，可以使用本领域技术人员众所周知的化合物。作为Wnt信号转导途径抑制物质，可列举例如Porcupine(PORCN)抑制剂，Frizzled抑制剂，Dishevelled(Dvl)抑制剂，端锚聚合酶(TANK)抑制剂，酪蛋白激酶1抑制剂，连环蛋白反应性转录抑制剂，p300抑制剂，CREB结合蛋白(CBP)抑制剂，BCL-9抑制剂(Am J CancerRes.2015；5(8)：2344-2360)等。另外，作为非经典Wnt途径的抑制物质，可列举例如钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶II(CaMKII)抑制剂，(TGF-β-活化激酶1(TAK1)抑制剂，Nemo-样激酶(NLK)抑制剂，LIM激酶抑制剂，雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)抑制剂，c-Jun NH 2-末端激酶(JNK)抑制剂，蛋白激酶C(PKC)抑制剂，甲硫氨酸氨基肽酶2(MetAP2)抑制剂，钙调磷酸酶(Calcineurin)抑制剂，活化T细胞的核因子(nuclear factor of activated Tcells)(NFAT)抑制剂，ROCK抑制剂等。另外，虽然没有报告作用机制，作为Wnt信号转导途径抑制物质可列举KY02111(N-(6-氯-2-苯并噻唑基)-3，4-二甲氧基苯丙酰胺)，KY03-I(2-(4-(3，4-二甲氧基苯基)丁酰胺)-6-碘苯并噻唑)。这些物质可以单独或组合使用。
作为PORCN抑制剂，可列举例如IWP-2(N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[(3，4，6，7-四氢-4-氧-3-苯基噻吩并[3，2-d]嘧啶-2-基)硫基]-乙酰胺)，IWP-3(2-[[3-(4-氟苯基)-3，4，6，7-四氢-4-氧代噻吩并[3，2-d]嘧啶-2-基]硫基]-N-(6.甲基-2.苯并噻唑基)-乙酰胺)，IWP-4(N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[[3，4，6，7-四氢-3-(2-甲氧基苯基)-4-氧代噻吩并[3，2-d]嘧啶-2-基]硫基]-乙酰胺)，IWP-L6(N-(5-苯基-2-吡啶基)-2-[(3，4，6，7-四氢-4-氧-3-苯基噻吩并[3，2-d]嘧啶-2-基)硫基]-乙酰胺)，IWP-12(N-(6-甲基-2-苯并噻唑基)-2-[(3，4，6，7-四氢-3，6-二甲基-4-氧代噻吩并[3，2-d]嘧啶-2-基)硫基]乙酰胺)，LGK-974(2-(2’，3-二甲基-2，4’-联吡啶-5-基)-N-(5-(吡嗪-2-基)吡啶-2-基)乙酰胺)，Wnt-C59(2-[4-(2-甲基吡啶-4-基)苯基]-N-[4-(吡啶-3-基)苯基]乙酰胺)，ETC-159(1，2，3，6-四氢-1，3-二甲基-2，6-二氧代-N-(6-苯基-3-哒嗪基)-7H-嘌呤-7-乙酰胺)，GNF-6231(N-[5-(4-Acetyl-1-哌嗪基)-2-吡啶基]-2’-氟-3-甲基[2，4’-联吡啶]-5-乙酰胺)等。这些物质可以单独或组合使用。
本发明中使用的第一Wnt信号转导途径抑制物质优选为包含选自由PORCN抑制剂，KY02111及KY03-I组成的组中的至少一种，更优选包含PORCN抑制剂。第一Wnt信号转导途径抑制物质也优选包含具有对于Wnt的非经典Wnt途径的抑制活性的物质。本发明中使用的PORCN抑制剂优选包含选自由IWP-2，IWP-3，IWP-4，IWP-L6，IWP-12，LGK-974，Wnt-C59，ETC-159及GNF-6231组成的组中的至少一种，更优选包含IWP-2或Wnt-C59，进一步优选包含IWP-2。
培养基中的Wnt信号转导途径抑制物质的浓度在能实现上述效果的范围内可适宜设定。从包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备效率的观点出发，例如作为第一Wnt信号转导途径抑制物质使用作为PORCN抑制剂的一种的IWP-2时，其浓度通常为约10nM～约50μM、优选为约10nM～约30μM，进一步优选为约100nM～约10μM，最优选为约2μM。当使用为PORCN抑制剂的一种的Wnt-C59时，其浓度通常为约10nM～约30μM、优选为约20nM～约10μM，更优选为约500nM。使用KY02111时，其浓度通常为约10nM～约50μM、优选为10nM～约30μM，更优选为约100nM～约10μM，进一步优选为约5μM。
第一Wnt信号转导途径抑制物质的添加时期通常为步骤(1)的多潜能干细胞的悬浮培养开始起48小时以内、优选为24小时以内，更优选为12小时以内，进一步优选为与悬浮培养开始同时。
步骤(1)的培养基中优选还存在TGFβ信号转导途径抑制物质。
作为步骤(1)中使用的TGFβ信号转导途径抑制物质，可以使用与步骤(a)中例示的相同的那些。步骤(a)及步骤(1)的TGFβ信号转导途径抑制物质可以相同也可以不同、优选为相同。
培养基中的TGFβ信号转导途径抑制物质的浓度在能实现上述效果的范围内可以适当设定。在作为TGFβ转导途径抑制物质使用SB431542的情况下，通常以约1nM～约100μM、优选为约10nM～约100μM，更优选为约100nM～约50μM，进一步优选为约500nM～约10μM的浓度使用。另外，在使用除了SB431542以外的TGFβ信号转导途径抑制物质的情况下，优选地以赋予与上述浓度的SB431542等同的TGFβ信号转导途径抑制活性的浓度使用。
用于步骤(1)的培养基没有特别限制，只要是上文提及的定义部分记载的那些即可。步骤(1)中使用的培养基可以为血清培养基或无血清培养基。从避免化学上未确定的成分的混入的观点出发，在本发明中优选使用无血清培养基。为了避免复杂的制备，例如优选使用：适量添加了市售的KSR等血清代替物的无血清培养基(例如：在IMDM和F-12的1∶1的混合液中添加了5％KSR，450μM 1-一硫代甘油及1x化学成分确定的脂质浓缩物的培养基，或在GMEM中添加了5％～20％KSR，NEAA，丙酮酸，2-巯基乙醇的培养基)。关于向无血清培养基中的KSR的添加量，例如在人ES细胞的情况下，通常为约1％～约30％、优选为约2％～约20％。
在步骤(1)的开始时，优选多潜能干细胞分散为单一细胞。因此，优选在步骤(1)开始前进行将步骤(a)中得到的多潜能干细胞分散成单一细胞的操作(也称为步骤(b))。作为“分散成单一细胞”可列举例如全细胞的7成以上为单一细胞，存在3成以下的2～50个细胞的团块的状态。作为分散成单一细胞的细胞，优选可列举8成以上为单一细胞，存在2成以下的2～50个细胞的团块的状态。分散成单一细胞的细胞可列举细胞之间的黏着(例如面黏着)几乎消失的状态。在一些实施方式中，分散成单一细胞的细胞可列举细胞-细胞间连接(例如粘附连接)几乎消失的状态。
步骤(a)中得到的多潜能干细胞的分散操作可包括上文所述的机械分散处理，细胞分散液处理，添加细胞保护剂的处理。这些处理可以联合进行。优选地，可在添加细胞保护剂的处理的同时进行细胞分散液处理，然后进行机械分散处理。
作为用于添加细胞保护剂的处理的细胞保护剂，可列举：FGF信号转导途径作用物质，肝素，ROCK抑制物质，肌球蛋白抑制物质，血清，或血清代替物。关于优选的细胞保护剂，可列举ROCK抑制物质。为了抑制由分散诱导的多潜能干细胞(特别是人的多潜能干细胞)细胞死亡，也可以从步骤(1)的培养开始时添加ROCK抑制物质。作为ROCK抑制物质，可列举Y-27632((R)-(+)-反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环已烷羧酰胺，二盐酸盐)，法舒地尔(HA1077)(1-(5-异喹啉基磺酰基)高哌嗪，盐酸盐)，H-1152(5-[[(2S)-六氢-2-甲基-1H-1，4-二氮杂
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-1-基]磺酰基]-4-甲基-异喹啉，二盐酸盐)，HA-1100(羟基法舒地尔)([1-(1-羟基-5-异喹啉磺酰基)高哌嗪，盐酸盐)等。作为细胞保护材料，也可以使用制备好的细胞保护剂。作为制备好的细胞保护剂，可列举例如：RevitaCell补充剂(Thermo FisherScientific公司制)，CloneR(Stemcell Technologies公司制)。这些物质可以单独或组合使用。
关于用于细胞分散处理的细胞分散液，可列举包含胰蛋白酶、胶原蛋白酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、链霉蛋白酶、DNA酶及木瓜蛋白酶等酶及乙二胺四乙酸等螯合剂中的至少一种的溶液。也可以使用市售的细胞分散液，例如TripLE Select(Thermo FisherScientific公司制)、TripLE Express(Thermo Fisher Scientific公司制)，Accumax(Innovative Cell Technologies公司制)。
作为机械分散处理的方法，可列举吹打处理或利用刮刀的刮片操作。将经分散的细胞悬浮在上述培养基中。
然后，将经分散的多潜能干细胞的混悬液接种在上文提及的培养容器中，将经分散的多潜能干细胞在相对于培养容器为非黏着性的条件下培养，由此使多个细胞凝聚而形成聚集体。
此时，可以通过将经分散的多潜能干细胞接种在诸如10cm平皿的比较大的培养容器中，从而在1个培养器中同时形成多个细胞的聚集体，但从每个聚集体的大小不易产生偏差的观点出发，优选在例如非细胞黏着性的96孔微量滴定板的这样的多孔板(U底，V底)的各孔中接种一定数量经分散的多潜能干细胞。通过将其静置培养时，细胞快速聚集，从而在各孔中形成1个细胞聚集体。作为多孔板，可列举例如PrimeSurface 96V底板(MS-9096V，住友Bakelite股份有限公司制)。为了更快速地形成细胞聚集体，可以进行离心操作。通过从多个孔回收在各孔中形成的聚集体，可以得到均一的聚集体的群体。
作为培养容器，也优选使用能够以在各孔内已置入了细胞聚集体或细胞团块的状态将板全体的培养基一次性交换的三维细胞培养容器。作为这样的三维细胞培养容器，可列举例如PrimeSurface 96有缝孔板(住友Bakelite股份有限公司制)等。该板中在96孔的各自上部设置有培养基能够出入的细开口部(缝)。由于缝被设定为细胞聚集体或细胞团块难以通过的宽度，因此，可以在防止细胞聚集体或细胞团块之间粘连，并将板全体的培养基一次性交换，可以提高操作的效率性及细胞团块的品质。
步骤(1)中的多潜能干细胞的浓度可以适当设定使得更均一，有效地形成细胞的聚集体。例如，当使用96孔微孔板悬浮培养人多潜能干细胞(例如，由步骤(a)得到的人iPS细胞)时，将配置使得每孔通常约1×103～约1×105细胞、优选为约3×103～约5×104细胞，更优选为约4×103～约2×104细胞优选为约4×103～约1.6×104细胞，特别优选为约8×103～约1.2×104细胞的液体添加于各孔中，将板静置而形成聚集体。细胞数可以通过用血细胞计数器计数而求出。
在步骤(1)中，当进行培养基更换操作时，可列举例如：不丢弃原有培养基且加入新培养基的操作(添加培养基操作)，弃掉半量左右(原有培养基的体积量的30～90％左右，例如40～60％左右)的原有培养基且加入半量左右(原有培养基的体积量的30～90％，例如40～60％左右)的新培养基的操作(半量培养基更换操作)，弃掉全量左右(原有培养基的体积量的90％以上)的原有培养基并加入全量左右(原有培养基的体积量的90％以上)的新培养基的操作(全量培养基更换操作)。
当在特定时间点添加特定成分时，可以进行例如在计算终浓度的基础上，丢弃半量左右的原有培养基并加入半量左右的含有比最终浓度还高的特定的成分的新培养基的操作(半量培养基更换操作)。
当通过在特定时间点稀释而降低原有培养基中包含的成分的浓度时，例如，可以每天多次进行培养基更换操作，优选在1小时内进行多次(例如，2-3次)。此外，当通过在特定时间点进行稀释而降低原有培养基中包含的成分的浓度时，可以将细胞或聚集体转移到其他的培养容器中。
培养基更换操作中使用的工具没有特别限制，可列举例如移液管、微量移液管(PIPETMAN)(注册商标)、多通道微量移液管(MULTICHANNELPIPETMAN)、连续的分配器等。例如，使用96孔板作为培养容器的情况下，可以使用多通道微量移液管。
用于形成聚集体所必需的悬浮培养的时间能够根据使用的多能性干细胞而适当确定，但为了形成均一聚集体，优选为尽可能短的时间。从经分散的细胞到形成细胞聚集体的步骤可分为：细胞发生聚集的步骤；及聚集的细胞形成细胞聚集体的步骤。对从接种经分散的细胞的时刻(即悬浮培养开始时)到细胞发生聚集而言，例如：在为人多潜能干细胞(例如，人iPS细胞)的情况下，优选为约24小时以内，更优选为约12小时以内形成聚集的细胞。在从接种经分散的细胞的时刻(即悬浮培养开始时)到形成细胞聚集体的步骤中，例如：在为人多潜能干细胞(例如，iPS细胞)的情况下，优选在约72小时以内，更优选为约48小时以内形成聚集体。所述到形成凝集体的时间可通过调整进行细胞凝集的器具、离心条件等而适宜调节。
对细胞聚集体的形成而言，可以基于聚集体的尺寸及细胞数目，宏观形态，采用组织染色分析的微观形态及其均一性、分化及未分化标记的表达及其均一性、分化标记的表达控制及其同步性、聚集体间的分化效率的再现性等而判断。
也可以在细胞聚集体形成后直接继续进行聚集体的培养。步骤(1)中的悬浮培养的时间通常为约8小时-6天，优选约12小时-48小时。
从促进细胞团块内部的神经系统细胞或组织的生存及增殖的观点出发，也可以将步骤(1)～(3)中任一项以上的步骤在Wnt信号转导途径作用物质的存在下进行。如上所述，作为Wnt信号转导途径可列举：经典Wnt途径(Canonical Wnt pathway)，非经典Wnt途径(Non-Canonical Wnt pathway)等。作为非经典Wnt途径，可列举：平面细胞极化(PCP)途径，Wnt/钙离子途径，Wnt-RAP1途径，Wnt-Ror2途径，Wnt-PKA途径，Wnt-GSK3MT途径，Wnt-aPKC途径，Wnt-RYK途径，Wnt-mTOR途径等。
Wnt信号转导途径作用物质没有限制，只要能活化由Wnt家族、蛋白质诱发的信号转导即可。可以为核酸，蛋白质，低分子有机化合物中的任一种。作为所述物质，可列举例如：促进Wnt的自分泌的物质，使Wnt稳定而抑制分解的物质，Wnt的重组蛋白质，与Wnt的部分序列肽及其派生物、衍生物，Wnt受体作用而使其活化的物质，使Wnt的细胞内信号转导机制活化的物质，使Wnt的细胞内信号转导因子及其变体(β连环蛋白S33Y等)，使Wnt响应序列下游的基因表达活化的物质等。作为Wnt信号转导途径作用物质而为人所知的蛋白质，可列举Wnt，R-Spondin等。
作为Wnt信号转导途径作用物质，可以使用本领域技术人员众所周知的化合物。作为具有作为Wnt信号转导途径作用物质的活性的化合物，可列举例如：氯化锂，AMBMP盐酸盐，SGC AAK1 1，Foxy 5，CHIR99021，CHIR98014，TWS119，SB216763，SB415286，BIO，AZD2858，AZD1080，AR-A014418，TDZD-8，LY2090314，IM-12，靛玉红，Bikinin，A 1070722，3F8，肯帕罗酮，10Z-Hymenialdisine，靛玉红-3’-肟，NSC 693868，TC-G 24，TCS 2002，TCS21311，CP21R7，BML-284，SKL2001，WAY 262611，IIIC3a，香草酸甲酯，IQ-1及这些化合物的衍生物等。
虽然在步骤(1)中添加第一Wnt信号转导途径抑制物质，但可以通过将作用点不同的Wnt信号转导途径作用物质和Wnt信号转导途径抑制物质组合使用，由此仅活化或抑制上述复数的Wnt信号转导途径中的特定途径。Wnt信号转导途径作用物质优选为作用在通过步骤(1)添加的第一Wnt信号转导途径抑制物质的下游的因子的物质。添加的Wnt信号转导途径作用物质也优选为使经典Wnt途径(Canonical Wnt pathway)活化的物质，进一步优选为通过细胞内的Wnt信号转导因子的β连环蛋白的分解的抑制，稳定作用而使Wnt信号转导途径活化的物质。作为具有β连环蛋白的分解的抑制，稳定作用的物质，可列举例如GSK3抑制剂及BML-284，SKL2001等。添加的Wnt信号转导途径作用物质也优选为促进、活化β连环蛋白反应性转录(β-catenin responsive transcription：CRT)的物质。
作为GSK3抑制剂，可列举CHIR99021，CHIR98014，TWS119，SB216763，SB415286，BIO，AZD2858，AZD1080，AR-A014418，TDZD-8，LY2090314，IM-12，靛玉红，Bikinin，A1070722，3F8，Kenpaullone，10Z-Hymenialdisine，靛玉红-3’-肟，NSC 693868，TC-G 24，TCS 2002，TCS 21311，CP21R7及这些化合物的衍生物。
作为优选的Wnt信号转导途径作用物质与第一Wnt信号转导途径抑制物质的组合，可列举GSK3抑制剂和PORCN抑制剂。在组合使用GSK3抑制剂和PORCN抑制剂的情况下，经典Wnt途径被活化，非经典Wnt途径被抑制。在组合使用GSK3抑制剂和PORCN抑制剂的情况下，，GSK3抑制剂优选包含选自由CHIR99021，CHIR98014，SB216763，SB415286，BIO组成的组中的至少一种，进一步优选包含CHIR99021。在组合使用GSK3抑制剂和PORCN抑制剂的情况下，PORCN抑制剂优选包含选自由IWP-2，IWP-3，IWP-4，IWP-L6，IWP-12，LGK-974，ETC-159，GNF-6231，Wnt-C59组成的组中的至少一种，进一步优选包含IWP-2。另外，可以组合使用GSK3抑制剂和KY02111及其衍生物等。对于GSK3抑制剂，作为作用机制不同的具有β连环蛋白的分解的抑制，稳定作用的物质，可列举例如：BML-284，SKL2001，这些化合物及其衍生物也可以与PORCN抑制剂，KY02111及其衍生物等组合使用。
培养基中的Wnt信号转导途径作用物质的浓度在能实现上述效果的范围内可以适当设定。从促进细胞团块内部的神经系统细胞或组织的生存及增殖的观点出发，在作为Wnt信号转导途径作用物质使用CHIR99021的情况下，通常以约10pM～约10mM、优选为约100pM～约1mM，更优选为约1nM～约100μM，进一步优选为约10nM～约30μM，最优选为约100nM～约3μM的浓度使用。另外，在使用除了CHIR99021以外的Wnt信号转导途径作用物质的情况下，优选地以赋予与上述浓度的CHIR99021等同的Wnt信号转导途径增强活性的浓度使用。
<步骤(2)>
对将步骤(1)中得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养的步骤(2)进行说明。
BMP信号转导途径作用物质是指能够增强由BMP(骨形成蛋白质)介导的信号转导途径的物质。作为BMP信号转导途径作用物质，可列举例如：BMP2，BMP4或者BMP7等BMP蛋白质，GDF7等GDF蛋白质，抗BMP受体抗体，或，BMP部分肽等。这些物质可以单独或组合使用。从生物学活性的观点而言，作为BMP信号转导途径作用物质的定义，可列举例如对于小鼠前体软骨细胞株ATDC5，源自小鼠颅顶的细胞株MC3T3-E1，源自小鼠横纹肌的细胞株C2C12等细胞分化诱导为成骨细胞样细胞的能力，及诱导碱性磷酸酶产生的能力的物质。作为具有上述活性的物质，可列举例如BMP-2，BMP-4，BMP-5，BMP-6，BMP-7，BMP-9，BMP-10，BMP-13/GDF-6，BMP-14/GDF-5，GDF-7等。
BMP2蛋白质及BMP4蛋白质可获自例如R&D Systems，BMP7蛋白质可获自例如Biolegend公司，GDF7蛋白质可获自例如富士胶片和光纯药股份有限公司公司。BMP信号转导途径作用物质优选为包含选自由BMP2，BMP4，BMP7，BMP13及GDF7组成的组中的至少1个蛋白质，更优选包含BMP4。
培养基中的BMP信号转导途径作用物质的浓度在能实现上述效果的范围内可以适当设定。从包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备效率的观点出发，在作为BMP信号转导途径作用物质使用BMP4的情况下通常以约1pM～约100nM、优选为约10pM～约50nM，更优选为约25pM～约25nM，进一步优选为约25pM～约5nM，特别优选为约100pM～约5nM，最优选为约500pM～约2nM的浓度使用。另外，在使用除了BMP4以外的BMP信号转导途径作用物质的情况下，优选地以赋予与上述浓度的BMP4等同的BMP信号转导途径增强活性的浓度使用。本领域技术人员在作为BMP信号转导途径作用物质使用例如市售的重组BMP蛋白质等时，可以通过将产品所附文件中记载的活性，例如相对于小鼠前体软骨细胞株ATDC5的诱导产生碱性磷酸酶的能力的ED50等值与上述BMP4的浓度和活性相比，从而容易地确定添加的BMP信号转导途径作用物质浓度。
步骤(2)中使用的培养基没有特别限定，只要包含BMP信号转导途径作用物质即可。步骤(2)中使用的培养基可以为血清培养基或无血清培养基。从避免化学上未确定的成分的混入的观点出发，优选使用无血清培养基。为了避免复杂的制备，例如优选使用：适量添加了市售的KSR等血清代替物的无血清培养基(例如：在IMDM和F-12的1∶1的混合液中添加了5％KSR，450μM 1-一硫代甘油及1x化学成分确定的脂质浓缩物的培养基，或在GMEM中添加了5％～20％KSR，NEAA，丙酮酸，2-巯基乙醇的培养基)。关于向无血清培养基中的KSR的添加量，例如在人ES细胞的情况下，通常以约1％～约30％、优选为约2％～约20％。
包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备效率的观点出发，步骤(2)的开始时期为从步骤(1)中悬浮培养开始优选为0.5小时以后6天以内，更优选为0.5小时以后72小时以内，进一步优选为24小时以后60小时以内。
从包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备效率的观点出发，步骤(2)的开始时期为在步骤(1)中形成有聚集体的表层中，优选有1成以上且10成以下，更优选为3成以上且10成以下，进一步优选为5成以上且10成以下的细胞互相形成了紧密连接的时期。
对于步骤(2)中在BMP信号转导途径作用物质的存在下的培养开始而言，可以使用进行了步骤(1)的培养容器进行上述培养基交换操作(例如培养基添加操作，半量培养基交换操作，总量培养基交换操作等)，也可以将细胞聚集体移至另外的培养容器。
步骤(2)中的利用包含BMP信号转导途径作用物质的培养基的悬浮培养的时期可适当设定。步骤(2)中的悬浮培养的时间通常为8小时～6天左右、优选为10小时～96小时左右，更优选为12小时～72小时左右，进一步优选为14小时～48小时左右，最优选为16小时～36小时左右。
在步骤(2)中，也优选接着添加在步骤(a)或步骤(1)中使用的添加物，例如Shh信号转导途径作用物质，第一Wnt信号转导途径抑制物质，Wnt信号转导途径作用物质，TGFβ信号转导途径抑制物质等。步骤(2)中添加的Shh信号转导途径作用物质，第一Wnt信号转导途径抑制物质，Wnt信号转导途径作用物质或TGFβ信号转导途径抑制物质可以与其以前的步骤中使用的物质相同，也可以不同、优选为相同。添加物的浓度及种类可以适宜调整。这些物质的添加时期可以与步骤(2)的开始同时，也可以不同。
<步骤(3)>
对包含将步骤(2)中得到的细胞聚集体进行悬浮培养的步骤，得到包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的步骤(3)进行说明。步骤(3)中，包含选自由在FGF信号转导途径作用物质的存在下培养的步骤(3a)，在BMP信号转导途径抑制物质的存在下培养的步骤(3b)及在FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质的存在下培养的步骤(3c)组成的组中的至少1个步骤。
<步骤(3a)>
对将步骤(2)中得到的细胞聚集体在FGF信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养的步骤(3a)进行说明。步骤(3a)为根据外在原因在不存在BMP信号转导途径抑制物质的条件下进行。进一步根据外在原因在BMP信号转导途径抑制物质的存在下进行时，作为步骤(3c)在后叙述。这里，“根据外在原因”是指因为人为添加而引起。
对FGF信号转导途径作用物质没有特别限定，只要为能增强由FGF(成纤维细胞生长因子)介导的信号转导途径的物质即可。作为FGF信号转导途径作用物质，可列举例如：FGF1，FGF2(也称为bFGF)，FGF8等FGF蛋白质，抗FGF受体抗体，FGF部分肽等。这些物质可以单独或组合使用。
FGF2蛋白质及FGF8蛋白质可以从例如富士胶片、和光纯药股份有限公司获得。FGF信号转导途径作用物质优选包含选自由FGF2及FGF8，以及它们的变体组成的组中的至少一种，更优选包含FGF2，进一步优选包含重组人FGF2。
培养基中的FGF信号转导途径作用物质的浓度在能实现上述效果的范围内可以适当设定。从促进神经组织部的上皮结构形成，向基板的分化及细胞的生存和增殖的观点出发，在作为FGF信号转导途径作用物质使用FGF2的情况下，通常以约1pg/ml～约100μg/ml、优选为约10pg/ml～约50μg/ml，更优选为约100pg/ml～约10μg/ml，进一步优选为约500pg/ml～约1μg/ml，最优选为约1ng/ml～约200ng/ml的浓度使用。另外，在使用除了FGF2以外的FGF信号转导途径作用物质的情况下，优选地以赋予与上述浓度的FGF2等同的FGF信号转导途径增强活性的浓度使用。
出于维持培养基中的FGF蛋白质的活性的目的，也优选在包含FGF蛋白质的培养基中添加肝素，硫酸乙酰肝素。对肝素而言，以钠盐形式可从例如富士胶片和光纯药股份有限公司获得。培养基中的肝素或硫酸乙酰肝素的浓度在能实现上述效果的范围内可以适当设定。培养基中的肝素钠的浓度通常为约1ng/ml～约100mg/ml、优选为约10ng/ml～约50mg/ml，更优选为约100ng/ml～约10mg/ml，进一步优选为约500ng/ml～约1mg/ml，最优选为约1μg/ml～约200μg/ml。在使用硫酸乙酰肝素的情况下，优选为具有与上述浓度的肝素等同的FGF蛋白质保护的活性的浓度。出于在37℃等细胞培养环境中维持FGF蛋白质的活性的目的，也优选使用例如在美国专利US8772460B2号中记载的热稳定FGF2等FGF的变体、生物分解性聚合物上结合了FGF2的StemBeads FGF2等FGF2缓释珠。热稳定(Thermostable)FGF2可从例如HumanZyme公司获得。StemBeads FGF2可从例如StemCulture公司获得。
<步骤(3b)>
对将步骤(2)中得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养的步骤(3b)进行说明。步骤(3b)为根据外在原因在不存在FGF信号转导途径作用物质的条件下进行。进一步根据外在原因在FGF信号转导途径作用物质的存在下进行时，作为步骤(3c)在后叙述。
BMP信号转导途径抑制物质只要能够抑制由BMP家族蛋白质诱发的信号传导，则没有限制。可以为核酸，蛋白质，低分子有机化合物中的任一种。作为该物质，可列举例如：抑制BMP的加工和向胞外的分泌的物质，直接作用于BMP的物质(例如：蛋白质抗体，适体等)，抑制编码BMP的基因的表达的物质(例如反义寡核苷酸，siRNA等)，抑制BMP受体和BMP的结合的物质，抑制经由BMP受体的信号转导引起的生理活性的物质。在BMP受体中存在I型BMP受体和II型BMP受体，作为I型BMP受体已知有BMPR1A，BMPR1B，ACVR，作为II型BMP受体已知有TGF-beta R-II，ActR-II，ActR-IIB，BMPR2，MISR-II。
作为BMP信号转导途径抑制物质为人所知的蛋白质，可列举例如：头蛋白(Noggin)，脊索发生素(Chordin)，卵泡抑制蛋白(Follistatin)，Gremlin，抑制素(Inhibin)，扭曲原肠胚形成(Twisted Gastrulation)，Coco，属于DAN家族的分泌蛋白质等。从在上述步骤(2)中培养液中添加BMP信号转导途径作用物质，由此更有效地抑制以后的BMP信号转导途径的观点出发，关于步骤(3b)中的BMP信号转导途径抑制物质，优选包含在抑制细胞外的BMP的分泌的下游的信号转导途径的物质，例如抑制BMP受体与BMP的结合的物质，利用BMP受体而抑制由信号转导引起的生理活性的物质等，更优选包含I型BMP受体的抑制剂。
作为BMP信号转导途径抑制物质，也可以使用本领域技术人员众所周知的化合物。作为BMP信号转导途径抑制物质，可列举例如：K02288(3-[(6-氨基-5-(3，4，5-三甲氧基苯基)-3-吡啶基]苯酚，3-[6-氨基-5-(3，4，5-三甲氧基苯基)-3-吡啶基]-苯酚)，Dorsomorphin(6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)吡唑并[1，5-a]嘧啶)，LDN-193189(4-[6-[4-(1-哌嗪基)苯基]吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基]喹啉二盐酸盐)，LDN-212854(5-[6-[4-(1-哌嗪基)苯基]吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基]喹啉)，LDN-214117(1-(4-(6-甲基-5-(3，4，5-三甲氧基苯基)吡啶-3-基)苯基)哌嗪)，ML347(5-[6-(4-甲氧苯基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基]喹啉))，DMH1(4-(6-(4-异丙氧基苯基)吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基)喹啉)，DMH2(4-[6-[4-[2-(4-吗啉基)乙氧基]苯基]吡唑并[1，5-a]嘧啶-3-基]-喹啉)等。这些物质可以单独或组合使用。
本发明中使用的BMP信号转导途径抑制物质优选为I型BMP受体抑制剂，更优选包含选自由K02288，Dorsomorphin，LDN-193189，LDN-212854，LDN-214117，ML347，DMH1及DMH2组成的组中的至少一种，进一步优选包含K02288。
培养基中的BMP信号转导途径抑制物质的浓度在能实现上述效果的范围内可以适当设定。从嗅上皮样组织的形成效率的观点出发，在作为步骤(3b)中的BMP转导途径抑制物质使用K02288的情况下，通常以约1nM～约100μM、优选为约10nM～约50μM，更优选为约100nM～约50μM，进一步优选为约500nM～约25μM的浓度使用。在作为BMP转导途径抑制物质使用LDN-193189的情况下，通常以约1nM～约100μM、优选为约10nM～约10μM，更优选为约25nM～约1μM，进一步优选为约100nM～约500nM的浓度使用。在作为BMP转导途径抑制物质使用LDN-212854的情况下，通常以约1nM～约100μM、优选为约10nM～约10μM，更优选为约25nM～约5μM，进一步优选为约250nM～约3μM的浓度使用。在作为BMP转导途径抑制物质使用ML-347的情况下，通常以约1nM～约100μM、优选为约10nM～约50μM，更优选为约100nM～约50μM，进一步优选为约1μM～约25μM的浓度使用。在作为BMP转导途径抑制物质使用DMH2的情况下，通常以约1nM～约100μM、优选为约10nM～约10μM，更优选为约25nM～约5μM，进一步优选为约250nM～约3μM的浓度使用。另外，在使用除了K02288以外的BMP信号转导途径抑制物质的情况下，优选地以赋予与上述浓度的K02288等同的BMP信号转导途径抑制活性的浓度使用。
<步骤(3c)>
对将步骤(2)中得到的细胞聚集体在FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质的存在下进行悬浮培养的步骤(3c)进行说明。
步骤(3c)中使用FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质的种类，浓度等可以在与步骤(3a)或步骤(3b)相同的条件下进行，也可以在不同条件下实施。步骤(3c)中，在作为FGF信号转导途径作用物质使用FGF2的情况下，通常以约1pg/ml～约100μg/ml、优选为约10pg/ml～约50μg/ml，更优选为约100pg/ml～约10μg/ml，进一步优选为约500pg/ml～约1μg/ml，最优选为约1ng/ml～约200ng/ml的浓度使用。步骤(3c)中，在作为BMP转导途径抑制物质使用K02288的情况下，通常以约1nM～约100μM、优选为约10nM～约50μM，更优选为约50nM～约50μM，进一步优选为约100nM～约25μM的浓度使用。
步骤(3c)可以在步骤(3a)或步骤(3b)后进行，也可以仅进行步骤(3c)。在不期望在细胞团块中形成视网膜组织时，优选从开始就进行步骤(3c)。在期望在细胞团块中形成视网膜组织时，优选首先进行步骤(3a)，之后进行步骤(3c)。在进行步骤(3a)后进行步骤(3c)时，步骤(3a)的培养时期通常为培养1天～40天，优选为2天～30天，更优选为3天～25天，进一步优选为6天～25天。此时使用的FGF信号转导途径作用物质的种类，浓度等可以为与仅进行步骤(3a)时相同的条件，也可以为不同条件。
当期望在细胞团块中形成视网膜组织，在进行步骤(3a)后进行步骤(3c)时，优选步骤(3a)的培养时期为实施到在细胞团块中形成视网膜组织。为了调查在在细胞团块中是否有视网膜组织形成，能够通过利用显微镜等观察细胞团块内部是否形成上皮样的组织，或制备细胞团块的切片，通过针对Rx，Chx10，N-钙黏着蛋白等视网膜组织中表达的标记的荧光免疫染色等办法进行。
从嗅上皮样组织的形成效率的观点出发，步骤(3a)，步骤(3b)或步骤(3c)的开始时期为步骤(2)的BMP信号转导途径作用物质的添加起优选0.5小时以后96小时以内，更优选为12小时以后72小时以内，进一步优选为12小时以后48小时以内。
从嗅上皮样组织的形成效率的观点出发，步骤(3a)，步骤(3b)或步骤(3c)的开始时期优选为在步骤(2)的BMP信号转导途径作用物质的添加后，且在细胞团块的表面形成有非神经上皮组织前开始。为了调查在细胞团块的表面是否形成有非神经上皮组织，能够通过利用显微镜等观察在细胞团块表面是否形成有上皮样的组织，或制备细胞团块的切片，通过针对细胞角蛋白，E-钙黏着蛋白，EpCAM等非神经上皮组织中表达的标记的荧光免疫染色等办法进行。
对步骤(3a)，步骤(3b)或步骤(3c)的培养开始而言，可以使用进行了步骤(2)的培养容器进行上述培养基交换操作(例如培养基添加操作，半量培养基交换操作，总量培养基交换操作等，也可以将细胞聚集体移至另外的培养容器。
步骤(3a)，步骤(3b)或步骤(3c)的悬浮培养的时期能够适当设定。在步骤(3a)，步骤(3b)或步骤(3c)中悬浮培养的时间通常为8小时～200天左右、优选为10小时～180天左右，更优选为12小时～150天左右，进一步优选为14小时～120天左右，最优选为20小时～100天左右。当在步骤(3b)或步骤(3c)后实施下述步骤(3d)的情况下，在步骤(3b)或步骤(3c)中悬浮培养的时间通常为8小时～12天左右、优选为10小时～6天左右。
<步骤(3d)>
步骤(3)可以在步骤(3b)或步骤(3c)后，还包含在不存在BMP信号转导途径抑制物质的条件下进行悬浮培养的步骤(3d)。即，对将在步骤(3b)或步骤(3c)中得到的细胞聚集体在不存在BMP信号转导途径抑制物质的条件下进行悬浮培养，得到细胞团块的步骤(3d)进行说明。也可以将步骤(3b)或步骤(3c)中得到的细胞团块，进一步在不存在BMP信号转导途径抑制物质的条件下进行悬浮培养。
为了在步骤(3d)中在不存在BMP信号转导途径抑制物质的条件下进行悬浮培养，需要将在步骤(3b)或步骤(3c)中添加的BMP信号转导途径抑制物质从培养环境中除去。作为为此而进行的操作，可列举例如半量培养基交换操作，总量培养基交换操作。上述培养基交换操作也可以1天进行多次、优选为1小时以内多次(例如2～3次)。进行多次培养基交换操作时的最后一次，除了进行步骤(3d)以后的培养的培养基以外，从降低细胞团块的制备所用费用的观点出发，可以使用例如生理盐水，不包含KSR及生长因子等添加物的培养基等。
另外，作为用于在不存在BMP信号转导途径抑制物质的条件下进行悬浮培养而另外的操作，可列举将细胞聚集体回收到另外的灭菌完毕的容器(15ml管，悬浮培养用培养皿等)中，用培养基或生理盐水等洗涤后，移到不存在BMP信号转导途径抑制物质的条件下的培养环境的操作(细胞聚集体的转移设备操作)。此时的转移设备之后的培养中使用的培养容器可以与到步骤(3b)或步骤(3c)中使用的那些相同(96孔板等)，也可以为其他容器(悬浮培养用平皿等)。
当实施步骤(3d)中的不存在BMP信号转导途径抑制物质的条件下的悬浮培养时，从避免培养基交换操作或细胞团块的转移设备操作的复杂的观点出发，也优选使用能够以细胞聚集体或细胞团块已置入各孔内的状态，直接将板全部的培养基一次性更换的三维细胞培养容器。
步骤(3d)中，通过将在步骤(3b)或步骤(3c)中得到的细胞聚集体在不存在BMP信号转导途径抑制物质的条件下进行悬浮培养，由此可以得到不易产生细胞死亡，更促进细胞的增殖，嗅上皮样组织的形成效率及神经组织部的上皮结构形成效率提高的细胞团块。
在步骤(3d)中，优选存在FGF信号转导途径作用物质。步骤(3d)中添加的FGF信号转导途径作用物质可以和步骤(3a)或(3c)中使用的物质相同，也可以不同，优选为相同。FGF信号转导途径作用物质的浓度及种类可以适宜调整。
从促进神经组织的上皮结构形成及增殖的观点出发，步骤(3d)的开始时期为步骤(3b)或(3c)的BMP信号转导途径抑制物质的添加后优选0.5小时以后60天以内，更优选为0.5小时以后30天以内，进一步优选为12小时以后96小时以内。
步骤(3d)中不存在BMP信号转导途径抑制物质的条件下的悬浮培养的时期能够适当设定。步骤(3d)中的悬浮培养的时间通常为8小时～200天左右、优选为10小时～180天左右，更优选为12小时～150天左右，进一步优选为14小时～120天左右，最优选为20天～100天左右。
步骤(3)中使用的培养基没有特别限定，可以为血清培养基或无血清培养基。从避免化学上未确定的成分的混入的观点出发，优选使用无血清培养基。为了避免复杂的制备，优选使用例如适量添加了市售的KSR等血清代替物的无血清培养基。关于向无血清培养基中的KSR的添加量，例如在人ES细胞的情况下，通常以约1％～约30％、优选为约2％～约20％。作为步骤(3)中使用的培养基，可列举例如在IMDM和F-12的1∶1的混合液中添加5％KSR，450μM 1-一硫代甘油及1x化学成分确定的脂质浓缩物的培养基，或在GMEM中添加了5％～20％KSR，NEAA，丙酮酸，2-巯基乙醇的培养基，在Neurobasal中添加了B27补充剂的培养基，在DMEM/F-12中添加了N2补充剂的培养基，StemPro NSC SFM无血清人神经干细胞培养培养基(Thermo Fisher Scientific公司制)等制备好的神经细胞培养用的培养基。
步骤(3)中，也优选继续添加步骤(a)，步骤(1)及步骤(2)的任一个步骤中细胞团块的制备中使用的添加物，例如Shh信号转导途径作用物质，第一Wnt信号转导途径抑制物质，Wnt信号转导途径作用物质，TGFβ信号转导途径抑制物质等。步骤(3)中添加的Shh信号转导途径作用物质，第一Wnt信号转导途径抑制物质，Wnt信号转导途径作用物质及TGFβ信号转导途径抑制物质可以分别与步骤(a)，步骤(1)及步骤(2)中的任一个步骤中使用的物质相同，也可以不同，优选为相同。添加物的浓度及种类可以适宜调整。步骤(3)中使用的添加物中更优选包含第一Wnt信号转导途径抑制物质，进一步优选包含第一Wnt信号转导途径抑制物质，Wnt信号转导途径作用物质及TGFβ信号转导途径抑制物质。
从促进神经组织部的上皮结构形成以及细胞的生存及增殖的观点出发，也优选步骤(3)在EGF信号转导途径作用物质的存在下进行。EGF信号转导途径作用物质是指能够增强由上皮生长因子(EGF)介导的信号转导的物质。作为EGF信号转导途径作用物质，可列举例如EGF，TGF-α，AR(双调蛋白(amphiregulin))，EPG，HB-EGF(肝素结合EGF样生长因子)，BTC(乙胞素(Betacellulin))，EPR(外调蛋白(epiregulin))等EGFR配体蛋白质，NRG(神经调节蛋白(neuregulin))1～4的ErbB3/4(上皮生长因子受体，HRE)配体蛋白质，阿普洛尔(alprenolo1)，卡维地洛(carvedilo1)等低分子化合物等。这些物质可以单独或组合使用。EGF蛋白质能够从例如Thermo Fisher Scientific公司及PrimeGene公司获取。HB-EGF蛋白质能够从例如R&D Systems公司获取。EGF信号转导途径作用物质优选包含EGF。
培养基中的Wnt信号转导途径作用物质的浓度在能实现上述效果的范围内可以适当设定。作为EGF信号转导途径作用物质使用EGF的情况下，通常以约1pg/ml～约100μg/ml、优选为约10pg/ml～约50μg/ml，更优选为约100pg/ml～约10μg/ml，进一步优选为约500pg/ml～约1μg/ml，最优选为约1ng/ml～约200ng/ml的浓度使用。另外，在使用除了EGF以外的EGF信号转导途径作用物质的情况下，优选地以赋予与上述浓度的EGF同等的EGF信号转导途径促进活性的浓度使用。
上述物质在步骤(3)中，可以存在于选自由步骤(3a)～(3d)组成的组中的至少1个步骤中，也可以在步骤(3a)～(3d)的全部步骤中存在。上述物质的添加时期可以为与步骤(3a)，步骤(3b)，步骤(3c)或步骤(3d)的开始同时，也可以不同。
步骤(3)中，通过将制备的细胞团块长期培养，可以得到包含分化进展的细胞，更成熟的细胞团块。这样的培养也称为成熟培养。在步骤(3)的成熟培养过程中，从避免化学上未确定的成分的混入的观点出发，可优选使用无血清培养基。在步骤(3)的成熟培养中，使用的培养基也可以使用从步骤(1)到步骤(3)中使用的那些相同的。另外，也可以使用在神经细胞等培养中使用的已知的培养基，例如在DMEM/F-12培养基和Neurobasal培养基的1∶1混合液中添加了0.5％N2补充剂和1％B27补充剂的培养基(N2B27培养基)，在KnockoutDMEM/F-12培养基中添加了StemPro NSC SFM补充剂的培养基(StemPro NSC SFM培养基)等。在实施成熟培养时，也可以在悬浮培养开始时用的培养容器中继续培养。另外，也可以将细胞团块转移到新培养容器，例如悬浮培养用平皿，悬浮培养用烧瓶等中实施培养。将在成熟培养过程中培养条件大幅改变的情况特别地作为步骤(3e)在后叙述。
<步骤(3e)>
步骤(3)可以在上述步骤(3a)，上述步骤(3b)或上述步骤(3c)后进一步包含进行培养的步骤(3e)。也可以在步骤(3d)后包含步骤(3e)。通过步骤(3e)，可以得到分化阶段更进展的嗅神经细胞。
在步骤(3e)中，使用的培养基也可以使用从步骤(1)到步骤(3)，或者在步骤(3)的成熟培养中使用的那些相同的。另外，也可以使用在神经细胞等培养中使用的已知的培养基，例如在DMEM/F-12培养基和Neurobasal培养基的1∶1混合液中添加0.5％N2补充剂和1％B27补充剂的培养基(N2B27培养基)，在Knockout DMEM/F-12培养基中添加StemPro NSCSFM补充剂的培养基(StemPro NSC SFM培养基)，在中枢神经系统类器官用的培养基(STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit)，上皮细胞培养用的培养基(PneumoCultALI培养基，CnT-Prime，Epithelial Culture Medium)等。
步骤(3e)中，也优选接着添加在上述步骤的任一个步骤中在细胞团块的制备中使用的添加物，例如BMP信号转导途径抑制物质，TGFβ信号转导途径抑制物质，Shh信号转导途径作用物质，第一Wnt信号转导途径抑制物质，Wnt信号转导途径作用物质，FGF信号转导途径作用物质，EGF信号转导途径作用物质等。步骤(3e)中添加的这些物质可以与分别上述步骤的任一个步骤中使用的物质相同，也可以不同、优选为相同。添加物的浓度及种类可以适宜调整。步骤(3e)中使用的添加物更优选包含选自由BMP信号转导途径抑制物质，TGFβ信号转导途径抑制物质，Wnt信号转导途径作用物质，FGF信号转导途径作用物质及EGF信号转导途径作用物质组成的组中的至少一种。
从促进嗅上皮样组织的成熟的观点出发，在步骤(3e)中优选还存在视黄酸转导途径作用物质。作为视黄酸转导途径作用物质，可列举例如全反式视黄酸，异维甲酸，9-顺式视黄酸，TTNPB，Ch55，EC19，EC23，芬维A胺，阿维A，曲法罗汀，阿达帕林等。这些物质可以单独或组合使用。
视黄酸转导途径作用物质优选包含EC23。在培养基中的视黄酸转导途径作用物质的浓度，只要是能够实现上述效果的范围即可，没有特别限定，作为视黄酸转导途径作用物质使用EC23时，例如EC23的浓度为约10pM～约10μM、优选为约100pM～约5μM，更优选为约1nM～约1μM，进一步优选为约10nM～约500nM。另外，在使用除了EC23以外的视黄酸转导途径作用物质的情况下，优选地以赋予与上述浓度的EC23同等的视黄酸转导途径作用物质的浓度使用。
从促进嗅上皮样组织的成熟的观点出发，步骤(3e)中优选还存在血清。作为血清没有特别限定，可以使用细胞培养中通常使用的血清。培养基中血清的浓度只要是能够实现上述效果的范围即可，没有特别限定，例如约1％～20％、优选为约3％～约15％。
在步骤(3e)中，从模拟细胞的保护和生物体的物理的环境而提高嗅上皮样组织的制备效率的观点出发，优选在含有增稠剂，具有粘性的培养基中培养细胞团块。
对于赋予培养基粘性的办法没有特别限制，可通过例如：将作为一般增稠剂已知的物质以适当的浓度添加到培养基中而实施。作为增稠剂，为可赋予培养基上述适度粘度的东西，在可赋予该粘度的浓度范围中，只要对细胞没有不良影响(没有细胞毒性)，就可以使用任何增稠剂。作为增稠剂，可列举例如甲基纤维素，果胶，瓜尔胶，黄原胶，罗望子树胶，卡拉胶，刺槐豆胶，结冷胶，糊精，定优胶，淀粉，塔拉胶，藻酸，可德兰多糖，酪蛋白钠，角豆胶，几丁质，壳聚糖，葡糖胺，支链淀粉，琼脂糖，膳食纤维及它们的化学修饰的物质或衍生物，纤维素，琼脂糖等多糖，乙基纤维素，羟乙基纤维素，羟丙基纤维素，羟乙基甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羟乙基乙基纤维素，羟丙基乙基纤维素，乙基羟乙基纤维素，二羟丙基纤维素，羟乙基羟丙基纤维素等多糖的醚，聚丙烯酰胺，聚氧乙烯，及聚乙烯基吡咯烷酮，乙二醇/丙二醇共聚物，聚乙烯亚胺聚乙烯基甲基醚，聚乙烯醇，聚丙烯酸，马来酸共聚物等合成高分子，胶原蛋白，明胶，透明质酸，葡聚糖(dextran)，角叉菜胶(carrageenan)等生物高分子，或者模仿它们的人工高分子(例如：弹性蛋白样肽等)。优选地，这些增稠剂可以单独使用，也可以以数种增稠剂的混合物形式使用。另外，也可以使用作为增稠剂使用的水溶性高分子的共聚物。优选地，可以使用甲基纤维素，聚乙二醇，聚乙烯基吡咯烷酮，羧甲基纤维素或它们的混合物，更优选为甲基纤维素。
具有粘性的培养基可以使用在作为培养环境优选的37℃条件下，通常具有100mPa·S以上、优选为500mPa·S以上、更优选为1000mPa·S以上，进一步优选为2000mPa·S以上的粘性的那些。
添加到培养基中的增稠剂的浓度只要能够赋予粘性，对细胞没有损伤性，就能够适当制备。在作为增稠剂使用甲基纤维素(4000cP)的情况下，通常以0.5％至10％、优选为1％至7.5％，进一步优选为2％至5％的浓度使用。
步骤(3e)中，从抑制形成的细胞团块中的包含嗅神经细胞的组织变薄，提高组织的制备效率观点出发，也优选将形成的细胞聚集体进行贴壁培养。
作为使细胞黏着的培养器材，也可以使用平面的细胞培养平皿，或者Transwell等薄膜状的细胞培养器材中的任一形态。这些细胞培养平皿或者细胞培养器材可以为了促进细胞的黏着而利用基底膜制品，层粘连蛋白等细胞外基质，聚-D-赖氨酸等合成细胞粘附分子等进行包被。
步骤(3e)中，从促进细胞团块中包含嗅神经细胞的组织的生存及成熟的观点出发，也优选将细胞聚集体利用气相液相界面培养法培养。气相液相界面培养法(Air liquidinterface culture)是指将细胞或组织的至少一个表面暴露于大气、或处于极其接近的位置的条件下的培养。为了实施气相液相界面培养法，可列举例如将细胞或组织在多孔膜上或细胞培养插件内培养，将插件内(内腔侧)的培养液取出，仅利用插件外侧的孔内的培养液进行培养，或者将琼脂糖等水凝胶置于培养平皿内，并且放置细胞或组织等而在从平皿内的培养基露出同时又不干燥的条件下培养等方法。从主要以降低由氧引起的在大气中暴露的毒性的目的出发，也可以将PDMS等透氧性的膜、板置于细胞或组织等上，调节暴露条件。
从促进嗅上皮样组织的成熟及增殖的观点出发，步骤(3e)的开始时期为步骤(3)的开始起例如60天以内、优选为30天以内，例如12小时以后、优选为96小时以后。
步骤(3e)中的培养的时期能够适当设定。步骤(3e)中的培养时期通常为8小时～200天左右、优选为1天～150天左右，进一步优选为2天～120天左右，最优选为4天～100天左右。
步骤(3)中，从促进嗅神经细胞及中枢神经系统细胞的成熟的观点出发，也可以包含将细胞聚集体包埋在凝胶中进行培养的步骤。作为凝胶，可以举出例如使用琼脂糖，甲基纤维素，胶原，基质胶等的凝胶，优选使用基质胶。
从避免异种成分及未确定因素的混入的观点出发，优选选自由步骤(1)，步骤(2)及步骤(3)组成的组中的至少1个步骤在不存在小鼠肉瘤源自基底膜制品(基质胶)的条件下进行。从促进嗅上皮样组织的生长的观点出发，步骤(3)也可以在基质胶的存在下进行。在使用基质胶的情况下，培养基中的基底膜制品的浓度优选为0.5％以上4％以下，从实验操作的方面考虑，更优选为0.5％以上1.5％以下。基底膜制品的添加时期根据细胞聚集体的状态而不同，例如为步骤(1)开始7天以后，更优选为第9天以后。基底膜制品的添加时期例如为步骤(3a)，(3b)或(3c)的开始第4天以后，第6天以后。
从抑制在细胞团块的表面形成的嗅上皮样组织的变薄，及分化转换为除了源自基板的组织以外的组织的观点出发，在步骤(3)中，也可以存在与步骤(1)，步骤(2)和/或步骤(3)中添加的第一Wnt信号转导途径抑制物质不同的Wnt信号转导途径抑制物质(在本发明中，也称第二Wnt信号转导途径抑制物质)。第二Wnt信号转导途径抑制物质优选为与第一Wnt信号转导途径抑制物质的作用机制不同，在步骤(1)中作为第一Wnt信号转导途径抑制物质使用PORCN抑制剂时，第二Wnt信号转导途径抑制物质优选为包含具有对于经典Wnt途径(canonical-Wnt pathway)的抑制活性的物质，更优选包含TANK抑制剂。在添加第二Wnt信号转导途径抑制物质的时，优选在步骤(1)中不添加Wnt信号转导途径作用物质。
作为具有对于经典Wnt途径的细胞内信号传导机构的抑制活性的物质，可列举例如Frizzled抑制剂，Dvl抑制剂，TANK抑制剂，酪蛋白激酶1抑制剂，连环蛋白反应性转录抑制剂，p300抑制剂，CBP抑制剂，BCL-9抑制剂。
作为TANK抑制剂，可列举例如IWR1-内(4-[(3aR，4S，7R，7aS)-1，3，3a，4，7，7a-六氢-1，3-二氧代-4，7-甲醇-2H-异吲哚-2-基]-N-8-喹啉基-苯甲酰胺)，XAV939(3，5，7，8-四氢-2-[4-(三氟甲基)苯基]-4H-硫基吡喃并[4，3-d]嘧啶-4酮)，MN-64(2-[4-(1-甲基乙基)苯基]-4H-1-苯并吡喃-4酮)，WIKI4(1-[(1S)-1-(4-氯-3-氟苯基)-2-羟乙基]-4-[2-[(2-甲基吡唑-3-基)氨基]嘧啶-4-基]吡啶-2酮)，TC-E 5001(3-(4-甲氧基苯基)-5-[[[4-(4-甲氧基苯基)-5-甲基-4h-1，2，4-三唑-3-基]硫基]甲基]-1，2，4-噁二唑)，JW 55(N-[4-[[[[四氢-4-(4-甲氧基苯基)-2H-吡喃-4-基]甲基]氨基]羰基]苯基]-2-呋喃羧酰胺)，AZ6102(rel-2-[4-[6-[(3R，5S)-3，5-二甲基-1-哌嗪基]-4-甲基-3-吡啶基]苯基]-3，7-二氢-7-甲基-4H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-4酮)等。这些物质可以单独或组合使用。
作为第二Wnt信号转导途径抑制物质使用的TANK抑制剂，优选为包含选自由IWR1-endo，XAV939及MN-64组成的组中的至少一种，更优选包含XAV939。培养基中的Wnt信号转导途径抑制物质的浓度在能实现上述效果的范围内可适宜设定。从基板样组织的保持和防止变薄的观点出发，例如作为第二Wnt信号转导途径抑制物质使用为TANK抑制剂的一种的XAV939时，其浓度通常为约0.01μM～约30μM、优选为约0.1μM～约30μM，更优选为约0.3μM。
第二Wnt信号转导途径抑制物质的添加时期为在早于步骤(3)中发生细胞团块表面的基板样组织的变薄和分化转换的阶段即可，为从步骤(1)的多潜能干细胞的悬浮培养开始通常12小时以后，通常28天以内、优选为24天以内，更优选为21天以内。
步骤(3)中，第一Wnt信号转导途径抑制物质和第二Wnt信号转导途径抑制物质可以同时存在于培养基中，也可以仅将第二Wnt信号转导途径抑制物质添加到培养基中。另外，也可以通过在半量培养基交换时仅添加第二Wnt信号转导途径抑制物质，而将第一Wnt信号转导途径抑制物质逐步进行稀释。
第二Wnt信号转导途径抑制物质在步骤(3)中可以存在于选自由步骤(3a)～(3d)组成的组中的至少1个步骤中，也可以在步骤(3a)～(3d)的全部步骤中存在。第二Wnt信号转导途径抑制物质的添加时期可以为与步骤(3a)，步骤(3b)，步骤(3c)或步骤(3d)的开始同时，也可以不同。
步骤(3)中，从抑制分化为中内胚层，提高向基板的分化效率和嗅上皮样组织的制备效率的观点出发，也优选添加对于转化生长因子-β-活化激酶1(TAK1)的抑制物质。TAK1为介导由TGFβ，骨形成蛋白质(BMP)，白介素1(IL-1)，TNF-α等所活化的信号传导的MAP激酶激酶激酶(MAPKKK)家族的丝氨酸苏氨酸蛋白质激酶。
TAK1抑制物质只要是能够抑制TAK1介导的信号传导则没有限制。可以为核酸，蛋白质，低分子有机化合物中的任一种。作为该物质，可列举例如抑制TAK1和基质的结合的物质，抑制TAK1的磷酸化的物质，促进TAK1的脱磷酸化的物质，抑制TAK1的转录、翻译的物质，促进TAK1的分解的物质等。
作为TAK1抑制物质，可列举例如(5Z)-7-Oxozeaenol((3S，5Z，8S，9S，11E)-3，4，9，10-四氢-8，9，16-三羟基-14-甲氧基-3-甲基-1H-2-苯并环十四烷-1，7(8H)-二酮)，N-Des(氨基羰基)AZ-TAK1抑制剂(3-氨基-5-[4-(4-吗啉基甲基)苯基]-2-噻吩羧酰胺)，Takinib(N1-(1-丙基-1H-苯并咪唑-2-基)-1，3-苯二羧酰胺)，NG25(N-[4-[(4-乙基-1-哌嗪基)甲基]-3-(三氟甲基)苯基]-4-甲基-3-(1H-吡咯并[2，3-b]吡啶-4-氧基)-苯甲酰胺三盐酸盐)及这些化合物的衍生物，类似物。这些物质可以单独或组合使用。
本发明中使用的TAK1抑制物质优选为(5Z)-7-Oxozeaenol。作为步骤(3)中的TAK1抑制物质使用(5Z)-7-Oxozeaenol的情况下，通常以约1nM～约100μM、优选为约10nM～约50μM，更优选为约100nM～约25μM，进一步优选为约500nM～约10μM的浓度使用。另外，在使用除了(5Z)-7-Oxozeaenol以外的TAK1抑制物质的情况下，优选地以赋予与上述浓度的(5Z)-7-Oxozeaenol同等TAK1抑制活性的浓度使用。
步骤(3)中，从抑制细胞死亡，促进细胞的增殖的观点出发，也优选在培养基中还添加生长因子。添加的生长因子的种类没有特别限定，只要可实现上述目标即可。作为用于该目的的生长因子，可列举胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor：IGF)，神经生长因子(Nerve growth factor：NGF)，脑源性神经营养因子(Brain-derivedneurotrophic factor：BDNF)，神经营养素3，神经营养素4/5，睫状神经营养因子(Ciliaryneurotrophic factor：CNTF)，血管内皮细胞生长因子(Vesicular endothelial growthfactor：VEGF)，色素上皮衍生因子(Pigment epithelium-derived factor：PEDF)，肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor：HGF)等。这些生长因子只要以能实现上述目标的浓度添加即可。
在步骤(3)中，从抑制细胞死亡，促进细胞的增殖的观点出发，也优选将血小板源生长因子(Platelet-derived growth factor：PDGF)等血小板源生长因子受体作用物质添加到培养基中。PDGF中存在A，B，C，D四种基因，形成AA，AB，BB，CC，DD的均或特定的组合的杂的二聚体而作为配体发挥功能。PDGF受体中存在α及β二种基因，形成αα，αβ，ββ的组合的均或杂的二聚体而作为受体发挥功能。之中，在包含基板的非神经外胚层中PDGFRβ充分表达，本发明使用的血小板源生长因子受体作用物质优选为具有对于PDGFRββ或PDGFRαβ的作用，更优选包含选自由PDGF-AB，PDGF-BB，PDGF-CC及PDGF-DD组成的组中的至少一种，进一步优选为包含选自由PDGF-BB及PDGF-CC组成的组中的至少一种。PDGF-AB，PDGF-BB，PDGF-CC及PDGF-DD能够以重组蛋白质的形式从R&D systems公司，GenScript公司等获得。
在步骤(1)，步骤(2)和/或步骤(3)中，从提高嗅上皮样组织的制备效率的观点出发，也优选添加促进分化为基板区域的化合物。作为具有如上所述的作用的化合物，可列举例如美国专利US20160326491A1号中记载的BRL-54443，菲咯啉(Phenanthroline)，小白菊内酯(Parthenolide)等。作为促进分化为基板区域的化合物而使用BRL-54443时，通常以10nM～100μM，使用菲咯啉时通常以10nM～100μM，使用小白菊内酯时通常以10nM～100μM的浓度使用。
步骤(3)中，从抑制细胞死亡，促进细胞的增殖的观点出发，也优选在高氧的气体氛围中培养。培养过程中的高氧条件可以通过例如将培养细胞的培养箱与氧泵连接，人工地供给氧而实现。用于所述目标的氧浓度通常为25％～80％，更优选为30％～60％。
步骤(3)中，从增加培养细胞团块的培养基中的氧供给量的观点出发，也可以使用气体交换效率高的培养器材。作为这样的培养器材的例子，可列举使细胞培养皿，板的底面设为气体透过性的膜的Lumox平皿(SARSTEDT股份有限公司制)，VECELL 96孔板(VesselCO.LTD.制)等。
[3.包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块]
在本发明中，称为“细胞”及“组织”的标记可以利用与分别存在于生物体内的相应细胞及组织相同的标记进行的免疫染色，及其他的特定的方法确认其存在，“细胞”及“组织”的功能，结构等不限于必须与生物体内存在的细胞及组织相同。例如：本发明的细胞团块中包含的“嗅神经细胞”可以利用与存在于生物体内的嗅神经细胞相同的标记染色，但其基因表达的状态、突触结合不一定必须与生物体内的嗅神经细胞为同一状态。
本发明中的细胞团块是指，
聚集体，其包含1)包含嗅神经细胞或其前体细胞的非神经上皮组织部，及，
2)包含神经系统细胞或其前体细胞的神经组织部，
上述神经系统细胞或其前体细胞包含构成中枢神经系统的神经系统细胞或其前体细胞，
上述神经组织部的表面的至少一部分包覆有上述非神经上皮组织部。
细胞团块为人工地形成的细胞的群体，具有一定的细胞种类，细胞数，形状及构成。构成本发明的细胞团块的细胞数没有特别限定，从形成包含多种细胞种类的细胞团块的观点出发，优选为30个以上、更优选为500个以上。本发明的细胞团块的形状没有特别限定，可以为球状，椭圆状，片状，优选为球状。本发明的细胞团块优选可以通过上述本发明的制备方法制备。
以下，适当使用图1对本发明涉及的细胞团块进行说明。将本发明涉及的细胞团块的一个形态示于图1的A～E。细胞团块包含非神经上皮组织部和神经组织部。神经组织部的至少一部分覆盖有非神经上皮组织部。神经组织部的表面优选为3成以上、更优选为6成以上，进一步优选为8成以上，最优选为全部覆盖有非神经上皮组织部。在非神经上皮组织部和神经组织部之间的至少一部分可以形成间隙。非神经上皮组织部包含嗅神经细胞或嗅神经前体细胞。神经组织部包含构成中枢神经系统的神经系统细胞或其前体细胞，也可以包含构成视网膜的神经系统细胞或其前体细胞。
<包含嗅神经细胞或其前体细胞的非神经上皮组织部>
本发明的细胞团块包含非神经上皮组织部。非神经上皮组织部指具有上皮结构的组织，且不包含神经上皮组织。上皮结构是指通过细胞彼此通过细胞间连接而连接，形成了层的结构。层可以为单层也可以为多层，优选为2层以上5层以下，更优选为3层以上4层以下。另外，上皮结构的一部分也可以为多层。本发明的细胞团块涉及的非神经上皮组织部中，在非神经上皮组织部中优选为5成以上9成以下，更优选为8成以上10成以下，最优选为全部具有上皮结构。非神经上皮组织部也可以包含细胞外基质。
非神经上皮组织部包含嗅神经细胞或其前体细胞。嗅神经细胞或其前体细胞可以定义为同时表达为神经系统细胞的标记的选自由Tuj1，NCAM，N-钙黏着蛋白，钙网膜蛋白组成的组中的至少1个，及为非神经系统细胞的标记的选自由EpCAM，E-钙黏着蛋白，细胞角蛋白组成的组中的至少1个的细胞，优选进一步表达为选自由在嗅神经细胞或其前体细胞中特异性表达的转录因子的Ebf1，Ebf2，Ebf3，NeuroD，Lhx2，Asc11组成的组中的至少一种。非神经上皮组织部中包含的嗅神经细胞优选表达嗅觉受体，更优选为与生物体内的嗅上皮中局部存在的嗅神经细胞同样地接受嗅觉信息，能够将信息传递到中枢神经系统。嗅神经细胞的前体细胞是指成熟时成为嗅神经细胞的细胞，也包含具有分化为嗅神经细胞的潜能的细胞。嗅神经细胞的前体细胞优选显示与存在于嗅上皮基板的神经细胞相同的性质。在构成非神经上皮组织部的细胞中，优选为1％以上、更优选为5％以上，进一步优选为10％以上50％以下的细胞为嗅神经细胞或其前体细胞。
非神经上皮组织部中进一步包含基底膜样结构是优选的，基底膜样结构形成于非神经上皮组织部和神经组织部之间是更优选的，在基底膜样结构上黏着有包含在非神经上皮组织部中的细胞是进一步优选的。基底膜样结构是指由细胞外基质构成的薄的膜状的结构，可以通过层粘连蛋白的免疫染色而判断。基底膜样结构优选为生物体内的基底膜同样地有利于非神经上皮组织部的结构的保持，非神经上皮组织部与神经组织部的机械分离，物质的选择性透过等。
非神经上皮组织部优选为形成假复层上皮或复层上皮，更优选为形成假复层上皮。假复层上皮是指细胞在基底膜样结构基础上形成了多个层，为全部的细胞伸长突起而与基底膜样结构进行接触的上皮结构，也称为假复层上皮。复层上皮是指细胞在基底膜样结构基础上形成了多个层的上皮结构。可以是非神经上皮组织部的一部分形成假复层上皮或复层上皮，也可以全部形成假复层上皮或复层上皮。
非神经上皮组织部包含嗅上皮样组织，优选在嗅上皮样组织中包含嗅神经细胞或其前体细胞。嗅上皮样组织指表达嗅上皮或其前体组织(嗅上皮基板)中表达的选自由Six1，Sp8，Sox2，Sox3，Dlx5，Emx2，Pax6，Otx2，PDGFRβ，细胞角蛋白，EpCAM，E-钙黏着蛋白及N-钙黏着蛋白组成的组中的至少一种的区域，优选表达Otx2，Sp8，Sox2，EpCAM，E-钙黏着蛋白及细胞角蛋白。
嗅上皮样组织优选还包含选自由支持细胞，基底细胞及鲍曼氏腺细胞，以及它们的前体细胞组成的组中的至少两种细胞，更优选包含基底细胞或其前体细胞。支持细胞或其前体细胞指表达选自由HIF2α，Sox2，Hes1，Hes5及Six1组成的组中的至少一种的细胞。基底细胞或其前体细胞指表达选自由p63，Wt1及Lgr5组成的组中的至少一种的细胞。鲍曼氏腺细胞或其前体细胞指表达选自由细胞角蛋白及Ascl3组成的组中的至少一种的细胞。
另外，嗅上皮样组织优选还包含嗅神经鞘细胞或其前体细胞。嗅神经鞘细胞或其前体细胞指表达选自由S100，Sox10及波形蛋白组成的组中的至少一种的细胞。作为嗅神经鞘细胞或其前体细胞的标记，可以使用例如Brain Structure and Function 222.4(2017)：1877-1895.中记载的标记。
支持细胞，基底细胞，鲍曼氏腺细胞或者嗅神经鞘细胞或它们的前体细胞优选显示与存在于生物体内的嗅上皮或嗅上皮基板的支持细胞，基底细胞，鲍曼氏腺细胞或者嗅神经鞘细胞或它们的前体细胞相同的性质。
嗅上皮样组织优选包含基底膜样结构，更优选形成假复层上皮结构或复层上皮结构。嗅上皮样组织优选具有与神经组织部对向的基底面，及位于与基底面为相反侧的顶端面，基底面中包含嗅神经前体细胞及基底细胞，顶端面中包含支持细胞及嗅神经细胞。基底面(或嗅神经前体细胞)优选与为层粘连蛋白阳性的非细胞性的结构的基底膜相接。存在于顶端面的细胞优选表达PKCζ。
将本发明涉及的细胞团块的一个形态的非神经上皮组织部放大的样子示于图1的B中。参考图1的B，非神经上皮组织部优选为与神经组织部对向的基底面，及位于与基底面为相反侧的顶端面。基底面中优选存在嗅神经细胞的前体细胞(嗅神经前体细胞)。
嗅上皮样组织优选包含嗅上皮内侧部和，及设在上述嗅上皮内侧部的周围的嗅上皮周缘部，并产生外侧-内侧(Lateral-Medial)的区域化。嗅上皮样组织也可以由嗅上皮内侧部及嗅上皮周缘部构成。嗅上皮内侧部指局部存在表达选自由Sox2，Tuj1及Ascl1组成的组中的至少一种的细胞的区域。嗅上皮周缘部指局部存在表达选自由Pbx，Meis1，Pax6，βIV微管蛋白组成的组中的至少1个、优选为Pax6及Pbx的细胞的区域。
非神经上皮组织部也可以包含除了嗅上皮样组织以外的非神经上皮组织。非神经上皮组织指不含有嗅神经细胞或其前体细胞，表达选自由细胞角蛋白，E-钙黏着蛋白及EpCAM组成的组中的至少一种，且不表达Ebf1，Ebf2，Ebf3，NeuroD，Lhx2，Ascl1区域。非神经上皮组织优选包含呼吸器官上皮及角膜细胞，以及它们的前体细胞。
将本发明涉及的细胞团块的一个形态示于图1的C。参考图1的C，细胞团块为神经组织部的全部被非神经上皮组织部所覆盖，在非神经上皮组织部的一部分也可以形成有嗅上皮样组织。嗅上皮样组织可以包含嗅上皮内侧部，及设在上述嗅上皮内侧部的周围的嗅上皮周缘部。被非神经上皮组织部所覆盖的细胞团块的表面的60％以上80％以下可以为嗅上皮内侧部。对嗅上皮样组织及非神经上皮组织的结构，大小及位置关系等没有特别限定。嗅上皮样组织与非神经上皮组织部之间也可以形成间隙。另外，如图1的D所示，神经组织部的一部分也可以覆盖有非神经上皮组织部。
<包含神经系统细胞或其前体细胞的神经组织部>
本发明的细胞团块包含神经组织部。神经组织部包含神经系统细胞或其前体细胞。神经系统细胞或其前体细胞包含构成中枢神经系统的神经系统细胞或其前体细胞。构成中枢神经系统的神经系统细胞或其前体细胞可定义为表达选自由Pax6，Bf1，Sp8，Sox1，Sox2，Emx2，Tuj1，N-钙黏着蛋白组成的组中的至少一种，且不表达细胞角蛋白的细胞，优选表达Pax6，Sox2及Tuj1。构成中枢神经系统的神经系统细胞或其前体细胞优选显示与生物体内的中枢神经系统中神经细胞，胶质细胞，神经干细胞等或它们的前体细胞相同的性质。
神经组织部也可以形成上皮结构。将本发明涉及的细胞团块的一个形态示于图1的E。神经组织部覆盖有非神经上皮组织部，神经组织部形成上皮结构。上皮结构可以形成于神经组织部的一部分，也可以形成于全部。在非神经上皮组织部和神经组织部之间的至少一部分可以形成间隙。
神经系统细胞或其前体细胞优选包含构成视网膜的神经系统细胞或其前体细胞。构成视网膜的神经系统细胞或其前体细胞可以为定义表达选自由Rax，Six3，Chx10，Pax6，Lhx2，Aldh1a3组成的组中的至少一种的细胞，优选表达Rax及Chx10。构成视网膜的神经系统细胞或其前体细胞优选显示与生物体内的视网膜细胞，视网膜前体细胞，视网膜特异性的神经细胞等或它们的前体细胞相同的性质。
中枢神经系统优选包含大脑。大脑(包含构成大脑的细胞)指表达选自由Emx家族基因，Otx2，Bf1及Pax6组成的组中的至少一种的组织。另外，大脑优选具有层结构。
大脑优选包含嗅皮质。嗅皮质指表达选自由Tbr1，Ctip2及FoxP2组成的组中的至少一种的组织。
大脑优选包含大脑基底核或其原基。大脑基底核或其原基指表达选自由Dlx家族基因，Gsh2，Nkx 2.1及Islet1组成的组中的至少一种的组织。
大脑基底核或其原基优选为外侧基底核原基。外侧基底核原基指表达选自由Er81及Islet1组成的组中的至少一种的组织。
大脑优选包含嗅球或其前体组织。嗅球或其前体组织指表达选自由Arx，Tbr1及Tbx21组成的组中的至少一种的组织。
细胞团块优选包含促性腺激素释放激素阳性神经细胞。促性腺激素释放激素阳性神经细胞指表达促性腺激素释放激素(GnRH)的细胞及其前体细胞。
与生物体的鼻腔组织不同，本发明的细胞团块中通常不形成骨组织，但在细胞团块中可以包含骨组织。骨组织，骨细胞或其前体细胞优选表达选自由Runx2，Osterix及ATF组成的组中的至少一种。在形成的细胞团块中是否形成有骨组织，可通过本领域技术人员众所周知的方法，例如茜素红染色，碱性磷酸酶染色，或对于上述骨组织特异性基因的免疫染色等办法而辨别。
对检测制备的细胞团块中包含细胞及组织的办法没有特别限定，优选可靠性和再现性高而能简便实施的办法。作为一例可以举出，基于显微镜的光学观察，使用对于各细胞或组织标记的抗体的免疫染色，对于标记基因的实时PCR法等基因表达分析，使用嗅觉受体作用物质的功能测定，对小鼠，大鼠等的移植等，优选为使用对于上述所述的标记的抗体的免疫染色。
免疫染色的结果的解释可以通过基于本领域技术人员的目测的辨别，或者使用相对于拍摄的图像的图像分析软件等的定量分析等对本领域技术人员而言众所周知的方法进行。当解释免疫染色的结果时，参考例如蛋白质核酸酶Vol.54No.2(2009)P185-192等，必须排除由自身荧光，二次抗体的非特异性吸附，多重染色时的荧光漏出等产生的假阳性。在本发明中，蛋白质的表达的有无依照后述的预备实验1所示的方法进行判断。
[4.作为嗅觉受体作用物质评价用试剂的使用方法]
本发明可以提供使用上述“包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块”的嗅觉受体作用物质的评价方法。
作为嗅觉受体作用物质的评价方法，例如包含嗅觉受体作用物质的评价方法，所述方法包含使由上述细胞团块制备的嗅神经细胞或嗅上皮样组织与被测物质进行接触的步骤，和，检验该被测物质对该细胞或该组织造成的影响的步骤，其为鉴定与评价对象的化合物发生反应的特定的嗅觉受体的方法。作为本发明的嗅觉受体作用物质评价的实施方法的一种实施方式，可以参考例如Scientific Reports 6，19934(2016)中记载的方法进行实施。
本发明的嗅觉受体作用物质评价的实施方法的一种实施方式为嗅觉受体作用物质评价的实施方法，所述方法包含下述步骤(A)～(D)。
(A)从包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块中分取表达嗅觉受体的细胞的步骤，
(B)使分取的表达嗅觉受体的细胞与待测物质进行接触的步骤，
(C)鉴定由于与待测物质的接触而活化的细胞的步骤，
(D)鉴定由于与待测物质的接触而活化的细胞中表达的嗅觉受体的步骤。
<步骤(A)>
对从包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块中分取表达嗅觉受体的细胞的步骤进行说明。
由于在包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块中，表达嗅觉受体的就是嗅神经细胞，因此步骤(A)中的分取方法只要为能够从细胞团块分取嗅神经细胞的方法即可。期望分取方法对细胞给予的损伤小，目标以外的细胞的混入较少。作为步骤(A)中的分取方法的一种实施方式，可以包含处理组织而分散为单一细胞的步骤。作为上述分散方法，可以举出例如基于使用蛋白质分解酶的酶处理的分散，基于钙螯合剂处理的分散，机械分散等，优选为基于酶处理的分散。作为分取方法的一种实施方式，也可以使用细胞表面标记仅纯化，分取目标的细胞。作为上述目标的细胞的分取方法，可列举例如使用对于嗅神经细胞特异性的细胞表面标记的抗体的荧光活化的细胞分选(fluorescence activated cell sorting：FACS)，磁性细胞分离(MACS)。作为嗅神经细胞特异性的细胞表面标记，可列举例如OCAM。或者也可以以PloS one，10(1)，e0113170等为参考而将在嗅神经细胞的细胞膜中表达的蛋白质，糖链，脂质等作为标记。分取的细胞可以在通常的细胞培养中使用的培养基中培养。其时，为了抑制细胞死亡，也可以添加生长因子及细胞保护剂。
另外，也可以将从细胞团块分离嗅上皮样组织而用于评价。可以从上述细胞团块在显微镜观察下用镊子等，将在细胞团块的外侧形成的嗅上皮样组织进行剥离，回收。嗅上皮样组织可以例如如Nature communications，2016，7.中记载的那样，作为以位于得到的细胞团块的表层的半透明的薄的上皮而辨别。作为嗅上皮样组织的回收方法，也可以使用冻融、优选为慢速冷冻法。在该方法中，通过将在外侧具有嗅上皮样组织及内侧具有神经上皮组织的细胞团块冻融，由此，不施加物理处理而将外侧的嗅上皮样组织从细胞团块剥离。
<步骤(B)>
对使分取的表达嗅觉受体的细胞或组织与待测物质进行接触的步骤进行说明。
在步骤(B)中与待测物质进行接触的细胞或组织可以为悬浮状态，黏着状态中的任一，从提高嗅神经细胞的生存率，容易进行之后的步骤的洗涤等操作的观点出发，优选为黏着状态的细胞。作为使细胞黏着的培养器材，也可以使用平面的细胞培养平皿，或者Transwell等薄膜状的细胞培养器材中的任一形态。这些细胞培养皿或者细胞培养器材可以为了促进细胞的黏着而包被有层粘连蛋白等细胞外基质，聚-D-赖氨酸等合成基质等。
步骤(B)中使用的被测物质可以以自身原样，或也可以用溶剂稀释而使用。作为在此时使用的稀释中使用的溶剂，优选对测试结果没有影响的那些，可以使用例如生理盐水，磷酸盐缓冲溶液(PBS)，Hanks’平衡盐溶液(HBSS)，DMEM等细胞培养用的培养基。在被测物质在培养液中不溶，且得不到良好的悬浊性的情况下，可以根据需要将DMSO，乙醇，矿物质油等作为增溶溶剂使用。
在步骤(B)中的被测物质的暴露条件中，培养温度，CO2浓度等培养条件能够适当设定。例如，培养温度为约30℃至约40℃，优选约37℃。另外，CO2浓度例如为约1％～约10％、优选为约5％。关于步骤(B)中被测物质的暴露时期也可适当设定。暴露时期为例如30秒～2天、优选为1分钟～1天。
<步骤(C)>
对鉴定由于与待测物质的接触而活化的细胞-的步骤进行说明。
在步骤(C)中实施的办法，只要能够鉴定由于与待测物质的接触而活化的细胞，就没有限定，优选能够简便且以低成本一次处理大量的被检物的办法。作为一例，可以举出膜检测电位的变化的办法，检测基因表达的变化的办法，检测细胞内离子浓度的变化的办法等、优选为使用Fluo4 AM等钙指示剂的检测细胞内离子浓度的变化的办法。
<步骤(D)>
对鉴定在由于与待测物质的接触而活化的细胞中表达的嗅觉受体的步骤进行说明。
步骤(D)中实施的办法，只要能够鉴定在活化的细胞中表达的嗅觉受体，就没有限定，优选能够简便且以低成本一次处理大量的被检物的办法。作为一例，可列举单一细胞RNA测序法。
[5.嗅觉受体作用物质的评价用试剂盒或嗅觉受体的筛选试剂盒]
本发明可以提供用于实施上述“4.作为嗅觉受体作用物质评价用试剂的使用方法”的嗅觉受体作用物质的评价用试剂盒，或嗅觉受体的筛选试剂盒。
在本试剂或试剂盒中包含本发明的细胞团块，或通过上述步骤(A)等从细胞团块分取的嗅神经细胞或者嗅上皮样组织，以及用于进行上述步骤(B)～(D)的试剂，培养液，培养容器，分析程序中的至少1个，优选包含作为阳性对照或阴性对照使用的试剂，或鉴定由于与待测物质的接触而活化的细胞的试剂。本试剂盒中，可以进一步包含记载筛选的顺序的文件、说明书。
本发明可以提供与上述“4.嗅觉受体作用物质评价用试剂作为的使用方法”或“5.嗅觉受体作用物质的评价用试剂盒或嗅觉受体的筛选试剂盒”同样地，使细胞团块中包含的神经细胞或神经组织和待测物质接触，从而评价神经毒性或药效的方法及试剂盒。
[6.治疗药物及疾病的治疗方法]
本发明可以提供由于神经组织的障碍或感觉器官的障碍、优选为嗅觉系统的障碍导致的疾病的治疗药物，其包含上述细胞团块或上述细胞团块中包含的细胞或组织。作为神经组织的障碍，可列举中枢神经系统的障碍，例如脊髓损伤，脑损伤，或神经变性疾病等。作为脑损伤，可列举例如出血性卒中，缺血性卒中，由脑病导致的脑损伤，外伤性脑损伤，由脑梗死、脑出血导致的脑损伤等。作为神经变性疾病，可列举例如阿尔茨海默病，多发性硬化症(MS)，外周神经障碍，亨廷顿病，肌萎缩性侧索固化症，帕金森病等。这些疾病也可以为非人动物的疾病。存在于嗅上皮的细胞(包含嗅神经细胞及其前体细胞)由于比其它源自神经组织的细胞的再生能力高，因此，作为神经损伤的治疗药物是优异的。
作为治疗药物，可列举例如包含本发明的细胞团块或细胞团块中包含的细胞或组织的悬浊液，以及包含它们的移植物(移植用载体)。作为悬浊液，可列举例如将细胞团块悬浊于人工泪液或生理盐水中的液。悬浊液也可以包含从细胞团块分离的非神经上皮细胞，可以包含促进细胞的黏着的因素，例如细胞外基质、透明质酸等。
进一步，可提供疾病的治疗方法，所述方法包含以治疗上必需的有效量将本发明的细胞团块中包含的细胞或组织移植到必须移植的对象中的步骤。通过以治疗上有效的细胞量的移植，可以使神经组织恢复，典型地，减轻与疾病相关的症状。
实施例
以下结合实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的范围不受其限定。另外，使用的试剂及材料没有特别限定，只要能够商业获取即可。
[预备实验1：免疫染色结果的定量化和判断基准]
进行了用于辨别荧光免疫染色样本的阳性、阴性的荧光强度的定量化。作为染色强度的定量化办法，针对将后述的测试例2中制备的培养第28天的细胞团块的冷冻切片的利用抗Lhx2抗体的荧光免疫染色结果的拍摄图像(图2的上部分)(最大激发波长490nm，最大荧光波长525nm)，输出以线段A-A’所示的感兴趣区域的线形的荧光强度分布，并比较了存在组织的冷冻切片的区域和不存在组织的区域的荧光强度。在图2的下部分显示的分析结果中，不存在组织的区域的荧光强度为219，通过目测辨别为阳性的荧光强度的强区域的数值为4053.333，相比于上述，荧光强度弱的阳性区域的数值为2043.667。因此，可知如图2的下部分的图中用虚线所示的那样，相对于在明场中确认了组织不存在的区域的荧光强度的平均值，将显示为5倍以上的高数值的位置作为阳性，由此定量地进行抗原的染色结果的阳性或阴性的辨别。以下实验通过与本预备实验同样的方法进行了表达为阳性或阴性的判断。
[比较实验1：包含神经组织的细胞聚集体的制备]
依照图3的上部分所示的顺序，将多潜能干细胞Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，制备了细胞聚集体。人ES细胞(KhES-1株，从京都大学获得)基于ScientificReports，4，3594(2014)中记载的方法在无饲养细胞条件下培养。作为无饲养细胞培养基使用了StemFit培养基(AK02N，Ajinomoto Co.，Inc.制)，无饲养细胞构架使用了层粘连蛋白511-E8(Nippi公司制)。
作为具体维持培养操作，首先将亚汇合的人ES细胞(KhES-1株)利用PBS洗涤之后，使用Accumax(Innovative Cell Technologies公司制)进行酶处理后，添加StemFit培养基并使用细胞刮刀从培养皿表面剥下细胞，通过吹打分散成单一细胞。之后，将分散为单一细胞的人ES细胞接种在利用层粘连蛋白511-E8包被的塑料培养皿中，在Y27632(ROCK抑制物质，富士胶片和光纯药公司制，10μM)的存在下，利用StemFit培养基进行了无饲养细胞培养。作为塑料培养皿而使用了6孔板(Corning公司制，细胞培养用，培养面积9.5cm2)的情况下，使分散为单一细胞的人ES细胞的接种细胞数为1.2×104。接种1天后，将总量培养基更换为不包含Y27632的StemFit培养基。然后，1-2天一次，将总量培养基更换为不含Y27632的StemFit培养基。接种后7天，培养至达到亚汇合(培养面积的6成覆盖有细胞的程度)。
将培养的细胞用于诱导分化中时，接种的6天后与StemFit培养基的培养基交换同时，添加了SB-431542(TGF-β信号转导途径抑制物质，富士胶片和光纯药股份有限公司制，终浓度5μM)和SAG(Shh信号途径作用物质，Enzo Life Sciences公司制，终浓度300nM)并培养24小时(步骤(a))。
将制备的亚汇合的人ES细胞利用PBS洗涤之后，使用Accumax进行了酶处理后，添加诱导分化用的无血清培养基并使用细胞刮刀从培养皿表面剥下细胞，通过吹打分散成单一细胞。
之后，将分散成单个细胞的人ES细胞在非细胞黏着性的96孔培养板(PrimeSurface 96V底板、MS-9096V，住友Bakelite公司制)中，以每1孔为1.2×104细胞的方式而悬浮在100μl的无血清培养基中，在37℃，5％CO2的条件下悬浮培养。此时的无血清培养基(gfCDM+KSR)中，使用了在F-12+Glutamax培养基(Thermo Fisher Scientific公司制)和IMDM+Glutamax培养基(Thermo Fisher Scientific公司制)的体积比1∶1混合液中添加5％Knockout血清替代品(Thermo Fisher Scientific公司制)，450μM 1-一硫代甘油(富士胶片和光纯药股份有限公司公司制)，1x化学成分确定的脂质浓缩物(Thermo FisherScientific公司制)，50单位/ml青霉素-50μg/ml链霉素(Nacalai Tesque股份有限公司制)的无血清培养基。
悬浮培养开始时(悬浮培养开始后第0天，步骤(1)开始)，在上述无血清培养基中添加了Y27632(终浓度20μM)，IWP-2(第一Wnt信号转导途径抑制物质，Tocris Bioscience公司制，终浓度2μM)，SB-431542(TGF信号转导途径抑制物质，富士胶片和光纯药股份有限公司制，终浓度1μM)。
之后，悬浮培养开始后第3天，以每孔100μl加入不含有Y27632，且包含IWP-2及SB-431542(也简称为SB431)的无血清培养基。之后，悬浮培养开始后第6，10，13，17，21，24天，使用不含有Y27632，且包含IWP-2和SB-431542的无血清培养基进行半量培养基交换。
悬浮培养开始后第28天，将聚集体回收到平皿中，使用倒置显微镜(Keyence股份有限公司制，BIOREVO)进行明场观察(图3的A)。其结果，通过上述诱导分化法形成了人多潜能干细胞的聚集体。
将悬浮培养开始后第28天的细胞聚集体用前端口径粗的200μl枪头回收到培养用管中，用PBS进行2次洗涤操作之后，4％多聚甲醛磷酸缓冲液(富士胶片和光纯药股份有限公司公司制)在室温固定15分钟。将固定后的细胞聚集体用PBS洗涤3次后，在20％蔗糖/PBS中在4℃中浸渍一夜，进行冷冻保护处理。将冷冻保护处理后的聚集体移至Cryomold<3号>(Sakura Finetek公司制)，将细胞聚集体周围的多余20％蔗糖/PBS用微移液管除去，之后包埋在O.C.T混合(Sakura Finetek公司制)中，在干冰中冷却的铝散热块上急冻，制备成制备冷冻切片用的块。将包埋有上述聚集体的块利用Leica CMl950极低温冷冻机(Leica公司制)制备成10μm厚的冷冻切片，贴在薄片载玻片(PLATINUM PRO Coat slide glass)(松浪硝子工业股份有限公司制)上。将载玻片上的冷冻切片的周围用ULTRA PAP笔(Bio MedicalScience股份有限公司制)圈起之后，用0.2％Triton-X100/TBS在室温透化处理10分钟，接着用封闭试剂N-102(日油股份有限公司制)和SuperBlock(TBS)封闭缓冲液(ThermoFisher Scientific公司制)的体积比1∶4混合液在室温进行封闭处理30分钟。
对于封闭处理后的冷冻切片，对每张载玻片添加300μl的用Antibody Diluent OPQuanto(Thermo Fisher Scientific公司制)稀释的一次抗体，在湿箱中在4℃中反应一夜。将一次抗体处理后的冷冻切片利用0.05％Tween-20/TBS在室温处理10分钟并进行3次洗涤操作后，利用Blocking One Histo(Nacalai Tesque股份有限公司制)和0.2％Triton-X100/TBS以体积比1∶19的比例混合的缓冲液稀释二次抗体，以每张载玻片300μl将稀释液添加到冷冻切片上，于室温反应1小时。将二次抗体处理后的冷冻切片利用0.05％Tween-20/TBS在室温处理10分钟并进行3次洗涤操作后，利用纯水将冷冻切片洗涤一次，之后，使用NEO盖玻片(松浪硝子工业股份有限公司制)和每张载玻片30μl的Prolong Diamond(Thermo Fisher Scientific公司制)将冷冻切片封入。将上述封入后的样本在室温的暗处静置一夜，使Prolong Diamond凝固后，用透明的指甲油包覆盖玻片的周围，在室温的暗处风干，之后，进行利用荧光显微镜的观察。样本的观察及图像的获得中使用了正立荧光显微镜Axio Imager m2(Carl Zeiss公司制)及附属软件Axio Vision。
作为一次抗体，使用了表1中记载的染色基板及中枢神经系统的细胞的抗Dlx5抗体，染色中枢神经系统的细胞的抗Sox1抗体，染色包含基板的非神经组织的泛细胞角蛋白(PanCK)抗体，染色神经细胞的抗Tuj1抗体。作为荧光标记二次抗体使用表2中记载的Alexa488标记驴抗兔抗体，CF555标记驴抗山羊抗体，CF555标记驴抗小鼠抗体，Alexa647标记驴抗小鼠抗体进行多重染色，对于核的对比染色，将1μg/ml的Hoechst33342(SigmaAldrich公司制)添加到二次抗体稀释液中。
将染色结果示于图3。细胞聚集体中含有表达Sox1及Dlx5的中枢神经系统的细胞(图3的B，C)。另外，在细胞聚集体的表面没有确认到泛细胞角蛋白阳性的组织，而细胞聚集体为Tuj1阳性，因此可知形成了不含有非神经上皮组织，且仅包含中枢神经系统的细胞的细胞聚集体(图3的D，F)。将根据染色结果假设的细胞聚集体的示意图示于图3的H。
[比较实验2：包含神经组织及非神经上皮组织的细胞聚集体的制备]
在比较实验1中追加在BMP信号转导途径作用物质的存在下培养的步骤(步骤(2))，依照图4的上部分所示的顺序制备了细胞聚集体。首先，将人ES细胞(KhES-1株)利用与比较实验1相同的操作进行保持培养及步骤(a)后，在Y27632(终浓度20μM)，IWP-2(终浓度2μM)及SB-431542(终浓度1μM)存在下开始悬浮培养(悬浮培养开始后第0天，步骤(1)开始)。
悬浮培养开始后第2天，以每孔100μl加入不含有Y27632，且包含IWP-2，SB-431542及BMP4(BMP信号转导途径作用物质，R&D Systems公司制)的无血清培养基(步骤(2)开始)。关于BMP4，在添加的培养基中添加3nM，使得孔中终浓度为1.5nM。之后，在悬浮培养开始后第6、10、13，17，21，24天使用不含有Y27632和BMP，但包含IWP-2和SB-431542的无血清培养基进行半量培养基更换。
悬浮培养开始后第28天，将细胞聚集体回收到平皿中，使用倒置显微镜进行明场观察(图4的A)。其结果，可知通过上述诱导分化法从人ES细胞形成了包含神经组织及非神经上皮组织的聚集体，进一步经历悬浮培养第21天到第28天，外侧的非神经上皮组织急速膨胀，与内侧的神经组织之间形成空间。
依照与比较实验1同样的方法进行了悬浮培养开始后第28天的细胞聚集体的荧光免疫染色。作为一次抗体使用了表1中记载的染色神经细胞的抗Tuj1抗体，染色基板及中枢神经系统的抗Sox2抗体，染色包含基板的非神经上皮组织的抗PanCK抗体，抗Six1抗体及抗EpCAM抗体，染色嗅上皮基板及中枢神经系统的抗Sp8抗体，染色基板及神经上皮组织的抗N-钙黏着蛋白抗体，染色包含视网膜的中枢神经系统以及基板及嗅上皮周缘部的抗Pax6抗体，染色视网膜的抗Chx10抗体，染色晶状体基板的抗Prox1抗体，抗C-Maf抗体及抗晶状体蛋白αA抗体，染色晶状体基板及中枢神经系统的抗Sox1抗体。作为荧光标记二次抗体使用了表2中记载的Alexa488标记驴抗兔抗体，CF555标记驴抗小鼠抗体，CF555标记驴抗山羊抗体，Alexa647标记驴抗小鼠抗体，Alexa647标记驴抗山羊抗体进行多重染色，在核的对比染色中使用了Hoechst33342。
将染色结果示于图4及图5。可知上述培养方法中制备的悬浮培养开始后第28天的细胞聚集体的内侧为Tuj1，N-钙黏着蛋白，Pax6，Chx10阳性的神经视网膜的上皮组织(图4的B，H，K，L)，外侧为EpCAM，Six1，泛细胞角蛋白阳性的角膜或眼睛表面外胚层的非神经上皮组织(图4的J，F，D)。此外，非神经上皮组织的一部分肥大，由于肥大部分为C-Maf，Sox1，Prox1，晶状体蛋白αA阳性(图5的O～U)，因此可知通过上述培养方法在细胞聚集体中形成了晶状体基板。另外，可知Chx10阳性的内侧的视网膜组织和泛细胞角蛋白阳性的外侧的非神经上皮组织之间，存在为泛细胞角蛋白阳性而不形成上皮的间充质类细胞(图4的D，E)。将根据以上的染色结果假设的细胞聚集体的示意图示于图5的V。
[实验1：从ES细胞制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块]
在比较实验2中追加在BMP信号转导途径抑制物质的存在下培养的步骤(3b))，依照图6的上部分所示的顺序制备了细胞团块。在实验1中进行从悬浮培养开始第13天的细胞聚集体的观察。
首先，将人ES细胞(KhES-1株)利用与比较实验1相同的操作进行保持培养及步骤(a)后，在Y27632(终浓度20μM)，IWP-2(终浓度2μM)及SB-431542(终浓度1μM)的存在下、使用PrimeSurface 96V底平板开始悬浮培养(悬浮培养开始后第0天，步骤(1)开始)。
悬浮培养开始后第2天，以每孔100μl加入不含有Y27632，且包含IWP-2，SB-431542，BMP4的无血清培养基(步骤(2)开始)。关于BMP4，在添加的培养基中添加3nM，使得孔中终浓度为1.5nM。
进一步，悬浮培养开始后第3天，使用不含有Y27632和BMP4，且包含IWP-2，SB-431542及K02288(BMP信号转导途径抑制物质，AdooQ Bioscience公司制)的无血清培养基进行半量培养基交换(步骤(3b)开始)。K02288，在添加的培养基中添加20μM，使得孔中终浓度为10μM。之后，悬浮培养开始后第6天和第10天，使用不含有Y27632和BMP4，且包含IWP-2，SB-431542及K02288的无血清培养基进行半量培养基交换。
悬浮培养开始后第13天，使用倒置显微镜进行明场观察(图6的A)。其结果，通过上述诱导分化法从人ES细胞形成了直径约600μm前后的球状的细胞聚集体。
依照与比较实验1同样的方法进行了悬浮培养开始后第13天的细胞聚集体的荧光免疫染色。作为一次抗体使用了表1中记载的染色基板及非神经上皮组织的抗Dlx5抗体，抗Six1抗体，抗泛细胞角蛋白(PanCK)抗体及抗E-钙黏着蛋白抗体，染色基板及神经上皮组织的抗N-钙黏着蛋白抗体，染色基板及神经系统细胞的抗Sox1抗体，抗Sox2抗体，抗Sox3抗体，抗Pax6抗体及抗Sp8抗体，在胚产生的早期染色外胚层的抗AP2α抗体，染色胚的前方区域的抗Otx2抗体。作为荧光标记二次抗体，使用了比较实验2中记载的抗体进行多重染色，在核的对比染色中使用了Hoechst33342。染色结果为阳性和阴性的判断与预备实验1同样进行。
将染色结果示于图6及图7。可知通过上述诱导分化法诱导的悬浮培养开始后第13天的细胞聚集体的内侧为由Sox1，Sox2，Sox3，Sp8，N-钙黏着蛋白阳性的中枢神经系统的细胞或其前体细胞构成的组织，外侧为Dlx5，Pax6，AP2α，Six1，Sp8，Sox2，Sox3，泛细胞角蛋白，E-钙黏着蛋白，N-钙黏着蛋白阳性的非神经上皮组织或基板(图6的B～L，图7的M～R)。在外侧形成的上皮组织基本为单层，没有观察到肥大，因此可知，在培养第13天为前基板区域及基板前体细胞的状态。另外，任意细胞均为Otx2阳性，因此可知诱导了胚的前方区域(图6的J)。在内侧的Sox1阳性的中枢神经系统的细胞或其前体细胞和，在外侧形成的泛细胞角蛋白阳性的非神经上皮组织之间，没有观察到骨前体细胞样的细胞。将通过上述培养方法形成的细胞聚集体的示意图示于图7的S。
[实验2：从ES细胞制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块]
在实验2中，与进行实验1相同的实验操作，如图8的上部分所示，培养时期比实验1延长，制备成包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块。与实验1同样进行步骤(a)，步骤(1)及步骤(2)之后，在悬浮培养开始后第3天，使用不含有Y27632和BMP4，且包含IWP-2，SB-431542，K02288的无血清培养基进行半量培养基交换(步骤(3b)开始)。之后，在悬浮培养开始后第6，10，13，17，21，24天，使用不含有Y27632和BMP，且包含IWP-2，SB-431542及K02288的无血清培养基进行半量培养基交换。
在悬浮培养开始后第28天，使用倒置显微镜进行明场观察(图8的A)。其结果，可知与实验1同样从人ES细胞形成了直径约600μm前后的球状的细胞团块。
依照与比较实验1同样的方法进行了悬浮培养开始后第28天的细胞团块的荧光免疫染色。作为一次抗体使用了表1中记载的染色嗅上皮基板的抗Dlx5抗体，抗Six1抗体，抗泛细胞角蛋白(PanCK)抗体，抗E-钙黏着蛋白抗体及抗Otx2抗体，染色嗅上皮周缘部的抗Pax6抗体及Pbx1/2/3/4，染色嗅上皮基板及中枢神经系统的细胞的抗N-钙黏着蛋白抗体，抗Sox2抗体，抗Sp8抗体及抗Emx2抗体，染色嗅神经细胞及其前体细胞的抗Ebf1抗体，抗NCAM抗体，抗钙网膜蛋白抗体及抗NeuroD抗体，染色中枢神经系统的细胞的抗Bf1抗体，染色中枢神经系统的细胞及嗅神经细胞的抗Tuj1抗体，染色神经视网膜的抗Chx10抗体，染色神经视网膜及嗅神经细胞的抗Lhx2抗体。作为荧光标记二次抗体，使用了比较实验2中记载的抗体进行多重染色，在核的对比染色中使用了Hoechst33342。染色结果为阳性和阴性的判断与预备实验1同样进行。
将染色结果示于图8及图9。在悬浮培养开始第28天，形成了细胞团块，其为包含外侧为E-钙黏着蛋白，N-钙黏着蛋白，泛细胞角蛋白，Sox2，Sixl，Dlx5，Sp8，Pax6，Otx2阳性的基板样(嗅上皮样组织)的非神经上皮组织部，内侧为E-钙黏着蛋白，泛细胞角蛋白阴性且N-钙黏着蛋白，Sox2，Sp8，Bf1，Emx2，Tuj1阳性的构成中枢神经系统(大脑)的神经系统细胞或其前体细胞的神经组织部。另外，外侧的基板样的上皮组织(嗅上皮样组织)中一部分的细胞为Lhx2，Ebf2，Tuj1，NCAM，钙网膜蛋白阳性的嗅神经细胞或其未成熟的前体细胞。在细胞团块的外侧，形成了Pax6阳性的嗅上皮周缘部。另外，在嗅上皮样组织的基底面中，观察到NeuroD阳性的细胞(图8B～M，图9N～AI)。根据以上可知，通过将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，将得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下培养后，进一步在BMP信号转导途径阻用物质的存在下培养，由此可以制备细胞团块，所述细胞团块含有1)包含嗅神经细胞或其前体细胞的非神经上皮组织部，及2)包含神经系统细胞或其前体细胞的神经组织部，其中，神经系统细胞或其前体细胞包含构成中枢神经系统的神经系统细胞或其前体细胞，且神经组织部的表面的至少一部分包覆有非神经上皮组织部。另外，非神经上皮组织部中包含存在嗅神经细胞或其前体细胞的嗅上皮样组织，嗅上皮样组织中包含嗅上皮内侧部和嗅上皮周缘部。通过上述制备方法形成的细胞团块的示意图示于图10。
[实验3：从人iPS细胞制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块]
实验3中，如图11的上部分所示，取代实验2中进行的在BMP信号转导途径抑制物质的存在下的培养步骤(3b)，而是进行在为FGF信号转导途径作用物质的FGF2的存在下的培养步骤(3a)，制备了包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块。另外，作为多潜能干细胞使用了人iPS细胞(HC-6#10株，从理化学研究所获取)。此外，培养时期设为21天。除了特别示出的操作以外，均进行与实验1相同的操作。
具体而言使用保持培养的人iPS细胞，进行步骤(a)，步骤(1)及步骤(2)之后，在悬浮培养开始后第3天，使用不含有Y27632和BMP4，且包含IWP-2，SB-431542，FGF2及肝素钠的无血清培养基进行半量培养基交换(步骤(3a)开始)。FGF2(FGF信号途径作用物质，富士胶片和光纯药股份有限公司制)和肝素钠(富士胶片和光纯药股份有限公司制)在添加的培养基中分别添加40ng/ml，20μg/ml，使得孔中终浓度为20ng/ml，10μg/ml。之后，在悬浮培养开始后第6，10，13，17天，使用不含有Y27632和BMP4，且包含IWP-2，SB-431542，FGF2及肝素钠的无血清培养基进行半量培养基交换。
在悬浮培养开始后第21天，使用倒置显微镜进行明场观察(图11的A，B)。其结果，可知与实验1中从人ES细胞形成的情况同样，从人iPS细胞形成了直径约600μm前后的球状的细胞团块。
依照与比较实验1同样的方法进行了悬浮培养开始后第21天的细胞团块的荧光免疫染色。作为一次抗体使用了表1中记载的染色神经系统的细胞的抗Tuj1抗体及抗NCAM抗体，染色神经视网膜及其前体细胞的抗Chx10抗体，染色基板及非神经上皮组织的抗Six1抗体，抗泛细胞角蛋白(PanCK)抗体，抗E-钙黏着蛋白抗体及抗EpCAM抗体，染色基板及神经上皮组织的抗N-钙黏着蛋白抗体，染色基板及神经系统细胞的抗Sox2抗体及抗Pax6抗体，染色嗅上皮基板及中枢神经系统细胞的抗Sp8抗体，染色胚的前方区域的抗Otx2抗体，染色嗅神经细胞及其前体细胞的抗Ebf1抗体及抗Ebf2抗体。作为荧光标记二次抗体，使用了比较实验2中记载的抗体进行多重染色。在核的对比染色中使用了Hoechst33342。染色结果为阳性和阴性的判断与预备实验1同样进行。
将染色结果示于图11及图12。在悬浮培养开始第21天，形成了为外侧为E-钙黏着蛋白，N-钙黏着蛋白，泛细胞角蛋白，EpCAM，Sox2，Six1，Sp8阳性的基板样(嗅上皮样组织)的非神经上皮组织部，内侧为E-钙黏着蛋白，泛细胞角蛋白，EpCAM阴性且N-钙黏着蛋白，NCAM，Tuj1，Chx10阳性的神经视网膜的神经上皮组织的细胞团块。为Otx2阳性，因此可知形成了胚的前方区域的组织。另外，外侧的基板样的上皮组织(嗅上皮样组织)中一部分的细胞为Ebf1，Ebf2，Tuj1，NCAM阳性的嗅神经细胞或其未成熟的前体细胞(图11C～N，图12O～Z)。根据以上可知，通过将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，将得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下培养后，进一步在FGF信号转导途径作用物质的存在下培养，由此可以制备细胞团块，所述细胞团块含有1)包含嗅神经细胞或其前体细胞的非神经上皮组织部，及2)包含神经系统细胞或其前体细胞的神经组织部，其中，神经系统细胞或其前体细胞包含构成中枢神经系统的神经系统细胞或其前体细胞，且神经组织部的表面的至少一部分包覆有上述非神经上皮组织部。另外，可知细胞团块的内部的神经组织部形成上皮结构，神经系统细胞或其前体细胞中包含构成视网膜的细胞。通过上述制备方法形成的细胞团块的示意图示于图12的AA。
[实验4：从人iPS细胞制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块]
实验4中，如图13的上部分所示，在步骤(3)中，首先进行FGF信号转导途径作用物质的存在下培养的步骤(3a)后，在FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质的存在下培养的步骤(3c)，制备了包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块。培养时期设为28天。除了特别示出的操作以外，均进行与实验3相同的操作。
具体而言使用保持培养的人iPS细胞，进行步骤(a)，步骤(1)及步骤(2)之后，在悬浮培养开始后第3天，使用不含有Y27632和BMP4，且包含IWP-2，SB-431542，FGF2及肝素钠的无血清培养基进行半量培养基交换(步骤(3a)开始)。关于FGF2和肝素钠，在添加的培养基中分别以40ng/ml，20μg/ml添加，使得孔中终浓度为20ng/ml，10μg/ml。之后，在悬浮培养开始后第6，10天，使用不含有Y27632和BMP4，且包含IWP-2，SB-431542，FGF2及肝素钠的无血清培养基进行半量培养基交换。进一步在悬浮培养开始后第13天，除上述物质以外开始以终浓度1μM包含K02288的培养基进行的培养(步骤(3c)开始)，在第17，21，24天，利用包含IWP-2，SB-431542，FGF2，肝素钠及K02288的培养基实施半量培养基交换。
悬浮培养开始后第28天，使用倒置显微镜进行明场观察(图13的A)。其结果，可知与实验1中从人ES细胞形成的情况同样，从人iPS细胞形成了直径约600μm前后的球状的细胞团块。
依照与比较实验1同样的方法进行了悬浮培养开始后第28天的细胞团块的荧光免疫染色。作为一次抗体使用了表1中记载的对于Dlx5，NeuroD1，NCAM，p63，Sox2，E-钙黏着蛋白，Pax6，Chx10，N-钙黏着蛋白，Six1，Sp8，EpCAM，Tuj1，Ebf2，泛细胞角蛋白的抗体。作为荧光标记二次抗体，使用了比较实验2中记载的抗体进行多重染色。在核的对比染色中，使用了Hoechst33342。染色结果为阳性和阴性的判断与预备实验1同样进行。
将染色结果示于图13及图14。在悬浮培养开始第28天，形成了为外侧为E-钙黏着蛋白，N-钙黏着蛋白，泛细胞角蛋白，EpCAM，Sox2，Six1，Sp8阳性的基板样(嗅上皮样组织)的非神经上皮组织部，内侧为E-钙黏着蛋白，泛细胞角蛋白，EpCAM阴性且N-钙黏着蛋白，NCAM，Tuj1，Chx10阳性的神经视网膜的神经上皮组织的细胞团块。另外，外侧的基板样的上皮组织(嗅上皮样组织)中一部分的细胞为NeuroD1，Ebf2，Tuj1，NCAM阳性的嗅神经细胞或其未成熟的前体细胞(图13B～M，图14N～U)。根据以上，通过将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，将得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下培养一定时期后，在FGF信号转导途径作用物质的存在下培养，进一步在FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质的存在下培养，由此制备了与实验3相同的细胞团块。另外，该细胞团块的内部的神经系统细胞或其前体细胞形成了神经视网膜的神经上皮组织。进一步，与实验3比较时，可知通过从悬浮培养开始第13天在FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质这两者的存在下培养，与在仅FGF信号转导途径作用物质的存在下培养时相比，更稳定地形成包含嗅神经细胞或其前体细胞的非神经上皮组织部。通过上述制备方法形成的细胞团块的示意图示于图14的V。
[实验5：从人iPS细胞制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞的团块]
实验5中，如图15的上部分所示，在实验4的条件中进一步在步骤(3c)中添加EGF信号转导途径作用物质，从人iPS细胞制备了包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块。除了特别示出的操作以外，均进行与实验3相同的操作。
具体而言使用保持培养的人iPS细胞，进行步骤(a)之后，将细胞接种到非细胞黏着性的96孔培养板(PrimeSurface 96V底板)中，进行步骤(1)，步骤(2)及步骤(3a)之后，在悬浮培养开始后第13天，在上述物质基础上，以添加了为终浓度1μM的K02288，为终浓度20ng/ml的人重组EGF(EGF信号转导途径作用物质，PrimeGene公司制)(步骤(3c)开始)，第17，21，24天，利用包含IWP-2，SB-431542，FGF2，肝素钠，K02288及EGF的培养基实施半量培养基交换。
悬浮培养开始后第28天，使用倒置显微镜进行明场观察(图15的A)。其结果，可知与实验1中从人ES细胞形成的情况同样，从人iPS细胞形成了直径约600μm前后的球状的细胞团块。
依照与比较实验1同样的方法进行了悬浮培养开始后第28天的细胞团块的荧光免疫染色。作为一次抗体使用了表1中记载的对于Dlx5，NeuroD1，NCAM，p63，Sox2，E-钙黏着蛋白，Pax6，Chx10，N-钙黏着蛋白，Six1，Sp8，EpCAM，Tuj1，Ebf2，泛细胞角蛋白的抗体。作为荧光标记二次抗体，使用了比较实验2中记载的抗体进行多重染色，在核的对比染色中，使用了Hoechst33342。染色结果为阳性和阴性的判断与预备实验1同样进行。
将染色结果示于图15及图16。在悬浮培养开始第28天，形成了为外侧为E-钙黏着蛋白，N-钙黏着蛋白，泛细胞角蛋白，EpCAM，Sox2，Six1，Sp8阳性的基板样(嗅上皮样组织)的非神经上皮组织部，内侧为E-钙黏着蛋白，泛细胞角蛋白，EpCAM阴性且N-钙黏着蛋白，NCAM，Tuj1，Chx10阳性的神经视网膜的神经上皮组织的细胞团块。另外，外侧的基板样的上皮组织(嗅上皮样组织)中一部分的细胞为NeuroD1，Ebf2，Tuj1，NCAM阳性的嗅神经细胞或其未成熟的前体细胞(图15B～M，图16N～U)。根据以上，通过将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，将得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下培养后，进一步在FGF信号转导途径作用物质的存在下培养一定时期后，在FGF信号转导途径作用物质，BMP信号转导途径抑制物质及EGF信号转导途径作用物质的存在下培养，由此制备了与实验3相同的细胞团块。另外，可知该细胞团块的内部的神经系统细胞或其前体细胞形成了神经视网膜的神经上皮组织。进一步，与实验3比较时，可知通过从悬浮培养开始第13天在FGF信号转导途径作用物质，BMP信号转导途径抑制物质的基础上在EGF信号转导途径作用物质的存在下培养，由此与仅在FGF信号转导途径作用物质的存在下培养时相比，更稳定地形成了包含嗅神经细胞或其前体细胞的非神经上皮组织部。
[实验6：从人iPS细胞制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块]
实验6中，如图17的上部分所示，作为步骤(3)，首先进行步骤(3c)，从步骤(3c)的中途添加EGF，进一步在其之后作为第二Wnt信号转导途径抑制物质在XAV939的存在下进行培养，制备了包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块。除了特别示出的操作以外，均进行与实验3相同的操作。
具体而言使用保持培养的人iPS细胞，在开始步骤(a)，步骤(1)及步骤(2)之后，在悬浮培养开始后第3天，使用不含有Y27632和BMP4，且包含IWP-2，SB-431542，FGF2，肝素钠及K02288的无血清培养基进行半量培养基交换(步骤(3c)开始)。使得FGF2和肝素钠及K02288的孔中终浓度为20ng/ml，10μg/ml及1μM。之后，在悬浮培养开始后第6，10天，使用不含有Y27632和BMP4，且包含IWP-2，SB-431542，FGF2，肝素钠及K02288的无血清培养基进行半量培养基交换。进一步在悬浮培养开始后第13天，在上述因子的基础上添加EGF(PrimeGene公司制)使得终浓度为20ng/ml。进一步在悬浮培养开始后第17天，在IWP-2，SB-431542，FGF2，肝素钠，K02288及EGF基础上，添加XAV939(Cayman Chemicals公司制)使得终浓度为300nM，在悬浮培养开始后第21天及第24天实施半量培养基交换。
悬浮培养开始后第28天，使用倒置显微镜进行明场观察(图17的A)。其结果，可知与实验1中从人ES细胞形成的情况同样，从人iPS细胞形成了直径约600μm前后的球状的细胞团块。
依照与比较实验1同样的方法进行了悬浮培养开始后第28天的细胞团块的荧光免疫染色。作为一次抗体，除了在表1中记载的对于Dlx5，NeuroD1，NCAM，p63，Sox2，E-钙黏着蛋白，Pax6，Chx10，N-钙黏着蛋白，Six1，Sp8，EpCAM，Tuj1，Ebf2，泛细胞角蛋白，Lhx2，钙网膜蛋白，Otx2的抗体以外，使用了染色未成熟的神经细胞及神经嵴的抗巢蛋白抗体，染色嗅上皮基板及中枢神经系统的一部分的神经核的抗Islet-1抗体，染色上皮细胞的抗β-连环蛋白抗体，染色顶端面的抗PKCζ抗体，染色基底膜的抗层粘连蛋白抗体，染色非神经上皮的抗CK8抗体，染色基板的抗Eya2抗体。作为荧光标记二次抗体，使用了比较实验2中记载的抗体进行多重染色。在核的对比染色中，使用了Hoechst33342。染色结果为阳性和阴性的判断与预备实验1同样进行。
将染色结果示于图17～图19。悬浮培养开始第28天，形成了一部分形成外侧为E-钙黏着蛋白，N-钙黏着蛋白，泛细胞角蛋白，EpCAM，Sox2，Six1，Sp8，Eya2，Islet-1，β-连环蛋白阳性的基板样(嗅上皮样组织)的非神经上皮组织部，内侧为E-钙黏着蛋白，泛细胞角蛋白，EpCAM阴性且N-钙黏着蛋白，NCAM，Tuj1，Chx10阳性的神经视网膜的神经上皮组织的细胞团块。在细胞团块的外侧的嗅上皮样组织中，外侧为PKCζ阳性的顶端面，内侧为层粘连蛋白阳性的基底面，产生了顶端面-基底面的极性。另外，外侧的基板样的上皮组织(嗅上皮样组织)中一部分的细胞为Lhx2，NeuroD1，Ebf2，Tuj1，钙网膜蛋白及NCAM阳性的嗅神经细胞或其未成熟的前体细胞。(图17B～M，图18N～AE，图19AF～AJ)。从上述结果可知，通过将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，将得到的细胞聚集体在BMP信号转导途径作用物质的存在下培养后，进一步在FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质的存在下培养，另外，添加EGF信号转导途径作用物质及第二Wnt信号转导途径原料物质，由此可制备与实验3相同的细胞团块。另外，可知该细胞团块的内部的神经系统细胞或其前体细胞形成了神经视网膜的神经上皮组织。进一步，与实验3比较时，可知通过在悬浮培养开始第13天添加EGF，在悬浮培养开始第17天添加新的第二Wnt途径抑制物质，与没有添加它们的条件相比，更稳定地形成包含嗅神经细胞或其前体细胞的非神经上皮组织部。形成的细胞团块的示意图示于图19的AK。
[实验7：细胞团块的制备中BMP信号转导途径作用物质的添加浓度的研究]
在实验7中，使用人ES细胞进行了由步骤(2)中BMP信号转导途径作用物质的浓度带来的细胞团块的制备效率的研究。进行与实验2(参考图8上部分)相同的实验操作，在步骤(2)中，将BMP4在培养基中的浓度设为0.025nM，0.1nM，0.25nM，0.5nM，1.5nM，5nM及无添加对照这7个条件。
悬浮培养开始后第28天，使用倒置显微镜进行明场观察。其结果，可知除了没有添加BMP信号转导途径作用物质的对照以外，利用任意的BMP4浓度时均与实验1同样从人ES细胞形成了直径约600μm前后的球状的细胞团块。
进一步，对添加各浓度的BMP4而形成的细胞团块评价为周围整体的80％以上被非神经上皮组织部包覆的接近球状的形态的细胞团块(第1级，例＝图20的A)，周围整体40％至80％为被非神经上皮组织部包覆的细胞团块或形状变形的细胞团块(第2级，例＝图20的B)，细胞团块表面的非神经上皮组织部的比例为40％以下的细胞团块(第3级，例＝图20的C)，完全不形成非神经上皮组织部的细胞团块(第4级，例＝图20的D)的4个阶段。评价通过使用倒置显微镜的明场观察进行。其结果，如图20的E所示，在没有添加BMP4的培养条件下，未观察到非神经上皮组织部。在步骤(2)中添加0.5nM以上的BMP4的培养条件下，高效率地形成了周围整体的80％以上被非神经上皮组织部包覆，为接近球状的形态的第1级的细胞团块。因此可知，在含有包含嗅神经细胞或其前体细胞的非神经上皮组织部的细胞团块的有效制备中，在步骤(2)中添加的BMP4的浓度优选为0.5nM以上。
[实验8：对细胞团块的制备中诱导分化开始前的前处理的研究]
实验8中，使用人iPS细胞进行了由前处理步骤(a)的有无带来的细胞团块的制备效率的研究。实验依照图21的上部分所示的顺序进行，除了特别示出的操作以外，进行与实验1相同的实验操作。将保持培养的人iPS细胞在接种到6孔板的6天后，与StemFit培养基的培养基交换同时，分为添加(1)仅与其它条件相同量的DMSO(对照)，(2)仅300nM SAG，(3)仅5μM SB-431542，(4)5μM SB431542及300nM SAG的4个条件进行前处理。
从步骤(a)的开始24小时之后，与实验1同样进行，在Y27632(终浓度20μM)，SB-431542(终浓度1μM)及IWP-2(终浓度2μM)的存在下开始悬浮培养(步骤(1)开始)，在悬浮培养开始后第2天使用不含有Y27632，且包含IWP-2，SB-431542及BMP4(终浓度1.5nM)的培养基进行半量培养基交换(步骤(2)开始)。在悬浮培养开始后第3天使用不含有Y27632和BMP4，且包含IWP-2，SB-431542，FGF2，肝素钠及K02288的无血清培养基进行半量培养基交换(步骤(3c)开始)。使得FGF2，肝素钠及K02288的孔中终浓度为20ng/ml，10μg/ml及1μM。之后，在悬浮培养开始后第6，10天，使用不含有Y27632和BMP4，且包含IWP-2，SB-431542，FGF2，肝素钠及K02288的无血清培养基进行半量培养基交换。
在悬浮培养开始后第13天，使用倒置显微镜进行明场观察(图21的A～G)。由没有实施前处理的人iPS细胞形成的细胞聚集体与(2)～(4)中进行前处理细胞聚集体相比，聚集体的直径更小。另外，对于细胞聚集体的外侧的非神经上皮组织的形成情况而言也在孔间观察到偏差，观察到形成了非神经上皮组织的细胞聚集体，也观察到没有形成的细胞聚集体(图21的A～D)。另一方面，由在(2)仅SAG，(3)仅SB-431542，(4)SAG+SB-431542中的任一条件下实施了前处理的细胞形成的细胞聚集体中，90％以上直径大于对照，也有效地形成了表面的非神经上皮组织(图21的E～G)。
进一步，对于从在各条件下进行了前处理的人iPS细胞形成的聚集团块，与实验7同样进行了第1～4级的4个阶段的评价。其结果，如图21的H所示，在(2)仅SAG，(3)仅SB-431542，(4)SAG+SB-431542的任一条件下实施了前处理的情况下，高效率地稳定地得到周围整体的80％以上被非神经上皮组织部包覆，接近球状的形态的第1级的细胞聚集体。因此，可知在包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的有效地制备中，优选在(2)仅SAG，(3)仅SB-431542，(4)SAG+SB-431542的任一条件下实施前处理。
[实验9：细胞团块的制备中第一Wnt信号转导途径抑制物质的研究]
实验9中，使用人iPS细胞进行了由第一Wnt信号转导途径抑制物质的种类带来的细胞团块的制备效率的研究。依照图22的上部分所示的顺序进行实验，除了特别示出的操作以外，进行与实验1相同的实验操作。将保持培养及进行了步骤(a)的人iPS细胞，利用添加第一Wnt信号转导途径抑制物质，Y27632(终浓度20μM)及SB-431542(终浓度1μM)的培养基开始悬浮培养。
作为第一Wnt信号转导途径抑制物质，使用了IWP-2(Tocris Bioscience公司制，终浓度2μμM)，IWP-3(Cayman Chemicals公司制，终浓度2μM)，IWP-4(Cayman Chemicals公司制，终浓度2μM)，Wnt C-59(Cayman Chemicals公司制，终浓度20nM)，KY02111(CaymanChemicals公司制，终浓度1μM)。作为第一Wnt信号转导途径抑制物质无添加的对照，添加了DMSO。
在悬浮培养开始后第2天，以每孔100μl加入不含有Y27632，且各包含第一Wnt信号转导途径抑制物质，SB-431542及BMP4(终浓度1.5nM)的无血清培养基。进一步，在悬浮培养开始后第3天，使用不含有Y27632和BMP4，且S包含B-431542，K02288，FGF2，肝素钠及EGF的无血清培养基进行半量培养基交换。使得K02288，FGF2，肝素钠，EGF的孔中终浓度为10μM，20ng/ml，10μg/ml及20ng/ml。在悬浮培养开始后第6，10，13，17，21，24天，使用不含有Y27632和BMP4，且各包含第一Wnt信号转导途径抑制物质和SB-431542，K02288，FGF2，肝素钠及EGF的无血清培养基进行半量培养基交换。
在悬浮培养开始后第28天，使用倒置显微镜进行明场观察(图22的A～F)。可知除了没有添加第一Wnt信号转导途径抑制物质的条件以外，均与实验3同样，形成了在外侧形成了非神经上皮样的组织的球状的细胞团块。
依照与比较实验1同样的方法进行了悬浮培养开始后第28天的细胞团块的荧光免疫染色。作为一次抗体，使用了表1中记载的染色基板及非神经上皮组织的抗Six1抗体及抗泛细胞角蛋白抗体，染色基板及神经系统细胞的抗Sox2抗体。作为荧光标记二次抗体使用了表2中记载的Alexa488标记驴抗兔抗体，CF555标记驴抗山羊抗体及Alexa647标记驴抗小鼠抗体进行多重染色。核的对比染色中使用了Hoechst33342。染色结果为阳性和阴性的判断与预备实验1同样进行。
将染色结果示于图23。在没有添加第一Wnt信号转导途径抑制物质的条件下，即使从悬浮培养开始第2天添加BMP4，在细胞聚集体的表面也没有形成非神经上皮组织。另一方面，在从悬浮培养开始时刻添加IWP-2，IWP-3，IWP-4，Wnt C-59，KY02111的各条件中，形成了在内侧存在神经上皮样的聚集体，在表面具有非神经上皮组织的聚集体。进一步，荧光免疫染色的结果可知，在添加了各种第一Wnt信号转导途径抑制物质的条件下，在细胞团块表面的非神经上皮中形成为Six1，Sox2，细胞角蛋白阳性且肥大的嗅上皮基板样的组织(图23G)。从上述结果可知，第一Wnt信号转导途径抑制物质的添加对于由BMP信号转导途径作用物质的添加带来的包含嗅上皮基板样的非神经上皮组织的细胞团块的制备有用。
[实验10：使用三维培养器的细胞团块的制备]
实验10中，使用与实验5不同的培养容器培养人iPS细胞，在悬浮培养开始第4天，进行BMP信号转导途径抑制物质的洗涤而进行了细胞团块的制备。实验按照图24的上部分所示的顺序，除了特别示出的实验操作以外，同样进行了实验3。
具体而言，使用保持培养的人iPS细胞，进行步骤(a)之后，将分散成单一细胞的人iPS细胞在非细胞黏着性的96孔三维培养器(PrimeSurface 96狭缝孔板，MS-9096S，住友Bakelite股份有限公司制)中以使其成为每孔1×104细胞的方式悬浮在100μl的无血清培养基中，在37℃，5％CO2的条件下进行悬浮培养。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始后第0天，步骤(1)开始)，在上述无血清培养基中添加了Y27632(终浓度20μM)，IWP-2(终浓度2μM)，SB-431542(终浓度1μM)。
在悬浮培养开始后第2天，每块板添加19.2ml的不含有Y27632，且包含IWP-2，SB-431542及BMP4的无血清培养基(步骤(2)开始)。关于BMP4，在添加的培养基中添加2.25nM，使得培养基中的终浓度为1.5nM。
在悬浮培养开始后第3天，使用不含有Y27632及BMP4，且包含IWP-2，SB-431542，K02288(终浓度10μM)，FGF2(终浓度20ng/ml)，EGF(终浓度20ng/ml)及肝素钠(终浓度10μg/ml)的无血清培养基进行半量培养基交换(步骤(3c)开始)。对于K02288，FGF2，EGF及肝素钠，在添加的培养基中以2倍的浓度添加，使得孔中终浓度为记载的浓度。接着，在悬浮培养开始后第4天，将板中的培养基用移液器吸引除去，进行3次利用15ml的IMDM和F-12的1∶1混合液的洗涤操作，进一步添加不含有Y27632，BMP4及K02288，且包含IWP-2，SB-431542，FGF2，EGF及肝素钠的培养基30ml，将板中的K02288尽可能地除去(步骤(3d)开始)。在悬浮培养开始后第10，13，17天，使用不含有Y27632，BMP4及K02288，且包含IWP-2，SB-431542，FGF2，EGF及肝素钠的无血清培养基进行半量培养基交换。
在悬浮培养开始后第28天，使用倒置显微镜进行明场观察(图24的A及B)。使用为三维培养器的狭缝孔板，即使在培养中途从培养基中除去BMP信号转导途径抑制物质的诱导分化条件下，也形成了在外侧具有肥大的嗅上皮样的非神经上皮组织的细胞团块。
[实验11：对细胞团块的制备中BMP信号转导途径作用物质的添加时期的研究]
在实验11中，使用人iPS细胞，将BMP信号转导途径作用物质的添加时期，即步骤(2)的开始时期从悬浮培养开始后第1天到第6天进行变化，进行了细胞团块的制备效率的研究。实验依照图25上部分所示的顺序进行，除了特别记载的实验操作以外，与实验1同样进行。
使用保持培养人iPS细胞，进行步骤(a)之后，将分散成单一细胞的人iPS细胞在非细胞黏着性的96孔三维培养器(PrimeSurface 96狭缝孔板，MS-9096S，住友Bakelite股份有限公司制)以使其成为每孔1×104细胞的方式悬浮在100μl的无血清培养基中，在37℃，5％CO2的条件下进行悬浮培养。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始后第0天，步骤(1)开始)，在上述无血清培养基中添加了Y27632(终浓度20μM)，IWP-2(终浓度2μM)，SB-431542(终浓度1μM)。
悬浮培养开始后第1，2，3，4，6天中的任一时刻，以每孔100μl加入不含有Y27632，且包含IWP-2，SB-431542，BMP4的无血清培养基(步骤(2)开始)。关于BMP4，在添加的培养基中添加3nM，使得孔中终浓度为1.5nM。
进一步，在添加包含BMP4的无血清培养基的次日，使用不含有Y27632和BMP4，且包含SB-431542，K02288，FGF2及肝素钠，EGF的无血清培养基进行半量培养基交换(步骤(3c)开始)。K02288，FGF2，肝素钠及EGF在添加的培养基中分别添加20μM，40ng/ml，20μg/ml，40ng/ml，使得孔中的终浓度为10μM，20ng/ml，10μg/ml，20ng/ml。之后，在悬浮培养开始后第6，10天，使用不含有Y27632和BMP4，且包含IWP-2，SB-431542，FGF2，肝素钠及K02288的无血清培养基进行半量培养基交换。在悬浮培养开始后第4及6天添加BMP4的条件下，在悬浮培养开始后第3天添加了100μl仅包含SB-431542和IWP-2的培养基，在即将加入添加有BMP4的培养基前，从孔中除去100μl的培养基。
悬浮培养开始后第13天，使用倒置显微镜进行明场观察(图25的A～E)。在悬浮培养开始后第1，2，3天任一时刻添加BMP4的条件下，在细胞聚集体的表面形成了非神经上皮组织，进一步在悬浮培养开始后第2天添加了BMP4的条件下，细胞聚集体的直径更大，最有效稳定地形成了在表面具有非神经上皮组织的细胞聚集体(图25的A～C)。另一方面，在悬浮培养开始后第4或6天添加BMP4的条件中，仅形成了有神经视网膜的程度厚的神经上皮，没有观察到在细胞聚集体的表面有非神经上皮组织的形成(图25的D，E)。从上述结果可知，为了制备包含神经组织部及非神经上皮组织部的细胞团块，优选在悬浮培养开始后96小时以内开始进行添加BMP信号转导途径作用物质的步骤(2)，更优选在悬浮培养开始后24小时以后且72小时以内添加BMP信号转导途径作用物质。
[实验12：细胞团块的制备中步骤(2)的开始时期的研究]
实验12中，观察从悬浮培养开始后第2天到第6天的细胞聚集团块的表面，进行了BMP信号转导途径作用物质的适当的添加时期的研究。实验依照图26上部分所示的顺序进行，除了特别示出的实验操作以外，与比较实验1同样进行。
使用保持培养人iPS细胞，进行步骤(a)之后，将分散成单一细胞的人iPS细胞在非细胞黏着性的96孔三维培养器(PrimeSurface 96狭缝孔板，MS-9096S，住友Bakelite股份有限公司制)以使其成为每孔1×104细胞的方式悬浮在100μl的无血清培养基中，在37℃，5％CO2的条件下进行悬浮培养。在悬浮培养开始时(悬浮培养开始后第0天，步骤(1)开始)，在上述无血清培养基中添加了Y27632(终浓度20μM)，IWP-2(终浓度2μM)及SB-431542(终浓度1μM)。
在悬浮培养开始后第2，3，4，6天中的任一时刻使用倒置显微镜进行明场观察(图26的A～D)。对悬浮培养开始后第2天的聚集体而言，在表面观察到凹凸，变形的形状，与此相对，在悬浮培养开始后第3，4，6天的聚集体中，在第2天观察到的凹凸减少，呈现接近球体的形状(图26的B～D)。
依照与比较实验1同样的方法，进行了悬浮培养开始后第2，3，4，6天的细胞团块的荧光免疫染色。作为一次抗体使用了表1中记载的染色紧密连接的抗ZO-1抗体。作为荧光标记二次抗体使用了Alexa488标记驴抗兔抗体，在核的对比染色中使用了Hoechst33342。染色结果为阳性和阴性的判断与预备实验1同样进行。
将染色结果示于图26。在悬浮培养开始后第2天的细胞聚集体中，聚集体的最表层的细胞的一部分为ZO-1阳性，形成了紧密连接(图26的E)。在悬浮培养开始后第3，4，6天的细胞聚集体中，表层的ZO-1阳性的细胞的比例明显发生减少(图26的F～H)。如实验11中记载的那样，制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块时，悬浮培养开始后第2天为优选的BMP信号转导途径作用物质的添加时期，从实验12的结果可知，在包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备过程中，作为用于确定BMP信号转导途径作用物质的添加时期的办法，能够利用在细胞聚集体的最表层的细胞中的紧密连接的检测。
[实验13：在生物体的嗅上皮中表达的基因的分析]
在实验13中，从胚胎第14.5天的大鼠胚胎制备了包含嗅上皮的头部的冠状切片，进行免疫染色，与在本申请中记载的制备法制备的嗅上皮进行比较。从妊娠第14.5天的大鼠回收子宫内的胚肽，用PBS洗涤之后，用4％多聚甲醛-磷酸缓冲液(富士胶片和光纯药股份有限公司制)在室温固定1小时。将固定后的胚胎用PBS洗涤之后，为了保护冷冻时的组织而将固定后的胚在10％，20％，30％蔗糖/PBS溶液中依次浸渍到沉降。将冷冻保护处理之后的胚胎的颈部用解剖用剪刀切割，将其头部移至Cryomold<2号>(Sakura Finetek公司制)，将头部周围的多余30％蔗糖/PBS用微移液管除去，之后包埋在O.C.T混合(Sakura Finetek公司制)中，在干冰中冷却的铝散热块上急冻，制备成制备冷冻切片用的块。将包埋有上述胚肽的块利用Leica CM1950极低温冷冻机(Leica公司制)制备成10μm厚的冷冻切片，贴在薄片载玻片(PLATINUM PRO Coat slide glass)(松浪硝子工业股份有限公司制)上。将载玻片上的冷冻切片的周围用防水笔(Bio Medical Science股份有限公司制)圈起之后，用0.2％Triton-X100/TBS在室温透化处理10分钟，接着用封闭试剂N-102(日油股份有限公司制)和SuperBlock(TBS)封闭缓冲液(Thermo Fisher Scientific公司制)的体积比1∶4混合液在室温进行封闭处理30分钟。
对于封闭处理后的冷冻切片，对每张载玻片添加300μl的用Antibody Diluent OPQuanto(Thermo Fisher Scientific公司制)稀释的一次抗体，在湿箱中在4℃中反应一夜。将一次抗体处理后的冷冻切片利用0.05％Tween-20/TBS在室温处理10分钟并进行3次洗涤操作后，利用Blocking One Histo(Nacalai Tesque股份有限公司制)和0.2％Triton-X100/TBS以1∶19的比例混合的缓冲液稀释二次抗体，以每张载玻片300gl将稀释液添加到冷冻切片上，于室温反应1小时。将二次抗体处理后的冷冻切片利用0.05％Tween-20/TBS在室温处理10分钟并进行3次洗涤操作后，利用纯水将冷冻切片洗涤一次，之后，使用NEO盖玻片(松浪硝子工业股份有限公司制)和每张载玻片30μl的Prolong Diamond(Thermo FisherScientific公司制)将冷冻切片封入。将封入后的样本在室温的暗处静置一夜，使ProlongDiamond凝固后，用透明的指甲油包覆盖玻片的周围，在室温的暗处风干，之后，进行利用荧光显微镜的观察。样本的观察及图像的获得中使用了正立荧光显微镜Axio Imager m2(Carl Zeiss公司制)及附属软件Axio Vision。
作为荧光免疫染色使用的一次抗体，使用了表1中记载的对于Sox2，E-钙黏着蛋白，Otx2，β-连环蛋白，Dlx5，Tuj1，Ebf2，泛细胞角蛋白，PKCζ，EpCAM，层粘连蛋白的抗体，及染色嗅神经细胞的抗Ebf1抗体。作为荧光标记二次抗体使用了表2中记载的抗体，为了核的对比染色而将1μg/ml的Hoechst33342添加到二次抗体稀释液中。染色结果为阳性和阴性的判断与预备实验1同样进行。
将染色结果示于图27。可知生物体的嗅上皮为细胞角蛋白，EpCAM，β-连环蛋白，E-钙黏着蛋白阳性的非神经上皮的同时，存在Ebf1，Ebf2，Tuj1阳性的嗅神经细胞。进一步，表达了Otx2，Dlx5，Sox2等胚的前方区域的基板标记基因。此外，可知嗅上皮的表面为PKCζ阳性的顶端面，内侧为层粘连蛋白阳性的基底面，存在顶端-基底轴的极性。与上述结果进行比较时，可知以本申请中记载的方法制备的包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块中的组织成功地再现了与生物体的嗅上皮极其相似的结构。
[实验14：在细胞团块的制备中Wnt信号转导途径作用物质和抑制物质的组合使用的研究]
依照图28上部分所示的顺序，组合使用Wnt信号转导途径作用物质和抑制物质而制备了细胞团块。将人iPS细胞(HC-6#10株，从理化学研究所获取)通过与实验1同样的方法进行了保持培养及步骤(a)。使得每孔的细胞数为9×103细胞，除此以外，通过与实验1同样的方法利用96孔培养板开始进行悬浮培养。
在悬浮培养开始时(悬浮培养开始后第0天，步骤(1)开始)，在上述无血清培养基中添加了Y27632(终浓度20μM)，IWP-2(终浓度2μM)，SB-431542(终浓度1μM)。此外，作为Wnt信号转导途径作用物质添加了CHIR99021(Cayman Chemical公司制)使得终浓度为300nM。将为Wnt信号转导途径抑制物质的IWP-2，和为Wnt信号转导途径作用物质的CHIR99021组合使用的情况下，β连环蛋白依赖性的Wnt典型途径被活化，β连环蛋白非依赖性的Wnt-非典型性途径被抑制。
在悬浮培养开始后第2天，以每孔100μl加入不含有Y27632，且包含SB-431542，BMP4，IWP-2及CHIR99021的无血清培养基(步骤(2)开始)。关于BMP4，在添加的培养基中添加3nM，使得孔中终浓度为1.5nM。
在悬浮培养开始后第3天，使用不含有Y27632及BMP4，且包含IWP-2，SB-431542，FGF2及CHIR99021的无血清培养基进行半量培养基交换(步骤(3a)开始)。之后，在悬浮培养开始后第6天和第10天，使用不含有Y27632及BMP4，且包含IWP-2，SB-431542，FGF2，CHIR99021，K02288的无血清培养基进行半量培养基交换(步骤(3c)开始)。对K02288的浓度及添加时期而言，根据人iPS细胞株HC-6#10株而调整，在悬浮培养开始后第6天向添加的培养基中添加2μM，使得孔中终浓度为1μM。在悬浮培养开始后第13天，利用在包含IWP-2，SB-431542，FGF2，CHIR99021及K02288的培养基中以使得终浓度为20ng/ml的方式添加了2倍量的EGF的培养基进行半量培养基交换。在悬浮培养开始后第17天，利用包含IWP-2，SB-431542，FGF，CHIR99021，K02288，EGF的培养基进行半量培养基交换，培养到悬浮培养开始后第21天。在悬浮培养开始后第21天，使用倒置显微镜进行得到的细胞团块的明场观察。
可知从人iPS细胞株HC-6#10通过上述诱导分化法诱导的悬浮培养开始后第21天的细胞团块中，在添加了为Wnt信号转导途径抑制物质的IWP-2的条件下，即使添加其信号传导下游的Wnt信号转导途径激活物质CHIR99021，也在细胞团块的外侧形成了嗅上皮样组织。进一步，源自人iPS细胞株的细胞团块的内部的神经系统组织的死细胞减少，形成了更高品质的包含嗅上皮样组织的细胞团块(图28的A，B)。根据该结果显示，1)PORCN抑制剂的非神经上皮组织形成促进作用并不是由于β连环蛋白依赖性Wnt典型途径的阻碍导致的，2)一定程度(3μM CHIR99021以下左右)的β连环蛋白依赖性Wnt典型途径的活性，对细胞团块内部的神经组织的生存和上皮形成的促进发挥作用，根据ES细胞或iPS细胞的株的性质，Wnt信号转导途径抑制物质与Wnt信号转导途径激活物质的组合使用对制备优质的细胞团块有效。
[实验15：细胞团块的制备中TAK1抑制剂的效果的研究]
依照图29上部分所示的顺序，在步骤(3)中添加TAK1抑制剂而制备了细胞团块。将人iPS细胞(HC-6#10株，从理化学研究所获取)通过与实验1同样的方法进行了保持培养及步骤(a)。使得每孔的细胞数为9×103细胞，除此以外，通过与实验1同样的方法利用96孔培养板开始进行悬浮培养。
在悬浮培养开始时(悬浮培养开始后第0天，步骤(1)开始)，在上述无血清培养基中添加了Y27632(终浓度20μM)，IWP-2(终浓度2μM)，SB-431542(终浓度1μM)及CHIR99021(终浓度300nM)。
在悬浮培养开始后第2天，以每孔100μl加入不含有Y27632，且包含SB-431542，BMP4，IWP-2及CHIR99021的无血清培养基(步骤(2)开始)。关于BMP4，在添加的培养基中添加3nM，使得孔中终浓度为1.5nM。
在悬浮培养开始后第3天，使用不含有Y27632及BMP4，且包含IWP-2，SB-431542，FGF2，肝素钠及CHIR99021的无血清培养基进行半量培养基交换。进一步将TAK1抑制剂-5z-7-oxozeaenol(Cayman Chemical公司制)4μM添加到添加的培养基中，使得孔中终浓度为2μM(步骤(3a)开始)。之后，在悬浮培养开始后第6天和第10天，使用不含有Y27632和BMP4，且包含IWP-2，SB-431542，FGF2，肝素钠，CHIR99021，K02288及5z-7-oxozeaenol的无血清培养基进行半量培养基交换(步骤(3c)开始)。在悬浮培养开始后第13天，利用在包含IWP-2，SB-431542，FGF2，肝素钠，CHIR99021，K02288及5z-7-oxozeaenol的培养基中以使得终浓度为20ng/ml的方式添加了2倍量的EGF的培养基进行半量培养基交换。在悬浮培养开始后第17天，利用包含IWP-2，SB-431542，FGF2，肝素钠，CHIR99021，K02288，5z-7-oxozeaenol及EGF的培养基进行半量培养基交换，培养到悬浮培养开始后第21天。在悬浮培养开始后第21天，使用倒置显微镜进行得到的细胞团块的明场观察。
从人iPS细胞株HC-6#10通过上述诱导分化法诱导的悬浮培养开始后第21天的细胞团块，与在没有添加TAK1抑制剂的条件下制备的细胞团块相比，进一步有效地在细胞团块的表面形成了嗅上皮样组织(图29的A，B)。从该结果可知，通过在步骤(3)中，在TGF-β受体抑制剂，BMP受体抑制剂基础上，对为TGF-β受体和BMP受体的下游的细胞内信号转导因子的TAK1进行抑制，进一步有效地产生分化为基板和嗅上皮样组织的诱导。
[实验16：具有粘性的培养基中的细胞团块的制备及相同培养基中的细胞团块的成熟培养]
依照图30上部分所示的方法，将细胞团块在具有粘性的培养基中进行成熟培养。参考日本专利第6176770号公报，制备了具有粘性的培养基。具体而言，称量甲基纤维素(Sigma Aldrich公司制，viscosity：4000cP，M0512)3g，在放入搅拌子的500ml的广口培养基瓶中利用高压釜进行灭菌，之后添加了100ml的培养基。作为培养基，使用了在F-12+Glutamax培养基和IMDM+Glutamax培养基的体积比1∶1混合液中添加了5％Knockout血清替代品，10％胎牛血清(Biosera公司制)，450μM 1-一硫代甘油，1x化学成分确定的脂质浓缩物，50单位/ml青霉素-50μg/ml链霉素，20ng/ml FGF-TS，20ng/ml EGF，20ng/ml IGF-1(R&DSystems公司制)，10μg/ml肝素钠，1μM SB431542，1μM K02288，300nM CHIR99021，100nMEC23(视黄酸信号转导途径作用物质)的培养基。将添加了培养基的放入甲基纤维素的培养基瓶在低温室内，使用高粘度液体对应的搅拌器(ASAHI理化制备所制，AMG-H)搅拌一夜。次日，确认了是否没有未溶解的甲基纤维素后，在冰箱内静置3天，除去培养液中的气泡。根据该方法制备的含有3％甲基纤维素的培养基为糖浆状的具有高粘性的液体。
将用上述方法制备的具有粘性的培养基使用正向置换方式的移液器(MicoromanM1000，GLISON公司制)添加8ml到气体透过性的膜底6cm平皿(lumox平皿，94.6077.333，Sarstedt公司制)中，在CO2培养箱内进行平衡。之后，将用实验15中记载的方法制备的培养第21天的细胞团块从96孔板回收到15ml管中，用5％KSR gfCDM培养基洗涤一次后，转移到放入了5％KSR gfCDM培养基的悬浮培养用6cm平皿中。进一步，使用广口的移液器枪头回收平皿中的细胞团块，与培养基8μl一起一个个喷出到放入了具有粘性的培养基的平皿中。使每一个6cm平皿的细胞团块的数量为24个。将细胞团块转移结束的平皿在CO2培养箱内进行恢复，培养(步骤(3e)开始)。培养开始后3天或4天一次，使得均一的方式滴加包含400ng/mlFGF-TS，400ng/ml EGF的5％KSR gfCDM 500μl。在高粘性培养开始后第24天，从诱导分化开始起第45天，使用倒置显微镜进行明场观察。
从人iPS细胞株HC-6#10通过上述诱导分化法诱导的悬浮培养开始后第45天的细胞团块，在细胞团块的表面形成了更肥大的嗅上皮样组织(图30的A)。从该结果可知，在具有粘性的培养基中培养细胞团块为抑制组织的物理的损伤，在长期的培养中有效。另外可知，如果在此时的培养基中，除了诱导分化时使用的因子以外还添加IGF，血清及视黄酸信号转导途径作用物质，则可进一步有效地保持嗅上皮样组织。
[实验17：在细胞团块的制备中基底膜制品的效果的研究]
依照图31上部分所示的顺序，步骤(3)中在基底膜制品的存在下制备了细胞团块。将人iPS细胞(HC-6#10株，从理化学研究所获取)通过与实验1同样的方法进行了保持培养及步骤(a)。使得每孔的细胞数为9×103细胞，除此以外，通过与实验1同样的方法利用96孔培养板开始进行悬浮培养。
悬浮培养开始时(悬浮培养开始后第0天，步骤(1)开始)，在上述无血清培养基中添加Y27632(终浓度20μM)，IWP-2(终浓度2μM)，SB-431542(终浓度1μM)及CHIR99021(终浓度300nM)。
在悬浮培养开始后第2天，以每孔100μl加入不含有Y27632，且包含SB-431542，BMP4，IWP-2及CHIR99021的无血清培养基(步骤(2)开始)。关于BMP4，在添加的培养基中添加3nM，使得孔中终浓度为1.5nM。
在悬浮培养开始后第3天，使用不含有Y27632和BMP4，且包含IWP-2，SB-431542，FGF2，CHIR99021，肝素钠及5z-7-oxozeaenol的无血清培养基进行半量培养基交换(步骤(3a)开始)。之后，在悬浮培养开始后第6天和第10天，使用不含有Y27632和BMP4，且包含IWP-2，SB-431542，FGF2，CHIR99021，肝素钠，K02288及5z-7-oxozeaenol的无血清培养基进行半量培养基交换(步骤(3c)开始)。在悬浮培养开始后第13天，利用在包含IWP-2，SB-431542，FGF2，CHIR99021，肝素钠，K02288，5z-7-oxozeaenol培养基中以使得终浓度为20ng/ml的方式添加了2倍量的EGF的培养基进行半量培养基交换。在悬浮培养开始后第17天利用包含IWP-2，SB-431542，FGF2，CHIR99021，肝素钠，K02288，5z-7-oxozeaenol及EGF的培养基进行半量培养基交换，培养到悬浮培养开始后第21天。将上述培养条件作为对照，与在悬浮培养开始第6，10或13天添加并使得终浓度为1％的Corning基质胶基底膜GrowthFactor Reduced(GFR)(Corning公司制)的培养基进行半量培养基交换的条件进行比较。在悬浮培养开始后第21天，使用倒置显微镜进行得到的细胞团块的明场观察。
从人iPS细胞株HC-6#10通过上述诱导分化法诱导的悬浮培养开始后第21天的细胞团块中，在悬浮培养开始第6天添加基质胶的条件下，与无添加的对照相比，细胞团块更大幅地生长，另一方面，表面的嗅上皮样的上皮的比例降低(图31的A，B)。在悬浮培养开始第10天或第13天添加基质胶的条件下，表面的嗅上皮样的上皮发生大幅肥大和增殖(图31的C，D)。从上述结果可知，通过在细胞团块的制备步骤中添加基底膜制品可促进嗅上皮样组织的生长。另外，此时的基底膜制品的浓度在使用基质胶时优选为0.5％以上4％以下，从实验操作的方面考虑，最优选为0.5％以上且1.5％以下时。
[实验18：在细胞团块的制备中在基底膜制品中的包埋培养的效果的研究]
依照图32上部分的顺序进行了基质胶包埋培养。将用实验15中记载的方法制备的培养第10天或培养第13天的细胞团块从96孔板回收到15ml管中，用5％KSR gfCDM培养基洗涤一次后，转移到放入了5％KSR gfCDM培养基的悬浮培养用6cm平皿中，置于37℃。将放置在事先于4℃保冷的保冷剂上的悬浮培养用6cm平皿中，每次30μl地滴加在冰上解冻的基质胶，制备了20个左右的液滴。将回收的上述细胞团块通过大口径枪头吐出到每个平皿中的基质胶内后，在37℃放置30分钟，使基质胶凝胶化。在基质胶变硬后，加入在5％KSR gfCDM中添加了20ng/ml FGF-TS，20ng/ml EGF，10μg/ml肝素钠，2μM IWP-2，1μM SB431542，1μMK02288，300nM CHIR99021，2μM 5z-7-Oxozeaenol的培养基5ml进行培养(步骤(3e)开始)。在基质胶包埋培养开始后第11天，从诱导分化开始起第21天，使用倒置显微镜进行明场观察。
其结果，在培养第10天，在实施了细胞团块的基质胶包埋培养的样品中，在嗅上皮样的上皮组织的外侧形成了神经嵴细胞或头部间充质类细胞样的组织(图32的A)。在培养第13天实施了包埋培养的样品中也同样。从上述结果可知，通过基质胶包埋培养能够形成除了嗅上皮和中枢神经系统以外，还具备将来的嗅神经鞘细胞的神经嵴细胞或头部间充质类组织的细胞团块。
工业实用性
根据本发明，能够由多潜能干细胞低成本而有良好效率地制备包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块。
[表1]
抗原 宿主 供应商 目录# 稀释
AP2 alpha 小鼠 Santa Cruz SC-53163 1/200
Bf1/FoxG1 兔 Takara Bio M227 1/500
钙网膜蛋白 山羊 R&D Systems AF5065-SP 1μg/ml
Chx10 山羊 Santa Cruz SC-21690 1/100
Chx10 绵羊 Exalpha X1180P 1/500
CK，pan 小鼠 Sigma Aldrich C2562-.2ML 1/1000
CK8 小鼠 R&D Systems MAB3165-SP 1μg/ml
c-Maf 小鼠 R&D Systems MAB8227-SP 1/200
晶状体蛋白αA 山羊 R&D Systems AF4848-SP 1μg/ml
Dlx5 兔 Atlas Antibodies HPA005670 1/500
Ebf1 山羊 R&D Systems AF5165-SP 1μg/ml
Ebf2 绵羊 R&D Systems AF7006-SP 0.5μg/ml
E-钙黏着蛋白 山羊 R&D Systems AF648-SP 1/1000
Emx2 绵羊 R&D Systems AF6470-SP 1/500
EpCAM 小鼠 Acris Antibodies AM33251SU-S 1/500
EpCAM 山羊 R&D Systems AF960-SP 0.5μg/ml
EYA2 兔 Atlas Antibodies HPA027024 1/500
Islet-1 山羊 R&D Systems AF1837-SP 1μg/ml
层粘连蛋白 小鼠 Dai-ichi Fine chemical F-54 1/1000
层粘连蛋白 兔 LSL LB-1013 1/1000
Lhx2 兔 Millipore AB10557 1/500
N-钙黏着蛋白 小鼠 BD Biossience 610920 1/500
NCAM 小鼠 Biolegend 304601 1/100
巢蛋白 兔 Spring Bioscience E18610 1/500
NeuroD1 山羊 R&D Systems AF2746-SP 1μg/ml
Otx2 兔 Takara M199 1/1000
p63 兔 Santa Cruz SC-8343 1/100
Pax6 兔 Covance PRB-278P 1/1000
Pbx1/2/3/4 小鼠 Santa Cruz SC-28313 1/100
PKCζ 兔 Santa Cruz SC-216 1/100
Prox1 山羊 R&D Systems AF2727-SP 1μg/ml
Six1 兔 Atlas Antibodies HPA001893 1/500
Sox1 山羊 R&D Systems AF3369-SP 1μg/ml
Sox2 小鼠 R&D Systems MAB2018-SP 0.5μg/ml
Sox3 山羊 R&D Systems AF2569-SP 1μg/ml
Sp8 山羊 Santa Cruz SC-104661 1/400
Tuj1 小鼠 Sigma Aldrich T8660 1/500
Tuj1 兔 GeneTex GTX130245 1/500
ZO-1 兔 Thermo Fisher Scientific 61-7300 1/500
β-连环蛋白 小鼠 BIOCARE Medical ACR406A 1/500
[表2]
靶标 标记 宿主 供应商 目录# 稀释
兔IgG Alexa 488 驴 Thermo Fisher Scientific A21206 1/1000
绵羊IgG CF 543 驴 Biotium 20322 1/1000
山羊IgG CF 555 驴 Biotium 20039 1/1000
小鼠IgG CF 555 驴 Biotium 20037 1/1000
山羊IgG Alexa 647 驴 Thermo Fisher Scientific A21447 1/1000
小鼠IgG Alexa 647 驴 Thermo Fisher Scientific A31571 1/1000

Claims (52)

1.包含嗅神经细胞或其前体细胞的细胞团块的制备方法，所述方法包括下述步骤(1)～(3)：
步骤(1)，将多潜能干细胞在第一Wnt信号转导途径抑制物质的存在下悬浮培养，形成细胞聚集体，
步骤(2)，在BMP信号转导途径作用物质的存在下悬浮培养所述步骤(1)中得到的细胞聚集体，
步骤(3)，将所述步骤(2)中得到的细胞聚集体进行悬浮培养，得到所述细胞团块，
其中，该步骤(3)包含选自由下列步骤组成的组中的至少一个步骤，
步骤(3a)，在FGF信号转导途径作用物质的存在下进行悬浮培养，
步骤(3b)，在BMP信号转导途径抑制物质的存在下进行悬浮培养，及
步骤(3c)，在FGF信号转导途径作用物质及BMP信号转导途径抑制物质的存在下进行悬浮培养。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤(3)包含所述步骤(3a)，且在所述步骤(3a)后进一步包含所述步骤(3c)。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述步骤(3)包含所述步骤(3b)或所述步骤(3c)，且在所述步骤(3b)或所述步骤(3c)后，进一步包含在不存在BMP信号转导途径抑制物质的条件下进行悬浮培养的步骤(3d)。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的制备方法，其中，在所述步骤(3)中，还存在EGF信号转导途径作用物质。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其中，在所述步骤(1)前进一步包含步骤(a)，所述步骤(a)为将所述多潜能干细胞在不存在饲养细胞的条件下，以包含1)选自由TGFβ家族信号转导途径抑制物质及sonic hedgehog信号转导途径作用物质组成的组中的至少1个，和2)未分化维持因子的培养基进行培养的步骤。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的制备方法，其中，所述BMP信号转导途径作用物质包含选自由BMP2，BMP4，BMP7，BMP13及GDF7组成的组中的至少1个蛋白质。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的制备方法，其中，所述步骤(3)包含选自由所述步骤(3a)及所述步骤(3c)组成的组中的至少1个步骤，且所述FGF信号转导途径作用物质包含选自由FGF2及FGF8，以及它们的变体组成的组中的至少一种。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的制备方法，其中，所述步骤(3)的开始时期为从添加所述步骤(2)的BMP信号转导途径作用物质起12小时以后到72小时以内。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的制备方法，其中，在选自由所述步骤(2)及所述步骤(3)组成的组中的至少1个步骤中，存在所述第一Wnt信号转导途径抑制物质。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的制备方法，其中，所述第一Wnt信号转导途径抑制物质包含具有对于非经典的Wnt途径的抑制活性的物质。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的制备方法，其中，所述第一Wnt信号转导途径抑制物质包含PORCN抑制剂。
12.根据权利要求1～11中任一项所述的制备方法，其中，所述第一Wnt信号转导途径抑制物质包含选自由KY02111及KY03-I组成的组中的至少一种。
13.根据权利要求1～12中任一项所述的制备方法，其中，所述步骤(3)包含选自由所述步骤(3b)及所述步骤(3c)组成的组中的至少1个步骤，且所述BMP信号转导途径抑制物质包含I型BMP受体抑制剂。
14.根据权利要求1～13中任一项所述的制备方法，其中，在选自由所述步骤(1)，所述步骤(2)及所述步骤(3)组成的组中的至少1个步骤中还存在TGFβ信号转导途径抑制物质。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其中，所述TGFβ信号转导途径抑制物质包含Alk5/TGFβR1抑制剂。
16.根据权利要求1～15中任一项所述的制备方法，其中，在选自由所述步骤(1)，所述步骤(2)及所述步骤(3)组成的组中的至少1个步骤中还存在Wnt信号转导途径作用物质。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其中，所述Wnt信号转导途径作用物质作用于所述第一Wnt信号转导途径抑制物质的作用点的下游的信号转导因子。
18.根据权利要求16或17所述的制备方法，其中，所述Wnt信号转导途径作用物质包含使Wnt经典途径活化的物质。
19.根据权利要求18所述的制备方法，其中，所述使Wnt经典途径活化的物质抑制β连环蛋白的分解或促进β连环蛋白的稳定。
20.根据权利要求16～19中任一项所述的制备方法，其中，所述Wnt信号转导途径作用物质包含GSK3抑制剂。
21.根据权利要求16～20中任一项所述的制备方法，其中，所述第一Wnt信号转导途径抑制物质包含PORCN抑制剂，所述Wnt信号转导途径作用物质包含GSK3抑制剂。
22.根据权利要求1～21中任一项所述的制备方法，其中，在所述步骤(3)中还存在TAK1抑制物质。
23.根据权利要求1～22中任一项所述的制备方法，其中，所述步骤(3)在所述步骤(3a)，所述步骤(3b)或所述步骤(3c)后，进一步包含进行培养的步骤(3e)。
24.根据权利要求23所述的制备方法，其中，在所述步骤(3e)中，存在选自由BMP信号转导途径抑制物质，TGFβ信号转导途径抑制物质，Wnt信号转导途径作用物质，FGF信号转导途径作用物质及EGF信号转导途径作用物质组成的组中的至少1个。
25.根据权利要求23或24所述的制备方法，其中，在所述步骤(3e)中，还存在选自由视黄酸转导途径作用物质，血清，胰岛素样生长因子受体作用物质，神经营养因子受体作用物质组成的组中的至少1个。
26.根据权利要求23～25中任一项所述的制备方法，其中，所述步骤(3e)在含有增稠剂的培养基中进行。
27.根据权利要求26所述的制备方法，其中所述含有增稠剂的培养基具有100mPa·s以上的粘度。
28.根据权利要求23～27中任一项所述的制备方法，其中，在所述步骤(3e)中进行贴壁培养。
29.根据权利要求28所述的制备方法，其中，在涂布有选自由细胞外基质，基底膜制品及合成细胞粘附分子组成的组中的至少1个的培养器材上进行所述贴壁培养。
30.根据权利要求23～29中任一项所述的制备方法，其中，在所述步骤(3e)中，通过气相液相界面培养法进行培养。
31.根据权利要求1～30中任一项所述的制备方法，其中，在所述步骤(3)中，包含将细胞聚集体包埋在凝胶中进行培养的步骤。
32.根据权利要求31所述的制备方法，其中，所述凝胶为基质胶。
33.根据权利要求1～32中任一项所述的制备方法，其中，在所述步骤(3)中，包含在含有基底膜制品的培养基中进行悬浮培养的步骤。
34.根据权利要求33所述的制备方法，其中，所述基底膜制品为基质胶，培养基中的所述基质胶的浓度为0.5％～4％。
35.根据权利要求1～34中任一项所述的制备方法，其中，在所述步骤(3)中，还存在与所述第一Wnt信号转导途径抑制物质不同的第二Wnt信号转导途径抑制物质。
36.根据权利要求35所述的制备方法，其中，所述第二Wnt信号转导途径抑制物质包含具有对于经典Wnt途径的抑制活性的物质。
37.根据权利要求35或36所述的制备方法，其中，所述第二Wnt信号转导途径抑制物质包含端锚聚合酶抑制剂。
38.细胞团块，其包含通过权利要求1～37中任一项所述的制备方法得到的嗅神经细胞或其前体细胞。
39.细胞团块，其包含1)包含嗅神经细胞或其前体细胞的非神经上皮组织部，和2)包含神经系统细胞或其前体细胞的神经组织部，
其中，所述神经系统细胞或其前体细胞包含构成中枢神经系统的神经系统细胞或其前体细胞，且所述神经组织部的表面的至少一部分包覆有所述非神经上皮组织部。
40.根据权利要求39所述的细胞团块，其中，所述嗅神经细胞或其前体细胞表达Tuj1，EpCAM及Lhx2。
41.根据权利要求39或40所述的细胞团块，其中，非神经上皮组织部还包含基底膜样结构，所述基底膜样结构形成于所述非神经上皮组织部与所述神经组织部之间。
42.根据权利要求39所述的细胞团块，其中，所述非神经上皮组织部形成假复层上皮或复层上皮。
43.根据权利要求39～42中任一项所述的细胞团块，其中，所述非神经上皮组织部包含嗅上皮样组织，在所述嗅上皮样组织中包含所述嗅神经细胞或其前体细胞。
44.根据权利要求43所述的细胞团块，其中，所述嗅上皮样组织包含基底细胞或其前体细胞。
45.根据权利要求43或44所述的细胞团块，其中，所述嗅上皮样组织具有与所述神经组织部对向的基底面，及位于与所述基底面相反侧的顶端面，
所述基底面面向基底膜，
所述顶端面为PKCζ或Ezrin阳性。
46.根据权利要求43～45中任一项所述的细胞团块，其中，所述嗅上皮样组织包含嗅上皮内侧部，及设在所述嗅上皮内侧部的周围的嗅上皮周缘部，
所述嗅上皮内侧部包含Sox2，Tuj1及Ascll阳性细胞，和
所述嗅上皮周缘部包含Pax6及Pbx阳性细胞。
47.根据权利要求43～46中任一项所述的细胞团块，其中，所述嗅上皮样组织还包含嗅神经鞘细胞或其前体细胞。
48.根据权利要求43～47中任一项所述的细胞团块，其中，所述非神经上皮组织部还包含除了所述嗅上皮样组织以外的非神经上皮组织。
49.根据权利要求39～48中任一项所述的细胞团块，其中，所述神经系统细胞或其前体细胞还包含构成视网膜的细胞或其前体细胞。
50.根据权利要求39～49中任一项所述的细胞团块，其中，所述神经系统细胞或其前体细胞包含大脑。
51.由于嗅觉系统的障碍导致的疾病的治疗药物，其包含权利要求38～50中任一项所述的细胞团块中包含的细胞或组织。
52.由于神经组织的障碍导致的疾病的治疗药物，其包含权利要求38～50中任一项所述的细胞团块中包含的细胞或组织。
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