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CN112574136A - 一系列苯并噁唑酮类衍生物的结构、制备方法及用途 - Google Patents

一系列苯并噁唑酮类衍生物的结构、制备方法及用途 Download PDF

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CN112574136A
CN112574136A CN202011441028.0A CN202011441028A CN112574136A CN 112574136 A CN112574136 A CN 112574136A CN 202011441028 A CN202011441028 A CN 202011441028A CN 112574136 A CN112574136 A CN 112574136A
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CN
China
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compound
solution
pharmaceutically acceptable
benzoxazolone
mixture
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Pending
Application number
CN202011441028.0A
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English (en)
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朱长进
马兵
张新
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Beijing Institute of Technology BIT
Original Assignee
Beijing Institute of Technology BIT
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D263/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings
    • C07D263/52—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D263/54—Benzoxazoles; Hydrogenated benzoxazoles
    • C07D263/58—Benzoxazoles; Hydrogenated benzoxazoles with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached in position 2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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Abstract

本发明公开了一系列苯并噁唑酮类衍生物的结构、制备方法及用途，即提供了化合物Ⅰ所示苯并噁唑酮类化合物结构、合成方法、及其药学上可以接受的盐或它们的混合物在制备预防和/或治疗糖尿病并发症药物中的用途。这类化合物作为醛糖还原酶抑制剂和抗氧化剂，还具有降血糖效果。该类化合物可以降血糖，抑制醛糖还原酶的活性，清除自由基和抑制脂质过氧化物的生成，提高谷胱甘肽含量和超氧化物歧化酶活性，从而降低尿蛋白水平，达到预防和/或治疗糖尿病并发症尤其是糖尿病肾病的作用。本发明还提供了包含此类化合物的具有预防和/或治疗糖尿病并发症作用的药物组合物。
Figure DDA0002822209190000011
其中，X为‑、或‑CH＝CH‑；R1为氢、羟基、甲氧基、或三氟甲基，R2为氢、甲氧基、或羟基。

Description

一系列苯并噁唑酮类衍生物的结构、制备方法及用途
技术领域
本发明涉及有机化学、药物化学及药理学领域，具体涉及到一系列苯并噁唑酮类衍生物、苯并噁唑酮类衍生物作为醛糖还原酶抑制剂、其制备方法、以及苯并噁唑酮类衍生物在制备用于预防或治疗糖尿病并发症的药物中的用途。
背景技术
糖尿病(DM)是一种常见的慢性代谢性疾病，与严重的退行性并发症如神经病变，肾病，视网膜病变，白内障，动脉粥样硬化和心肌梗塞有关。由于糖尿病并发症的高致残率和高致死率，它已成为世界上大多数国家居民健康和寿命的主要威胁之一。事实上，它们的预防和控制仍然是具有挑战性的问题。依帕司他(Epalrestat)是目前唯一上市的糖尿病并发症治疗药物，但仅限于日本市场，近期被引入中国和印度。
在具有胰岛素非依赖性葡萄糖转运(视网膜，晶状体，肾和神经)的组织中，高血糖症条件下发生的通过多元醇途径增加的葡萄糖通量是众所周知的与继发性糖尿病并发症有关的因素。醛糖还原酶(ALR2)是多元醇途径中的关键限速酶。研究表明多元醇通路以及其下游的氧化应激反应与糖尿病并发症密切相关。因此，当开发出一种具有抗氧化活性的醛糖还原酶抑制剂，就能同时抑制山梨醇的异常聚积和氧化应激，从而有望发展为糖尿病并发症的治疗药物。
大量动物和临床实验已证明醛糖还原酶抑制剂对治疗糖尿病并发症非常有效。过去30年中，至少有14种醛糖还原酶抑制剂被证明非常有效并且已通过 II期临床。其中最有效的是在日本已上市的依帕司他、和已进入或通过III期临床的非达司他(Fidarestat)和AS-3201，且非达司他被证明比已上市的依帕司他更有效，它在体内的抑制效果要远远高于依帕司他。同时，直接抑制活性氧或氧化应激的抗氧化剂也可有效治疗糖尿病并发症。作为天然抗氧化剂的黄酮类化合物曾被发现具有醛糖还原酶抑制活性，只是其活性强度不足未能获得进一步的发展。另外，在预防或者治疗糖尿病并发症的同时，能够降低患糖尿病机体内血糖水平，提高患有糖尿病机体对血糖浓度的调节能力，对于治疗糖尿病也是一个重要的途径。因此，开发更为安全有效的治疗糖尿病并发症的药物是当务之急。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的对ALR2具有较强抑制能力，同时对自由基和脂质过氧化物具有较强抑制能力并具有降血糖效果的化合物及其制备方法，通过提取大鼠晶状体的醛糖还原酶进行这类化合物对ALR2的抑制活性实验，并通过配制1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)溶液和提取大鼠的脑匀浆进行化合物在大鼠体外对自由基的清除实验，证明了此化合物是高效的醛糖还原酶抑制剂，能够明显的降低血糖，抑制ALR2的活性，同时能够有效抑制自由基的生成，从而达到预防和/或治疗糖尿病并发症尤其是糖尿病肾病的作用。
因此，本发明的第一个方面，提供了式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所示化合物结构、合成、药学上可以接受的盐或它们的混合物在制备预防和/或治疗糖尿病并发症药物中的用途，
Figure RE-GDA0002949141870000021
Ⅰ式中，X为-、-CH＝CH-；
R为氢、羟基、甲氧基、或三氟甲基。
本发明还提供了一种用于预防和/或治疗糖尿病并发症的药物组合物，其包含：治疗有效量的式Ⅰ所示的苯并噁唑酮类化合物、药学上可以接受的盐或它们的混合物作为活性成分；和药学上可接受的载体、赋形剂或缓释剂。
本发明的第二方面，提供了一种具有式Ⅰ结构的化合物的制备方法，包括步骤：
(i)以式Ⅰa为原料，用1,1'-羰基二咪唑作为酰化试剂，经过一步操作形成式Ⅰb化合物；
Figure RE-GDA0002949141870000031
(ⅱ)以式Ⅰb为原料，在碱存在下，通过C-N键的生成在1位N上偶联上乙酸甲酯，从而形成式Ⅰc化合物：
Figure RE-GDA0002949141870000032
(ⅲ)以式Ⅰc为原料，在惰性条件、碱和金属催化剂存在下，通过C-C键的生成在7位C上偶联上取代或未取代的芳基、芳烷基，从而形成式Ⅰd化合物：
Figure RE-GDA0002949141870000041
(ⅳ)以式Ⅰd为原料，发生脱甲基反应，形成式Ⅰe化合物；
Figure RE-GDA0002949141870000042
其中，化合物Ⅰ中R的定义如上所述。
本发明的第三方面，提供了一种用于预防和/或治疗糖尿病并发症的药物化合物，其包含：治疗有效量的如前述任一项所述的用途，其特征在于：所述化合物，药学上可以接受的盐或它们的混合物作为醛糖还原酶抑制剂在制备预防或治疗糖尿病并发症和降低患糖尿病机体血糖含量药物的应用。
发明的主要优点在于:
经过广泛而深入的研究，合成了一种新型的具有结构式Ⅰ的苯并噁唑酮类衍生物，并经过体外实验证实了此类化合物对ALR2和自由基有很好的抑制作用，且对醛还原酶(Aldehyde Reductase，ALR1)只有弱的抑制作用，说明本发明的苯并噁唑酮类衍生物是高效的、高选择性、低毒的多功能醛糖还原酶抑制剂，具备用于制备预防和/或治疗糖尿病并发症尤其是糖尿病肾病的药物的用途。经过对该化合物在患糖尿病小鼠体内的糖耐量实验(GTT)、并测定小鼠体内脂质过氧化物(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性，发现了这种化合物在体内对于患糖尿病小鼠血糖降低的作用，以及对脂质过氧化物的清除作用和对活性氧的抑制作用。
活性成份
如本文所用，术语“活性成分”、“活性化合物”、“本发明的化合物”、“新型的醛糖还原酶抑制剂”可以互换使用，这些术语所指的均为本发明的具有结构式Ⅰ所示的苯并噁唑酮类化合物，药学上可接受的盐或它们的混合物。
药物组合物
本发明还提供了预防和/或治疗糖尿病并发症以及用于患糖尿病机体降糖作用的药物组合物，其包含：
(a)预防和/或治疗有效量的式Ⅰ所示的苯并噁唑酮类化合物，药学上可接受的盐或它们的混合物作为活性成分；
(b)药学上可接受的载体、赋形剂或缓释剂。
本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由…组成”和“由…组成”都包含在术语“含有”中。
本发明中，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激、和过敏反应)即有合理的效益/风险比的物质。
本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将本发明的活性物质或其生理上可接受的盐传送给人和/或动物的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。载体可以是固体或液态。
本发明所述的药物组合物所含活性成分占所述药物组合物总重量的 0.01-99.9％；和药学上可接受的载体、赋形剂或缓释剂，其中组合物的总重量为100％。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
为了解决上述现有技术中所存在问题，开发一种高效的、高选择性、低毒的多功能醛糖还原酶抑制剂，并且其具备用于制备预防和/或治疗糖尿病并发症尤其是糖尿病肾病的药物的用途，本发明的发明人创新地提出了一种结构式I 所述的化合物，由此可获得一种预防和/或治疗糖尿病并发症尤其是糖尿病肾病的药物。
基于上述巧妙的构思，本发明提供了一种式Ⅰ所示的化合物或其药学上可以接受的盐或它们的混合物，
Figure RE-GDA0002949141870000061
其中，X为-、或-CH＝CH-；
R1为氢、羟基、甲氧基、或三氟甲基，R2为氢、甲氧基、或羟基。
当R1为羟基，R2为甲氧基时，化合物具有最强的醛糖还原酶抑制效果，且具有较强的抗氧化效果。当羟基和甲氧基存在时，该化合物的羟基和甲氧基可以和醛糖还原酶的特异性口袋形成氢键，加强醛糖还原酶的抑制效果。同时，酚羟基的存在，使该化合物具有分子间发生Diels-Alder的性质，从而俘获自由基，产生抗氧化的效果。
本发明还提供了一种制备上述式I所示的化合物的方法，该方法包括如下步骤：
Figure RE-GDA0002949141870000071
其中，X为-、或-CH＝CH-；
R1为氢、羟基、甲氧基、或三氟甲基，R2为氢、甲氧基、或羟基
图1是一系列苯并噁唑酮衍生物的结构及其制备方法图
S1：所述所述反应中用到的酰化试剂为1,1'-羰基二咪唑；溶剂除了是N,N -二甲基甲酰胺外，还可以是乙腈，四氢呋喃等；反应温度60℃-90℃。
S2：所述所述反应中用到的碱除了碳酸钾，还可以是碳酸钠，碳酸铯等；溶剂除了是乙腈外，还可以是N,N-二甲基甲酰胺，四氢呋喃，二氧六环等；反应温度60℃-90℃。
S3：所述反应中用到的催化剂，除了醋酸钯与三邻甲基苯基膦，还可以是四三苯基膦钯，醋酸钯与三苯基膦，氯化钯与三苯基膦，氯化钯与三临甲基苯基磷等；所述反应中用到的碱，除了三乙胺，还可以是二乙胺、叔丁醇钠等；所述反应中用到的溶剂，除了N,N-二甲基甲酰胺外，还可以是甲苯、二甲基亚砜等；反应温度90℃-120℃；
S4：所述反应中用到的碱，除了氢氧化锂外，还可以是氢氧化钠，氢氧化钾等；所用到溶剂除了四氢呋喃外，还可以是二氧六环，甲醇，水等；反应温度0℃-30℃。
上述步骤中S1使用1,1'-羰基二咪唑作为酰化试剂，可以一步完成苯并噁唑酮母核的构建，另外S4中使用氢氧化锂水解，可以在生成羧酸侧链的同时保持苯并噁唑酮的结构不被破坏。
此外，本发明对此类化合物对ALR2和自由基的抑制作用进行了研究，并对该类化合物在患糖尿病小鼠体内进行了糖耐量实验(GTT)、测定了小鼠体内脂质过氧化物(MDA)、山梨醇和谷胱甘肽(GSH)含量和超氧化物歧化酶 (SOD)活性，由此发现这种化合物在体内对于患糖尿病小鼠血糖降低的作用，以及对脂质过氧化物的清除作用和对活性氧的抑制作用，并且在体内有效的抑制了醛糖还原酶。
上述实验活性证明该类化合物中的羧酸侧链和芳基侧链可以有效地分别进入醛糖还原酶的阴离子口袋和特异性口袋，从而产生醛糖还原酶抑制效果，减少葡萄糖经多元醇通路的代谢，从而减少山梨醇的含量，并降低谷胱甘肽的损耗增加谷胱甘肽的含量。而芳基侧链中酚羟基的存在，可以有效地减少俘获小鼠体内的自由基，从而减少脂质过氧化物的产生，并提高超氧化物歧化酶的活性。化合物的整体结构使糖尿病小鼠的血糖降低。
实施例
以下将用实施例进一步说明本发明。这些实施例仅用于举例说明本发明，但不可以任何方式限制本发明。实施例中的所有参数及说明，除另外说明外，都是以质量为依据。实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
实施例1：甲基(E)-2-(7-(4-羟基-3-甲氧基苯乙烯基)-2-苯并噁唑酮-3(2H)-烷基) 乙酸(化合物1)
Figure RE-GDA0002949141870000091
将1,1'-羰基二咪唑(1.6mmol)加入到含有2-氨基-6溴苯酚(1.0mmol)的DMF(3mL)溶液中，60℃下加热2h，将反应混合物倒入水中(15ml)，再用EtOAc(3×15ml) 萃取。收集有机层，用盐水(15mL)冲洗，加入MgSO4干燥，再旋蒸。从乙氧基乙酸乙酯中重结晶得到所需产物7-溴-2-苯并噁唑酮。(黄色晶体，产率46％， 115mg)：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ11.81ppm(s,1H),7.59ppm(d,J＝1.6 Hz,1H),7.33ppm(dd,J＝8.3,1.6Hz,1H),7.05ppm(dd,J＝8.3,1.2Hz,1H)。
将7-溴-2-苯并噁唑酮(1mmol)、K2CO3(1mmol)、溴乙酸甲酯(1.2mmol) 加入到CH3CN(10mL)中，65℃下搅拌3h。反应完成后，采用硅藻土垫过滤，旋蒸。将残留物在乙酸乙酯中重结晶得到化合物甲基2-(7-溴-2-苯并噁唑酮-3(2H)-烷基)乙酸甲酯。(白色晶体，产率74％，211mg)：1H NMR(400MHz, Chloroform-d)δ7.30–7.26ppm(m,1H),7.11ppm(d,J＝8.5Hz,1H),7.04ppm(d, J＝1.9Hz,1H),4.55ppm(s,2H),3.82ppm(s,3H)。
将2-(7-溴-2-苯并噁唑酮-3(2H)-烷基)乙酸甲酯、Pd(OAc)2(0.03mmol)和 P(o-tolyl)3(0.07mmol)加入到DMF(10mL)中，在氩气保护下，室温搅拌30min。加入2-甲氧基-4乙烯基苯酚(1.5mmol)、Et3N(0.30g,3mmol)、DMF(1ml)。将反应混合物在100℃下加热12h，反应完成后，将混合物倒入水中，用EtOAc萃取 (3×15ml)。收集有机层，加入MgSO4干燥，在真空中蒸发。然后，对混合物进行柱层析，得到所需的产物甲基(E)-2-(7-(4-羟基-3-甲氧基苯乙烯基)-2-苯并噁唑酮-3(2H)-烷基)乙酸甲酯。(黄色晶体，产率35％，118mg)：1H NMR(400MHz, DMSO-d6)δ9.26ppm(d,J＝1.7Hz,1H),7.38ppm(s,1H),7.35ppm(d,J＝7.0Hz,1H),7.24ppm(d,J＝13.0Hz,2H),7.21–7.15ppm(m,1H),7.12ppm(d,J＝16.5 Hz,1H),7.06ppm(d,J＝8.2Hz,1H),6.80ppm(d,J＝8.0Hz,1H),4.81ppm(s, 2H),3.86ppm(s,3H),3.73ppm(s,3H)。
将甲基(E)-2-(7-(4-羟基-3-甲氧基苯乙烯基)-2-苯并噁唑酮-3(2H)-烷基)乙酸甲酯(1mmol)和饱和LiOH(5mL)加入到THF中，室温下搅拌2h，反应完成后，加入0.1N HCl酸化至pH＝3。将悬浮液用EtOAc(3×15mL)萃取，收集有机相，加入MgSO4干燥，在真空中蒸发。将残留物在乙酸乙酯中重结晶得到甲基 (E)-2-(7-(4-羟基-3-甲氧基苯乙烯基)-2-苯并噁唑酮-3(2H)-烷基)乙酸。(黄色晶体，产率48％，149mg)：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.30ppm(s,1H),7.39–7.30 ppm(m,2H),7.25ppm(s,1H),7.20ppm(t,J＝7.9Hz,1H),7.13ppm(d,J＝8.2Hz, 1H),7.10ppm(s,1H),7.05ppm(d,J＝8.2Hz,1H),6.80ppm(d,J＝8.1Hz,1H), 4.54ppm(s,2H),3.86ppm(s,3H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ169.36, 154.43,148.38,147.74,139.24,133.22,132.13,128.68,124.48,121.11,121.00, 118.75,116.07,110.44,108.19,56.13,44.04ppm；HRMS(ESI)m/z calcd for[M-H] -340.0827,found 340.0816.
实施例2：甲基(E)-2-(7-(4-甲氧基苯乙烯基)-2-苯并噁唑酮-3(2H)-烷基)乙酸(化合物2)
Figure RE-GDA0002949141870000111
用甲基(E)-2-(7-(4-甲氧基苯乙烯基)-2-苯并噁唑酮-3(2H)-烷基)乙酸甲酯替代实施例1中的甲基(E)-2-(7-(4-羟基-3-甲氧基苯乙烯基)-2-苯并噁唑酮-3(2H)- 烷基)乙酸甲酯，按照实施例1所述制备方法制得。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.61ppm(d,J＝8.2Hz,2H),7.45–7.34ppm(m, 2H),7.22ppm(dd,J＝13.2,5.2Hz,2H),7.19–7.12ppm(m,1H),6.98ppm(d,J＝ 8.1Hz,2H),4.68ppm(s,2H),3.79ppm(s,3H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ 169.20,159.91,154.30,139.31,132.54,131.88,129.69,128.59,124.58,121.33, 121.00,119.39,114.74,108.37,55.66,43.45ppm；HRMS(ESI)m/z calcd for[M-H] -324.0877,found 324.0876。
实施例3：甲基(E)-2-(7-(4-羟基-3-甲氧基苯乙烯基)-2-苯并噁唑酮-3(2H)-烷基) 乙酸(化合物3)
Figure RE-GDA0002949141870000121
用甲基(E)-2-(7-(3，4-二羟基基苯乙烯基)-2-苯并噁唑酮-3(2H)-烷基)乙酸甲酯替代实施例1中的甲基(E)-2-(7-(4-羟基-3-甲氧基苯乙烯基)-2-苯并噁唑酮 -3(2H)-烷基)乙酸甲酯，按照实施例1所述制备方法制得。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.36ppm(dd,J＝7.8,1.5Hz,2H),7.28ppm(d,J ＝16.4Hz,1H),7.24–7.14ppm(m,2H),7.07–6.98ppm(m,1H),6.97–6.90ppm (m,1H),6.81–6.73ppm(m,1H),4.67ppm(s,2H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6) δ169.21,154.31,146.72,146.01,139.21,133.25,131.85,128.63,124.57,121.15, 121.10,119.55,118.07,116.27,113.76,108.11,43.45ppm；HRMS(ESI)m/z calcd for[M-H]-326.0670,found326.0680。
实施例4：2-(2-羰基-7-苯并噁唑-3(2H)-yl)乙酸衍生物(化合物4)
Figure RE-GDA0002949141870000122
将2-(7-溴-2-苯并噁唑酮-3(2H)-烷基)乙酸甲酯(1mmol)、(PPh3)4Pd(0.03mmol)、4-三氟甲基苯硼酸(1.1mmol)、K2CO3(0.65g,2mmol)和H2O(1mL)加入到DMF(10mL)中，100℃下搅拌12h。反应完成后，将混合物倒入水中，用EtOAc (3×15mL)萃取，收集有机相，加入MgSO4干燥，在真空中蒸发。将混合物柱层析后得到化合物甲基2-(2-氧-7-(4-(三氟甲基)苯基)苯并噁唑酮-3(2H)-烷基)乙酸甲酯。(白色晶体，产率47％，161mg)：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.01 ppm(d,J＝8.1Hz,2H),7.91ppm(d,J＝8.0Hz,2H),7.49ppm(dd,J＝7.1,2.3Hz, 1H),7.44–7.33ppm(m,2H),4.86ppm(s,2H),3.75ppm(s,3H)。
将2-(2-氧-7-(4-(三氟甲基)苯基)苯并噁唑酮-3(2H)-烷基)乙酸甲酯(1mmol)和饱和LiOH(5mL)加入到THF(5mL)中混合，室温下搅拌2h。反应完成后，加入0.1N HCl酸化至pH＝3。将悬浮液用EtOAc(3×15mL)萃取，收集有机相，加入MgSO4干燥，在真空中蒸发。将残留物在乙酸乙酯中重结晶得到2-(2-氧 -7-(4-(三氟甲基)苯基)苯并噁唑酮-3(2H)-烷基)乙酸。(白色晶体，产率37％， 92mg)：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.20ppm(s,1H),8.01ppm(d,J＝8.0 Hz,2H),7.91ppm(d,J＝8.1Hz,2H),7.47ppm(d,J＝7.4Hz,1H),7.43–7.33ppm(m,2H),4.72ppm(s,2H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ169.15,154.11, 139.58,138.76,132.33,129.31,126.28,126.25,125.08,122.43,121.84,110.19, 49.06,43.54ppm；HRMS(ESI)m/z calcd for[M-H]-336.0489,found 336.0482.
实施例5：2-(2-氧-7-(3，4-二羟基苯基)苯并噁唑酮-3(2H)-烷基)乙酸(化合物5)
Figure RE-GDA0002949141870000131
用2-(2-氧-7-(3，4-二羟基苯基)苯并噁唑酮-3(2H)-烷基)乙酸甲酯替代实施例4中的2-(2-氧-7-(4-(三氟甲基)苯基)苯并噁唑酮-3(2H)-烷基)乙酸甲酯，按照实施例1所述制备方法制得。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.86ppm(s,1H),7.99ppm(s,1H),6.90 ppm(s,1H),6.74ppm(q,J＝10.1,9.4Hz,3H),6.39ppm(dd,J＝34.5,7.8Hz, 2H),3.84ppm(s,2H)；13CNMR(101MHz,DMSO-d6)δ169.24,154.38, 146.30,145.89,138.98,132.13,125.67,124.78,123.82,121.63,119.70, 116.45,115.81,108.00,43.43ppm；HRMS(ESI)m/z calcd for[M-H]- 300.0514,found 300.0517.
实施例5.化合物对ALR2和ALR1体外抑制作用实验
实验中用到了ALR2测定用磷酸盐缓冲溶液、ALR1测定用的磷酸钠缓冲液 1、磷酸钠缓冲液2、NADPH溶液以及D,L-甘油醛溶液、D-葡萄糖醛酸钠溶液，它们的配制方法如下：
(1)配制0.1M,pH＝6.2的ALR2测定用磷酸盐缓冲溶液
溶液A：3.12g NaH2PO4·2H2O溶于100ml水配成0.2M的溶液；
溶液B：3.58g Na2HPO4·12H2O溶于50ml水配成0.2M的溶液。
取A81.5ml，B 18.5ml，用水稀释至终体积为200ml，调节pH至6.2，即得。
(2)配制10mM,pH＝7.2的ALR1测定用的磷酸盐缓冲溶液1
0.3801g磷酸钠，8.5513g蔗糖，0.0809g EDTA二钾盐，0.0175mLβ-巯基乙醇溶于100mL水中，调节pH至7.2，即得。
(3)配制10mM,pH＝7.2的ALR1测定用的磷酸盐缓冲溶液2
0.3801g磷酸钠，0.0809g EDTA二钾盐，0.0140mLβ-巯基乙醇溶于100mL水中，调节pH至7.2，即得。
(4)配制0.104mM NADPH溶液(以缓冲溶液作为溶剂)
0.0043g NADPH溶于50ml缓冲溶液配制成。
(5)配制10mM D,L-甘油醛溶液(以缓冲溶液作为溶剂)
0.045g D,L-甘油醛溶于50ml缓冲溶液配制成。
(6)配制20mM D-葡萄糖醛酸钠溶液(以缓冲溶液作为溶剂)
0.2341g D-葡萄糖醛酸钠溶于50ml缓冲溶液1中配制成。
(7)处理透析袋：
①把透析袋剪成适当长度(10-20cm)的小段，剪三段。在大体积的2％(W/V)NaHCO3和1mM EDTA二钾盐(pH＝8.0)中将透析袋煮沸10min。
②用蒸馏水彻底清洗透析袋，放在1mM EDTA二钾盐(pH＝8.0)中，将之煮沸10min。
③冷却后，存放在4℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内，从此时取用透析袋时必须带手套。用前在透析袋内装满水，然后排出，将之清洗干净。
(8)ALR2的提取：从正常杀死的老鼠眼球中迅速提出晶状体，然后加入3倍(0.4ml/lens)于其体积的冷去离子水(0-4℃)，再用Glas-Potter匀浆器匀浆。匀浆液在低温离心机中以12000×g转速，0-4℃的温度，离心30min。最后取上清液，即为ALR2的水溶液，用于酶活测试。
(9)ALR1的提取：将大鼠断颈处死，迅速取出肾脏，然后加入3倍(3ml/g 肾脏)于其体积冷却的10mM磷酸钠缓冲液1(pH＝7.2，内含0.25M蔗糖，2.0 mM EDTA二钾盐，2.5mMβ-巯基乙醇)(0-4℃)，再用Glas-Potter匀浆器匀浆。匀浆液在低温离心机中以12000×g转速，0-4℃的温度，离心30min。取上清液，加入饱和硫酸铵溶液，形成饱和度为40％的硫酸铵溶液，0-4℃下搅拌30 min，12000×g转速低温离心15min。取上清液重复上述步骤，分别使硫酸铵的饱和度达到55％，然后是75％的盐溶液。75％饱和度的硫酸铵溶液离心后的沉淀用50体积10mM磷酸钠缓冲液2(pH＝7.2，内含2.0mM EDTA二钾盐，2.0 mMβ-巯基乙醇)溶解，并用此缓冲液透析过夜。透析后的即为ALR1的水溶液，用于酶活测试。
(10)酶活性的测试：在30℃的温度下，在1ml测试比色皿中分别加入0.25mL0.104mM NADPH,0.25mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.2),0.1mL所提取的酶液，0.15mL去离子水。参照比色皿中加入0.25mL 0.104mM NADPH,0.50mL 0.1M磷酸盐缓冲溶液(pH＝6.2),0.1mL所提取的酶液，0.15mL去离子水。然后把含有上述混合液的两个比色皿放在30℃条件下，保温10min。最后向测试比色皿中加入0.25mL 10mM底物开始反应，用紫外分光光度计在340nm监测5min。从所得数据，以吸光度为纵轴，时间为横轴，可得一直线，求得此直线的斜率，记为I0，代表酶活。酶的活性最佳值是处于NADPH吸光度变化在 0.01±0.0010(ALR2)或0.015±0.0010(ALR1)吸光度单位/min的范围内，如果不在此范围，通过稀释酶液来使其达到这一范围。对测试比色皿要加对照比色皿是为了校正由于非酶因素(比如空气中氧气也会氧化NADPH)所导致的 NADPH的氧化。
(11)化合物抑制百分数的测试：同测酶活的方法相似，只是在未加底物时，要在测试比色皿和参照比色皿中各加入5μL的被测化合物溶液。所得直线的斜率记为Ix。然后根据下面的公式计算可得该浓度下的抑制百分数。
I％＝(|I0-Ix|/|I0|)×100％
重复测量不同浓度的化合物溶液，分别计算出相应浓度的抑制百分数，可得到“抑制百分数”对“浓度对数”的直线，然后从图中读出抑制百分数为50％对应的浓度对数，反对数即可得IC50。
表1化合物Ⅰ体外对ALR2和ALR1的抑制活性
Figure RE-GDA0002949141870000161
Figure RE-GDA0002949141870000171
aIC50(nM)(95％C.L.)是在本发明所实施的实验体系中所测得值
bIC50(μM)(95％C.L.)是在本发明所实施的实验体系中所测得值
实验证实，部分化合物在体外对ALR2有明显的抑制作用，尤其是化合物1， IC50值为6.9±2.1nM，且这些化合物对ALR1只有弱的抑制作用，说明这些化合物具有高选择性。
DPPH法测定化合物体外抗氧化活性
(1)0.025mg/mLDPPH溶液的配制
0.025g DPPH溶于1000mL甲醇中，搅拌完全溶解即得。
(2)化合物甲醇溶液的配制
不同化合物分别配制成100μM、50μM、10μM、5μM、1μM不同浓度。
(3)化合物DPPH自由基清除率的测定
化合物对DPPH自由基清除能力的测定步骤，如表2所示，取0.1mL化合物溶液，加入到1mL的DPPH溶液中，用甲醇补足至3mL。将混合溶液摇匀，室温反应2h后，在517nm波长处测定各样品的吸光度值，每个样品平行测定 3次，取平均值，计算抑制率，Trolox为对照样，化合物DPPH自由基清除率测定结果，如表3所示。
化合物DPPH自由基清除率测定公式如下：
Figure RE-GDA0002949141870000172
其中Ai为加入化合物后的吸光度值；Aj为未加DPPH，只加化合物的吸光度值；Ac为未加化合物，只加DPPH的吸光值。
表2化合物DPPH自由基清除率的测定步骤(单位mL)
Figure RE-GDA0002949141870000181
表3化合物DPPH自由基清除率测定结果
Figure RE-GDA0002949141870000182
实验证实，部分化合物在体外对DPPH自由基有明显的抑制作用，尤其是化合物1，100μM浓度下DPPH自由基清除率为94.5％，说明这些化合物具有很强的体外抗氧化活性。
实施例6.MDA法测定化合物体外抗氧化活性
1.溶液的配制
(1)20μM/mL三氯化铁溶液的配制
将0.0027g三氯化铁(FeCl3·6H2O)，溶于10mL双蒸水中，然后再取1mL 该稀释液，加4mL双蒸水，搅拌完全溶解即得。
(2)100μM/mL维生素C溶液的配制
将0.0088g维生素C，溶于10mL双蒸水中，取1mL该溶液，加4mL双蒸水，搅拌完全溶解即得。
(3)化合物甲醇溶液的配制
不同化合物配制成浓度为100μM、50μM的甲醇溶液，搅拌完全溶解即得。
2.脑匀浆液制备
(1)大鼠灌流处死，迅速取出脑组织，用滤纸吸湿后，称取湿重，每次实验称取2克，加入到手动匀浆器中；
(2)向匀浆器中加入一定体积的冷生理盐水，冰浴氛围下手动匀浆10分钟；
(3)将匀浆液倒入离心管中，于4℃，3000r/min条件下，离心10min，取上清液，-20℃保存。
3.化合物与脑匀浆液共孵育
取出制备好的匀浆液以及其他各溶液，按表4依次将脑匀浆液，药液，三氯化铁，维生素C等共0.5mL，加入到1.5mL离心管中，混匀，对于空白管和对照管需加入甲醇或双蒸水补足反应体系的体积为0.5mL。
将离心管置于37℃水浴锅中，孵育30分钟，期间不断摇晃离心管2-3次，使化合物与脑匀浆液充分作用；取出离心管置于冰水中，按试剂盒进行接下来的操作。
表4三氯化铁维生素C体系诱导的脑匀浆中脂质过氧化反应(单位mL)
Figure RE-GDA0002949141870000191
4.脑匀浆中脂质过氧化物MDA含量的测定
(1)试剂盒组成与溶液的配制：
试剂一：液体，20ml一瓶，室温保存备用；
试剂二：为12ml液体，用时每瓶按试剂盒说明书加一定量的双蒸水，充分混匀，置于4℃冰箱保存；
试剂三：为粉剂，用时将粉剂加入到90-100℃的热双蒸水中，充分溶解后，按试剂盒说明，用双蒸水补足体积，再按说明书加入冰醋酸，充分混匀，避光，置于4℃冰箱保存；
标准品：10n mol/mL四乙氧基丙烷，4℃冰箱保存。
(2)实验步骤
1)取离心管若干，每个样品做三个平行管，按表5进行加样；
表5脑匀浆中脂质过氧化物MDA含量测定加样表(单位mL)
Figure RE-GDA0002949141870000201
2)摇动几下试管架，混匀。再按表6加入其他试剂；
表6脑匀浆中脂质过氧化物MDA含量测定加样表(单位mL)
Figure RE-GDA0002949141870000202
3)旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95度水浴，或煮沸40min；
4)取出，流水冷却，3500-4000转/分的速度离心10分钟，然后取上清，532nm 处，蒸馏水调零，测各管吸光度值；
5)MDA含量计算公式：
Figure RE-GDA0002949141870000211
5.化合物对脑匀浆中脂质过氧化物的抑制率，测定结果如表7所示。
表7化合物对脑匀浆中脂质过氧化物的抑制率
Figure RE-GDA0002949141870000212
实验证实，部分化合物对脑匀浆中的脂质过氧化物有明显的抑制作用，尤其是化合物1，3对脂质过氧化物的抑制百分率更是高达50％，53.8％抗氧化活性很强。
实施例7.动物体内实验(STZ诱导的小鼠)
(1)实验动物及分组
链脲佐菌素(STZ)作为一种广谱性抗生素，不仅具有抗菌、对神经内分秘肿瘤细胞的毒性作用，还广泛应用于糖尿病小鼠的诱导实验中。本实验采用的糖尿病小鼠模型为STZ诱导糖尿病小鼠。
遵从随机分组的原则，将造模成功的糖尿病小鼠，平均分成四组，每组10 只，分别为空白组、低剂量药物组、高剂量药物组、二甲双胍阳性对照组、依帕司他阳性对照组。
实验期间，小鼠饲养在北京理工大学制药工程专业化学实验中心，实验仪器用具和食物均进行灭菌操作。遵循SPF级动物饲养条件，温度设置在24℃，通风，12小时交替照明，小鼠自由采食、进水，并保持鼠笼的干燥和洁净。
(2)药物和试剂
0.5％CMCNa溶液的配制：准确称取CMCNa 0.05g，分多次缓慢加入到100 ml、90℃的去离子水中，加热不断搅拌5小时，至羧甲基纤维素钠完全溶解。待溶液将至室温，倒入150ml的离心管中，用封口膜密闭封好，置于4℃冰箱中冷藏待用。小鼠的灌胃量在0.1-0.3ml/10g的体积范围，实验选择0.15ml/kg 进行灌胃，剂量选择为：低剂量组-80mg/kg，高剂量组-160mg/kg，阳性对照组 -80mg/kg，空白组按照相应体重灌胃不同体积CMCNa。
低剂量组：准确称取化合物1的质量为0.267g，置于研钵中，研磨至均匀细小粉末状，无明显可见大颗粒，然后将化合物缓慢加入到50mlCMCNa溶液中，搅拌均匀，即得到浓度为5.33mg/ml的溶液(80mg/kg小鼠重量)
高剂量组：准确称取化合物1的质量为0.534g，置于研钵中，研磨至均匀细小粉末状，无明显可见大颗粒，然后将化合物缓慢加入到50mlCMCNa溶液中，搅拌均匀，即得到浓度为10.66mg/ml的溶液(160mg/kg小鼠重量)
二甲双胍阳性对照组：将两片0.5g/片的二甲双胍置于研钵中，研磨至均匀细小粉末状，无明显可见大颗粒，然后将二甲双胍粉末缓慢加入到188mlCMCNa 溶液中，搅拌均匀，即得到浓度为5.33mg/ml的溶液(80mg/kg小鼠重量)
依帕司他阳性对照组：准确称取二甲双胍的质量为0.267g，置于研钵中，研磨至均匀细小粉末状，无明显可见大颗粒，然后将化合物缓慢加入到50 mlCMCNa溶液中，搅拌均匀，即得到浓度为10.66mg/ml的溶液(80mg/kg小鼠重量)
实施例8.血糖测试(Glu)
常见的便携式血糖仪有三种分析方法，分别为葡萄糖氧化酶电化学法、葡萄糖氧化酶光化学法和葡萄糖脱氢酶电化学法，该实验选用的血糖仪为葡萄糖脱氢酶电化学法。葡萄糖脱氢酶能特异的催化β-D葡萄糖和NAD+(NADP+)生成 D-葡萄糖酸内酯和NADH(NADPH)，根据反应前后电流的变化，体现血糖值的大小。
对造模成功的糖尿病小鼠，根据分组给药，分别在第2周，第4周，第6 周，第8周，禁食10小时(禁食不禁水)，剪尾测血糖。挤血时注意不要过度用力，以防止部分组织液进入血液中，对血液造成稀释，测量数据失准。用碘伏在剪尾处进行消毒，防止小鼠感染。
通过以上方法，得出的数据如下：
表8 STZ诱导小鼠葡萄糖含量实验结果
Figure RE-GDA0002949141870000231
在小鼠成功造模后，即第0周，五组糖尿病小鼠的血糖值均在21.3mmol/L 附近。实验进行至第一周，相比于Ctrl组，高、低剂量组与二甲双胍组小鼠血糖值均有一定程度的下降，其中L-dose组和H-dose组血糖分别降低了17.7％和 34.9％。由数据分析得出，二甲双胍与化合物1具有明显的降糖功效(P＜0.05)。第4周，二甲双胍组、L-dose组和H-dose组与Ctrl组相比，小鼠血糖仍明显降低。第6周，各组血糖值均较第7天有所上升，初步分析血糖的上升与小鼠糖尿病病情的恶化有关，随着实验的进行，小鼠胰岛β细胞受损程度加深，机体对葡萄糖的利用率下降。二甲双胍组、L-dose组、H-dose组对模型鼠血糖仍然具有明显降低作用。通过SPSS.17检验，二甲双胍组、高低剂量组P＜0.05。进一步说明化合物1和二甲双胍的降糖效果。第8周，二甲双胍与化合物1仍表现出明显的降血糖效果。通过8周的给药和血糖测试，说明化合物1对糖尿病模型鼠的具有明显的降糖效果，二甲双胍具有良好降糖效果。
实施例9.葡萄糖糖耐量实验(GTT)
(1)小鼠过夜禁食16小时。
(2)称重，取0点血。
(3)腹腔注射20％葡萄糖2g/Kg体重，分别记录每只动物注射的具体时间。
(4)按不同动物的具体注射时间分别在0、15、30、60、90、120min时间点进行血糖测定。结果如表5。
表9 STZ诱导小鼠糖耐量实验结果
Figure RE-GDA0002949141870000241
由表可知，五组糖尿病模型鼠在注射葡萄糖30min内，血糖值急剧升高， 30min时，Metformin组血糖值达到28.6mmol/L，L-dose组达到46.2mmol/L， H-dose组达到36.5mmol/L，Ctrl组达到45.9mmol/L。H-dose组在60min达到 38.6mmol/L。30min-60min，除H-dose组和二甲双胍组，其它三组血糖均不同程度降低，60min时，Ctrl组降至44.5mmol/L，L-dose组降至39.6mmol/L。H-dose组于60min达到峰值，60-120min时血糖降低。Metformin组90min血糖达到峰值，90-120min血糖降低。和通过与Ctrl组对比，化合物1和二甲双胍对血糖的调节具有明显的作用，可以促进葡萄糖的吸收和分解，降低血液中的葡萄糖含量。
分析上述数据可知，化合物1和二甲双胍对于糖尿病模型鼠的血糖恢复效果较好，葡萄糖耐量明显改善，说明化合物1和二甲双胍对小鼠的糖耐量受损具有一定修复作用。
实施例10.肝脏中脂质过氧化物MDA含量的测定
1)试剂盒组成与溶液的配制：
试剂一：液体，20ml一瓶，室温保存备用；
试剂二：为12ml液体，用时每瓶按试剂盒说明书加一定量的双蒸水，充分混匀，置于4℃冰箱保存；
试剂三：为粉剂，用时将粉剂加入到90-100℃的热双蒸水中，充分溶解后，按试剂盒说明，用双蒸水补足体积，再按说明书加入冰醋酸，充分混匀，避光，置于4℃冰箱保存；
标准品：10n mol/mL四乙氧基丙烷，4℃冰箱保存。
2)实验步骤
(1)取离心管若干，每个样品做三个平行管，按表6进行加样；
表10血浆中脂质过氧化物MDA含量测定加样表(单位mL)
Figure RE-GDA0002949141870000251
(2)摇动几下试管架，混匀。再按表6加入其他试剂；
表11血浆中中脂质过氧化物MDA含量测定加样表(单位mL)
Figure RE-GDA0002949141870000261
(3)旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜薄膜扎紧，用针头刺一小孔，95度水浴，或煮沸40min；
(4)取出，流水冷却，3500-4000转/分的速度离心10分钟，然后取上清，532nm 处，蒸馏水调零，测各管吸光度值；
(5)MDA含量计算公式：
Figure RE-GDA0002949141870000262
通过以上方法，得出的数据如下：
表12 STZ诱导小鼠MDA实验数据
Figure RE-GDA0002949141870000263
本实验利用MDA试剂盒，对给药8周后糖尿病小鼠的肝脏组织进行MDA 含量测试，通过肝脏中MDA的含量，体现药物的抗氧化能力及治疗效果。以上各组测定值均为给药8周后的测定值，其中正常组和空白组表示分别灌胃相应剂量的羧甲基纤维素钠溶液。分析上表得出，8周时，正常组小鼠MDA值为0.557 nmol/mgprot，Ctrl组为1.407nmol/mgprot，L-dose组为0.468nmol/mgprot，H-dose 组为0.774nmol/mgprot。通过统计软件SPSS.17.0分析得出，L-dose组和H-dose 组相较于Ctrl组均有显著性差异(p<0.05)；二甲双胍组为0.797nmol/mgprot，依帕司他组为0.504nmol/mgprot。说明该醛糖还原酶抑制剂在氧化应激过程中，对丙二醛的有明显抑制作用。
实施例11.肾脏总SOD活性检测
1)试剂盒组成与溶液的配制：
试剂一：SOD样品制备液；
试剂二：SOD检测缓冲液；
试剂三：WST-8；
试剂四：酶溶液；
试剂五：反应启动液(40X)；
2)实验步骤
(1)组织样品的准备：动物用生理盐水(0.9％NaCl，含有0.16mg/ml肝素钠)灌流清除血液后获取组织样品。取适量的组织样品，按照每10mg组织加入100微升SOD样品制备液的比例在4℃或冰浴进行匀浆(可以使用玻璃匀浆器或各类常见电动匀浆器)。4℃约12,000g离心3-5min，取上清作为待测样品。
(2)WST-8/酶工作液的配制：按照每个反应160μl的体积配制适量的WST-8/ 酶工作液。均匀混合151μl SOD检测缓冲液、8μl WST-8和1μl酶溶液，即可配制成160μl WST-8/酶工作液。
反应启动工作液的配制：把试剂盒中的反应启动液(40X)融解后混匀，按照每1μl反应启动液(40X)加入39μl SOD检测缓冲液的比例进行稀释，混匀后即为反应启动工作液。
(3)参考下表使用96孔板设置样品孔和各种空白对照孔。并按下表依次加入待测样品和其它各种溶液。加入反应启动工作液后充分混匀。
(4)37℃孵育30分钟。在450nm测定吸光度。
(5)SOD活性计算公式：抑制百分率＝[(A空白对照1－A空白对照2)－(A 样品－A空白对照3)]/(A空白对照1－A空白对照2)×100％
待测样品中SOD酶活力单位＝检测体系中SOD酶活力单位＝抑制百分率/(1 －抑制百分率)units
表13肾脏中总SOD活性测定加样表(单位mL)
Figure RE-GDA0002949141870000281
通过以上方法，得出的数据如下：
表14肾脏总SOD活性实验数据
Figure RE-GDA0002949141870000282
本实验利用SOD活性试剂盒，对给药8周后糖尿病小鼠的肾脏组织进行总SOD 活性测试，通过肾脏总SOD活性，体现药物的抗氧化能力及治疗效果。以上各组测定值均为给药8周后的测定值，其中正常组和空白组表示分别灌胃相应剂量的羧甲基纤维素钠溶液。分析上表得出，8周时，正常组小鼠SOD活性值为 20.2U/mgprot，Ctrl组为9.6U/mgprot，L-dose组为26.7U/mgprot，H-dose组为 13.3U/mgprot。通过统计软件SPSS.17.0分析得出，L-dose组和H-dose组相较于Ctrl组均有显著性差异(p<0.05)；说明该醛糖还原酶抑制剂在氧化应激过程中，可以有效地提高SOD活性。
实施例12.肾脏中谷胱甘肽(GSH)含量的测定
1)试剂盒组成与溶液的配制：
试剂一：总谷胱甘肽检测缓冲液；
试剂二：谷胱甘肽还原酶；
试剂三：氧化型谷胱甘肽(GSSG)；
试剂四：DTNB；
试剂五：蛋白去除试剂M；
试剂六：NADPH；
试剂七：DMSO；
试剂八：GSH清除辅助液；
试剂九：GSH清除试剂。
2)实验步骤
(1)组织样品的准备：取组织用液氮速冻，然后研成粉末。每10mg研碎的组织粉末，加入30μl蛋白去除试剂M溶液，充分Vortex。再加入70μl蛋白去除试剂M溶液，用玻璃匀浆器充分匀浆(对于比较容易匀浆的组织可以不用液氮速冻等处理，而直接加入适量蛋白去除试剂M溶液进行匀浆)。4℃放置10min 后，10,000g 4℃离心10min，取上清用于总谷胱甘肽的测定。
(2)待测GSSG含量样品的准备：取部分上述准备好的待测总谷胱甘肽含量的样品，按照每100μl样品加入20μl稀释的GSH清除辅助液的比例加入稀释的 GSH清除辅助液，立即vortex混匀。再按照每100μl样品加入4μl GSH清除试剂工作液的比例加入GSH清除工作液，立即vortex混匀，25℃反应60min。通过上述反应可以清除高达50μM的GSH，如果样品中GSH含量过高需进行适当稀释后再进行去除GSH的操作。通过上述处理就可以用于后续的测定。
(3)参考下表，使用96孔板，依次加入样品或标准品，混匀。加入150μl总谷胱甘肽检测工作液后，混匀，25℃或室温孵育5min。
表15肾脏中GSH含量测定加样表(μL)
Figure RE-GDA0002949141870000301
(3)反应25min(或30-60min)后测定412nm处吸光度。
通过以上方法，得出的数据如下：
表16 STZ诱导小鼠GSH含量实验数据
Figure RE-GDA0002949141870000302
Figure RE-GDA0002949141870000311
本实验利用GSH试剂盒，对给药8周后糖尿病小鼠的肾脏组织进行GSH 含量测试，通过肾脏中GSH的含量，体现药物的抗氧化能力及治疗效果。以上各组测定值均为给药8周后的测定值，其中正常组和空白组表示分别灌胃相应剂量的羧甲基纤维素钠溶液。分析上表得出，8周时，正常组小鼠GSH值为0.158 nmol/mgprot，Ctrl组为0.085nmol/mgprot，L-dose组为0.227nmol/mgprot，H-dose 组为0.263nmol/mgprot。通过统计软件SPSS.17.0分析得出，L-dose组和H-dose 组相较于Ctrl组均有显著性差异(p<0.05)；二甲双胍组为0.170nmol/mgprot，依帕司他组为0.174nmol/mgprot。说明该醛糖还原酶抑制剂在氧化应激过程中，可以增加肾脏组织内的谷胱甘肽含量。
实施例13.尿蛋白/肌酐测试
1、尿蛋白含量检测
1)试剂盒组成与溶液的配制：
试剂一：CBB试剂
试剂二：563mg/L标准蛋白溶液
2)实验步骤
(1)参考下表，使用96孔板，依次加入样品或标准品，混匀。
表17尿蛋白含量测定加样表(单位mL)
Figure RE-GDA0002949141870000312
Figure RE-GDA0002949141870000321
(2)尿蛋白含量计算公式：
Figure RE-GDA0002949141870000322
2、尿肌酐含量检测
1)试剂盒组成与溶液的配制：
试剂一：酶溶液A
试剂二：酶溶液B
试剂三：标准品(442μmol/L)
2)实验步骤
(1)参考下表，使用96孔板，依次加入样品或标准品，混匀。
表18尿肌酐含量测定加样表(单位10μL)
Figure RE-GDA0002949141870000323
(2)肌酐含量计算公式
Figure RE-GDA0002949141870000324
注：
Figure RE-GDA0002949141870000331
通过以上方法，得出的数据如下：
表12 STZ诱导小鼠尿蛋白/肌酐实验数据
Figure RE-GDA0002949141870000332
本实验利用尿蛋白含量和肌酐含量检测试剂盒，测量给药8周后糖尿病小鼠的尿蛋白/肌酐水平，体现药物在高血糖状态下对肾脏的治疗和保护效果。以上各组测定值均为给药8周后的测定值，其中正常组和空白组表示分别灌胃相应剂量的羧甲基纤维素钠溶液。分析上表得出，8周时，正常组小鼠尿蛋白/肌酐值为0.546，Ctrl组为1.012，L-dose组为0.477nmol/mgprot，H-dose组为0.584。通过统计软件SPSS.17.0分析得出，L-dose组和H-dose组相较于Ctrl组均有显著性差异(p<0.05)；二甲双胍组为0.832，依帕司他组为0.893。说明药物在高血糖状态下，可以有效地保护和治疗肾脏，降低尿蛋白水平。
实验方法和实验结果说明分析
本发明的苯并噁唑酮衍生物是高效的、高选择性、具有降血糖和抗氧化效果的的醛糖还原酶抑制剂，具备用于制备预防和/或治疗糖尿病并发症尤其是糖尿病肾病的药物的用途。STZ糖尿病小鼠的体内实验都说明了化合物1在降低患糖尿病机体内葡萄糖含量；同时降低脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量以及提高谷胱甘肽(GSH)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性方面有着显著地效果展现了明显的抗氧化效果；另外化合物1有效降低了糖尿病小鼠尿蛋白水平，体现化合物1在高血糖状态下对于肾脏的保护和治疗效果。
在本发明提及的所有参考文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。另外，本领域技术人员还可在本发明精神内作其它变化，当然这些依据本发明精神所作的变化，都应包含在本发明所要求保护的范围内。

Claims (7)

1.一种式Ⅰ所示的化合物或其药学上可以接受的盐或它们的混合物，
Figure FDA0002822209160000011
其中，X为-、或-CH＝CH-；
R1和R2各自独立地选自氢、羟基、甲氧基、或三氟甲基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物为下列化合物中的一个：
Figure FDA0002822209160000012
3.一种制备权利要求1所述的化合物其药学上可以接受的盐或它们的混合物的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)以化合物Ⅰa为原料，用1,1'-羰基二咪唑作为酰化试剂进行反应，由此得到化合物Ⅰb；
Figure FDA0002822209160000021
(ⅱ)以化合物Ⅰb为原料，在碱存在下，通过C-N键的生成在1位N上偶联上乙酸甲酯，由此得到化合物Ⅰc：
Figure FDA0002822209160000022
(ⅲ)以化合物Ⅰc为原料，在惰性条件、碱和金属催化剂存在下，通过C-C键的生成在3位C上偶联上取代或未取代的芳基、或芳烷基，由此得到化合物Ⅰd：
Figure FDA0002822209160000023
(ⅳ)以化合物Ⅰd为原料进行水解反应，由此得到化合物Ⅰe；
Figure FDA0002822209160000031
4.一种权利要求1或2所述的或其药学上可以接受的盐或它们的混合物在制备用于预防或治疗糖尿病并发症的药物中的用途。
5.一种醛糖还原酶抑制剂，其包含权利要求1或2所述的化合物或其药学上可以接受的盐或它们的混合物。
6.一种用于预防或治疗糖尿病并发症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含：治疗有有效量的权利要求1或2所述的化合物、药学上可以接受的盐或它们的混合物作为活性成分；和药学上可接受的载体、赋形剂或缓释剂。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂、悬浮剂或气雾剂，其所含活性成分占所述药物组合物总重量的0.01-99.9％。
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