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CN112566672A - 制造基于肽的疫苗的改进方法 - Google Patents

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CN112566672A
CN112566672A CN201980049152.1A CN201980049152A CN112566672A CN 112566672 A CN112566672 A CN 112566672A CN 201980049152 A CN201980049152 A CN 201980049152A CN 112566672 A CN112566672 A CN 112566672A
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CN
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peptide antigen
antigen conjugate
solution
sterile
conjugate
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CN201980049152.1A
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杰弗里·林恩
安德鲁·依希祖卡
文森特·科布尔
朱亚玲
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National Institutes of Health NIH
Original Assignee
Avidi Technology
National Institutes of Health NIH
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Abstract

公开了一种生产适合施用于哺乳动物的肽抗原偶联物的方法。所述肽抗原偶联物包含连接到疏水性嵌段的肽抗原。所述方法包括在使所述肽抗原与所述疏水性嵌段直接地或间接地连接的条件下，在疏水性嵌段片段与肽抗原片段摩尔比为1:1或更大的情况下，在药学上可接受的有机溶剂中，使疏水性嵌段片段与包含所述肽抗原的肽抗原片段反应；以及获得包含所述肽抗原偶联物、未反应的疏水性嵌段片段和药学上可接受的有机溶剂的产物溶液。

Description

制造基于肽的疫苗的改进方法
本发明在与美国健康与人类服务部(Department of Health and HumanServices)的机构国立卫生研究院(National Institutes of Health)的合作研究和开发协议的履行中产生。美国政府享有本发明的一定权利。
优先权
本申请要求于2018年5月22日提交的美国临时专利申请第62/674,752号的优先权，所述美国临时专利申请特此通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开总体上涉及个性化医学或精密医学领域，并且更具体地涉及用于个性化医学的疫苗的制造。
背景技术
对药物中存在的活性药物成分的应答可能因不同个体而改变，并且这种变化驱使人们对个性化医学(也称为精密医学)的兴趣日益增加。个性化医学涉及使用关于个体的基因、蛋白质和环境的信息来指导个体接受的医疗护理。提供对疾病分子基础的更多理解的新的诊断和信息学方法的持续发展，意味着有越来越多的患者特异性信息可用。
在癌症疗法中，关于个体的肿瘤的特定信息可用于协助诊断、设计治疗方案、了解治疗效果或做出预后。类似地，关于个体的基因、蛋白质和环境的特定信息可用于通过基于该信息开发疫苗来定制癌症治疗的预防性方法。对于某些癌症的免疫学治疗，一种优选的免疫应答是识别肿瘤相关抗原的CD8 T细胞应答和/或CD4 T细胞应答。然而，产生有效的针对癌症的T细胞免疫的主要挑战是，对于产生针对肿瘤相关抗原(特别是新抗原，其为个体患者通常所特有的肿瘤细胞特异性蛋白)的T细胞应答，大多数当前的疫苗方法受到有限的抗原宽度的阻碍。例如，关于抗原宽度，当前基于金标准肽的疫苗方法(即将25个氨基酸的合成长肽与佐剂polyIC:LC混合)诱导针对不到10％的预测新抗原的CD8 T细胞应答(参见：S.Kreiter等,Nature 520,692-696,2015)。因此，需要改进的基于肽的疫苗方法。
通过分别鉴定作为免疫介导的病变原因的特定自身抗原或外来抗原，有可能实现治疗自身免疫或过敏症的个性化方法。被鉴定为病变原因的抗原可以以基于肽的疫苗的形式施用，所述基于肽的疫苗能够诱导针对自身抗原或外来抗原的耐受性或抑制。例如，针对外来抗原的免疫应答可以是导致病变例如过敏症的特定类型的免疫应答。针对这种外来抗原的疫苗可以以基于肽的疫苗的形式提供，以将免疫应答转变为不会导致病变的类型。
包含肽抗原的免疫原性组合物可用作疫苗以在受试者中诱导免疫应答，包括用于治疗或预防癌症或感染性疾病，或者甚至用于诱导耐受性和/或免疫抑制以用于治疗或预防自身免疫或过敏症。用于诱导免疫应答以治疗或预防癌症和感染性疾病的基于肽的疫苗组合物可以含有基于肽的抗原和特定类型的佐剂，所述佐剂促进诱导抗原特异性细胞毒性T细胞应答和/或介导病原体清除或灭杀病毒感染细胞或癌细胞的抗体。相反，用于诱导致耐受性或抑制性应答的基于肽的疫苗的组合物可以含有抗原和媒介物(例如递送系统，如粒子载体)和/或免疫调节剂，例如mTOR抑制剂，但将缺乏诱导细胞毒性T细胞的特定佐剂，并且反而可诱导T细胞耐受或调控细胞例如调控性CD4 T细胞的活化，以下调或调节应答的定性特征。
开发用于癌症治疗的个性化疫苗方法的主要挑战是，关于如何最好地构建基于肽的疫苗来可靠地引发T细胞免疫，目前尚无共识。类似地，关于如何最好地构建基于肽的疫苗以诱导免疫耐受或将免疫应答从导致与过敏症相关的症状的免疫应答转变为无害类型的应答，尚无共识。
当前基于肽的疫苗递送平台面临的另一个主要挑战在于它们没有考虑到肽抗原的范围广泛的可能的物理和化学特征。例如，个体化的癌症疫苗方法可能需要生成一组特异性针对每个患者肿瘤的独特肽抗原。类似地，对于治疗自身免疫疾患的个体化方法，可以将多种不同的抗原鉴定为病变原因，并且导致病变的特定抗原集合在不同患者之间可能改变。因此，用于治疗自身免疫的诱导耐受性的疫苗可能需要含有每位患者特有的一组肽抗原。在每种情况下，每位患者特有的肽抗原集合将具有广泛范围的可能的物理和化学特征，这些特征可能会(i)当通过固相肽合成(SPPS)生产时引起制造挑战，以及(ii)导致由于肽抗原和/或疫苗制剂的其他组分(例如递送系统、免疫调节剂等)之间的不希望的相互作用引起的或甚至由于疏水性肽抗原的聚集而引起的制剂特征的可变性。
与基于肽的疫苗的制造相关的另一个挑战在于确保肽抗原可以作为粒子产生或配制在具有最佳尺寸(即在适当的粒度范围内)的粒子载体内，以允许被抗原呈递细胞有效摄取以诱导体内免疫应答(M.F.Bachmann等,Nat Rev Immunol,10,787-796,2010)。由于粒度(范围)是影响包含基于肽的疫苗的免疫原性组合物在体内诱导免疫应答的能力的重要参数，因此可靠的纳米粒子组装和对粒度(范围)的控制在基于肽的疫苗的任何制造过程中都是重要的。然而，出于任何一个或多个以下原因，目前制造呈粒子形式的基于肽的疫苗的方法可能不令人满意：它们涉及费时的制备；它们导致粒度(范围)的变化程度达到不可接受的水平；和/或它们涉及使用不适合施用于患者的有机溶剂，因此可能需要进行另外的测试，以确保在施用于患者之前已除去了这类潜在有害的溶剂。
本发明人先前已经开发了新颖的基于肽的疫苗组合物，其克服了当前基于肽的疫苗方法的局限性。所述新颖的基于肽的疫苗组合物考虑到了肽抗原的物理和化学性质的可变性，因此可推广到任何肽抗原，从而确保了制剂的一致性和对于可用于诱导受试者的免疫应答的宽泛范围的可能的肽抗原的可靠活性。新颖的基于肽的疫苗组合物在个性化癌症治疗领域中特别有用，其中个性化癌症疫苗中使用的肽抗原的特征在不同患者之间可能有所改变。然而，基于肽的疫苗组合物用于适应任何肽抗原的适用性意味着所述组合物还可以用于其他基于个性化免疫学的治疗，例如分别用于诱导耐受性或用于调节对过敏原的免疫应答以治疗自身免疫和过敏症。
已经开发了新颖的基于肽的疫苗组合物，现在需要用于制造基于肽的疫苗的方法，所述方法可靠、普遍适用和/或可以适应肽抗原的物理和/或化学性质的广泛范围的可变性。
发明内容
在第一方面，本公开提供了一种生产适合施用于哺乳动物的肽抗原偶联物的方法，所述肽抗原偶联物包含连接到疏水性嵌段的肽抗原，所述方法包括：在使所述肽抗原与所述疏水性嵌段直接地或间接地连接的条件下，在疏水性嵌段片段与肽抗原片段摩尔比为1:1或更大的情况下，在药学上可接受的有机溶剂中，使疏水性嵌段片段与包含所述肽抗原的肽抗原片段反应；以及获得包含所述肽抗原偶联物、未反应的疏水性嵌段片段和药学上可接受的有机溶剂的产物溶液。
在第一方面的某些实施方式中，所形成的产物溶液包含未反应的疏水性嵌段片段，并且所述未反应的疏水性嵌段片段未从产物溶液中除去。
在第一方面的某些实施方式中，所述方法还包括无菌过滤所述产物溶液以获得包含肽抗原偶联物、任何未反应的疏水性嵌段片段和药学上可接受的有机溶剂的无菌产物溶液。在这些实施方式中的某些实施方式中，所述方法还包括向所述无菌产物溶液中添加过量体积的水性缓冲剂，接着混合以产生包含肽抗原偶联物、任何未反应的疏水性嵌段片段、药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。所述肽抗原偶联物粒子的水溶液可以包含未反应的疏水性嵌段片段和未从肽抗原偶联物粒子的水溶液中除去的未反应的疏水性嵌段片段。在这些实施方式中的某些实施方式中，所述方法不涉及除去药学上可接受的有机溶剂。
在第一方面的某些实施方式中，所述方法还包括将所述无菌产物溶液冻干以获得冻干无菌产物。在这些实施方式中的某些实施方式中，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述冻干无菌产物中，接着混合以产生包含肽抗原偶联物、任何未反应的疏水性嵌段片段和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
在第一方面的某些实施方式中，所述方法还包括纯化所述肽抗原偶联物以获得呈冻干纯化肽抗原偶联物形式的纯化肽抗原偶联物和/或包含纯化肽抗原偶联物和药学上可接受的有机溶剂的纯化肽抗原偶联物溶液。在这些实施方式中的某些实施方式中，所述方法还包括无菌过滤所述纯化肽抗原偶联物溶液以获得包含肽抗原偶联物和药学上可接受的有机溶剂的无菌纯化肽抗原偶联物溶液。在这些实施方式中的某些实施方式中，所述方法还包括向所述无菌纯化肽抗原偶联物溶液中添加过量体积的水性缓冲剂，接着混合以产生包含肽抗原偶联物、药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
在第一方面的某些实施方式中，所述方法还包括将所述无菌纯化肽抗原偶联物溶液冻干以获得冻干无菌纯化肽抗原偶联物。在这些实施方式中的某些实施方式中，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到冻干无菌纯化肽抗原偶联物中，接着混合以产生包含肽抗原偶联物和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
在第一方面的某些实施方式中，所述方法还包括分析所述产物溶液、无菌产物溶液、冻干无菌产物、冻干纯化肽抗原偶联物、纯化肽抗原偶联物溶液、无菌纯化肽抗原偶联物溶液和/或冻干无菌纯化肽抗原偶联物在添加水性缓冲剂后形成聚集物质的倾向，所述分析包括：(i)将特定体积的产物溶液、无菌产物溶液、纯化肽抗原偶联物溶液和/或无菌纯化肽抗原偶联物溶液从第一容器等分到第二容器中，和/或将特定质量的冻干无菌产物、冻干纯化肽抗原偶联物和/或冻干无菌纯化肽抗原偶联物从第一容器添加到第二容器中；(ii)向所述第二容器中添加一定体积的水性缓冲剂，以获得包含肽抗原偶联物和任何未反应的疏水性嵌段片段的肽抗原偶联物粒子的水溶液，其中所述肽抗原偶联物的浓度不低于0.01mg/mL；(iii)通过测量在大于350nm的波长下的吸光度来评定肽抗原偶联物粒子的水溶液的浊度；以及(iv)基于所述肽抗原偶联物粒子的水溶液的吸光度与仅水性缓冲剂的吸光度的比较，确认所述肽抗原偶联物粒子的水溶液中存在或不存在聚集物质。
在第一方面的某些实施方式中，药学上可接受的有机溶剂选自由二甲亚砜(DMSO)、甲醇和乙醇组成的组中的一种或多种。在这些实施方式中的某些实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是DMSO。
在第一方面的某些实施方式中，肽抗原片段具有选自[C]-[B1]-A-[B2]-X1、[B1]-A-[B2]-X1([C])、X1-[B1]-A-[B2]-[C]或X1([C])-[B1]-A-[B2]的式，其中C是带电荷部分，B1是N端延长部，A是肽抗原，B2是C端延长部，[]表示所述基团是任选的，并且X1是包含第一反应性官能团的连接物前体；并且疏水性嵌段片段具有选自X2-H、X2([C])-H或X2-H([C])的式，其中H是疏水性嵌段，C是带电荷部分，[]表示所述基团是任选的，并且X2是包含与第一反应性官能团反应的第二反应性官能团的连接物前体，并且X1和X2进行反应以形成共价键，从而产生连接物L。
在某些实施方式中，肽抗原偶联物具有式[C]-[B1]-A-[B2]-L-H。在这些实施方式中的某些实施方式中，肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的式：A-L-H、C-A-L-H、B1-A-L-H、A-B2-L-H、C-B1-A-L-H、C-A-B2-L-H和C-B1-A-B2-L-H。
在某些实施方式中，肽抗原偶联物具有式H-L-[B1]-A-[B2]-[C]。在这些实施方式中的某些实施方式中，肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的分子式：H-L-A、H-L-A-C、H-L-B1-A、H-L-A-B2、H-L-B1-A-C、H-L-A-B2-C和H-L-B1-A-B2-C。
在第一方面的某些实施方式中，疏水性嵌段包含基于聚(氨基酸)的聚合物。在这些实施方式中的某些实施方式中，所述基于聚(氨基酸)的聚合物包含芳环或杂环芳环。在这些实施方式中的某些实施方式中，所述基于聚(氨基酸)的聚合物包含芳基胺。
根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在疏水性嵌段片段与肽抗原片段摩尔比为约1:1至约3:1的情况下，使所述疏水性嵌段片段与所述肽抗原片段反应。
在第一方面的某些实施方式中，在疏水性嵌段片段与肽抗原片段摩尔比为1:1至约12:10的情况下，使所述疏水性嵌段片段与所述肽抗原片段反应。
在第一方面的某些实施方式中，所述方法还包括形成包含两种或更多种肽抗原偶联物的肽抗原偶联物混合物或冻干肽抗原偶联物混合物，所述方法包括：将特定体积的包含第一肽抗原偶联物的第一产物溶液、包含第一肽抗原偶联物的第一纯化肽抗原偶联物溶液、包含第一肽抗原偶联物的第一无菌产物溶液和/或包含第一肽抗原偶联物的第一无菌纯化肽抗原偶联物溶液与至少包含第二肽抗原偶联物的第二产物溶液、包含第二肽抗原偶联物的第二纯化肽抗原偶联物溶液、包含第二肽抗原偶联物的第二无菌产物溶液和/或包含第二肽抗原偶联物的第二无菌纯化肽抗原偶联物溶液组合，以获得至少包含第一肽抗原偶联物和第二肽抗原偶联物、任何未反应的疏水性嵌段片段和药学上可接受的有机溶剂的肽抗原偶联物混合物；和/或将特定质量的包含第一肽抗原偶联物的第一冻干产物、包含第一肽抗原偶联物的第一冻干纯化肽抗原偶联物、包含第一肽抗原偶联物的第一冻干无菌产物和/或包含第一肽抗原偶联物的第一冻干无菌纯化肽抗原偶联物与至少特定质量的包含第二肽抗原偶联物的第二冻干产物、包含第二肽抗原偶联物的第二冻干纯化肽抗原偶联物、包含第二肽抗原偶联物的第二冻干无菌产物和/或包含第二肽抗原偶联物的第二冻干无菌纯化肽抗原偶联物组合，以获得至少包含第一肽抗原偶联物和第二肽抗原偶联物以及任何未反应的疏水性嵌段片段的冻干肽抗原偶联物混合物。
在某些实施方式中，肽抗原偶联物混合物包含未反应的疏水性嵌段片段，并且所述未反应的疏水性嵌段片段未从肽抗原偶联物混合物中除去。
在某些实施方式中，将特定体积的第一产物溶液、第一纯化肽抗原偶联物溶液、第一无菌产物溶液和/或第一无菌纯化肽抗原偶联物溶液与至少第二产物溶液、第二纯化肽抗原偶联物溶液、第二无菌产物溶液和/或第二无菌纯化肽抗原偶联物溶液组合的步骤包括选择并转移特定体积的溶液以从一个容器转移到第二容器，所述方法包括以下步骤：(i)确定至少第一产物溶液、第一纯化肽抗原偶联物溶液、第一无菌产物溶液、第一无菌纯化肽抗原偶联物溶液、第二产物溶液、第二纯化肽抗原偶联物溶液、第二无菌生产溶液和/或第二无菌纯化肽抗原偶联物溶液中的肽抗原偶联物的摩尔浓度；(ii)将特定体积的至少第一产物溶液、第一纯化肽抗原偶联物溶液、第一无菌产物溶液和/或第一无菌纯化肽抗原偶联物溶液和第二产物溶液、第二纯化肽抗原偶联物溶液、第二无菌产物溶液和/或第二无菌纯化肽抗原偶联物溶液从第一容器等分到第二容器中，以获得特定摩尔含量的各第一肽抗原偶联物和第二肽抗原偶联物。
在某些实施方式中，确定至少第一产物溶液、第一纯化肽抗原偶联物溶液、第一无菌产物溶液、第一无菌纯化肽抗原偶联物溶液、第二产物溶液、第二纯化肽抗原偶联物溶液、第二无菌产物溶液和/或第二无菌纯化肽抗原偶联物溶液中的肽抗原偶联物的摩尔浓度的方法包括测量所述肽抗原偶联物在约300至约350nm之间的波长下的UV-Vis吸收。
在某些实施方式中，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到肽抗原偶联物混合物中，接着混合以产生至少包含第一肽抗原偶联物和第二肽抗原偶联物、任何未反应的疏水性嵌段片段、任何药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的水溶液。
在某些实施方式中，所述方法还包括将肽抗原偶联物混合物冻干以获得冻干肽抗原偶联物混合物。在这些实施方式中的某些实施方式中，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述冻干肽抗原偶联物混合物中，接着混合以产生至少包含第一肽抗原偶联物和第二肽抗原偶联物、任何未反应的疏水性嵌段片段和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的水溶液。
在某些实施方式中，所述方法还包括无菌过滤所述肽抗原偶联物混合物以获得无菌肽抗原偶联物混合物。在这些实施方式中的某些实施方式中，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述无菌肽抗原偶联物混合物产物中，接着混合以产生至少包含第一肽抗原偶联物和第二肽抗原偶联物、任何未反应的疏水性嵌段片段、药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
在某些实施方式中，所述方法还包括将无菌肽抗原偶联物混合物冻干以获得冻干无菌肽抗原偶联物混合物。在这些实施方式中的某些实施方式中，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到无菌肽抗原偶联物混合物中，接着混合以产生至少包含第一肽抗原偶联物和第二肽抗原偶联物、任何未反应的疏水性嵌段片段和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
在第二方面，本公开提供了一种用于生产适合施用于哺乳动物的肽抗原偶联物的固相肽合成方法，所述肽抗原偶联物包含连接到疏水性嵌段的肽抗原，所述方法包括：提供固相树脂结合的疏水性嵌段片段；通过依次偶联独立的氨基酸和/或聚氨基酸片段以形成与所述树脂结合的疏水性嵌段偶联的肽抗原片段，或将肽抗原片段与所述树脂结合的疏水性嵌段偶联，形成树脂结合的肽抗原偶联物；从所述树脂上切割肽抗原偶联物以获得肽抗原偶联物；以及纯化所述肽抗原偶联物，以获得呈冻干纯化肽抗原偶联物形式的纯化肽抗原偶联物和/或包含所述纯化肽抗原偶联物和药学上可接受的有机溶剂的纯化肽抗原偶联物溶液。
在第二方面的某些实施方式中，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到冻干纯化肽抗原偶联物中，接着混合以产生包含肽抗原偶联物和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的水溶液，或者将过量体积的水性缓冲剂添加到纯化肽抗原偶联物溶液中，接着混合以产生包含肽抗原偶联物、药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的水溶液。
在第二方面的某些实施方式中，所述方法还包括无菌过滤所述纯化肽抗原偶联物溶液以获得包含肽抗原偶联物和药学上可接受的有机溶剂的无菌纯化肽抗原偶联物溶液。在某些实施方式中，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到无菌纯化肽抗原偶联物溶液中，接着混合以产生包含肽抗原偶联物、药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
在第二方面的某些实施方式中，所述方法还包括将所述无菌纯化肽抗原偶联物溶液冻干以获得冻干无菌纯化肽抗原偶联物。在某些实施方式中，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述冻干无菌纯化肽抗原偶联物中，接着混合以产生包含肽抗原偶联物和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
在第二方面的某些实施方式中，所述方法还包括分析所述冻干纯化肽抗原偶联物、纯化肽抗原偶联物溶液、无菌纯化肽抗原偶联物溶液和/或冻干无菌纯化肽抗原偶联物在添加水性缓冲剂后形成聚集物质的倾向，所述分析包括以下步骤：(i)将特定体积的纯化肽抗原偶联物溶液和/或无菌纯化肽抗原偶联物溶液从第一容器等分到第二容器中，和/或将特定质量的冻干纯化肽抗原偶联物和/或冻干无菌纯化肽抗原偶联物从第一容器添加到第二容器中；(ii)向所述第二容器中添加一定体积的水性缓冲剂，以获得包含肽抗原偶联物的肽抗原偶联物粒子的水溶液，其中肽抗原偶联物的浓度不低于0.01mg/mL；(iii)通过测量水性混合物在大于350nm的波长下的吸光度来评定肽抗原偶联物粒子的水溶液的浊度；以及(iv)基于肽抗原偶联物粒子的水溶液的吸光度与仅水性缓冲剂的吸光度的比较，确认肽抗原偶联物粒子的水溶液中存在或不存在聚集物质。
在第二方面的某些实施方式中，药学上可接受的有机溶剂选自由二甲亚砜(DMSO)、甲醇和乙醇组成的组中的一种或多种。在某些实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是DMSO。
在第二方面的某些实施方式中，肽抗原片段具有选自[C]-[B1]-A-[B2]或[B1]-A-[B2]-[C]的式，其中C是带电荷部分，B1是N端延长部，A是肽抗原，B2是C端延长部，并且[]表示所述基团是任选的。
在第二方面的某些实施方式中，肽抗原偶联物具有式[C]-[B1]-A-[B2]-H，其中H是疏水性嵌段。在某些实施方式中，肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的式：A-H、C-A-H、B1-A-H、A-B2-H、C-B1-A-H、C-A-B2-H和C-B1-A-B2-H。
在第二方面的某些实施方式中，肽抗原偶联物具有式H-[B1]-A-[B2]-[C]。在某些实施方式中，肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的式：H-A、H-A-C、H-B1-A、H-A-B2、H-B1-A-C、H-A-B2-C和H-B1-A-B2-C。
在第二方面的某些实施方式中，疏水性嵌段包含基于聚(氨基酸)的聚合物。在某些实施方式中，所述基于聚(氨基酸)的聚合物包含芳环或杂环芳环。在某些实施方式中，所述基于聚(氨基酸)的聚合物包含芳基胺。
在第二方面的某些实施方式中，所述方法还包括形成包含两种或更多种肽抗原偶联物的肽抗原偶联物混合物，所述方法包括：将特定体积的包含第一肽抗原偶联物的第一纯化肽抗原偶联物溶液和/或包含第一肽抗原偶联物的第一无菌纯化肽抗原偶联物溶液与至少包含第二肽抗原偶联物的第二纯化肽抗原偶联物溶液和/或包含第二肽抗原偶联物的第二无菌纯化肽抗原偶联物溶液组合，以获得至少包含第一肽抗原偶联物和第二肽抗原偶联物以及药学上可接受的有机溶剂的肽抗原偶联物混合物；和/或将特定质量的包含第一肽抗原偶联物的第一冻干纯化肽抗原偶联物和/或包含第一肽抗原偶联物的第一冻干无菌纯化肽抗原偶联物与至少特定质量的包含第二肽抗原偶联物的第二冻干纯化肽抗原偶联物和/或包含第二肽抗原偶联物的第二冻干无菌纯化肽抗原偶联物组合，以获得至少包含第一肽抗原偶联物和第二肽抗原偶联物的肽抗原偶联物混合物。
在某些实施方式中，将特定体积的第一纯化肽抗原偶联物溶液和/或第一无菌纯化肽抗原偶联物溶液与至少第二纯化肽抗原偶联物溶液和/或第二无菌纯化肽抗原偶联物溶液组合的步骤包括选择并转移特定体积的溶液以从一个容器转移到第二容器，所述方法包括以下步骤：(i)确定至少第一纯化肽抗原偶联物溶液、第一无菌纯化肽抗原偶联物溶液、第二纯化肽抗原偶联物溶液和/或第二无菌纯化肽抗原偶联物溶液中的肽抗原偶联物的摩尔浓度；(ii)将特定体积的至少第一纯化肽抗原偶联物溶液、第一无菌纯化肽抗原偶联物溶液和第二纯化肽抗原偶联物溶液和/或第二无菌纯化肽抗原偶联物溶液从第一容器等分到第二容器中，以获得特定摩尔含量的各第一肽抗原偶联物和第二肽抗原偶联物。
在某些实施方式中，确定至少第一纯化肽抗原偶联物溶液、第一无菌纯化肽抗原偶联物溶液、第二纯化肽抗原偶联物溶液和/或第二无菌纯化肽抗原偶联物溶液中的肽抗原偶联物的摩尔浓度的方法包括测量肽抗原偶联物在约300至约350nm之间的波长下的UV-Vis吸收。
在第二方面的某些实施方式中，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到肽抗原偶联物混合物中，接着混合以产生至少包含第一肽抗原偶联物和第二肽抗原偶联物、任何药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的水溶液。
在第二方面的某些实施方式中，所述方法还包括将肽抗原偶联物混合物冻干以获得冻干肽抗原偶联物混合物产物。在某些实施方式中，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到冻干肽抗原偶联物混合物中，接着混合以产生至少包含第一肽抗原偶联物和第二肽抗原偶联物和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的水溶液。
在第二方面的某些实施方式中，所述方法还包括无菌过滤所述肽抗原偶联物混合物以获得无菌肽抗原偶联物混合物。在某些实施方式中，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述无菌肽抗原偶联物混合物中，接着混合以产生至少包含第一肽抗原偶联物和第二肽抗原偶联物、药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
在第二方面的某些实施方式中，所述方法还包括将无菌肽抗原偶联物混合物冻干以获得冻干无菌肽抗原偶联物混合物。在某些实施方式中，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述冻干无菌肽抗原偶联物混合物中，接着混合以产生至少包含第一肽抗原偶联物和第二肽抗原偶联物和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
在第三方面，本公开提供了一种生产肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液的方法，所述方法包括：制备包含肽抗原偶联物和药学上可接受的有机溶剂的肽抗原偶联物溶液，所述肽抗原偶联物包含与疏水性嵌段连接的肽抗原；将所述肽抗原偶联物溶液无菌过滤以产生无菌肽抗原偶联物溶液；以及向所述无菌肽抗原偶联物溶液中添加水性缓冲剂，以产生所述肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
在第三方面的某些实施方式中，所述方法还包括：a')制备包含第二肽抗原偶联物和药学上可接受的有机溶剂的第二肽抗原偶联物溶液，所述第二肽抗原偶联物包含与疏水性嵌段连接的第二肽抗原；a")将特定体积的各所述肽抗原偶联物溶液和第二肽抗原偶联物溶液组合以获得包含两种或更多种不同肽抗原偶联物的肽抗原偶联物混合物，然后对所述肽抗原偶联物混合物进行步骤b)和c)。
在第三方面的某些实施方式中，所述方法还包括：a')制备包含第二肽抗原偶联物和药学上可接受的有机溶剂的第二肽抗原偶联物溶液，所述第二肽抗原偶联物包含与疏水性嵌段连接的第二肽抗原；b')将第二肽抗原偶联物溶液无菌过滤以产生第二无菌肽抗原偶联物溶液；以及b")将特定体积的各所述无菌肽抗原偶联物溶液和第二无菌肽抗原偶联物溶液组合以获得组合的无菌肽抗原偶联物溶液，然后对所述组合的无菌肽抗原偶联物溶液进行步骤c)。
在第三方面的某些实施方式中，所述方法还包括分析肽抗原偶联物溶液、第二肽抗原偶联物溶液、无菌肽抗原偶联物溶液、第二无菌肽抗原偶联物溶液、肽抗原偶联物混合物和/或无菌肽抗原偶联物混合物在添加水性缓冲剂后形成聚集物质的倾向，所述分析包括以下步骤：(i)将特定体积的肽抗原偶联物溶液、第二肽抗原偶联物溶液、无菌肽抗原偶联物溶液、第二无菌肽抗原偶联物溶液、肽抗原偶联物混合物和/或无菌肽抗原偶联物混合物从第一容器等分到第二容器中；(ii)向所述第二容器中添加一定体积的水性缓冲剂，以获得包含肽抗原偶联物的肽抗原偶联物粒子的水溶液，其中肽抗原偶联物的浓度不低于0.01mg/mL；(iii)通过测量水性混合物在大于350nm的波长下的吸光度来评定肽抗原偶联物粒子的水溶液的浊度；以及(iv)基于肽抗原偶联物粒子的水溶液的吸光度与仅水性缓冲剂的吸光度的比较，确认肽抗原偶联物粒子的水溶液中存在或不存在聚集物质。
在第三方面的某些实施方式中，药学上可接受的有机溶剂选自由二甲亚砜(DMSO)、甲醇和乙醇组成的组中的一种或多种。在某些实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是DMSO。
在第三方面的某些实施方式中，肽抗原偶联物具有式[C]-[B1]-A-[B2]-H，其中C是带电荷部分，B1是N端延长部，A是肽抗原，B2是C端延长部，H是疏水性嵌段，并且[]表示所述基团是任选的。在某些实施方式中，肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的式：A-H、C-A-H、B1-A-H、A-B2-H、C-B1-A-H、C-A-B2-H和C-B1-A-B2-H。
在第三方面的某些实施方式中，肽抗原偶联物具有式H-[B1]-A-[B2]-[C]，其中H是疏水性嵌段，B1是N端延长部，A是肽抗原，B2是C端延长部，C是带电荷部分，并且[]表示所述基团是任选的。在某些实施方式中，肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的式：H-A、H-A-C、H-B1-A、H-A-B2、H-B1-A-C、H-A-B2-C和H-B1-A-B2-C。
在第三方面的某些实施方式中，肽抗原偶联物具有式[C]-[B1]-A-[B2]-L-H，其中C是带电荷部分，B1是N端延长部，A是肽抗原，B2是C端延长部，H是疏水性嵌段，L是连接物，并且[]表示所述基团是任选的。在某些实施方式中，肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的式：A-L-H、C-A-L-H、B1-A-L-H、A-B2-L-H、C-B1-A-L-H、C-A-B2-L-H和C-B1-A-B2-L-H。
在第三方面的某些实施方式中，肽抗原偶联物具有式H-L-[B1]-A-[B2]-[C]，其中C是带电荷部分，B1是N端延长部，A是肽抗原，B2是C端延长部，H是疏水性嵌段，L是连接物，并且[]表示所述基团是任选的。在某些实施方式中，肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的式：H-L-A、H-L-A-C、H-L-B1-A、H-L-A-B2、H-L-B1-A-C、H-L-A-B2-C和H-L-B1-A-B2-C。
在第三方面的某些实施方式中，疏水性嵌段包含基于聚(氨基酸)的聚合物。在某些实施方式中，所述基于聚(氨基酸)的聚合物包含芳环或杂环芳环。在某些实施方式中，所述基于聚(氨基酸)的聚合物包含芳基胺。
在第四方面，本公开提供了一种用于分析包含与疏水性嵌段连接的肽抗原的肽抗原偶联物组合物在添加水性缓冲剂后形成聚集物质的倾向的方法，所述分析包括以下步骤：(i)将特定体积的肽抗原偶联物溶液从第一容器等分到第二容器中，和/或将特定质量的肽抗原偶联物从第一容器添加到第二容器中；(ii)向所述第二容器中添加一定体积的水性缓冲剂，以获得包含肽抗原偶联物的肽抗原偶联物粒子的水溶液，其中肽抗原偶联物的浓度不低于0.01mg/mL；(iii)通过测量水性混合物在大于350nm的波长下的吸光度来评定肽抗原偶联物粒子的水溶液的浊度；以及(iv)基于肽抗原偶联物粒子的水溶液的吸光度与仅水性缓冲剂的吸光度的比较，确认肽抗原偶联物粒子的水溶液中存在或不存在聚集物质。
在第四方面的某些实施方式中，肽抗原偶联物具有选自[C]-[B1]-A-[B2]-H或[B1]-A-[B2]-H([C])的式，其中C是带电荷部分，B1是N端延长部，A是肽抗原，B2是C端延长部，H是疏水性嵌段，并且[]表示所述基团是任选的。在某些实施方式中，肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的式：A-H、C-A-H、B1-A-H、A-B2-H、C-B1-A-H、C-A-B2-H和C-B1-A-B2-H。
在第四方面的某些实施方式中，肽抗原偶联物具有式H-[B1]-A-[B2]-[C]或H([C)]-[B1]-A-[B2]，其中B1是N端延长部，A是肽抗原，B2是C端延长部，C是带电荷部分，H是疏水性嵌段，并且[]表示所述基团是任选的。在某些实施方式中，肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的式：H-A、H-A-C、H-B1-A、H-A-B2、H-B1-A-C、H-A-B2-C和H-B1-A-B2-C。
在第四方面的某些实施方式中，肽抗原偶联物具有选自[C]-[B1]-A-[B2]-L-H、[B1]-A-[B2]-L([C])-H或[B1]-A-[B2]-L-H([C])的式，其中C是带电荷部分，B1是N端延长部，A是肽抗原，B2是C端延长部，H是疏水性嵌段，L是连接物，并且[]表示所述基团是任选的。在某些实施方式中，肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的式：A-L-H、C-A-L-H、B1-A-L-H、A-B2-L-H、C-B1-A-L-H、C-A-B2-L-H和C-B1-A-B2-L-H。
在第四方面的某些实施方式中，肽抗原偶联物具有选自H-L-[B1]-A-[B2]-[C]、H([C])-L-[B1]-A-[B2]或H-L([C])-[B1]-A-[B2]的式，其中C是带电荷部分，B1是N端延长部，A是肽抗原，B2是C端延长部，H是疏水性嵌段，L是连接物，并且[]表示所述基团是任选的。在某些实施方式中，肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的式：H-L-A、H-L-A-C、H-L-B1-A、H-L-A-B2、H-L-B1-A-C、H-L-A-B2-C和H-L-B1-A-B2-C。
在第四方面的某些实施方式中，疏水性嵌段包含基于聚(氨基酸)的聚合物。在某些实施方式中，所述基于聚(氨基酸)的聚合物包含芳环或杂环芳环。在某些实施方式中，所述基于聚(氨基酸)的聚合物包含芳基胺。
在第五方面，本公开提供了一种生产肽抗原偶联物混合物的方法，所述混合物包含与疏水性嵌段连接的第一肽抗原和与疏水性嵌段连接的至少第二肽抗原，所述方法包括：制备包含第一肽抗原偶联物和药学上可接受的有机溶剂的第一肽抗原偶联物溶液；制备包含第二肽抗原偶联物和药学上可接受的有机溶剂的至少第二肽抗原偶联物溶液；将特定体积的肽抗原偶联物溶液组合，以获得包含第一肽抗原偶联物和至少第二肽抗原偶联物以及药学上可接受的有机溶剂的肽抗原偶联物混合物。
在第五方面的某些实施方式中，将特定体积的肽抗原偶联物溶液组合的步骤包括选择并转移特定体积的每种肽抗原偶联物溶液以从一个容器转移到第二容器，所述方法包括以下步骤：(i)确定每种肽抗原偶联物溶液中肽抗原偶联物的摩尔浓度；(ii)将特定体积的每种肽抗原偶联物溶液从第一容器等分到第二容器中，以获得特定摩尔含量的每种肽抗原偶联物。
在第五方面的某些实施方式中，确定每种肽抗原偶联物溶液中肽抗原偶联物的摩尔浓度的方法包括测量肽抗原偶联物在约300至约350nm之间的波长下的UV-Vis吸收。
在第五方面的某些实施方式中，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到肽抗原偶联物混合物中，接着混合以产生包含第一肽抗原偶联物和至少第二肽抗原偶联物、药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的水溶液。
在第五方面的某些实施方式中，所述方法还包括将肽抗原偶联物混合物冻干以获得冻干肽抗原偶联物混合物。在某些实施方式中，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到冻干肽抗原偶联物混合物中，接着混合以产生包含第一肽抗原偶联物和至少第二肽抗原偶联物、药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的水溶液。
在第五方面的某些实施方式中，所述方法还包括无菌过滤所述肽抗原偶联物混合物以获得无菌肽抗原偶联物混合物。在某些实施方式中，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到无菌肽抗原偶联物混合物中，接着混合以产生包含第一肽抗原偶联物和至少第二肽抗原偶联物、药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
在第五方面的某些实施方式中，所述方法还包括将所述无菌肽抗原偶联物混合物冻干以获得冻干无菌肽抗原偶联物混合物。在某些实施方式中，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到冻干无菌肽抗原偶联物混合物中，接着混合以产生包含第一肽抗原偶联物和至少第二肽抗原偶联物、药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
在第五方面的某些实施方式中，所述方法还包括分析肽抗原偶联物混合物、冻干肽抗原偶联物混合物、无菌肽抗原偶联物混合物和/或冻干无菌肽抗原偶联物混合物在添加水性缓冲剂后形成聚集物质的倾向，所述分析包括以下步骤：(i)将特定体积的肽抗原偶联物混合物和/或无菌肽抗原偶联物混合物从第一容器等分到第二容器中，和/或将特定质量的冻干肽抗原偶联物混合物和/或冻干无菌肽抗原偶联物混合物从第一容器添加到第二容器中；(ii)向所述第二容器中添加一定体积的水性缓冲剂以获得包含第一肽抗原偶联物和至少第二肽抗原偶联物的肽抗原偶联物粒子的水溶液，其中肽抗原偶联物的浓度不低于0.01mg/mL；(iii)通过测量水性混合物在大于350nm的波长下的吸光度来评定肽抗原偶联物粒子的水溶液的浊度；以及(iv)基于肽抗原偶联物粒子的水溶液的吸光度与仅水性缓冲剂的吸光度的比较，确认肽抗原偶联物粒子的水溶液中存在或不存在聚集物质。
在第五方面的某些实施方式中，用于选择要包括在肽抗原偶联物混合物中的第一肽抗原偶联物和至少第二肽抗原偶联物的组成和体积的方法包括以下步骤中的任何一者或两者：(i)确定肽抗原偶联物溶液中肽抗原偶联物的摩尔浓度；(ii)在添加过量的水性缓冲剂以将肽抗原偶联物稀释至不低于0.01mg/mL的浓度后，确定每种肽抗原偶联物溶液形成聚集物质的倾向。
在第五方面的某些实施方式中，源自于各自单独地具有在添加水性缓冲剂后形成聚集物质的倾向的肽抗原偶联物混合物和/或无菌肽抗原偶联物混合物的肽抗原偶联物的摩尔浓度占肽抗原偶联物混合物中的肽抗原偶联物的总摩尔含量的60％以下。
在第五方面的某些实施方式中，确定肽抗原偶联物混合物和/或无菌肽抗原偶联物混合物中的肽抗原偶联物的摩尔浓度的方法包括测量肽抗原偶联物在约300至约350nm之间的波长下的UV-Vis吸收。
在第六方面，本公开提供了通过第一方面和第二方面中任一者的方法产生的肽抗原偶联物。
在第七方面，本公开提供了包含第六方面的肽抗原偶联物的免疫原性组合物。
在第八方面，本公开提供了通过第三方面的方法产生的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
在第九方面，本公开提供了通过第五方面的方法产生的肽抗原偶联物混合物。
附图说明
将参考附图讨论本公开的实施方式，其中：
图1是本公开的一个或多个实施方式的制造过程的示意性略图；
图2显示了一种完全通过固相肽合成来生产基于肽的疏水性嵌段片段(X2-H)的可能的合成途径。
图3显示了使用固相肽合成和溶液相合成的组合来生产基于肽的疏水性嵌段片段(X2-H)的四种可能的合成途径。
图4显示了根据本公开的实施方式的用于生产疏水性嵌段片段的反应方案1.4的实例；
图5显示了根据本公开的实施方式的用于生产疏水性嵌段片段的反应方案1.5的实例；
图6显示了肽抗原片段(例如C1-B1-A-B2-X1)和疏水性嵌段片段(X2-H)在DMSO中的叠氮化物-炔烃反应的HPLC迹线，所述反应导致肽抗原片段完全转化为肽抗原偶联物(C-B1-A-B2-L-H)；
图7A显示了肽抗原片段(例如C1-B1-A-B2-X1)和疏水性嵌段片段(X2-H)的反应随时间的HPLC迹线，所述反应导致肽抗原片段完全转化为肽抗原偶联物(C-B1-A-B2-L-H)，其是通过使用过量的疏水性嵌段片段驱动的；
图7B显示了由肽抗原片段(例如C1-B1-A-B2-X1)和疏水性嵌段片段(X2-H)的反应产生的肽抗原偶联物形成的反应动力学；
图8显示了肽抗原片段(例如C1-B1-A-B2-X1)和疏水性嵌段片段(X2-H)之间的反应的动力学曲线。所述反应不受肽抗原(A)长度或疏水性嵌段(H)组成的影响；
图9显示了由肽抗原片段(例如C1-B1-A-B2-X1)与疏水性嵌段片段(X2-H)之间的反应产生的肽抗原偶联物形成随时间的HPLC迹线，所述反应通过提高反应温度和试剂浓度来加速。在升高的温度和试剂浓度下未观察到副产物或分解；
图10A是图10中所示的HPLC迹线中所示的反应动力学的图；
图10B是总结了反应温度和试剂浓度如何影响肽抗原片段(例如C1-B1-A-B2-X1)和疏水性嵌段片段(X2-H)之间的偶联反应动力学的计算半衰期(T1/2)的图；
图11A显示了肽抗原片段(例如C1-B1-A-B2-X1)和疏水性嵌段片段(X2-H)以及含有过量疏水性嵌段片段(X2-H)的产物溶液的HPLC迹线，所述过量疏水性嵌段片段(X2-H)可以通过色谱分离(即HPLC)去除，以产生纯化肽抗原偶联物溶液；
图11B是显示与添加水性缓冲剂后的纯化肽抗原偶联物溶液相比，过量的疏水性嵌段片段(X2-H)对由产物溶液形成的疫苗粒子尺寸的影响的图。数据表明，通过色谱分离除去过量的疏水性嵌段片段对疫苗粒子尺寸没有明显的影响；
图11C是显示在用疫苗粒子的水溶液对小鼠进行两次疫苗接种后过量的疏水性嵌段片段(X2-H)对CD8 T细胞应答的影响的图，所述疫苗粒子的水溶液是通过向包含肽抗原偶联物和任何未反应的疏水性嵌段片段的产物溶液中添加水性缓冲剂而形成的，或者通过向纯化肽抗原偶联物溶液中添加水性缓冲剂而形成的；
图12A显示了通过改变用于与肽抗原片段(例如C1-B1-A-B2-X1)反应的疏水性嵌段片段(X2-H)的摩尔比而获得的不同产物溶液的HPLC色谱图；
图12B是显示过量(即未反应的)疏水性嵌段片段(X2-H)如何影响水溶液的浊度或水溶液中疫苗粒子尺寸的图，所述水溶液是通过将水性缓冲剂添加到具有不同量的未反应的疏水性嵌段片段的产物溶液中而形成的；
图13是一系列图和表格，其显示了在将水性缓冲剂添加到不同组成的肽抗原偶联物混合物之后，构成肽抗原偶联物混合物的单个肽抗原(A)的电荷和亲水性变化如何影响肽抗原偶联物粒子的水溶液的浊度和疫苗粒子的尺寸；
图14显示了具有极端电荷、亲水性和流体动力学行为(即如由浊度测量指示的形成聚集体的倾向)的肽抗原(A)如何影响疫苗粒子的尺寸以及在向不同组成的肽抗原偶联物混合物中添加水性缓冲剂后形成的肽抗原偶联物粒子的水溶液的浊度；
图15A显示了在使用包含PTFE膜的过滤器进行无菌过滤之前和之后，包含肽抗原偶联物的产物溶液的HPLC色谱图；
图15B是显示在无菌过滤产物溶液以产生无菌产物溶液之后，无菌过滤技术和滤膜组成如何影响肽抗原偶联物的回收率的图；
图16显示了在使用包含PTFE膜的过滤器进行无菌过滤之前和之后，肽抗原偶联物混合物的HPLC色谱图；
图17显示了示意性流程图：将肽抗原偶联物混合以产生肽抗原偶联物混合物；将所述肽抗原偶联物混合物无菌过滤以产生无菌肽抗原偶联物混合物；然后将过量的水性缓冲剂添加到无菌肽抗原偶联物混合物中以产生由纳米粒子胶束构成的肽抗原偶联物粒子的水溶液；
图18A是显示了肽抗原偶联物粒子随时间的粒度变化的图，所述肽抗原偶联物粒子在本实施例中为纳米粒子胶束，其是通过向包含单个肽抗原偶联物、未反应的疏水性嵌段片段和DMSO的产物溶液中添加过量的水性缓冲剂而形成的；
图18B是显示了肽抗原偶联物粒子随时间的粒度变化的图，所述肽抗原偶联物粒子在本实施例中为纳米粒子胶束，其是通过向包含7种不同的肽抗原偶联物、任何未反应的疏水性嵌段片段和DMSO的肽抗原偶联物混合物中添加过量的水性缓冲剂而形成的；
图19显示了证明药学上可接受的有机溶剂(在本实施例中为DMSO)如何影响肽抗原偶联物粒子的水溶液的(A)粒度、(B&C)免疫原性和(D&E)全身毒性的图，所述肽抗原偶联物粒子的水溶液是通过将过量的水性缓冲剂添加到包含5种不同肽抗原偶联物、任何未反应的疏水性嵌段片段和DMSO的不同肽抗原偶联物混合物中而形成的。将四组肽抗原偶联物混合物从DMSO悬浮在PBS中，得到肽抗原偶联物粒子于12.5％v/v DMSO(a-d 12.5％DMSO)中的水溶液；或者将四组肽抗原偶联物混合物冻干以得到固体，将其重悬于PBS中以得到不含DMSO的肽抗原偶联物粒子(或“纳米粒子胶束”)的水溶液(a-d；无DMSO)；
图20显示了基于式C-[B1]-A-B2-L-H的带负电荷的肽抗原偶联物的肽抗原偶联物粒子水溶液的粒度测量，所述肽抗原偶联物即Ac-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Val-Cit-Thr-Ala-Pro-Asp-Asn-Leu-Gly-Tyr-Met-Ser-Pro-Val-Cit-Lys(N3-DBCO)-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-NH2和Ac-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Gly-Ile-Pro-Val-His-Leu-Glu-Leu-Ala-Ser-Met-Thr-Asn-Met-Glu-Leu-Met-Ser-Ser-Ile-Val-His-Gln-Gln-Val-Phe-Pro-Thr-Ser-Pro-Val-Cit-Lys(N3-DBCO)-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-NH2，分别称为Adpgk肽抗原偶联物和Trp1肽抗原偶联物，具有不同摩尔当量的Tris(相对于肽抗原偶联物上存在的酸的摩尔数)；
图21显示了通过SC途径用不同剂量(8至100nmol)的MC38小鼠肿瘤新抗原Adpgk进行疫苗接种的C57BL/6小鼠(每组n＝5)的CD8 T细胞应答动力学，所述新抗原Adpgk以不同组成的式C-B1-A-B2-L-H的肽抗原偶联物递送，即(A)作为Tris铵盐的带净负电荷序列(缩写为(-)有Tris)，(B)无Tris的带净负电荷序列(缩写为(-)无Tris)或(C)带正电荷序列(缩写为(+))。在第0、14和28天对小鼠进行疫苗接种。在第12、21和35天，使用针对IFN-g产生的细胞内细胞因子染色测定，从全血测量CD8 T细胞应答；
图22显示了通过SC途径用不同剂量(8和32nmol)的MC38小鼠肿瘤新抗原Cpne1进行疫苗接种的C57BL/6小鼠(每组n＝3)的CD8 T细胞应答动力学，所述新抗原Cpne1以式C-B1-A-B2-L-H的肽抗原偶联物形式递送，其包含具有正电荷的带电荷部分，即Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Val-Arg-Asp-Phe-Thr-Gly-Ser-Asn-Gly-Asp-Pro-Ser-Ser-Pro-Try-Ser-Leu-His-Tyr-Leu-Ser-Pro-Thr-Gly-Val-Asn-Glu-Tyr-Ser-Pro-Val-Cit-Lys(N3-DBCO)-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-NH2(缩写为(+)CAH)，或具有负电荷的带电荷部分，以及由带有芳基胺的氨基酸构成的B2，即Ac-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Val-Cit-Asp-Phe-Thr-Gly-Ser-Asn-Gly-Asp-Pro-Ser-Ser-Pro-Try-Ser-Leu-His-Tyr-Leu-Ser-Pro-Thr-Gly-Val-Asn-Glu-Tyr-Ser-Pro-Val-Cit-Phe(NH2)-Phe(NH2)-Phe(NH2)-Phe(NH2)-Lys(N3-DBCO)-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-NH2(缩写为(-)CAH)，其中Phe(NH2)是对氨基-苯丙氨酸。在第0、14和28天对小鼠进行疫苗接种。在第7、21、35和42天，使用针对IFN-g产生的细胞内细胞因子染色测定，从全血测量CD8 T细胞应答；以及
图23显示了第21天通过SC途径用MC38小鼠肿瘤新抗原Adpgk进行疫苗接种的C57BL/6小鼠(每组n＝4)的CD8 T细胞应答，所述新抗原Adpgk以包含式A-B2-L-H的肽抗原偶联物和式C-L-H的带电荷两亲性载体分子的镶嵌粒子(缩写为AH+CH)或包含式A-B2-L-H的肽抗原偶联物和式C-B1-A'-B2-L-H(其中A'是保守抗原)的带电荷两亲性载体分子的镶嵌粒子(缩写为AH+CA'H)形式递送。在第0天和第14天对小鼠进行疫苗接种。在第21天，使用针对IFN-g产生的细胞内细胞因子染色测定，从全血测量CD8 T细胞应答。
具体实施方式
本文描述了一种生产适合施用于哺乳动物的肽抗原偶联物的方法。所述肽抗原偶联物包含连接到疏水性嵌段的肽抗原。所述方法包括在使肽抗原与疏水性嵌段直接地或间接地连接的条件下，在疏水性嵌段片段与肽抗原片段摩尔比为1:1或更大的情况下，在药学上可接受的有机溶剂中，使疏水性嵌段片段与包含所述肽抗原的肽抗原片段反应，以及获得包含肽抗原偶联物、未反应的疏水性嵌段片段和药学上可接受的有机溶剂的产物溶液。
本文还描述了一种固相肽合成方法，用于生产适合施用于哺乳动物的肽抗原偶联物。所述肽抗原偶联物包含连接到疏水性嵌段的肽抗原。
所述方法包括提供固相树脂结合的疏水性嵌段片段；通过依次偶联独立的氨基酸和/或聚氨基酸片段以形成与树脂结合的疏水性嵌段偶联的肽抗原片段，或使肽抗原片段与树脂结合的疏水性嵌段偶联，形成树脂结合的肽抗原偶联物；从树脂上切割肽抗原偶联物以获得肽抗原偶联物；以及纯化所述肽抗原偶联物，以获得呈冻干纯化肽抗原偶联物形式的纯化肽抗原偶联物和/或包含所述纯化肽抗原偶联物和药学上可接受的有机溶剂的纯化肽抗原偶联物溶液。或者，所述方法包括提供固相树脂结合的肽抗原片段；通过将疏水性嵌段片段与树脂结合肽抗原片段偶联以形成树脂结合的肽抗原偶联物，从而形成树脂结合的肽抗原偶联物；从树脂上切割肽抗原偶联物以获得肽抗原偶联物；以及纯化所述肽抗原偶联物，以获得呈冻干纯化肽抗原偶联物形式的纯化肽抗原偶联物和/或包含所述纯化肽抗原偶联物和药学上可接受的有机溶剂的纯化肽抗原偶联物溶液。
本文还描述了一种生产肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液的方法。所述方法包括制备包含肽抗原偶联物和药学上可接受的有机溶剂的肽抗原偶联物溶液，所述肽抗原偶联物包含与疏水性嵌段连接的肽抗原；无菌过滤所述肽抗原偶联物溶液以产生无菌肽抗原偶联物溶液；以及将水性缓冲剂添加到所述无菌肽抗原偶联物溶液中，以产生肽抗原粒子的无菌水溶液。
本文还描述了一种用于分析包含与疏水性嵌段连接的肽抗原的肽抗原偶联物组合物在添加水性缓冲剂后形成聚集物质的倾向的方法。所述分析包括以下步骤：(i)将特定体积的肽抗原偶联物溶液从第一容器等分到第二容器中，和/或将特定质量的肽抗原偶联物从第一容器添加到第二容器中；(ii)向所述第二容器中添加一定体积的水性缓冲剂，以获得包含肽抗原偶联物的肽抗原偶联物粒子的水溶液，其中肽抗原偶联物的浓度不低于0.01mg/mL；(iii)通过测量水性混合物在大于350nm的波长下的吸光度来评定肽抗原偶联物粒子的水溶液的浊度；以及(iv)基于肽抗原偶联物粒子的水溶液的吸光度与仅水性缓冲剂的吸光度的比较，确认肽抗原偶联物粒子的水溶液中存在或不存在聚集物质。
本文还描述了一种生产肽抗原偶联物混合物的方法，所述混合物包含连接到疏水性嵌段的第一肽抗原和连接到疏水性嵌段的至少第二肽抗原。所述方法包括制备包含第一肽抗原偶联物和药学上可接受的有机溶剂的第一肽抗原偶联物溶液；制备包含第二肽抗原偶联物和药学上可接受的有机溶剂的至少第二肽抗原偶联物溶液；将特定体积的肽抗原偶联物溶液组合，以获得包含第一肽抗原偶联物和至少第二肽抗原偶联物以及药学上可接受的有机溶剂的肽抗原偶联物混合物。
除非另有明确说明，否则在整个本说明书中使用以下缩写：
A：肽抗原
B1：N端延长部
B2：C端延长部
C：带电荷部分
H：疏水性嵌段
L：将肽抗原片段([C]-[B1]-A-[B2])和疏水性嵌段片段(H)共价连接的连接物。注意，这种特定形式的连接物在整个本说明书中用大写“L”表示。用于接合肽抗原偶联物的其他组分的所有其他连接物用小写字母“l”表示
X1：包含第一反应性官能团的连接物前体
X2：包含第二反应性官能团的连接物前体
为了在本公开的实践中指导本领域的普通技术人员，下面给出本文使用的术语的详情。本公开中的术语应理解为可用于提供对特定实施方式的更好描述，并且不应被视为限制性的。
约：在本公开的上下文中，“约”是指设定量±5％。例如，“约10”是指9.5至10.5。“约5:1”的比率是指4.75:1至5.25:1的比率。
佐剂：“佐剂”是添加到疫苗中以增强或改变抗原的免疫原性的任何物质。本领域普通技术人员对佐剂是熟知的(参见：Perrie等,Int J Pharm 364:272-280,2008；和Brito等,Journal of controlled release,190C:563-579,2014)。佐剂可以是递送系统，例如基于无机盐(例如被称为铝佐剂的氢氧化铝或磷酸盐)的粒子，油包水或水包油乳液或聚合物粒子(例如PLGA)，其中抗原被简单地与其混合或吸附到其上、并入在其中或间接地或通过共价相互作用直接地连接到其上。或者，佐剂可以是化学上确定的分子，其结合于确定的受体并诱导下游信号传导途径，包括模式识别受体(PRR)激动剂，例如Toll样受体(TLR)的合成或天然存在激动剂，干扰素基因的刺激物(STING)，核苷酸结合低聚结构域样受体(NLR)，视黄酸诱导型基因I样受体(RLR)或C型凝集素受体(CLR)，以及生物分子(“生物佐剂”)，例如IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L、4-1BBL。分别与Toll样受体7(TLR-7)和TLR-7/8a结合的核苷酸碱基的小分子类似物，例如羟基腺嘌呤和咪唑并喹啉，以及TLR-2/6、TLR-4、STING和NOD的激动剂，在本公开中用作示例性PRR激动剂。通常，本文列出的任何PRR激动剂或生物佐剂都可以通过任何合适的手段与本公开的肽抗原偶联物接合。
施用：在本公开的上下文中，“施用”是指通过任何有效途径向受试者提供或给予药剂，例如，包含如本文所述的肽抗原偶联物的免疫原性组合物。示例性的施用途径包括但不限于口服，注射(例如皮下、肌内、真皮内、腹膜内和静脉内)，透皮(例如局部)，鼻内，阴道和吸入途径。
化合物的“施用”和“施用”化合物应理解为是指提供如本文所述的化合物、化合物的前药或药物组合物。所述化合物或组合物可以由另一个人施用于受试者，或者其可以由受试者自我施用。
抗原：抗原是含有与T细胞或B细胞受体结合的表位并且可以刺激受试者的免疫应答，特别是B细胞应答和/或T细胞应答的任何分子。表位可由肽、糖肽、脂质或任何合适的含有表位的分子构成，所述表位可以与特定的B细胞或T细胞蛋白的组分相互作用。这类相互作用可以通过免疫细胞产生应答。“表位”是指与B和/或T细胞蛋白即B细胞受体和T细胞受体相互作用的抗原(例如肽抗原)的区域。
芳族：芳族化合物是具有奇数个在形成环的碳或氮原子之间离域的π轨道电子对的不饱和的环状环。芳族氨基酸包括具有包含芳族基团的侧链的那些，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸。苯是含有三个双键的6碳环，是一种原型芳族化合物。苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(Trp)是原型芳族氨基酸。芳基可以指芳族取代基，并且芳基-胺可以指包含胺的芳族基团。示例性的芳族胺是苯胺。芳族杂环是指包含的环状环结构包含碳和另一种原子例如氮、氧或硫的芳环。核苷酸碱基例如腺嘌呤和胞嘧啶是示例性的芳族杂环。
生物相容的：如果材料在与体液、细胞或组织接触时发挥最小的破坏性或宿主应答效果，则它们被认为是生物相容的。生物相容性基团可以含有化学部分，包括来自以下类别的化学部分：脂族、脂环族、杂脂族、杂脂环族、芳基或杂芳基。然而，取决于分子组成，这些部分并不总是生物相容的。
或者，术语“生物相容性”被认为是指与识别蛋白和/或生物系统的其他组分(例如天然存在的抗体，包括糖蛋白的细胞蛋白，或细胞)的最小相互作用；或者特定地旨在与生物系统的组分(例如药物和前药)相互作用的物质和官能团，以使相互作用的结果不是显著负面的或破坏性的。
CD4：分化簇4，一种表面糖蛋白，可与存在于其他细胞表面上的II类MHC分子相互作用。T细胞的一个子集表达CD4并且这些细胞通常称为辅助T细胞。
CD8：分化簇8，一种表面糖蛋白，可与存在于其他细胞表面上的I类MHC分子相互作用。T细胞的一个子集表达CD8并且这些细胞通常称为细胞毒性T细胞或杀手T细胞。
电荷：物质的一种物理性质，这种物理性质影响所述物质与其他原子和分子(包括溶质和溶剂)的相互作用。带电荷物质经历来自于其他类型的带电荷物质以及不保有全整数电荷值的分子例如极性分子的静电力。相同电荷的两个带电荷分子彼此排斥，而不同电荷的两个带电荷分子彼此吸引。电荷通常以正或负整数单位描述。
有效量：在本公开的上下文中，“有效量”和相关术语是指诱导期望应答所需的量。例如，诱导例如肽抗原偶联物的免疫应答所需的试剂的量，无论是单独使用还是与一种或多种额外试剂一起使用。
接枝聚合物：可以描述为由一种组成的聚合物与另一种组成的第二聚合物的侧链连接产生的聚合物。通过共聚单体连接到第二聚合物的第一聚合物是接枝共聚物。通过末端基团连接到第二聚合物的第一聚合物可以描述为嵌段聚合物(例如，A-B型二嵌段)或端接枝聚合物。
亲水性指数/GRAVY值：是表示氨基酸的疏水或亲水特征的数值。存在多种可用于描述构成肽的氨基酸的相对疏水和亲水特征的标度。在本公开中，使用Kyte和Doolittle的亲水性标度(Kyte J,Doolittle RF,J.Mol.Biol 157:105–32,1983)来计算构成肽抗原片段和肽抗原偶联物的氨基酸序列的亲水性总平均(GRAVY)值，有时称为GRAVY评分，所述肽抗原片段和肽抗原偶联物包括肽抗原(A)、任选的基于肽的N端和C端任选延长部(B1和B2)以及任选的带电荷部分(C)。肽的GRAVY值是构成肽的所有氨基酸的亲水性值的总和除以肽的长度(即氨基酸数目)。GRAVY值是相对值。GRAVY值越大，则认为肽序列的疏水性越强，而GRAVY值越低，则认为肽序列的亲水性越强。
亲水性的：在本公开的上下文中，“亲水性的”和相关术语是指材料在水性介质中自由分散的趋势。如果一种材料优先与其他亲水性材料相互作用并且避免与疏水性材料相互作用，则认为所述材料是亲水性的。在一些情况下，亲水性可以用作相对术语，例如，同一分子可以被描述为亲水性或非亲水性的，这取决于其所比较的分子。亲水性分子通常是极性的和/或带电荷的，并具有良好的水溶性，例如可溶至高达0.1mg/mL或更高。
疏水性的：在本公开的上下文中，“疏水性的”和相关术语是指材料避免与水接触的趋势。如果一种材料优先与其他疏水性材料相互作用并且避免与亲水性材料相互作用，则认为所述材料是疏水性的。疏水性是相对术语；同一分子可以被描述为疏水性或非疏水性的，这取决于其所比较的分子。疏水性分子通常是非极性和不带电荷的，并具有不良的水溶性，例如，不溶至低达0.1mg/mL或更低。
疏水性配体：是一种与生物受体结合并具有疏水特征的分子。在一些实施方式中，疏水性配体沿着聚合物的主链排列，从而向其连接的聚合物赋予疏水特性。在一些实施方式中，疏水性配体是模式识别受体激动剂，其具有有限的水溶性，因此可以被描述为疏水性的。在另外的实施方式中，疏水性配体是TLR-7或TLR-7/8激动剂，例如咪唑并喹啉。
免疫应答：免疫应答是直接地或间接地(例如通过细胞或细胞因子媒介)刺激引起的免疫系统细胞(例如B细胞、T细胞或单核细胞)的活性变化。在一个实施方式中，所述应答对特定抗原是特异性的(“抗原特异性应答”)。在一个实施方式中，免疫应答是T细胞应答，例如CD4 T细胞应答或CD8 T细胞应答。在一个实施方式中，免疫应答导致另外的T细胞后代的产生。在一个实施方式中，免疫应答导致T细胞的运动。在另一个实施方式中，所述应答是B细胞应答，并导致特异性抗体的产生或另外的B细胞后代的产生。在其他实施方式中，所述应答是抗原呈递细胞应答。“增强免疫应答”是指佐剂和作为肽抗原偶联物的一部分的免疫原性剂如肽抗原的共同施用，其中与在不存在佐剂的情况下向受试者施用免疫原性剂相比，佐剂增加了对免疫原性剂的所需免疫应答。在一些实施方式中，抗原被用于刺激免疫应答，导致细胞毒性T细胞活化，从而杀死病毒感染的细胞或癌细胞。在一些实施方式中，抗原用于诱导耐受性或免疫抑制。致耐受性应答可能是由T细胞或B细胞对抗原无应答而产生的。抑制性免疫应答可能是由调节性细胞例如下调免疫应答即抑制免疫应答的调节性T细胞的活化而产生的。在不存在佐剂的情况下施用于患者的抗原通常是致耐受性或抑制性的，并且与佐剂一起施用的抗原通常具有刺激性，并导致免疫细胞的募集、扩增和活化。
免疫原性组合物：包含抗原和任选地诱导针对抗原的可测量免疫应答的佐剂的材料制剂。
配体：是一个通用术语，用于描述与生物受体结合的任何分子。模式识别受体激动剂是与模式识别受体(PRR)结合的特定类型的配体，并且也可以称为佐剂或具有佐剂性质的配体。例如，PRR激动剂是与PRR(例如TLR)结合的配体。与PRR(或PRRa)结合的配体也可以被称为佐剂、分子佐剂、佐剂分子或具有佐剂性质的配体。在水中具有有限溶解性的配体可以被称为疏水性配体，而水溶性的配体可以被称为亲水性配体。具有佐剂性质的疏水性配体或亲水性配体可分别称为疏水性佐剂或亲水性佐剂。
连接或偶联：术语“连接”或“偶联”是指直接地或间接地接合在一起。第一部分可以与第二部分共价或非共价连接。在一些实施方式中，第一分子通过共价键连接到另一分子。在一些实施方式中，第一分子通过静电吸引连接到另一分子。在一些实施方式中，第一分子通过偶极-偶极力(例如氢键)连接到另一分子。在一些实施方式中，第一分子通过范德华力(也称为伦敦力)连接到另一分子。第一分子可以通过这些偶联的任何和所有组合与另一分子连接。分子可以间接地连接，例如通过使用连接物。分子可以通过插入独立地非共价结合到两个分子的组分而间接地连接。
如本文所用，“连接”及其变体是指使分子保持化学或物理缔合，包括在免疫接种之后，至少直到它们接触细胞，特别是免疫细胞为止。
在一些实施方式中，连接的组分是缔合的，使得至少在接触细胞例如免疫细胞之前，组分不能彼此自由分散。例如，两个组分可以彼此共价连接，使得这两个组分不能分开地分散或扩散。在优选的实施方式中，肽抗原偶联物由肽抗原(A)构成，所述肽抗原(A)直接地或经由延长部(B1或B2)间接地共价连接到疏水性嵌段(H)。包含疏水性嵌段(H)的肽抗原偶联物在水性条件下组装成粒子，其中两种或更多种肽抗原偶联物缔合形成稳定物，其中单独的肽抗原偶联物和构成所述肽抗原偶联物的组分在遇到细胞例如免疫细胞之前无法分散或扩散。
连接具体地区别于例如可以在常规疫苗例如含有与佐剂混合的水溶性肽抗原的疫苗中存在的抗原与佐剂的简单混合物。在简单混合物中，所述组分可以在疫苗接种的组织内及其外自由地独立分散。
净电荷：分子或(如果指定)分子的区段所携带的静电荷的总和。
粒子：由分子组装体构成的纳米或微米级超分子结构。本公开的肽抗原偶联物包含与疏水性嵌段(H)连接的肽抗原(A)，其组装成胶束或其他超分子结构或在附连时作为预先形成的粒子存在。包含肽抗原偶联物的粒子可以被摄取到细胞(例如免疫细胞，如抗原呈递细胞)中。在一些实施方式中，肽抗原偶联物在水溶液中形成粒子。在一些实施方式中，肽抗原偶联物的粒子形成取决于pH或温度。在一些实施方式中，由肽抗原偶联物构成的纳米粒子具有5纳米(nm)至500nm之间的平均直径。在一些实施方式中，由肽抗原偶联物构成的纳米粒子可以大于100nm。在一些实施方式中，由肽抗原偶联物构成的纳米粒子被包含在较大的粒子结构中，所述较大的粒子结构太大而不能被免疫细胞摄取(例如，大于约5000nm的粒子)，并缓慢释放出包含肽抗原偶联物的较小的纳米粒子。
在一些实施方式中，包含疏水性嵌段(H)的肽抗原偶联物形成纳米粒子。纳米粒子通过疏水相互作用使肽抗原偶联物缔合而形成，因此可以被视为超分子组装体。在一些实施方式中，纳米粒子是胶束。在优选的实施方式中，纳米粒子胶束的直径为约5至50nm之间。在一些实施方式中，肽抗原偶联物形成胶束，并且胶束形成具有温度依赖性，pH依赖性或者同时具有温度和pH依赖性。在一些实施方式中，所公开的纳米粒子包含肽抗原偶联物，其由与疏水性嵌段(H)连接的肽抗原(A)构成，所述疏水性嵌段(H)由与具有佐剂性质的配体(例如PRR激动剂)连接的聚合物构成；将肽抗原与纳米粒子中的PRR激动剂连接在一起可防止PRR激动剂在施用于受试者后自由地分散，从而防止全身毒性。
所述粒子可以通过包含肽抗原偶联物的独立分子的组装而形成，或者在由与预先形成的粒子连接的肽抗原(A)构成的肽抗原偶联物的情况下，粒子可以通过共价或非共价相互作用而交联。
肽或多肽：通过酰胺键接合在一起的两个或更多个天然或非天然氨基酸残基。氨基酸残基可以含有翻译后修饰(例如，糖基化和/或磷酸化)。这些修饰可以模拟体内天然发生或者可为非天然的翻译后修饰。肽抗原偶联物的任何一种或多种组分可以由肽构成。
肽的长度没有概念上的上限。通常根据应用选择肽的长度。在几个实施方式中，疏水性嵌段(H)由长度可以为3至1,000个氨基酸之间，通常长度不超过300个氨基酸的肽构成。在一些实施方式中，N端和/或C端延长部(B1和/或B2)是长度在约1至8个氨基酸之间的肽。在一些实施方式中，带电荷部分(C)是由带正电荷、带负电荷或同时带正电荷和带负电荷的氨基酸构成的肽，并且长度通常不超过16个氨基酸。
在优选的实施方式中，肽抗原(A)是5至约50个氨基酸，通常约7至35个氨基酸，例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35个氨基酸的肽。在其他实施方式中，肽抗原(A)的长度为约50个氨基酸或更长。因此，在一些实施方式中，肽抗原(A)可以被认为是蛋白质。
注意，肽抗原(A)可以是最小表位(有时称为min或ME)或包含最小表位的长肽(有时称为LP或SLP)。因此，应理解，当最小表位或长肽被称为以肽抗原偶联物形式递送时，则最小表位或长肽是肽抗原(A)，除非另有说明。
在一些实施方式中，任选的带电荷部分(C)、抗原(A)、任选的延长部(B1和B2)和连接物前体X1是氨基酸，并且可以通过固相肽合成制备为连续肽序列，其有时被称为“肽抗原片段”。注意，肽抗原片段的净电荷或GRAVY的计算不包括连接物前体X1。
将指代肽抗原(A)的肽序列称为“PA”，将指代N端延长部(B1)的肽序列称为“PN”，并且将指代C端延长部(B2)的肽序列称为“PC”。构成肽抗原(A)的氨基酸序列由式PA1…PAn表示，其中PA表示构成肽抗原(A)的任何氨基酸残基并且n是整数值。例如，8-氨基酸肽抗原(A)可表示为PA1-PA2-PA3-PA4-PA5-PA6-PA7-PA8。构成N端延长部(B1)的氨基酸序列由式PN…PNn表示，其中PN表示构成N端延长部的任何氨基酸残基并且n是整数值。构成C端延长部(B2)的氨基酸序列由式PC1…PCn表示，其中PC表示构成C端延长部的任何氨基酸残基并且n是整数值。
肽修饰：肽可以用一种或多种如下所述的若干修饰来改变或以其他方式合成。另外，这些肽的类似物(非肽有机分子)、衍生物(从肽开始获得的化学官能化的肽分子)和变体(同源物)可用于本文所述的方法中。本文所述的肽由氨基酸序列、类似物、衍生物和变体构成，其可以是L-和/或D-形式。这些肽可以含有天然存在的和以其他方式产生的肽、类似物、衍生物和变体。
肽可以通过多种化学技术来修饰，以产生具有与未修饰的肽基本上相同的活性并且任选地具有其他期望性质的衍生物。例如，肽的羧酸基团，无论是在羧基末端还是在侧链，都可以以药学上可接受的阳离子的盐的形式提供或被酯化以形成CC1-CC16酯，其中CC是指碳链(因此，CC1是指单个碳并且CC16是指16个碳)，或者被转化为酰胺。肽的氨基，无论是在氨基末端还是在侧链，都可以是药学上可接受的酸加成盐的形式，例如HCl盐、HBr盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、甲苯磺酸盐、马来酸盐、酒石酸盐和其他有机盐，或者可以被修饰或转化为酰胺。
氨基酸可以被修饰，以使得其通过共价键含有PRR激动剂，例如TLR激动剂，例如基于咪唑并喹啉的TLR-7或TLR-7/8激动剂。
肽可以被修饰以包含含有正电荷或负电荷或两者的取代基。正电荷和/或负电荷可能受肽所处的pH影响。
可以使用公认的技术将肽侧链的羟基转化为CC1-CC16烷氧基或CC1-CC16酯，或者可以将羟基转化(例如硫酸化或磷酸化)以引入负电荷。肽侧链的苯基和苯酚环可以被一个或多个卤素原子例如氟、氯、溴或碘取代，或被CC1-CC16烷基、CC1-CC16烷氧基、其羧酸和酯或这些羧酸的酰胺取代。肽侧链的亚甲基可以延长到同源的CC2-CC4亚烷基。硫醇可用于形成二硫键或硫醚，例如通过与马来酰亚胺的反应。硫醇可以用许多公认的保护基团中的任何一种例如乙酰胺基团来保护。本领域技术人员也将认识到将环状结构引入本发明的肽中，以便选择并向结构提供构象约束，从而提高稳定性的方法。关于可以对官能团进行的额外修饰的详情，可以参考Greene等,"格林有机合成中的保护基(Greene's Protective Groupsin Organic Synthesis)"第四版,John Wiley&Sons,Inc.2006。
设想了肽抗原(A)的肽模拟物和有机模拟物的实施方式，由此这些肽模拟物和有机模拟物的化学成分的三维排列模拟肽主链和组分氨基酸侧链的三维排列，从而产生具有可测量的诱导耐受性或免疫抑制的能力或增强的产生刺激性免疫应答(例如细胞毒性T细胞或抗体应答)的能力的免疫原性肽的这些肽模拟物和有机模拟物。
药学上可接受的媒介物：可用于本公开中的药学上可接受的载体(媒介物)是常规的。雷明顿药学(Remington's Pharmaceutical Sciences),E.W.Martin,Mack PublishingCo.,Easton,PA,第15版(1975)描述了适用于药物递送一种或多种治疗性组合物(例如一种或多种治疗性癌症疫苗)和额外医药剂的组合物和制剂。
通常，载体的本质将取决于所采用的具体施用模式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射流体，其包括药学上和生理学上可接受的流体例如水、生理盐水、平衡盐溶液、水性右旋糖、甘油等作为媒介物。对于固体组合物(例如粉剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，常规的无毒固体载体可以包括例如药用级的甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除生物中性载体外，待施用的药物组合物可以含有少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
极性：物质性质的一种描述。极性是相对术语，并且可以描述具有部分电荷的分子或分子的一部分，所述部分电荷由分子中键合在一起的原子之间的电负性差异引起，例如氮与氢之间的键。极性分子具有与其他极性分子相互作用的偏好性，并且通常不与非极性分子缔合。在特定的非限制性情况下，极性基团可以含有羟基或氨基或羧基或带电荷基团。在特定的非限制性情况下，极性基团可以具有与极性溶剂例如水相互作用的偏好性。在特定的非限制性情况下，引入额外的极性基团可以提高分子的一部分的溶解性。
聚合物：含有重复的结构单元(单体)的分子。正如在整个本公开中更详细描述的，聚合物可用于肽抗原偶联物的任何数量的组分，并且可以是天然的或合成的。在优选的实施方式中，疏水性或两亲性聚合物用作疏水性嵌段(H)并驱动肽抗原偶联物的粒子组装。在一些实施方式中，肽抗原(A)是包含氨基酸的聚合物。在一些实施方式中，延长部(B1和B2)包含聚合物，例如PEG、聚(氨基酸)或其组合。所公开的实施方式中包括的聚合物可以形成可施用于受试者而不会引起不良副作用的聚合物纳米粒子。所公开的实施方式中包括的聚合物可以形成可施用于受试者以引起免疫应答或治疗和/或改善疾病的聚合物纳米粒子。所公开的实施方式中包括的聚合物可以包括具有官能团的侧链，所述官能团可以被用于例如促进与佐剂或用于诱导免疫抑制或耐受性的分子(如大环内酯类，例如雷帕霉素)的连接。在几个实施方式中，聚合物可以含有通过连接物连接的两个或更多个聚合物嵌段以产生嵌段共聚物(例如两亲性二嵌段共聚物)。在几个实施方式中，聚合物嵌段的特征可以主要是疏水性的。在几个实施方式中，聚合物由肽、其类似物、衍生物和变体构成。可用于实施本发明的聚合物的不同组成在别处更详细地讨论。
聚合：通常在催化剂、热或光下进行的化学反应，其中单体组合以形成链状或交联的大分子(聚合物)。链也可以通过使用适当的取代基和化学反应的额外化学合成而结合。单体可以含有反应性物质。聚合通常通过加成或缩合来进行。当引发剂(通常是自由基)与单体中的双键反应时，发生加成聚合。自由基加成到双键的一侧，在另一侧产生自由电子。然后，该自由电子与另一种单体反应，并且所述链变得自增长，因此一次向增长链的末端添加一个单体单元。缩合聚合涉及两种单体的反应，导致分裂出水分子。在其他聚合形式中，通过分阶段引入活化单体，一次向增长的链中添加一种单体，例如在固相肽合成期间。
纯化的：具有相对不含杂质或掺杂或污染某种物质的物质的组成。术语纯化的是相对术语并且不需要绝对纯度。因此，例如，纯化肽抗原偶联物是其中肽抗原偶联物比由疏水性嵌段片段和肽抗原片段之间的反应产生的产物溶液中的肽抗原偶联物更富集的肽抗原偶联物。在一个实施方式中，将肽抗原偶联物纯化，使得所述肽抗原偶联物代表纯化物质的至少50％。在一些实施方式中，肽抗原偶联物为至少60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％纯。纯度可以通过多种不同的方法来确定。通常，纯度通过HPLC、元素分析或氨基酸分析或其组合来确定。
可溶的：能够分子或离子分散在溶剂中以形成均质溶液。当提及肽时，可溶性肽应理解为溶液中的单个分子，其不会通过疏水性或其他非共价相互作用组装成多聚体或其他超分子结构。可溶性分子应理解为以单分子形式自由分散在溶液中。在几个实施方式中，肽抗原可以是可溶性肽抗原，其在室温下在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中溶解高达至少0.1mg/ml。在其他实施方式中，肽抗原偶联物在室温下可溶于二甲亚砜和/或其他有机溶剂，但在室温下在水性溶剂例如pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水中不可溶。本文所述的疏水性分子(例如疏水性嵌段(H))不溶低至约0.1mg/mL。溶解性可以通过目测、通过浊度测量或通过动态光散射来确定。
受试者：是指人类和非人类动物，包括鸟类和非人类哺乳动物，例如啮齿动物(例如小鼠和大鼠)，非人类灵长类动物(例如猕猴)，伴侣动物(例如驯养的狗和猫)，牲畜(例如猪、绵羊、奶牛、美洲驼和骆驼)，以及非驯养动物(例如大型猫科动物)。
超分子：是指通过非共价相互作用缔合的两个或更多个分子。在一些实施方式中，分子由于疏水相互作用而缔合。在一些实施方式中，分子由于静电相互作用而缔合。所述缔合向超分子复合物赋予新的特性，而所述组成分子中的任一者未享有所述特性，例如尺寸增加，这会影响材料与免疫系统的相互作用以及不同的免疫应答。例如，肽抗原偶联物可聚集以形成超分子复合物。
T细胞：一种类型的白细胞，其是免疫系统的一部分并且可以参与免疫应答。T细胞包括但不限于CD4 T细胞和CD8 T细胞。CD4 T细胞在其表面上展示CD4糖蛋白，并且这些细胞通常被称为辅助性T细胞。这些细胞通常协调免疫应答，包括抗体应答和细胞毒性T细胞应答，但是，CD4 T细胞也可以抑制免疫应答，或者CD4 T细胞可以充当细胞毒性T细胞。CD8T细胞在其表面上展示CD8糖蛋白，并且这些细胞通常被称为细胞毒性T细胞或杀手T细胞，然而CD8 T细胞也可以抑制免疫应答。
遥爪(Telechelic)：用于描述具有一个或两个可能相同或不同的反应性末端的聚合物。所述词源自于telos和chele，分别是末端(end)和爪(claw)的希腊语单词。半遥爪聚合物描述了仅具有单个末端基团例如可以经历额外反应例如聚合的反应性官能团的聚合物。杂遥爪聚合物描述了具有两个末端基团例如具有不同反应性质的反应性官能团的聚合物。
本文中，疏水性嵌段(H)可由在一个或两个末端处具有反应性基团的聚合物构成。在一些实施方式中，将佐剂置于聚合物的一个末端处，并且聚合物的另一末端可与直接地或通过延长部(B1或B2)或连接物(L)间接地与肽抗原(A)连接的连接物反应。在这个实例中，聚合物相对于佐剂是半遥爪的，这意味着佐剂仅附连到包含疏水性嵌段(H)的聚合物链的一个末端。
治疗、预防或改善疾病：“治疗”是指在疾病或病理状况开始发展后减轻其征兆或症状或标志物的干预措施。例如，治疗疾病可导致肿瘤负荷的减少，这意味着肿瘤和/或转移瘤的数量或尺寸的减少，或者治疗疾病可导致免疫耐受性，其降低了与自身免疫相关的系统。“预防”疾病是指抑制疾病的全面发展。可以完全阻止疾病发展。可以预防疾病的严重程度或程度或种类发展。“改善”是指疾病例如癌症的征兆或症状或标志物的数量或严重程度的降低。
减少疾病或与疾病有关的病理状况的征兆或症状或标志物，是指治疗的任何可观察到的有益效果和/或对近端替代终点的任何可观察到的效果，例如肿瘤体积，无论是否有症状。可以例如通过在易感受试者(例如患有尚未转移的肿瘤的受试者，或可能暴露于病毒感染的受试者)中疾病的临床症状的延迟发作，疾病的某种或所有临床症状的严重程度降低，疾病进展缓慢(例如通过延长患有肿瘤或病毒感染的受试者的寿命)，减少疾病复发的次数，受试者的整体健康或福祉的改善，或通过本领域公知的其他参数(例如，对于特定肿瘤或病毒感染特有的)，来证明与肿瘤或病毒感染相关的征兆或症状的减轻。“预防性”治疗是出于降低发展中病理的风险或严重程度的目的而施用于不表现出疾病征兆或仅表现出早期征兆的受试者的治疗。
在一个实例中，期望的应答是在受试者中诱导免疫应答，所述免疫应答导致肿瘤的尺寸、体积、生长速率或数目(例如转移瘤)的减少。例如，一种或多种药剂可以诱导免疫应答，其与不存在所述药剂下的应答相比将肿瘤的尺寸、体积或数目减少所需量，例如减少至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少50％、至少75％、至少90％或至少95％。
肿瘤或癌症或赘生性：细胞异常生长，其可以是良性或恶性的，通常但并不总是引起临床症状。“赘生性”细胞生长是指对生理信号例如生长和抑制因子无应答的细胞生长。
“肿瘤”是赘生性细胞的集合体。在大多数情况下，肿瘤是指形成实体肿块的赘生性细胞的集合体。这些肿瘤可以被称为实体肿瘤。在一些情况下，赘生性细胞可能不会形成实体肿块，例如患有一些白血病的情况。在这些情况下，赘生性细胞的集合体可以被称为液体癌症。
癌症是指作为固体或液体的赘生性细胞的恶性生长。将癌症定义为恶性的癌症特征包括转移、干扰邻近细胞的正常功能、以异常水平释放细胞因子或其他分泌产物、以及抑制或加剧炎性或免疫应答，侵入周围或远端组织或器官例如淋巴结等。
不存在显著不良临床症状和/或生长缓慢的肿瘤被称为“良性的”。
“恶性的”是指引起或将来可能引起显著的临床症状。侵入周围组织和/或转移和/或通过产生和分泌对邻近或远端身体系统有影响的化学介体而产生显著临床症状的肿瘤被称为“恶性的”。
“已建立的”或“现有的”肿瘤是在开始治疗时存在的肿瘤。通常，可以通过诊断测试来鉴别已建立的肿瘤。在一些实施方式中，已建立的肿瘤可以被触诊。在一些实施方式中，已建立的肿瘤的尺寸为至少500mm3，例如至少600mm3、至少700mm3或至少800mm3。在其他实施方式中，肿瘤长度为至少1cm。关于实体肿瘤，已建立的肿瘤通常具有新建立的和稳定的血液供应，并且可能已诱导调节性T细胞(Treg)和髓样来源的抑制细胞(MDSC)。
本领域普通技术人员将认识到，上文提供的定义并不旨在包括不允许的取代模式(例如，被5个不同的基团取代的甲基等)。这些不允许的取代模式对于本领域普通技术人员来说是容易识别的。
除非本文另外指出，否则本文公开和/或上文定义的任何官能团可以被取代或未被取代。
除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
除非上下文另外明确指出，否则不带具体数量的指称物包括复数个指称物。术语“包含”是指“包括”。因此，包含“A”或“B”是指包括A，包括B，或包括A和B两者。此外应理解，关于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小以及所有分子量或分子质量值都是近似值，并出于描述的目的被提供。
尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本公开的实践或测试中，但是本文描述了合适的方法和材料。在发生冲突的情况下，以本说明书(包括术语解释)为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并不意图是限制性的。
生产肽抗原偶联物的方法
本文所述的方法特别适合于溶液相制造式[C]-[B1]-A-[B2]-L-H的肽抗原偶联物，例如具有式A-L-H、C-A-L-H、B1-A-L-H、A-B2-L-H、C-B1-A-L-H、C-A-B2-L-H和/或C-B1-A-B2-L-H的肽抗原偶联物。或者，本文所述的方法特别适合于制造式H-L-[B1]-A-[B2]-[C]的肽抗原偶联物，例如具有式H-L-A、H-L-A-C、H-L-B1-A、H-L-A-B2、H-L-B1-A-C、H-L-A-B2-C和/或H-L-B1-A-B2-C的肽抗原偶联物。更进一步，本文所述的方法特别适合于制造式[B1]-A-[B2]-L-H-C和[B1]-A-[B2]-L(C)-H的肽抗原偶联物，例如具有式A-L-H-C、B1-A-L-H-C、A-B2-L-H-C、B1-A-B2-L-H(C)、A-L(C)-H、B1-A-L(C)-H、A-B2-L(C)-H和/或B1-A-B2-L(C)-H的肽抗原偶联物，其中括号指示连接物(L)同时与带电荷部分(C)和疏水性嵌段(H)连接。
在一些实施方式中，肽抗原(A)可直接地或通过延长部(B1或B2)或带电荷部分(C)连接到疏水性嵌段(H)以获得式[C]-[B1]-A-[B2]-[L]-H、[B1]-A-[B2]-[L](C)-H、[B1]-A-[B2]-[C]-[L]-H或[B1]-A-[B2]-[L]-H-(C)的肽抗原偶联物，其中连接物(L)是任选的。在这些实施方式中，可以通过固相或溶液相合成直接地或经由延长部(B1或B2)或带电荷部分(C)将肽抗原(A)直接连接到疏水性嵌段(H)而获得肽抗原偶联物。
在一些优选的实施方式中，使肽抗原片段与疏水性嵌段片段以1或更大的摩尔比反应。肽抗原片段与疏水性嵌段片段的摩尔比可为约1至约3，例如约1至约1.2。肽抗原片段与疏水性嵌段片段的摩尔比可为1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9或3.0。
在优选的实施方式中，使肽抗原片段在药学上可接受的有机溶剂中与疏水性嵌段片段反应以获得产物溶液。药学上可接受的有机溶剂可以是技术人员已知的药学上可接受的任何有机液体，并且疏水性嵌段片段和肽抗原片段在其中足够可溶以允许它们彼此反应。合适的药学上可接受的有机溶剂包括但不限于二甲亚砜(DMSO)、甲醇和乙醇。在特定的实施方式中，药学上可接受的有机溶剂是二甲亚砜(DMSO)。
出乎意料的是，我们的结果表明，与基于脂族基团的疏水性嵌段(例如脂肪酸或胆固醇)相比，包含含有芳环和杂环芳环，特别是被胺取代的那些，即芳基胺的疏水性嵌段的疏水性嵌段片段和肽抗原偶联物，在药学上可接受的有机溶剂中表现出提高的溶解性。
肽抗原片段和疏水性嵌段片段的反应可以在约20℃至约150℃，例如约20℃至约55℃，包括但不限于20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃的温度下进行。本领域技术人员将理解，所使用的反应温度可以至少部分地取决于所使用的药学上可接受的有机溶剂以及在连接物前体X1和X2上的第一官能团和第二官能团的反应性。
在反应条件下，连接物前体X1和X2上的第一官能团和第二官能团进行反应以形成连接物(L)，如稍后更详细地描述的。
所形成的产物溶液包含肽抗原偶联物，例如式[C]-[B1]-A-[B2]-L-H的肽抗原偶联物，式X2-H的未反应疏水性嵌段片段和药学上可接受的有机溶剂。可以从含有未反应的疏水性嵌段片段的产物溶液中纯化肽抗原偶联物，以获得纯化肽抗原偶联物，其可以以冻干固体的形式提供或者可以悬浮在药学上可接受的有机溶剂中并作为纯化肽抗原偶联物溶液储存。出乎意料的是，我们的结果表明残留在产物溶液中的过量疏水性嵌段片段对由肽抗原偶联物形成的纳米粒子胶束的粒度、稳定性或体内活性没有有意义的影响，这表明没有必要从粗产物溶液除去过量的疏水性嵌段片段，并且因此，如果需要的话，可以通过使用大摩尔过量的式X2-H的疏水性嵌段片段来安全地驱动形成连接物(L)的反应完成。
本文所述的方法也特别适合于固相制造式[C]-[B1]-A-[B2]-H或H-[B1]-A-[B2]-[C]的肽抗原偶联物。例如，本文所述的方法特别适合于固相制造式[C]-[B1]-A-[B2]-H的肽抗原偶联物，例如具有式A-H、C-A-H、B1-A-H、A-B2-H、C-B1-A-H、C-A-B2-H和C-B1-A-B2-H的肽抗原偶联物。本文所述的方法也特别适合于固相制造式H-[B1]-A-[B2]-[C]的肽抗原偶联物，例如具有式H-A、H-A-C、H-B1-A、H-A-B2、H-B1-A-C、H-A-B2-C和H-B1-A-B2-C的肽抗原偶联物。
可将通过溶液或固相方法产生的产物溶液或纯化肽抗原偶联物溶液储存起来以供进一步使用。
在一些实施方式中，可以通过UV-Vis光谱法或色谱法分析包含肽抗原偶联物的溶液，例如产物溶液或纯化肽抗原偶联物溶液，以确定与肽抗原偶联物和任何未反应的疏水性嵌段片段相关的吸光度或曲线下面积(色谱图中随时间变化的吸光度)。出乎意料的是，对于包含含有一个或多个芳族基团的疏水性嵌段的肽抗原偶联物，我们的结果表明，在特定波长(例如大于约300nm的波长)下吸光度和/或曲线下面积之间的关系以及肽抗原偶联物的摩尔浓度对于每种肽抗原偶联物而言大致相等，而与肽抗原(A)序列无关。这些出乎意料的结果表明，与UV-Vis检测器(例如多二极管阵列或多波长检测器)在线进行的色谱分析(例如HPLC)是评定产物溶液或纯化肽抗原偶联物溶液中的肽抗原偶联物和任何未反应的疏水性嵌段片段的摩尔浓度的可靠方法，并且相同的消光系数可用于确定肽抗原偶联物浓度，而与肽抗原(A)序列的变化无关。因此，在优选的实施方式中，用于确定包含一种或多种不同的肽抗原偶联物的溶液中的肽抗原偶联物的摩尔量的方法是通过基于预定摩尔消光系数的UV-Vis光谱法或色谱法在大于约300nm，介于约300-650nm之间，通常约300至350nm，例如300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、330、340或350的波长下进行的，所述摩尔消光系数与肽抗原组成无关。
在优选的实施方式中，向产物溶液或纯化肽抗原偶联物溶液中添加水性介质，例如水性缓冲剂如PBS，导致肽抗原偶联物自发组装成稳定的纳米粒子胶束。纳米粒子胶束的粒度范围可能不会明显散射可见光，而聚集物质散射可见光，其可以通过溶液浊度(即吸光度)测量来评定。因此，在一些实施方式中，所述方法还包括通过测量溶液浊度来分析包含肽抗原偶联物、任何未反应的疏水性嵌段片段和药学上可接受的有机溶剂的纯化肽抗原偶联物溶液或产物溶液在添加到水性缓冲剂(例如pH 7.4的PBS)中后形成聚集物质的倾向。
测量溶液浊度的方法包括以下步骤：(i)将特定体积的产物溶液或纯化肽抗原偶联物溶液从第一容器等分到第二容器中；(ii)向所述第二容器中添加一定体积的水性缓冲剂(例如PBS)，以获得稀释至不低于0.01mg/mL的浓度的肽抗原偶联物的水性混合物；(iii)通过测量所述水性混合物在大于350nm的波长下的吸光度来评定水性混合物的浊度；以及(iv)基于水性混合物的吸光度与仅水性缓冲剂相比的比较，确认水性混合物中存在或不存在聚集物质。用于评定浊度的波长应选自未被肽抗原偶联物、任何未反应的疏水性嵌段或药学上可接受的有机溶剂吸收的光的波长。在优选的实施方式中，选择用于评定浊度的光的波长通常选自350至650nm。在优选的实施方式中，波长选自350至450，例如350、360、370、380、390、400、410、420、430、440或450nm。出乎意料的是，发现浊度测量是评定纳米粒子胶束化的可靠测定，从而提高了表征和释放用于个性化疗法的肽抗原偶联物的效率。
本文公开的出乎意料的发现是，尽管包含第一肽抗原偶联物的产物溶液或纯化肽抗原偶联物溶液在添加水性缓冲剂例如PBS后可能具有形成聚集物质的倾向，但是包含第一肽抗原偶联物和两种或更多种额外肽抗原偶联物的肽抗原偶联物混合物在添加水性缓冲剂后可能较不易于形成聚集物质。基于这些发现，开发了本文所述的方法，其对于选择有待包括于肽抗原混合物中的两种或更多种肽抗原偶联物特别有用，以防止形成不适合临床使用的聚集物质。
在优选的实施方式中，选择两种或更多种不同组成的肽抗原偶联物以包括在用于个性化疗法的肽抗原偶联物混合物中的方法包括以下步骤：对于特异性针对每个患者的肽抗原偶联物的全集，确定包含独立的肽抗原偶联物的独立产物溶液或独立纯化肽抗原偶联物溶液在添加到水性缓冲剂中后形成聚集物质的倾向。特异性针对每个患者的肽抗原偶联物的全集可以在1至100之间，通常在约5至20之间，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种独特的肽抗原偶联物。在优选的实施方式中，评定了每种肽抗原偶联物在添加水性缓冲剂后形成聚集物质的倾向。然后根据独立的肽抗原偶联物形成聚集物质的倾向，将独立的患者特异性肽抗原偶联物等分并混合在一起，使得形成聚集物质的任何肽抗原偶联物中的每一者的摩尔量小于肽抗原偶联物混合物中肽抗原偶联物的总摩尔量的60％。
在优选的实施方式中，肽抗原偶联物混合物包含两种或更多种独特的肽抗原偶联物，例如2至20种之间，并且肽抗原偶联物混合物中肽抗原偶联物的总摩尔量的不大于60％易于聚集，例如肽抗原偶联物的总摩尔量的约0、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％和60％易于聚集。
肽抗原偶联物混合物可以储存以供进一步使用。所述进一步使用可以包括以下步骤：通过UV-Vis光谱法或色谱法(与UV-Vis检测器在线)分析肽抗原偶联物混合物，以确定混合物中两种或更多种肽抗原偶联物中的每一者以及任何未反应的疏水性嵌段片段的摩尔浓度；和/或评估肽抗原偶联物混合物在添加水性缓冲剂例如PBS后形成聚集物质的倾向。
产物溶液、纯化肽抗原偶联物溶液或肽抗原偶联物混合物可以储存以供进一步使用。所述进一步使用可以包括无菌过滤产物溶液、纯化肽抗原偶联物溶液或肽抗原偶联物混合物以提供包含一种或多种肽抗原偶联物、任何未反应的疏水性嵌段片段和药学上可接受的有机溶剂的无菌产物溶液、无菌纯化肽抗原偶联物溶液或无菌肽抗原偶联物混合物。尽管在优选实施方式中将肽抗原偶联物作为水性混合物施用于受试者，但是本文公开的出乎意料的发现是，与肽抗原偶联物的水性混合物的无菌过滤相比，在添加水性缓冲剂之前对产物溶液、纯化肽抗原偶联物或肽抗原偶联物混合物进行无菌过滤(同时肽抗原偶联物是在药学上可接受的有机溶剂中)可导致提高的物质回收率。因此，在优选的实施方式中，制备个性化疗法的方法包括以下步骤：在添加水性缓冲剂之前，对产物溶液、纯化肽抗原偶联物或肽抗原偶联物混合物进行无菌过滤。
无菌产物溶液、无菌纯化肽抗原偶联物溶液或无菌肽抗原偶联物混合物可以被冻干并储存以供进一步使用。
可将无菌肽抗原偶联物溶液、无菌纯化肽抗原偶联物溶液或无菌肽抗原偶联物混合物与水性缓冲剂例如PBS混合以获得肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。因此，在某些实施方式中，所述方法还包括向无菌肽抗原偶联物溶液中添加过量体积的水性缓冲剂，接着混合以产生包含含有一种或多种肽抗原偶联物、任何未反应的疏水性嵌段片段和药学上可接受的有机溶剂的稳定纳米粒子胶束的水性混合物。
出乎意料的是，我们的结果表明，稳定的纳米粒子胶束通过向药学上可接受的有机溶剂(例如DMSO)中的肽抗原偶联物中简单地添加水性缓冲剂(例如PBS缓冲剂)来生成，并且不需要除去有机溶剂。在这些实施方式中，无菌肽抗原偶联物溶液、无菌纯化肽抗原偶联物溶液或无菌肽抗原偶联物混合物可以包含至多约50％(v/v)DMSO，例如至多12.5％(v/v)DMSO，包括但不限于0.1(v/v)、0.25％(v/v)、0.5％(v.v)、1％(v/v)、1.5％(v/v)、2％(v/v)、2.5％(v/v)、3％(v/v)、3.5％(v/v)、4％(v/v)、4.5％(v/v)、5％(v/v)、5.5％(v/v)、6％(v/v)、6.5％(v/v)、7％(v/v)、7.5％(v/v)、8％(v/v)、8.5％(v/v)、9％(v/v)、9.5％(v/v)、10％(v/v)、10.5％(v/v)、11％(v/v)、11.5％(v/v)、12％(v/v)或12.5％(v/v)。因此，该方法提供了一种用于从两亲性化合物生成肽抗原偶联物粒子的简单且可靠的方法。
肽抗原(A)
用于本公开的实施方式中的肽抗原可以选自病原体、癌细胞、自身抗原或过敏原。在一些实施方式中，基于肽的抗原可以包括来自病原体(例如病毒、细菌或真菌)或目标组织(例如癌细胞)的多肽或蛋白质的区域。在其他实施方式中，抗原可以是源自于病原体的完整蛋白质或糖蛋白，或者可以是所述蛋白质或糖蛋白的肽或糖肽片段。在其他实施方式中，抗原可以是主要由肿瘤组织(而不是健康组织)表达的蛋白质或蛋白质的肽片段并且是肿瘤相关抗原。在其他实施方式中，抗原是与自身免疫相关的蛋白质或肽。在其他实施方式中，抗原是与过敏症相关的外来蛋白质或糖蛋白。
肽抗原(A)可以是可用于在受试者中诱导免疫应答的任何抗原。取决于抗原的性质和所需的免疫应答，免疫应答可以是促炎性的或致耐受性的。在一些实施方式中，抗原(A)是肿瘤相关抗原，例如自身抗原或新抗原。在其他实施方式中，抗原(A)是感染性疾病抗原，例如源自于病毒、细菌、真菌或原生动物微生物病原体的抗原。在其他实施方式中，抗原(A)是源自于过敏原或自身抗原介导的自身免疫的肽。
肽抗原(A)由能够在受试者中诱导免疫应答例如T细胞或B细胞应答的氨基酸序列或肽模拟物构成。在一些实施方式中，肽抗原(A)包含一种或多种具有翻译后修饰的氨基酸，非天然氨基酸或肽模拟物。肽抗原可以是天然的、非天然的或翻译后修饰的氨基酸、肽模拟物或其任何组合的任何序列，其具有抗原或预测抗原，即具有T细胞或B细胞表位的抗原。
免疫原性组合物可以包含一种或多种不同的肽抗原偶联物，每种肽抗原偶联物具有不同的肽抗原(A)组成。在一些实施方式中，免疫原性组合物包含具有至多50种不同肽抗原偶联物的粒子，每种肽抗原偶联物具有独特的肽抗原(A)组成。在一些实施方式中，免疫原性组合物包含镶嵌粒子，所述镶嵌粒子包含20种不同的肽抗原偶联物。在其他实施方式中，免疫原性组合物包含镶嵌粒子，所述镶嵌粒子包含5种不同的肽抗原偶联物。在一些实施方式中，免疫原性组合物包含20种不同的粒子组合物，各自由独特的肽抗原偶联物组装而成(即，每个粒子含有单个肽抗原偶联物组合物)。在其他实施方式中，免疫原性组合物包含5种不同的粒子组合物，各自由独特的肽抗原偶联物组装而成(即，每个粒子含有单个肽抗原偶联物组合物。在其他实施方式中，免疫原性组合物包含由单个肽抗原偶联物组合物构成的单个粒子组合物。
肽抗原(A)的长度取决于具体应用，并且通常在约5至约50个氨基酸之间。在优选的实施方式中，肽抗原(A)为约7至35个氨基酸，例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸。在其他实施方式中，肽抗原是多肽的片段。在其他情况下，肽抗原是全长多肽，例如可以重组表达的蛋白质抗原。基于肿瘤相关抗原、感染性疾病抗原、过敏原或自身抗原的肽抗原(A)可以作为全长序列递送，但长度优选不超过50个氨基酸。在优选的实施方式中，肽抗原(A)为7至35个氨基酸，通常约25个。因此，对于长度大于25个氨基酸的肿瘤相关抗原、感染性疾病抗原、过敏原或自身抗原，例如100个氨基酸的抗原，所述抗原可分为7至35个氨基酸(例如25个氨基酸)的肽抗原(A)，其中每个肽抗原(A)都含有独特的氨基酸组成；或者，肽抗原(A)可以是重叠的肽池，其中抗原被分为具有重叠序列的一组数目为7至35个氨基酸(例如25个氨基酸)的肽抗原(A)。例如，包含100个氨基酸的抗原的重叠肽池可以被分为八个25个氨基酸的肽抗原(A)，每个肽抗原(A)被12个氨基酸抵消(即，构成100个氨基酸的肽序列的每个后续25个氨基酸的肽从前一个肽的第13个氨基酸位置开始)。本领域技术人员理解存在许多用于从抗原生成肽池的排列。
在一些实施方式中，肽抗原(A)是构成肿瘤相关抗原、感染性疾病抗原、过敏原或自身抗原的部分的最小CD8或CD4 T细胞表位，其在计算机中预测(或凭经验测量)为结合MHC-I或MHC-II分子。对于肿瘤相关抗原，作为在计算机中预测(或凭经验测量)为结合MHC-I或MHC-II分子的最小CD8或CD4 T细胞表位的肽抗原(A)也应该是肿瘤细胞特有的氨基酸序列。预测MHC-1或MHC-II结合的算法广泛可用(参见Lundegaard等,Nucleic Acids Res.,36:W509-W512,2008和http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)。在针对特定受试者(例如患者)的个性化疗法的一些实施方式中，包含肽抗原偶联物的肽抗原(A)可以包含来自肿瘤相关抗原、感染性疾病抗原、过敏原或自身抗原的最小CD8 T细胞表位，其通常是7-13个氨基酸的肽，其被预测为对所述受试者表达的特定MHC-I等位基因具有<1,000nM的结合亲和力。在针对特定受试者(例如患者)的个性化疗法的一些实施方式中，肽抗原(A)可以包含来自肿瘤相关抗原、感染性疾病抗原、过敏原或自身抗原的最小CD4 T细胞表位，其为10-16个氨基酸的肽，其被预测为对所述受试者表达的特定MHC-II等位基因具有<1,000nM的结合亲和力。在一个优选的实施方式中，当不能鉴定出肿瘤相关抗原、感染性疾病抗原、过敏原或自身抗原的最小CD8或CD4 T细胞表位时，或者当肿瘤相关抗原、感染性疾病抗原、过敏原或自身抗原含有多个CD8和CD4 T细胞表位时，肽抗原(A)可以是16-35个氨基酸，或者可以是至多50个氨基酸，例如至多35个氨基酸、至多25个氨基酸、或至多20个氨基酸、或至多16个氨基酸，以使得其可以含有所有可能的CD8或CD4 T细胞表位。
在本公开的一些实施方式中，肽抗原(A)源自于肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原可以是存在于健康细胞上但优先由肿瘤细胞表达的自身抗原，或者是新抗原，所述新抗原是特异性针对肿瘤细胞并且个体患者所特有的异常蛋白。合适的自身抗原包括由肿瘤细胞优先表达的抗原，例如CLPP、周期蛋白-A1、MAGE-A1、MAGE-C1、MAGE-C2、SSX2、XAgE1b/GAGED2a、Melan-A/MART-1、TRP-1、酪氨酸酶、CD45、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3、IGF2B3、激肽释放酶4、KIF20A、Lengsin、Meloe、MUC5AC、存活蛋白、前列腺酸性磷酸酶、NY-ESO-1和MAGE-A3。新抗原因癌症的固有遗传不稳定性而产生，所述不稳定性可以引起DNA、RNA剪接变体中的突变以及翻译后修饰的变化，这些都可能产生重新生成的(de novo)蛋白质产物，其被统称为新抗原或有时称为预测新抗原。DNA突变包括DNA的变化，包括非同义错义突变、无义突变、插入、缺失、染色体倒位和染色体易位，这些都可能产生新的基因产物以及因此新抗原。RNA剪接位点变化可以产生新的蛋白质产物，并且错义突变可以引入允许翻译后修饰(例如磷酸化)的氨基酸，所述翻译后修饰可以是抗原性的。肿瘤细胞的不稳定性还可以引起表观遗传学变化和某些转录因子的活化，这可能导致某些不被健康的非癌性细胞表达的抗原被肿瘤细胞选择性表达。
在个性化癌症疫苗中使用的肽抗原偶联物应包括包含肿瘤相关抗原中对肿瘤细胞来说独特的部分的肽抗原(A)。包含从错义突变产生的新抗原的肽抗原(A)应涵盖由一个或多个核苷酸多态性编码的氨基酸变化。包含从移码突变、剪接位点变异、插入、倒位和缺失产生的新抗原的肽抗原(A)应涵盖新的肽序列和新的肽序列的接合部。包含具有新的翻译后修饰的新抗原的肽抗原(A)应涵盖带有一个或多个翻译后修饰例如磷酸或聚糖的氨基酸。在优选的实施方式中，所述肽抗原(A)在由突变产生的氨基酸变化或新的接合部的任一侧翼上包含0-25个氨基酸。在一个实施方式中，肽抗原(A)是在由单核苷酸多态性产生的氨基酸变化的任一侧翼上包含12个氨基酸的新抗原序列，例如25个氨基酸的肽，其中第13个氨基酸是由单核苷酸多态性产生的氨基酸残基。在一些实施方式中，肽抗原(A)是在具有新的翻译后修饰的氨基酸的任一侧翼上包含12个氨基酸的新抗原序列，例如25个氨基酸的肽，其中第13个氨基酸是由新的翻译后修饰位点产生的氨基酸残基。在其他实施方式中，肽抗原(A)是在由插入、缺失或倒位产生的新的接合部的任一侧翼上包含0-12个氨基酸的新抗原序列。在一些情况下，包含由新的序列产生的新抗原的肽抗原(A)可以涵盖整个新的序列，包括在也可能产生的新的接合部的任一侧上的0-25个氨基酸。
适合作为肽抗原(A)用于本公开的免疫原性组合物的肿瘤相关抗原，可以通过本领域技术人员熟知的各种技术来鉴定。肿瘤相关抗原可以通过与健康细胞、即来自于受试者的非癌性细胞相比评定肿瘤细胞的蛋白质表达来鉴定。用于评定蛋白质表达的合适方法包括但不限于免疫组织化学、免疫荧光、蛋白质印迹、色谱法(即尺寸排阻色谱法)、ELISA、流式细胞术和质谱法。优先被肿瘤细胞表达但不被健康细胞表达或被有限数目的健康细胞表达的蛋白质(例如CD20)，是合适的肿瘤相关抗原。对患者的肿瘤活检组织进行DNA和RNA测序，然后通过生物信息学来鉴定编码蛋白质的DNA中被表达为RNA并产生预测将结合到患者的抗原呈递细胞(APC)上的MHC-I等位基因的肽的突变，也可用于鉴定适合作为肽抗原(A)用于本公开的免疫原性组合物的肿瘤相关抗原。
在一些实施方式中，适合作为肽抗原(A)用于免疫原性组合物的肿瘤相关抗原使用质谱法来鉴定。合适的肽抗原(A)是在从MHC分子洗脱后通过质谱法鉴定出的来自于患者的肿瘤活检组织但不来自于同一受试者的健康组织的肽(即所述肽抗原仅仅存在于肿瘤细胞上，但不存在于来自于同一受试者的健康细胞上)。质谱法可以单独地或与用于鉴定肿瘤相关抗原的其他技术组合使用。本领域技术人员认识到，存在许多方法用于鉴定适合作为肽抗原(A)用于本公开的实践的肿瘤相关抗原，例如新抗原(参见Yadav等,Nature,515:572-576,2014)。
在某些实施方式中，用作肽抗原(A)的肿瘤相关抗原在赘生性细胞群体内是克隆的或几乎克隆的，所述赘生性细胞群体在其他方面可以被认为是非均质的。
在个性化癌症疫苗接种方案中被选择用作肽抗原(A)的肿瘤相关抗原，可以根据肽-MHC结合的质谱法确认和/或计算机预测的MHC结合亲和力和肿瘤内的RNA表达水平进行选择。这些数据提供了关于肿瘤相关抗原是否被肿瘤细胞表达并呈递以及因此是T细胞的适合靶标的信息。这些判据可用于选择在个性化癌症疫苗中使用的肽抗原(A)。个性化癌症疫苗可以包含1-100种独特的肽抗原(A)，例如长度为8-50个氨基酸的新抗原。在优选的实施方式中，使用了20种具有8-16个氨基酸的肽抗原(A)，例如8、9、10、11、12、13、14、15或16个氨基酸。在其他实施方式中，使用20种具有16-35个氨基酸的肽抗原(A)，每个肽抗原(A)包含16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸，通常不超过50个氨基酸。在一个非限制性实例中，使用了20种肽序列长度为8个氨基酸的肽抗原(A)作为个性化癌症疫苗。在另一个非限制性实例中，由20种不同的肽抗原偶联物形成的粒子构成的免疫原性组合物被用作个性化癌症疫苗，所述肽抗原偶联物由长度为25个氨基酸的肽抗原(A)构成。在另一个非限制性实例中，将20种肽序列长度为8-16个氨基酸的肽抗原(A)和包含通用CD4 T辅助物的肽抗原(A)用作个性化癌症疫苗。
对于患有具有超过50个肿瘤相关新抗原的高度突变肿瘤的患者来说，可以使用向下选择方法来选择用于由肽抗原偶联物构成的个性化癌症疫苗的肽抗原(A)。在一些实施方式中，使用向下选择方法来选择包含被预测在肿瘤细胞内具有最高MHC结合亲和力和RNA表达水平的表位的肽抗原(A)。额外的判据可以应用于肿瘤相关自身抗原或新抗原的选择。例如，预测的免疫原性或预测的肽抗原(A)引起与其他自身抗原反应的T细胞并可能引起自身免疫的能力，是所考虑的额外判据。例如，包含肿瘤相关抗原并具有高的预测免疫原性但还具有低的引起自身免疫的潜力的肽抗原(A)，是用于选择在个性化癌症疫苗中使用的潜在肽抗原(A)的判据。在一些实施方式中，预期引起T细胞或抗体应答并且所述T细胞或抗体应答与健康细胞上存在的自身抗原反应的新抗原，不被选择用作肽抗原(A)。对于具有少于例如20-50个预测新抗原的患者来说，向下选择方法可能不是关键的，因此所有20-50个预测新抗原可能被用作个性化癌症疫苗中的肽抗原(A)。
癌症疫苗可以包括包含患者特异性肿瘤相关抗原和/或在患者之间共有的肿瘤相关抗原的肽抗原(A)。例如，所述肿瘤相关抗原可以是保守的自身抗原例如NY-ESO-1(睾丸癌)或gp100(黑素瘤)，或者所述抗原可能是通常不被健康细胞表达但在患者之间是保守的隐蔽表位，例如Na17(黑素瘤)。本公开的免疫原性组合物可以包括由所谓的热点突变产生的肽抗原(A)，所述热点突变是在某些基因或基因区域中以比根据几率预测的更高的频率发生的频繁突变。热点突变的非限制性实例包括：BRAF蛋白中的V600E突变，其对于黑素瘤、乳突性甲状腺癌和结肠直肠癌来说是常见的；或KRAS G12突变，其属于最常见的突变，例如KRAS G12C。由热点突变产生的大量合适的自身抗原以及新抗原是已知的，并且通过引用并入本文：参见Chang等,Nature Biotechnology,34:155-163,2016；Vigneron,N.等,CancerImmunology,13:15-20,2013。
在一些实施方式中，肽抗原(A)可以来自于血液肿瘤。血液肿瘤的非限制性实例包括白血病，包括急性白血病(例如11q23阳性急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性髓系白血病和成髓细胞、早幼粒细胞、髓单核细胞、单核细胞和红白血病)、慢性白血病(例如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性髓系白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高等级形式)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、重链病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和骨髓增生异常。
在一些实施方式中，肽抗原(A)可以来自于实体肿瘤。实体肿瘤如肉瘤和癌瘤的非限制性实例包括纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴系恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌(包括基底细胞样乳腺癌、导管癌和小叶性乳腺癌)、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤(Wilms'tumor)、宫颈癌、睾丸癌、精原细胞瘤、膀胱癌和CNS肿瘤(例如神经胶质瘤、星型细胞瘤、成髓细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤)。在几个实例中，肿瘤是黑素瘤、肺癌、淋巴瘤、乳腺癌或结肠癌。
在一些实施方式中，肽抗原(A)是来自于乳腺癌例如导管癌或小叶癌的肿瘤相关抗原。在一些实施方式中，肽抗原(A)是来自于前列腺癌的肿瘤相关抗原。在一些实施方式中，肽抗原(A)是来自于皮肤癌例如基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤(Kaposi'ssarcoma)或黑素瘤的肿瘤相关抗原。在一些实施方式中，肽抗原(A)是来自于肺癌例如腺癌、支气管肺泡癌、大细胞癌或小细胞癌的肿瘤相关抗原。在一些实施方式中，肽抗原(A)是来自于脑癌例如成胶质细胞瘤或脑膜瘤的肿瘤相关抗原。在一些实施方式中，肽抗原(A)是来自于结肠癌的肿瘤相关抗原。在一些实施方式中，肽抗原(A)是来自于肝癌例如肝细胞癌的肿瘤相关抗原。在一些实施方式中，肽抗原(A)是来自于胰腺癌的肿瘤相关抗原。在一些实施方式中，肽抗原(A)是来自于肾癌例如肾细胞癌的肿瘤相关抗原。在一些实施方式中，肽抗原(A)是来自于睾丸癌的肿瘤相关抗原。
在一些实施方式中，肽抗原(A)是源自于癌前疾患例如原位癌的变种或外阴上皮内瘤样病变、宫颈上皮内瘤样病变或阴道上皮内瘤样病变的肿瘤相关抗原。
在一些实施方式中，肽抗原(A)是来自于传染性因子例如病毒、细菌或真菌的抗原。在另外的实施方式中，肽抗原(A)是源自于传染性因子的肽或糖肽；例如，HIV包膜融合肽或来自于HIV的V3或V1/V2糖肽。
在一些实施方式中，肽抗原(A)代表自身抗原。所述自身抗原可以根据筛查受试者自己的T细胞对在患者自己的MHC-I分子的背景中呈递的自身抗原的自体反应性来鉴定和选择。或者，所述肽抗原可以使用计算机模拟方法来选择，所述计算机模拟方法预测具有下述性质的潜在的自身抗原：(i)对结合受试者自己的MHC-I分子具有预测的高亲和力，和(ii)被表达和/或已知与造成受试者的自体免疫综合征的病理相关。在其他实施方式中，所述肽抗原代表源自于过敏原的CD4表位，并且根据对患者自己的MHC-II分子具有高结合亲和力的肽抗原进行选择。
本领域技术人员认识到，可以选择导致免疫应答的任何蛋白质或翻译后修饰的蛋白质(例如糖蛋白)用作本发明的免疫原性组合物中的肽抗原(A)。
在一些实施方式中，包含肽抗原偶联物的肽抗原(A)特异性针对个体患者。包含特异性针对个体患者的肽抗原(A)的肽抗原偶联物可以用于个性化疗法，例如用作用于治疗自身免疫或过敏症的个性化癌症疫苗或个性化耐受诱导疫苗。
包含在个性化癌症疫苗中的肽抗原(A)的选择是一个多步骤过程，其中一些步骤可能是可有可无的。
第一步骤包括鉴定特异性针对肿瘤或相对于正常组织被肿瘤过度表达的肿瘤相关抗原。因此，获得了肿瘤组织和正常组织。肿瘤组织和正常组织可以固定在福尔马林中并进行石蜡包埋，或者可以是新鲜分离的组织。正常组织可能是含有白细胞的血液。处理肿瘤组织和正常组织以分离DNA。对DNA进行进一步处理和测序，以鉴定肿瘤DNA和正常组织DNA之间的差异。这些DNA差异可能是导致非同义突变的单核苷酸或双核苷酸或更高阶核苷酸变化，导致移码突变的插入和缺失，导致交替剪接变体的剪接位点突变，或产生单一氨基酸缺失的可以通读的终止密码子。通过染色体易位或倒位或复制，可能产生其他突变。存在大量方式可以使DNA水平上的变化产生肿瘤特异性的异常肽序列和/或具有异常翻译后修饰的肽，并且它们可以被称为新抗原或预测新抗原。
第二步骤包括确定在步骤1中鉴定的肿瘤相关抗原是否确实由肿瘤表达。分离肿瘤RNA，处理并测序，以确定通过步骤1鉴定的突变是否被肿瘤细胞表达为RNA。可以基于RNA表达水平选择包含从肿瘤和正常组织的DNA测序鉴定的突变的肽抗原(A)以包含在个性化癌症疫苗中。另外，可以选择与非癌组织相比在肿瘤中产生更高RNA水平的肿瘤相关自身抗原作为用于包括在内的肽抗原(A)。其中未鉴定到RNA转录本的突变通常不被选择为用于包括在疫苗中的肽抗原(A)。包含突变的肽抗原(A)或肿瘤相关自身抗原可以基于突变肽(即新抗原)或肿瘤相关自身抗原的RNA表达水平被优先考虑，例如可以优先考虑更高表达的突变或肿瘤相关自身抗原。在包括在个性化癌症疫苗中的肽抗原(A)的选择中可以同时使用多种判据。例如，突变肽(即新抗原)或肿瘤相关自身抗原包含的表位的预测的MHC结合亲和力和RNA表达水平可以一起用于选择用于包括在个性化癌症疫苗中的最佳的一组肽抗原(A)。在这种场景中，非常高表达的含有具有中等结合亲和力的T细胞表位的肽抗原(A)可以优先于含有具有更高结合亲和力的T细胞表位但被所述肿瘤以非常低的水平表达的不同肽抗原(A)。
另一个考虑因素是在构成肿瘤的不同肿瘤细胞之间突变或肿瘤相关自身抗原的克隆或保守程度如何。通过将突变的频率与肿瘤分离的DNA中的野生型变体的频率进行比较来评定突变的克隆性。肿瘤相关新抗原或自身抗原可以基于它们包含的突变的克隆性或近似克隆性进行选择，以用作用于包括在由肽抗原偶联物构成的个性化癌症疫苗中的肽抗原(A)。例如，如果肽抗原(A)据预测存在于>50％的肿瘤细胞、>75％的肿瘤细胞、>85％的肿瘤细胞、>95％的肿瘤细胞或>99％的肿瘤细胞中，则它们可以被优先考虑用于包括在内。
在一些实施方式中，用于包括在由肽抗原偶联物构成的个性化癌症疫苗中的肽抗原(A)，可以基于如通过计算机模拟结合算法确定的所述抗原内包含的表位对给定I类和/或II类MHC分子的预测结合来进一步优先考虑。在一个非限制性实例中，首先通过测序鉴定每位受试者的MHC类型。然后，测试通过任何合适的手段(例如DNA测序、RNA表达或质谱法)鉴定的每个突变肽(即新抗原)或肿瘤相关自身抗原与所述受试者中存在的每种MHC分子的预测结合，所述MHC分子在人类患者的情况下，例如可以是多达6个独特的I类MHC等位基因。存在几种可以用于预测MHC结合的公开可用的算法，包括netMHC人工神经网络、稳定化矩阵方法和免疫表位数据库(IEDB)分析资源一致性算法。也可以使用非公开的算法。含有具有高的预测结合亲和力的表位的肽抗原(A)与含有具有低的预测结合亲和力的表位的肽抗原(A)相比，更可能诱导免疫应答。本文公开的一个出乎意料的发现是，当使用本文描述的包含肽抗原偶联物的免疫原性组合物施用时，超过50％的具有通过IEDB一致性算法预测的结合亲和力小于0.5百分位数的表位的肽抗原(A)，包括预测的新抗原，能够产生T细胞应答(即CD8 T细胞应答)。基于这个出乎意料的发现，含有使用IEDB一致性算法获得的结合亲和力小于0.5百分位数的表位的肽抗原(A)，包括包含预测新抗原的肽抗原(A)，可以被选择用于包含肽抗原偶联物的个性化癌症疫苗中。
另外，结合到MHC的抗原的质谱法确认或抗原与MHC的结合的在质谱法上训练的算法，可以用于选择用于包括在个性化癌症疫苗中的肽抗原(A)。在这种场景中，对肿瘤组织进行处理以鉴定结合到MHC分子的肽。在肿瘤细胞但不在正常细胞的表面上鉴定到的可能是突变肽(即新抗原)、蛋白酶体剪接变体或肿瘤相关自身抗原的肽，可以优先考虑用于包括在个性化癌症疫苗中。本文公开的一个出乎意料的发现是，高比例(即7个中的7个)的基于质谱法确认的结合到肿瘤细胞上的MHC-I并被选择用于个性化癌症疫苗中的预测新抗原，当作为包含肽抗原偶联物的免疫原性组合物中的肽抗原(A)递送时，引起高量值的CD8T细胞应答，表明质谱法或基于质谱法的预测性算法可能是用于选择在由肽抗原偶联物构成的个性化癌症疫苗中用作肽抗原(A)的新抗原的可靠的过滤器。
也可以基于T细胞识别测定法选择肽抗原(A)以包括在内。例如，人们可以使用一种测定法，其中将包含预测新抗原或肿瘤相关自身抗原的合成肽(或在原位产生所述肽的表达系统)添加到源自于受试者的血液、肿瘤组织或其他组织的T细胞的体外培养物。给定肽的T细胞识别可以例如通过ELISpot测定法或通过流式细胞术来评定。在体外T细胞测定法中识别的抗原可以优先考虑作为肽抗原(A)包括在由肽抗原偶联物构成的个性化疫苗中。
最后，肽抗原(A)可以基于任意数量的预测性算法进行选择。可以使用基于在大型数据集上训练的预测性算法被预测为具有免疫原性或功效的肽抗原(A)。另外，预测性算法可用于选择肽新抗原，其被预测引起对突变表位但不对野生型表位特异的T细胞应答，即对自身抗原来说不具有交叉反应性的T细胞。
可以使用上述方法的任何组合来鉴定和选择在由肽抗原偶联物构成的个性化癌症疫苗中使用的包含新抗原或肿瘤相关自身抗原等的肽抗原(A)。
引起非同义氨基酸取代的单核苷酸多态性可以出现在结合到I类MHC的通常长度为8-13个氨基酸的肽表位中的任何位置中。因此，为了覆盖可能结合给定I类MHC的所有可能的表位，在个性化癌症疫苗中使用的包含新抗原的肽抗原(A)可以在所述非同义突变的任一侧上包括12个氨基酸，产生长度为25个氨基酸的肽，其中所述突变氨基酸作为中间(第13个)残基。或者，肽抗原(A)可以仅包括被预测结合到I类MHC的最小表位(长度为8-13个氨基酸)。或者，个性化癌症疫苗可同时含有包含25个氨基酸的新抗原的肽抗原(A)和仅包含新抗原的预测最小表位的肽抗原(A)。
II类MHC的肽结合口袋通常结合12-16个氨基酸的肽，并且在一些情况下多达20或更多个氨基酸的肽。因此，由仅含有预测的结合I类的最小表位(其通常长度为8-13个氨基酸)的肽抗原(A)构成的个性化癌症疫苗不太可能诱导CD4 T细胞应答。然而，含有25个氨基酸(或“25-mer”)的肽抗原(A)的癌症疫苗可能但不总是诱导靶向给定突变的CD4 T细胞应答。
在癌症疫苗中，25个氨基酸(或“25mer”)的肽抗原(A)与包含精确的～7至12个氨基酸的最小表位的肽抗原(A)相比可能诱导较低水平的CD8 T细胞应答，这可能是由于不同长度的肽抗原的加工和呈递的效率的差异。因此，包括在癌症疫苗中的25个氨基酸的肽抗原(A)可能引起与由包含最小表位的肽抗原(A)诱导的应答相比更低量值的CD8 T细胞应答。因此，在一些实施方式中，包括在由肽抗原偶联物构成的癌症疫苗中的25个氨基酸的肽抗原(A)不引起可检测的CD8 T细胞应答，而包含精确的最小表位的7至12个氨基酸的肽抗原(A)引起可检测的CD8 T细胞应答。在另外的实施方式中，包括在由肽抗原偶联物构成的癌症疫苗中的25个氨基酸的肽抗原(A)引起可检测的CD4 T细胞应答，而包含精确的最小表位的7至12个氨基酸的肽抗原(A)不引起可检测的CD4 T细胞应答。基于这些出乎意料的发现，在一些实施方式中，包含相同表位的两种长度的肽抗原(A)即最小CD8 T细胞表位(被称为“Min”或最小表位(ME))和所述25个氨基酸的肽(被称为合成长肽(SLP)或长肽)两者，可以作为肽抗原(A)被包括在由肽抗原偶联物构成的个性化癌症疫苗中。在一些实施方式中，由最小CD4和CD8 T细胞表位构成的肽抗原(A)被包括在由肽抗原偶联物构成的个性化癌症疫苗中。在另外的实施方式中，由最小CD8 T细胞构成的肽抗原(A)和包含通用CD4 T细胞表位的肽抗原(A)和任选地由最小CD4 T细胞表位构成的肽抗原(A)，被包括在由肽抗原偶联物构成的个性化癌症疫苗中。在优选的实施方式中，包括在由肽抗原偶联物构成的个性化疫苗中的肽抗原(A)为7至35个氨基酸，通常为15至35个氨基酸，例如25个氨基酸。引起非同义氨基酸取代的单核苷酸多态性可以出现在结合到I类MHC的通常长度为8-13个氨基酸的肽表位中的任何位置中。因此，为了覆盖可能结合给定I类MHC的所有可能的表位，在个性化癌症疫苗中使用的包含新抗原的肽抗原(A)可以在所述非同义突变的任一侧上包括12个氨基酸，产生长度为25个氨基酸的肽，其中所述突变氨基酸作为中间(第13个)残基。或者，肽抗原(A)可以仅包括被预测结合到I类MHC的最小表位(长度为8-13个氨基酸)。或者，个性化癌症疫苗可同时含有包含25个氨基酸的新抗原的肽抗原(A)和仅包含新抗原的预测最小表位的肽抗原(A)。
连接物(L)、连接物前体(X1)和连接物前体(X2)
肽抗原(A)可以通过任何合适的手段，包括任何合适的连接物，直接地或通过连接物(L)、延长部(B1或B2)或带电荷部分(C)间接地与疏水性嵌段(H)连接。
在优选的实施方式中，连接物(L)任选地经由延长部(B1或B2)和/或带电荷部分(C)将肽抗原(A)与疏水性嵌段(H)接合。
在其他实施方式中，在固相肽合成期间或经由溶液相片段缩合，将肽抗原(A)直接地或经由延长部(B1或B2)与疏水性嵌段(H)接合。在一些实施方式中，可切割的肽延长部(B1或B2)是异双官能性的，例如，B2延长部的N端胺连接到肽抗原(A)的C端并且B2延长部的C端羧基直接连接到疏水性嵌段(H)。虽然该实例中的延长部(B1或B2)可以用作连接物，但并非所有连接物都是延长部。
执行位点选择性偶联的特定功能，即将肽抗原(A)与疏水性嵌段(H)接合或连接在一起的连接物子集被称为“连接物(L)”。连接物(L)由于连接物前体X1与连接物前体X2之间的反应而形成。例如，直接地或经由延长部(B1或B2)或带电荷部分(C)间接地连接到肽抗原(A)的连接物前体X1可以与附连到疏水性嵌段(H)的连接物前体X2反应，形成将肽抗原(A)与疏水性嵌段(H)连接的连接物(L)。连接物前体X1允许肽抗原(A)与疏水性嵌段(H)的位点选择性连接。在一些实施方式中，可以产生直接地或通过延长部(B1或B2)连接到连接物前体X1的肽抗原(A)并分离为肽抗原片段，然后分开地添加到包含与连接物前体X2连接的疏水性嵌段(H)的疏水性嵌段片段中，其中肽抗原片段与疏水性嵌段片段选择性地反应以形成连接物(L)，从而接合肽抗原(A)和疏水性嵌段(H)。
连接物(L)或连接物前体X1可以直接地或分别通过N端延长部(B1)或C端延长部(B2)或经由带电荷部分(C)间接地在肽抗原(A)的N端或C端与肽抗原(A)连接。在优选的实施方式中，连接物(L)或连接物前体X1通过酰胺键与肽抗原(A)或延长部(B1或B2)连接。连接物前体X1可以通常在固相肽合成期间直接地或通过延长部(B1或B2)间接地与肽抗原片段连接。注意，直接地连接到肽抗原(A)的N端或C端的连接物(L)或连接物前体X1不被视为延长部。
连接物(L)可以包含将肽抗原(A)与疏水性嵌段(H)接合的任何合适的键。在优选的实施方式中，连接物(L)包含共价键。共价键的非限制性实例包括包含二硫化物、酰胺、硫醚、腙和三唑的那些。包含二硫化物基团的连接物(L)可以通过二硫化物与硫醇的反应来形成。可以通过使羧酸化物(例如，羧酸、酯、羧酸卤化物、活化羧酸等)与胺或肼反应来形成包含酰胺基团的连接物(L)。可以通过马来酰亚胺与硫醇的反应来形成包含硫醚基团的连接物(L)。可以通过酮与胺或肼的反应来形成包含腙基团的连接物(L)。可以通过叠氮化物与炔烃的反应来形成包含三唑基团的连接物(L)。在所有情况下，一对反应性基团中的每个反应性基团可以是第一或第二反应性官能团。
合适的连接物前体X1是与疏水性嵌段(H)上的连接物前体X2选择性反应，而在肽抗原(A)、任选的延长部(B1和/或B2)或任选的带电荷部分(C)的任何其他位点处不存在连接的那些。这种选择性对于确保可以在肽抗原(A)与疏水性嵌段(H)之间形成连接而不修饰肽抗原(A)很重要。
在优选的实施方式中，连接物(L)是由于连接物前体X1与X2之间的生物正交“点击化学”反应而形成的。在一些实施方式中，所述点击化学反应是无催化剂的点击化学反应，例如应变促进的叠氮化物-炔烃环加成反应，其不需使用铜或任何催化剂。允许生物正交反应的连接物前体X1的非限制性实例包括包含选自叠氮化物、炔烃、四嗪、反式环辛烯(TCO)和双环壬炔(BCN)的官能团的分子。在一些实施方式中，包含叠氮化物的连接物前体X1与连接物前体X2反应以形成三唑连接物。在其他实施方式中，包含四嗪的连接物前体X1与包含反式环辛烯(TCO)的连接物前体X2反应，以形成包含逆需求Diels-Alder连接产物的连接物。在优选的实施方式中，连接物前体X1是带有叠氮化物官能团的非天然氨基酸，其与包含炔烃的连接物前体X2反应，经历1,3-偶极环加成以形成稳定的三唑环。在优选的实施方式中，连接到疏水性嵌段(H)的X2连接物前体包含经历应变促进的环加成的炔烃，例如二苯并环辛炔(DBCO)。在另外的实施方式中，X1连接物前体包含炔烃，其与疏水性嵌段(H)上存在的包含叠氮化物的连接物前体X2反应。在其他实施方式中，X1连接物前体包含叠氮化物，其与疏水性嵌段(H)上存在的包含TCO或BCN基团的连接物前体X2反应。
在其他实施方式中，取决于所述肽抗原(A)的组成而允许位点选择性反应的连接物前体X1，可以包含包括硫醇、肼、酮和醛的官能团。在一些实施方式中，包含硫醇的连接物前体X1分别与包含吡啶基二硫化物或马来酰亚胺的连接物前体X2反应，以形成二硫化物或硫醚连接物(L)。在其他实施方式中，包含肼的连接物前体X1与包含酮或醛的连接物前体X2反应，以形成腙连接物(L)。在一些实施方式中，连接物前体X1是具有硫醇官能团的天然或非天然氨基酸残基例如半胱氨酸，其与包含硫醇反应性官能团例如马来酰亚胺或吡啶基二硫化物的连接物前体X2反应。
在一些实施方式中，连接物前体X1是一种肽序列，其与提供在疏水性嵌段(H)上的构成连接物前体X2的另一个肽序列连接。连接可以是无酶的天然化学连接或酶介导的过程，例如由转肽酶(Sortase)或Spy连接酶促进的连接。在其他实施方式中，连接物前体X1通过高亲和力、非共价相互作用，例如通过卷曲螺旋相互作用或静电相互作用，结合到疏水性嵌段(H)上的构成连接物前体X2的互补分子。在其他实施方式中，连接物前体X1结合到蛋白质例如生物素，其与蛋白质例如链霉亲和素形成高亲和力相互作用。在其他实施方式中，连接物前体X1是与存在于连接物前体X2上的互补核苷酸杂交的寡核苷酸或肽核酸。
在一些实施方式中，连接物前体X1和连接物前体X2各自共价附连到被偶联的两个部分。在一些实施方式中，连接物前体X1和连接物前体X2是双官能的，意味着连接物在两个位点处包括官能团，其中所述官能团用于将连接物偶联至所述两个部分。两个官能团可以相同(被认为是同双官能连接物)或不同(被认为是异双官能连接物)。例如，在一些实施方式中，还包含炔烃和酸的构成异双官能连接物的连接物前体X2用于连接带有胺的疏水性嵌段(H)和连接到带有叠氮化物的连接物前体X1的肽抗原(A)；连接物前体X2的酸和炔烃分别与胺和叠氮化物反应形成酰胺和三唑键，从而连接两个异源分子。在一些实施方式中，构成异双官能连接物的连接物前体X2是连接到酸的二苯并环辛炔(DBCO)、TCO或BCN分子。在其他实施方式中，连接物前体X2是与接合胺和硫醇的马来酰亚胺连接的酸或接合两个胺的双(羧酸)。在其他实施方式中，可以使用三官能或多官能的连接物前体X2，其中连接是相同或不同的。
本领域技术人员认识到，为连接物前体X1和X2选择的合适的官能团对或互补分子对可以在X1与X2之间换位。例如，由三唑构成的连接物可以由分别包含叠氮化物和炔烃的连接物前体X1和X2形成，或者由分别包含炔烃和叠氮化物的连接物前体X1和X2形成。因此，可以将产生连接物(L)的任何合适的官能团对置于X1或X2上。
本公开中提出的特定连接物前体(X1和X2)和连接物(L)提供了出乎意料的可制造性的提高和生物活性的提高。许多这样的连接物前体(X1和X2)和连接物(L)可以适合于本发明的实践，并且在全文中各处更详细描述。
连接物前体(X1)可以附连到肽抗原片段的N端氨基酸，例如B1的N端氨基酸，或者当不存在B1时直接附连到肽抗原(A)。或者，肽抗原片段连接物前体(X1)可以附连到B2的C端氨基酸或者当不存在B2时附连到肽抗原(A)。
在一些实施方式中，连接物前体X1是直接地或通过B2延长部或带电荷部分(C)间接地连接到肽抗原(A)的C端的氨基酸，并具有下式：
Figure BDA0002911415990000681
其中X1的官能团(FG)被选择成与连接物前体X2上的FG特异性反应，并且通常选自胺、叠氮化物、肼或硫醇；R1通常选自OH或NH2，并且y1是任何整数，例如1、2、3、4、5、6、7或8；并且氨基酸的α胺通常连接到延长部B2的C端氨基酸，或如果不存在B2延长部则连接到肽抗原(A)的C端氨基酸。
在其他实施方式中，连接物前体X1直接地或通过延长部(B1或B2)或带电荷部分(C)间接地连接到肽抗原(A)的N端，并具有下式：
Figure BDA0002911415990000682
其中官能团(FG)被选择成与连接物前体X2反应，并且通常选自胺、叠氮化物、肼或硫醇；y2是任何整数，通常是1、2、3、4、5、6、7或8；并且羰基通常连接到延长部B1的N端氨基酸的α胺，或当不存在B1时连接到肽抗原(A)。
在一些实施方式中，连接物前体X1是直接地或通过B2延长部或带电荷部分(C)间接地连接到肽抗原(A)的C端的叠氮基氨基酸，并具有下式：
Figure BDA0002911415990000683
其中氨基酸的α胺连接到B2的C端氨基酸，或如果不存在B2延长部则连接到肽抗原(A)；R1选自OH或NH2，并且y1是任何整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8。含叠氮基的连接物前体X1的非限制性实例是5-叠氮基-2-氨基戊酸、4-叠氮基-2-氨基丁酸和3-叠氮基-2-氨基丙酸。
在其他实施方式中，当含叠氮基的连接物前体X1连接到N端延长部(B1)，或者当不存在B1时直接连接到肽抗原(A)的N端时，所述连接物前体X1具有下式：
Figure BDA0002911415990000691
其中羰基通常连接到延长部B1的N端氨基酸的α胺，或当不存在B1时连接到肽抗原(A)；并且y2是任何整数，通常是1、2、3、4、5、6、7或8。含叠氮基的连接物前体的非限制性实例包括6-叠氮基-己酸、5-叠氮基-戊酸、4-叠氮基-丁酸和3-叠氮基-丙酸。
疏水性嵌段(H)上提供的连接物前体X2包含被选择以允许与连接物前体X1选择性反应以形成连接物(L)的官能团。在一些实施方式中，构成X2的官能团包括羰基，例如与在连接物前体X1上提供的胺或肼反应以形成包含酰胺或腙的连接物(L)的活化酯/羧酸或酮。在其他实施方式中，构成X2的官能团包括叠氮化物，其与提供在连接物前体X1上的炔烃反应以形成三唑。在其他实施方式中，构成X2的官能团选自马来酰亚胺或二硫化物，其与提供在连接物前体X1上的硫醇反应以形成包含硫醚或二硫化物的连接物(L)。连接物前体X2可以通过任何合适的手段附连到疏水性嵌段(H)。在一些实施方式中，疏水性嵌段(H)包含肽，并且X2连接到基于肽的疏水性嵌段(H)的N端。
在其中连接物前体X1包含叠氮化物的一些实施方式中，连接物前体X2包含炔烃部分。炔烃的非限制性实例包括脂族炔烃，环辛炔例如二苄基环辛炔(DBCO或DIBO)，二氟辛炔(DIFO)和联芳基氮杂环辛炔酮(BARAC)。在一些具体的实施方式中，含炔烃的连接物前体X2包含DBCO分子。在其中连接物前体X1包含叠氮化物的其他实施方式中，连接物前体X2包含BCN分子。在其中连接物前体X1包含四嗪的其他实施方式中，连接物前体X2包含TCO分子。
在一些实施方式中，C端延长部(B2)通过肽抗原(A)的C端处的酰胺键连接到肽抗原(A)，所述C端延长部(B2)又经由连接物(L)连接到疏水性嵌段(H)。这种C端连接的肽抗原偶联物的实例是(A)7-25-B2-L-H，其中(A)7-35代表包含7至35个氨基酸的肽抗原(A)。在一个非限制性实例中，具有八肽序列PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1的肽抗原(A)在C端处连接到四肽延长部(B2)，例如Ser-Leu-Val-Arg，所述四肽延长部(B2)连接到含叠氮基的连接物前体(X1)叠氮基-赖氨酸(6-叠氮基2-氨基己酸，Lys(N3))，所述连接物前体(X1)又与含有环辛炔的连接物前体(X2)的二苯并环辛炔(DBCO)部分反应，所述连接物前体(X2)连接到疏水性嵌段(H)，产生PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1-Ser-Leu-Val-Arg-Lys(N3-DBCO-H)。
其他连接物和间隔基团
除连接物(L)外，肽抗原偶联物还可以包含其他连接物部分。在这种情况中，连接物被广义地定义为将两个或更多个部分连接或偶联或接合在一起的任何分子或原子团。本文公开的肽抗原偶联物是复杂分子，其包含多个不同的功能组分(肽抗原(A)，疏水性嵌段(H)，连接物(L)，任选的延长部(B1和/或B2)，任选的带电荷部分(C)，或任选的一种或多种配体等)，其可以通过任何合适的手段连接或接合在一起。
合适的连接物部分包括但不限于直链或支链碳连接物、杂环碳连接物、刚性芳族连接物、柔性环氧乙烷连接物、肽连接物或其组合。在一些实施方式中，碳连接物可以包括C1-C18烷烃连接物，例如低级烷基C4；烷烃连接物可以用于增加两个或更多个异源分子之间的间隔，而较长链烷烃连接物可以用于赋予疏水特征。或者，可以使用亲水性连接物例如环氧乙烷连接物代替烷烃连接物，以增加任何两个或更多个异源分子之间的间隔并增加水溶性。在其他实施方式中，连接物可以是赋予刚性的芳族化合物或聚(芳族)化合物。连接物分子可以包含亲水性或疏水性连接物。在几个实施方式中，连接物包括可以被细胞内酶(例如组织蛋白酶或免疫蛋白酶体)切割的可降解肽序列。
在一些实施方式中，连接物可以由聚(环氧乙烷)(PEG)构成。连接物的长度取决于连接物的目的。例如，可以增加连接物(例如PEG连接物)的长度以分离免疫原性组合物的组分，例如减少空间位阻，或者在亲水性PEG连接物的情况下可以用于提高水溶性。连接物例如PEG可以是短连接物，其长度可以是至少2个单体。连接物例如PEG的长度可以是约2至约24个单体，例如长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24个单体或更多个。
在其中连接物包含碳链的一些实施方式中，所述连接物可以包含约1或2至约18个碳的链，例如长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、15、16、17、18个或更多个碳。在其中连接物包含碳链的一些实施方式中，所述连接物可以包含约12至约20个碳的链。在其中连接物包含碳链的一些实施方式中，所述连接物可以包含不超过18个碳的链。在一些实施方式中，佐剂通过合适的连接物例如低级烷基连接到疏水性嵌段(H)。
在一些实施方式中，连接物在细胞内条件下是可切割的，使得所述连接物的切割导致释放出与所述连接物连接的任何组分，例如肽抗原(A)。
例如，连接物可以通过位于细胞内囊泡中(例如，在溶酶体或内体或小窝内)的酶或通过细胞溶质(例如蛋白酶体或免疫蛋白酶体)中的酶切割。连接物可以是例如被蛋白酶切割的肽连接物，所述蛋白酶包括但不限于位于细胞内囊泡如溶酶体或内体区室中的蛋白酶(例如组织蛋白酶)。肽连接物的长度通常为2-10个氨基酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个(例如至多20个)氨基酸，例如长度为11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸。已知某些二肽被包括组织蛋白酶例如组织蛋白酶B和D和纤溶酶的蛋白酶水解(参见例如Dubowchik和Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123)。例如，可以使用可被硫醇依赖性蛋白酶组织蛋白酶-B切割的肽连接物(例如，Phe-Leu或Gly-Phe-Leu-Gly连接物)。这些连接物的其他实例描述于例如通过引用并入本文的美国专利第6,214,345号中。在一个具体的实施方式中，可被细胞内蛋白酶切割的肽连接物是Val-Cit连接物或Phe-Lys连接物(参见例如美国专利第6,214,345号，其描述了具有Val-Cit连接物的阿霉素的合成)。
连接物中可切割肽的特定序列可以用于促进细胞内摄取后免疫细胞的加工。例如，本文公开的免疫原性组合物的几个实施方式在水性条件下形成粒子，其被免疫细胞例如抗原呈递细胞(例如树突状细胞)内化。可以选择可切割的肽连接物以在免疫细胞的细胞内摄取后促进肽连接物的加工(即水解)。可以选择可切割的肽连接物的序列以促进细胞内蛋白酶的加工，例如细胞内囊泡中的组织蛋白酶或胞浆空间中的蛋白酶体或免疫蛋白酶体。
在几个实施方式中，由式Pn…P4-P3-P2-P1的肽序列构成的连接物用于促进被组织蛋白酶识别，其中P1选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或蛋氨酸；P2选自甘氨酸、亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸；P3选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、脯氨酸或亮氨酸；并且P4选自甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。在一个非限制性实例中，被组织蛋白酶识别的式P4-P3-P2-P1的四肽连接物在P1的C端处通过酰胺键连接到异源分子，并具有序列Ser-Pro-Leu-Cit。为清楚起见，氨基酸残基(Pn，其中n是任何整数)从切割位点的近端到远端进行编号，所述切割位点在P1残基的C端；例如，P1-P1'之间的酰胺键被水解。促进被内体和溶酶体蛋白酶例如组织蛋白酶切割的合适的肽序列在文献中充分描述(参见：Choe等,J.Biol.Chem.,281:12824-12832,2006)。
在几个实施方式中，选择由肽序列构成的连接物以促进被蛋白酶体或免疫蛋白酶体识别。选择式Pn…P4-P3-P2-P1的肽序列以促进被蛋白酶体或免疫蛋白酶体识别，其中P1选自碱性残基和疏水性支链残基，例如精氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；P2、P3和P4任选地选自亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸和酪氨酸。在一个非限制性实例中，被蛋白酶体识别的式P4-P3-P2-P1的可切割连接物通过P1处的酰胺键连接到异源分子，并具有序列Tyr-Leu-Leu-Leu。促进被蛋白酶体或免疫蛋白酶体降解的序列可以单独使用或与组织蛋白酶可切割的连接物组合使用。在一些实施方式中，促进免疫蛋白酶体加工的氨基酸与促进由内体蛋白酶加工的连接物连接。在文献中充分描述了许多促进被免疫蛋白酶体切割的合适序列(参见：Kloetzel等,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.,2:179-187),2001；Huber等,Cell,148:727-738,2012；和Harris等,Chem.Biol.,8:1131-1141,2001)。
在其他实施方式中，肽抗原偶联物的任何两种或更多种组分可以通过对酸性条件下的水解敏感的pH敏感性连接物接合在一起。许多pH敏感键是本领域技术人员熟悉的，并且包括例如腙、半卡巴腙、硫代半卡巴腙、顺式乌头酰胺、原酸酯、乙缩醛、缩酮等(参见例如美国专利第5,122,368号；第5,824,805号；第5,622,929号；Dubowchik和Walker,1999,Pharm.Therapeutics 83:67-123；Neville等,1989,Biol.Chem.264:14653-14661)。在优选的实施方式中，所述键在生理pH下例如在约7.4的pH下是稳定的，但是在溶酶体pH即～pH5-6.5下经历水解。在一些实施方式中，配体通过形成pH敏感键的FG与疏水性嵌段(H)连接，例如酮与肼之间反应形成pH不稳定的腙键。pH敏感键(例如腙)提供以下优点：所述键在生理pH下即在约pH 7.4下稳定，但在较低的pH值(例如细胞内囊泡的pH)下水解。
在其他实施方式中，连接物包含在还原条件下可切割的键，例如可还原的二硫键。用于引入二硫键的许多不同的连接物在本领域中是已知的(参见例如Thorpe等,1987,Cancer Res.47:5924-5931；Wawrzynczak等,在免疫偶联物中：在放射成像和癌症疗法中的抗体偶联物(In Immunoconjugates:Antibody Conjugates in Radioimagery andTherapy of Cancer)(C.W.Vogel编,Oxford U.Press,1987)；Phillips等,Cancer Res.68:92809290,2008)。也参见美国专利第4,880,935号。)。在一些实施方式中，配体连接到带有硫醇官能团的疏水性嵌段(H)以形成二硫键。在一些实施方式中，两个或更多个疏水性嵌段通过二硫键连接在一起。
在另外的实施方式中，肽抗原偶联物的任何两个组分之间的连接可以通过以下形成：酶促反应，例如表达的蛋白质连接或通过转肽酶(参见：Fierer等,Proc.Natl.Acad.Sci.,111:W1176-1181,2014；和Theile等,Nat.Protoc.,8:1800-1807,2013。)，化学酶促反应(Smith等,Bioconjug.Chem.,25:788-795,2014)或非共价高亲和力相互作用，例如生物素-亲和素和卷曲螺旋相互作用(Pechar等,Biotechnol.Adv.,31:90-96,2013)或本领域技术人员已知的任何合适手段(参见：Chalker等,Acc.Chem.Res.,44:730-741,2011；Dumas等,Agnew Chem.Int.Ed.Engl.,52:3916-3921,2013)。
N端(B1)和C端(B2)延长部
肽抗原偶联物可以包含N端(B1)和/或C端(B2)延长部，其中B1或B2可以经由连接物(L)连接到促进粒子形成的疏水性嵌段(H)。组分中的任一者都可以通过任何合适的手段连接。
N端和C端延长部B1和B2可以由以下中的任何一种或多种构成：氨基酸，包括非天然氨基酸；亲水性环氧乙烷单体(例如PEG)；疏水性烷烃链；等等；或其组合。N端和C端延长部B1和B2通过任何合适的手段，例如通过稳定的酰胺键，连接到肽抗原(A)。
在一些实施方式中，延长部(B1和B2)用于控制肽抗原(A)的降解速率，但也可以执行任何一种或多种额外功能。在一些实施方式中，N端或C端延长部(B1或B2)可以是自由的(其中N端或C端延长部的一个末端与肽抗原(A)连接，而另一末端不与另一分子连接)，并用于减缓肽抗原(A)的降解；例如，基于B1肽的延长部可以通过酰胺键与肽抗原(A)的N端连接以减缓降解。在其他实施方式中，N端和/或C端延长部(B1和/或B2)可以连接到异源分子，并且因此可以用作连接物以及调节肽抗原(A)的降解。提供连接物功能的N端和/或C端延长部可以将肽抗原直接地或通过连接物(L)间接地连接到疏水性嵌段(H)和/或带电荷部分(C)。
在一些实施方式中，延长部(B1和/或B2)用于提供任何两个异源分子之间的距离，即间隔。在其他实施方式中，延长部(B1和/或B2)用于向肽抗原偶联物赋予疏水或亲水特性。在其他实施方式中，可以选择延长部(B1和/或B2)的组成以赋予刚性或柔性。在其他实施方式中，N端和/或C端延长部(B1和/或B2)可以帮助稳定由肽抗原偶联物形成的粒子。
在一些实施方式中，延长部(B1和/或B2)由带电荷的官能团例如带电荷的氨基酸残基(例如精氨酸、赖氨酸)构成，其在生理pH下赋予静电荷。延长部中存在的带电荷残基的数量可用于调节肽抗原偶联物的净电荷。
在一些实施方式中，选择添加到肽抗原(A)的C端延长部(B2)以促进式[C]-[B1]-A-B2-[X1]的肽抗原片段的制造，其中[]表示所述基团是任选的，其可以通过将氨基酸序列并入B2中，从而在固相肽合成期间破坏β-片层形成并防止序列截短。在一个非限制性实例中，在固相肽合成期间并入C端二肽连接物(B2)即Gly-Ser，作为假脯氨酸二肽(例如Gly-Ser(Psi(Me,Me)pro))。在另外的实施方式中，在组织蛋白酶可切割的C端延长部(B2)序列例如Ser-Pro-Leu-Arg(SEQ ID NO:1)中包括脯氨酸；由此包括脯氨酸以便于制造并促进内体蛋白酶对延长部的加工。
在一些实施方式中，肽抗原(A)在C端处连接到B2延长部，所述B2延长部直接地或通过连接物(L)间接地连接到疏水性嵌段(H)。在一些实施方式中，B1延长部连接到肽抗原(A)的N端，并且B2延长部连接在肽抗原(A)的C端处，其中B1或B2直接地或经由连接物(L)连接到疏水性嵌段(H)。在其他实施方式中，肽抗原(A)在N端处连接到B1延长部，所述B1延长部直接地或经由连接物(L)连接到疏水性嵌段(H)。在一些实施方式中，带电荷部分(C)连接到延长部B1或B2，其分别与肽抗原(A)的N端或C端连接，其中不与带电荷部分(C)连接的延长部直接地或经由连接物(L)连接到疏水性嵌段(H)。在另外的实施方式中，带电荷部分(C)连接到分别与肽抗原(A)的N端和C端连接的B1和B2延长部两者。在另外的实施方式中，带电荷部分(C)连接到与肽抗原(A)的N端连接的B1延长部，但不连接到与肽抗原(A)的C端连接的B2延长部，其可以直接地或通过连接物(L)连接到疏水性嵌段(H)。连接物前体X1或连接物(L)可以通过任何合适的手段例如酰胺键连接到任一个延长部(B1或B2)。在优选的实施方式中，延长部(B1和B2)是被选择用于被例如蛋白酶的酶识别和水解的肽序列。延长部(B1和B2)优选是可切割的肽，包括被内体蛋白酶和/或免疫蛋白酶体识别的氨基酸。
如此处更详细描述的，由可降解肽构成的延长部(B1或B2)的组成取决于所述延长部是连接到肽抗原(A)的N端(B1)还是C端(B2)。
作为非限制性实例，C端延长部(B2)可以是促进被组织蛋白酶、免疫蛋白酶体或组织蛋白酶和免疫蛋白酶体两者切割的肽序列。优先被免疫蛋白酶体识别用于加工的与肽抗原(A)的C端近端连接的氨基酸包括小的不带电荷的残基，例如甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸。优先被组织蛋白酶识别用于加工的与肽抗原(A)的C端近端连接的氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或蛋氨酸。
在一些实施方式中，延长部(B2)是与肽抗原(A)的C端残基连接的可降解的肽，并且由被某些蛋白酶识别并水解的氨基酸序列构成。在一些实施方式中，C端延长部(B2)是长度为约1至8个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸，通常不超过10个氨基酸的肽序列。在优选的实施方式中，C端延长部(B2)经由在肽抗原(A)的C端羧基与延长部(B2)的N端残基的α胺之间形成的酰胺键与肽抗原(A)连接。B2与肽抗原(A)之间的酰胺键可以被酶切割。
注意，将指代肽抗原的肽序列称为“PA”，将指代N端延长部(B1)的肽序列称为“PN”，并且将指代C端延长部(B2)的肽序列称为“PC”。构成肽抗原(A)的氨基酸序列由式PA1…PAn表示，其中PA表示构成肽抗原(A)的任何氨基酸残基并且n是整数值。例如，8-氨基酸肽抗原(A)可以表示为PA1-PA2-PA3-PA4-PA5-PA6-PA7-PA8。构成N端延长部(B1)的氨基酸序列由式PN…PNn表示，其中PN表示构成N端延长部的任何氨基酸残基并且n是整数值。构成C端延长部(B2)的氨基酸序列由式PC1…PCn表示，其中PC表示构成C端延长部的任何氨基酸残基并且n是整数值。
通常按照从切割位点近端至远端的顺序对氨基酸位置进行编号，其中切割位点的C端氨基酸位置由一阶符号(例如Pn')表示。例如，对于与八肽抗原(PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1)的C端连接的四肽延长部(PC1'-PC2'-PC3'-PC4')，例如PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1-PC1'-PC2'-PC3'-PC4'，PA1-PC1'之间的酰胺键被酶识别并水解。
在某些实施方式中，C端延长部(B2)是被选择以促进免疫蛋白酶体识别和切割以及任选地内体蛋白酶识别的氨基酸序列。由于肽抗原(A)通常含有C端残基，例如亮氨酸，其可促进免疫蛋白酶体的水解，例如在肽抗原(A)的C端残基近端的酰胺键处，因此应选择与肽抗原(A)的C端连接的延长部，以促进免疫蛋白酶体识别和在肽抗原(A)的C端近端的酰胺键处的切割。免疫蛋白酶体偏好在肽抗原(A)的C端氨基酸PA1邻近的PC1'位置处的小的不带电荷的氨基酸，例如PA1-PC1'之间的酰胺键。然而，内体蛋白酶偏好大体积的疏水性氨基酸(例如，亮氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸或谷氨酰胺)和碱性氨基酸(例如，精氨酸和赖氨酸)。因此，可以选择C端延长部以促进被任何一种或两种蛋白酶识别。
在一些实施方式中，具有序列PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1的肽抗原(A)与具有序列PC1'…PCn'的C端肽延长部(B2)连接，其中n是1至8的整数值，例如PA8-PA7-PA6-PA4-PA3-PA2-PA1-PC1'…PCn'。C端延长部(B2)的组成取决于所用延长部序列的长度。在一些实施方式中，C端延长部B2是选自Gly、Ala、Ser、Arg、Lys、Cit、Gln、Thr、Leu、Nle或Met的单个氨基酸PC1'。在另外的实施方式中，C端延长部B2是二肽PC1'-PC2'，其中PC1'选自Gly、Ala或Ser；并且PC2'选自Gly、Ala、Ser、Pro、Arg、Lys、Cit、Gln、Thr、Leu、Nle或Met。在另外的实施方式中，C端延长部B2是三肽PC1'-PC2'-PC3'，其中PC1'选自Gly、Ala或Ser；PC2'选自Gly、Ala、Ser或Pro；并且PC3'选自Gly、Ser、Arg、Lys、Cit、Gln、Thr、Leu、Nle或Met。注意，Cit＝瓜氨酸。
在另外的实施方式中，C端延长部B2是四肽延长部PC1'-PC2'-PC3'-PC4'，其中PC1'选自甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸；PC2'选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸或亮氨酸；PC3'选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸；并且PC4'选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或蛋氨酸。在另外的实施方式中，C端延长部B2是五肽PC1'-PC2'-PC3'-PC4'-PC5'，其中PC1'选自甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸；PC2'选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；PC3'选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、脯氨酸或亮氨酸；PC4'选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸；并且PC5'选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或蛋氨酸。在另外的实施方式中，C端延长部B2是六肽PC1'-PC2'-PC3'-PC4'-PC5'-PC6'，其中PC1'选自甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸；PC2'选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸或脯氨酸；PC3'选自甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸、精氨酸、赖氨酸、谷氨酸或天冬氨酸；PC4'选自脯氨酸或亮氨酸；PC5'选自甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸；并且PC6'选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或蛋氨酸。
六肽C端延长部(B2)的非限制性实例包括Gly-Gly-Lys-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO:2)、Gly-Gly-Lys-Pro-Leu-Arg(SEQ ID NO:3)、Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO:4)、Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Cit(SEQ ID NO:26)、Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Cit(SEQ ID NO:33)、Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO:5)、Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO:6)、Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO:7)。
五肽C端延长部(B2)的非限制性实例包括Gly-Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO:8)、Gly-Ser-Leu-Val-Cit(SEQ ID NO:29)、Gly-Lys-Pro-Val-Cit(SEQ ID NO:32)、Gly-Lys-Pro-Val-Arg(SEQ ID NO:9)、Gly-Ser-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO:10)、Gly-Glu-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO:11)。
四肽C端延长部(B2)的非限制性实例包括Ser-Leu-Val-Cit(SEQ ID NO:36)、Ser-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO:12)、Ser-Pro-Val-Cit(SEQ ID NO:27)、Glu-Leu-Val-Arg(SEQID NO:13)、Ser-Pro-Val-Arg(SEQ ID NO:14)、Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO:15)、Lys-Pro-Leu-Arg(SEQ ID NO:16)、Glu-Leu-Val-Cit(SEQ ID NO:28)、Glu-Leu-Val-Leu(SEQID NO:17)、Glu-Pro-Val-Cit(SEQ ID NO:34)、Glu-Gly-Val-Cit(SEQ ID NO:35)。
三肽C端延长部(B2)的非限制性实例包括Gly-Ser-Gly、Gly-Ser-Arg、Gly-Ser-Leu、Gly-Ser-Cit、Gly-Pro-Gly、Gly-Pro-Arg、Gly-Pro-Leu、Gly-Pro-Cit。
二肽C端延长部(B2)的非限制性实例包括Gly-Ser、Gly-Pro、Val-Cit、Gly-Arg、Gly-Cit。
单个氨基酸C端延长部(B2)的非限制性实例包括Gly、Ser、Ala、Arg、Lys、Cit、Val、Leu、Met、Thr、Gln或Nle。在上述实例中，Arg可以用Lys代替；Lys可以用Arg代替；Glu可以用Asp代替；并且Asp可以用Glu代替。
连接到肽抗原(A)的C端的C端连接物(B2)可以选择以被免疫蛋白酶体和内体蛋白酶两者识别(即水解)。在一个非限制性实例中，具有序列PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1的肽抗原(A)在C端处连接到具有序列PC1'-PC2'-PC3'-PC4'的C端四肽延长部(B2)，其中PC1'选自甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸，并且PC4'选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或蛋氨酸，例如，Ser-P3-P2-Arg。在一些实施方式中，具有序列PA8-PA7-PA6-PA5-PA4-PA3-PA2-PA1的肽抗原(A)在C端处连接到具有序列PC1'-PC2'-PC3'-PC4'-PC5'-PC6'的C端六肽延长部(B2)，其中PC1'和PC2'选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸或丝氨酸，并且PC6'选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或蛋氨酸，例如Gly-Gly-PC3'-PC4'-PC5'-Arg。与肽抗原(A)的C端连接的、促进被免疫蛋白酶体和组织蛋白酶两者加工的C端延长部(B2)的非限制性实例是Gly-Gly-Lys-Pro-Leu-Arg(SEQID NO:3)。偏好被免疫蛋白酶体和组织蛋白酶加工的、连接在肽抗原(A)的C端处的C端延长部(B2)的另一个非限制性实例是Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Cit(SEQ ID NO:26)或Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Cit(SEQ ID NO:33)。
在一些实施方式中，N端延长部(B1)是长度为约1至8个氨基酸，例如1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸，通常长度不超过10个氨基酸的肽序列，其通过例如在延长部(B1)的羧基与肽抗原(A)的N端残基的α胺之间形成的酰胺键与肽抗原(A)连接。B1与肽抗原(A)之间的酰胺键可以被酶切割。应理解，通常按照从切割位点近端至远端的顺序对氨基酸位置进行编号，其中在切割位点的C端的氨基酸位置由一阶符号表示(例如Pn')。例如，对于与八肽(PA1'-PA2'-PA3'-PA4'-PA5'-PA6'-PA7'-PA8')的肽抗原(A)的N端连接的四肽延长部(PN4-PN3-PN2-PN1)，例如PN4-PN3-PN2-PN1-PA1'-PA2'-PA3'-PA4'-PA5'-PA6'-PA7'-PA8'，PN1-PA1'之间的酰胺键被酶识别并水解。
作为非限制性实例，N端延长部(B1)可以是被内体蛋白酶识别的酶可降解肽，其中与肽抗原(A)(例如PA1'-PA2'-PA3'-PA4'-PA5'-PA6'-PA7'-PA8')连接的四肽延长部(PN4-PN3-PN2-PN1)的PN1位置选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或蛋氨酸，例如PN4-PN3-PN2-Arg。在一些实施方式中，N端延长部(B1)是被免疫蛋白酶体识别的酶可降解肽，其中四肽(PN4-PN3-PN2-PN1)的PN1位置选自异亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或缬氨酸，例如PN4-PN3-PN2-Leu。在另外的实施方式中，N端延长部(B1)是被内体蛋白酶和免疫蛋白酶体两者识别的酶可降解肽，其中八肽(PN8-PN7-PN6-PN5-PN4-PN3-PN2-PN1)延长部的PN5和PN1位置选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或蛋氨酸(对于被组织蛋白酶识别的PN5位置)，以及异亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或缬氨酸(对于被免疫蛋白酶体识别的PN1位置)；例如PN8-PN7-PN6-Arg-PN4-PN3-PN2-Leu。被组织蛋白酶和免疫蛋白酶体识别的N端延长部(B1)的一个非限制性实例是Lys-Pro-Leu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Leu。被组织蛋白酶和免疫蛋白酶体识别的N端延长部(B1)的另一个非限制性实例是Ser-Leu-Val-Cit-Tyr-Leu-Leu-Leu。
在一些实施方式中，N端延长部(B1)是被内体蛋白酶识别的酶可降解的四肽，其中四肽延长部(例如PN4-PN3-PN2-PN1)的PN1位置优选选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或蛋氨酸，例如PN4-PN3-PN2-Arg；PN2选自甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸；PN3选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、脯氨酸或亮氨酸；并且PN4选自甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。在一些实施方式中，N端延长部(B1)是被内体蛋白酶识别的酶可降解的三肽，其中三肽延长部(例如PN3-PN2-PN1)的PN1位置优选选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或蛋氨酸；PN2选自甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸；并且PN3选自甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、脯氨酸或亮氨酸。在一些实施方式中，N端延长部(B1)是被内体蛋白酶识别的酶可降解的二肽，其中二肽延长部(例如PN2-PN1)的PN1位置优选选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或蛋氨酸；并且PN2选自甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。在另外的实施方式中，N端延长部(B1)是被内体蛋白酶识别的氨基酸，其中PN1位置优选选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或蛋氨酸。
在其他实施方式中，N端延长部(B1)是被免疫蛋白酶体识别的酶可降解肽，其中四肽延长部(PN4-PN3-PN2-PN1)的P1位置优选选自异亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或缬氨酸，例如PN4-PN3-PN2-Leu。
在另外的实施方式中，N端延长部(B1)是被内体蛋白酶和免疫蛋白酶体两者识别的酶可降解肽，其中八肽延长部(PN8-PN7-PN6-PN5-PN4-PN3-PN2-PN1)的PN5和PN1位置选自精氨酸、赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或蛋氨酸(对于被组织蛋白酶识别的PN5位置)，以及异亮氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或缬氨酸(对于被免疫蛋白酶体识别的PN1位置)；例如PN8-PN7-PN6-Arg-PN4-PN3-PN2-Leu。被组织蛋白酶和免疫蛋白酶体识别的N端延长部(B1)的非限制性实例是Lys-Pro-Leu-Arg-Tyr-Leu-Leu-Leu(SEQ ID NO:18)。
被免疫蛋白酶体识别的四肽N端延长部(B1)的非限制性实例包括：Ser-Leu-Val-Cit(SEQ ID NO:36)、Ser-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO:19)、Ser-Pro-Val-Cit(SEQ ID NO:30)、Glu-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO:20)、Ser-Pro-Val-Arg(SEQ ID NO:21)、Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO:22)、Lys-Pro-Leu-Arg(SEQ ID NO:23)、Lys-Pro-Val-Arg(SEQ ID NO:24)、Glu-Leu-Val-Cit(SEQ ID NO:31)、Glu-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO:25)、Glu-Pro-Val-Cit(SEQ ID NO:37)和Lys-Pro-Val-Cit(SEQ ID NO:38)。
三肽N端延长部(B1)的非限制性实例包括：Leu-Val-Cit、Leu-Val-Leu、Pro-Val-Cit、Leu-Val-Arg、Pro-Val-Arg、Pro-Leu-Arg、Gly-Val-Ser。
二肽N端延长部(B1)的非限制性实例包括：Val-Cit、Val-Leu、Val-Arg、Leu-Arg。
单个氨基酸N端延长部(B1)的非限制性实例包括Cit、Arg、Leu或Lys。在上述实例中，Arg可以用Lys代替；Lys可以用Arg代替；Glu可以用Asp代替；并且Asp可以用Glu代替。注意，Cit＝瓜氨酸。
疏水性嵌段(H)
肽抗原(A)可以直接地或经由延长部(B1或B2)、带电荷部分(C)和/或连接物(L)连接到疏水性嵌段(H)。在一些实施方式中，连接物前体(X2)连接到疏水性嵌段(H)，并与肽抗原片段上的连接物前体(X1)反应，形成直接地或经由延长部(B1或B2)间接地连接到肽抗原(A)的连接物(L)。
在本公开中，术语“疏水性嵌段”(H)用作通用术语来描述具有有限水溶性或两亲性特征的分子，其可以与肽抗原(A)连接，产生肽抗原偶联物，所述肽抗原偶联物在水性条件下形成粒子。在上下文中，疏水性嵌段(H)由于其不良溶解性或在特定温度和pH范围内的水性条件下组装成粒子的趋势而促进粒子组装。
疏水性嵌段(H)的目的是使肽抗原偶联物变成颗粒形式，作为调节药代动力学并促进被抗原呈递细胞摄取的手段。由肽抗原偶联物形成的粒子的直径尺寸应在约10nm至10,000nm之间。在优选的实施方式中，粒子是纳米粒子，其尺寸可以被摄取到细胞的内体系统(例如免疫细胞)中。纳米粒子的直径平均尺寸范围可以为约10nm至约500nm。因此，在一些实施方式中，纳米粒子的直径平均可为约10nm、约20nm、约30nm、约40nm、约50nm、约100nm、200nm、300nm、400nm或500nm。在其他实施方式中，纳米粒子的直径平均可为约10-50nm，或约10-100nm，或约10-200nm或约10-500nm。在优选的实施方式中，粒度的直径范围为约20-200nm。组合物中的粒子尺寸可以改变，但是通常将落入本文所述的尺寸范围内。例如，组合物中大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于91％、大于92％、大于93％、大于94％、大于95％、大于96％、大于97％、大于98％或大于99％的粒子将落在本文所述的尺寸范围内。在一些实施方式中，肽抗原(A)可以连接到延长部(B1或B2)，所述延长部(B1或B2)直接地或经由连接物(L)连接到疏水性嵌段(H)，其组装成对于被免疫细胞摄取来说过大(例如大于约5,000nm的粒子)并且在注射位点处形成储库的粒子。
在一些实施方式中，疏水性嵌段(H)可以呈预先形成的粒子的形式，即，所述粒子在连接肽抗原(A)之前形成。所述粒子可以由疏水性材料例如某些聚合物或脂质、交联的亲水性聚合物例如水凝胶、或交联的疏水性聚合物例如交联的聚苯乙烯构成，其在水性条件下保持结构。预先形成的粒子的非限制性实例包括聚合物粒子，例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚合物囊泡(polymersome)或泊洛沙姆(polaxmer)；基于脂质的胶束、脂质体或其他基于脂质的多层囊泡；水包油乳剂，例如水包矿物油和矿物油包水乳剂；无机盐粒子，例如磷酸铝或氢氧化铝盐粒子(即铝佐剂)；金属纳米粒子，例如氧化铁粒子；二氧化硅纳米粒子；和基于多糖的粒子。在一些实施方式中，预先形成的粒子是脂质体纳米粒子。在其他实施方式中，预先形成的粒子是铁粒子。在其他实施方式中，预先形成的粒子是聚合物粒子。应当理解，这些粒子在与肽抗原(A)连接之前已经形成，并且前一种粒子不同于通过组装两种或更多种包含疏水性嵌段(H)的肽抗原偶联物形成的粒子。
肽抗原(A)与预先形成的粒子连接的效率取决于肽抗原(A)的性质和所用连接的类型。例如，肽抗原(A)可以被吸附或并入到预先形成的粒子内，并且可以凭经验确定每种肽抗原(A)的这个过程的效率，因为肽抗原(A)的性质会影响吸附和并入。肽抗原(A)可以通过高亲和力相互作用(例如静电)或共价键连接到预先形成的粒子，其中预先形成的粒子具有设定数目的反应位点，这些反应位点将决定可以连接到预先形成的粒子的肽抗原(A)的数目。对于包含多种不同肽抗原(A)例如20种不同肽抗原(A)的免疫原性组合物，每种类型的肽抗原(A)的多个拷贝可以在分开的预先形成的粒子上递送，或者20种肽抗原(A)中的每一种的多个拷贝可以在同一预先形成的粒子上递送。
预先形成的粒子的局限性在于肽抗原(A)与粒子的比率不能容易地控制。或者，在优选的实施方式中，在粒子组装之前，肽抗原(A)直接地或经由连接物(L)连接到疏水性嵌段(H)。由任选地通过延长部(B1或B2)和/或连接物(L)连接到疏水性嵌段(H)的肽抗原(A)构成的肽抗原偶联物是在分子上确定的实体，并且肽抗原(A)与疏水性嵌段(H)的比率可以精确控制。在优选的实施方式中，所述比率是1:1的肽抗原(A)与疏水性嵌段(H)。在另外的非限制性实施例中，所述比率可以是1:3至3:1的肽抗原(A)与疏水性嵌段(H)。
与预先形成的粒子相反，肽抗原偶联物可以通过将肽抗原(A)直接地或通过延长部(B1或B2)和/或连接物(L)间接地连接到疏水性嵌段(H)以产生在化学上确定的单分子来形成，
疏水性嵌段(H)是具有基本上有限的水溶性的分子，或者是两亲性的，并且能够在水性条件下组装成超分子结构，例如胶束、纳米粒子或微粒。在优选的实施方式中，疏水性嵌段(H)在水性条件下是不溶的或形成胶束，溶解低至约0.1mg/mL或约0.01mg/mL。
如本文所述的疏水性嵌段(H)包括可以形成超分子结构例如胶束或形成双层的层状或多层结构(例如脂质体或聚合物囊泡)的两亲性分子，以及完全不溶并形成聚集体的化合物。疏水性嵌段(H)的疏水特征可以是温度和/或pH响应性的。在一些实施方式中，疏水性嵌段(H)是在低温下可溶于水但在高于例如20℃的温度，例如20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40℃下不溶或形成胶束的聚合物。在其他实施方式中，疏水性嵌段(H)是在低pH下，例如在低于6.5的pH下具有水溶性，但例如在高于6.5的pH下不溶的聚合物。
疏水性嵌段(H)可以选自任何高级烷烃、环状芳族化合物、脂肪酸、衍生自萜烯/异戊二烯的化合物或具有有限水溶性的聚合物。示例性的高级烷烃包括但不限于辛烷、壬烷、癸烷、十一烷、十二烷、十三烷、十四烷、十五烷、十六烷、十七烷和十八烷。示例性的环状芳族化合物包括但不限于苯和稠合苯环结构或杂环芳族分子。示例性的饱和和不饱和脂肪酸包括但不限于肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸或油酸。在其他实施方式中，疏水性嵌段(H)包含二酰基脂质，例如1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺或1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺或脂肽，例如Pam2Cys。在一些实施方式中，基于脂肪酸或脂质的疏水性嵌段(H)还可以包含PEG。衍生自萜烯/异戊二烯的示例性化合物包括固醇衍生物例如胆固醇和角鲨烯。在一些实施方式中，疏水性嵌段(H)包含胆固醇。
在优选的实施方式中，疏水性嵌段(H)是水溶性有限的聚合物或者是两亲性的并且能够在水性条件下组装成粒子例如胶束。
疏水性嵌段(H)可以包含线性或支化聚合物。所述聚合物可以是均聚物、共聚物或三元共聚物。所述聚合物可以由一种或多种不同类型的单体单元构成。所述聚合物可以是统计共聚物或交替共聚物。所述聚合物可以是嵌段共聚物，例如A-B型，或者所述聚合物可以由接枝共聚物构成，从而通过聚合物类似反应将两种聚合物连接起来。
示例性聚合物包括但不限于PLGA，疏水性聚(氨基酸)，聚(谷氨酸苄基酯)，聚苯乙烯，基于环氧乙烷或环氧丙烷单体的泊洛沙姆和温度响应性聚合物，例如聚(N,N'-二乙基丙烯酰胺)，聚(N-正丙基丙烯酰胺)，聚(N-异丙基丙烯酰胺)，聚[二(乙二醇)甲基丙烯酸酯甲基醚]和某些聚乙二醇化的聚(氨基酸)例如聚(γ-(2-甲氧基乙氧基)酯基-L-谷氨酸)。在一些实施方式中，疏水性嵌段(H)是由疏水性氨基酸构成的聚(氨基酸)。在优选的实施方式中，包含聚(氨基酸)的疏水性嵌段(H)由包含芳环的氨基酸构成。在其他实施方式中，疏水性嵌段(H)是与配体例如PRR激动剂连接的聚(氨基酸)。在其他实施方式中，疏水性嵌段(H)是A-B型二嵌段共聚物。在一些实施方式中，所述二嵌段共聚物是温度响应性的，并且能够响应于温度变化而组装成粒子。在一些实施方式中，疏水性嵌段(H)包含A-B型二嵌段共聚物，其还包含与二嵌段共聚物的一个嵌段连接的配体，例如PRR激动剂。
有利的是，我们的数据表明，与基于脂族化合物或固醇衍生物的疏水性聚合物、脂质或脂肪酸相比，基于包含芳环(特别是被胺取代的那些，即芳基胺)的聚合物的疏水性嵌段(H)在制造期间更易于加工。具体来说，基于包含芳环的聚合物的疏水性嵌段(H)倾向于在大多数有机溶剂(包括DMSO、甲醇和乙醇)中具有提高的溶解性，并且与标准反相HPLC分析和纯化方法相容。因此，在优选的实施方式中，疏水性嵌段(H)包含芳环。在一些实施方式中，疏水性嵌段(H)附连到一种或多种包含芳环结构的配体。在其他实施方式中，连接到基于聚合物的疏水性嵌段的配体包含杂环芳环。在一些实施方式中，连接到基于聚合物的疏水性嵌段的配体包含进一步包含芳基胺的芳环。在一些实施方式中，连接到聚合物的疏水性配体是PRR激动剂。
所述聚合物可以包括天然存在的和合成的单体及其组合。天然生物聚合物可以包括由氨基酸构成的肽；具体实例是聚(色氨酸)。天然生物聚合物可以是化学修饰的。例如，由谷氨酸或赖氨酸残基构成的生物聚合物可以分别在γ羧基或ε氨基上被修饰。生物聚合物可以是多糖，其可以包括但不限于糖原、纤维素和葡聚糖。额外实例包括天然存在的多糖，包括藻酸盐和壳聚糖。聚合物也可以由天然存在的小分子例如乳酸或乙醇酸构成，或者可以是两者的共聚物(即PLGA)。
在一些实施方式中，疏水性嵌段(H)由阴离子(例如聚(酸性))聚合物或阳离子(例如聚(碱性))聚合物或阴离子和阳离子聚合物的组合构成。阳离子聚合物可以通过静电相互作用与带负电荷的肽结合，或者可用于复合带负电荷的核酸例如DNA和RNA。在一些实施方式中，所述聚合物在pH 7.4下为水不溶性两性离子，但在小于约6的pH下带净正电荷并且是水溶性的。在一些实施方式中，包含第一聚合物的疏水性嵌段(H)携带分别与第二聚合物上的负电荷或正电荷互补的正电荷或负电荷，并且所述第一聚合物和第二聚合物通过电荷中和形成静电复合物，使所述复合物不溶。在一些实施方式中，阳离子聚合物可以是天然存在的或合成的聚(胺)，例如聚(赖氨酸)或聚(乙烯亚胺)(PEI)。在另外的实施方式中，阳离子聚合物可以是由胺与双(丙烯酰胺)或双(丙烯酸酯)的Michael加成反应产生的聚(酰胺基胺)(PAA)或聚(β氨基酯)(PBAE)。可以在所公开的实施方式中使用的阳离子聚合物的非限制性实例包括聚(乙烯亚胺)，聚(烯丙基阴离子盐酸盐；PAH)，腐胺，尸胺，聚(赖氨酸)(PL)，聚(精氨酸)，聚(三甲基亚胺)，聚(四亚甲基亚胺)，聚(丙烯亚胺)，氨基糖苷-聚胺，双脱氧-二氨基-b-环糊精，精胺，亚精胺，尸胺，聚甲基丙烯酸(2-二甲基氨基)乙酯，聚(组氨酸)，阳离子化明胶，树枝状聚合物，壳聚糖，及其任何组合。阳离子聚合物可以含有季铵基团，例如存在于甲基化壳聚糖上的季铵基团。或者，所述聚合物可以是阴离子聚合物。在一些非限制性实例中，聚阴离子聚合物是聚(谷氨酸)。在替代实施方式中，聚阴离子聚合物是聚(天冬氨酸)。所述聚合物可以是基于聚磷酸酯的聚合物。所述聚合物可以包含天然阴离子多糖，包括例如由1-4)-连接的β-D-甘露糖醛酸酯和古洛糖醛酸构成的藻酸。所述聚合物可以包含核苷酸。其他聚阴离子聚合物可以同样适合。
在一些实施方式中，疏水性嵌段(H)是在某些pH范围内的水溶性阳离子聚合物，但是不带电荷并且在生理pH 7.4附近的pH范围内不溶于水。在一些实施方式中，疏水性嵌段(H)是包含芳族胺的聚合物，其中芳族胺的共轭酸的pKa小于7.5。在低于芳族胺的pKa的pH下，芳族胺被质子化并因此使聚合物带正电荷。由包含芳族胺的聚合物构成的疏水性嵌段(H)的非限制性实例是聚(苯丙氨酸胺)。在一些实施方式中，疏水性嵌段(H)是包含氮杂环的聚合物，其中构成杂的氮原子的pKa小于7.5。在低于构成杂环的氮原子的pKa的pH下，氮被质子化并使聚合物带正电荷。由包含具有可质子化(即碱性)氮原子的杂环的聚合物构成的疏水性嵌段(H)的非限制性实例是聚(组氨酸)。本文中，我们报道了出乎意料的发现，即由包含可质子化氮的聚合物(例如芳族胺或“芳基胺”)构成的疏水性嵌段在制造、粒子稳定性和生物活性方面提供了出乎意料的改进。
在一些实施方式中，疏水性嵌段(H)可以是基于聚(二甘醇甲基醚甲基丙烯酸酯)-(DEGMA)的聚合物。在另外的实施方式中，疏水性嵌段(H)是可以包括(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺、苯乙烯基和乙烯基部分的单体的聚合物。基于(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酰胺以及苯乙烯基和乙烯基的单体的具体实例分别包括N-2-羟丙基(甲基丙烯酰胺)(HPMA)、羟乙基(甲基丙烯酸酯)(HEMA)、苯乙烯和乙烯基吡咯烷酮(PVP)。所述聚合物可以是由以下单体构成的热响应性聚合物：N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)；N-异丙基甲基丙烯酰胺(NIPMAm)；N,N'-二乙基丙烯酰胺(DEAAm)；N-(L)-(1-羟甲基)丙基甲基丙烯酰胺(HMPMAm)；N,N'-二甲基乙基甲基丙烯酸酯(DMEMA)，甲基丙烯酸2-(2-甲氧基乙氧基)乙基酯(DEGMA)。在一些实施方式中，疏水性聚合物是包含HPMA或HPMA DEGMA单体的聚合物。在一些实施方式中，包含HPMA和DEGMA单体的聚合物是A-B型二嵌段聚合物。本文报道的出乎意料的发现是，连接到包含HPMA亲水性嵌段的A-B型二嵌段共聚物的肽抗原(A)组装成尺寸均匀的纳米粒子胶束，而与肽抗原(A)的组成无关。
疏水性嵌段(H)也可以包含基于环状单体的聚合物，所述环状单体包括环状氨基甲酸酯、环状醚、环状酰胺、环状酯、环状酸酐、环状硫化物和环状胺。
基于包含环状单体的聚合物的疏水性嵌段(H)可以通过开环聚合来制备，并且包括聚酯、聚醚、聚胺、聚碳酸酯、聚酰胺、聚氨酯和聚磷酸酯；具体实例可以包括但不限于聚己内酯和聚(乙烯亚胺)(PEI)。合适的聚合物也可以通过缩合反应制备并且包括聚酰胺、聚缩醛和聚酯。
在一些实施方式中，疏水性嵌段(H)是可以包括3至10,000个单体单元的聚合物。在优选的实施方式中，所述聚合物包括约3至300个单体单元，例如3至10个，例如3、4、5、6、7、8、9、10个单体单元；或者约10至100个单体单元，例如10、20、30、40、50、60、70、80、90、100；或者约100至200个单体单元；或者约200至300个单体单元，通常不超过1,000个单体单元。在一些实施方式中，聚合物可以包含至多1,000至10,000个单体单元。通常，至少需要五个单体才能形成足够尺寸的疏水性嵌段(H)，以促进肽抗原偶联物的粒子形成，但出乎意料的是，由具有少至3个包含芳环的单体的聚合物构成的疏水性嵌段(H)足以驱动肽抗原偶联物的粒子组装。将聚合物的长度从3个单体增加到5个单体以及从5个单体增加到10个单体，增加了促进粒子形成的力的强度，从而导致由肽抗原偶联物形成的更稳定和更大尺寸的粒子。在一些实施方式中，肽抗原偶联物包含疏水性嵌段，所述疏水性嵌段包含5-100个单体的聚合物，这导致在水性条件下形成约10-300nm直径的粒子。在另外的实施方式中，包含疏水性嵌段(H)的聚合物由约300个单体构成，并导致肽抗原偶联物组装成约20至500nm或约100-500nm之间的粒子。
在一些实施方式中，构成疏水性嵌段(H)的聚合物的平均分子量可以是约1,000至1,000,000g/mol之间。在优选的实施方式中，聚合物的平均分子量是约1,000至60,000g/mol之间。在一些实施方式中，聚合物分子量是约1,000至5,000之间，或约5,000至10,000之间，或约10,000至20,000之间，或约20,000至30,000之间，或约25,000至60,000之间。在一些实施方式中，疏水性嵌段(H)是A-B型二嵌段聚合物，其平均分子量是约10,000g/mol至约60,000g/mol之间，例如约10,000g/mol、20,000g/mol、30,000g/mol、40,000g/mol、50,000g/mol或60,000g/mol。在一些实施方式中，聚合物是A-B型二嵌段聚合物，其中A嵌段与B嵌段的分子量比率是约1:5至约5:1。在非限制性实例中，平均分子量为约60,000g/mol的A-B型二嵌段聚合物由以下构成：平均分子量为约10,000g/mol的A嵌段和平均分子量为约50,000g/mol的B嵌段；平均分子量为约20,000g/mol的A嵌段和平均分子量为约40,000g/mol的B嵌段；平均分子量为约30,000g/mol的A嵌段和平均分子量为约30,000g/mol的B嵌段；平均分子量为约40,000g/mol的A嵌段和平均分子量为约20,000g/mol的B嵌段；平均分子量为约50,000g/mol的A嵌段和平均分子量为约10,000g/mol的B嵌段。
聚合物的多分散度Mw/Mn可以在约1.0至约5.0的范围内。聚合物可以通过多种聚合技术形成。基于肽和核苷酸的聚合物可以通过固相合成制备，并且由于聚合物是在分子上确定的，因此具有1.0的多分散度。通过链增长聚合形成的聚合物将具有>1.0的多分散度。聚合物可以通过活性聚合技术或无溶液径向聚合来合成。在优选的实施方式中，通过固相肽合成法合成基于肽的生物聚合物。包含具有芳环的氨基酸例如色氨酸但在水性条件下具疏水性的基于肽(或“聚(氨基酸)”)的聚合物，与不具有芳环的肽(或“聚(氨基酸)”)相比，在通过固相合成制造时提供出乎意料的改进。因此，在优选的实施方式中，基于通过固相合成产生的肽的疏水性嵌段(H)包括包含芳环的氨基酸。在另外的实施方式中，通过可逆的加成-断裂链转移(RAFT)聚合来合成基于丙烯酰胺和丙烯酸酯的聚合物。在另外的实施方式中，通过开环聚合来合成聚(氨基酸)和聚(磷酸酯)。
在一些实施方式中，疏水性嵌段(H)可以包含进一步包含一种或多种配体例如PRR激动剂的聚合物。在一些实施方式中，基于聚合物的疏水性嵌段(H)可以包括包含至少一个可以与配体偶联或与可以与配体偶联的连接物偶联的官能团的单体。在其他实施方式中，基于聚合物的疏水性嵌段(H)可以包含与聚合物的末端和/或侧链连接的配体。
在用于治疗或预防癌症和感染性疾病的免疫原性组合物的优选实施方式中，疏水性嵌段(H)是连接到配体的聚合物。在一些实施方式中，配体包含芳环结构，例如杂环芳环，另外，其中所述配体可以任选地为疏水性配体，其促进由肽抗原偶联物在水性条件下形成的粒子的稳定性增加。在其他实施方式中，连接到基于聚合物的疏水性嵌段(H)的配体还可以进一步包含杂环芳环。在一些实施方式中，连接到基于聚合物的疏水性嵌段(H)的配体包含进一步包含芳基胺的芳环。在一些实施方式中，附连到疏水性嵌段(H)的配体是包含杂环芳环的疏水性配体，任选地其中所述疏水性配体还包含芳族胺(即Ar-NH2)。在其中疏水性嵌段(H)包含配体(所述配体包含芳族基团，任选地还包含杂环和/或芳基胺)的实施方式中，我们报道了出乎意料的发现，即这些疏水性嵌段(H)在药学上可接受的有机溶剂例如DMSO和乙醇中高度可溶，但不溶于水性缓冲剂中。
在一些实施方式中，连接到基于聚合物的疏水性嵌段(H)的配体是模式识别受体激动剂(PRRa)，例如具有佐剂性质的STING、NOD受体或TLR的激动剂。连接到聚合物的具有佐剂性质的配体可以是或源自于任何合适的佐剂化合物，例如PRR激动剂。合适的具有佐剂性质的配体包括包含小的有机分子，即分子量小于约3,000道尔顿的分子的化合物，但在一些实施方式中，佐剂可以具有小于约700道尔顿的分子量，并且在一些情况下佐剂可以具有约200道尔顿至约700道尔顿的分子量。
在用于治疗或预防癌症或感染性疾病的免疫原性组合物的优选实施方式中的疏水性嵌段(H)是连接到具有佐剂性质的配体的聚合物。具有佐剂性质的配体，例如PRR激动剂，可以通过任何合适的连接物连接到聚合物的侧链或末端基团。在一些实施方式中，构成基于聚合物的疏水性嵌段(H)的单体包含侧链，所述侧链包含可与具有佐剂性质的配体偶联或与可与具有佐剂性质的配体偶联的连接物偶联的至少一个官能团。在其中基于聚合物的疏水性嵌段(H)包含具有佐剂性质的配体的一些实施方式中，所述聚合物的所有单体都连接到具有佐剂性质的配体。在其中疏水性嵌段(H)包含具有佐剂性质的配体的其他实施方式中，聚合物中并非所有单体都连接到佐剂。
在其中疏水性嵌段(H)包含通过沿着聚合物主链分布的单体单元与具有佐剂性质的配体连接的聚合物的一些实施方式中，增加聚合物上的配体的密度导致对肽抗原(A)的免疫应答的出乎意料的改进。
在某些实施方式中，具有佐剂性质的配体例如PRR激动剂与聚合物的单体的摩尔比可以选自约1:100至1:1mol/mol(或约1摩尔％至约100摩尔％)，例如1:2.5至1:1mol/mol。
连接到基于聚合物的疏水性嵌段(H)的具有佐剂性质的配体(例如PRR激动剂)的密度可以针对特定应用根据需要进行改变。具有佐剂性质的配体，例如PRR激动剂，可以以1至100摩尔％、例如1至10摩尔％或50-100摩尔％连接到聚合物。摩尔％是指与具有佐剂性质的配体(例如PRR激动剂)连接的构成聚合物的单体的百分比。例如，10摩尔％配体(例如PRR激动剂)等于总共100个单体单元中有10个单体单元连接到所述配体。其余90个可以是未连接到配体的形成大分子的单体单元。
连接到基于聚合物的疏水性嵌段(H)的配体(例如具有佐剂性质的配体)的密度应进行选择，以确保肽抗原偶联物(i)可溶于药学上可接受的有机溶剂例如DMSO中；(ii)可以在生理温度和pH下在水性条件中形成稳定的纳米粒子；和/或(iii)能够在受试者中诱导免疫应答，特别是T细胞应答。
连接到聚合物的配体(例如PRR激动剂)的最佳密度取决于聚合物组成、聚合物长度以及配体的组成。当配体是具有低水溶性的疏水性/两亲性分子，例如基于咪唑并喹啉的Toll样受体-7和-8激动剂(TLR-7/8a)，并且单独的聚合物具有水溶性(即未连接到配体的聚合物具有水溶性)时，当聚合物由约5-30个单体单元构成时，配体通常以约20-100摩尔％的密度连接到聚合物；当聚合物由30-100个单体单元构成时，配体通常以10-50摩尔％的密度连接到聚合物；或者当聚合物由100-300个单体单元构成时，配体通常以5-20摩尔％的密度连接到聚合物。通常，具有佐剂性质的配体的摩尔％对于较短的聚合物来说较高，而对于较长的聚合物来说较低。
附连到亲水性或温度响应性聚合物的具有佐剂性质的配体(例如PRRa)的最佳密度为1至25％，所述聚合物大于10,000g/mol并且基于选自以下的共聚单体：N-2-羟丙基(甲基丙烯酰胺)(HPMA)，羟乙基(甲基丙烯酸酯)(HEMA)，苯乙烯，乙烯基吡咯烷酮(PVP)，N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)，N-异丙基甲基丙烯酰胺(NIPMAm)，N,N'-二乙基丙烯酰胺(DEAAm)，N-(L)-(1-羟甲基)丙基甲基丙烯酰胺(HMPMAm)，N,N'-二甲基乙基甲基丙烯酸酯(DMEMA)，甲基丙烯酸2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(DEGMA)或被取代的聚(磷酸酯)，例如，附连到聚合物的佐剂的密度可以是约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％或约25％。
在一些实施方式中，疏水性嵌段(H)是两亲性的A-B型二嵌段共聚物，其中一个嵌段是疏水性的并且另一个嵌段是亲水性的。在一些实施方式中，当疏水性嵌段(H)是两亲性的A-B型二嵌段共聚物并且配体是疏水性的，例如咪唑并喹啉TLR-7/8激动剂时，所述配体优选以约1至50摩尔％、通常约1至20摩尔％之间的密度连接到疏水性嵌段。在一些实施方式中，当疏水性嵌段(H)是两亲性的A-B型二嵌段共聚物并且配体是亲水性的时，所述配体优选以约1至20摩尔％之间的密度连接到亲水性嵌段，或者在亲水性嵌段的亲水性末端上，因此A-B型二嵌段共聚物相对于配体是半遥爪的。在一个非限制性实例中，疏水性嵌段(H)包含温度响应性A-B型二嵌段共聚物，其包含HPMA嵌段和DEGMA嵌段，并且咪唑并喹啉TLR-7/8激动剂以约1至5摩尔％之间的密度连接到DEGMA嵌段。在另一个非限制性实例中，疏水性嵌段(H)包含A-B型二嵌段聚合物，其包含HPMA共聚物疏水性嵌段和HPMA均聚物亲水性嵌段，并且咪唑并喹啉TLR-7/8激动剂以约20摩尔％的密度连接到HPMA共聚物疏水性嵌段。在一些实施方式中，疏水性嵌段是三嵌段共聚物例如A-B-A或其他多嵌段共聚物组合物。
本文报道的出乎意料的发现是，与包含连接到具有佐剂性质的配体的HPMA亲水性嵌段的A-B型二嵌段共聚物连接的肽抗原(A)组装成尺寸均匀的纳米粒子胶束，而与肽抗原(A)的组成无关，并且这种纳米粒子胶束形成的可靠性提高与T细胞免疫的量值增加相关。在一个非限制性实例中，肽抗原(A)通过三唑连接物(Lys(N3)-DBCO)连接到由HPMA共聚物疏水性嵌段(即p[(HPMA)-co-(MA-b-Ala-2B)])和HPMA均聚物亲水性嵌段(即p(HPMA))构成的二嵌段共聚物，形成肽抗原偶联物p{[(HPMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO-(Lys(N3))-A，其中2B是TLR-7/8a，也称为化合物1。在另外的实施方式中，肽抗原(A)通过三唑连接物(Lys(N3)-DBCO)连接到由DEGMA共聚物疏水性嵌段(即p[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2B)])和HPMA均聚物亲水性嵌段(即p(HPMA))构成的二嵌段共聚物，形成肽抗原偶联物p{[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO-(Lys(N3))-A，其中2B是TLR-7/8a，也称为化合物1。在其他实施方式中，肽抗原(A)通过三唑连接物(Lys(N3)-DBCO)连接到由与具有佐剂性质的配体连接的DEGMA均聚物(即2BXy-p[(DEGMA))和HPMA均聚物亲水性嵌段(即p(HPMA))构成的二嵌段共聚物，形成肽抗原偶联物2BXy-p{[(DEGMA)-co-(MA-b-Ala-2B)]-b-p(HPMA)}-DBCO-(Lys(N3))-A，其中肽抗原(A)和2BXy(TLR-7/8a也称为化合物2)连接在聚合物相对两个末端的单个位点上，这使得聚合物是杂遥爪的。
在几个实施方式中，疏水性嵌段(H)是基于聚(氨基酸)的聚合物，其由谷氨酸或天冬氨酸与芳族和/或疏水性氨基酸例如苯丙氨酸、氨基苯丙氨酸胺(或“苯丙氨酸胺”)、色氨酸、酪氨酸、谷氨酸苄酯、组氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸和缬氨酸的共聚单体构成，并且一种或多种具有佐剂性质的配体例如PRRa通过谷氨酸的γ羧酸或天冬氨酸的β羧酸附连到聚合物。在优选的实施方式中，疏水性嵌段(H)是由谷氨酸和色氨酸的共聚单体构成的基于聚(氨基酸)的聚合物，其中一种或多种具有佐剂性质的配体例如PRRa通过γ羧酸连接到谷氨酸残基。在另外的实施方式中，疏水性嵌段(H)是由赖氨酸和芳族和/或疏水性氨基酸例如苯丙氨酸、氨基苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、谷氨酸苄酯、亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸和缬氨酸的共聚单体构成的基于聚(氨基酸)的聚合物，其中一种或多种具有佐剂性质的配体例如PRRa通过赖氨酸的ε胺附连到聚合物。在优选的实施方式中，疏水性嵌段(H)是由赖氨酸和色氨酸的共聚单体构成的基于聚(氨基酸)的聚合物，其中一种或多种具有佐剂性质的配体例如PRRa通过ε胺连接到赖氨酸。在其中疏水性嵌段(H)是与一种或多种具有佐剂性质的配体例如PRRa连接的聚(氨基酸)共聚物的优选的实施方式中，所述聚合物的长度是5-30个氨基酸，并且所述佐剂以20至100摩尔％，例如30％、50％、60％、80％和100摩尔％的密度附连。在另外的实施方式中，配体仅附连到聚(氨基酸)聚合物的单个末端，即所述聚合物相对于配体是半遥爪的。
在本文中，我们报道了出乎意料的发现，即与主要由脂族氨基酸或脂族配体构成的聚(氨基酸)相比，由还包含芳族基团例如芳族氨基酸(例如苯丙氨酸、氨基苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸、谷氨酸苄酯)的基于聚(氨基酸)的共聚物和/或与聚合物连接的芳族配体(例如咪唑并喹啉)构成的疏水性嵌段(H)，通过改进的有机溶剂溶解性以及改进的肽抗原偶联物的粒子稳定性和生物活性，导致出乎意料的可制造性的改进。另一个出乎意料的发现是，包含含有1-甲基色氨酸的疏水性嵌段(H)的肽抗原偶联物导致免疫应答的量值增加，这可能是由于1-甲基色氨酸抑制吲哚胺2,3-二加氧酶的能力。因此，在优选的实施方式中，由聚(氨基酸)或其他类型的聚合物构成的疏水性嵌段(H)包括一种或多种芳族氨基酸和/或包含芳族基团的配体。
在另外的实施方式中，疏水性嵌段(H)是完全由谷氨酸、天冬氨酸或带有羧酸的非天然氨基酸残基构成的基于聚(氨基酸)的聚合物，其中具有佐剂性质的配体连接到所有的谷氨酸、天冬氨酸或非天然氨基酸残基，即具有佐剂性质的配体以100摩尔％的密度附连。在另外的实施方式中，疏水性嵌段(H)是完全由赖氨酸或带有游离胺的非天然氨基酸构成的基于聚(氨基酸)的聚合物，并且具有佐剂性质的配体与所有的赖氨酸或非天然氨基酸残基连接，即佐剂以100摩尔％的密度附连。在另外的实施方式中，包括聚乙二醇化的共聚单体，例如γ-(2-甲氧基乙氧基)酯基-L-谷氨酸)，以使共聚物具有温度响应性。在其他实施方式中，可以将温度响应性聚合物接枝到聚(氨基酸)的悬垂侧链上以形成接枝共聚物。在另外的实施方式中，可将温度响应性聚合物连接到聚(氨基酸)聚合物的末端以形成温度响应性二嵌段聚合物。在另外的实施方式中，疏水性的第二聚合物可以与聚(氨基酸)聚合物连接，所述聚(氨基酸)聚合物通过悬垂侧基连接到具有佐剂性质的配体以形成接枝共聚物，或连接到聚(氨基酸)的末端以形成二嵌段共聚物。
在一些实施方式中，疏水性嵌段(H)是连接到疏水性配体(“配体”)例如疏水性佐剂的基于聚(氨基酸)的聚合物，并具有下式：
Figure BDA0002911415990000981
在式I中，R2通常选自氢、羟基或胺中的一者。在一些实施方式中，R2通过任何合适的连接物分子连接到佐剂或另一种聚合物。整数y3通常是1至6，例如1、2、3、4、5或6。亚甲基单元的数目y4通常是0至6，例如0、1、2、3、4、5或6。单体重复数目由k指示，并且通常在3至300之间。配体通过连接物X连接到聚(氨基酸)的主链上。在式I的优选实施方式中，配体是疏水性配体(“配体”)，例如疏水性佐剂。在一些实施方式中，连接物X可以连接到与配体连接的第二聚合物。在一些实施方式中，单体k可以各自连接到相同的配体或连接到两个或更多个不同的配体。
式I的聚(氨基酸)的N端可以通过任何合适的手段通过连接物(L)连接到肽抗原(A)。在一些实施方式中，式I的聚(氨基酸)的N端直接连接到肽抗原(A)的C端或通过酰胺键连接到B2延长部的C端。在其他实施方式中，式I的聚(氨基酸)的N端连接到连接物前体(X2)，所述连接物前体(X2)与直接地或通过延长部(B1或B2)连接到肽抗原(A)的连接物前体(X1)反应。在一些实施方式中，含环辛炔的连接物前体(X2)附连到式I的聚(氨基酸)的N端，并连接到肽抗原片段的含叠氮基的连接物前体(X1)。
在一些实施方式中，式I中的整数y3等于1并且式I简化为式I(a)。
Figure BDA0002911415990000991
在一些实施方式中，整数y4等于0，并且式I(a)进一步简化为式I(b)。
Figure BDA0002911415990000992
在优选的实施方式中，将聚(氨基酸)主链接合到配体的连接物X是用官能团(FG)封端的烷基链。式I(b)因此可以被详细化以得到式I(c)。
Figure BDA0002911415990001001
在式I(c)中，整数y5通常是0至6，例如0、1、2、3、4、5或6。式I(c)中包括的官能团(FG)通常选自羧酸、胺、硫醇、醛、酮、肼、叠氮化物或炔烃。在优选的实施方式中，FG将配体直接地或通过连接物连接到聚(氨基酸)主链。在一些实施方式中，FG可以连接到第二聚合物。
为清楚起见，本文公开的对式I的任何提及是指式I的聚(氨基酸)的任何可能的实施方式，包括式I、式I(a)、式I(b)或式I(c)，除非另有明确说明。
任选地，疏水性嵌段(H)可以是由四种不同类别的共聚单体即疏水性单体(l)、间隔物单体(m)、用于电荷补偿的带电荷的氨基酸单体(n)和用于配体附连的含官能团的单体(o)构成的基于聚(氨基酸)的聚合物。出于不同的原因，不同的共聚单体可以包括在疏水性嵌段(H)中。选择包含含芳族氨基酸的疏水性单体(l)以增加主链的疏水特性。可以选择间隔物单体(m)，例如甘氨酸、丝氨酸和丙氨酸，以增加通过单体(o)附连的配体的单体之间的间隔。选择带电荷的共聚单体(n)以平衡带电荷的配体，使得疏水性嵌段(H)的总电荷为零。含官能团的单体(o)用于配体附连。
疏水性嵌段(H)可以是基于聚(氨基酸)的聚合物，其包含一种或多种疏水性单体(l)、任选地一种或多种间隔物单体(m)、任选地一种或多种带电荷的氨基酸单体(n)和任选地一种或多种含配体的单体(o)。所述疏水性单体、间隔物单体、带电荷的氨基酸单体和含配体的单体可以以任何组合和任何顺序组装。
在一些实施方式中，疏水性嵌段(H)是具有下式的基于聚(氨基酸)的聚合物：
Figure BDA0002911415990001011
式II的基于聚(氨基酸)的聚合物通常包含单体l和任选的单体m、n和o。R3通常选自氢、羟基或胺中的一者。在一些实施方式中，R3是配体，例如具有佐剂性质的配体，或通过任何合适的连接物分子连接到疏水性嵌段(H)的另一种聚合物。构成每个单体的侧基的数目由以y6、y8、y10和y12表示的整数指示，并且通常是1至6，例如1、2、3、4、5或6。由y7、y9、y11和y13指示的亚甲基单元的数目通常是0至6，例如0、1、2、3、4、5或6。式II的聚(氨基酸)的N端胺通常连接到连接物前体X2或者可以直接地或经由延长部(B1或B2)连接到肽抗原(A)。在典型的实施方式中，式II的基于聚(氨基酸)的聚合物包含选自任何天然或非天然氨基酸的单体l，其中R4选自低级烷基或芳族基团并使聚合物主链具有疏水特性。在一些实施方式中，式II中包括的R4可以选自
Figure BDA0002911415990001012
Figure BDA0002911415990001013
Figure BDA0002911415990001021
Figure BDA0002911415990001031
Figure BDA0002911415990001032
其中R4的X是任何合适的连接物。
在一些实施方式中，式II的基于聚(氨基酸)的聚合物包含任选的共聚单体m，其选自任何天然或非天然的氨基酸，例如PEG氨基酸间隔物(例如，式II的m是-NH-(CH2-CH2-O)y14-(CH2)y15-(CO)-，其中y14是通常在1至24之间的整数并且y15是通常在1至3之间的整数)或具有小取代基的氨基酸，其中，例如，R5选自氢、低级烷基或包含羟基的低级烷基并且被提供以增加聚合物主链的间距或柔性。在一些实施方式中，式II中包括的R5可以选自-H、-CH3、
Figure BDA0002911415990001033
在一些实施方式中，式II的基于聚(氨基酸)的聚合物包含任选的共聚单体n，其选自任何天然或非天然氨基酸，其中R6选自任何包含永久地或在特定pH下带有电荷的官能团的基团。在一些实施方式中，式II中包括的R6可以选自
Figure BDA0002911415990001041
在一些实施方式中，式II的基于聚(氨基酸)的聚合物包含任选的共聚单体o，其选自任何天然或非天然氨基酸，其中配体通过任何合适的连接物X连接到单体o。配体可以是具有佐剂性质的配体。与式II的聚(氨基酸)连接的配体在性质上可以是疏水性的、亲水性的、两亲性的、带电荷的或中性的。包含单体o的式II的基于聚(氨基酸)的聚合物还可以包含单体单元l、m和n，其补偿附连到单体o的配体的性质。
在式II的基于聚(氨基酸)的聚合物中，单体重复数目由l、m、n和o表示，其中l、m、n和o的总和通常是3至300之间的任何整数。不同类型的单体l、m、n或o中的每一者可以是相同或不同的。由“l”表示的单体使式II的基于聚(氨基酸)的聚合物具有疏水特性，即，使所述聚合物成为水不溶性疏水性嵌段(H)。疏水性单体l可以是相同或不同的，并且通常包含芳环。在优选的实施方式中，疏水性单体l包含杂环和/或胺取代的芳环。由“m”表示的任选的共聚单体可以用于增加构成聚合物主链的不同单体的柔性或间距。由“n”表示的任选的共聚单体包含带电荷的官能团。由“o”表示的任选的共聚单体用于附连配体例如PRR激动剂。在一些实施方式中，通过任何合适的连接物连接到单体o的配体是PRR激动剂。在一些实施方式中，单体o连接到带有正电荷或负电荷的配体并且与相反电荷的单体n相邻。在一些实施方式中，将带电荷的共聚单体n置于与共聚单体o相邻，所述共聚单体o包含与构成共聚单体n的官能团相反电荷的官能团，并且所述相反的电荷产生零净电荷，因此单体n用于中和由附连到单体o的配体所携带的电荷。
构成式II的基于聚(氨基酸)的聚合物的单体l、m、n和o的百分比取决于具体的应用。在一些实施方式中，式II的基于聚(氨基酸)的聚合物完全由单体l构成。在其他实施方式中，式II的基于聚(氨基酸)的聚合物由共聚单体l和o构成，例如5至95摩尔％的单体l和约95至5摩尔％的单体o。在一些实施方式中，式II的基于聚(氨基酸)的聚合物包含共聚单体l和m，其中m提供疏水性单体l之间的间隔，即距离，并且可以降低聚合物刚性。在其他实施方式中，式II的基于聚(氨基酸)的聚合物包含单体l、m和o，其中单体m在包含单体l和o的大体积取代基之间提供间隔。在其他实施方式中，式II的基于聚(氨基酸)的聚合物包含单体l和o以及任选地单体m和n，其中单体n用于调节聚合物主链的电荷。在某些实施方式中，式II的基于聚(氨基酸)的聚合物完全由单体m和o构成。在其他实施方式中，式II的基于聚(氨基酸)的聚合物完全由单体m、n和o构成，或仅由n和o构成。在其他实施方式中，式II的基于聚(氨基酸)的聚合物包含单体l、m、n和o。
其中式II的基于聚(氨基酸)的聚合物包含具有佐剂性质的配体，经由任何合适的连接物连接到具有佐剂性质的配体的由单体o表示的构成所述聚合物的单体百分比通常为10至60％，例如，长度为20个氨基酸的聚合物的2至12个氨基酸是单体o。在式II的聚(氨基酸)聚合物的一些实施方式中，l是主要的单体单元。在另外的实施方式中，式II的基于聚(氨基酸)的聚合物完全由l单体构成，即所有单体都是l单体，任选地其中佐剂直接地或经由第二聚合物或通过任何合适的连接物分子间接地附连到聚(氨基酸)的末端。
在式(II)的基于聚(氨基酸)的疏水性嵌段的一些实施方式中，整数y6、y8、y10和y12等于1并且式II简化为：
Figure BDA0002911415990001061
在一些实施方式中，整数y7、y9、y11和y13等于0并且式II(a)进一步简化为式II(b)。
Figure BDA0002911415990001062
在优选的实施方式中，连接物X由具有官能团(FG)的烷基链构成。
式II(b)因此可以被详细化以得到式II(c)。
Figure BDA0002911415990001063
在式II(c)中，整数y16通常是0至6，例如0、1、2、3、4、5或6。式II(c)中包括的官能团(FG)通常选自羧酸、胺、硫醇、醛、酮、肼、叠氮化物或炔烃。在优选的实施方式中，FG将配体直接地或通过连接物连接到聚(氨基酸)主链。在一些实施方式中，FG可以连接到第二聚合物。
为清楚起见，本文公开的对式II的任何提及是指式II的聚(氨基酸)的任何可能的实施方式，包括式II、式II(a)、式II(b)和/或式II(c)，除非另有明确说明。
具有佐剂性质的配体可以连接到本公开的任何疏水性嵌段(H)。在某些实施方式中，具有佐剂性质的配体连接到式II的聚合物。具有佐剂性质的配体可以通过o单体上的悬垂官能团(FG)；在聚合物的末端；或通过接枝到悬垂官能团(FG)或聚合物末端的另一种分子或聚合物间接地，连接到式II的基于聚(氨基酸)的聚合物。在优选的实施方式中，单体o的官能团(FG)将具有佐剂性质的配体或其他配体分子通过共价键连接到聚(氨基酸)主链。在一些实施方式中，构成式II的单体o的FG可以连接到第二聚合物。式II中包括的FG可以选自羧酸、醛、酮、胺、肼、硫醇、叠氮化物或炔烃，或者可以用于将配体或另一种聚合物连接到聚合物主链的任何合适的官能团。
在优选的实施方式中，式II的聚(氨基酸)的N端直接地或通过延长部(B1或B2)，通过连接物前体X1和X2的反应通过连接物(L)连接到肽抗原(A)。在一些实施方式中，式II的聚(氨基酸)的N端直接地(即不存在连接物(L))连接到肽抗原(A)的C端或通过酰胺键连接到B2延长部的C端。在其他实施方式中，式II的聚(氨基酸)的N端连接到含环辛炔基团(例如DBCO)的连接物前体(X2)，所述连接物前体(X2)与直接地或通过延长部(B1或B2)连接到肽抗原(A)的含叠氮基的连接物前体(X1)反应。
式I或式II的聚(氨基酸)是疏水性嵌段(H)，其可以通过N端胺、C端羧酸或任选地通过沿聚(氨基酸)主链分布的侧链通过连接物(L)，直接地或通过延长部(B1或B2)间接地连接到肽抗原(A)。
在一些实施方式中，式I或式II的聚(氨基酸)是疏水性嵌段(H)，其在N端处经由连接物(L)连接到C端延长部(B2)，所述延长部(B2)连接到肽抗原(A)，得到式A-B2-L-H的肽抗原偶联物。
在一些其他实施方式中，式I或式II的聚(氨基酸)是疏水性嵌段(H)，其在N端处经由连接物(L)连接，所述连接物(L)连接到C端延长部(B2)，所述延长部(B2)连接到肽抗原(A)的C端，所述肽抗原(A)在N端处连接到N端延长部(B1)，所述延长部(B1)连接到带电荷部分(C)，得到式C-B1-A-B2-L-H的肽抗原偶联物。
在一些其他实施方式中，带电荷部分(C)可以直接地连接到由式I或式II的聚(氨基酸)构成的疏水性嵌段(H)，或经由直接地或经由延长部连接到肽抗原(A)的连接物(L)连接到所述疏水性嵌段(H)。在此，对于A-B2-L(C)-H或A-B2-L-H(C)，括号符号旨在指示C直接地连接到L或H，其中L和H也连接在一起。
本文公开的出乎意料的发现是，通过增加酰胺与末端氨基酸的N端胺之间的亚甲基单元的数目，可以增加用于将X2连接物前体附连到基于肽的疏水性嵌段的N端位置的反应速率。重要的是，这些发现不限于疏水性嵌段(H)的反应性，并且表明基于氨基酸的连接物应尽可能包含两个或更多个亚甲基单元。因此，在优选的实施方式中，式I和II的疏水性嵌段的N端氨基酸包含两个或更多个，通常在2至7个之间，例如1、2、3、4、5、6、7个亚甲基单元。为清楚起见，具有2个亚甲基单元的氨基酸是β-丙氨酸，并且具有5个亚甲基单元的氨基酸是氨基-己酸。在优选的实施方式中，式I和II的基于肽的疏水性嵌段的N端氨基酸是氨基-己酸。在其他实施方式中，式I和II的基于肽的疏水性嵌段的N端氨基酸是β-丙氨酸。
在一些实施方式中，配体附连到肽抗原偶联物的疏水性嵌段(H)。在优选的实施方式中，附连到疏水性嵌段(H)的配体是包含芳环的疏水性配体。在一些实施方式中，附连到疏水性嵌段(H)的配体是包含杂环芳环的疏水性配体，任选地其中所述疏水性配体还包含芳族胺(即Ar-NH2)。在这样的实施方式中，任选地包含杂环和/或芳基胺的疏水性芳环提供了出乎意料的特性，即包含这些结构的肽抗原偶联物高度可溶于药学上可接受的有机溶剂例如DMSO和乙醇中，但不溶于水性缓冲剂。
在优选的实施方式中，疏水性嵌段(H)包含聚(氨基酸)，其中疏水性配体附连到沿聚(氨基酸)的主链分布的侧基。在一些实施方式中，疏水性配体包含芳环，任选地还包含杂环或芳基胺。
在一些实施方式中，附连到疏水性嵌段的配体是免疫调节剂或其他具有佐剂性质的配体，例如PRR激动剂。佐剂可以是疏水性的或亲水性的。在优选的实施方式中，配体包含芳族杂环。
在几个实施方式中，具有佐剂性质的配体可以是模式识别受体(PRR)激动剂。模式识别受体(PRR)激动剂的非限制性实例包括TLR-1/2/6激动剂(例如脂肽和糖脂，例如Pam2cys或Pam3cys脂肽)；TLR-3激动剂(例如dsRNA，例如PolyI:C，和核苷酸碱基类似物)；TLR-4激动剂(例如脂多糖(LPS)衍生物，例如单磷酰脂质A(MPL)和基于嘧啶并吲哚的小分子)；TLR5激动剂(例如鞭毛蛋白)；TLR-7和-8激动剂(例如ssRNA和核苷酸碱基类似物，包括咪唑并喹啉、羟基-腺嘌呤、苯并萘啶和洛索立滨的衍生物)；TLR-9激动剂(例如未甲基化的CpG)；干扰素基因刺激物(STING)激动剂(例如环状二核苷酸，例如环状二腺苷酸单磷酸酯)；C型凝集素受体(CLR)激动剂(例如可以是直链或支链的各种单糖、二糖、三糖和聚合糖，例如甘露糖、Lewis-X三糖等)；RIG-I样受体(RLR)激动剂；NOD样受体(NLR)激动剂(例如来自于细菌的肽基葡聚糖和结构基序，例如内消旋-二氨基庚二酸和胞壁酰二肽)；及其组合。在几个实施方式中，模式识别受体激动剂可以是TLR激动剂，例如基于咪唑并喹啉的TLR-7/8激动剂。例如，具有佐剂性质的配体可以是被FDA批准供人类使用的咪喹莫特(R837)或雷西莫德(R848)。
在几个实施方式中，具有佐剂性质的配体可以是TLR-7激动剂、TLR-8激动剂和/或TLR-7/8激动剂。已知众多这样的激动剂，包括许多不同的咪唑并喹啉化合物。
咪唑并喹啉可用于本文公开的方法中。咪唑并喹啉是一种合成的免疫调节药物，其通过在抗原呈递细胞(例如树突状细胞)上结合Toll样受体7和8(TLR-7/TLR-8)来发挥作用，在结构上模拟这些受体的天然配体、病毒单链RNA。咪唑并喹啉是包含稠合喹啉-咪唑骨架的杂环化合物。本公开还涵盖了其衍生物、盐(包括水合物、溶剂化物和N-氧化物)和前药。特定的咪唑并喹啉化合物是本领域已知的，参见例如美国专利第6,518,265号；和美国专利第4,689,338号。在一些非限制性实施方式中，咪唑并喹啉化合物不是咪喹莫特和/或不是雷西莫德。
在一些实施方式中，具有佐剂性质的配体可以是具有与五元含氮杂环稠合的2-氨基吡啶的小分子，包括但不限于咪唑并喹啉胺和被取代的咪唑并喹啉胺，例如酰胺取代的咪唑并喹啉胺，磺酰胺取代的咪唑并喹啉胺，脲取代的咪唑并喹啉胺，芳基醚取代的咪唑并喹啉胺，杂环醚取代的咪唑并喹啉胺，酰胺基醚取代的咪唑并喹啉胺，磺酰胺基醚取代的咪唑并喹啉胺，脲取代的咪唑并喹啉醚，硫醚取代的咪唑并喹啉胺，羟胺取代的咪唑并喹啉胺，肟取代的咪唑并喹啉胺，6-、7-、8-或9-芳基、杂芳基、芳氧基或芳基亚烷氧基取代的咪唑并喹啉胺，和咪唑并喹啉二胺；四氢咪唑并喹啉胺，包括但不限于酰胺取代的四氢咪唑并喹啉胺，磺酰胺取代的四氢咪唑并喹啉胺，脲取代的四氢咪唑并喹啉胺，芳基醚取代的四氢咪唑并喹啉胺，杂环醚取代的四氢咪唑并喹啉胺，酰胺基醚取代的四氢咪唑并喹啉胺，磺酰胺基醚取代的四氢咪唑并喹啉胺，脲取代的四氢咪唑并喹啉醚，硫醚取代的四氢咪唑并喹啉胺，羟胺取代的四氢咪唑并喹啉胺，肟取代的四氢咪唑并喹啉胺和四氢咪唑并喹啉二胺；咪唑并吡啶胺，包括但不限于酰胺取代的咪唑并吡啶胺，磺酰胺取代的咪唑并吡啶胺，脲取代的咪唑并吡啶胺，芳基醚取代的咪唑并吡啶胺，杂环醚取代的咪唑并吡啶胺，酰胺基醚取代的咪唑并吡啶胺，磺酰胺基醚取代的咪唑并吡啶胺，脲取代的咪唑并吡啶醚，和硫醚取代的咪唑并吡啶胺；1,2-桥接的咪唑并喹啉胺；6,7-稠合的环烷基咪唑并吡啶胺；咪唑并萘啶胺；四氢咪唑并萘啶胺；
Figure BDA0002911415990001112
唑并喹啉胺；噻唑并喹啉胺；
Figure BDA0002911415990001113
唑并吡啶胺；噻唑并吡啶胺；
Figure BDA0002911415990001114
唑并萘啶胺；噻唑并萘啶胺；吡唑并吡啶胺；吡唑并喹啉胺；四氢吡唑并喹啉胺；吡唑并萘啶胺；四氢吡唑并萘啶胺；以及与吡啶胺、喹啉胺、四氢喹啉胺、萘啶胺或四氢萘啶胺稠合的1H-咪唑二聚体。
在一些实施方式中，具有佐剂性质的配体是具有下式的咪唑并喹啉：
Figure BDA0002911415990001111
在式III中，R7选自氢、任选取代的低级烷基或任选取代的低级醚中的一者；并且R8选自任选取代的芳基胺或任选取代的低级烷基胺中的一者。R8可以任选地被取代成与聚合物连接的连接物。出乎意料的发现是，在其中R8选自低级烷基胺的一些化合物中，虽然所述化合物不如R8选自芳基胺的化合物有效，但应答质量得到提高。因此，式III的中等效力佐剂导致质量更好的应答。注意：式III的佐剂是一种类型的配体，并且可以被称为式III的佐剂或具有佐剂性质的配体。
在一些实施方式中，式III中包括的R7可以选自氢、
Figure BDA0002911415990001121
Figure BDA0002911415990001122
在一些实施方式中，R8可以选自
Figure BDA0002911415990001123
Figure BDA0002911415990001124
其中e指示亚甲基单元的数目并且是1至4的整数。
在一些实施方式中，R8可以是
Figure BDA0002911415990001125
在一些实施方式中，R8可以是
Figure BDA0002911415990001126
在一些实施方式中，R7可以是
Figure BDA0002911415990001127
并且R8可以是
Figure BDA0002911415990001128
其中
Figure BDA0002911415990001129
并且
Figure BDA00029114159900011210
的式III的佐剂被称为化合物1，而其中
Figure BDA00029114159900011211
并且
Figure BDA00029114159900011212
的式III的佐剂被称为化合物2。
由连接到式III的佐剂的式I的聚(氨基酸)构成的疏水性嵌段(H)的非限制性实例包括：
Figure BDA0002911415990001131
其中k在3-300之间。例如，当k＝5时，所述肽由连接到式III的佐剂的5个氨基酸构成。在一些实施方式中，由连接到式III的佐剂的式I的聚(氨基酸)构成的疏水性嵌段(H)可以直接地或经由连接物(L)和/或延长部(B1或B2)间接地连接到肽抗原(A)，所述肽抗原(A)通过任何合适的手段任选地连接到带电荷部分(C)以形成肽抗原偶联物。在一些实施方式中，连接到式III的佐剂的式I的聚(氨基酸)的N端直接地连接到肽抗原(A)的C端或者通过酰胺键连接到B2延长部的C端。在其他实施方式中，与式III的佐剂连接的式I的聚(氨基酸)的N端连接到带有可点击基团例如炔烃或DBCO的连接物前体X2或硫醇反应性连接物前体X2例如马来酰亚胺，所述连接物前体X2与直接地或通过延长部(B1或B2)连接到肽抗原(A)的连接物前体X1反应。在优选的实施方式中，带有DBCO分子的连接物前体X2附连到与式III的佐剂连接的式I的聚(氨基酸)的N端，并用于与带有叠氮化物的连接物前体X1反应，所述连接物前体X1直接地或通过延长部(B1或B2)连接到肽抗原(A)。
由与式III的佐剂连接的式II的聚(氨基酸)构成的疏水性嵌段(H)的非限制性实例包括：
Figure BDA0002911415990001141
例如：
Figure BDA0002911415990001142
其中共聚单体l通常是3-300之间的整数，并且任选的共聚单体o通常是3-300之间的整数个氨基酸残基，其中l和o的总和通常在约3-300之间。或者，o为0，并且聚合物完全由l构成，即，所述聚合物是未连接到佐剂的聚(色氨酸)聚合物。在一些实施方式中，与式III的佐剂连接的式II的聚(氨基酸)的N端通过任何合适的手段直接地或通过连接物(L)和/或延长部(B1或B2)间接地连接到肽抗原(A)。在一些实施方式中，与式III的佐剂连接的式II的聚(氨基酸)的N端直接地连接到肽抗原(A)的C端或通过酰胺键连接到B2延长部的C端。在其他实施方式中，与式III的佐剂连接的式II的聚(氨基酸)的N端连接到带有可点击基团(例如DBCO)的连接物前体X2或硫醇反应性连接物前体X2(例如马来酰亚胺)，所述连接物前体X2与直接地或通过延长部(B1或B2)连接到肽抗原(A)的连接物前体X1反应。在优选的实施方式中，DBCO连接物前体X2附连到与式III的佐剂连接的式II的聚(氨基酸)的N端，并用于与带有叠氮化物官能团的连接物前体X1反应。
构成疏水性嵌段(H)的聚合物的长度以及附连的配体(例如，具有佐剂性质的配体，例如PRR激动剂)的数目和效力是影响肽抗原偶联物的活性的潜在重要参数。由包含疏水性氨基酸和/或与配体连接的氨基酸的聚(氨基酸)构成的疏水性嵌段(H)，应具有足够的长度，以允许在与任何肽抗原(A)(包括高亲水性肽抗原(A))连接时形成粒子，其将抵抗基于聚(氨基酸)的疏水性嵌段(H)驱动粒子组装的趋势。当与某些肽抗原(A)，特别是具有高电荷密度的亲水性肽抗原(A)连接时，长度不足的聚(氨基酸)例如可能无法提供足够的疏水性表面积以促进在水性条件下形成粒子。因此，如本文所公开的，式I或式II的聚(氨基酸)的长度应大于3个氨基酸，优选长度为5-30个氨基酸，例如长度为5、6、7、8、9、10、20或30个氨基酸。虽然带有多个疏水性氨基酸或疏水性配体的长度大于30个氨基酸，例如长度为约30、40或50个氨基酸的聚(氨基酸)可以被认为难以通过固相肽合成来生产，但本文报道的出乎意料的发现是，包含胺、芳族基团和/或芳基胺的聚(氨基酸)与没有这些基团的序列相比，导致改进的可制造性。
在一个非限制性实例中，肽抗原(A)连接到疏水性嵌段(H)，并且可另外包含任选的延长部(B1和/或B2)和任选的连接物(L)，以得到式IV的肽抗原偶联物，其中[]表示所述基团是任选的：
[B1]-A-[B2]-[L]-H或H-[L]-[B1]-A-[B2]
式IV
式IV的肽抗原(A)由整数个氨基酸n构成，其中n通常在7-35之间，例如7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个氨基酸，并且疏水性嵌段(H)通常是与式III的佐剂连接的式I或II的聚(氨基酸)。
在此作为实例示出式IV的肽抗原偶联物的一个非限制性实例，所述肽抗原偶联物由以下构成：肽抗原(A)，其任选地在N端处连接到组织蛋白酶可切割的四肽延长部(B1＝Lys-Pro-Leu-Arg SEQ ID NO:16)并且在C端处连接到组合的免疫蛋白酶体和组织蛋白酶可切割的六肽延长部(B2＝Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg SEQ ID NO:4)，所述六肽延长部连接到三唑连接物(L)，所述三唑连接物(L)连接到疏水性嵌段(H)，所述疏水性嵌段(H)由连接到式III的佐剂的式I的聚(氨基酸)构成：
Figure BDA0002911415990001161
带电荷部分(C)
肽抗原(A)表现出广泛范围的物理和化学性质，其可以影响由肽抗原偶联物形成的粒子的尺寸和稳定性。在不补偿不同肽抗原(A)可能具有的物理和化学性质范围的情况下，肽抗原偶联物可能表现出一系列流体动力学行为，包括在水性条件下以纳米级超分子缔合体(例如胶束)、亚微米或微米级粒子或聚集体形式存在。为了允许更好地控制由与疏水性嵌段(H)连接的肽抗原(A)构成的肽抗原偶联物形成的粒子的流体动力学行为(即尺寸和稳定性)，带电荷部分(C)可以直接地连接到肽抗原(A)，或者通过延长部(B1和/或B2)；通过连接物(L)，或通过疏水性嵌段(H)间接地连接到肽抗原(A)。带电荷部分(C)的目的是提供对在水性条件下由肽抗原偶联物形成的粒子的总电荷和稳定性的控制。
本文公开的包含连接到疏水性嵌段(H)的肽抗原并在水性条件下组装成粒子的免疫原性组合物，在没有足够表面电荷以使粒子稳定的情况下可能絮凝。因此，可以将带电荷部分(C)任选地连接到肽抗原偶联物，作为使所述粒子稳定并防止絮凝的手段。
基于在生理条件(约7.4的pH)下肽抗原的预测电荷和肽抗原偶联物所需的净电荷来选择带电荷部分(C)。带电荷部分(C)带有赋予静电荷的官能团。在一些实施方式中，带电荷部分(C)是由天然或非天然氨基酸构成的肽，所述天然或非天然氨基酸含有分别赋予正电荷或负电荷的碱性或酸性官能团。
带电荷部分(C)是指具有一个或多个官能团的任何分子，所述官能团在pH为约7.4的水性缓冲剂中带正电荷或负电荷。构成带电荷部分(C)的官能团可以具有部分或全整数电荷值。带电荷部分(C)可以是具有单个带电官能团或多个带电官能团的分子。带电荷部分(C)的净电荷可以是正、负或中性的。构成带电荷部分(C)的官能团的电荷可能依赖于或不依赖于带电荷部分(C)分散在其中的溶液的pH，例如对于叔胺和季铵化合物来说情况就是如此，它们分别是pH依赖性和pH不依赖性的。分子的电荷可以基于分子的Lewis结构和本领域技术人员已知的公认方法容易地估算。电荷可能由诱导效应产生，例如键合在一起的电子亲和力不同的原子可以产生极性共价键，产生带部分负电荷的原子和带部分正电荷的原子。例如，键合到氢的氮在氮上产生部分负电荷，并在所述氢原子上产生部分正电荷。或者，当指派给分子中的原子的电子数目小于或等于所述原子的原子序数时，所述原子可以被认为具有全整数电荷值。所述分子的电荷通过将构成所述分子的每个原子的电荷求和来确定。本领域技术人员熟悉通过将分子中每个原子的形式电荷求和来估算分子的电荷的过程。
带电荷部分(C)可带有净负电荷、净正电荷或中性电荷，并且取决于本文公开的发明的具体应用所需的肽抗原偶联物的净电荷。例如，已知大多数细胞表面带有净负电荷。因此，带净正电荷的粒子可以与所有细胞表面相互作用，不具有高度特异性。相反，带净负电荷的粒子将与大多数细胞表面静电排斥，但已显示促进被某些抗原呈递细胞群体的选择性摄取。例如，已发现静脉内递送到循环中的带正电荷粒子积累在肝和肺中以及脾脏中的抗原呈递细胞内，而带负电荷粒子已被发现在静脉内施用后优先积累在脾脏中的抗原呈递细胞中。因此，可以调整带电荷部分(C)的净电荷以满足应用的具体需求。
在一些实施方式中，带电荷部分(C)具有净负电荷，并且由在生理pH下即在约7.4的pH下带有负电荷的官能团构成。带有净负电荷的合适的带电荷部分(C)包括带有官能团(例如，pKa小于约6.5的官能团)的分子，所述官能团在生理pH下即在约7.4的pH下作为酸的共轭碱出现。这些包括但不限于带有羧酸根、硫酸根、磷酸根、氨基磷酸根和膦酸根的分子。带有羧酸根的带电荷部分(C)可以是但不限于谷氨酸、天冬氨酸、丙酮酸、乳酸、乙醇酸、葡萄糖醛酸、柠檬酸、异柠檬酸、α-酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸和草酰乙酸及其衍生物。在优选的实施方式中，带负电荷部分(C)由具有1-20个带负电荷官能团，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个带负电荷官能团的分子构成，但通常不超过16个带负电荷官能团。在一些实施方式中，带电荷部分(C)是长度为2-6个氨基酸的聚(谷氨酸)肽。由1、2、3、4、5或6个氨基酸构成的聚(谷氨酸)序列预期在pH 7.4下分别带有-1、-2、-3、-4、-5和-6的负电荷。在另外的实施方式中，带电荷部分(C)是磷酸丝氨酸或磺基丝氨酸。
在某些实施方式中，带电荷部分(C)具有净负电荷并且由1个或更多个带负电荷氨基酸构成。在优选的实施方式中，带净负电荷的带电荷部分(C)由1至20个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个带负电荷氨基酸构成。在一个非限制性实例中，由16个天冬氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp，用于制备具有-16的净负电荷的带电荷部分(C)；由15个天冬氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp，用于制备具有-15的净负电荷的带电荷部分(C)；由14个天冬氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp，用于制备具有-14的净负电荷的带电荷部分(C)；由13个天冬氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp，用于制备具有-13的净负电荷的带电荷部分(C)；由12个天冬氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp，用于制备具有-12的净负电荷的带电荷部分(C)；由11个天冬氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp，用于制备具有-11的净负电荷的带电荷部分(C)；由10个天冬氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp，用于制备具有-10的净负电荷的带电荷部分(C)；由9个天冬氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp，用于制备具有-9的净负电荷的带电荷部分(C)；由8个天冬氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp，用于制备具有-8的净负电荷的带电荷部分(C)；由7个天冬氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp，用于制备具有-7的净负电荷的带电荷部分(C)；由6个天冬氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp，用于制备具有-6的净负电荷的带电荷部分(C)；由5个天冬氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Asp-Asp-Asp-Asp-Asp，用于制备具有-5的净负电荷的带电荷部分(C)；由4个天冬氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Asp-Asp-Asp-Asp，用于制备具有-4的净负电荷的带电荷部分(C)；由3个天冬氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Asp-Asp-Asp，用于制备具有-3的净负电荷的带电荷部分(C)；由2个天冬氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Asp-Asp，用于制备具有-2的净负电荷的带电荷部分(C)；由1个天冬氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Asp，用于制备具有-1的净负电荷的带电荷部分(C)。在上述实例中，天冬氨酸(Asp)可以被任何合适的带负电荷氨基酸(包括但不限于谷氨酸、磺基丝氨酸或磷酸丝氨酸)代替，其中所述带负电荷氨基酸可以是相同或不同的。
在一些实施方式中，带电荷部分(C)具有净正电荷并且由带正电荷官能团构成。合适的带正电荷部分(C)包括具有在生理pH下即在约7.4的pH下带有正电荷的官能团的那些，例如弱碱的共轭酸，其中碱的共轭酸的pKa大于约8.5。合适的带正电荷部分(C)包括但不限于带有伯胺、仲胺和叔胺以及季铵、胍、鏻和锍官能团的分子。带有铵官能团的合适分子包括例如咪唑鎓和四烷基铵化合物。在一些实施方式中，带电荷部分(C)由不依赖于pH而带有永久性正电荷的季铵化合物构成。
具有不依赖于pH的电荷的带正电荷官能团的非限制性实例包括：
Figure BDA0002911415990001201
其中X-是任何合适的抗衡阴离子。
在另外的实施方式中，带电荷部分(C)由在生理pH下作为碱的共轭酸存在的官能团例如伯胺、仲胺和叔胺构成。在优选的实施方式中，带正电荷部分(C)由1-20个带正电荷官能团，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个带正电荷官能团构成，但通常不超过16个带电荷官能团。在一些实施方式中，带电荷部分(C)是长度为1-6个氨基酸的聚(赖氨酸)肽。由1、2、3、4、5或6个氨基酸构成的聚(赖氨酸)序列预期在pH 7.4下分别带有+1、+2、+3、+4、+5或+6的正电荷。在另外的实施方式中，带电荷部分(C)是长度为2-6个氨基酸的聚(精氨酸)肽。
在某些实施方式中，带电荷部分(C)具有净正电荷并且由1个或更多个带正电荷氨基酸构成。在优选的实施方式中，具有净正电荷的带电荷部分(C)由1至20个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、15、16、17、18、19或20个带正电荷氨基酸构成。在一个非限制性实例中，由16个赖氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys，用于制备具有+16的净正电荷的带电荷部分(C)；由15个赖氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys，用于制备具有+15的净正电荷的带电荷部分(C)；由14个赖氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys，用于制备具有+14的净正电荷的带电荷部分(C)；由13个赖氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys，用于制备具有+13的净正电荷的带电荷部分(C)；由12个赖氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys，用于制备具有+12的净正电荷的带电荷部分(C)；由11个赖氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys，用于制备具有+11的净正电荷的带电荷部分(C)；由10个赖氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys，用于制备具有+10的净正电荷的带电荷部分(C)；由9个赖氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys，用于制备具有+9的净正电荷的带电荷部分(C)；由8个赖氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys，用于制备具有+8的净正电荷的带电荷部分(C)；由7个赖氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys，用于制备具有+7的净正电荷的带电荷部分(C)；由6个赖氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys，用于制备具有+6的净正电荷的带电荷部分(C)；由5个赖氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Lys-Lys-Lys-Lys-Lys，用于制备具有+5的净正电荷的带电荷部分(C)；由4个赖氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Lys-Lys-Lys-Lys，用于制备具有+4的净正电荷的带电荷部分(C)；由3个赖氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Lys-Lys-Lys，用于制备具有+3的净正电荷的带电荷部分(C)；由2个赖氨酸单体构成的带电荷部分(C)，例如Lys-Lys，用于制备具有+2的净正电荷的带电荷部分(C)；由1个赖氨酸构成的带电荷部分(C)，例如Lys，用于制备具有+1的净正电荷的带电荷部分(C)。在上述实例中，赖氨酸(Lys)可以被任何合适的带正电荷氨基酸(包括但不限于三甲基赖氨酸或精氨酸)代替，其中所述带正电荷氨基酸可以是相同或不同的。
带电荷部分(C)可以另外包含小的不带电荷的亲水性氨基酸或亲水性连接物例如环氧乙烷，其用于i)提高水溶性和ii)增加带电荷官能团之间的距离以防止不完全电离。例如，聚合物上的一个官能团的电离可能通过局部效应影响邻近官能团的pKa。例如，与第二胺非常接近的胺的质子化可能降低第二胺的共轭酸的pKa。为了减少局部效应对邻近官能团的电离潜力的影响，可以使用连接物分子来增加构成带电荷部分的带电荷官能团之间的距离。连接物分子可以包含1-5个小的不带电荷的亲水性氨基酸，例如1、2、3、4和5个氨基酸。或者，连接物可以包含1-4个单体单元的环氧乙烷(即PEG)连接物，例如长度为1、2、3或4个环氧乙烷单体。在优选的实施方式中，将1至2个小的不带电荷的亲水性氨基酸置于构成带电荷部分(C)的相邻带电荷氨基酸之间，其中所述氨基酸通过酰胺键连接。在某些实施方式中，将丝氨酸置于构成具有净正电荷的带电荷部分(C)的每个带电荷氨基酸之间。在优选的实施方式中，带电荷部分(C)由重复的赖氨酸和丝氨酸的二肽构成，即(Lys-Ser)n，其中n通常是1-20之间的任何整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。作为其他实例，将丝氨酸置于具有+2净电荷的三肽带电荷部分(C)的每个带电荷氨基酸之间，例如Lys-Ser-Lys；将丝氨酸置于具有+3净电荷的5个氨基酸的带电荷部分(C)的每个带电荷氨基酸之间，例如Lys-Ser-Lys-Ser-Lys；将丝氨酸置于具有+4净电荷的7个氨基酸的带电荷部分(C)的每个带电荷氨基酸之间，例如Lys-Ser-Lys-Ser-Lys-Ser-Lys。在上述实例中，赖氨酸(Lys)可以被任何合适的带正电荷氨基酸(包括但不限于三甲基赖氨酸或精氨酸)代替，其中所述带正电荷氨基酸可以是相同或不同的。
在某些实施方式中，将丝氨酸置于构成具有净负电荷的带电荷部分(C)的每个带电荷氨基酸之间。在优选的实施方式中，带电荷部分由重复的天冬氨酸和丝氨酸的二肽构成，即(Asp-Ser)n，其中n通常是1-20之间的任何整数，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。例如，将丝氨酸置于具有-2净电荷的三肽带电荷部分(C)的每个带电荷氨基酸之间，例如Asp-Ser-Asp；将丝氨酸置于具有-3净电荷的5个氨基酸的带电荷部分(C)的每个带电荷氨基酸之间，例如Asp-Ser-Asp-Ser-Asp；将丝氨酸置于具有-4净电荷的7个氨基酸的带电荷部分(C)的每个带电荷氨基酸之间，例如Asp-Ser-Asp-Ser-Asp-Ser-Asp。在上述实例中，天冬氨酸(Asp)可以被任何合适的带负电荷氨基酸(包括但不限于谷氨酸、磺基丝氨酸或磷酸丝氨酸)代替，其中所述带负电荷氨基酸可以是相同或不同的。
在另外的实施方式中，带电荷部分(C)由带负电荷和带正电荷氨基酸两者构成。由相反电荷的氨基酸构成的二肽例如Lys-Asp被称为两性离子二肽，因为它们被预测在pH7.4下具有0的净中性电荷。一个或多个两性离子二肽可以被包括在带电荷部分(C)中，作为i)提高水溶性和ii)在特定pH范围内提供优势电荷(例如净负或净正电荷)的手段。例如，两性离子二肽可以用于增加肽序列的亲水特性，而不增加或减少肽序列在pH 7.4下的电荷。然而，所述两性离子可以用于在特定pH下提供净电荷。例如，在这个实例中将N端胺和C端羧酸的贡献排除在外，所述两性离子二肽Lys-Asp在pH 7.4下具有0的净电荷，但在pH<4下具有+1的净电荷，并且在pH>10下具有-1的净电荷。一个或多个两性离子二肽可以被添加到带电荷部分(C)的序列；例如，一个二肽Lys-Asp；两个二肽Lys-Asp-Lys-Asp；三个二肽Lys-Asp-Lys-Asp-Lys-Asp等。在上述实例中，赖氨酸(Lys)可以被任何合适的带正电荷氨基酸(包括但不限于三甲基赖氨酸或精氨酸)代替，并且天冬氨酸(Asp)可以被任何合适的带负电荷氨基酸(包括但不限于谷氨酸、磺基丝氨酸或磷酸丝氨酸)代替，其中所述带正电荷或带负电荷氨基酸可以是相同或不同的。
带电荷部分(C)的组成被选择成提供用于具体应用的肽抗原偶联物所需的净电荷。在本文公开的几个实施方式中，带电荷部分(C)是由赖氨酸或精氨酸构成、或者由赖氨酸或精氨酸和不带电荷氨基酸构成的带正电荷的聚(氨基酸)。在一些实施方式中，带电荷部分包含带有不依赖于pH的正电荷的锍或季铵官能团。在本文公开的几个实施方式中，带电荷部分(C)是由谷氨酸或天冬氨酸构成、或者由谷氨酸或天冬氨酸和不带电荷氨基酸构成的带负电荷的聚(氨基酸)。在一些实施方式中，带电荷部分包含磷酸或硫酸基团，例如磺基丝氨酸或磷酸丝氨酸。在另外的实施方式中，带电荷部分由赖氨酸或精氨酸和谷氨酸或天冬氨酸构成、或者由赖氨酸或精氨酸和谷氨酸或天冬氨酸以及不带电荷氨基酸构成。带正电荷和带负电荷官能团两者可以被包含在同一个带电荷部分(C)上。带电荷部分(C)可以是正、负或中性的，但肽抗原偶联物的净电荷应该是非零的，例如大于+3或小于-3的净电荷是优选的，并取决于具体应用。
在一些实施方式中，肽抗原偶联物包含单个带电荷部分(C)。在其他实施方式中，肽抗原偶联物包含两个带电荷部分。对于具有两个带电荷部分(C)的肽抗原偶联物，将靠近肽抗原(A)的N端的带电荷部分称为C1，并且将靠近肽抗原的C端的带电荷部分称为C2。在一些实施方式中，C1和C2可以是相同的带电荷部分，而在其他实施方式中，C1和C2可以是不同的带电荷部分。
可以选择带电荷部分(C1和C2)和延长序列(B1和B2)的组成以提供特定数目的带电荷残基，其提供所需的净电荷和亲水性。在优选的实施方式中，调节包含带电荷部分(C)的带电官能团的数目，使得包含带电荷部分(C)、肽抗原(A)、任选的延长部(B1和/或B2)、连接物(L)和疏水性嵌段(H)的肽抗原偶联物的净电荷在约-3至-10之间或+3至+10之间。
带电荷部分(C)可以直接地或通过延长部(B1或B2)、连接物(L)和/或疏水性嵌段(H)间接地连接到肽抗原(A)。
在优选的实施方式中，带电荷部分(C)连接到延长部(B1)，所述延长部连接到肽抗原(A)的N端，所述肽抗原(A)在C端处连接到延长部(B2)，所述延长部(B2)直接地或经由连接物(L)连接到疏水性嵌段(H)，以得到式V的肽抗原偶联物：
C-[B1]-A-[B2]-[L]-H或H-[L]-[B1]-A-[B2]-C
式V
在几个实施方式中，带电荷部分(C)位于式V的肽抗原偶联物的N端，其中带电荷部分(C)连接到N端延长部(B1)，所述延长部(B1)由长度通常为1至4个氨基酸的组织蛋白酶可切割延长部构成(B1＝PN1、PN2-PN1、PN3-PN2-PN1或PN4-PN3-PN2-PN1)，所述延长部(B1)连接到肽抗原(A)的N端，所述肽抗原(A)在C端处连接到C端延长部(B2)，所述延长部(B2)由长度通常为1至6个氨基酸的免疫蛋白酶体、组织蛋白酶或组合的免疫蛋白酶体和组织蛋白酶可切割的延长部构成(B2＝PC1'、PC1'-PC2'、PC1'-PC2'-PC3'、PC1'-PC2'-PC3'-PC4'、PC1'-PC2'-PC3'-PC4'-PC5'或PC1'-PC2'-PC3'-PC4'-PC5'-PC6')，所述延长部(B2)连接到连接物(L)，所述连接物(L)连接到疏水性嵌段(H)。式V的肽抗原偶联物的肽抗原(A)由整数个氨基酸n构成，其中n通常是7-35个氨基酸或至多50个氨基酸，并且疏水性嵌段(H)通常是连接到式III的佐剂的式I或II的聚(氨基酸)。
式V的肽抗原偶联物的一个非限制性实例如下，所述肽抗原偶联物包含：带电荷部分(C＝Lys-Lys)，其连接到组织蛋白酶可切割的四肽延长部(B1＝Lys-Pro-Leu-Arg)，所述四肽延长部连接在肽抗原(A)的N端处，所述肽抗原(A)在C端处连接到组织蛋白酶可切割六肽延长部(B2＝Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg)，所述六肽延长部连接到连接物(L)，所述连接物(L)连接到疏水性嵌段(H)，所述疏水性嵌段(H)由连接到式III的佐剂的式I的聚(氨基酸)构成：
Figure BDA0002911415990001261
在式V的肽抗原偶联物的一个非限制性实例C-B1-(A)7-35-B2-L-H中，具有序列Ala-Lys-Phe-Val-Ala-Ala-Trp-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-Ala的肽抗原(A)连接到具有序列Ser-Leu-Val-Arg的N端延长部(B1)和具有序列Ser-Leu-Val-Arg的C端延长部(B2)，所述延长部(B1)连接到由具有序列Glu-Lys的二肽构成的带电荷部分(C)，所述延长部(B2)连接到连接物(L)(Lys(N3-DBCO)，所述连接物(L)连接到疏水性嵌段(H)，例如：Glu-Lys-Ser-Leu-Val-Arg-Ala-Lys-Phe-Val-Ala-Ala-Trp-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-Ala-Ser-Leu-Val-Arg-Lys(N3-DBCO-H)，产生在pH 7.4下具有+5的净电荷的肽抗原偶联物。为清楚起见，假定本实例中的疏水性嵌段(H)对电荷的贡献可忽略不计并且C端被酰胺化。
在另外的实施方式中，带电荷部分(C；或当存在两个带电荷部分时为C2)可以直接地连接到疏水性嵌段(H)或连接到连接物(L)，所述连接物(L)连接到C端延长部(B2)，所述延长部(B2)连接到肽抗原(A)的C端，所述肽抗原(A)任选地在N端处连接到N端延长部(B1)，所述延长部(B1)任选地连接到另一个任选的带电荷部分(C1)，得到式VI的抗原偶联物：
[B1]-A-[B2]-L(C)-H、[B1]-A-[B2]-L-H(C)、[C1]-[B1]-A-[B2]-L(C2)-H、[C1]-[B1]-A-[B2]-L-H(C2)、H-L(C)-[B1]-A-[B2]、H(C)-[B1]-A-[B2]、H-L(C1)-[B1]-A-[B2]-C2或H(C1)-[B1]-A-[B2]-C2
式VI
在几个实施方式中，带电荷部分(C)位于式VI的肽抗原偶联物的C端处，其中带电荷部分(C)连接到连接物(L)，所述连接物(L)连接到C端延长部(B2)，所述延长部(B2)由长度通常为1至6个氨基酸的免疫蛋白酶体、组织蛋白酶或组合的免疫蛋白酶体和组织蛋白酶可切割的延长部构成(B2＝PC1'、PC1'-PC2'、PC1'-PC2'-PC3'、PC1'-PC2'-PC3'-PC4'、PC1'-PC2'-PC3'-PC4'-PC5'或PC1'-PC2'-PC3'-PC4'-PC5'-PC6')，所述延长部(B2)连接到肽抗原(A)的C端，所述肽抗原(A)任选地在N端处连接到长度通常为1至4个氨基酸的组织蛋白酶可切割延长部(B1＝PN1、PN2-PN1、PN3-PN2-PN1或PN4-PN3-PN2-PN1)，其中连接物(L)另外连接到疏水性嵌段(H)，如此处所示：
Figure BDA0002911415990001281
式VI的肽抗原偶联物的肽抗原(A)由整数个氨基酸n构成，其中n通常是7-35个氨基酸或至多50个氨基酸，并且疏水性嵌段(H)通常是连接到式III的佐剂的式I或II的聚(氨基酸)。
提供了式VI的肽抗原偶联物的一个非限制性实例，所述肽抗原偶联物由以下构成：带电荷部分(C＝Lys-Lys)，其经由酰胺键连接到连接物(L)的C端，所述连接物(L)连接到组合的免疫蛋白酶体和组织蛋白酶可切割的六肽C端延长部(B2＝Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg)，所述延长部连接到肽抗原(A)的C端，所述肽抗原(A)在N端处连接到组织蛋白酶可切割四肽N端延长部(B1＝Lys-Pro-Leu-Arg)，其中连接物(L)另外连接到疏水性嵌段(H)，所述疏水性嵌段(H)由连接到式III的佐剂的式I的聚(氨基酸)构成：
Figure BDA0002911415990001291
式VI的肽抗原偶联物的另一个非限制性实例B1-A-B2-L-H(C)为：带电荷部分(C＝Lys-Lys-Lys-Lys-Lys)，其经由连接物连接到疏水性嵌段(H)，所述疏水性嵌段(H)由与式III的佐剂连接的式I的聚(氨基酸)构成，所述疏水性嵌段(H)连接到连接物(L)，所述连接物(L)连接到组合的免疫蛋白酶体和组织蛋白酶可切割的六肽C端延长部(B2＝Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg)，所述延长部连接到肽抗原(A)的C端，并且其中所述肽抗原的N端连接到组织蛋白酶可切割的四肽N端延长部(B1＝Lys-Pro-Leu-Arg)：
Figure BDA0002911415990001301
在式VI的肽抗原偶联物的一个非限制性实例B1-(A)7-35-B2-L(-C)-H中，具有序列Ala-Lys-Phe-Val-Ala-Ala-Trp-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-Ala的肽抗原(A)连接到具有序列Ser-Leu-Val-Arg的N端延长部(B1)和具有序列Ser-Leu-Val-Arg的C端延长部(B2)，所述延长部(B2)连接到连接物前体X1例如Lys(N3)，所述连接物前体X1连接到由具有序列Glu-Lys的二肽构成的带电荷部分(C)和包含DBCO分子的连接物前体X2，所述连接物前体X2连接到疏水性嵌段(H)，例如：Ser-Leu-Val-Arg-Ala-Lys-Phe-Val-Ala-Ala-Trp-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-Ala-Ser-Leu-Val-Arg-Lys(N3-DBCO-H)-Glu-Lys，其中Glu-Lys序列连接到连接物(L)(Lys(N3-DBCO)的C端，产生在pH 7.4下具有+4的预测净电荷的肽抗原偶联物。此处，假设疏水性嵌段(H)对肽抗原偶联物的电荷贡献可忽略不计。
其中带电荷部分(C)连接到疏水性嵌段(H)的式VI的肽抗原偶联物对于快速产生个性化疗法(例如癌症疫苗)可能是有利的。与带电荷部分(C)和连接物前体X2(例如，包含环辛炔的X2)连接的疏水性嵌段(H)可以批量制备，然后容易地与带有连接物前体X1(例如，包含叠氮化物的X1)的任何肽抗原(A)组合以形成式VI的肽抗原偶联物[B1]-A-[B2]-L-H(C)，其中[]表示所述基团是任选的。
带电荷部分(C)的功能是稳定在水性条件下由肽抗原偶联物形成的纳米粒子。当疏水性嵌段(H)诱导肽抗原偶联物的粒子形成时，任选的带电荷部分(C)提供防止絮凝的抗衡力量，并且在一些实施方式中，驱动肽抗原偶联物组装成具有由带电荷部分(C)提供的表面电荷的纳米粒子胶束。
对于某些应用，需要带正电荷的肽抗原偶联物。在一些实施方式中，式V的肽抗原偶联物由以下构成：带电荷部分(C)连接到N端肽延长部(B1)，所述肽延长部(B1)连接到肽抗原(A)，所述肽抗原(A)连接到C端肽延长部(B2)，所述肽延长部(B2)通过连接物(L)连接到疏水性嵌段(H)，并且所得肽抗原偶联物具有净正电荷，其中疏水性嵌段(H)由连接到式III的佐剂的式I或式II的聚(氨基酸)构成。通过肽抗原(A)的C端连接的疏水性嵌段(H)起着诱导粒子形成的作用，并且通过肽抗原(A)的N端连接的带电荷部分(C)通过在这些粒子表面的高正电荷密度而起着稳定粒子的作用。因此，安置在式V的带净正电荷的肽抗原偶联物的疏水性嵌段(H)近端的B2延长部(其中带电荷部分(C)通过肽抗原(A)的N端连接)优选由不带电荷和疏水性的氨基酸构成，所述氨基酸有助于促进粒子形成并且通常选自单个氨基酸，例如甘氨酸、丝氨酸、瓜氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或蛋氨酸；二肽，例如Gly-Cit、Gly-Ser或Gly-Leu；三肽，例如Gly-Ser-Cit、Gly-Pro-Cit或Gly-Pro-Gly；四肽，例如Ser-Pro-Val-Cit或Gly-Pro-Gly-Cit；五肽，例如Gly-Ser-Val-Leu-Cit、Gly-Pro-Val-Leu-Cit；或六肽，例如Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Cit或Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Cit。在一些实施方式中，使用包括单个带电荷氨基酸的C端延长部(B2)，并且其通常选自单个氨基酸，例如精氨酸或赖氨酸；二肽，例如Gly-Arg或Gly-Lys；三肽，例如Gly-Ser-Arg或Gly-Ser-Lys；四肽，例如Gly-Pro-Gly-Arg、Gly-Ser-Val-Arg或Ser-Leu-Val-Arg(其中Arg可以被Lys代替)；五肽，例如Gly-Ser-Leu-Val-Arg(其中Arg可以被Lys代替)；和六肽，例如Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg或Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Arg(其中Arg可以被Lys代替)。安置在式V的带正电荷的肽抗原偶联物的带电荷部分(C)近端的B1延长部(其中带电荷部分(C)通过肽抗原(A)的N端连接)优选含有带电荷氨基酸例如Arg或Lys，并且通常选自：选自Arg或Lys的单个氨基酸；选自Val-Arg或Leu-Arg的二肽(其中Arg可以被Lys代替)；选自Pro-Val-Arg或Gly-Val-Arg的三肽(其中Arg可以被Lys代替)；或选自Lys-Leu-Val-Arg、Lys-Pro-Val-Arg、Lys-Pro-Leu-Arg、Ser-Leu-Val-Arg和Ser-Pro-Val-Arg的四肽(其中Arg可以被Lys代替)。不同的延长部B1和B2可以与任何带电荷部分(C)、肽抗原(A)和疏水性嵌段(H)组合使用，以获得所需的肽抗原偶联物的亲水性总平均值和净电荷。
对于某些应用，需要带负电荷的肽抗原偶联物。在一些实施方式中，式V的肽抗原偶联物由以下构成：具有净负电荷的带电荷部分(C)连接到N端肽延长部(B1)，所述肽延长部(B1)连接到肽抗原(A)，所述肽抗原(A)连接到C端肽延长部(B2)，所述肽延长部(B2)通过连接物(L)连接到疏水性嵌段(H)，并且所得的肽抗原偶联物具有净负电荷，其中疏水性嵌段(H)由连接到式III的佐剂的式I或式II的聚(氨基酸)构成。通过肽抗原(A)的C端连接的疏水性嵌段(H)起着诱导粒子形成的作用，并且通过肽抗原(A)的N端连接的带电荷部分(C)通过高负电荷密度起着稳定粒子的作用。因此，安置在式V的带净负电荷的肽抗原偶联物的疏水性嵌段(H)近端的B2延长部(其中带电荷部分(C)通过B1延长部连接在肽抗原(A)的N端)优选由不带电荷和疏水性的氨基酸构成，所述氨基酸有助于促进粒子形成并且通常选自单个氨基酸，例如甘氨酸、丝氨酸、瓜氨酸、亮氨酸、正亮氨酸或蛋氨酸；二肽，例如Gly-Ser、Gly-Cit或Gly-Leu；三肽，例如Gly-Ser-Cit、Gly-Pro-Cit或Gly-Pro-Gly；四肽，例如Ser-Pro-Val-Cit、Ser-Pro-Val-Cit或Gly-Pro-Gly-Cit；五肽，例如Gly-Ser-Val-Leu-Cit、Gly-Pro-Val-Leu-Cit；或六肽，例如Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Cit或Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Cit或Gly-Gly-Ser-Pro-Leu-Cit。在一些实施方式中，使用包括单个带电荷氨基酸的C端延长部(B2)，并且其通常选自单个氨基酸，例如精氨酸或赖氨酸；二肽，Gly-Arg(其中Arg可以被Lys代替)；三肽，例如Gly-Ser-Arg(其中Arg可以被Lys代替)；四肽，例如Gly-Pro-Gly-Arg、Gly-Ser-Val-Arg、Ser-Leu-Val-Arg、Asp-Leu-Val-Cit或Asp-Leu-Val-Leu(其中Asp可以被Glu代替并且Arg可以被Lys代替)；五肽，例如Gly-Ser-Leu-Val-Arg或Gly-Asp-Leu-Val-Leu或Gly-Asp-Leu-Val-Arg；和六肽，例如Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg或Gly-Gly-Ser-Pro-Val-Arg(其中Asp可以被Glu代替并且Arg可以被Lys代替)；或Gly-Ser-Glu-Leu-Val-Arg或Gly-Gly-Asp-Pro-Val-Arg(其中Asp可以被Glu代替并且Arg可以被Lys代替)。安置在式V的带净负电荷的肽抗原偶联物的带电荷部分(C)近端的B1延长部(其中带电荷部分(C)经由B1延长部通过肽抗原的N端连接)优选含有带电荷氨基酸，例如Asp或Glu，并且通常选自单个氨基酸，例如Cit、Leu、Arg或Lys；二肽，选自Val-Cit、Leu-Cit、Val-Arg或Leu-Arg(其中Arg可以被Lys代替)；三肽，选自Pro-Val-Arg、Pro-Val-Cit、Gly-Val-Arg或Gly-Val-Cit(其中Arg可以被Lys代替)；或四肽，选自Ser-Leu-Val-Arg、Ser-Pro-Val-Arg、Ser-Pro-Leu-Cit、Ser-Leu-Val-Cit、Ser-Pro-Val-Cit、Asp-Leu-Val-Arg、Asp-Pro-Val-Arg、Asp-Leu-Val-Cit、Asp-Leu-Val-Leu、Ser-Gly-Val-Cit或Asp-Pro-Val-Cit(其中Arg可以被Lys代替并且Asp可以被Glu代替)。不同的延长部B1和B2可以与任何带电荷部分(C)、肽抗原(A)和疏水性嵌段(H)组合，以获得所需的肽抗原偶联物的亲水性总平均值和净电荷。
基于聚(阴离子)的带电荷部分(C)的使用
生产具有由基于酸的阴离子例如基于肽的低聚物或基于天冬氨酸、谷氨酸、磺基丝氨酸或磷酸丝氨酸的聚合物构成的带电荷部分(C)的肽抗原偶联物的挑战是，这些酸的质子化形式通常在水溶液中难溶，并且通常甚至在水混溶性有机溶剂中的溶解性也很差。酸的有限溶解性可以对制造和处理具有由酸构成的带电荷部分(C)的肽抗原片段和/或肽抗原偶联物构成挑战。例如，与式C-[B1]-A-[B2]-[L]-H和H-[L]-[B1]-A-[B2]-C(其中C是由一个或多个带有酸官能团的氨基酸构成的带电荷部分)的肽抗原偶联物相比，式C-[B1]-A-[B2]-[L]-H和H-[L]-[B1]-A-[B2]-C(其中C是由一个或多个带有胺官能团的氨基酸构成的带电荷部分)的肽抗原偶联物提供了改进的制造。然而，可能存在需要多个酸官能团以提供肽抗原偶联物的净负电荷的情况(当酸被去质子化时，即以酸的共轭碱的形式)。例如，高正电荷可以导致肽抗原偶联物与带负电荷的细胞表面非特异性地相互作用。因此，对于某些应用，通过使用带净负电荷的肽抗原偶联物，避免这些非特异性相互作用可能是有益的，所述净负电荷由存在于带电荷部分(C)上的弱酸(例如，来自COOH的COO-)的一种或多种共轭碱提供。
基于改进具有包含酸的带电荷部分的肽抗原片段和肽抗原偶联物的可制造性的需要，开发了两种策略并且导致了可制造性的出乎意料的改进。下面描述这两种与抗衡离子的选择和带电荷的两亲性载体分子的使用有关的策略。
抗衡离子的选择
发现构成带电荷部分的酸的共轭碱的抗衡离子的选择可影响肽抗原片段和肽抗原偶联物的可制造性。
尽管使用碱金属离子例如钠(Na+)和钾(K+)作为酸的共轭碱的抗衡离子可提供具有良好水溶性的盐(例如羧酸钠盐)，但通常发现这些盐在水混溶性溶剂例如DMSO、DMF、甲醇、乙醇和丙酮中具有不充分的溶解性，所述溶剂是在疏水性嵌段与肽抗原片段反应期间用于溶解疏水性嵌段(H)的优选溶剂体系。
相反，发现有机碱(例如基于烷基胺，特别是三烷基胺的那些)的共轭酸可提高肽抗原片段和肽抗原偶联物在水和水混溶性有机溶剂中的溶解性。因此，在某些实施方式中，包含酸的肽抗原片段、肽抗原偶联物以及两亲性载体分子被制备为酸的铵盐形式。用于形成铵盐的合适胺包括但不限于铵，伯胺(例如三(羟甲基)氨基甲烷)，基于二烷基胺的仲胺(例如二甲胺和二乙胺)，基于三烷基胺的叔胺(例如三甲胺、二异丙基乙胺(DIPEA)和三乙胺(TEA))，以及季铵化合物。出乎意料的是，作为肽抗原片段、肽抗原偶联物和两亲性载体分子上存在的酸的铵盐的三(羟甲基)氨基甲烷(或Tris)提高了这些分子在水混溶性有机溶剂例如DMSO、DMF、丙酮和乙醇以及水溶液中的溶解性；另外，当将由三(羟甲基)氨基甲烷制备的肽抗原片段、肽抗原偶联物和两亲性载体分子的铵盐悬浮在水性缓冲剂例如pH 7.4的PBS中时，这些盐对水性缓冲剂的pH影响最小。由于这些原因，三(羟甲基)氨基甲烷的质子化形式是用于制备存在于肽抗原片段、肽抗原偶联物和两亲性载体分子上的酸的共轭碱的盐的优选的抗衡离子。
基于聚(阴离子)的两亲性载体分子
还发现使用两亲性载体分子的特定组成，例如式C-[B]-[L]-H或C-[B1]-[A']-[B2]-[L]-[H]，其包含带有一个或多个酸(或共轭碱的盐)的带电荷部分，可以与任何患者特异性的肽抗原偶联物简单混合以形成镶嵌粒子，从而避免了在患者特异性肽抗原偶联物上添加包含酸的带电荷部分的需要。通过将带电荷部分添加到保守的非患者特异性部分，即两亲性载体分子上，这极大地简化了制造，特别是与制造由基于肽的聚(酸)构成的两亲性物质相关的挑战。
该方法被鉴定为特别适合于制备具有由肽抗原偶联物和两亲性载体分子构成的具有净负电荷的纳米粒子胶束的免疫原性组合物，其中净负电荷由两亲性载体分子上存在的带负电荷官能团提供，所述官能团由酸的共轭碱构成，例如羧酸根、磺酸根、硫酸根、膦酸根和/或磷酸根。
因此，在由肽抗原偶联物和两亲性载体分子构成的具有净负电荷的纳米粒子胶束的免疫原性组合物的某些实施方式中，式A-[B2]-[L]-H或H-[L]-[B1]-A的肽抗原偶联物与式C-[B]-[L]-H或H-[L]-[B]-C的两亲性载体分子以适当的摩尔比混合在水混溶性有机溶剂中，然后悬浮于水溶液，优选pH为约7.4的水性缓冲剂。
为清楚起见，下面示出了由式A-B2-L-H的肽抗原偶联物和式C-B-L-H的两亲性载体分子构成的具有净负电荷的纳米粒子胶束的免疫原性组合物的一个非限制性实例：
Figure BDA0002911415990001361
其中y17是构成带电荷部分(C)的单体的重复单元的整数，通常选自约1至16之间，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16；y18是构成间隔物的单体的重复单元的整数，其通常在约4至约200之间；并且，基于肽的带电荷部分的N端氨基酸的胺为游离胺的形式或例如被酰基封端。为了更清楚起见，在其中疏水性嵌段是聚(色氨酸)、连接物(L)是Lys(N3-DBCO)、并且带负电荷部分(C)呈Tris盐形式的上述非限制性实例中，结构为：
Figure BDA0002911415990001371
制备由肽抗原偶联物和两亲性载体分子构成的纳米粒子胶束的考虑因素
本文报道的意外发现是带有带电荷部分的肽抗原偶联物(例如C-[B1]-A-[B2]-[L]-H)在存在高摩尔过量、至多4倍高过量疏水性嵌段片段(X2-H)下可以形成稳定胶束。一种非约束性的解释是带有带电荷部分的肽抗原偶联物形成稳定胶束，并且疏水性嵌段片段并入这种胶束纳米粒子的疏水核内。
这些发现促使人们对不存在带电荷部分的肽抗原偶联物(例如[B1]-A-[B2]-[L]-H或H-[L]-[B1]-A-[B2])与两亲性载体分子(例如式S-[B]-[L]-H或S-[B1]-[A']-[B2]-[L]-H的两亲性载体分子，其中增溶基团S可以包含带电荷部分，例如C-[B]-[L]-H或C-[B1]-[A']-[B2]-[L]-H，其用于稳定并入了肽抗原偶联物的胶束)组合的策略进行评估。注意：增溶基团S可以是任何亲水性分子，包括任何带电荷分子，其在本文中被称为带电荷部分(C)。
制备由肽抗原偶联物和两亲性载体分子构成的纳米粒子胶束的免疫原性组合物的一个非限制性实例是将一种或多种式[B1]-A-[B2]-[L]-H的肽抗原偶联物(例如A-B2-L-H)与式C-[B]-[L]-H的两亲性载体分子(例如C-B-H)以肽抗原偶联物摩尔数与两亲性载体分子摩尔数为4:1的摩尔比组合在DMSO中，然后向DMSO溶液中添加水溶液，例如缓冲剂。
两亲性载体分子的组成的考虑因素
在一些实施方式中，肽抗原偶联物不包含带电荷部分，例如[B1]-A-[B2]-[L]-H，其中[]表示所述基团是任选的。非限制性实例包括A-H、A-L-H、A-B2-H、A-B2-L-H和B1-A-B2-L-H。
某些不包含带电荷部分的肽抗原偶联物可以在水性条件(例如pH7.4的水性缓冲剂如PBS)下经历聚集，除非这些偶联物在载体内稳定或配制。因此，用不包含带电荷部分(C)的肽抗原偶联物产生稳定的纳米粒子胶束的一种手段是将这种肽抗原偶联物与确实形成稳定的纳米粒子胶束的肽抗原偶联物和/或两亲性载体分子中的任一者或两者组合。
在一些实施方式中，将不包含带电荷部分(C)的第一肽抗原偶联物(例如[B1]-A-[B2]-[L]-H)与包含带电荷部分的第二肽抗原偶联物(例如C-[B1]-A-[B2]-[L]-H)混合在DMSO溶液中，然后重悬在水性条件下以形成稳定的纳米粒子。在其他实施方式中，不包含带电荷部分(C)的肽抗原偶联物(即[B1]-A-[B2]-[L]-H)与连接到带电荷部分的疏水性嵌段(例如C-H)混合在DMSO溶液中，然后重悬在水性条件下以形成稳定的纳米粒子。
在一些实施方式中，不包含带电荷部分的肽抗原偶联物，例如[B1]-A-[B2]-[L]-H，其中[]表示所述基团是任选的，与两亲性载体C-[B1]-[A']-[B2]-[L]-H组合，其中[]表示所述基团是任选的，并且任选的A'是保守抗原(即不是患者特异性的)。
在一些实施方式中，不包含带电荷部分的肽抗原偶联物，例如[B1]-A-[B2]-[L]-H，其中[]表示所述基团是任选的，与例如S-[B]-[L]-H的式的两亲性载体组合，其中S是增溶基团，其可以任选地包含带电荷部分，例如C-[B]-[L]-H。
在其他实施方式中，将包含带电荷部分(C)的肽抗原偶联物与两亲性载体组合，所述两亲性载体用于进一步改善并确保由肽抗原偶联物形成的纳米粒子胶束的稳定性。
两亲性载体分子可以是中性的或者包括在生理pH下携带电荷的官能团，因此可以被称为带电荷的两亲性载体分子或有时称为带电荷的载体分子。
在一些实施方式中，两亲性载体分子是中性的并具有式S-[B]-[L]-H或H-[L]-[B]-S。在其他实施方式中，式S-[B]-[L]-H或H-[L]-[B]-S的两亲性载体分子具有净负电荷或净正电荷，因此可以由式C-[B]-[L]-H或H-[L]-[B]-C表示，其中增溶基团S是带电荷部分(C)。
具有净正电荷或净负电荷的两亲性载体分子通常包含2个或更多个，通常不超过10个带电荷官能团，例如2、3、4、5、6、7、8、9和10个，它们可以包含带正电荷和/或带负电荷官能团(在生理pH 7.4下)。带正电荷官能团通常选自胺和胍碱，和/或季铵或锍基团。带负电荷官能团通常选自羧酸根、磺酸根、硫酸根、膦酸根和磷酸根。
选择包含在带电荷的两亲性载体分子中的带电荷官能团的数目以确保稳定的纳米粒子胶束形成并防止聚集体的形成。在一些实施方式中，需要4个或更多个胺或胍官能团以确保与式S-B-H的两亲性载体分子形成稳定的纳米粒子胶束，其中H由5个或更多个疏水性氨基酸，例如5个或更多个色氨酸氨基酸构成。在其他实施方式中，需要4个或更多个羧酸官能团以确保与式S-B-H的两亲性载体分子形成稳定的纳米粒子胶束，其中H由5个或更多个疏水性氨基酸，例如5个或更多个色氨酸氨基酸构成。出乎意料的是，发现其中H由5个或更多个疏水性氨基酸(例如5个或更多个色氨酸氨基酸)构成的式S-B-H的两亲性载体分子形成稳定的纳米粒子胶束，其中少至两个或更多个官能团由磺酸根、硫酸根、膦酸根和/或磷酸根构成。
此外，还发现带电荷官能团的数目取决于间隔物B的组成和两亲性载体分子的结构。
式S-B-H的线性两亲性载体分子(其中B由小的和/或亲水性的氨基酸构成，并且H由5个或更多个疏水性氨基酸，例如5个或更多个色氨酸氨基酸构成)通常需要具有更大数目的带电荷官能团的带电荷部分，例如6个或更多个、有时10个或更多个胺、胍和/或羧酸根，或3个或更多个、有时4个或更多个磺酸根、硫酸根、膦酸根和/或磷酸根。相反，式S-B-H的线性两亲性载体分子(其中B由亲水性聚合物例如PEG或HPMA构成，并且H由5个或更多个疏水性氨基酸例如5个或更多个色氨酸氨基酸构成)通常需要具有较少带电荷官能团的带电荷部分，例如4个或更多个、有时8个或更多个胺、胍和/或羧酸根，或2个或更多个、有时3个或更多个磺酸根、硫酸根、膦酸根和/或磷酸根。
另外，还发现两亲性载体分子净电荷与纳米粒子胶束形成之间的关联强烈依赖于两亲性载体分子的结构。值得注意的是，本文报道的出乎意料的发现是，具有刷形结构的两亲性载体分子与线性结构相比需要较少的带电荷官能团。具有刷形结构的两亲性载体分子可以通过将疏水性嵌段连接到为CB提供两个或更多个连接点的扩增连接物来制备，例如(C-B)y19-K-[L]-H，其中K是扩增连接物，并且y19表示存在整数(通常在2至8之间)个的带电荷嵌段(C)，其与附连到扩增连接物的间隔物(B)连接，所述扩增连接物直接地或通过连接物(L)附连到疏水性嵌段。
为清楚起见，在此提供具有式(C-B)y19-K-H的刷形结构的两亲性载体分子的一个非限制性实例，其中y19是4：
Figure BDA0002911415990001411
其中y17是构成带电荷部分(C)的单体的重复单元的整数，通常选自约1至16之间，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16；y18是构成间隔物的单体的重复单元的整数，通常在约4至约200之间；并且，如该实施例中所示，基于肽的带电荷部分(C)的N端氨基酸的胺是游离胺的形式或例如被酰基封端。
肽抗原偶联物与两亲性载体分子的摩尔比的选择
一个显著且出乎意料的发现是，即使存在高摩尔过量的肽抗原偶联物，广泛范围的不同两亲性载体分子的结构和组成也能够导致稳定的纳米粒子形成。
通常，发现当仅悬浮在水性缓冲剂中时形成稳定纳米粒子胶束的两亲性载体分子容许约4倍摩尔过量的肽抗原偶联物与两亲性载体分子，即肽抗原偶联物摩尔数与两亲性载体分子的摩尔数为约1至4的摩尔比，例如约1.1、1.2、1.3、1.4.、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9至约4.0。但是，发现两亲性载体分子容许过量肽抗原偶联物的能力取决于几个因素，包括两亲性载体分子的净电荷、结构和组成。
通常发现式C-[B]-[L]-H、H-[L]-[B]-C、C-[B1]-[A']-[B2]-[L]-H和H-[L]-[B1]-[A']-[B2]-C的线性两亲性载体分子(具有由氨基酸构成并具有大于+6或小于-6的净电荷的带电荷部分)容许高达4倍摩尔过量的肽抗原偶联物。
带有含胺的氨基酸的肽序列的改进的可制造性
本发明人出乎意料地观察到，肽抗原偶联物富集包含胺的氨基酸例如赖氨酸和精氨酸(具有胍基)导致可制造性的提高，否则难以制造基于肽的疏水性嵌段、肽抗原片段和肽抗原偶联物。
当肽序列中富集带有羧酸的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)或带有羟基的氨基酸(例如丝氨酸、酪氨酸和苏氨酸)，并且肽确实富集某些疏水性氨基酸，特别是脂族氨基酸，例如亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸时，没有观察到这种改进，甚至降低了可制造性。这些发现的非约束性解释是，胺和胍基(在带有保护基时)在固相肽合成期间允许足够的溶解性和链增长，并且(在切割和脱保护后)促进了在肽纯化和处理中通常使用的水和水混溶性有机溶剂(包括DMSO、DMF、乙腈、甲醇和乙醇)中的溶解性。此外，由于通常将酸(例如甲酸、乙酸和三氟乙酸)添加到HPLC溶剂中，因此带有胺的氨基酸也有助于在纯化期间溶解肽，甚至可以改善峰形以帮助纯化。
因此，在某些实施方式中，肽抗原片段、肽抗原偶联物和/或疏水性嵌段是用一种或多种带有胺官能团的氨基酸合成的。在肽抗原片段的某些实施方式中，肽抗原片段包含一个或多个带有胺官能团的氨基酸。本文报道的出乎意料的发现是，尽管某些肽抗原不能作为天然序列制造，即，在天然肽抗原序列的两侧没有任何氨基酸残基，但可制造作为带有一个或多个，通常1至30个之间，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个带有胺官能团的氨基酸的肽抗原片段和肽抗原偶联物合成的那些相同的肽抗原。
因此，在一些优选的实施方式中，肽抗原片段具有式[C]-[B1]-A-[B2]-X1、[B1]-A-[B2]-X1([C])、X1-[B1]-A-[B2]-[C]或X1([C])-[B1]-A-[B2]，其中C是带电荷部分，B1是N端延长部，A是肽抗原，B2是C端延长部，[]表示所述基团是任选的，并且X1是包含第一反应性官能团的连接物前体，并且[C]、[B1]和/或[B2]包含带有胺官能团的氨基酸。在这样的实施方式中，可以基于氨基酸与带电荷部分和疏水性嵌段的接近性来选择带有胺官能团的氨基酸的组成。
对于安置在带电荷部分处或近端的带有胺官能团的氨基酸，氨基酸(当存在于肽中时)在生理pH下应为水溶性的。合适的氨基酸包括但不限于包含低级烷基胺或胍的那些。为清楚起见，此处显示了非限制性实例：
其中，R10通常选自
Figure BDA0002911415990001441
Figure BDA0002911415990001442
其中X是任何连接物并且a是任何整数，但通常是1至6之间的整数。在优选的实施方式中，带有低级烷基胺的氨基酸是赖氨酸。
在一些实施方式中，式C-[B1]-A-[B2]-X1或X1-[B1]-A-[B2]-C的肽抗原片段或式C-[B1]-A-[B2]-[L]-H或H-[L]-[B1]-A-[B2]-C的肽抗原偶联物包括带电荷部分，所述带电荷部分包含带有胺官能团的亲水性氨基酸，例如带有低级烷基胺或胍的氨基酸。在其他实施方式中，式[C]-B1-A-[B2]-X1或X1-[B1]-A-B2-[C]的肽抗原片段或式[C]-B1-A-[B2]-[L]-H或H-[L]-[B1]-A-B2-[C]的肽抗原偶联物分别包括N端或C端延长部，其包含带有胺官能团的氨基酸，例如带有低级烷基胺或胍的氨基酸。在其他实施方式中，式C-B1-A-[B2]-X1或X1-[B1]-A-B2-C的肽抗原片段或式C-B1-A-[B2]-[L]-H或H-[L]-[B1]-A-B2-C的肽抗原偶联物分别包括带电荷部分和N端或C端延长部，其包含带有胺官能团的氨基酸，例如带有低级烷基胺或胍的氨基酸。
在肽抗原片段和肽抗原偶联物中并入带有胺官能团的氨基酸，例如带有低级烷基胺或胍的氨基酸，例如赖氨酸或精氨酸，出乎意料地改进了可制造性。非约束性的解释包括胺官能团促进溶解性以及反相HPLC纯化期间的纯化。
在疏水性嵌段处或附近安置带有芳基胺的氨基酸
包含低级烷基胺或胍的氨基酸在生理pH(～pH 7.4)下带有正电荷，其有助于提高在生理pH下或接近生理pH下在水溶液中的溶解性，但是当氨基酸位于疏水性嵌段(H)处或附近时，这些特性(即在生理pH下的溶解性)可能不理想。因此，本公开的发明人试图解决的当前挑战是，需要改进基于肽的疏水性嵌段、肽抗原片段和肽抗原偶联物的可制造性，而不会不利地影响基于这些材料的两亲性物质在生理pH附近的水溶液中形成稳定粒子的能力。
认识到这一挑战，本公开的发明人介绍了两种新颖的方法，以利用在疏水性嵌段处或附近并入带有胺官能团的氨基酸的益处，而不会不利地影响疏水性嵌段(H)的疏水特性或通过本文所述的两亲性肽抗原偶联物来破坏粒子形成。一种方法是在制造期间将烷基胺引入基于肽的疏水性嵌段中，但是在将这些疏水性嵌段并入肽抗原偶联物中之前将烷基胺基团封端(例如酰化)。另一种方法是将带有芳基胺的氨基酸并入肽序列(例如基于肽的疏水性嵌段、肽抗原片段和肽抗原偶联物)中，所述氨基酸在低于生理pH的pH(例如小于6.5的pH)下带有正电荷，但在生理pH下呈中性(不带电荷)。
本文公开的出乎意料的发现是，与缺乏带有芳基胺官能团的肽相比，在固相肽合成期间将一个或多个氨基酸(例如1至30个之间)带有芳基胺官能团的氨基酸并入肽例如肽抗原片段、基于肽的疏水性嵌段和/或肽抗原偶联物中，导致改进的可制造性。这些发现是出乎意料的，因为通常认为包含芳族基团的氨基酸由于其疏水特征而难以制造。然而，出乎意料的是，如本文所报道的，将具有芳族胺(芳基胺)的氨基酸添加到肽序列导致与如上所述的添加低级烷基胺所观察到的相当的改进的可制造性。
尽管带有芳基胺的氨基酸改进了可制造性，但是这些氨基酸通常在生理pH(～pH7.4)的水性条件下是高度疏水性的。因此，这些氨基酸应安置在疏水性嵌段处或附近，但优选不要安置在肽抗原偶联物的带电荷部分(如果存在的话)处或附近。在优选的实施方式中，带有芳基胺基的氨基酸被安置在疏水性嵌段处或近端以促进粒子组装。合适的疏水性氨基酸包括但不限于包含芳基胺的那些。为清楚起见，此处显示了带有芳基胺的氨基酸(以及具有可质子化氮的合适杂环)的氨基酸的非限制性实例：
其中，R11通常选自
Figure BDA0002911415990001461
Figure BDA0002911415990001462
Figure BDA0002911415990001471
其中X是任何连接物并且a是任何整数，但通常是1至6之间的整数。在优选的实施方式中，被安置在疏水性嵌段(H)处或附近的带有芳基胺的疏水性氨基酸是对氨基-苯丙氨酸。
在一些实施方式中，式[C]-[B1]-A-B2-X1或X1-B1-A-[B2]-[C]的肽抗原片段或式[C]-[B1]-A-B2-[L]-H或H-[L]-B1-A-[B2]-[C]的肽抗原偶联物分别包含C端或N端延长部，其包含一个或多个带有芳基胺基团的疏水性氨基酸。
在一些实施方式中，肽抗原片段具有式C-B1-A-B2-X1，并且C端延长部(B2)包含一个或多个包含芳基胺基团的疏水性氨基酸。
在其他实施方式中，肽抗原片段具有式A-B2-X1，并且C端延长部包含一个或多个带有芳基胺基团的氨基酸。
在一些实施方式中，肽抗原片段具有式X1-B1-A-B2-C，并且N端延长部(B1)包含一个或多个带有芳基胺基团的氨基酸。在其他实施方式中，肽抗原片段具有式X1-B1-A，并且N端延长部包含一个或多个带有芳基胺官能团的氨基酸。
与并入带有芳基胺官能团的氨基酸对肽的可制造性的影响有关的出乎意料的发现，导致开发了基于肽抗原偶联物的新型组合物和制造免疫原性组合物例如疫苗的方法，其中带有N端和/或C端延长部(其包含一个或多个芳基胺)的肽例如肽抗原片段(例如[C]-[B1]-A-[B2]-[X1])是通过固相肽合成生产的，然后与疏水性嵌段例如[X2]-H反应，产生具有式[C]-[B1]-A-[B2]-[L]-H的肽抗原偶联物。出乎意料的是，式[C]-[B1]-A-[B2]-[X1]或X1-[B1]-A-[B2]-C的肽抗原片段例如A-B2-X1和X1-B1-A，以及式[C]-[B1]-A-[B2]-[L]-H或[H]-[B1]-A-[B2]-[C]的肽抗原偶联物例如A-B2-L-H和H-L-B1-A(其包含具有一个或多个带有芳基胺基团的氨基酸的N端或C端延长部)，与不具有芳基胺的仅肽抗原或肽抗原片段(例如[C]-[B1]-A-[B2]-[X1])和/或肽抗原偶联物(例如[C]-[B1]-A-[B2]-[L]-H)相比，导致改进的可制造性，包括在有机溶剂中的改进的溶解性。
包含带有芳基胺的氨基酸的疏水性嵌段(H)
基于出乎意料的发现，即，并入一个或多个带有胺官能团的氨基酸导致肽例如肽抗原片段和肽抗原偶联物的制造得以改进，本公开的发明人开发了一种新的策略，其中在固相肽合成期间将一个或多个(通常3至30个之间)的包含芳基胺的氨基酸并入树脂上式[C]-[B1]-A-[B2]-[L]-H或H-[L]-[B1]-A-[B2]-[C]的肽抗原偶联物的疏水性嵌段中。虽然发现具有疏水性嵌段(H)(基于常规使用的亲脂性分子，例如脂肪酸、脂质或由具有脂族侧链的氨基酸或不含胺的芳族基团构成的肽)的式[C]-[B1]-A-[B2]-[L]-H或H-[L]-[B1]-A-[B2]-[C]的肽抗原偶联物的合成难以合成和/或纯化，但出乎意料地发现在固相合成期间在树脂上并入疏水性嵌段(其包含一个或多个带有芳族胺的氨基酸)，导致肽抗原偶联物的合成改善。重要的是，还发现具有包含一个或多个、通常3至30个带有芳基胺的氨基酸的疏水性嵌段(H)的式[C]-[B1]-A-[B2]-[L]-H或H-[L]-[B1]-A-[B2]-[C]的肽抗原偶联物在悬浮于水性缓冲剂中时可靠地组装成粒子，这是由于带有芳基胺基团的氨基酸的疏水特性。
历史上，由于合成期间的低偶联效率和/或使纯化复杂化的有限的溶解性，高疏水性肽序列的制造一直是具有挑战性的。重要的是，前述结果突出了出乎意料的发现，即可以通过使用带有芳基胺基团的氨基酸来克服这一挑战，所述氨基酸改善了在水混溶性有机溶剂中的制造和溶解性，但在生理pH(即pH 7.4)附近的水性条件下具有足够的疏水性，以致在用作两亲性化合物内的疏水性部分时，保留了驱动粒子形成所需的疏水特征。
在一些实施方式中，在树脂上产生的式[C]-[B1]-A-[B2]-[L]-H或H-[L]-[B1]-A-[B2]-[C]的肽抗原偶联物是使用包含一个或多个、通常3至30个带有芳基胺基团的疏水性氨基酸的疏水性嵌段来合成的。
在其他实施方式中，式[C]-[B1]-A-B2-[L]-H或H-[L]-B1-A-[B2]-[C]的肽抗原偶联物分别包含C端或N端延长部，以及包含带有芳基胺官能团的氨基酸的疏水性嵌段。
在其他实施方式中，使带有X2连接物前体并且包含一个或多个、通常3至30个带有芳基胺基团的疏水性氨基酸的疏水性嵌段在溶液相中分别与[C]-[B1]-A-[B2]-X1或X1-[B1]-A-[B2]-[C]的肽抗原片段反应，产生式[C]-[B1]-A-[B2]-L-H和H-L-[B1]-A-[B2]-[C]的肽抗原偶联物。
缺少带电荷部分(例如A-B2-[L]-H和H-[L]-B1-A)并且分别在C端和N端延长部处包含一个或多个带有芳基胺的氨基酸的肽抗原偶联物是高度疏水性的，并且在免疫原性组合物的优选实施方式中，通常与两亲性载体分子例如带电荷的两亲性载体分子组合，所述两亲性载体分子用于将肽抗原偶联物溶解在水溶液(例如水性缓冲剂)中，并促进肽抗原偶联物并入胶束中。
在包含肽抗原偶联物的纳米粒子胶束的免疫原性组合物的一些实施方式的制备中(所述肽抗原偶联物缺乏带电荷部分，例如A-B2-[L]-H和H-[L]-B1-A，并且在C端和/或N端延长部处包含一个或多个带有芳基胺的氨基酸)，将这些肽抗原偶联物悬浮在水混溶性有机溶剂(例如DMSO、DMF、乙醇或丙酮)中，并与带电荷的两亲性载体分子(例如，式C-[B]-[L]-H或C-[B1]-A'-[B2]-[L]-H的带电荷的两亲性载体分子)混合以形成混合物，将所述混合物用水溶液稀释以产生由肽抗原偶联物例如A-B2-[L]-H或H-[L]-B1-A和带电荷的两亲性载体分子例如C-[B]-[L]-H或C-[B1]-A'-[B2]-[L]-H构成的纳米粒子胶束的水溶液。
为清楚起见，此处提供纳米粒子胶束的免疫原性组合物的非限制性实例，所述纳米粒子胶束包含带电荷的两亲性载体分子和式A-B2-L-H的肽抗原偶联物，其中一个或多个带有芳基胺的氨基酸存在于C端延长部(B2)中：
Figure BDA0002911415990001501
其中a是任何整数，通常在约1至10之间；y17是构成带电荷部分(C)的单体的重复单元的整数，通常选自约1至16之间，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16；y18是构成两亲性载体分子的间隔基团(B)的单体的重复单元的整数，通常在约4至约200之间；并且，基于肽的带电荷部分的N端氨基酸的胺是游离胺的形式或例如被酰基封端。
带有芳基胺的氨基酸数目的选择
带有芳基胺的氨基酸数目的选择取决于这些氨基酸是位于延长部序列上还是位于疏水性嵌段上。将带有芳基胺的氨基酸并入到肽抗原片段的连接物前体(X1)近端的延长部(B1或B2)上，或并入到肽抗原偶联物的连接物(L)或疏水性嵌段(H)近端的延长部(B1或B2)上，应具有足够高的数目，以提高肽序列在水混溶性有机溶剂中的溶解性。出乎意料的是，本公开的发明人发现1至10个之间，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9和10个带有芳基胺基团的氨基酸足以改进肽抗原片段和肽抗原偶联物的可制造性和溶解性。因此，在具有包含带有芳基胺的氨基酸的N端或C端延长部的肽抗原片段和肽抗原偶联物的优选实施方式中，带有芳基胺的氨基酸的数目通常选择为1至10之间，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9和10个带有芳基胺的氨基酸。
带有芳基胺的氨基酸的具体数目的选择部分地取决于整个肽序列的长度。为了合成具有总共10至50个氨基酸的式[C]-[B1]-A-B2-X1或X1-B1-A-[B2]-[C]的肽抗原片段，通常将带有芳基胺基团的氨基酸分别安置在B2或B1位置处，并且通常是1至6之间的整数。
将带有芳基胺的氨基酸并入基于肽的疏水性嵌段(H)，当疏水性嵌段单独生产或作为肽抗原偶联物在树脂上生产时，应具有足够高的数目以提高肽序列在水混溶性有机溶剂中的溶解性；和/或当用作疏水性嵌段的主要和/或多数单体单元时，当存在于肽抗原偶联物或两亲性载体分子例如S-[B]-[L]-H上时，应具有足够高的数目以驱动粒子组装，其中S是增溶基团，其可以包含带电荷部分，例如C-[B]-[L]-H。
出乎意料的是，本公开的发明人发现，1至10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9和10个带有芳基胺基团的氨基酸足以改进基于肽的疏水性嵌段和肽抗原偶联物的可制造性和溶解性，但是当这些氨基酸是疏水性嵌段中的主要和/或多数单体单元时，3至30个，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个所述氨基酸是优选的。因此，在优选的实施方式中，并入在树脂上产生的基于肽的疏水性嵌段中的带有芳基胺的氨基酸的数目通常选择为3至30之间。但是，值得注意的是，包含超过30个氨基酸，通常超过50个氨基酸的基于肽的疏水性嵌段(H)优选通过汇集组装由固相肽合成产生的两种或更多种肽来制备，或通过替代途径，例如通过开环聚合来制备。
免疫原性组合物
本文公开的肽抗原偶联物可以用于免疫原性组合物中以治疗肿瘤、感染性疾病、自身免疫或过敏症。
肽抗原偶联物可以单独使用或与其他疗法组合使用。为了治疗癌症，可以在治疗外科手术、放射疗法或化学疗法之前、期间或之后使用由肽抗原偶联物构成的免疫原性组合物。在优选的实施方式中，包含肽抗原偶联物的免疫原性组合物与免疫调节剂例如细胞因子(例如IL-2)、抗肿瘤抗体、检查点抑制剂(例如抗PD1)抗体或者逆转免疫抑制、直接地杀死肿瘤细胞或增强针对肿瘤的免疫应答的其他小分子或生物制剂组合使用。本文公开的肽抗原偶联物也可以用于异源初免-加强免疫接种中，例如用肽抗原偶联物进行的初免或加强，以及用异源疫苗例如病毒载体进行的初免或加强。
本文公开的免疫原性组合物可以配制成被制备用于向受试者施用的药物组合物，并且其包括治疗有效量的一种或多种如本文所述的免疫原。所公开的化合物的治疗有效量将取决于施用途径，受试者的物种和所治疗受试者的身体特征。可以考虑的特定因素包括疾病严重程度和阶段、体重、饮食和同时用药。这些因素与确定所公开化合物的治疗有效量的关系是本领域技术人员所理解的。
供施用于受试者的免疫原性组合物可以是药物组合物，并且除了所选择的分子之外，还可以包括至少一种其他药学上可接受的添加剂，例如载体、增稠剂、稀释剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂等。免疫原性组合物还可以包含一种或多种另外的活性成分，例如抗微生物剂、麻醉剂等。用于这些制剂的药学上可接受的载体是常规的。E.W.Martin,雷明顿药学(Remington's Pharmaceutical Sciences),Mack Publishing Co.,Easton,PA,第19版(1995)描述了适用于本文公开的化合物的药物递送的组合物和制剂。
通常，载体的性质将取决于所采用的特定施用模式。例如，肠胃外制剂通常含有注射液，其包括药学上和生理学上可接受的流体例如水、生理盐水、平衡盐溶液、水性右旋糖、甘油等作为媒介物。除生物中性载体外，待施用的药物组合物可以含有少量的无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如乙酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
为了配制免疫原性组合物，可以将所公开的纳米粒子组分或含有所公开的纳米粒子组分的溶液与各种药学上可接受的添加剂以及用于分散纳米粒子的碱或媒介物组合。期望的添加剂包括但不限于pH控制剂，例如精氨酸、氢氧化钠、甘氨酸、盐酸、柠檬酸等。另外，可以包括局部麻醉剂(例如苯甲醇)、等渗剂(例如氯化钠、甘露糖醇、山梨糖醇)、吸附抑制剂(例如Tween 80或Miglyol 812)、溶解性增强剂(例如环糊精及其衍生物)、稳定剂(例如血清白蛋白)和还原剂(例如谷胱甘肽)。佐剂例如氢氧化铝(例如Amphogel，WyethLaboratories,Madison,NJ)、弗氏佐剂、MPLTM(3-O-脱酰化单磷酰脂质A；Corixa,Hamilton,IN)和IL-12(Genetics Institute,Cambridge,MA)以及本领域众所周知的许多其他合适的佐剂可以包括在组合物中。当组合物为液体时，通常将如相对于0.9％(w/v)生理盐水溶液的张力视为1所测量的制剂的张力调节至在施用部位将不会诱导实质性、不可逆转组织损害的值。通常，将溶液的张力调节至约0.3至约3.0，例如约0.5至约2.0，或约0.8至约1.7的值。
本公开的免疫原性组合物通常在制造、储存和使用条件下是无菌和稳定的。无菌溶液可以通过将所需量的化合物与所需的一种或多种本文列举的成分组合并入适当的溶剂中，接着过滤灭菌来制备。通常，通过将化合物和/或其他生物活性剂并入无菌媒介物中来制备分散体，所述无菌媒介物含有基本分散介质和本文列举的所需其他成分。在无菌粉末的情况下，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，其从先前无菌过滤的溶液中产生化合物加上任何其他所需成分的粉末。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，来预防微生物的作用。
本公开还包括试剂盒、包装和多容器单元，其含有本文所述的免疫原性组合物、活性成分和/或用于施用它们的工具，以用于预防和治疗哺乳动物受试者的疾病和其他疾患。在一个实施方式中，这些试剂盒包括含有一种或多种本文所述的免疫原性组合物的容器或制剂。在一个实例中，将免疫原性组合物配制在药物制剂中以递送至受试者。免疫原性组合物任选地包含在散装分配容器或单元或多单位剂型中。可以提供任选的分配工具，例如肺部或鼻内喷雾施用器。包装材料任选地包括标签或说明书，指示与其一起包装的医药剂可用的治疗目的和/或使用方式。
实施例
实施例1-通过悬垂侧链连接到生物活性配体分子(配体)的式II的基于肽的疏水性嵌段的合成
Figure BDA0002911415990001551
基于式II(b)的疏水性嵌段(H)的疏水性嵌段片段
包含生物活性配体分子(“配体”)和连接物前体X2的疏水性嵌段片段(例如上面显示的式II(b)的疏水性嵌段的实例)必须以不破坏配体或连接物前体X2的合成方案来制备。可以通过固相肽合成(SPPS)或氨基酸N-羧酸酐(NCA)的开环聚合来合成基于肽的疏水性嵌段(H)。尽管开环聚合可以在温和的条件下以配体和连接物前体X2的低降解风险进行，但是SPPS相比于开环聚合提供优势，即肽的长度以及单体的分布和组成通过向树脂中可编程地逐步添加氨基酸而在化学上精确限定。
产生基于肽的疏水性嵌段片段有几种不同的途径，包括基于式I和式II的疏水性嵌段(H)的那些。一种途径是通过SPPS执行整个合成(方案1.1，图2)。在方案1.1中，配体分子在偶联之前附连到独立的氨基酸或与树脂上的氨基酸偶联，而连接物前体X2可以在链延长完成后简单地连接到N端位置。然而，配体分子和/或连接物前体X2在肽的脱保护和从固相树脂中切割所需的酸性或碱性条件期间可能不稳定。另外，配体分子在偶联步骤期间可能是反应性的，使得(未保护的)配体不适合在链延长期间包括在肽链上，或者需要保护配体以使这种策略合适。为了避免不希望的反应或分解，在肽从树脂上切割后，可以将配体分子和连接物前体X2中的任一者或两者与肽连接。方案1.2和1.3(图3)描述了部分树脂上偶联，其中连接物前体X2或配体分别与溶液中基于肽的疏水性嵌段(H)偶联。最后，如果连接物前体X2和配体都不适合树脂上偶联，则如方案1.4和1.5(图3)所示，连接物前体X2和配体的偶联都可以在溶液中进行。
在某些实施方式中，将式II的疏水性嵌段(H)与式III的佐剂(咪唑并喹啉TLR-7/8a，称为“TLR-7/8a”)和包含可点击基团(例如DBCO)的连接物前体X2连接。由于TLR-7/8a含有在SPPS所用的偶联条件下具有反应性的芳基胺，并且由于我们出乎意料地发现，DBCO分子在高碱性(20％哌啶/DMF)和酸性条件(>30％TFA/DCM)下不稳定，因此优选使用方案1.4和1.5生产这样的疏水性嵌段片段，其中在肽从树脂上切割后，发生TLR-7/8a和DBCO分子的偶联(图4和图5)。
实施例2-肽抗原偶联物的合成
通过应变促进的叠氮化物-炔烃环加成的偶联
合成肽抗原偶联物的优选途径是通过汇集合成，其中产生包含抗原(A)和含有“可点击基团”的连接物前体(X1)以及任选地C、B1和B2的肽抗原片段。独立地，在平行方案中，产生了与对连接物前体X1具有反应性的连接物前体(X2)连接的疏水性嵌段(H)。然后，经由X1与X2之间的形成连接物(L)的反应将肽抗原片段和疏水性嵌段片段连接在一起。
在一个实例中，肽抗原片段连接物前体(X1)是叠氮基氨基酸，例如在肽抗原片段(C-B1-A-B2-X1)的C端位置处的叠氮基赖氨酸，并且疏水性嵌段片段(X2-H)上的连接物前体(X2)是DBCO并位于疏水性嵌段(H)的N端处。如图6所示，使肽抗原片段(例如C1-B1-A-B2-X1)和疏水性嵌段片段(X2-H)在室温下在DMSO中以1:1.2的摩尔比反应，并且这些条件导致肽抗原片段完全转化为肽抗原偶联物(C-B1-A-B2-L-H)，这是由使用过量的疏水性嵌段片段驱动的(图7)。重要的是，使用不同长度的肽抗原片段(C-B1-A-B2-X1)以及疏水性嵌段(H)的不同组成，观察到相似的反应动力学(图8)，表明肽抗原片段与疏水性嵌段(H)的无铜点击化学偶联生成肽抗原偶联物是一种稳定且可靠的反应。
反应动力学
由于个性化癌症疫苗需要快速制造，因此增加形成肽抗原偶联物的反应速率是有益的。通过增加反应温度和/或增加试剂浓度，以及通过使用催化剂、伴侣分子或通过鉴定最佳的溶剂和盐浓度(如较大的大分子的情况)，可以增加反应动力学。
然而，事先不知道增加反应温度将如何影响肽抗原片段、疏水性嵌段片段或所得肽抗原偶联物的稳定性。我们的结果表明，将反应温度提高到55℃会使反应半衰期降低约3倍，而不会产生副产物或起始原料分解(图9和图10)。通过增加起始原料的浓度，可以观察到类似的反应动力学改进(图10)。如图10B所示，在所测试的各种肽抗原片段范围内，反应半衰期随着反应物浓度和反应温度的升高而缩短，表明这些结果广泛适用于肽抗原偶联物的合成。
过量的疏水性嵌段(H)对粒子稳定性和体内活性的影响
当将肽抗原片段与疏水性嵌段片段偶联时，使用摩尔过量(0-20％)的疏水性嵌段片段以实现最大的(接近100％)肽转化。过量的(即未反应的)疏水性嵌段片段的除去可以通过色谱分离或使用可以选择性除去未反应的DBCO改性的疏水性嵌段片段的清除剂来实现。然而，这些纯化步骤可以降低总的肽抗原偶联物的产率并显著增加制造成本和时间。
尽管放弃昂贵且费时的除去未反应的疏水性嵌段片段的纯化步骤会更加有效，但尚不清楚过量的疏水性嵌段片段如何影响包含肽抗原偶联物、任何未反应的疏水性嵌段片段(有时称为未反应的疏水性嵌段)和药学上可接受的有机溶剂的产物溶液的流体动力学行为(即粒度，其定义为通过DLS测量的平均流体动力学直径，和稳定性)或免疫原性。实际上，粒度影响粒子在体内的药代动力学和生物分布。因此，重要的是控制由肽抗原偶联物形成的粒子的尺寸并确保在肽抗原偶联物的不同组合物之间的一致的尺寸分布。
为了评估过量的(即未反应的)疏水性嵌段片段如何影响粒度和体内活性，我们合成了肽抗原片段长度不同的两种不同的肽抗原偶联物，并将各自的反应混合物(即产物溶液)分为相等体积的两部分(图11)。立即将一部分重悬于PBS中，以提供肽抗原偶联物粒子的水性混合物并用于粒度和体内测试，并且另一部分通过HPLC纯化以除去过量的(即未反应的)疏水性嵌段(H)并且然后冻干以产生冻干纯化肽抗原偶联物，将所述冻干纯化肽抗原偶联物重悬于PBS中并且然后评估粒度和体内活性。含有高达20％的游离疏水性嵌段的粗偶联产物(产物溶液)和HPLC纯化物质(冻干纯化肽抗原偶联物)两者导致在水性缓冲剂中形成了具有类似尺寸的纳米级粒子(肽抗原偶联物粒子的水溶液)(图11B)，表明过量的疏水性嵌段片段对水性缓冲剂中由肽抗原偶联物粒子形成的粒子的尺寸影响极小。重要的是，由HPLC纯化肽抗原偶联物和粗反应混合物(产物溶液)的水性混合物两者诱导的免疫应答导致CD8 T细胞应答的类似量值，其与未处理动物相比具有统计学显著性，表明过量疏水性嵌段片段对肽抗原偶联物的体内活性具有极小的影响。
为了扩展我们的发现，我们评估了过量的(未反应的)疏水性嵌段片段的极值如何影响由肽抗原偶联物形成的粒子的尺寸和稳定性(图12)。我们使肽抗原片段(C-B1-A-B2-X1，其中X1＝叠氮基赖氨酸)与不同摩尔比的疏水性嵌段片段(DBCO-2B3W2，有时称为“疏水性嵌段(H)”)反应，肽抗原片段与疏水性嵌段片段的摩尔比在1:0.94至1:9.37摩尔比的范围内(图12A)。出乎意料的是，包含式V的肽抗原偶联物的产物溶液形成稳定的纳米粒子胶束，其疏水性嵌段片段高达约3倍过量(图12B)，而对通过包含高达10倍过量的未反应的疏水性嵌段片段的产物溶液形成的纳米粒子胶束的尺寸和稳定性的影响极小。这些结果表明，过量的疏水性嵌段片段可能被包封在由肽抗原偶联物在水溶液中形成的胶束纳米粒子结构内。因此，由肽抗原偶联物形成的胶束的流体动力学稳定性提供了一种手段来溶解未反应的疏水性嵌段片段以及可能的其他疏水性药物。
这些结果清楚地表明了新的发现，即过量的(即未反应的)疏水性嵌段片段对肽抗原偶联物的粒度、稳定性或体内活性具有有限的影响，这表明没有必要从产物溶液中除去未反应的疏水性嵌段片段。该结论是基于以下两种观测结果得出的：1)对于粗反应混合物(即产物溶液)和HPLC纯化肽抗原偶联物两者(图11B)以及具有广泛范围的未反应疏水性嵌段片段量的肽抗原偶联物的粗反应混合物(产物溶液)(图12)，由肽抗原偶联物在PBS缓冲剂中形成的粒子的流体动力学尺寸相同；和2)对于产物溶液以及HPLC纯化肽抗原偶联物两者，在体内诱导的免疫原性相同(图11C)。这些出乎意料的发现的隐含结论是，在偶联步骤后无需额外纯化，这意味着可以将粗反应混合物(产物溶液)进行进一步使用，例如用于表征、无菌过滤、配制，然后施用于受试者。
实施例3-产物溶液和纯化肽抗原偶联物溶液的表征
评定肽抗原偶联物和疏水性嵌段片段浓度
产物溶液或纯化肽抗原偶联物溶液可以通过UV-Vis光谱法或色谱法进行分析，以确定与肽抗原偶联物和任何未反应的疏水性嵌段片段相关的吸光度或曲线下面积(色谱图中随时间变化的吸光度)。对于包含发色团(例如式III的佐剂，称为咪唑并喹啉TLR-7/8a)的肽抗原偶联物和疏水性嵌段片段，可以使用发色团独特的吸光度来评定发色团所附连的分子的浓度。出乎意料的是，我们报道了通过HPLC和/或UV-Vis光谱法在315至330nm之间进行的吸光度测量可用于评定包含咪唑并喹啉TLR-7/8a的肽抗原偶联物和疏水性嵌段片段的浓度。
此处描述的用于评定溶液中肽抗原偶联物和/或疏水性嵌段含量的方法是基于Beer-Lambert定律关系，所述关系将发色团在特定波长下的吸光度与浓度相关联，如此处所提供：
Figure BDA0002911415990001591
其中C＝浓度；A＝吸光度；l＝路径长度；ε＝消光系数
在溶液中使用UV-Vis光谱法确定肽抗原偶联物以及疏水性嵌段(H)的含量(浓度)依赖于疏水性嵌段上存在这样的基团，所述基团的UV-Vis波长吸光度落在由构成肽抗原偶联物的患者特异性部分的氨基酸所吸收的波长范围(即200-300nm)之外。虽然基于脂质、脂肪酸和胆固醇的疏水性嵌段以及常用的疏水性聚合物例如PLGA和聚(己内酯)不会明显吸收高于300nm的光，但是包含芳族基团的疏水性嵌段，例如包含基于咪唑并喹啉的TLR-7/8a的本文所述的疏水性嵌段，是在高于300nm具有强吸光度的良好发色团，这超出了典型肽的吸光度范围。
目前尚不清楚这种技术是否可用于确定肽抗原偶联物的浓度，以及各肽抗原偶联物是否具有相同的摩尔吸收系数，而与肽抗原(A)序列无关。因此，首先有必要通过产生肽抗原偶联物的“测试集”来验证所述方法，其中肽抗原(A)具有广泛范围的物理化学特性，电荷范围为+6至-6并且亲水性为+2至-2，这代表高达98％的新抗原(表1)，其是使用称为2B3W2的疏水性嵌段产生的。
表1：肽抗原的“测试集”的组成
Figure BDA0002911415990001601
重要的是，具有包含咪唑并喹啉TLR-7/8a的疏水性嵌段例如2B3W2的肽抗原偶联物在325nm处具有强吸光度，这是由于每个AVT01偶联物上连接了三个基于咪唑并喹啉的TLR-7/8a，其落在氨基酸吸收的波长范围(即200-300nm)之外，并且预期使偶联物的摩尔吸收系数(波长>300nm)不依赖于抗原组成。
为了确认由于某些疏水性嵌段(H)在波长>300nm处的吸光度而导致的摩尔消光系数(ε)与任何可能的肽抗原偶联物的潜在新抗原组成无关，根据先前建立的程序合成了肽抗原偶联物的“测试集”，进行HPLC纯化并通过EA和AAA评估含量；(2)然后将每种肽抗原偶联物在DMSO溶液中以已知浓度连续稀释，并通过UV-Vis光谱法(OD 325nm)和UPLC-MS(AUC在325nm)评定325nm处的吸光度，以生成将吸光度与浓度相关联的标准曲线(斜率＝ε)。
重要的是，确定测试集中每种肽抗原偶联物的平均摩尔消光系数(ε)是等效的，这证实了UV-Vis光谱法适合用于确定肽抗原偶联物在溶液中的浓度，所述肽抗原偶联物包含吸收>300nm的疏水性嵌段。
评定肽抗原偶联物在水性缓冲剂中的稳定性
向产物溶液或纯化肽抗原偶联物溶液中添加水性缓冲剂(例如PBS)导致肽抗原偶联物自发组装成稳定的纳米粒子胶束，从而提供肽抗原偶联物粒子的水溶液。虽然可以通过DLS或显微镜检查来评定由肽抗原偶联物形成的粒子的确切尺寸范围，但这些测量并未提供明确的手段来评定肽抗原偶联物在水性缓冲剂中的稳定性(即肽抗原偶联物形成聚集物质的倾向)。由于由肽抗原偶联物形成的纳米粒子胶束太小而无法明显散射可见光，因此可以通过使用浊度测量来评定肽抗原偶联物形成聚集物质的倾向，所述浊度测量是通过评定肽抗原偶联物在不被构成肽抗原偶联物或疏水性嵌段片段的发色团吸收的波长下的吸光度来进行的。因此，所测量的任何吸光度都是由于肽抗原偶联物粒子在水溶液中形成的聚集体而散射的光。本文报道的出乎意料的发现是，通过评定在350至650nm之间的波长处的吸光度而进行的浊度测量提供了灵敏且特异性的方法来确定肽抗原偶联物形成聚集物质的倾向。
实施例4-为多抗原粒子选择抗原的方法
用于肽抗原偶联物混合物的肽抗原偶联物的选择
基于肽抗原偶联物的疫苗，特别是个性化癌症疫苗，将包括多种不同的肽抗原偶联物，其中肽抗原(A)部分是可变的。因此，多种肽抗原偶联物可能需要在同一溶液中一起施用。
不同基础组成的肽抗原偶联物的相互作用可能影响稳定的纳米粒子胶束的形成。然而，出乎意料的是，我们已发现，当共配制为多肽抗原偶联物粒子(有时称为肽抗原偶联物混合物)时，在单独存在时不溶性的单个肽抗原偶联物形成稳定的纳米粒子。因此，肽抗原偶联物的水性混合物(基于肽抗原偶联物混合物)形成多肽抗原偶联物粒子，其克服了某些单个肽抗原偶联物在水性条件下聚集的倾向。
如我们先前在共同待决的申请国际专利申请第PCT/US2018/026145号中所公开的那样，对于式C-B1-A-B2-X1的肽抗原偶联物，由C-B1-部分提供的电荷可以被调节以实现纳米粒子以肽抗原偶联物的水性混合物形式胶束化所需的肽抗原偶联物的净电荷。基于肽抗原(A)部分的基础性质选择C-B1-部分的组成，以使所得肽抗原偶联物例如C-B1-A-B2-L-H将形成稳定的纳米粒子胶束的可能性最大。我们的分析表明，从人类基因组产生的大多数肽抗原都以单个肽抗原偶联物形式形成稳定的纳米粒子胶束(图13)。仍然有大约10％的单个肽抗原偶联物在PBS缓冲剂中聚集(即浊度在490nm处超过>0.05OD，或粒度>200nm)。尽管在这些序列作为独立的肽抗原偶联物起作用时可能会产生不希望的聚集特性，但是当这些偶联物与其他肽抗原偶联物共同配制为肽抗原偶联物混合物时，可以容许这些偶联物形成稳定的胶束，从而形成呈水性混合物形式的多肽抗原偶联物粒子。为了评估在同一肽抗原偶联物粒子中一起递送的具有不同电荷和亲水性的测试抗原A1-A9的不同组合如何影响所得多抗原粒子的尺寸和稳定性，我们评估了代表不同可能场景的7种独特的肽抗原偶联物混合物的组成(图13)。值得注意的是，不管肽抗原偶联物的组成如何，所有混合物都组装成直径在约20-40nm直径之间的纳米粒子胶束。这一新发现表明，肽抗原偶联物以肽抗原偶联物混合物形式递送，所述肽抗原偶联物混合物以水性混合物形式形成多肽抗原偶联物粒子，这可能是确保递送具有广泛范围的物理特性的肽抗原(A)的肽抗原偶联物组装成稳定的纳米粒子胶束的可靠策略。
我们先前已经鉴定了抗原序列，尽管它们是以式C-B1-A-B2-L-H的肽抗原偶联物形式产生的，但是它们不会形成稳定的纳米粒子胶束，而是在水性缓冲剂中作为独立的肽抗原偶联物重构时聚集(所谓的“困难”序列)。我们先前也已经鉴定了式C-B1-A-B2-L-H的肽抗原偶联物序列，当它们分别重构时确实形成了稳定的纳米粒子胶束(所谓的“行为良好”序列)。因此，我们寻求确定在肽抗原偶联物混合物(“多抗原粒子制剂”)中，这种“困难”序列可以与“行为良好”序列混合的程度，以形成稳定的纳米粒子胶束。因此，为了评估多肽抗原偶联物粒子对递送不同组成的肽抗原偶联物的耐受性，我们评估了在向多肽抗原偶联物混合物中添加水性缓冲剂后形成的多肽抗原偶联物粒子的尺寸和稳定性，所述混合物具有多达5种独特的肽抗原偶联物(等摩尔量)，其包含电荷和亲水性不同的肽抗原(A)(图14)。
我们发现，对于含有最多60摩尔％的困难肽抗原偶联物序列的肽抗原偶联物混合物，形成稳定胶束。当该数字上升至80摩尔％时，发生聚集。由于少于10％的肽抗原偶联物是“困难”的(当单独重构时在PBS中聚集)，因此包含4种或更多种肽抗原偶联物的任何5肽抗原偶联物混合物(即5种独特的肽抗原偶联物)具有聚集倾向(“困难的”肽抗原偶联物序列)的可能性为约1/2,000。然后，这些结果提供了出乎意料的发现，即增加肽抗原偶联物混合物中不同肽抗原偶联物的数目可以改善粒子稳定性。因此，我们的结果表明，大于99.95％的并入有5种或更多种独特的肽抗原偶联物的肽抗原偶联物混合物将形成稳定的20-40nm胶束，其作为水性混合物的浊度小于0.05。
因此，为了避免在肽抗原偶联物混合物中包含>60摩尔％的“困难”序列的场景，可以首先单独评定肽抗原偶联物在水性缓冲剂中的浊度和粒度。在受试者要接受20种独特抗原(分为4个池，每个池各由5个独特的肽抗原偶联物组成)的情形下，预期约2个抗原(～10％)将是“困难的”。可以首先通过浊度测量来鉴定这样的“困难”序列，然后有意地将其分成不同的池(例如，每个池1个困难序列)，以避免任何给定池的>60摩尔％由“困难”序列构成。此外，可以基于上述吸光度测量方法精确地等分每种肽抗原偶联物的确切摩尔浓度，以确保所得的肽抗原偶联物混合物包含精确限定比率的每种不同的肽抗原偶联物。
要包括在每个肽抗原偶联物混合物池中的抗原的选择也可以基于预测的MHC结合亲和力。当在同一位点施用多种抗原时，可能会出现“抗原竞争”，即与当抗原作为单一肽抗原偶联物单独施用时相比，当以作为肽抗原偶联物混合物的水性混合物的多抗原粒子形式施用时，对特定抗原的免疫应答(即T细胞应答)的量值降低的现象。
另外，来自该经验数据的机器学习算法可用于改进选择单个肽抗原偶联物以包括在肽抗原偶联物混合物中的方法，作为减轻选择不相容偶联物的可能性的手段，所述不相容偶联物将导致当用水性缓冲剂稀释肽抗原偶联物以形成肽抗原偶联物的水性混合物时，多抗原粒子聚集的倾向。
总之，通过在水性缓冲剂(例如PBS)中重构之前，根据上述选择方法将多种不同的肽抗原偶联物在有机溶剂(例如DMSO)中组合在一起，可以改善式C-B1-A-B2-L-H的抗原子集当在水性缓冲剂中单独重构时未能形成稳定的纳米粒子胶束的假定问题。
实施例5-肽抗原偶联物的无菌过滤和重构
过滤和重构
在施用于患者之前，应对肽抗原偶联物(例如，产物溶液、纯化肽抗原偶联物溶液或肽抗原偶联物混合物)进行无菌过滤，作为确保产品无菌并清除制造期间可能引入的任何颗粒碎片的手段。无菌过滤应发生在最接近患者施用的位置，但也应在可以实施无菌过滤的位置。紧接在患者施用之前，下一个最接近的步骤是通过将肽抗原偶联物悬浮在水性缓冲剂中以获得肽抗原偶联物的水性混合物来形成纳米粒子胶束。为了提供最大确定性的产品无菌性，无菌过滤步骤然后应在将肽抗原偶联物(即产物溶液、纯化肽抗原偶联物溶液或肽抗原偶联物混合物)悬浮于水性介质之前或之后立即进行。
溶剂系统、药物浓度、滤膜组成和过滤技术都会影响无菌过滤后的产物回收率。因此，我们使用两种类型的带PTFE膜的过滤装置(离心过滤管和传统注射器过滤器)在不同溶剂(DMSO和PBS缓冲剂)中以各种浓度的肽抗原偶联物进行无菌过滤后，评估了肽抗原偶联物的回收率。
通过计算无菌过滤之前和之后的肽抗原偶联物的峰面积，使用HPLC确定使用不同过滤方案的肽抗原偶联物的回收率(图15)。我们的结果表明溶剂系统对肽抗原偶联物的回收率有重大影响。因此，当通过注射器过滤器或离心过滤器技术无菌过滤时，浓度高达20mg/mL的DMSO中的肽抗原偶联物显示出大于95％的回收率(图15B)，而水性缓冲剂(即PBS)中的相同肽抗原偶联物表现出约20-40％的物质损失(图15B)。当在同一DMSO溶液中存在多种肽抗原偶联物(作为肽抗原偶联物混合物)时，也观察到高回收效率，因为在同一混合物中对于不同组成的肽抗原偶联物未观察到回收率差异(图16)。这些结果突出了出乎意料的发现，即，对DMSO中的肽抗原偶联物进行无菌过滤始终导致物质的高回收效率，而不论偶联物组合物的浓度和过量的疏水性嵌段片段的百分比如何。此外，尽管离心过滤和注射器过滤都可以回收具有与过滤前相同浓度的肽抗原偶联物的物质，但少量溶液可以保留在注射器过滤器上，这在以低样本体积处理时可能会大大降低回收率。因此，在以低样品体积处理时，离心过滤是优选的。
重要的是，我们的结果告知了何时以及如何进行无菌过滤。我们的结果表明，当肽抗原偶联物在有机溶剂中无菌过滤时，可以实现最佳的肽抗原偶联物回收。因此，在肽抗原偶联物仍存在于有机溶剂(例如DMSO)中时，偶联反应完成后应进行无菌过滤(图17)。可以在单个肽抗原偶联物上进行无菌过滤(图15)，或者可以将多个肽抗原偶联物混合到混合物(例如肽抗原偶联物混合物)中并无菌过滤(图16和图17)。然后可以将肽抗原偶联物的无菌过滤有机溶液(即无菌产物溶液、无菌纯化肽抗原偶联物溶液或无菌肽抗原偶联物混合物)储存、冻干或与PBS混合(图17)。
肽抗原偶联物混合物的过滤和粒子随时间的稳定性
对于肽抗原偶联物混合物的无菌过滤，在含有等质量的7种独特肽抗原偶联物的DMSO溶液的无菌过滤后，显示出高回收率(98％)(图17)。一旦在PBS缓冲剂中重构，所述混合物立即形成纳米级胶束(粒径～15-40nm直径)，其在室温下至少1周对聚集稳定(图18)。因此，在水性缓冲剂中重构之前混合不同的肽抗原偶联物不会对无菌过滤过程或纳米粒子胶束的尺寸和稳定性产生不利影响。
DMSO的使用对粒度、稳定性和体内活性的影响
在有机溶剂(例如DMSO)中对肽抗原偶联物进行无菌过滤后(图17)，可以通过蒸发除去有机溶剂，随后将干粉直接地重悬于水性缓冲剂中，或者可以将药学上可接受的有机溶剂(例如DMSO)中的肽抗原偶联物立即悬浮在水性缓冲剂(例如PBS)中，以获得包含由肽抗原偶联物形成的纳米粒子胶束的肽抗原偶联物的水性混合物。由于溶剂蒸发过程会增加成本和制造时间，因此优选将悬浮在有机溶剂中的肽抗原偶联物与水性缓冲剂混合的后一种方法，但是该过程对纳米粒子组装的影响尚不清楚。实际上，在有机溶剂中由两亲性分子形成纳米粒子胶束的两种常见方法是使用透析或共溶剂蒸发。透析需要专门的设备，并且所述过程通常需要2天或更长时间。相反，共溶剂蒸发涉及将溶解药物的有机溶剂添加到水性缓冲剂中，然后蒸发有机溶剂以使得能够形成纳米粒子胶束。
作为共溶剂蒸发过程的替代方案，我们的方法是简单地用水性缓冲剂稀释DMSO中的无菌肽抗原偶联物混合物(包含多种不同的生产溶液)，以生成肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液，所述粒子组装成纳米粒子胶束。一个出乎意料的发现是，在将水性缓冲剂添加到固体或DMSO溶液形式的肽抗原偶联物中后，立即形成纳米粒子胶束(图19A)。重要的是，发现包含高达溶液的12.5％(v/v)的DMSO的肽抗原偶联物的水性混合物对肽抗原偶联物的粒度或体内活性没有影响(图19A-E)。该数据表明，稳定的纳米粒子胶束是通过简单地在PBS缓冲剂中将来自DMSO溶液的肽抗原偶联物重构而生成的，并且不需要除去有机溶剂即DMSO。因此，该方法提供了一种用于从两亲性化合物例如本文所述的肽抗原偶联物生成纳米粒子胶束的简单且可靠的方法。
另一个考虑因素是有机溶剂中肽抗原偶联物与水性缓冲剂组合的顺序。另一个出乎意料的发现是，为了确保可靠地组装纳米粒子胶束，必须向小体积的在有机溶剂中的肽抗原偶联物(例如产物溶液、纯化肽抗原偶联物溶液或肽抗原偶联物混合物)中添加大体积的水性缓冲剂，而不是向较大体积的水性缓冲剂中添加小体积的在有机溶剂中的肽抗原偶联物。
因此，在一个优选的制造方案中，肽抗原偶联物或肽抗原偶联物混合物是在DMSO中，并且向该溶液中添加较大体积的水性缓冲剂，接着快速混合，以产生稳定的纳米粒子胶束。
实施例6-抗衡离子对在DMSO和水溶液中的溶解性的影响
为了评估抗衡离子对由具有带负电荷官能团的带电荷部分构成的肽抗原片段和肽抗原偶联物的溶解性的影响，评估了不同的抗衡离子对式C-B1-A-B2-X1、Ac-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Leu-Val-Cit-Ala-Gln-Leu-Asn-Asp-Val-Val-Leu-Ser-Pro-Val-Cit-Lys(N3)-NH2的模型肽抗原片段的溶解性的影响，其中Lys(N3)是叠氮基赖氨酸。
构成肽抗原片段Ac-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Leu-Val-Cit-Ala-Gln-Leu-Asn-Asp-Val-Val-Leu-Ser-Pro-Val-Cit-Lys(N3)-NH2的酸的质子，可以使用阳离子交换柱或通过用氢氧化钠中和酸来与钠交换，通过添加氨或有机碱即三乙胺(TEA)、二异丙基乙胺(DIPEA)或三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)来中和质子，并评定所得盐在水和DMSO中的溶解性。
如下文(表2)所示，只有铵盐和Tris盐才能确保肽抗原片段在DMSO、水混溶性溶剂和水中的溶解性。
表2：带电荷部分抗衡离子对溶解性的影响
抗衡离子 溶于水？ 溶于DMSO？
无(质子化) 否 是
钠 是 否
TEA 是 否
DIPEA 是 否
铵 是 是
Tris 是 是
为了评估肽抗原偶联物的Tris盐在免疫原性组合物中的适用性，分别评估了式C-[B1]-A-B2-L-H的两种肽抗原偶联物即Ac-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Val-Cit-Thr-Ala-Pro-Asp-Asn-Leu-Gly-Tyr-Met-Ser-Pro-Val-Cit-Lys(N3-DBCO)-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-NH2和Ac-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Gly-Ile-Pro-Val-His-Leu-Glu-Leu-Ala-Ser-Met-Thr-Asn-Met-Glu-Leu-Met-Ser-Ser-Ile-Val-His-Gln-Gln-Val-Phe-Pro-Thr-Ser-Pro-Val-Cit-Lys(N3-DBCO)-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-NH2(称为Adpgk偶联物和Trp1偶联物)的Tris盐。
为了制备肽抗原偶联物的Tris盐，将每种肽抗原偶联物悬浮在DMSO中，然后将肽抗原偶联物的酸用1.25或2.5当量的Tris中和，然后悬浮在水性缓冲剂(PBS pH 7.4)中，浓度为80或320μM，并评定粒度和稳定性。
值得注意的是，虽然呈Tris盐形式的肽抗原偶联物(具有1.25和2.5当量的Tris)形成稳定的纳米粒子胶束，但质子化形式的肽抗原偶联物在溶液中聚集(图20)。这些结果证实了肽抗原偶联物的Tris盐用于确保在水性缓冲剂中稳定的纳米粒子胶束化的适用性。
为了评估Tris盐用于免疫原性组合物中的适用性，用式C-B1-A-B2-L-H的肽抗原偶联物对小鼠进行疫苗接种，所述肽抗原偶联物包含具有正电荷的带电荷部分，即Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Val-Arg-Gly-Ile-Pro-Val-His-Leu-Glu-Leu-Ala-Ser-Met-Thr-Asn-Met-Glu-Leu-Met-Ser-Ser-Ile-Val-His-Gln-Gln-Val-Phe-Pro-Thr-Ser-Pro-Val-Cit-Lys(N3-DBCO)-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-NH2，或包含具有负电荷的带电荷部分以及由带有芳基胺的氨基酸构成的B2，即Ac-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Val-Cit-Gly-Ile-Pro-Val-His-Leu-Glu-Leu-Ala-Ser-Met-Thr-Asn-Met-Glu-Leu-Met-Ser-Ser-Ile-Val-His-Gln-Gln-Val-Phe-Pro-Thr-Ser-Pro-Val-Cit-Phe(NH2)-Phe(NH2)-Phe(NH2)-Phe(NH2)-Lys(N3-DBCO)-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-NH2，其中Phe(NH2)是对氨基-苯丙氨酸。重要的是，在接受带负电荷的肽抗原偶联物的Tris盐的所有动物中都诱导了CD8 T细胞应答(图21)。
实施例7-疏水性嵌段(H)和两亲性载体分子的合成和表征
不同两亲性载体分子的组合文库通过以下来制备：生成一系列包含带有炔烃的X1连接物前体的疏水性嵌段(H)，并使它们以组合方式与带有连接物前体X2的不同S-B组合物反应，所述连接物前体X2带有叠氮化物基团，以形成式C-B-L-H的两亲性载体分子。疏水性嵌段的合成和所得的式C-B-L-H的带电荷两亲性载体分子的描述如下。
疏水性嵌段的合成
化合物3，DBCO-WWWWW
Figure BDA0002911415990001701
化合物3(称为DBCO-W5、W5或DBCO-(Trp)5)通过以下合成：使137.6mg(0.15mmol，1eq)的通过固相肽合成制备的前体NH2-(Trp)5-NH2与146.1mg的DBCO-NHS(0.057mmol，2.5eq)和14.7mg三乙胺(0.15mmol，1.1eq)在3.0mL DMSO中反应。化合物3在制备型HPLC系统上使用经12分钟52-72％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度在Agilent制备型C18柱(50x100mm，5μm)上纯化。在～10分钟时洗脱产物，并且收集所得级分，冷冻，然后冻干，获得75.1mg(42％收率)的光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末。MS(ESI)对于C74H66N12O7的计算值m/z 1234.52，实测值1235.6(M+H)+。
化合物4，DBCO-(F')5
Figure BDA0002911415990001711
化合物4(称为DBCO-F'5或F'5)通过以下合成：使49.8mg(0.06mmol，1eq)的通过固相肽合成制备的前体NH2-(F')5-NH2与24.5mg的DBCO-TT(0.057mmol，1.0eq)和30.3mg的NaHCO3(0.36mmol，6.0eq)在1.0mL DMF中反应。反应在室温下进行过夜，并且HPLC表明反应在24小时之前完成。化合物4在制备型HPLC系统上使用经10分钟10-30％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度在Agilent制备型C18柱(30x100mm，5μm)上纯化。在～3.4分钟时洗脱产物，并且收集所得的级分，冷冻，然后冻干，获得25.8mg(38.4％收率)的光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末。MS(ESI)对于C64H66N12O7的计算值m/z 1114.52，实测值1116.1(M+H)+。
化合物5，DBCO-2B3W2
Figure BDA0002911415990001712
化合物5(称为DBCO-2B3W2、2B3W2或DBCO-(Glu(2B)3(Trp)2))如PCT/US2018/026145中所述合成，获得光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色粉末。MS(ESI)对于C110H126N24O10的计算值m/z 1943.01，实测值973.0(M/2)+。
化合物6，DBCO-Ahx-(F')5
Figure BDA0002911415990001721
化合物6(称为DBCO-Ahx-F'5或Ahx-F'5)通过以下合成：使400mg(0.4mmol，1eq)的通过固相肽合成制备的前体(6-羟基己酰基)-(F')5-NH2与171.05mg的DBCO-NHS(0.4mmol，1.0eq)和258.1mg的三乙胺(2.55mmol，6.0eq)在3.7mL DMSO中反应。以0.25eq的4个增量添加DBCO-NHS。反应在室温下进行过夜，并且HPLC表明反应在24小时之前完成。化合物6在制备型HPLC系统上使用经12分钟13-43％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度在Agilent制备型C18柱(50x100mm，5μm)上纯化。在～5.7分钟时洗脱产物，并且收集所得级分，冷冻，然后冻干，获得217.0mg(41.5％收率)的光谱纯(在254nm下>95％AUC)的白色/黄色粉末。MS(ESI)对于C70H76N12O9的计算值m/z 1228.59，实测值1228.7(M+H)+。
化合物7，DBCO-Ahx-(F')10
Figure BDA0002911415990001722
化合物7(称为DBCO-Ahx-F'10或Ahx-F'10)通过以下合成：使450mg(0.26mmol，1eq)的通过固相肽合成制备的前体(6-羟基己酰基)-(F')10-NH2与103.4mg的DBCO-NHS(0.26mmol，1.0eq)和286.1mg的三乙胺(2.83mmol，11.0eq)在3.3mL DMSO中反应。以0.25eq的4个增量添加DBCO-NHS。反应在室温下进行过夜，并且HPLC表明反应在24小时之前完成。化合物7在制备型HPLC系统上使用经12分钟15-45％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度在Agilent制备型C18柱(50x100mm，5μm)上纯化。在～5.1分钟时洗脱产物，并且收集所得级分，冷冻，然后冻干，获得265.4mg(50.6％收率)的光谱纯(在254nm下>95％AUC)的红色/铜色粉末。MS(ESI)对于C205H226N42O24的计算值m/z 3659.78，实测值1221.3(M+3H)+。
化合物8，DBCO-Ahx-(F')20
Figure BDA0002911415990001731
化合物8(称为DBCO-Ahx-F'20或Ahx-F'20)通过以下合成：使480mg(0.14mmol，1eq)的通过固相肽合成制备的前体(6-羟基己酰基)-(F')20-NH2与57.3mg的DBCO-NHS(0.14mmol，1.0eq)和302.4mg的三乙胺(2.99mmol，21.0eq)在3.0mL DMSO中反应。以0.25eq的4个增量添加DBCO-NHS。反应在室温下进行过夜，并且HPLC表明反应在24小时之前完成。化合物8在制备型HPLC系统上使用经12分钟13-43％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度在Agilent制备型C18柱(50x100mm，5μm)上纯化。在～5.5分钟时洗脱产物，并且收集所得级分，冷冻，然后冻干，获得106.6mg(20.5％收率)的光谱纯(在254nm下94.4％AUC)的棕色/铜色粉末。MS(ESI)对于C115H126N22O14的计算值m/z 2039.99，实测值1020.5(M+2H)+。
化合物9，DBCO-bis(TT)
Figure BDA0002911415990001741
化合物9(称为DBCO-2-氨基-1,3-双(羧基乙氧基)丙烷(TT)2或DBCO-bis(TT))通过以下合成：使385.6mg(0.74mmol，1当量)的前体DBCO-2-氨基-1,3-双(羧基乙氧基)丙烷与193.4mg的2-噻唑啉-2-硫醇(1.62mmol，2.2eq)和367.5mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(1.92mmol，2.6eq)和4-二甲基氨基吡啶在4.0mL DCM中反应。反应在室温下进行过夜，并且HPLC表明反应在24小时之前完成。产物在Agilent分析型C18柱(4.6x100mm，2.7μm)上于6.8分钟时洗脱。用乙酸乙酯和1M HCl萃取化合物9，并在旋转蒸发仪上干燥，获得317.1mg(59.3％收率)的不纯(在254nm下27.0％AUC)的黄色粉末。MS(ESI)对于C34H36N4O6S4的计算值m/z 724.15，实测值725.3(M+H)+
化合物10，DBCO-bis(Ahx-F'10)
Figure BDA0002911415990001742
化合物10(称为DBCO-2-氨基-1,3-双(羧基乙氧基)丙烷(Ahx-F'10)2或DBCO-bis(Ahx-F'10))通过以下合成：使13.0mg(0.018mmol，1eq)的前体DBCO-2-氨基-1,3-双(羧基乙氧基)丙烷(TT)2、化合物10与314.2mg的通过固相肽合成制备的(6-羟基己酰基)-(F')10-NH2(0.18mmol，10eq)和199.5mg的三乙胺(1.97mmol，11.0eq)在1.8mL DMSO中反应。反应在室温下进行过夜，并且HPLC表明反应在24小时之前完成。化合物10在制备型HPLC系统上使用经14分钟5-25-35％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度在Agilent制备型C18柱(50x100mm，5μm)上纯化。在～9.8分钟时洗脱产物，并且收集所得级分，冷冻，然后冻干，获得19.16mg(26.8％收率)的光谱纯(在254nm下83.4％AUC)的橙色粉末。MS(ESI)对于C220H252N44O30的计算值m/z 3989.95，实测值1330.8(M+3H)+。
化合物11，DBCO-Ahx-W5
Figure BDA0002911415990001751
化合物11(称为DBCO-Ahx-W5)通过以下合成：将14.2mg(0.035mmol，1eq)的前体DBCO-NHS与37.5mg的通过固相肽合成制备的(6-羟基己酰基)-(W)5-NH2(0.035mmol，1eq)和3.93mg的三乙胺(0.039mmol，1.1eq)在0.5mL DMSO中反应。反应在室温下进行过夜，并且HPLC表明反应在24小时之前完成。将化合物11在两次1M HCl和一次H2O中洗脱，获得34.3(71.9％收率)的光谱纯(在254nm下92.6％AUC)的粉红色粉末。MS(ESI)对于C80H76N12O9的计算值m/z 1348.59，实测值1348.4(M+H)+。
化合物12，DBCO-bis(Ahx-W5)
Figure BDA0002911415990001761
化合物12(称为DBCO-2-氨基-1,3-双(羧基乙氧基)丙烷(Ahx-W5)2或DBCO-bis-(Ahx-W5))通过以下合成：使13.0mg(0.018mmol，1eq)的前体DBCO-2-氨基-1,3-双(羧基乙氧基)丙烷(TT)2与41.3mg的通过固相肽合成制备的(6-羟基己酰基)-(W)5-NH2(0.039mmol，2.2eq)和9.1mg的三乙胺(0.09mmol，2.3eq)在0.3mL DMSO中反应。反应在室温下进行过夜，并且HPLC表明反应在24小时之前完成。化合物12在制备型HPLC系统上使用经16分钟15-60-90％乙腈/H2O(0.05％TFA)的梯度在Agilent制备型C18柱(30x100mm，5μm)上纯化。在～12.7分钟时洗脱产物，并且收集所得级分，冷冻，然后冻干，获得12.5mg(30.8％收率)的光谱纯(在254nm下>95％AUC)的粉红色粉末。MS(ESI)对于C150H152N24O20的计算值m/z2609.16，实测值1305.0(M+2H)+。
两亲性载体分子的合成
通过使不同组成的带有连接物前体X1(带有炔烃)的疏水性嵌段与不同组成的带有连接物前体X2(带有叠氮化物)的C-B反应，来制备不同C-B-L-H组成的组合文库。首先将每种前体X1-H和C-B-X2悬浮于DMSO中，浓度大于20mg/mL DMSO，具体取决于特定组合物的溶解性，有时高达100mg/mL DMSO，然后以每1.0摩尔C-B2-X2约1.05摩尔X1-H的摩尔比组合在反应容器中。所述反应在室温下进行，并且对于其中X1包含DBCO基团的组合物，没有任何额外试剂。通过LC-MS监测反应，并在C-B-X2片段完全转化为C-B-L-H后确定反应完成。
该反应方案用于制备不同组成的两亲性载体分子，其特征在于能够以0.5mg/mL的两亲性载体分子的浓度在水性缓冲剂PBS pH 7.4中形成稳定的纳米粒子胶束。根据两亲性载体分子的化学组成和结构，以下总结了这些研究的结果。
线性肽
通过动态光散射对一系列式C-B-L-H的线性两亲性载体的粒度和稳定性进行了评估，其中带电荷部分(C)和间隔物(B)分别包含具有不同疏水性嵌段组成的肽，即聚(赖氨酸)和聚(丝氨酸-共-甘氨酸)。结果表明，纳米粒子胶束化高度依赖于这些组成的净电荷，其中C-B-L-H具有+8的净电荷并且包含至多20个基于Phe(NH2)的疏水性氨基酸的疏水性嵌段，即苯丙氨酸-胺，有时缩写为F'，形成稳定的纳米粒子胶束，而发现净电荷为+4的那些聚集(表3)。
表3：基于肽的线性两亲性载体分子
Figure BDA0002911415990001771
注意：上表中使用了氨基酸的单字母缩写。
线性PEG
通过动态光散射对具有不同的疏水性嵌段组成的一系列式C-B-L-H的线性两亲性载体的粒度和稳定性进行了评估，其中带电荷部分(C)包含肽并且间隔物(B)包含亲水性聚合物即PEG。
与具有基于肽的间隔物的两亲性载体分子所观察到的结果相似，纳米粒子胶束化高度依赖于净电荷，其中C-B-L-H具有+8的净电荷并且包含具有至多20个基于F'的疏水性氨基酸的疏水性嵌段，形成稳定的纳米粒子胶束(表4)。但是，值得注意的是，几种C-B-L-H组成(其中B由24个单体单元环氧乙烷(PEG)构成)形成了具有少至+4净电荷的稳定的纳米粒子胶束，这表明基于亲水性聚合物的间隔基团(B)不需要像具有基于肽的间隔物的两亲性载体分子那样高的电荷。
表4：基于肽和亲水性聚合物的线性两亲性载体分子
Figure BDA0002911415990001781
注意：上表中使用了氨基酸的单字母缩写；并且，上表中的低聚(赖氨酸)序列通过N端连接到PEG间隔物并用酰胺封端。
树枝状带电荷部分，具有线性PEG(圆锥形)
通过动态光散射对具有不同的疏水性嵌段组成的一系列式C-B-L-H的圆锥形两亲性载体的粒度和稳定性进行了评估，其中带电荷部分(C)包含树枝状结构的肽并且间隔物(B)包含亲水性聚合物即PEG。圆锥形结构表现出与基于线性C-B-L-H的两亲性载体分子总体相似的特征，其中B是亲水性聚合物，并且值得注意的是，需要高达+8净电荷才能稳定由20个基于F'的疏水性氨基酸构成的疏水性嵌段(H)(例如Ahx-(F')20)(表5)。
表5：基于肽和亲水性聚合物的圆锥形两亲性载体分子
组成(C-B-L-H)，L＝(Lys(N3-DBCO)) 净电荷 MW 尺寸(直径，nm)
K2K-PEG4-Lys(N3-DBCO)-Ahx-(F')5 4 2033.3 1685
K2K-PEG4-Lys(N3-DBCO)-Ahx-(F')10 4 2843.5 53
K2K-PEG4-Lys(N3-DBCO)-Ahx-(F')20 4 4465.32 2038
K2K-PEG4-Lys(N3-DBCO)-(Ahx-(F')10)2 4 4792.3 2000
K2K-PEG24-Lys(N3-DBCO)-Ahx-(F')5 4 2913.09 3
K2K-PEG24-Lys(N3-DBCO)-Ahx-(F')10 4 3723.29 24
K2K-PEG24-Lys(N3-DBCO)-Ahx-(F')20 4 5345.11 5590
K2K-PEG24-Lys(N3-DBCO)-(Ahx-(F')10)2 4 5672.09 2000
K4K2K-PEG4-Lys(N3-DBCO)-Ahx-(F')5 8 2544.7 532
K4K2K-PEG4-Lys(N3-DBCO)-Ahx-(F')10 8 3354.9 10
K4K2K-PEG4-Lys(N3-DBCO)-Ahx-(F')20 8 4976.72 20
K4K2K-PEG4-Lys(N3-DBCO)-(Ahx-(F')10)2 8 5303.7 67
K4K2K-PEG24-Lys(N3-DBCO)-Ahx-(F')5 8 3425.77 892
K4K2K-PEG24-Lys(N3-DBCO)-Ahx-(F')10 8 4235.97 17
K4K2K-PEG24-Lys(N3-DBCO)-Ahx-(F')20 8 5857.79 32
K4K2K-PEG24-Lys(N3-DBCO)-(Ahx-(F')10)2 8 6184.77 2000
注意：上表中使用了氨基酸的单字母缩写；并且
K2K和K4K2K是分别包含3和7个赖氨酸的赖氨酸树突。为清楚起见，此处显示了K2K的结构(连接到间隔物B)：
Figure BDA0002911415990001801
具有刷形结构的C-B-L-H
最后，通过动态光散射对具有不同的疏水性嵌段组成的一系列式(C-B)y19-K-L-H的刷形两亲性载体的粒度和稳定性进行了评估，其中带电荷部分(C)包含肽，间隔物(B)包含亲水性聚合物即PEG，并且K是对于每一个疏水性嵌段具有4个连接位点的扩增连接物(y19＝4)。
一个惊人的发现是，与其他组成和结构的两亲性载体分子相比，刷形两亲性载体分子需要较少的净电荷来形成稳定的纳米粒子胶束。例如，发现净电荷为+4的具有基于Ahx-(F')20和(Ahx-(F')10)2的疏水性嵌段的线性和圆锥形两亲性载体分子结构形成聚集体，这表明电荷稳定化不足，而式(C-B)y19-K-L-H的刷形结构都形成稳定的纳米粒子胶束，不存在聚集体(表6)。
表6：基于肽和亲水性聚合物的刷形两亲性载体分子
Figure BDA0002911415990001802
Figure BDA0002911415990001811
注意：上表中使用了氨基酸的单字母缩写；并且，上表中的低聚(赖氨酸)序列通过N端连接到PEG间隔物并用酰胺封端。
实施例8-具有烷基胺和芳基胺的肽抗原片段的合成
高疏水性肽抗原(A)的制造可能具有挑战性。然而，如本文所公开的，将胺并入肽序列可以改进可制造性。因此，为了改进肽抗原(A)的可制造性，将带有胺和/或胍官能团的氨基酸置于带电荷部分(C)和/或带电荷部分近端的延长部上，并评估可制造性和易于操作性(例如在常用溶剂中的溶解性)。
具有制造挑战性的天然肽抗原(A)(参见表7，第二行)被生产为具有不同长度的带有赖氨酸的带电荷部分(C)的式C-B1-A-B2-X1的肽抗原片段(表7，第3至5行)。值得注意的是，具有多个赖氨酸残基而不是天然抗原的肽抗原片段是可制造的。
表7：胺对肽抗原可制造性的影响
肽抗原片段(C-B1-A-B2-X1)，K'＝Lys(N3) 确认的MW 成功合成
QGTDVVIAIFIILAMSFVPASFVVF(仅抗原) -- 否
KKKKKKK-VR-QGTDVVIAIFIILAMSFVPASFVVF-SPVZ-K' 4431.01 是
KKKKKKKKK-VR-QGTDVVIAIFIILAMSFVPASFVVF-SPVZ-K' 4687.75 是
KKKKKKKKKK-VR-QGTDVVIAIFIILAMSFVPASFVVF-SPVZ-K' 4815.95 是
注意：上表中使用了氨基酸的单字母缩写。
类似地，如果不并入赖氨酸、对氨基-苯丙氨酸或组氨酸残基，则不能制造包含高度疏水性肽抗原(A)的肽抗原片段(表8)，这表明包含具有可质子化氮的胺、芳基胺和/或杂环(例如咪唑、喹啉等)的肽抗原片段有利于制造，这可能是通过提高合成和纯化期间的溶解性。
表8：胺对肽抗原片段的可制造性的影响
肽抗原片段([C]-[B1]-A-B2-X1)，K'＝Lys(N3) 确认的MW 成功合成
VVIAIFIILV-ZK' -- 否
VVIAIFIIL-SPVZ-K' -- 否
KKKKKK-SLVR-VVIAIFIIL-SPVZ-K' 2818.29 是
VVIAIFIIL-SPVZF'F'F'F'F'F'F'F'-K' 2243.17 是
VVIAIFIIL-SPVZHHHH-K' 2142.56 是
注意：上表中使用了氨基酸的单字母缩写。
为了扩展这些发现，合成了一系列包含胺、芳基胺、胍和/或氮杂环(例如咪唑、喹啉等)的不同肽抗原片段，以评估可制造性和用于免疫原性组合物的适用性。表9显示了该数据的子集。
表9：带有具有可质子化氮的芳基胺和芳族杂环的肽抗原片段的实例
Figure BDA0002911415990001821
注意：上表中使用了氨基酸的单字母缩写。
实施例9-包含胺和/或芳基胺的疏水性嵌段
为了扩展上述发现，评估了并入具有胺和/或芳基胺的氨基酸对疏水性嵌段(H)的合成的影响。
如表10所示，并入带有胺而不是羧酸的氨基酸(例如谷氨酸)导致疏水性嵌段例如基于聚(Trp)的疏水性嵌段的可制造性提高。
表10：包含烷基胺的疏水性嵌段
疏水性嵌段前体 确认的MW 成功合成
Fmoc-WWWWWEWWWW -- 否
Fmoc-WWEWWWWEWW -- 否
Fmoc-EWEWEEWEWE 1758.80 是
Fmoc-WWWWWKWWWW 1821.10 是
Fmoc-WWKWWWWKWW 1985.30 是
Fmoc-KWKWKKWKWK 1753.15 是
Fmoc-WWWWWKWWWWW 2007.30 是
Fmoc-KWWKWWKWWKWWKWWK 2870.42 是
注意：上表中使用了氨基酸的单字母缩写。
类似地，发现并入带有芳基胺的氨基酸可以改进疏水性嵌段例如基于聚(Trp)的疏水性嵌段的可制造性(表11)。值得注意的是，与由两种不同氨基酸组成的嵌段构成的疏水性嵌段相比，穿插入带有芳基胺的氨基酸导致改进的可制造性(参见表11，第5和6行)。
表11：包含芳基胺的疏水性嵌段
疏水性嵌段，F'＝氨基苯丙氨酸 确认的MW 成功合成
WWWWWWWWWW -- 否
F'F'F'F'F' 827.90 是
F'F'F'F'F'F'F'F'F'F' 1638.76 是
WWWWWWWWWWF'F'F'F'F'F'F'F'F'F' -- 否
WF'WF'WF'WF'WF'WF'WF'WF'WF'WF' 3500.86 是
F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F' 3260.50 是
F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F'F' 4882.25 是
实施例10-基于包含芳基胺的肽抗原片段的免疫原性组合物
为了评估基于包含芳基胺的肽抗原片段的免疫原性组合物的适用性，用式C-B1-A-B2-L-H的肽抗原偶联物对小鼠进行疫苗接种，所述肽抗原偶联物包含具有正电荷的带电荷部分，即Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Val-Arg-Asp-Phe-Thr-Gly-Ser-Asn-Gly-Asp-Pro-Ser-Ser-Pro-Try-Ser-Leu-His-Tyr-Leu-Ser-Pro-Thr-Gly-Val-Asn-Glu-Tyr-Ser-Pro-Val-Cit-Lys(N3-DBCO)-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-NH2，或包含具有负电荷的带电荷部分和由带有芳基胺的氨基酸构成的B2，即Ac-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Val-Cit-Asp-Phe-Thr-Gly-Ser-Asn-Gly-Asp-Pro-Ser-Ser-Pro-Try-Ser-Leu-His-Tyr-Leu-Ser-Pro-Thr-Gly-Val-Asn-Glu-Tyr-Ser-Pro-Val-Cit-Phe(NH2)-Phe(NH2)-Phe(NH2)-Phe(NH2)-Lys(N3-DBCO)-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-NH2，其中Phe(NH2)是对氨基-苯丙氨酸。重要的是，在所有接受带负电荷的肽抗原偶联物的tris盐的动物中都诱导了CD8 T细胞应答(图22)。电荷修饰肽被制成具有四个对氨基-苯丙氨酸氨基酸作为C端延长部(B2)的一部分，以提高纯化期间肽的溶解性。在所有接种疫苗的动物中都检测到CD8 T细胞应答。
实施例11-基于两亲性载体分子的免疫原性组合物
为了评估由肽抗原偶联物和两亲性载体分子构成的免疫原性组合物的适用性，下面评估并描述两种两亲性载体分子策略。
一种方法是形成基于式A-B2-L-H的肽抗原偶联物与式C-L-H的带电荷两亲性载体分子的组合的镶嵌粒子。简而言之，式A-L-H的肽抗原偶联物即Gly-Ile-Pro-Val-His-Leu-Glu-Leu-Ala-Ser-Met-Thr-Asn-Met-Glu-Leu-Met-Ser-Ser-Ile-Val-His-Gln-Gln-Val-Phe-Pro-Thr-Lys(N3-DBCO)-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-NH2与Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys(N3-DBCO)-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-NH2以等摩尔比混合在DMSO溶液中，然后悬浮在PBS中至浓度为80μM。
第二种方法是形成基于式A-B2-L-H的肽抗原偶联物与式C-B1-A'-B2-L-H的带电荷两亲性载体分子的组合的镶嵌粒子，其中A'是保守抗原，或者在这种特定情况下是辅助表位。式A-L-H的肽抗原偶联物即Gly-Ile-Pro-Val-His-Leu-Glu-Leu-Ala-Ser-Met-Thr-Asn-Met-Glu-Leu-Met-Ser-Ser-Ile-Val-His-Gln-Gln-Val-Phe-Pro-Thr-Lys(N3-DBCO)-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-NH2与式C-B1-A'-B2-L-H的两亲性载体分子即Lys-Lys-Lys-Ser-Leu-Val-Ar-Ala-Lys-Phe-Val-Ala-Ala-Trp-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-Ala-Ser-Pro-Val-Cit-(N3-DBCO)-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-Trp-Glu(2B)-NH2以等摩尔比混合在DMSO溶液中，然后悬浮在PBS中至浓度为80μM。
在第0天和第14天用两种免疫原性组合物和CD8 T细胞对小鼠进行疫苗接种，并在第21天评定CD8 T细胞应答(图23)。重要的是，由不具有带电荷部分的肽抗原偶联物和带电荷的两亲性载体分子构成的免疫原性组合物可导致高量值的CD8 T细胞应答(图23)。
序列
本文公开了以下氨基酸序列。
Ser-Pro-Leu-Arg(SEQ ID NO:1)
Gly-Gly-Lys-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO:2)
Gly-Gly-Lys-Pro-Leu-Arg(SEQ ID NO:3)
Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO:4)
Gly-Gly-Ser-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO:5)
Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Arg(SEQ ID NO:6)
Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Leu(SEQ ID NO:7)
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在整个本说明书和所附的权利要求书中，除非上下文另有需要，否则短语“包含”和“包括”及其变化形式应该被理解为暗示包括所陈述的整数或成组整数，但是不排除任何其他整数或成组整数。
在本说明书中对任何现有技术的引用不是并且不应被视为承认以任何形式暗示这些现有技术构成一般常识的一部分。
本领域技术人员应该理解，本发明的用途不限于所描述的特定应用。本发明在本文中描述或描绘的特定要素和/或特征方面也不限于其优选实施方式。应该理解，本发明不限于所公开的一个或多个实施方式，而是能够在不背离由所附权利要求书阐述和限定的本发明范围的情况下进行大量重新排列、修改和替换。

Claims (111)

1.一种生产适合施用于哺乳动物的肽抗原偶联物的方法，所述肽抗原偶联物包含连接到疏水性嵌段的肽抗原，所述方法包括：
在使所述肽抗原与所述疏水性嵌段直接地或间接地连接的条件下，在疏水性嵌段片段与肽抗原片段摩尔比为1:1或更大的情况下，在药学上可接受的有机溶剂中，使所述疏水性嵌段片段与包含所述肽抗原的肽抗原片段反应；以及
获得包含所述肽抗原偶联物、未反应的疏水性嵌段片段和药学上可接受的有机溶剂的产物溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所形成的产物溶液包含未反应的疏水性嵌段片段，并且所述未反应的疏水性嵌段片段未从所述产物溶液中除去。
3.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括无菌过滤所述产物溶液以获得包含肽抗原偶联物、任何未反应的疏水性嵌段片段和药学上可接受的有机溶剂的无菌产物溶液。
4.根据权利要求3所述的方法，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述无菌产物溶液中，接着混合以产生包含所述肽抗原偶联物、任何未反应的疏水性嵌段片段、药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述肽抗原偶联物粒子的水溶液包含未反应的疏水性嵌段片段，并且所述未反应的疏水性嵌段片段未从所述肽抗原偶联物粒子的水溶液中除去。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的方法，其中所述方法不涉及除去所述药学上可接受的有机溶剂。
7.根据权利要求3所述的方法，所述方法还包括将所述无菌产物溶液冻干以获得冻干无菌产物。
8.根据权利要求7所述的方法，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述冻干无菌产物中，接着混合以产生包含所述肽抗原偶联物、任何未反应的疏水性嵌段片段和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
9.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，所述方法还包括纯化所述肽抗原偶联物以获得呈冻干纯化肽抗原偶联物形式的纯化肽抗原偶联物和/或包含所述纯化肽抗原偶联物和药学上可接受的有机溶剂的纯化肽抗原偶联物溶液。
10.根据权利要求9所述的方法，所述方法还包括无菌过滤所述纯化肽抗原偶联物溶液以获得包含所述肽抗原偶联物和药学上可接受的有机溶剂的无菌纯化肽抗原偶联物溶液。
11.根据权利要求10所述的方法，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述无菌纯化肽抗原偶联物溶液中，接着混合以产生包含所述肽抗原偶联物、药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
12.根据权利要求10所述的方法，所述方法还包括将所述无菌纯化肽抗原偶联物溶液冻干以获得冻干无菌纯化肽抗原偶联物。
13.根据权利要求12所述的方法，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述冻干无菌纯化肽抗原偶联物中，接着混合以产生包含所述肽抗原偶联物和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括分析所述产物溶液、无菌产物溶液、冻干无菌产物、冻干纯化肽抗原偶联物、纯化肽抗原偶联物溶液、无菌纯化肽抗原偶联物溶液和/或冻干无菌纯化肽抗原偶联物在添加水性缓冲剂后形成聚集物质的倾向，所述分析包括：
(i)将特定体积的所述产物溶液、无菌产物溶液、纯化肽抗原偶联物溶液和/或无菌纯化肽抗原偶联物溶液从第一容器等分到第二容器中，和/或将特定质量的所述冻干无菌产物、冻干纯化肽抗原偶联物和/或冻干无菌纯化肽抗原偶联物从第一容器添加到第二容器中；
(ii)向所述第二容器中添加一定体积的所述水性缓冲剂，以获得包含所述肽抗原偶联物和任何未反应的疏水性嵌段片段的肽抗原偶联物粒子的水溶液，其中所述肽抗原偶联物的浓度不低于0.01mg/mL；
(iii)通过测量在大于350nm的波长下的吸光度来评定所述肽抗原偶联物粒子的水溶液的浊度；以及
(iv)基于所述肽抗原偶联物粒子的水溶液的吸光度与仅水性缓冲剂的吸光度的比较，确认所述肽抗原偶联物粒子的水溶液中存在或不存在聚集物质。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述药学上可接受的有机溶剂选自由二甲亚砜(DMSO)、甲醇和乙醇组成的组中的一种或多种。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述药学上可接受的有机溶剂是DMSO。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肽抗原片段具有选自[C]-[B1]-A-[B2]-X1、[B1]-A-[B2]-X1([C])、X1-[B1]-A-[B2]-[C]或X1([C])-[B1]-A-[B2]的式，其中C是带电荷部分，B1是N端延长部，A是肽抗原，B2是C端延长部，[]表示所述基团是任选的，并且X1是包含第一反应性官能团的连接物前体；并且所述疏水性嵌段片段具有选自X2-H、X2([C])-H或X2-H([C])的式，其中H是疏水性嵌段，C是带电荷部分，[]表示所述基团是任选的，并且X2是包含与所述第一反应性官能团反应的第二反应性官能团的连接物前体，并且X1和X2进行反应以形成共价键，从而产生连接物L。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有式[C]-[B1]-A-[B2]-L-H。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的式：A-L-H、C-A-L-H、B1-A-L-H、A-B2-L-H、C-B1-A-L-H、C-A-B2-L-H和C-B1-A-B2-L-H。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有式H-L-[B1]-A-[B2]-[C]。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的式：H-L-A、H-L-A-C、H-L-B1-A、H-L-A-B2、H-L-B1-A-C、H-L-A-B2-C和H-L-B1-A-B2-C。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述疏水性嵌段包含基于聚(氨基酸)的聚合物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述基于聚(氨基酸)的聚合物包含芳环或杂环芳环。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述基于聚(氨基酸)的聚合物包含芳基胺。
25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述疏水性嵌段片段与所述肽抗原片段在疏水性嵌段片段与肽抗原片段摩尔比为约1:1至约3:1下反应。
26.根据权利要求25所述的方法，其中使所述疏水性嵌段片段与所述肽抗原片段在疏水性嵌段片段与肽抗原片段摩尔比为1:1至约12:10下反应。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括形成包含两种或更多种肽抗原偶联物的肽抗原偶联物混合物或冻干肽抗原偶联物混合物，所述方法包括：
将特定体积的包含第一肽抗原偶联物的第一产物溶液、包含第一肽抗原偶联物的第一纯化肽抗原偶联物溶液、包含第一肽抗原偶联物的第一无菌产物溶液和/或包含第一肽抗原偶联物的第一无菌纯化肽抗原偶联物溶液与至少包含第二肽抗原偶联物的第二产物溶液、包含第二肽抗原偶联物的第二纯化肽抗原偶联物溶液、包含第二肽抗原偶联物的第二无菌产物溶液和/或包含第二肽抗原偶联物的第二无菌纯化肽抗原偶联物溶液组合，以获得至少包含所述第一肽抗原偶联物和所述第二肽抗原偶联物、任何未反应的疏水性嵌段片段和所述药学上可接受的有机溶剂的肽抗原偶联物混合物；和/或
将特定质量的包含第一肽抗原偶联物的第一冻干产物、包含第一肽抗原偶联物的第一冻干纯化肽抗原偶联物、包含第一肽抗原偶联物的第一冻干无菌产物和/或包含第一肽抗原偶联物的第一冻干无菌纯化肽抗原偶联物与至少特定质量的包含第二肽抗原偶联物的第二冻干产物、包含第二肽抗原偶联物的第二冻干纯化肽抗原偶联物、包含第二肽抗原偶联物的第二冻干无菌产物和/或包含第二肽抗原偶联物的第二冻干无菌纯化肽抗原偶联物组合，以获得至少包含所述第一肽抗原偶联物和所述第二肽抗原偶联物以及任何未反应的疏水性嵌段片段的冻干肽抗原偶联物混合物。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述肽抗原偶联物混合物包含未反应的疏水性嵌段片段，并且所述未反应的疏水性嵌段片段未从所述肽抗原偶联物混合物中除去。
29.根据权利要求27或权利要求28所述的方法，其中将特定体积的所述第一产物溶液、所述第一纯化肽抗原偶联物溶液、所述第一无菌产物溶液和/或所述第一无菌纯化肽抗原偶联物溶液与至少所述第二产物溶液、所述第二纯化肽抗原偶联物溶液、所述第二无菌产物溶液和/或所述第二无菌纯化肽抗原偶联物溶液组合的步骤包括选择并转移特定体积的溶液以从一个容器转移到第二容器，所述方法包括以下步骤：
(i)确定至少所述第一产物溶液、所述第一纯化肽抗原偶联物溶液、所述第一无菌产物溶液、所述第一无菌纯化肽抗原偶联物溶液、所述第二产物溶液、所述第二纯化肽抗原偶联物溶液、所述第二无菌生产溶液和/或所述第二无菌纯化肽抗原偶联物溶液中所述肽抗原偶联物的摩尔浓度；
(ii)将特定体积的至少所述第一产物溶液、所述第一纯化肽抗原偶联物溶液、所述第一无菌产物溶液和/或所述第一无菌纯化肽抗原偶联物溶液和所述第二产物溶液、所述第二纯化肽抗原偶联物溶液、所述第二无菌产物溶液和/或所述第二无菌纯化肽抗原偶联物溶液从所述第一容器等分到第二容器中，以获得特定摩尔含量的各所述第一肽抗原偶联物和所述第二肽抗原偶联物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中确定至少所述第一产物溶液、所述第一纯化肽抗原偶联物溶液、所述第一无菌产物溶液、所述第一无菌纯化肽抗原偶联物溶液、所述第二产物溶液、所述第二纯化肽抗原偶联物溶液、所述第二无菌产物溶液和/或所述第二无菌纯化肽抗原偶联物溶液中的肽抗原偶联物的摩尔浓度的方法包括测量所述肽抗原偶联物在约300至约350nm的波长下的UV-Vis吸收。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述肽抗原偶联物混合物中，接着混合以产生至少包含所述第一肽抗原偶联物和所述第二肽抗原偶联物、任何未反应的疏水性嵌段片段、任何药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的水溶液。
32.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述肽抗原偶联物混合物冻干以获得冻干肽抗原偶联物混合物。
33.根据权利要求32所述的方法，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述冻干肽抗原偶联物混合物中，接着混合以产生至少包含所述第一肽抗原偶联物和所述第二肽抗原偶联物、任何未反应的疏水性嵌段片段和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的水溶液。
34.根据权利要求27至30中任一项所述的方法，所述方法还包括无菌过滤所述肽抗原偶联物混合物以获得无菌肽抗原偶联物混合物。
35.根据权利要求34所述的方法，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述无菌肽抗原偶联物混合物产物中，接着混合以产生至少包含所述第一肽抗原偶联物和所述第二肽抗原偶联物、任何未反应的疏水性嵌段片段、药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
36.根据权利要求34所述的方法，所述方法还包括将所述无菌肽抗原偶联物混合物冻干以获得冻干无菌肽抗原偶联物混合物。
37.根据权利要求36所述的方法，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述无菌肽抗原偶联物混合物中，接着混合以产生至少包含所述第一肽抗原偶联物和所述第二肽抗原偶联物、任何未反应的疏水性嵌段片段和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
38.一种用于产生适合施用于哺乳动物的肽抗原偶联物的固相肽合成方法，所述肽抗原偶联物包含连接到疏水性嵌段的肽抗原，所述方法包括：
提供固相树脂结合的疏水性嵌段片段；
通过依次偶联独立的氨基酸和/或聚氨基酸片段以形成与所述树脂结合的疏水性嵌段偶联的肽抗原片段，或将肽抗原片段与所述树脂结合的疏水性嵌段偶联，形成树脂结合的肽抗原偶联物；
或者，提供固相树脂结合的肽抗原片段；通过将所述疏水性嵌段片段与所述树脂结合的肽抗原片段偶联以形成树脂结合的肽抗原偶联物，从而形成树脂结合的肽抗原偶联物；
从所述树脂上切割所述肽抗原偶联物以获得肽抗原偶联物；以及
纯化所述肽抗原偶联物以获得呈冻干纯化肽抗原偶联物形式的纯化肽抗原偶联物和/或包含所述纯化肽抗原偶联物和药学上可接受的有机溶剂的纯化肽抗原偶联物溶液。
39.根据权利要求38所述的方法，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述冻干纯化肽抗原偶联物中，接着混合以产生包含所述肽抗原偶联物和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的水溶液，或者将过量体积的水性缓冲剂添加到所述纯化肽抗原偶联物溶液中，接着混合以产生包含所述肽抗原偶联物、药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的水溶液。
40.根据权利要求38所述的方法，所述方法还包括无菌过滤所述纯化肽抗原偶联物溶液，以获得包含肽抗原偶联物和药学上可接受的有机溶剂的无菌纯化肽抗原偶联物溶液。
41.根据权利要求40所述的方法，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述无菌纯化肽抗原偶联物溶液中，接着混合以产生包含所述肽抗原偶联物、药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
42.根据权利要求40所述的方法，所述方法还包括将所述无菌纯化肽抗原偶联物溶液冻干以获得冻干无菌纯化肽抗原偶联物。
43.根据权利要求42所述的方法，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述冻干无菌纯化肽抗原偶联物中，接着混合以产生包含所述肽抗原偶联物和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
44.根据权利要求38至43中任一项所述的方法，所述方法还包括分析所述冻干纯化肽抗原偶联物、纯化肽抗原偶联物溶液、无菌纯化肽抗原偶联物溶液和/或冻干无菌纯化肽抗原偶联物在添加水性缓冲剂后形成聚集物质的倾向，所述分析包括以下步骤：
(i)将特定体积的所述纯化肽抗原偶联物溶液和/或无菌纯化肽抗原偶联物溶液从第一容器等分到第二容器中，和/或将特定质量的所述冻干纯化肽抗原偶联物和/或冻干无菌纯化肽抗原偶联物从第一容器添加到第二容器中；
(ii)向所述第二容器中添加一定体积的所述水性缓冲剂，以获得包含所述肽抗原偶联物的肽抗原偶联物粒子的水溶液，其中所述肽抗原偶联物的浓度不低于0.01mg/mL；
(iii)通过测量所述水性混合物在大于350nm的波长下的吸光度来评定所述肽抗原偶联物粒子的水溶液的浊度；以及
(iv)基于所述肽抗原偶联物粒子的水溶液的吸光度与仅水性缓冲剂的吸光度的比较，确认所述肽抗原偶联物粒子的水溶液中存在或不存在聚集物质。
45.根据权利要求38至44中任一项所述的方法，其中所述药学上可接受的有机溶剂选自由二甲亚砜(DMSO)、甲醇和乙醇组成的组中的一种或多种。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述药学上可接受的有机溶剂是DMSO。
47.根据权利要求38至46中任一项所述的方法，其中所述肽抗原片段具有选自[C]-[B1]-A-[B2]或[B1]-A-[B2]-[C]的式，其中C是带电荷部分，B1是N端延长部，A是肽抗原，B2是C端延长部，并且[]表示所述基团是任选的。
48.根据权利要求38至47中任一项所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有式[C]-[B1]-A-[B2]-H，其中H是疏水性嵌段。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的式：A-H、C-A-H、B1-A-H、A-B2-H、C-B1-A-H、C-A-B2-H和C-B1-A-B2-H。
50.根据权利要求38至47中任一项所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有式H-[B1]-A-[B2]-[C]。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的式：H-A、H-A-C、H-B1-A、H-A-B2、H-B1-A-C、H-A-B2-C和H-B1-A-B2-C。
52.根据权利要求38至51中任一项所述的方法，其中所述疏水性嵌段包含基于聚(氨基酸)的聚合物。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述基于聚(氨基酸)的聚合物包含芳环或杂环芳环。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述基于聚(氨基酸)的聚合物包含芳基胺。
55.根据权利要求38至54中任一项所述的方法，所述方法还包括形成包含两种或更多种肽抗原偶联物的肽抗原偶联物混合物，所述方法包括：
将特定体积的包含第一肽抗原偶联物的第一纯化肽抗原偶联物溶液和/或包含第一肽抗原偶联物的第一无菌纯化肽抗原偶联物溶液与至少包含第二肽抗原偶联物的第二纯化肽抗原偶联物溶液和/或包含第二肽抗原偶联物的第二无菌纯化肽抗原偶联物溶液组合，以获得至少包含所述第一肽抗原偶联物和所述第二肽抗原偶联物以及所述药学上可接受的有机溶剂的肽抗原偶联物混合物；和/或
将特定质量的包含第一肽抗原偶联物的第一冻干纯化肽抗原偶联物和/或包含第一肽抗原偶联物的第一冻干无菌纯化肽抗原偶联物与至少特定质量的包含第二肽抗原偶联物的第二冻干纯化肽抗原偶联物和/或包含第二肽抗原偶联物的第二冻干无菌纯化肽抗原偶联物组合，以获得至少包含所述第一肽抗原偶联物和所述第二肽抗原偶联物的肽抗原偶联物混合物。
56.根据权利要求55所述的方法，其中将特定体积的所述第一纯化肽抗原偶联物溶液和/或所述第一无菌纯化肽抗原偶联物溶液与至少所述第二纯化肽抗原偶联物溶液和/或所述第二无菌纯化肽抗原偶联物溶液组合的步骤包括选择并转移特定体积的溶液以从一个容器转移到第二容器，所述方法包括以下步骤：
(i)确定至少所述第一纯化肽抗原偶联物溶液、所述第一无菌纯化肽抗原偶联物溶液、所述第二纯化肽抗原偶联物溶液和/或所述第二无菌纯化肽抗原偶联物溶液中的所述肽抗原偶联物的摩尔浓度；
(ii)将特定体积的至少所述第一纯化肽抗原偶联物溶液、所述第一无菌纯化肽抗原偶联物溶液和所述第二纯化肽抗原偶联物溶液和/或所述第二无菌纯化肽抗原偶联物溶液从所述第一容器等分到第二容器中，以获得特定摩尔含量的各所述第一肽抗原偶联物和所述第二肽抗原偶联物。
57.根据权利要求56所述的方法，其中确定至少所述第一纯化肽抗原偶联物溶液、所述第一无菌纯化肽抗原偶联物溶液、所述第二纯化肽抗原偶联物溶液和/或所述第二无菌纯化肽抗原偶联物溶液中的肽抗原偶联物的摩尔浓度的方法包括测量所述肽抗原偶联物在约300至约350nm之间的波长下的UV-Vis吸收。
58.根据权利要求55至57中任一项所述的方法，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述肽抗原偶联物混合物中，接着混合以产生至少包含所述第一肽抗原偶联物和所述第二肽抗原偶联物、任何药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的水溶液。
59.根据权利要求55至57中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述肽抗原偶联物混合物冻干以获得冻干肽抗原偶联物混合物产物。
60.根据权利要求59所述的方法，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述冻干肽抗原偶联物混合物中，接着混合以产生至少包含所述第一肽抗原偶联物和所述第二肽抗原偶联物和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的水溶液。
61.根据权利要求55至57中任一项所述的方法，所述方法还包括无菌过滤所述肽抗原偶联物混合物以获得无菌肽抗原偶联物混合物。
62.根据权利要求61所述的方法，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述无菌肽抗原偶联物混合物中，接着混合以产生至少包含所述第一肽抗原偶联物和所述第二肽抗原偶联物、药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
63.根据权利要求61所述的方法，所述方法还包括将所述无菌肽抗原偶联物混合物冻干以获得冻干无菌肽抗原偶联物混合物。
64.根据权利要求63所述的方法，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述冻干无菌肽抗原偶联物混合物中，接着混合以产生至少包含所述第一肽抗原偶联物和所述第二肽抗原偶联物和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
65.一种生产肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液的方法，所述方法包括：
a)制备包含肽抗原偶联物和药学上可接受的有机溶剂的肽抗原偶联物溶液，所述肽抗原偶联物包含连接到疏水性嵌段的肽抗原；
b)无菌过滤所述肽抗原偶联物溶液以产生无菌肽抗原偶联物溶液；以及
c)向所述无菌肽抗原偶联物溶液中添加水性缓冲剂以产生所述肽抗原粒子的无菌水溶液。
66.根据权利要求65所述的方法，所述方法还包括：
a')制备包含第二肽抗原偶联物和药学上可接受的有机溶剂的第二肽抗原偶联物溶液，所述第二肽抗原偶联物包含连接到疏水性嵌段的第二肽抗原；
a”)将特定体积的各所述肽抗原偶联物溶液和所述第二肽抗原偶联物溶液组合以获得包含两种或更多种不同肽抗原偶联物的肽抗原偶联物混合物，然后对所述肽抗原偶联物混合物进行步骤b)和c)。
67.根据权利要求65所述的方法，所述方法还包括：
a')制备包含第二肽抗原偶联物和药学上可接受的有机溶剂的第二肽抗原偶联物溶液，所述第二肽抗原偶联物包含连接到疏水性嵌段的第二肽抗原；
b')无菌过滤所述第二肽抗原偶联物溶液以产生第二无菌肽抗原偶联物溶液；以及
b”)将特定体积的各所述无菌肽抗原偶联物溶液和所述第二无菌肽抗原偶联物溶液组合以获得组合的无菌肽抗原偶联物溶液，然后对所述组合的无菌肽抗原偶联物溶液进行步骤c)。
68.根据权利要求65至67中任一项所述的方法，所述方法还包括分析所述肽抗原偶联物溶液、所述第二肽抗原偶联物溶液、所述无菌肽抗原偶联物溶液、所述第二无菌肽抗原偶联物溶液、所述肽抗原偶联物混合物和/或所述无菌肽抗原偶联物混合物在添加水性缓冲剂后形成聚集物质的倾向，所述分析包括以下步骤：
(i)将特定体积的所述肽抗原偶联物溶液、所述第二肽抗原偶联物溶液、所述无菌肽抗原偶联物溶液、所述第二无菌肽抗原偶联物溶液、所述肽抗原偶联物混合物和/或所述无菌肽抗原偶联物混合物从第一容器等分到第二容器中；
(ii)向所述第二容器中添加一定体积的所述水性缓冲剂，以获得包含所述肽抗原偶联物的肽抗原偶联物粒子的水溶液，其中所述肽抗原偶联物的浓度不低于0.01mg/mL；
(iii)通过测量所述水性混合物在大于350nm的波长下的吸光度来评定所述肽抗原偶联物粒子的水溶液的浊度；以及
(iv)基于所述肽抗原偶联物粒子的水溶液的吸光度与仅水性缓冲剂的吸光度的比较，确认所述肽抗原偶联物粒子的水溶液中存在或不存在聚集物质。
69.根据权利要求65至68中任一项所述的方法，其中所述药学上可接受的有机溶剂选自由二甲亚砜(DMSO)、甲醇和乙醇组成的组中的一种或多种。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述药学上可接受的有机溶剂是DMSO。
71.根据权利要求65至70中任一项所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有式[C]-[B1]-A-[B2]-H，其中C是带电荷部分，B1是N端延长部，A是肽抗原，B2是C端延长部，H是疏水性嵌段，并且[]表示所述基团是任选的。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的式：A-H、C-A-H、B1-A-H、A-B2-H、C-B1-A-H、C-A-B2-H和C-B1-A-B2-H。
73.根据权利要求65至70中任一项所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有式H-[B1]-A-[B2]-[C]，其中H是疏水性嵌段，B1是N端延长部，A是肽抗原，B2是C端延长部，C是带电荷部分，并且[]表示所述基团是任选的。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的式：H-A、H-A-C、H-B1-A、H-A-B2、H-B1-A-C、H-A-B2-C和H-B1-A-B2-C。
75.根据权利要求65至70中任一项所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有式[C]-[B1]-A-[B2]-L-H，其中C是带电荷部分，B1是N端延长部，A是肽抗原，B2是C端延长部，H是疏水性嵌段，L是连接物，并且[]表示所述基团是任选的。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的式：A-L-H、C-A-L-H、B1-A-L-H、A-B2-L-H、C-B1-A-L-H、C-A-B2-L-H和C-B1-A-B2-L-H。
77.根据权利要求65至70中任一项所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有式H-L-[B1]-A-[B2]-[C]，其中C是带电荷部分，B1是N端延长部，A是肽抗原，B2是C端延长部，H是疏水性嵌段，L是连接物，并且[]表示所述基团是任选的。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的式：H-L-A、H-L-A-C、H-L-B1-A、H-L-A-B2、H-L-B1-A-C、H-L-A-B2-C和H-L-B1-A-B2-C。
79.根据权利要求65至78中任一项所述的方法，其中所述疏水性嵌段包含基于聚(氨基酸)的聚合物。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述基于聚(氨基酸)的聚合物包含芳环或杂环芳环。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述基于聚(氨基酸)的聚合物包含芳基胺。
82.一种用于分析包含连接到疏水性嵌段的肽抗原的肽抗原偶联物组合物在添加水性缓冲剂后形成聚集物质的倾向的方法，所述分析包括以下步骤：
(i)将特定体积的肽抗原偶联物溶液从第一容器等分到第二容器中，和/或将特定质量的肽抗原偶联物从第一容器添加到第二容器中；
(ii)向所述第二容器中添加一定体积的所述水性缓冲剂，以获得包含所述肽抗原偶联物的肽抗原偶联物粒子的水溶液，其中所述肽抗原偶联物的浓度不低于0.01mg/mL；
(iii)通过测量所述水性混合物在大于350nm的波长下的吸光度来评定所述肽抗原偶联物粒子的水溶液的浊度；以及
(iv)基于所述肽抗原偶联物粒子的水溶液的吸光度与仅水性缓冲剂的吸光度的比较，确认所述肽抗原偶联物粒子的水溶液中存在或不存在聚集物质。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有选自[C]-[B1]-A-[B2]-H或[B1]-A-[B2]-H([C])的式，其中C是带电荷部分，B1是N端延长部，A是肽抗原，B2是C端延长部，H是疏水性嵌段，并且[]表示所述基团是任选的。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的式：A-H、C-A-H、B1-A-H、A-B2-H、C-B1-A-H、C-A-B2-H和C-B1-A-B2-H。
85.根据权利要求82所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有式H-[B1]-A-[B2]-[C]或H([C)]-[B1]-A-[B2]，其中B1是N端延长部，A是肽抗原，B2是C端延长部，C是带电荷部分，H是疏水性嵌段，并且[]表示所述基团是任选的。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的式：H-A、H-A-C、H-B1-A、H-A-B2、H-B1-A-C、H-A-B2-C和H-B1-A-B2-C。
87.根据权利要求82所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有选自[C]-[B1]-A-[B2]-L-H、[B1]-A-[B2]-L([C])-H或[B1]-A-[B2]-L-H([C])的式，其中C是带电荷部分，B1是N端延长部，A是肽抗原，B2是C端延长部，H是疏水性嵌段，L是连接物，并且[]表示所述基团是任选的。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的式：A-L-H、C-A-L-H、B1-A-L-H、A-B2-L-H、C-B1-A-L-H、C-A-B2-L-H和C-B1-A-B2-L-H。
89.根据权利要求82所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有选自H-L-[B1]-A-[B2]-[C]、H([C])-L-[B1]-A-[B2]或H-L([C])-[B1]-A-[B2]的式，其中C是带电荷部分，B1是N端延长部，A是肽抗原，B2是C端延长部，H是疏水性嵌段，L是连接物，并且[]表示所述基团是任选的。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述肽抗原偶联物具有选自由以下组成的组的式：H-L-A、H-L-A-C、H-L-B1-A、H-L-A-B2、H-L-B1-A-C、H-L-A-B2-C和H-L-B1-A-B2-C。
91.根据权利要求82至90中任一项所述的方法，其中所述疏水性嵌段包含基于聚(氨基酸)的聚合物。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述基于聚(氨基酸)的聚合物包含芳环或杂环芳环。
93.根据权利要求92所述的方法，其中所述基于聚(氨基酸)的聚合物包含芳基胺。
94.一种用于生产肽抗原偶联物混合物的方法，所述混合物包含连接到疏水性嵌段的第一肽抗原和连接到疏水性嵌段的至少第二肽抗原，所述方法包括：
制备包含第一肽抗原偶联物和药学上可接受的有机溶剂的第一肽抗原偶联物溶液；
制备包含第二肽抗原偶联物和药学上可接受的有机溶剂的至少第二肽抗原偶联物溶液；
将特定体积的所述肽抗原偶联物溶液组合，以获得包含所述第一肽抗原偶联物和所述至少第二肽抗原偶联物以及药学上可接受的有机溶剂的肽抗原偶联物混合物。
95.根据权利要求94所述的方法，其中将特定体积的所述肽抗原偶联物溶液组合的步骤包括选择并转移特定体积的每种肽抗原偶联物溶液以从一个容器转移到第二容器，所述方法包括以下步骤：
(i)确定每种肽抗原偶联物溶液中所述肽抗原偶联物的摩尔浓度；
(ii)将特定体积的每种肽抗原偶联物溶液从所述第一容器等分到第二容器中，以获得特定摩尔含量的每种肽抗原偶联物。
96.根据权利要求95所述的方法，其中确定每种肽抗原偶联物溶液中肽抗原偶联物的摩尔浓度的方法包括测量所述肽抗原偶联物在约300至约350nm之间的波长下的UV-Vis吸收。
97.根据权利要求94至96中任一项所述的方法，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述肽抗原偶联物混合物中，接着混合以产生包含所述第一肽抗原偶联物和至少所述第二肽抗原偶联物、药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的水溶液。
98.根据权利要求97所述的方法，所述方法还包括将所述肽抗原偶联物混合物冻干以获得冻干肽抗原偶联物混合物。
99.根据权利要求98所述的方法，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述冻干肽抗原偶联物混合物中，接着混合以产生包含所述第一肽抗原偶联物和至少所述第二肽抗原偶联物、药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的水溶液。
100.根据权利要求94至96中任一项所述的方法，所述方法还包括无菌过滤所述肽抗原偶联物混合物以获得无菌肽抗原偶联物混合物。
101.根据权利要求100所述的方法，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述无菌肽抗原偶联物混合物中，接着混合以产生包含所述第一肽抗原偶联物和至少所述第二肽抗原偶联物、药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
102.根据权利要求100所述的方法，所述方法还包括将所述无菌肽抗原偶联物混合物冻干以获得冻干无菌肽抗原偶联物混合物。
103.根据权利要求102所述的方法，所述方法还包括将过量体积的水性缓冲剂添加到所述冻干无菌肽抗原偶联物混合物中，接着混合以产生包含所述第一肽抗原偶联物和至少所述第二肽抗原偶联物、药学上可接受的有机溶剂和水性缓冲剂的肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液。
104.根据权利要求94至103中任一项所述的方法，所述方法还包括分析所述肽抗原偶联物混合物、冻干肽抗原偶联物混合物、无菌肽抗原偶联物混合物和/或冻干无菌肽抗原偶联物混合物在添加水性缓冲剂后形成聚集物质的倾向，所述分析包括以下步骤：
(i)将特定体积的所述肽抗原偶联物混合物和/或无菌肽抗原偶联物混合物从第一容器等分到第二容器中，和/或将特定质量的所述冻干肽抗原偶联物混合物和/或冻干无菌肽抗原偶联物混合物从第一容器添加到第二容器中；
(ii)向所述第二容器中添加一定体积的所述水性缓冲剂，以获得包含所述第一肽抗原偶联物和至少所述第二肽抗原偶联物的肽抗原偶联物粒子的水溶液，其中所述肽抗原偶联物的浓度不低于0.01mg/mL；
(iii)通过测量所述水性混合物在大于350nm的波长下的吸光度来评定所述肽抗原偶联物粒子的水溶液的浊度；以及
(iv)基于所述肽抗原偶联物粒子的水溶液的吸光度与仅水性缓冲剂的吸光度的比较，确认所述肽抗原偶联物粒子的水溶液中存在或不存在聚集物质。
105.根据权利要求94至104中任一项所述的方法，其中选择要包括在所述肽抗原偶联物混合物中的所述第一肽抗原偶联物和所述至少第二肽抗原偶联物的组成和体积的方法包括以下步骤中的任一者或两者：
(i)确定所述肽抗原偶联物溶液中的所述肽抗原偶联物的摩尔浓度；
(ii)在添加过量的水性缓冲剂以将所述肽抗原偶联物稀释至不低于0.01mg/mL的浓度后，确定每种肽抗原偶联物溶液形成聚集物质的倾向。
106.根据权利要求105所述的方法，其中源自于各自单独地具有在添加所述水性缓冲剂后形成聚集物质的倾向的所述肽抗原偶联物混合物和/或所述无菌肽抗原偶联物混合物的肽抗原偶联物的摩尔浓度占所述肽抗原偶联物混合物中的肽抗原偶联物的总摩尔含量的60％以下。
107.根据权利要求105或权利要求106所述的方法，其中确定所述肽抗原偶联物混合物和/或所述无菌肽抗原偶联物混合物中的肽抗原偶联物的摩尔浓度的方法包括测量所述肽抗原偶联物在约300至约350nm之间的波长下的UV-Vis吸收。
108.一种肽抗原偶联物，其通过权利要求1至64中任一项所述的方法生产。
109.一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含根据权利要求109所述的肽抗原偶联物。
110.一种肽抗原偶联物粒子的无菌水溶液，其通过根据权利要求65至81中任一项所述的方法生产。
111.一种肽抗原偶联物混合物，其通过根据权利要求94至107中任一项所述的方法生产。
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