CN112522322A - 一种nrp1配体的修饰技术 - Google Patents
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Abstract
本发明专利涉及医疗技术领域，尤其为一种NRP1配体的修饰技术，包括以下步骤：NRP1‑L慢病毒表达载体：事先准备好材料，NRP1‑L基因序列密码子优化后，通过基因全合成的方式合成DNA，然后通过Gibson组装克隆到慢病毒载体pLVX(Clontech)；通过慢病毒载体转染后修饰T细胞，可以加强修饰后T细胞在肿瘤微环境中的浸润能力，有效地抑制肿瘤生长，对NRP1的竞争性结合也可以阻断肿瘤内部的血管生成，起到协同抑制肿瘤生长的作用，这个改造方法将有效提升过继T细胞在实体瘤中的治疗效果，并进一步建立、完善基因修饰T细胞的技术平台。
Description
技术领域
本发明专利涉及医疗技术领域，具体为一种NRP1配体的修饰技术。
背景技术
恶性肿瘤已成为严重威胁中国人群健康的主要公共卫生问题之一。最新统计数据显示，恶性肿瘤相关死亡占居民死因的23.91％，且近十几年来，恶性肿瘤的发病死亡均呈持续上升态势。目前，常用的治疗手段包括手术切除、放/化疗和靶向药物治疗，但肿瘤复发导致的治疗失败仍是临床上恶性肿瘤治疗面临的主要问题。近年来，免疫细胞过继疗法和基因修饰T细胞技术的发展为治愈难治性肿瘤提供了可能。目前，基因修饰T细胞技术在实体瘤的临床应用受限于过继T细胞衰竭及向瘤内浸润不足等因素，其中，T细胞向瘤内浸润不足是导致影响过继T细胞疗法疗效的主要原因。在体内研究中，回输的T细胞只有不到2％可以穿透血管内皮到达肿瘤微环境，极大的影响了T细胞的治疗效果。
肿瘤微环境中复杂的免疫环境抑制T细胞的浸润，阻碍过继T细胞进入肿瘤组织内部。比如，肿瘤组织高密度的基质和拥挤的细胞排列组成了阻碍T细胞浸润的物理屏障，而微环境内重塑的细胞因子和趋化因子的表达模式和异常的血管结构特征，如异常的血流、低周皮细胞覆盖率、内皮细胞失效、不能形成三级淋巴结构等特征，都在不同程度上降低T细胞向瘤内的浸润能力，为此提出一种NRP1配体的修饰技术，来解决此问题，最终不但可以解决修饰T细胞向肿瘤内浸润的问题，也可以修饰其它免疫细胞或者药物载体，达到促进其向肿瘤组织浸润的目的。
发明专利内容
本发明专利的目的在于提供一种NRP1配体的修饰技术，解决了肿瘤微环境中复杂的免疫环境抑制T细胞的浸润，阻碍过继T细胞进入肿瘤组织内部的问题，比如，肿瘤组织高密度的基质和拥挤的细胞排列组成了阻碍T细胞浸润的物理屏障，而微环境内重塑的细胞因子和趋化因子的表达模式和异常的血管结构特征，如异常的血流、低周皮细胞覆盖率、内皮细胞失效、不能形成三级淋巴结构等特征，都在不同程度上降低T细胞向瘤内的浸润能力的问题。
为实现上述目的，本发明专利提供如下技术方案：一种NRP1配体的修饰技术，包括以下步骤：
步骤1：NRP1-L慢病毒表达载体：事先准备好材料，NRP1-L基因序列密码子优化后，通过基因全合成的方式合成DNA，然后通过Gibson组装克隆到慢病毒载体pLVX(Clontech)；
步骤2：NRP1-L病毒载体的构建：计数3×106个293T细胞，悬浮于10ml无血清DMEM培养基，接种在10cm培养皿上，待细胞贴壁占培养皿总面积50％以上后进行转染；将TCR慢病毒载体和慢病毒包装质粒pmd2.G、pSPAX2以2：1：1的比例混合，转染到293T细胞，置于37℃、5％CO2细胞培养箱内孵育；转染24小时后更换一次新鲜DMEM培养基，72小时收集包含病毒的培养上清，分装冻存；
步骤3：NRP1-L修饰Jurkat细胞的转染及培养：计数Jurkat细胞，加入10％FBS/RPMI-1640培养基，调整细胞浓度至1×106/ml，每孔1ml；加入500μL病毒上清液，添加精蛋白硫酸盐(终浓度8μg/ml)，置于37℃、5％CO2细胞培养箱内孵育2小时；离心弃病毒上清液，添加1ml 10％FBS/RPMI-1640培养基，置于细胞培养箱内培养3天；
步骤4：NRP1-L修饰Jurkat细胞的培养及扩增：取1×106个细胞进行NRP1-L抗体染色，流式细胞术检测NRP1-L/GFP双阳性细胞的比例，鉴定感染效率，同时GFP转染Jurkat细胞作为对照；将培养孔中细胞转移至T25培养瓶中扩增，添加10％FBS/RPMI-1640配置培养基至10ml，置于细胞培养箱内培养3天；
步骤5：构建3D细胞球(three-dimensional spheroid)模型：取1×104个293T细胞，种植于超低吸附96孔板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱内培养，直至24小时后；
步骤6：Jurkat细胞浸润3D细胞球：分别取1×104、3×104、6×104个NRP1-L修饰Jurkat细胞，加入3D细胞球中，共培养48小时；
步骤7：高内涵显微镜分析Jurkat细胞在3D细胞球内部的分布情况：48小时后，PBS清洗3D细胞球3次，用高内涵显微镜断层扫描3D细胞球内部GFP荧光细胞的分布，通过统计荧光总体强度，可见不同Jurkat细胞数量条件下，NRP1-L修饰Jurkat处理组3D细胞球内部GFP荧光强度均显著强于Jurkat-GFP对照和野生型Jurkat；
步骤8：流式细胞术分析3D细胞球内部Jurkat细胞的占比：48小时，PBS清洗3D细胞球3次，加入200微升胰酶消化3分钟，吹打5次将3D细胞球吹散成单细胞悬液，通过流式细胞术分析单细胞悬液中Jurkat细胞的占比，可见不同Jurkat细胞数量条件下，NRP1-L修饰Jurkat在3D细胞球内部细胞数量占比均显著高于Jurkat-GFP对照和野生型Jurkat。
优选的，所述在步骤1中，准备的材料包括：
(1)RPMI-1640培养基(Hyclone，Catalog number SH30809.01)
(2)DMEM高糖培养基(Hyclone，Catalog number SH30243.01)
(3)胎牛血清(FBS，Gibco，Catalog number 26140079)
(4)双抗(Hyclone，Catalog number SH40003.01)
(5)0.25％胰酶(Hyclone，Catalog number SH30042.02)
(6)无血清细胞冻存液：BAMBANKER(GC Lymphotec Inc，Catalog number 302-14681)
(7)NRP1-L慢病毒表达载体(上海朗晶，基因全合成)
(8)慢病毒包装质粒pMD2.G和pSPAX2(Addgene)
(9)精蛋白硫酸盐(Sigma Aldrich，Catalog number 53597-25-4)
(10)293T细胞(ATCC，Catalog number CRL-3216TM)
(11)Jurkat细胞(ATCC，Catalog number TIB-152TM)
(12)NRP1-L抗体(Bioss，Catalog number bs-0297G-APC)
(13)超低吸附96孔板(corning，Catalog number 7007)。
优选的，所述在步骤1中，NRP1-L氨基酸序列：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDHTPGNSNKWKHLQENKKGRPRRGGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT*。
优选的，所述在步骤2中，分装冻存，冻存的温度为-80℃长期保存。
优选的，所述在步骤3中，置于5％CO2细胞培养箱内培养时，温度保持37℃。
优选的，所述在步骤4中，置于5％CO2细胞培养箱内培养时，温度保持37℃。
优选的，所述在步骤5中，直至24小时后，细胞聚集成规则的圆球形，直径约600μm。
与现有技术相比，本发明专利的有益效果如下：
本发明专利调控趋化因子的表达模式，如阻断CCL2或增强IL-12以加强T细胞迁移能力，表达外源性趋化因子受体来增强T细胞转运，或抑制血管生成如阻断VEGF信号通路、促进整合素依赖的T细胞迁移等，NRP1(Neuropilin 1)是一个血管通透性调节因子，是血管生成因子VEGF的共受体，参与血管生成信号通路的调控，近期研究表明调控NRP1可以打开内皮细胞屏障和抑制肿瘤血管生成，利用靶向NRP1的肿瘤穿透肽，如iRGD修饰T细胞表面，可以加强其在肿瘤微环境中的浸润能力，有效地抑制荷瘤小鼠的肿瘤增长，利用NRP1配体(NRP1-Ligand，NRP1-L)与内皮细胞及肿瘤细胞中高表达的NRP1的特异性结合能力，一方面可以打开内皮细胞屏障，促进T细胞浸润，另一方面竞争VEGF与内源性NRP1的结合而阻断VEGF信号通路，抑制肿瘤血管新生，这种NRP1配体的T细胞将不仅具有高特异的肿瘤细胞识别能力，而且能够高效定位到内皮细胞，穿越内皮屏障；对NRP1的竞争性结合也可以阻断肿瘤内部的血管生成，起到协同抑制肿瘤生长的作用，这个改造方法将有效提升过继T细胞在实体瘤中的治疗效果，并进一步建立、完善基因修饰T细胞的技术平台。
附图说明
图1为本发明专利NRP1-L表达载体结构示意图；
图2为本发明专利流式细胞术鉴定NRP1-L在T细胞的表达效率示意图；
图3为本发明专利3D细胞球的物理特征示意图；
图4为本发明专利NRP1-L修饰Jurkat细胞在3D细胞球中的浸润示意图；
图5为本发明专利3D细胞球内部NRP1-L修饰Jurkat细胞的比例示意图；
图6为本发明专利3D细胞球内部NRP1-L修饰Jurkat示意图；
图7为本发明专利3D细胞球内部NRP1-L修饰Jurkat细胞的比例示意图。
具体实施方式
下面将通过实施例的方式对本发明作更详细的描述，这些实施例仅是举例说明性的而没有任何对本发明范围的限制。
本发明提供一种技术方案：一种NRP1配体的修饰技术，包括以下步骤：
步骤1：NRP1-L慢病毒表达载体：事先准备好材料，NRP1-L基因序列密码子优化后，通过基因全合成的方式合成DNA，然后通过Gibson组装克隆到慢病毒载体pLVX(Clontech)；
步骤2：NRP1-L病毒载体的构建：计数3×106个293T细胞，悬浮于10ml无血清DMEM培养基，接种在10cm培养皿上，待细胞贴壁占培养皿总面积50％以上后进行转染；将TCR慢病毒载体和慢病毒包装质粒pmd2.G、pSPAX2以2：1：1的比例混合，转染到293T细胞，置于37℃、5％CO2细胞培养箱内孵育；转染24小时后更换一次新鲜DMEM培养基，72小时收集包含病毒的培养上清，分装冻存；
步骤3：NRP1-L修饰Jurkat细胞的转染及培养：计数Jurkat细胞，加入10％FBS/RPMI-1640培养基，调整细胞浓度至1×106/ml，每孔1ml；加入500μL病毒上清液，添加精蛋白硫酸盐(终浓度8μg/ml)，置于37℃、5％CO2细胞培养箱内孵育2小时；离心弃病毒上清液，添加1ml 10％FBS/RPMI-1640培养基，置于细胞培养箱内培养3天；
步骤4：NRP1-L修饰Jurkat细胞的培养及扩增：取1×106个细胞进行NRP1-L抗体染色，流式细胞术检测NRP1-L/GFP双阳性细胞的比例，鉴定感染效率，同时GFP转染Jurkat细胞作为对照；将培养孔中细胞转移至T25培养瓶中扩增，添加10％FBS/RPMI-1640配置培养基至10ml，置于细胞培养箱内培养3天；
步骤5：构建3D细胞球(three-dimensional spheroid)模型：取1×104个293T细胞，种植于超低吸附96孔板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱内培养，直至24小时后；
步骤6：Jurkat细胞浸润3D细胞球：分别取1×104、3×104、6×104个NRP1-L修饰Jurkat细胞，加入3D细胞球中，共培养48小时；
步骤7：高内涵显微镜分析Jurkat细胞在3D细胞球内部的分布情况：48小时后，PBS清洗3D细胞球3次，用高内涵显微镜断层扫描3D细胞球内部GFP荧光细胞的分布，通过统计荧光总体强度，可见不同Jurkat细胞数量条件下，NRP1-L修饰Jurkat处理组3D细胞球内部GFP荧光强度均显著强于Jurkat-GFP对照和野生型Jurkat；
步骤8：流式细胞术分析3D细胞球内部Jurkat细胞的占比：48小时，PBS清洗3D细胞球3次，加入200微升胰酶消化3分钟，吹打5次将3D细胞球吹散成单细胞悬液，通过流式细胞术分析单细胞悬液中Jurkat细胞的占比，可见不同Jurkat细胞数量条件下，NRP1-L修饰Jurkat在3D细胞球内部细胞数量占比均显著高于Jurkat-GFP对照和野生型Jurkat。
实施例一：
NRP1-L慢病毒表达载体：事先准备好材料，NRP1-L基因序列密码子优化后，通过基因全合成的方式合成DNA，然后通过Gibson组装克隆到慢病毒载体pLVX(Clontech)，质粒合成服务由上海朗晶生物科技有限公司提供；
NRP1-L病毒载体的构建：计数3×106个293T细胞，悬浮于10ml无血清DMEM培养基，接种在10cm培养皿上，待细胞贴壁占培养皿总面积50％以上后进行转染；将TCR慢病毒载体和慢病毒包装质粒pmd2.G、pSPAX2以2：1：1的比例混合，转染到293T细胞，置于37℃、5％CO2细胞培养箱内孵育；转染24小时后更换一次新鲜DMEM培养基，72小时收集包含病毒的培养上清，分装冻存；
NRP1-L修饰Jurkat细胞的转染及培养：计数Jurkat细胞，加入10％FBS/RPMI-1640培养基，调整细胞浓度至1×106/ml，每孔1ml；加入500μL病毒上清液，添加精蛋白硫酸盐(终浓度8μg/ml)，置于37℃、5％CO2细胞培养箱内孵育2小时；离心弃病毒上清液，添加1ml10％FBS/RPMI-1640培养基，置于细胞培养箱内培养3天；
NRP1-L修饰Jurkat细胞的培养及扩增：取1×106个细胞进行NRP1-L抗体染色，流式细胞术检测NRP1-L/GFP双阳性细胞的比例，鉴定感染效率，同时GFP转染Jurkat细胞作为对照；将培养孔中细胞转移至T25培养瓶中扩增，添加10％FBS/RPMI-1640配置培养基至10ml，置于细胞培养箱内培养3天；
构建3D细胞球(three-dimensional spheroid)模型：取1×104个293T细胞，种植于超低吸附96孔板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱内培养，直至24小时后；
Jurkat细胞浸润3D细胞球：分别取1×104、3×104、6×104个NRP1-L修饰Jurkat细胞，加入3D细胞球中，共培养48小时；
高内涵显微镜分析Jurkat细胞在3D细胞球内部的分布情况：48小时后，PBS清洗3D细胞球3次，用高内涵显微镜断层扫描3D细胞球内部GFP荧光细胞的分布，通过统计荧光总体强度，可见不同Jurkat细胞数量条件下，NRP1-L修饰Jurkat处理组3D细胞球内部GFP荧光强度均显著强于Jurkat-GFP对照和野生型Jurkat；
流式细胞术分析3D细胞球内部Jurkat细胞的占比：48小时，PBS清洗3D细胞球3次，加入200微升胰酶消化3分钟，吹打5次将3D细胞球吹散成单细胞悬液，通过流式细胞术分析单细胞悬液中Jurkat细胞的占比，可见不同Jurkat细胞数量条件下，NRP1-L修饰Jurkat在3D细胞球内部细胞数量占比均显著高于Jurkat-GFP对照和野生型Jurkat。
实施例二：
NRP1-L慢病毒表达载体：事先准备好材料，NRP1-L基因序列密码子优化后，通过基因全合成的方式合成DNA，然后通过Gibson组装克隆到慢病毒载体pLVX(Clontech)，质粒合成服务由上海朗晶生物科技有限公司提供；
准备的材料包括：
(1)RPMI-1640培养基(Hyclone，Catalog number SH30809.01)
(2)DMEM高糖培养基(Hyclone，Catalog number SH30243.01)
(3)胎牛血清(FBS，Gibco，Catalog number 26140079)
(4)双抗(Hyclone，Catalog number SH40003.01)
(5)0.25％胰酶(Hyclone，Catalog number SH30042.02)
(6)无血清细胞冻存液：BAMBANKER(GC Lymphotec Inc，Catalog number 302-14681)
(7)NRP1-L慢病毒表达载体(上海朗晶，基因全合成)
(8)慢病毒包装质粒pMD2.G和pSPAX2(Addgene)
(9)精蛋白硫酸盐(Sigma Aldrich，Catalog number 53597-25-4)
(10)293T细胞(ATCC，Catalog number CRL-3216TM)
(11)Jurkat细胞(ATCC，Catalog number TIB-152TM)
(12)NRP1-L抗体(Bioss，Catalog number bs-0297G-APC)
(13)超低吸附96孔板(corning，Catalog number 7007)。
NRP1-L氨基酸序列
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDHTPGNSNKWKHLQENKKGRPRRGGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT*。
NRP1-L病毒载体的构建：计数3×106个293T细胞，悬浮于10ml无血清DMEM培养基，接种在10cm培养皿上，待细胞贴壁占培养皿总面积50％以上后进行转染；将TCR慢病毒载体和慢病毒包装质粒pmd2.G、pSPAX2以2：1：1的比例混合，转染到293T细胞，置于37℃、5％CO2细胞培养箱内孵育；转染24小时后更换一次新鲜DMEM培养基，72小时收集包含病毒的培养上清，分装冻存于-80℃长期保存；
NRP1-L修饰Jurkat细胞的转染及培养：计数Jurkat细胞，加入10％FBS/RPMI-1640培养基，调整细胞浓度至1×106/ml，每孔1ml；加入500μL病毒上清液，添加精蛋白硫酸盐(终浓度8μg/ml)，置于37℃、5％CO2细胞培养箱内孵育2小时；离心弃病毒上清液，添加1ml10％FBS/RPMI-1640培养基，置于37℃、5％CO2细胞培养箱内培养3天；
RP1-L修饰Jurkat细胞的培养及扩增：取1×106个细胞进行NRP1-L抗体染色，流式细胞术检测NRP1-L/GFP双阳性细胞的比例，鉴定感染效率，同时GFP转染Jurkat细胞作为对照；将培养孔中细胞转移至T25培养瓶中扩增，添加10％FBS/RPMI-1640配置培养基至10ml，置于37℃、5％CO2细胞培养箱内培养；
NRP1-L修饰Jurkat细胞的浸润能力鉴定：
(1)构建3D细胞球(three-dimensional spheroid)模型：取1×104个293T细胞，种植于超低吸附96孔板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱内培养，24小时后，细胞聚集成规则的圆球形，直径约600μm；
(2)Jurkat细胞浸润3D细胞球：分别取1×104、3×104、6×104个NRP1-L修饰Jurkat细胞，加入3D细胞球中，共培养48小时；
(3)高内涵显微镜分析Jurkat细胞在3D细胞球内部的分布情况：48小时后，PBS清洗3D细胞球3次，用高内涵显微镜断层扫描3D细胞球内部GFP荧光细胞的分布，通过统计荧光总体强度，可见不同Jurkat细胞数量条件下，NRP1-L修饰Jurkat处理组3D细胞球内部GFP荧光强度均显著强于Jurkat-野生型Jurkat；
表中1×104、3×104、6×104个Jurkat细胞条件下，3D细胞球内部的GFP荧光强度定量。
(4)流式细胞术分析3D细胞球内部Jurkat细胞的占比：48小时，PBS清洗3D细胞球3次，加入200微升胰酶消化3分钟，吹打5次将3D细胞球吹散成单细胞悬液，通过流式细胞术分析单细胞悬液中Jurkat细胞的占比，可见不同Jurkat细胞数量条件下，NRP1-L修饰Jurkat在3D细胞球内部细胞数量占比均显著高于Jurkat-GFP对照和野生型Jurkat。
表中1×104、3×104、6×104个Jurkat细胞条件下，3D细胞球内部的Jurkat细胞的数量。
尽管已经示出和描述了本发明专利的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明专利的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明专利的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种NRP1配体的修饰技术，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1：NRP1-L慢病毒表达载体：事先准备好材料，NRP1-L基因序列密码子优化后，通过基因全合成的方式合成DNA，然后通过Gibson组装克隆到慢病毒载体pLVX(Clontech)；
步骤2：NRP1-L病毒载体的构建：计数3×106个293T细胞，悬浮于10ml无血清DMEM培养基，接种在10cm培养皿上，待细胞贴壁占培养皿总面积50％以上后进行转染；将TCR慢病毒载体和慢病毒包装质粒pmd2.G、pSPAX2以2：1：1的比例混合，转染到293T细胞，置于37℃、5％CO2细胞培养箱内孵育；转染24小时后更换一次新鲜DMEM培养基，72小时收集包含病毒的培养上清，分装冻存；
步骤3：NRP1-L修饰Jurkat细胞的转染及培养：计数Jurkat细胞，加入10％FBS/RPMI-1640培养基，调整细胞浓度至1×106/ml，每孔1ml；加入500μL病毒上清液，添加精蛋白硫酸盐(终浓度8μg/ml)，置于37℃、5％CO2细胞培养箱内孵育2小时；离心弃病毒上清液，添加1ml 10％FBS/RPMI-1640培养基，置于细胞培养箱内培养3天；
步骤4：NRP1-L修饰Jurkat细胞的培养及扩增：取1×106个细胞进行NRP1-L抗体染色，流式细胞术检测NRP1-L/GFP双阳性细胞的比例，鉴定感染效率，同时GFP转染Jurkat细胞作为对照；将培养孔中细胞转移至T25培养瓶中扩增，添加10％FBS/RPMI-1640配置培养基至10ml，置于细胞培养箱内培养3天；
步骤5：构建3D细胞球(three-dimensional spheroid)模型：取1×104个293T细胞，种植于超低吸附96孔板，置于37℃、5％CO2细胞培养箱内培养，直至24小时后；
步骤6：Jurkat细胞浸润3D细胞球：分别取1×104、3×104、6×104个NRP1-L修饰Jurkat细胞，加入3D细胞球中，共培养48小时；
步骤7：高内涵显微镜分析Jurkat细胞在3D细胞球内部的分布情况：48小时后，PBS清洗3D细胞球3次，用高内涵显微镜断层扫描3D细胞球内部GFP荧光细胞的分布，通过统计荧光总体强度，可见不同Jurkat细胞数量条件下，NRP1-L修饰Jurkat处理组3D细胞球内部GFP荧光强度均显著强于Jurkat-GFP对照和野生型Jurkat；
步骤8：流式细胞术分析3D细胞球内部Jurkat细胞的占比：48小时，PBS清洗3D细胞球3次，加入200微升胰酶消化3分钟，吹打5次将3D细胞球吹散成单细胞悬液，通过流式细胞术分析单细胞悬液中Jurkat细胞的占比，可见不同Jurkat细胞数量条件下，NRP1-L修饰Jurkat在3D细胞球内部细胞数量占比均显著高于Jurkat-GFP对照和野生型Jurkat。
2.根据权利要求1所述的一种NRP1配体的修饰技术，其特征在于：所述在步骤1中，准备的材料包括：
(1)RPMI-1640培养基(Hyclone，Catalog number SH30809.01)
(2)DMEM高糖培养基(Hyclone，Catalog number SH30243.01)
(3)胎牛血清(FBS，Gibco，Catalog number 26140079)
(4)双抗(Hyclone，Catalog number SH40003.01)
(5)0.25％胰酶(Hyclone，Catalog number SH30042.02)
(6)无血清细胞冻存液：BAMBANKER(GC Lymphotec Inc，Catalog number 302-14681)
(7)NRP1-L慢病毒表达载体(上海朗晶，基因全合成)
(8)慢病毒包装质粒pMD2.G和pSPAX2(Addgene)
(9)精蛋白硫酸盐(Sigma Aldrich，Catalog number 53597-25-4)
(10)293T细胞(ATCC，Catalog number CRL-3216TM)
(11)Jurkat细胞(ATCC，Catalog number TIB-152TM)
(12)NRP1-L抗体(Bioss，Catalog number bs-0297G-APC)
(13)超低吸附96孔板(corning，Catalog number 7007)。
3.根据权利要求1所述的一种NRP1配体的修饰技术，其特征在于：所述在步骤1中，NRP1-L氨基酸序列：
METDTLLLWVLLLWVPGSTGDHTPGNSNKWKHLQENKKGRPRRGGGGSGGGGSGGGGSEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSIYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT*。
4.根据权利要求1所述的一种NRP1配体的修饰技术，其特征在于：所述在步骤2中，分装冻存，冻存的温度为-80℃长期保存。
5.根据权利要求1所述的一种NRP1配体的修饰技术，其特征在于：所述在步骤3中，置于5％CO2细胞培养箱内培养时，温度保持37℃。
6.根据权利要求1所述的一种NRP1配体的修饰技术，其特征在于：所述在步骤4中，置于5％CO2细胞培养箱内培养时，温度保持37℃。
7.根据权利要求1所述的一种NRP1配体的修饰技术，其特征在于：所述在步骤5中，直至24小时后，细胞聚集成规则的圆球形，直径约600μm。
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