CN112516297A - 一种基于鱼精蛋白为载体的抗原和佐剂共传递纳米疫苗的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种基于鱼精蛋白为载体的抗原和佐剂共传递纳米疫苗，所述纳米疫苗，包括载体、抗原、佐剂；所述载体为鱼精蛋白硫酸盐；本发明还提供上述疫苗的制备方法和应用，本发明制备的纳米疫苗能够有效提升抗原提呈细胞对抗原和佐剂的摄取效率，高效刺激抗原提呈细胞的成熟，并协助抗原实现交叉呈递，显著提升抗原和佐剂的体内传递效率，激发机体产生高效的体液免疫和细胞免疫，同时产生免疫记忆效应。通过对小鼠皮下黑色素瘤进行体内治疗，证实该纳米疫苗具有良好的抗肿瘤免疫治疗效果。本发明所述的纳米疫苗结构简单、制备便捷且免疫治疗性能优异，具有良好的应用潜力。

Description

一种基于鱼精蛋白为载体的抗原和佐剂共传递纳米疫苗的制 备方法及其应用

技术领域

本发明涉及免疫学技术领域，尤其涉及一种基于鱼精蛋白为载体的纳米疫苗的制备方法与应用。

背景技术

肿瘤已经成为严重危害人类健康的疾病，传统的肿瘤治疗方法如化疗、放疗、手术切除，很难抑制肿瘤在体内的转移和复发，难以实现肿瘤根除。而肿瘤免疫疗法通过激发和增强机体的免疫功能杀伤肿瘤细胞，在彻底地根治肿瘤方面展现出了极大的希望。

近年来，免疫疗法在抗肿瘤治疗领域受到了极大关注，免疫治疗目前常用的方法有：过继淋巴细胞疗法(T细胞、NK细胞)、细胞因子疗法、基因疗法、抗肿瘤抗体治疗、免疫检查点(PD-1/PD-L1、CTLA-4)阻断治疗和肿瘤疫苗等。在众多免疫类型中，肿瘤疫苗是一种较为理想的主动免疫治疗方式，具有良好的特异性。通过将肿瘤抗原导入患者体内，激发患者自身免疫系统，从而达到控制或清除肿瘤的目的。

肿瘤蛋白和多肽亚单位疫苗存在的主要问题是该类抗原的免疫原性较差，且在体内传递效率较低。纳米材料的引入可以有效改善抗原体内传递效率，增强抗原免疫原性，优化疫苗治疗方案。另一方面，纳米疫苗可实现抗原和佐剂的共同递送，有助于激发机体产生更为强劲的抗肿瘤免疫应答，提升治疗效率。因此，纳米疫苗已成为肿瘤免疫治疗领域的研究热点。目前现有的纳米疫苗体系大多载体结构复杂、制备繁琐，难以转化应用。

现有技术CN109939229A公开了一种自组装的纳米佐剂及由该佐剂形成的纳米疫苗的制备方法与应用，所述纳米疫苗由以下浓度的原料组成：羧甲基葡聚糖溶液0.5-3mg/mL，鱼精蛋白硫酸盐溶液0.3-1.8mg/mL，病毒抗原终浓度0.4-0.025mg/mL，CpG寡脱氧核苷酸终浓度0.2-0.0125mg/mL。

上述纳米疫苗的制备步骤如下:

(1)用去离子水制备羧甲基葡聚糖溶液，并过0.22μm的微孔滤膜，羧甲基葡聚糖溶液浓度为0.5-3mg/mL

(2)用去离子水制备鱼精蛋白硫酸盐溶液，并过0.22μm的微孔滤膜，鱼精蛋白硫酸盐溶液浓度为0.3-1.8mg/mL。

(3)将病毒抗原与CpG寡脱氧核苷酸溶于上述(1)中的羧甲基葡聚糖溶液中，其中，病毒抗原终浓度为0.4-0.025mg/mL，CpG寡脱氧核苷酸终浓度为0.2-0.0125mg/mL。

(4)将上述(2)中的鱼精蛋白硫酸盐溶液逐滴滴加到上述(3)中的溶液中，使用磁力搅拌器搅拌5-60min，放置稳定，离心，去除上清液，分散，用超纯水复溶，即得包载病毒抗原与CpG寡脱氧核苷酸的纳米疫苗。

上述专利使用的鱼精蛋白与CpG寡脱氧核苷酸自组装形成纳米佐剂，制备的纳米疫苗仅作为预防性疫苗使用。

现有技术中可溶性蛋白和多肽抗原的免疫原性较差且体内抗原传递效率低，严重影响该类抗原的免疫治疗效果。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺陷和不足，本发明提供了一种基于鱼精蛋白为载体的抗原和佐剂共传递纳米疫苗及其制备方法和应用，实现以下发明目的：本发明制备的纳米疫苗有效提升树突状细胞对抗原和佐剂的内吞效率，高效刺激树突状细胞成熟，激发机体产生高效的细胞免疫及免疫记忆反应，实现有效的免疫治疗效果；制备方法简单易重复，适合大规模生产。

为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：

一种基于鱼精蛋白为载体的抗原和佐剂共传递纳米疫苗，包括载体、抗原、佐剂；

以下是对上述技术方案的进一步改进：

所述载体为带正电的鱼精蛋白硫酸盐(PRT)；

所述抗原为带负电的蛋白或多肽抗原；

所述抗原为肿瘤细胞表面洗脱的抗原多肽或肿瘤细胞内部异常表达的蛋白相关多肽。

所述的带负电的蛋白或多肽抗原包含如下抗原中的一种：酪氨酸酶相关蛋白2(Trp2)肿瘤蛋白抗原及其衍生的多肽抗原；黑色素瘤相关抗原gp100；P1A，MAGE，BAGE在内的CT肿瘤抗原；黏蛋白1(MUC1)糖肽肿瘤抗原；肿瘤模型抗原OVA蛋白及其衍生多肽抗原；其他本领域技术人员熟知的肿瘤蛋白及多肽抗原市售产品。

所述佐剂为带负电的非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)；

本发明所述的载体PRT是一种天然强碱性多聚阳离子多肽，富含精氨酸，其稳定性高，免疫原性低，且生物安全性好，同时可提高疫苗在体内的传递效率。

所述载体、抗原和佐剂之间的质量比是(1～20)：1：0.5，优选为(1～10)：0.5：1；

优选的是，所述纳米疫苗的粒径为50～500nm，优选为220-350nm。

本发明还提供了上述纳米疫苗的制备方法，包括以下步骤：

1)将PRT溶解于PBS缓冲溶液中，得到PRT溶液；

2)将蛋白或多肽抗原物质溶解于PBS缓冲溶液中，得到抗原溶液；

3)将CpG溶解于PBS缓冲溶液中，得到CpG溶液；

4)将所述PBS溶液、抗原溶液和CpG溶液混合涡旋，静置反应，得到纳米疫苗；

上述PBS缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液，浓度为0.01M，pH为7.2-7.4。

所述步骤1)、步骤2)和步骤3)之间没有时间顺序限制。

所述步骤1)中PRT溶液的浓度为0.1～20g/L；优选为1-10g/L；

所述步骤2)中蛋白或多肽抗原溶液的浓度为0.1～5g/L；优选为0.5-2g/L；

所述步骤3)中CpG溶液的浓度为0.1～5g/L，优选为0.5-2g/L；

所述步骤4)中静置反应的温度为20～30℃，优选为25℃，静置时间为20～30min。

所述涡旋时间为10-30s。

本发明采用的载体鱼精蛋白是一种富含精氨酸的天然聚阳离子多肽，其稳定性高且生物安全性良好。基于天然多聚阳离子鱼精蛋白为载体的纳米疫苗的制备可通过静电吸附以及物理缠绕作用完成。

本发明利用鱼精蛋白(PRT)作为载体材料，该材料作为一种天然的聚阳离子多肽，具有良好的阳离子特性，其稳定性高、免疫原性低且生物安全性好。利用PRT作为载体构建结构简单、制备方便、性能稳定的纳米疫苗，同时实现对抗原和佐剂的共递送，不仅能够增强抗原的免疫原性，而且能够提高疫苗的体内传递效率。该纳米疫苗注射到机体后，带正电的PRT可促进纳米疫苗在抗原提呈细胞中的摄取，进一步协助抗原进行交叉提呈，刺激抗原提呈细胞的成熟，提升疫苗的体内传递效率，激发机体产生高效的细胞免疫及免疫记忆反应，实现有效的免疫治疗效果。同时，该方案也具有良好的灵活性和可拓展性，可根据治疗疾病类型和特点选择相应的负电性佐剂和抗原，有利于针对具体病例进行个性化治疗。而且，PRT材料为FDA批准的可用于临床的安全材料，本发明中该纳米疫苗体系具有极大的临床应用及转化潜力。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明所述纳米疫苗，实现对抗原和佐剂的共传递，促进纳米疫苗在抗原提呈细胞中的摄取，协助抗原交叉提呈，刺激抗原提呈细胞的成熟，有效提升树突状细胞对抗原和佐剂的内吞效率，提升疫苗的体内传递效率，激发机体产生高效的细胞免疫及免疫记忆反应，实现有效的免疫治疗效果；解决了肿瘤蛋白和多肽亚单位疫苗免疫原性较差，且在体内传递效率较低等问题。该纳米疫苗可用于预防性和治疗性疫苗领域。

(2)本发明制备的纳米疫苗，电位为8.3-29.8mV，粒径为50～500nm，PDI为0.175-0.312；

(3)本发明制备的纳米疫苗有利于促进抗原和佐剂在抗原提呈细胞中的内吞，抗原和佐剂在抗原提呈细胞中的内吞率为70-81％；

(4)本发明制备的纳米疫苗，促进树突状细胞的成熟，细胞表面共刺激分子CD80的表达率为73.5-76％；CD86的表达率为70-74％；

(5)本发明制备的纳米疫苗，促进BMDCs分泌免疫活化细胞因子，上清液中TNF-α的含量为49-52ng/L，IL-6的含量为26-30ng/L。

(6)本发明制备的纳米疫苗能够在体内高效激活细胞免疫系统的功能，小鼠三次免疫纳米疫苗后，其肿瘤组织中CD8+ T细胞的含量为5.3-5.6％，T细胞的含量为8.3-8.9％。

(7)本发明制备的纳米疫苗能够在体内高效激活体液免疫系统的功能，小鼠三次免疫纳米疫苗后，小鼠血清中Anti-OVA IgG(滴度)为4.3-4.7，IgG2a/IgG1(浓度比)为0.43-0.59。

(8)本发明制备的纳米疫苗具有更好的肿瘤抑制效果，第20天，肿瘤体积为CpG/OVA组肿瘤体积的25-30％。

(9)本发明制备的纳米疫苗能够在体内高效激活免疫记忆反应，说明纳米疫苗具有突出的免疫记忆保护作用，小鼠在再次受到肿瘤的侵袭后，其脾脏组织中EM细胞(CD3⁺CD44⁺CD62L^-)的含量为25.68-30.53％。

附图说明

图1是为PBS、CpG/OVA、纳米疫苗PRT/CpG/OVA在小鼠肿瘤的免疫治疗效果。

具体实施方式

本发明所述纳米疫苗提高了抗原的免疫原性，增强了抗原提呈细胞对纳米疫苗的摄取，高效刺激树突状细胞的成熟，有效激发机体产生特异性的细胞免疫和免疫记忆反应，有效识别杀伤肿瘤，实现高效的抗肿瘤免疫治疗效果。实验结果表明，本发明提供的纳米疫苗，能够明显提高抗原及佐剂在抗原提呈细胞中的摄取量，并高效刺激树突状细胞成熟；采用该纳米疫苗免疫小鼠三次后，能够明显激活体内细胞免疫及免疫记忆反应。

通过PRT载体实现抗原和佐剂的共递送，正电性的PRT提高了抗原及佐剂在抗原提呈细胞中的摄取量，从而高效刺激树突状细胞的成熟，并介导抗原的交叉提呈，显著提升抗原和佐剂的体内传递效率，激发机体产生高效的体液免疫和细胞免疫，同时产生免疫记忆效应。

在本发明中，所述溶解方式包括搅拌溶解或超声溶解，为了使PRT完全分散溶解。本发明对所述超声和搅拌的条件没有特殊的限定，能够使天然多聚阳离子鱼精蛋白完全溶解即可。本发明对所述PRT的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的PRT的市售产品即可。

本发明将蛋白或多肽抗原物质溶解于PBS缓冲溶液中，得到抗原溶液。在本发明中，所述溶解方式包括超声溶解或搅拌溶解，为了使抗原物质完全分散溶解。本发明对所述超声和搅拌的条件没有特殊的限定，能够使抗原物质完全溶解即可。本发明对所述抗原物质的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的蛋白或多肽抗原物质的市售产品即可。

本发明将CpG溶解于PBS缓冲溶液中，得到CpG溶液。在本发明中，所述溶解方式包括超声溶解或搅拌溶解，为了使CpG完全分散溶解。本发明对所述超声和搅拌的条件没有特殊的限定，能够使CpG完全溶解即可。本发明对所述CpG的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的CpG的市售产品即可。

在本发明中，将PRT溶液、抗原溶液和CpG溶液混合的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规混合方式将三者混匀即可，如可通过涡旋处理、搅拌等方式将三者混合。

在本发明中，将PRT溶液、抗原溶液和CpG溶液混合均匀后，进行静置反应处理，在静置处理过程中，PRT静电吸附带负电的免疫抗原和CpG，构成抗原和佐剂共传递纳米疫苗。

下面结合实施例，对本发明提供的基于鱼精蛋白为载体的纳米疫苗及其制备方法进行详细的描述，但是不能将它们理解为对本申请保护范围的限定。

下述实施例2-4中，CpG/OVA组的制备为：将OVA溶解于PBS缓冲溶液中，得到OVA溶液；将CpG溶解于PBS缓冲溶液中，得到CpG溶液。将OVA溶液和CpG溶液混合，涡旋处理20s后，室温下静置放置25min，得到CpG/OVA组疫苗。

下述实施例2-4中，PBS和PRT与实施例1中的原料相同，作为对照组。

实施例1

纳米疫苗的制备

将PRT溶解于PBS缓冲溶液中，PRT的浓度为0.1-20mg/mL，形成PRT溶液。将卵清蛋白(OVA，作为模型抗原)溶解于PBS缓冲溶液中，OVA的浓度为0.1-5mg/mL，形成OVA溶液。将CpG溶解于PBS缓冲溶液中，CpG的浓度为0.1-5mg/mL，形成CpG溶液。将PRT溶液、OVA溶液和CpG溶液三者混合，涡旋处理20s后，室温下静置放置25min，得到纳米疫苗PRT/CpG/OVA。

实施例2

纳米疫苗粒径分布

将实施例1制备得到纳米疫苗进行粒径分布研究。使用纳米粒度及Zeta电位分析仪测定其平均粒径、Zeta电位和粒径分散指数(PDI)。结果参照表1。

表1实施例1的电位、粒径和PDI测试结果

实施例3

效果实验

(1)纳米疫苗在抗原提呈细胞中的内吞

选用小鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)，从小鼠体内获取骨髓细胞，体外刺激诱导，培养七天后分化成BMDCs。BMDCs培养七天后，用移液枪吸取培养基轻吹细胞，收集细胞悬浮液置于15mL离心管，1000rpm，3min离心收集细胞；按照每孔1×10⁶细胞的密度接种于6孔板培养，置于37℃含体积分数5％二氧化碳培养箱中继续培养过夜。之后加入样品材料(样品分别为：PBS、CpG/OVA-FITC和PRT/CpG/OVA-FITC，加入量为OVA的终浓度为5μg/mL)，继续培养4h，然后采用流式细胞仪检测抗原和佐剂的内吞。

上述的OVA-FITC是经过异硫氰酸荧光素FITC标记的OVA，通过荧光素对OVA进行标记，以用于流式细胞仪的检测。

表2实施例1中纳米疫苗在抗原提呈细胞中的内吞结果

结果表明，采用纳米疫苗后，抗原和佐剂在抗原提呈细胞中的内吞量均显著增加。证明，形成纳米疫苗有利于促进抗原和佐剂在抗原提呈细胞中的内吞。

(2)纳米疫苗刺激抗原提呈细胞的成熟

BMDCs培养七天后，用移液枪吸取培养基轻吹细胞，收集细胞悬浮液置于15mL离心管，1000rpm，3min离心收集细胞；按照每孔1×10⁶细胞的密度接种于6孔板培养，置于37℃含体积分数5％二氧化碳培养箱中继续培养过夜。之后加不同组分材料(分别为：PBS、LPS、PRT、CpG/OVA和PRT/CpG/OVA，加入量为OVA的终浓度为5μg/mL)，继续培养24h；然后采用流式技术检测BMDCs表面共刺激分子的表达，细胞表面共刺激分子(CD80，CD86)的上调是DCs成熟的标志。

表3实施例1中共刺激分子的表达结果

LPS是脂多糖，作为检测抗原提呈细胞成熟的阳性对照；

PBS和PRT与实施例1中的原料相同。

结果表明，相比于PBS组和CpG/OVA组，PRT/CpG/OVA能够有效上调BMDCs上CD80和CD86分子的表达，说明实施例1制备的纳米疫苗不仅能够增强抗原佐剂的内吞，而且能够促进树突状细胞的成熟。

(3)纳米疫苗促进BMDCs分泌免疫活化细胞因子

BMDC培养七天后，用移液枪吸取培养基轻吹细胞，收集细胞悬浮液置于15mL离心管，1000rpm，3min离心收集细胞；按照每孔1×10⁶细胞的密度接种于6孔板培养，置于37℃含体积分数5％二氧化碳培养箱中继续培养过夜。之后加不同组分材料(分别为：PBS、LPS、PRT、CpG/OVA和PRT/CpG/OVA，加入量为OVA终浓度为5μg/mL)，继续培养24h，离心收集培养上清检测细胞因子含量。

表4实施例1中因子分泌结果

测试结果参见表4，可以看出，细胞因子分泌的结果与成熟实验结果一致。相比PBS组和CpG/OVA组，纳米疫苗组明显促进BMDC细胞分泌免疫活化细胞因子TNF-α和IL-6。

实施例4

体内免疫学评价

(1)纳米疫苗激活体内细胞免疫

采用18g左右的C57BL/6小鼠，对小鼠进行随机分组，每组6只，将2×10⁶个小鼠B16-OVA黑色素瘤细胞接种于小鼠背部。次日，对小鼠进行皮下免疫不同材料(分别是：PBS、CpG/OVA和PRT/CpG/OVA，每只小鼠的注射剂量以OVA为30μg为准)，之后每七天进行免疫一次，共计三次。第三次免疫七天后，将小鼠脱臼处死，提取小鼠肿瘤置于10mL Ep管，剪碎，用注射器活塞芯轻轻研压肿瘤组织，过200目网筛，冰PBS缓冲溶液冲洗，获取细胞悬液。吸取部分细胞悬液分别进行细胞分子标记，经过4℃孵育30min后，PBS缓冲溶液离心洗涤，流式细胞仪检测。

表5实施例1中免疫细胞检测结果

体内实验结果表明，相对于PBS组和CpG/OVA组，小鼠三次免疫纳米疫苗后，其肿瘤组织中CD8⁺ T细胞和T细胞的含量明显增加，说明实施例1制备的纳米疫苗能够在体内高效激活细胞免疫系统的功能。

(2)纳米疫苗激活体液免疫

采用18g左右的C57BL/6小鼠，对小鼠进行随机分组，每组6只，将2×10⁶个小鼠B16-OVA黑色素瘤细胞接种于小鼠背部。次日，对小鼠进行皮下免疫不同材料(分别是：PBS、CpG/OVA和PRT/CpG/OVA，每只小鼠的注射剂量以OVA为30μg为准)，之后每七天进行免疫一次，共计三次。第三次免疫七天后，取小鼠血清，用ELISA方法进行OVA特异性血清抗体(总IgG、IgG1和IgG2a亚型)的浓度的测量。

表6实施例1中特异性抗体检测结果

体内实验结果表明，相对于PBS组和CpG/OVA组，其血清中的OVA特异性血清抗体(总IgG、IgG1和IgG2a亚型)的浓度含量明显增加，说明实施例1制备的纳米疫苗能够在体内高效激活体液免疫系统的功能。

(3)纳米疫苗的抑瘤实验

采用18g左右的C57BL/6小鼠，对小鼠进行随机分组，每组6只，将2×10⁶个小鼠B16-OVA黑色素瘤细胞接种于小鼠背部。次日，对小鼠进行皮下免疫不同材料(分别是：PBS、CpG/OVA和PRT/CpG/OVA，每只小鼠的注射剂量以OVA为30μg为准)，之后每七天进行免疫一次，共计三次。随着肿瘤生长，在小鼠背部出现肉眼可见，定期测量肿瘤大小，以此评价肿瘤抑制效果。测试方法如下：用游标卡尺测量小鼠肿瘤的长(最长径)和宽(垂直于最长径方向的宽度)，肿瘤体积按照公式【长×(宽×宽)/2】计算。结果如图1所示。PRT/CpG/OVA具有更好的肿瘤抑制效果。

本发明组PRT/CpG/OVA疫苗，PRT、CpG、OVA的质量比为4：0.5：1。

第20天各组肿瘤体积如下：

PBS：2411.181mm³；CpG/OVA：1326.149mm³；PRT/CpG/OVA：361.677mm³。

(4)纳米疫苗激活体内免疫记忆反应

采用18g左右的C57BL/6小鼠，对小鼠进行随机分组，每组6只，将2×10⁶个小鼠B16-OVA黑色素瘤细胞接种于小鼠背部。次日，对小鼠进行皮下免疫不同材料(分别是：PBS、CpG/OVA和PRT/CpG/OVA，每只小鼠的注射剂量以OVA为30μg为准)。之后每七天进行免疫一次，共计三次。在最后一次免疫治疗后，再次对小鼠注射2×10⁶个小鼠B16-OVA黑色素瘤细胞，并在第32天后，将小鼠脱臼处死，提取小鼠脾脏置于10mL Ep管，剪碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏组织，过200目网筛，冰PBS缓冲溶液冲洗，获取细胞悬液。吸取部分细胞悬液分别进行细胞分子标记，经过4℃孵育30min后，PBS缓冲溶液离心洗涤，流式细胞仪检测。

表7实施例1中免疫细胞检测结果

体内实验结果表明，相对于PBS组和CpG/OVA组，小鼠在再次受到肿瘤的侵袭后，其脾脏组织中EM细胞(CD3⁺CD44⁺CD62L^-)的含量明显增加，说明实施例1制备的纳米疫苗能够在体内高效激活免疫记忆反应，说明纳米疫苗具有突出的免疫记忆保护作用。

通过PRT可以实现负电性抗原和佐剂CpG的共同递送，借助上述三种组分之间的静电吸附以及物理缠绕作用形成抗原和佐剂共传递纳米疫苗。本发明中发现PRT能够有效提升抗原提呈细胞对抗原和佐剂的摄取效率，高效刺激抗原提呈细胞的成熟，并协助抗原实现交叉呈递，显著提升抗原和佐剂的体内传递效率。本发明制备的纳米疫苗皮下注射到小鼠体内，可激发小鼠体内产生高效的体液免疫和细胞免疫，同时产生免疫记忆效应。通过对小鼠皮下黑色素瘤进行体内治疗，证实该纳米疫苗具有良好的抗肿瘤免疫治疗效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种基于鱼精蛋白为载体的抗原和佐剂共传递纳米疫苗，其特征在于：所述纳米疫苗，包括载体、抗原、佐剂；所述载体为鱼精蛋白硫酸盐。

2.根据权利要求1所述的纳米疫苗，其特征在于：所述载体为带正电的鱼精蛋白硫酸盐；所述抗原为带负电的蛋白或多肽抗原；所述佐剂为带负电的非甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤。

3.根据权利要求1所述的纳米疫苗，其特征在于：所述载体、抗原和佐剂之间的质量比是(1～20)：1：0.5。

4.根据权利要求1所述的纳米疫苗，其特征在于：所述纳米疫苗的粒径为50～500nm。

5.根据权利要求1所述的纳米疫苗，其特征在于：所述抗原为肿瘤细胞表面洗脱的抗原多肽或肿瘤细胞内部异常表达的蛋白相关多肽。

6.根据权利要求1所述的纳米疫苗，其特征在于：所述抗原包括酪氨酸酶相关蛋白2及其衍生多肽肿瘤抗原；黑色素瘤相关抗原gp100；包括P1A，MAGE，BAGE在内的CT肿瘤抗原；黏蛋白1(MUC1)糖肽肿瘤抗原；肿瘤模型抗原OVA蛋白及其衍生多肽抗原。

7.一种基于鱼精蛋白为载体的抗原和佐剂共传递纳米疫苗的制备方法，其特征在于：

所述制备方法，包括以下步骤：

1)将载体溶解于PBS缓冲溶液中，得到载体溶液；

2)将抗原溶解于PBS缓冲溶液中，得到抗原溶液；

3)将佐剂溶解于PBS缓冲溶液中，得到佐剂溶液；

4)将上述三种溶液混合，静置反应，得到纳米疫苗；

所述步骤1)、步骤2)和步骤3)之间没有时间顺序限制。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中载体溶液的浓度为0.1～20g/L；

所述步骤2)中抗原溶液的浓度为0.1～5g/L；

所述步骤3)中佐剂溶液的浓度为0.1～5g/L。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述静置反应的温度为20～30℃，时间为20～30min。

10.权利要求1～9任意一项所述的纳米疫苗的应用，其特征在于，所述纳米疫苗用于预防性和治疗性疫苗领域。

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