CN112501267A - 一种rna外切酶-纳米孔复合体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种RNA外切酶‑纳米孔复合体及其制备方法和应用。该应用为RNA的测序方法，包括以下步骤：采用RNA外切酶‑纳米孔复合体，先利用RNA外切酶将测序样品从一端开始，依次切下单个核苷酸并通过纳米孔，再利用核苷酸通过纳米孔的特征，进行基础核苷酸和修饰核苷酸判定；如判定结果为基础核苷酸，则记录其AUCG的种类及顺序；如判定结果为修饰核苷酸，则记录其位置，并通过其他谱学特征检测其化学修饰的种类；通过上述过程，得到测序样品的核苷酸及其化学修饰的序列信息，实现RNA序列的直读。RNA外切酶‑纳米孔复合体包括：纳米孔结构；固定在纳米孔结构内的RNA外切酶。该RNA外切酶‑纳米孔复合体能够用于RNA直测，测序速度快且能够保障各种修饰核苷酸都能够被测定。

Description

一种RNA外切酶-纳米孔复合体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因测序技术领域，更具体地说，是涉及一种RNA外切酶-纳米孔复合体及其制备方法和应用。

背景技术

RNA是组成生命的重要大分子物质，是细胞、生命体行驶生物学功能的重要物质基础。RNA是由A、U、C、G四种基础核苷酸(nucleotide，nt)组成的单链、长链大分子。此外，A、U、C、G四种核苷酸还会在酶的催化下形成不同化学基团修饰的核苷酸，这些修饰同样具有重要的生物学功能。生物医学研究需要了解样品中每个RNA单分子的核苷酸序列，以及哪个位置上的核苷酸进行了何种化学修饰，即单分子RNA序列(包括修饰核苷酸)直测。在天然RNA分子中，主要为基础核苷酸，而修饰核苷酸的比例一般仅在0.1％左右，但是种类繁多，已知的有170余种不同化学结构的修饰核苷酸，在单分子水平准确区分具有相当挑战。

现有的RNA直测技术包括纳米孔测序和光谱检测两种。纳米孔测序的速度快，～1000nt/秒，但是只能分辨A、U、C、G四种基础核苷酸以及种类有限的几种修饰核苷酸；拉曼光谱等谱学检测能够区分上百种修饰核苷酸，但是速度很慢，检测单个核苷酸的积分时间通常在1秒以上，而且很难实现单分子水平的并行化检测。即使应用特定的光学结构设计，增益拉曼光谱信号，并缩短积分时间至100ms(CN110628599A)，也很难实现100个以上的并行化检测。因此，对于常规的单个细胞的RNA测序样本，常包含1×10⁹个核苷酸，单独以光谱检测仍需要>100天的时间，远远不能满足实际应用的需要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种RNA外切酶-纳米孔复合体及其制备方法和应用，本发明提供的RNA外切酶-纳米孔复合体能够用于RNA直测，测序速度快且能够保障各种修饰核苷酸都能够被测定。

本发明提供了一种RNA外切酶-纳米孔复合体，包括：

纳米孔结构；

固定在所述纳米孔结构内的RNA外切酶。

所述的RNA外切酶在水解基础核苷酸(AUCG)和大部分修饰核苷酸单体时的速度存在明显差异。

优选的，所述纳米孔结构为蛋白质纳米孔；所述蛋白质纳米孔通过融合蛋白技术将RNA外切酶融合表达并自组装，形成RNA外切酶和蛋白质纳米孔的偶联体。

优选的，所述蛋白质纳米孔为修饰β-环糊精的α-溶血素蛋白纳米孔、MspA、CsgG或其他可用于测序的纳米孔。

优选的，所述纳米孔结构为固态纳米孔；所述固态纳米孔通过点击化学方法将RNA外切酶引导并修饰在固态纳米孔附近，形成RNA外切酶和固态纳米孔的偶联结构。

优选的，所述RNA外切酶包括原核生物的RNA外切酶或其突变体。

本发明还提供了一种上述技术方案所述的RNA外切酶-纳米孔复合体的制备方法，包括以下步骤：

a)构建RNA外切酶纳米孔复合体固态支撑结构，

b)将RNA外切酶-蛋白纳米孔融合蛋白镶嵌于所述固态支撑结构内，形成RNA外切酶-纳米孔复合体；或在固态支撑结构内制备针尖纳米孔，再将RNA外切酶固定在其边缘附近，形成RNA外切酶-纳米孔复合体。

本发明还提供了一种RNA的测序方法，包括以下步骤：

采用上述技术方案所述的RNA外切酶-纳米孔复合体，首先利用RNA外切酶将测序样品从一端开始，依次切下单个核苷酸并通过纳米孔，然后利用核苷酸通过纳米孔的特征，进行基础核苷酸和修饰核苷酸判定；

如判定结果为基础核苷酸，则记录其AUCG的种类及顺序；

如判定结果为修饰核苷酸，则记录其位置，并通过谱学特征检测确定其化学修饰的种类；

通过上述过程，得到所述测序样品的核苷酸的序列信息，实现RNA序列的直读。

优选的，所述利用核苷酸通过纳米孔的特征，进行基础核苷酸和修饰核苷酸判定的过程具体为：

在纳米孔两侧灌注高盐溶液，并施加正负电极，形成跨膜电压和跨纳米孔的离子电流，并应用膜片钳放大电路记录离子电流；

核苷酸从负电极侧进入所述高盐溶液，在电场驱动下通过纳米孔，涌向正电极；

以核苷酸通过纳米孔时离子电流信号出现的短暂降低，记录为一次跨孔事件，根据核苷酸通过纳米孔时与前次跨孔事件的时间间隔，判断通过纳米孔的核苷酸是基础核苷酸还是修饰核苷酸。

优选的，所述纳米孔正电极一侧设计“Y”型纳流通道，在两个分叉通道内分别设置基础核苷酸捕获电极和修饰核苷酸的捕获电极；

所述基础核苷酸捕获电极打开，驱动单核苷酸通过纳米孔，并进入其所在通道；当修饰核苷酸通过纳米孔时，因其跨孔事件时间间隔增大，则通过反馈电路设计启动所述修饰核苷酸捕获电极使其捕获电压高于基础核苷酸捕获电极的捕获电压，将修饰核苷酸吸附至另一个通道，实现修饰核苷酸的分选；

上述修饰核苷酸通过纳米孔进入分叉通道后，迅速降低修饰核苷酸的捕获电压，使其低于所述基础核苷酸捕获电极的电压，保证后续基础核苷酸进入正确通道。

优选的，所述检测修饰核苷酸化学修饰种类的方法选自单分子拉曼光谱、荧光光谱、红外光谱、吸收光谱、反射光谱、质谱、介电特性和能谱中的一种或多种。

本发明提供了一种RNA外切酶-纳米孔复合体及其制备方法和应用。该应用为一种RNA的测序方法，包括以下步骤：采用RNA外切酶-纳米孔复合体，首先利用RNA外切酶将测序样品从一端开始，依次切下单个核苷酸并通过纳米孔，然后利用核苷酸通过纳米孔的特征，进行基础核苷酸和修饰核苷酸判定；如判定结果为基础核苷酸，则记录其AUCG的种类及顺序；如判定结果为修饰核苷酸，则记录其位置，并检测其化学修饰的种类；通过上述过程，得到所述测序样品的核苷酸的序列信息，实现RNA序列的直读。所述RNA外切酶-纳米孔复合体包括：纳米孔结构；固定在所述纳米孔结构内的RNA外切酶。与现有技术相比，本发明提供的RNA外切酶-纳米孔复合体能够用于RNA直测，测序速度快且能够保障各种修饰核苷酸都能够被测定。

附图说明

图1为本发明实施例中RNase R水解修饰核苷酸的速度变慢的示意图；

图2为本发明实施例提供的外切酶-蛋白纳米孔偶联体的示意图；

图3为本发明实施例中修饰核苷酸分选纳流通道和捕获电极的设计示意图；

图4为本发明实施例1提供的基于外切酶-纳米孔偶联蛋白的测序单元的结构示意图；

图5为本发明实施例1提供的模块化组装的纳米孔装置的结构示意图；

图6为本发明实施例2提供的外切酶-复合固态纳米孔结构的复合体的结构示意图；

图7为本发明实施例2提供的基于外切酶的核酸测序系统的结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供了一种RNA外切酶-纳米孔复合体，包括：

纳米孔结构；

固定在所述纳米孔结构内的RNA外切酶。

在本发明中，所述RNA外切酶-纳米孔复合体包括纳米孔结构和RNA外切酶；所述RNA外切酶固定在所述纳米孔结构内。

在本发明一个优选的实施例中，所述纳米孔结构为蛋白质纳米孔；所述蛋白质纳米孔通过融合蛋白技术将RNA外切酶融合表达并自组装，形成RNA外切酶和蛋白质纳米孔的偶联体。在本发明中，所述蛋白质纳米孔通常由8-12个单体组成，形成孔状蛋白通道；所述蛋白质纳米孔可以是α-溶血素蛋白，MspA，CsgG，优选为修饰β-环糊精的α-溶血素蛋白纳米孔。本发明采用上述能够用于核酸测序的修饰β-环糊精的α-溶血素蛋白纳米孔，该纳米孔具有单核苷酸分辨率，可以识别通过其孔道的单个基础核苷酸，其区分A、U、C、G四种核苷酸的准确率可以高达99％(Ayub M,et al.Nano Lett.2013,12:6144-50.)。目前，应用膜片钳电流检测跨纳米孔离子电流的频率可以达到100kHz，应用集成电路并行化检测跨纳米孔离子电流的测序芯片的检测频率也达到10kHz，可以准确检测以1000nt/秒通过的核苷酸，满足本发明对纳米孔检测部分的需求。

在本发明中，所述RNA外切酶能够将RNA分子中的单链核酸从一端依次水解成单核苷酸；针对天然RNA样品，需使用RNA外切酶，但也可以使用天然的或经人工改造后能以RNA为底物的DNA外切酶；其中，天然的RNA外切酶的种类有很多，每种生物都编码多种RNA外切酶，所述RNA外切酶优选包括原核生物和真核生物的RNA外切酶或其突变体；来自原核生物的RNA外切酶或其突变体更易于通过体外表达获得有活性的酶，因此更为常用；所述原核RNA外切酶包括PNP、RNase II、RNaseR等蛋白家族。

在本发明优选的实施例中，所述RNA外切酶为RNase R；RNaseR具有3’→5’RNA外切活性，能够降解几乎所有的线性RNA，包括具有复杂修饰核苷酸的rRNA和tRNA；RNaseR由一个单体组成，包括水解和解旋两个结构域，同时具有解旋活性，可以打开单链RNA的二级结构，并依次从末端将其水解成单个核苷酸。体外表达来自南极嗜冷菌(Psychrobactersp.)的RNaseR蛋白，(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)，具有在室温和高盐条件下仍具有较高外切活性的特点，更适合本发明的应用。RNA外切酶水解不同核苷酸的速度需存在差异，通常的，水解A、U、C、G等常见的核苷酸时，水解速度快，而在水解修饰核苷酸时，如：m6A、5mC、5hmC、m1A等170余种，速度明显较慢；利用这种速度差异可以区分在RNA样本中通常含量很高的基础核苷酸和含量很低的修饰核苷酸，然后分别用速度快但识别核苷酸种类少的纳米孔检测器件和识别种类多但速度慢的光谱检测器件进行核苷酸种类的判定。RNaseR水解常见的由基础核苷酸组成的RNA链的速度一般在50-300nt/秒(Lee G，et al.Science 2012,336(6089):1726-1729；Fazal FM,et al.Proc Natl Acad Sci USA.2015,112(49):15101-15106)；本发明对比来自Psychrobacter sp.的RNaseR水解基础核苷酸和修饰核苷酸的速度，如果将基础核苷酸组成的RNA链中的两个连续核苷酸A替换成修饰核苷酸m6A，则会使RNase水解速度明显放慢，并在修饰核苷酸处出现明显的停留(图1)；因此，RNaseR水解修饰核苷酸的速度差异可以用于分选修饰核苷酸。

本发明对所述融合蛋白技术没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的技术方案即可。本发明应用融合蛋白技术可以将RNA外切酶和蛋白质纳米孔融合表达，形成一个上段为外切酶，下段为纳米孔单体，中间由铰链(5-20氨基酸)链接的蛋白单体，再与单独的纳米孔蛋白单体混合在一起，自组装成RNA外切酶和蛋白纳米孔的偶联体，参见图2所示。

在本发明另一个优选的实施例中，所述纳米孔结构为固态纳米孔；所述固态纳米孔通过点击化学方法将RNA外切酶引导并修饰在固态纳米孔附近，形成RNA外切酶和固态纳米孔的偶联结构。本发明对所述固态纳米孔的制备方法没有特殊限制，采用本领域技术人员熟知的构建复合固态纳米孔支撑结构的技术方案即可(参考专利：CN110628598A，CN110628597A)。同时，随着固态纳米孔的加工工艺逐步提高，能够实现基础核苷酸的准确识别，从而实现与上述技术方案中蛋白质纳米孔相同的功能并用于本发明。

在本发明中，所述RNA外切酶制备与上述技术方案中的相同，在此不再赘述。

在本发明中，所述通过点击化学方法将RNA外切酶引导并修饰的目的是将RNA外切酶偶联在固态纳米孔边缘，在本发明优选的实施例中，使用点击化学方法，将RNA外切酶引导并修饰在复合固态纳米孔流体下腔一侧的表面；可选的方法为：将RNA外切酶的水解核苷酸出口附近的某个外侧氨基酸突变成半胱氨酸，与固态纳米孔边缘修饰的巯基形成二硫键，从而将所述RNA外切酶固定在固态纳米孔边缘。

本发明还提供了一种上述技术方案所述的RNA外切酶-纳米孔复合体的制备方法，包括以下步骤：

构建纳米孔结构，再在所述纳米孔结构内固定RNA外切酶，形成RNA外切酶-纳米孔复合体。

本发明提供的制备方法，针对不同纳米孔结构，分别采用先制备出用于支撑外切酶-蛋白纳米孔和修饰核苷酸捕获的固态结构，再将外切酶-蛋白纳米孔偶联复合体镶嵌于固态结构表面的脂双层中，最终形成蛋白-固态复合纳米孔的制备方法，以及首先构建复合固态纳米孔支撑结构，再将外切酶固定于复合固态纳米孔的制备方法。

本发明还提供了一种RNA的测序方法，包括以下步骤：

采用上述技术方案所述的RNA外切酶-纳米孔复合体，首先利用RNA外切酶将测序样品从一端开始，依次切下单个核苷酸并通过纳米孔，然后利用核苷酸通过纳米孔的特征，进行基础核苷酸和修饰核苷酸判定；

如判定结果为基础核苷酸，则记录其AUCG的种类及顺序；

如判定结果为修饰核苷酸，则记录其位置，并检测其化学修饰的种类；

通过上述过程，得到所述测序样品的核苷酸的序列信息，实现RNA序列的直读。

在本发明中，所述的RNA外切酶-纳米孔复合体中RNA外切酶和纳米孔紧密偶联在一起，从而确保核苷酸通过纳米孔的次序不被打乱；在此基础上，RNA外切酶从核酸链的一端依次切下核苷酸，这些核苷酸进一步依切下的次序通过纳米孔，从而能够从纳米孔信号中还原出这些核苷酸在样本核酸链中的顺序，即测序。

在本发明中，所述测序样品包括但不限于各种提取自动物、植物、微生物、环境、培养物等的天然RNA，或经过富集得到的mRNA、tRNA、rRNA、miRNA、circRNA、以及其他non-coding RNA，或者人工合成的RNA，或上述RNA的混合物。此外，对于需要精细测量DNA中被化学修饰的脱氧核苷酸的修饰种类和位置，也可以使用本发明所述的方法，只需要将RNA外切酶换成DNA外切酶。

本发明首先利用RNA外切酶将测序样品从一端开始，依次切下单个核苷酸并通过纳米孔；优选从RNA的3’端开始将单个核苷酸逐一水解下来，经RNA外切酶水解下来的核苷酸依次通过紧邻设计的纳米孔。

在本发明中，所述利用核苷酸通过纳米孔的特征，进行基础核苷酸和修饰核苷酸判定的过程优选具体为：

在纳米孔两侧灌注高盐溶液，并施加正负电极，形成跨膜电压和跨纳米孔的离子电流，并应用膜片钳放大电路记录离子电流；

核苷酸从负电极侧进入所述高盐溶液，在电场驱动下通过纳米孔，涌向正电极；

以核苷酸通过纳米孔时离子电流信号出现的短暂降低，记录为一次跨孔事件，根据核苷酸通过纳米孔时与前次跨孔事件的时间间隔，判断通过纳米孔的核苷酸是基础核苷酸还是修饰核苷酸。

在本发明中，核苷酸通过纳米孔时，因空间效应阻挡跨纳米孔的离子电流，导致离子电流信号出现短暂降低，记录为一次跨孔事件，基础核苷酸因水解速度快，其通过纳米孔时与前次跨孔事件的时间间隔短(依据RNaseR的水解速度计算为3～20ms)，而修饰核苷酸因水解速度慢，其通过纳米孔时与前次跨孔事件的时间间隔更长，因此通过与前次跨孔事件的时间间隔可以判断本次通过纳米孔的核苷酸是基础还是修饰核苷酸。

在本发明中，所述纳米孔正电极一侧设计“Y”型纳流通道，在两个分叉通道内分别设置基础核苷酸捕获电极和修饰核苷酸的捕获电极(参见图3所示)；

所述基础核苷酸捕获电极打开，驱动单核苷酸通过纳米孔，并进入其所在通道；当修饰核苷酸通过纳米孔时，因其时间间隔增大，则通过反馈电路设计启动所述修饰核苷酸捕获电极并关闭所述基础核苷酸捕获电极或使修饰核苷酸捕获电极的电压高于基础核苷酸的捕获电压，将修饰核苷酸吸附至另一个通道，实现修饰核苷酸的分选；

上述修饰核苷酸通过纳米孔进入分叉通道后，迅速降低修饰核苷酸的捕获电压，并打开所述基础核苷酸捕获电极，使基础核苷酸捕获电压高于修饰核苷酸捕获电压，保证后续基础核苷酸进入正确通道。

本发明通过上述采用反馈电路触发捕获电极施加正电压的过程，实现修饰核苷酸的分选。在本发明中，所述修饰核苷酸通过纳米孔时的时间间隔优选＞10ms，所述基础核苷酸通过纳米孔时的时间间隔优选小于10ms。

在本发明中，如判定结果为修饰核苷酸，则记录其位置，并应用谱学检测信号判定其化学修饰的种类；所述检测其化学修饰的种类的过程优选还包括：

利用捕获电极吸附修饰核苷酸至光谱检测区域，进行光谱检测，得到其化学修饰的种类。

在本发明中，所述检测修饰核苷酸化学修饰种类的方法优选选自单分子拉曼光谱、荧光光谱、红外光谱、吸收光谱、反射光谱、质谱和能谱中的一种或多种；以上化学分子的谱学特征均可判定修饰核苷酸的化学结构。在本发明优选的实施例中，采用单分子拉曼光谱判定修饰核苷酸化学结构(参考专利：CN110628599A)；单分子光谱检测具有热点效应，即待测分子位于热点区域，才能够获得足够的信号。拉曼光谱的热点区域为金属表面，本实施例中，利用热点区域的金属结构与修饰核苷酸的捕获电极链接，可以将修饰核苷酸捕获至拉曼光谱检测的热点区域，提高光谱检测的灵敏度。

本发明通过上述过程，能够得到所述测序样品的核苷酸(包括修饰核苷酸)的序列信息，实现RNA序列(包括修饰核苷酸)的直读。

本发明提供了一种RNA外切酶-纳米孔复合体及其制备方法和应用。该应用为一种RNA的测序方法，包括以下步骤：采用RNA外切酶-纳米孔复合体，首先利用RNA外切酶将测序样品从一端开始，依次切下单个核苷酸并通过纳米孔，然后利用核苷酸通过纳米孔的特征，进行基础核苷酸和修饰核苷酸判定；如判定结果为基础核苷酸，则记录其AUCG的种类及顺序；如判定结果为修饰核苷酸，则记录其位置，并检测其化学修饰的种类；通过上述过程，得到所述测序样品的核苷酸的序列信息，实现RNA序列的直读。所述RNA外切酶-纳米孔复合体包括：纳米孔结构；固定在所述纳米孔结构内的RNA外切酶。与现有技术相比，本发明提供的RNA外切酶-纳米孔复合体能够用于RNA直测，测序速度快且能够保障各种修饰核苷酸都能够被测定。

为了进一步说明本发明，下面通过以下实施例进行详细说明。

实施例1外切酶-蛋白纳米孔偶联结构

(1)形成蛋白纳米孔支撑和核苷酸捕获固态结构：

①在硅晶圆衬底上形成含硅化合物牺牲层，再在所述含硅化合物牺牲层上形成基底层；

②所述基底层具体采取在硅层表面旋涂光刻胶，电子束曝光制作掩模版，使用反应离子刻蚀(RIE)形成边宽为1-1000μm(优选为500μm)的方形的硅孔基底；

③使用氢氧化钾或羟化四甲铵通过湿法刻蚀在上述硅孔基底上形成纳米孔结构，形成拉曼光谱检测固态结构；

④将所述拉曼光谱检测固态结构顶部固定于柔性基底(或其他基底)上，在拉曼光谱检测固态结构的基底层底部采取在硅层表面旋涂光刻胶，电子束曝光制作掩模版，使用反应离子刻蚀(RIE)形成直径为1-1000μm(优选为优选为100μm)的圆形的硅孔基底。

(2)形成外切酶-蛋白纳米孔偶联复合体：

①为了减少空间位阻影响两个单体蛋白空间结构形成及活性，本发明设计了长度21个氨基酸的短的肽链GGGGSEAAAKEAAAKHHHHHH来链接两个蛋白，以更好固定两单体空间结构；

②采用基因合成策略制备融合蛋白基因，从N端开始从头合成8×His序列标签、外切酶(去终止密码子)、链接肽、蛋白质纳米孔单体基因(保留终止密码子)基因；

③将融合基因同源重组到原核表达载体PET26b载体NdeI，HindШ酶切位点间，转化大肠肝菌DH5α，PCR、测序筛选、鉴定出阳性克隆；

④提取融合蛋白PET26b表达质粒，转化BL21(DE3)pLysS感受态细胞，平板克隆筛选；挑取阳性克隆接种至10ml含kan、Cm抗生素的LB培养基，过夜培养；次日，按1：100接至500ml含Kan、Cm的LB培养基，25℃200rpm培养至OD600值0.3-0.5，再加入终浓度0.2-0.4μM的IPTG，16℃诱导过夜，离心收集菌体；

⑤加入25ml裂解缓冲液20mM Tris-HCl(pH＝8.0)，500mMNaCl，1mM DTT，0.1mMEDTA，低温超高压连续流细胞破碎机匀质，4℃12000rpm离心15min；

⑥上清加入终浓度10mM的咪唑，上样Ni-NTA Resin柱纯化，用该缓冲液平衡5倍体积后，100mM咪唑20mM Tris-HCl(pH＝8.0)洗脱；

⑦将洗脱液上Resource Q柱并平衡后，再用100-350mM NaCl 20mM Tris-HCl(pH＝8.0)缓冲液线性洗脱，分时收集；

⑧将收集液上样于superdex200分子筛柱进一步纯化及脱盐，紫外监测收集蛋白峰；PAGE鉴定纯度，需大于90％；

⑨将融合蛋白和同样方法表达的纳米孔单体蛋白按照摩尔比1：(1～30)(优选为1：8-12)混合，自组装成外切酶-蛋白纳米孔偶联复合体。

(3)形成基于外切酶-纳米孔偶联蛋白的测序单元：

①在支撑固态结构底部，灌流电泳液，覆盖圆形硅孔表面，然后在电泳液中加入二植酰磷脂酰胆碱(DPhPC)(或其他可形成脂质双分子层的高分子聚合物)；

②吸去硅孔表面的液体，直至刚刚漏出硅孔上缘，在硅孔上缘形成覆盖硅孔的脂质双分子层；

③补充电泳液完全覆盖硅孔和脂质双分子层，加入步骤(2)自组装的外切酶-蛋白纳米孔偶联复合物，蛋白纳米孔自发嵌入脂质双分子层，形成基于外切酶-纳米孔偶联蛋白的测序单元。

本发明实施例1提供的基于外切酶-纳米孔偶联蛋白的测序单元的结构示意图参见图4所示。

本发明还提供一种模块化组装的纳米孔装置，如图5所示；纳米孔装置包括壳体、流体下腔密封层、蛋白-固态复合纳米孔结构、流体下腔基座、电源、第一电极、第二电极和第三电极；所述第一电极镶嵌集成在所述纳米孔结构基底上方，所述第二电极镶嵌集成在硅孔侧壁，与流体下腔相连，所述第三电极位于所述流体下腔底部，所述第一、二电极分别与所述电源的正极相连接，所述第三电极与所述电源的负极相连接，用于电泳技术驱动待检测溶液(如含DNA片段的溶液)中的核酸片段和核苷酸分子从负极一侧穿越纳米孔涌向正极；纳米孔结构的其余技术细节已在上文充分阐述，在此不再赘述。

实施例2外切酶-固态纳米孔偶联结构

(1)形成复合固态纳米孔结构：

①在硅晶圆衬底上形成含硅化合物牺牲层，再在所述含硅化合物牺牲层上形成基底层；

②所述基底层具体采取在硅层表面旋涂光刻胶，电子束曝光制作掩模版，使用反应离子刻蚀(RIE)形成边宽为1-1000μm(优选为500μm)的方形的硅孔基底；

③使用氢氧化钾或羟化四甲铵通过湿法刻蚀在上述硅孔基底上形成纳米孔结构，形成拉曼光谱检测固态结构；

④将所述拉曼光谱检测固态结构顶部固定于柔性基底(或其他基底)上，在拉曼光谱检测固态结构底部通过形成双层交叉硅纳米线，构建近零厚度纳米孔(参考专利：CN111440855A)，再在纳米孔流体下腔一侧，使用溅射工艺(或蒸发工艺)形成金属层，所述金属层是铜、银、金、锌、汞、镉、钴、镍或铝中的一种，本实施例为金。

(2)将外切酶固定于上述复合固态纳米孔：

①使用基因工程方法对外切酶蛋白质表面的特殊氨基酸残基进行定点突变，替换成半胱氨酸；本实施例使用RNase R作为外切酶；

②将待测核酸片段一端连接可被外切酶识别的单链寡核苷酸，所述单链寡核苷酸长度为5-100nt；本实施例所述单链寡核苷酸为长度为8-50nt的易于与RNase R结合的多聚腺苷酸(polyA)。

③使用电泳方法驱动单链寡核苷酸，单链寡核苷酸牵引外切酶蛋白质进入复合纳米孔流体下腔底部凹陷中，并将外切酶蛋白质在稳定于流体下腔中靠近复合纳米孔的位置；

④外切酶表面修饰的半胱氨酸的巯基与金层层表面结合形成金-硫键，外切酶蛋白质通过金-硫键锚定于复合纳米孔流体下腔中近纳米孔的位置，形成外切酶-复合固态纳米孔结构的复合体。

本发明实施例2提供的外切酶-复合固态纳米孔结构的复合体的结构示意图参见图6所示。

本发明还提供一种基于外切酶的核酸测序系统，如图7所示；拉曼光谱法生物分子测序系统包括复合纳米孔、膜片钳电流检测系统、激光拉曼显微镜、光谱测量装置和数据采集分析装置；复合纳米孔置于激光拉曼显微镜的下方。

纳米孔装置包括壳体、流体下腔密封层、复合纳米孔结构、流体下腔基座、电源、第一电极、第二电极和第三电极；所述第一电极镶嵌集成在所述纳米孔结构基底上方，所述第二电极镶嵌集成在硅孔侧壁，与流体下腔相连，所述第三电极位于所述流体下腔底部，所述第一、二电极分别与所述电源的正极相连接，所述第三电极与所述电源的负极相连接，第三电极在通常情况下处于断开状态，并接受反馈电路的调控而开启；所述复合基底纳米孔结构包括第一、二、三液体流道，流体上腔(光谱纳米孔以上)、纳米孔中间流体腔(介于光谱纳米孔和针尖纳米孔之间)、流体下腔(针尖纳米孔以下)；所述第一液体流道连接外部与所述流体上腔，以向所述流体上腔输入或排出溶液；所述第二液体流道连接外部与所述流体中腔，以向所述流体中腔输入或排出溶液；所述第三液体流道连接外部与所述流体下腔，以输入或排出所述流体下腔内溶液；所述流体腔密封层密封所述流体腔；纳米孔装置包括的以上技术特征在上文已作详细介绍，在此不再赘述。

应用实施例

(1)含待测量生物分子溶液通过第三液体流道进入流体下腔，自发扩散或电泳驱动至针尖纳米孔腔内；被实施例1的外切酶-蛋白纳米孔偶联复合体中的外切酶捕获，或者在实施例2的复合纳米孔中，外切酶与待测生物分子在装载前提前结合，然后装载入流体下腔，然后外切酶通过点击化学反应结合在针尖纳米孔的金属层表面。

(2)通过第三液体流道注入ATP分子为外切酶供能，外切酶将生物分子的单体从一端依次水解下来，并在第一、二电极形成的电场作用下通过针尖纳米孔，连接于膜片钳系统的第一电极和第二电极测量得到的跨针尖纳米孔离子电流，当生物分子单体(如单核苷酸)通过针尖纳米孔时，测量到离子电流的一次阻断信号，称为一次跨孔事件，当一次跨孔事件后，超过阈值时间，在本发明优选的实施例中，在RNase R水解RNA时，此阈值可以为10ms，仍未出现跨孔事件时，则通过反馈电路启动第三电极，施加捕获电压，捕获电压可以为10-200mV，在本发明优选的实施例中，捕获电压为30-70mV；同时关闭第二电极，则之后通过针尖纳米孔的单体被第三电极捕获至光谱纳米孔热点区域，当捕获完成后，将第三电极电压迅速降至10mV以下，同时开启第二电极，停止继续捕获。

(3)在光谱检测完成后，在第三电极施加短暂反向电压，将吸附于热点的单体排斥入流体中腔。

本发明还提供一种生物分子读序方法，包括以下步骤：

(1)膜片钳系统记录跨针尖纳米孔的离子电流，以及每次跨孔事件的阻塞电流信号；

(2)激光拉曼显微镜向所述复合纳米孔光谱纳米孔一侧发射激光，所述生物分子单体位于光谱纳米孔热点区域时，产生拉曼光谱信号，具有优异的区分度和化学灵敏度；

(3)光谱测量装置测量拉曼光谱信号得出测量数据；

(4)数据采集分析装置分析所述测量数据，首先通过跨孔事件中阻塞电流信号判定基础核苷酸的种类，并通过跨孔事件时间间隔记录修饰核苷酸在单链生物分子中的位置，然后通过光谱测量数据，判定修饰核苷酸的种类，最终并输出结果。

所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 中国科学院北京基因组研究所（国家生物信息中心）

<120> 一种RNA外切酶-纳米孔复合体及其制备方法和应用

<130> MP2025846

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 769

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Glu Tyr Glu Gly Thr Val Ser Gly His Arg Asp Gly His Gly

1 5 10 15

Phe Val Leu Arg Asp Asp Gly Glu Ser Asp Ile Tyr Leu Pro Gln Asn

20 25 30

Glu Met Arg Ala Val Leu His Lys Asp Arg Val Lys Val Arg Ile Val

35 40 45

Arg Gln Asp Arg Lys Asn Arg Pro Glu Gly Arg Ile Thr Glu Ile Leu

50 55 60

Glu Arg Ser Ser Asn Pro Ile Ile Gly Arg Leu Leu Gln Glu Ser Gly

65 70 75 80

Val Trp Leu Val Ala Pro Glu Asp Lys Arg Tyr Gly Gln Asp Val Leu

85 90 95

Ile Pro Lys Gly Ala Thr Gly Leu Ala Lys Thr Gly Gln Ile Val Val

100 105 110

Val Lys Leu Thr Glu Pro Pro Ala Leu Phe Gly Gln Pro Val Gly Arg

115 120 125

Ile Glu Glu Val Leu Gly Glu Ile Asp Asp Pro Gly Met Glu Ile Glu

130 135 140

Ile Ala Val Arg Lys Tyr Gly Val Pro His Asp Phe Ser Asp Ala Ala

145 150 155 160

Ile Ala Leu Ala Arg Thr Leu Pro Asp Ala Val Arg Pro Thr Asp Lys

165 170 175

Asn Gly Arg Val Asp Leu Thr Asp Ile Ala Leu Val Thr Ile Asp Gly

180 185 190

Glu Asp Ala Arg Asp Phe Asp Asp Ala Val Tyr Cys Glu Pro Ala Lys

195 200 205

Val Gly Arg Gly Lys Gly Trp Arg Leu Leu Val Ala Ile Ala Asp Val

210 215 220

Ser His Tyr Val Glu Thr Gly Ser Ala Ile Asp Ile Asp Ala Tyr Asp

225 230 235 240

Arg Ala Thr Ser Val Tyr Phe Pro Arg Arg Val Ile Pro Met Leu Pro

245 250 255

Glu Lys Leu Ser Asn Gly Leu Cys Ser Leu Asn Pro Asn Val Glu Arg

260 265 270

Val Cys Met Val Cys Asp Met Leu Val Asn Ala Lys Gly Glu Val His

275 280 285

Ala Tyr Gln Phe Tyr Pro Ala Val Met Phe Ser His Ala Arg Phe Thr

290 295 300

Tyr Thr Glu Val Ala Ala Ile Leu Ala Asn Thr Arg Gly Pro Glu Ala

305 310 315 320

Ala Gln Arg Lys Ala Leu Val Pro His Leu Leu Asn Leu His Asp Val

325 330 335

Tyr Gln Ala Leu Leu Gln Glu Arg Gly Val Arg Gly Ala Val Asp Phe

340 345 350

Glu Thr Thr Glu Thr Gln Ile Val Cys Asp Glu Val Gly Arg Ile Glu

355 360 365

Lys Ile Val Pro Arg Thr Arg Asn Val Ala His Lys Leu Ile Glu Glu

370 375 380

Ala Met Leu Ala Ala Asn Val Cys Ser Ala Asp Phe Ile Ala Gln Ser

385 390 395 400

Lys His Ile Gly Leu Phe Arg Val His Glu Gly Pro Ser Pro Glu Lys

405 410 415

Lys Asp Ala Leu Arg Asn Tyr Leu Lys Ala Ile Gly Leu Gly Met Thr

420 425 430

Ile Ser Asp Asp Pro Thr Pro Gly Glu Phe Gln Lys Ile Ala Gln Ala

435 440 445

Thr Lys Asp Arg Pro Asp Ala Pro Gln Ile His Thr Met Leu Leu Arg

450 455 460

Ser Met Gln Gln Ala Ile Tyr Thr Pro Met Asn Asn Gly His Phe Gly

465 470 475 480

Leu Ala Phe Glu Ala Tyr Thr His Phe Thr Ser Pro Ile Arg Arg Tyr

485 490 495

Pro Asp Leu Leu Val His Arg Val Ile Lys Ala Val Leu Ala Lys Lys

500 505 510

Lys Tyr Gln Leu Pro Val Leu Pro Thr Pro Gly Glu Ala Glu Ala Lys

515 520 525

Leu Ser Lys Arg Leu Ser Ser Arg Val Lys Asp Pro Glu Gln Lys Pro

530 535 540

Lys Lys Leu Ser Gly Asp Glu Leu Ala Trp Gln Ala Ala Gly Leu His

545 550 555 560

Cys Ser Ala Asn Glu Arg Arg Ala Asp Glu Ala Ser Arg Asp Val Glu

565 570 575

Ala Trp Leu Lys Cys Lys Tyr Met Arg Glu His Leu Gly Glu Glu Phe

580 585 590

Gly Gly Val Val Thr Ala Ala Thr Gly Phe Gly Ile Phe Val Thr Leu

595 600 605

Asp Ala Met Tyr Val Glu Gly Leu Val His Ile Thr Glu Leu Gly Gly

610 615 620

Glu Tyr Phe Arg Phe Asp Glu Ala Arg Gln Glu Leu Arg Gly Glu Arg

625 630 635 640

Ser Gly Leu Arg Tyr Ala Ile Gly Thr Arg Val Arg Val Gln Val Ser

645 650 655

Arg Val Asp Leu Asp Gly Arg Lys Ile Asp Phe Arg Leu Leu His Glu

660 665 670

Gly Asp Asp Leu Leu Ala Ala Gly Ala Arg Gly Gly Arg Asp Lys Gly

675 680 685

Gly Asp Lys Gly Gly Ala His Gly Ala Asp Gln Pro Pro Gln Glu Arg

690 695 700

Gly Lys Arg Ala Pro Arg Ala Asp Arg Ala Gly Val Pro Ser Ala Gly

705 710 715 720

Arg Gly Glu Lys Ser Ser Ala Arg Ser Glu Arg Ser Ala Ser Arg Ser

725 730 735

Ala Thr Ser Pro Ile Gln Ala Pro Lys Ala Ala Val Lys Lys Ser Thr

740 745 750

Gly Lys Ser Thr Glu Lys Val Gly Arg Lys Pro Gly Lys Lys Thr Arg

755 760 765

Arg

Claims (10)

1.一种RNA外切酶-纳米孔复合体，包括：

纳米孔结构；

固定在所述纳米孔结构内的RNA外切酶；

所述的RNA外切酶在水解基础核苷酸单体和修饰核苷酸单体时的速度存在差异。

2.根据权利要求1所述的RNA外切酶-纳米孔复合体，其特征在于，所述纳米孔结构为蛋白质纳米孔；所述蛋白质纳米孔通过融合蛋白技术将RNA外切酶融合表达并自组装，形成RNA外切酶和蛋白质纳米孔的偶联体。

3.根据权利要求2所述的RNA外切酶-纳米孔复合体，其特征在于，所述蛋白质纳米孔为修饰β-环糊精的α-溶血素蛋白纳米孔，MspA、CsgG或其他可用于测序的纳米孔。

4.根据权利要求1所述的RNA外切酶-纳米孔复合体，其特征在于，所述纳米孔结构为固态纳米孔；所述固态纳米孔通过点击化学方法将RNA外切酶引导并修饰在固态纳米孔附近，形成RNA外切酶和固态纳米孔的偶联结构。

5.根据权利要求1所述的RNA外切酶-纳米孔复合体，其特征在于，所述RNA外切酶包括原核生物的RNA外切酶或其突变体。

6.一种权利要求1～5任一项所述的RNA外切酶-纳米孔复合体的制备方法，包括以下步骤：

a)构建RNA外切酶纳米孔复合体固态支撑结构，

b)将RNA外切酶-蛋白纳米孔融合蛋白镶嵌于所述固态支撑结构内，形成RNA外切酶-纳米孔复合体；或在固态支撑结构内制备针尖纳米孔，再将RNA外切酶固定在其边缘附近，形成RNA外切酶-纳米孔复合体。

7.一种RNA的测序方法，包括以下步骤：

采用权利要求1～5任一项所述的RNA外切酶-纳米孔复合体，首先利用RNA外切酶将测序样品从一端开始，依次切下单个核苷酸并通过纳米孔，然后利用核苷酸通过纳米孔的特征，进行基础核苷酸和修饰核苷酸判定；

如判定结果为基础核苷酸，则记录其AUCG的种类及顺序；

如判定结果为修饰核苷酸，则记录其位置，并检测其化学修饰的种类；

通过上述过程，得到所述测序样品的核苷酸的序列信息，实现RNA序列的直读。

8.根据权利要求7所述的测序方法，其特征在于，所述利用核苷酸通过纳米孔的特征，进行基础核苷酸和修饰核苷酸判定的过程具体为：

在纳米孔两侧灌注高盐溶液，并施加正负电极，形成跨膜电压和跨纳米孔的离子电流，并应用膜片钳放大电路记录离子电流；

核苷酸从负电极侧进入所述高盐溶液，在电场驱动下通过纳米孔，涌向正电极；

以核苷酸通过纳米孔时离子电流信号出现的短暂降低，记录为一次跨孔事件，根据核苷酸通过纳米孔时与前次跨孔事件的时间间隔，判断通过纳米孔的核苷酸是基础核苷酸还是修饰核苷酸。

9.根据权利要求8所述的测序方法，其特征在于，所述纳米孔正电极一侧设计“Y”型纳流通道，在两个分叉通道内分别设置基础核苷酸捕获电极和修饰核苷酸的捕获电极；

所述基础核苷酸捕获电极打开，驱动单核苷酸通过纳米孔，并进入其所在通道；当修饰核苷酸通过纳米孔时，因其时间间隔增大，则通过反馈电路设计启动所述修饰核苷酸捕获电极使其捕获电压高于基础核苷酸捕获电极的捕获电压，将修饰核苷酸吸附至另一个通道，实现修饰核苷酸的分选；

上述修饰核苷酸通过纳米孔进入分叉通道后，迅速降低修饰核苷酸的捕获电压，使其低于所述基础核苷酸捕获电极的电压，保证后续基础核苷酸进入正确通道。

10.根据权利要求7所述的测序方法，其特征在于，所述检测修饰核苷酸化学修饰种类的方法选自单分子拉曼光谱、荧光光谱、红外光谱、吸收光谱、反射光谱、质谱、介电特性和能谱中的一种或多种。

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