CN112481229B

CN112481229B - 一种ω转氨酶及其突变体、重组质粒、基因工程菌及其应用

Info

Publication number: CN112481229B
Application number: CN202011346097.3A
Authority: CN
Inventors: 王华磊; 魏东芝; 谢有余
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2020-11-25
Filing date: 2020-11-25
Publication date: 2022-12-30
Anticipated expiration: 2040-11-25
Also published as: CN112481229A

Abstract

本发明提供了一种ω转氨酶及其突变体、重组质粒、基因工程菌及其应用。该ω转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示，ω转氨酶突变体由ω转氨酶的氨基酸序列突变得到，与SEQ ID No：2具有至少90％的同源性。本发明从瘤状伯克霍尔德菌中提取了ω转氨酶基因，实现了该ω转氨酶基因的异源表达，所产生的ω转氨酶菌株对一系列芳基烷基类底物展示了优良的催化活性。本发明还将该ω转氨酶进行突变获得一系列ω转氨酶突变体，通过将该ω转氨酶突变体偶联不同的酶，应用于生物酶法不对称合成(S)‑1‑苯丙胺和其它手性胺类产品的生产中，具有经济环保、手性选择性高的特点，为转氨酶的工业应用提供了一个潜在的选择。

Description

一种ω转氨酶及其突变体、重组质粒、基因工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，更具体地涉及一种ω转氨酶及其突变体、重组质粒、基因工程菌及其应用。

背景技术

目前，世界上95％的药物都是手性药物，其中70％的手性药物都需要用到手性胺作为手性前体去合成下一步的目标产物。主流的合成手性胺的方法依然是化学法，或者生物化学法相结合。然而，近年来，国家对于化学合成的监管力度愈加严格，相应的，生物制造行业正被大力扶持，这是由于化学法其本身苛刻的合成条件的危险性以及后期排污对于环境造成的严重污染所致的局面。特别是对于手性药物或者手性砌块的合成，大多数情况下，为了提高目标产物的立体选择性，会使用到贵重的循环利用率低的重金属或者过渡态金属，以此来提高所需要的光学纯的手性胺的比率。这种提高立体选择性的方式，无疑对后期的排污工作造成了巨大的经济损失，更重要的是对可持续型平衡型环境的不可逆破坏。因此，建立更加高效的环保的生产手性产品的生态友好型方法，迫在眉睫。

生物法由于其温和的反应条件、简单的反应组分、极高的立体选择性和环境友好特性，引起了广泛的关注。相比于化学法冗长的反应链，生物法所使用的原料更加简单，步骤更加简短，特别是催化剂的使用，是具有生物相容性的酵素，在食品和医药领域具有很大的优势。

生物法合成手性胺的方式也有很多种，包括脂肪酶的拆分、酰胺酶的水解、胺脱氢酶的胺化、腈水解酶的水解和转氨酶的拆分以及不对称合成等。本文所使用到的转氨酶主要指的是第一类或第四类PLP酶(5’-磷酸吡哆醛依赖型酶)。在转氨反应中，氨基供体首先和PLP(磷酸吡哆醛)共价结合形成磷酸吡多胺(PMP)，随后PMP把氨基转移给含有羰基的氨基受体，由此完成转氨反应和辅酶的循环(图1中的a所示)。转氨酶催化合成手性胺的方式主要有两种，第一种是去消旋化的拆分，由外消旋的胺经拆分形成具有单一光学纯度的S或者R型胺，理论转化率只有50％(图1中的b所示)；第二种是不对称还原胺化，由前体酮直接不对称胺化生成光学纯的胺类产物，理论转化率可以达到100％(图1中的c所示)。基于原料利用率的考虑，不对称胺化自然而然的成为了更受青睐的合成方案。例如，近些年来最成功的转氨酶工业化应用案例就是抗糖尿病药物西塔列汀(Merck公司及Codexis公司)的生物酶法合成，该过程使用的催化剂正是第四类PLP依赖性酶(R)-ω-转氨酶ATA-117及一系列突变体，这些突变体菌株催化的不对称还原是由西塔列汀前体酮一步生成光学纯的(R)-西塔列汀，其温和的反应条件相比于使用到钋和铑等过渡态金属的化学法，具有很大的优势，该生物过程也获得了2010年美国总统绿色化学挑战奖。

光学纯的(S)-1-苯丙胺是重要的抗抑郁药I型促肾上腺皮质激素释放因子受体拮抗剂(CRF-Ⅰ)的手性前体。对应的前体酮1-苯丙酮为芳基烷基类底物，而且其小取代基是一个大于甲基的基团(乙基)。转氨酶之所以立体选择性高，正是基于其严格的大小口袋作用机制，而天然的转氨酶其小口袋一般很难容纳超过一个甲基的小基团，特别是大集团还是芳基类的衍生物，空间位阻的阻碍效应显得尤为明显。目前所报道的天然的对该底物具有催化活性的S型转氨酶例如OATA和PDTA等，对1-苯丙酮的催化活力也是极低。而经过改造的突变株对该底物的催化活性虽然提高了，但是转化效率并不高，例如经过改造的PDTA在催化4.2mM的1-苯丙酮时，反应时间为3天，转化率也只有79％，虽然其e.e.值大于99％。目前该抗抑郁药的合成路线主要还是以化学合成法来进行。所以生物催化转化法制备(S)-1-苯丙胺具有良好的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种ω转氨酶及其突变体、重组质粒、基因工程菌及其应用，从而解决现有技术中制备手性胺的生物酶的缺失。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种ω转氨酶，所述ω转氨酶的氨基酸序列如SEQID No：2所示，碱基序列如SEQ ID No：1所示。

所述ω转氨酶BPTA来源于DSMZ 17167瘤状伯克霍尔德菌(Burkholderiaphymatum STM815)。

根据本发明的第二方面，提供一种ω转氨酶突变体，所述ω转氨酶突变体的氨基酸序列由SEQ ID No：2所示的ω转氨酶的氨基酸序列发生突变得到，所述ω转氨酶突变体与SEQ ID No：2所示的氨基酸序列具有至少90％的同源性。

进一步优选地，所述ω转氨酶突变体与SEQ ID No：2所示的氨基酸序列具有至少95％的同源性。

根据本发明的优选方案，该ω转氨酶突变体发生所述突变的氨基酸位点包括：第78位氨基酸位点，第82位氨基酸位点，第284位氨基酸位点，第440位氨基酸位点中的至少一个。

具体地，78位的甲硫氨酸M可以突变成苯丙氨酸F、色氨酸W、异亮氨酸I、亮氨酸L、缬氨酸V、丙氨酸A，优选的，是突变成苯丙氨酸F。

82位的色氨酸W可以突变成丙氨酸A、甲硫氨酸M、异亮氨酸I、亮氨酸L、缬氨酸V和甘氨酸G，优选的，是突变成丙氨酸A。

284位的异亮氨酸I可以突变成苯丙氨酸F、色氨酸W、甲硫氨酸M、亮氨酸L、缬氨酸V、丙氨酸A，优选的，是突变成苯丙氨酸F。

440位的苏氨酸T可以突变成谷氨酰胺Q、甲硫氨酸M、异亮氨酸I、亮氨酸L、缬氨酸V、丙氨酸A、半胱氨酸C和天冬酰胺N，优选的，是突变成谷氨酰胺Q。

根据本发明的另一优选方案，所述ω转氨酶突变体包括：BPTA_W82A，BPTA_W82A/M78F，BPTA_W82A/I284F，BPTA_W82A/T440Q，BPTA_{M78F/W82A/I284F/T440Q}中的任意一种。其中，BPTA_W82A即为82位的色氨酸W突变成丙氨酸A所获得的ω转氨酶突变体，BPTA_W82A/M78F即为82位的色氨酸W突变成丙氨酸A、78位的甲硫氨酸M突变成苯丙氨酸F所获得的ω转氨酶突变体，BPTA_W82A/I284F即为82位的色氨酸W突变成丙氨酸A、284位的异亮氨酸I突变成苯丙氨酸F所获得的ω转氨酶突变体，BPTA_W82A/T440Q即为82位的色氨酸W突变成丙氨酸A、440位的苏氨酸T突变成谷氨酰胺Q所获得的ω转氨酶突变体，BPTA_{M78F/W82A/I284F/T440Q}即为78位的甲硫氨酸M突变成苯丙氨酸F、82位的色氨酸W突变成丙氨酸A、284位的异亮氨酸I突变成苯丙氨酸、440位的苏氨酸T突变成谷氨酰胺Q所获得的ω转氨酶突变体。

根据本发明的第三方面，提供一种重组质粒，所述重组质粒由SEQ ID No：2所示的ω转氨酶的编码序列与表达载体质粒连接构建而成，或者由如上所述的ω转氨酶突变体的编码序列与表达载体质粒连接构建而成。

表达质粒可以是pET系列、pQE系列、pRSET系列、pGEX系列、pBV系列、pTrc系列、pTwin系列、pEZZ系列、pKK系列以及pUC系列，优选地，该表达载体质粒为pET-28a(+)，构成重组质粒bpta-pET-28a(+)。

根据本发明的第四方面，提供一种ω转氨酶基因工程菌，所述ω转氨酶基因工程菌表达如上所述的ω转氨酶，或如上所述的ω转氨酶突变体。即，所述ω转氨酶基因工程菌是将包括ω转氨酶的重组质粒转化宿主菌获得的基因工程菌株，或者是将包括ω转氨酶突变体的重组质粒转化宿主菌获得的基因工程菌株。

根据本发明的第五方面，提供一种如上所述的ω转氨酶及如上所述的ω转氨酶突变体在合成手性胺类产品中的应用。

根据本发明的一个优选方案，特别是将如上所述的ω转氨酶及如上所述的ω转氨酶突变体应用于催化1-苯丙酮生成(S)-1-苯丙胺。

该应用包括：将ω转氨酶或ω转氨酶突变体作为催化剂，在以下三种级联反应体系中进行催化反应：

ⅰ)100mM pH 8.0Tris-HCl、ω转氨酶或其突变体菌株冻干菌粉10g/L、丙酮酸脱羧酶(PDC)10g/L、100mM 1-苯丙酮、500～1000mM L-丙氨酸、5％～15％v/v DMSO、0.5～1mMPLP；

ⅱ)100mM pH 8.0Tris-HCl、ω转氨酶或其突变体菌株冻干菌粉10g/L、乳酸脱氢酶(LDH)5g/L、葡萄糖脱氢酶(GDH)5g/L、100mM 1-苯丙酮、500～1000mM L-丙氨酸、5％～15％v/v DMSO、0.5～1mM PLP、0.25～0.5mM NAD⁺、葡萄糖150～250g/L；

ⅲ)100mM pH 8.0Tris-HCl、ω转氨酶或其突变体菌株冻干菌粉10g/L、氨基酸脱氢酶(AADH)5g/L、葡萄糖脱氢酶(GDH)5g/L、100mM 1-苯丙酮、500～1000mM L-丙氨酸、5％～15％v/v DMSO、0.5～1mM PLP、0.25～0.5mM NAD⁺、葡萄糖150～250g/L、甲酸铵150～250mM；

其中，上述三种级联反应体系都是在30～37℃条件下进行反应，反应结束后，先将反应液调酸至pH为1～1.5，反应液用乙酸乙酯萃取，舍去萃取相，后将反应液调碱至pH为13～13.5，收集萃取相，离心，取有机相减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到淡黄色油状液体即为(S)-1-苯丙胺粗品。

特别优选地，第一种反应体系为：100mM pH 8.0Tris-HCl、ω转氨酶或其突变体菌株冻干菌粉10g/L、丙酮酸脱羧酶(PDC)10g/L、100mM 1-苯丙酮、500mM L-丙氨酸、5％v/vDMSO、1mM PLP。

特别优选地，第二种反应体系为：100mM pH 8.0Tris-HCl、ω转氨酶或其突变体菌株冻干菌粉10g/L、乳酸脱氢酶(LDH)5g/L、葡萄糖脱氢酶(GDH)5g/L、100mM 1-苯丙酮、500mM L-丙氨酸、5％v/v DMSO、1mM PLP、0.25mM NAD⁺、葡萄糖250g/L。

特别优选地，第三种反应体系为：100mM pH 8.0Tris-HCl、ω转氨酶或其突变体菌株冻干菌粉10g/L、氨基酸脱氢酶(AADH)5g/L、葡萄糖脱氢酶(GDH)5g/L、100mM 1-苯丙酮、500mM L-丙氨酸、5％v/v DMSO、1mM PLP、0.25mM NAD⁺、葡萄糖250g/L、甲酸铵250mM。

特别优选地，上述三种方法都是在30℃水浴锅中进行反应，反应结束，先将反应液调酸至pH为1，反应液用乙酸乙酯萃取，舍去萃取相，后将反应液调碱至pH为13，收集萃取相，离心，取有机相减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到淡黄色油状液体即为(S)-1-苯丙胺粗品。

上述三种级联反应体系中，所使用的丙酮酸脱羧酶(PDC)的登录号为GenBank:AAM49566.1；乳酸脱氢酶(LDH)的登录号为GenBank:WP_000204727.1；葡萄糖脱氢酶(GDH)的登录号为GenBank:WP_003246720.1；氨基酸脱氢酶(AADH)的登录号为GenBank:WP_003243280.1。

本发明从瘤状伯克霍尔德菌(Burkholderia phymatum STM815)中提取了ω转氨酶基因bpta，并构建了含有ω转氨酶基因bpta的基因工程菌株，从而实现了该ω转氨酶基因bpta的异源表达。本发明还针对该野生型BPTA进行改造得到了一系列ω转氨酶突变体，比如BPTA_W82A，BPTA_W82A/M78F，BPTA_W82A/I284F，BPTA_W82A/T440Q，BPTA_{M78F/W82A/I284F/T440Q}等等，进而通过该ω转氨酶突变体获得一系列对芳基烷基类底物具有较好的催化活性的工程菌。

所述ω转氨酶及其突变体的催化温度优选为30～37℃，pH优选为7～9。

所述ω转氨酶及其突变体的催化温度最优选为30℃，pH最优选为8.0。

根据本发明的研究发现，该ω转氨酶对芳基烷基类底物酮的还原活性较高，这是绝大多数天然转氨酶所不具备的催化特性，特别是针对小取代基不超过一个甲基的芳基烷基类底物活性非常高，其中对苯氧基丙酮的活性最高。

根据本发明的研究还发现，在不对称催化1-苯丙酮生成(S)-1-苯丙胺中，野生型ω转氨酶采用三种级联方式的转化率都很低，最高的转化率也仅为1.8％，为偶联丙酮酸脱羧酶的级联方式。多种ω转氨酶突变体则相对野生型ω转氨酶的转化率高很多。其中，四个位点同时突变获得的突变体BPTA_{M78F/W82A/I284F/T440Q}相比于野生型ω转氨酶以及其他ω转氨酶突变体而言，其转化效率提升了很多，最高为偶联丙酮酸脱羧酶的级联方式，转化率为94.4％，产率为86％，而偶联乳酸脱氢酶和氨基酸脱氢酶的次之，转化率分别为88％和63％。

根据本发明提供的生物催化法单水相制备手性胺(S)-1-苯丙胺，最高产量为94mM/L(18.8g/L)，e.e.值大于99.9％。与传统的化学法相比，该ω转氨酶及其突变体基因工程菌株介导的生物酶法具有反应条件温和、立体选择性高的特点。

综上所述，本发明从瘤状伯克霍尔德菌中提取了ω转氨酶基因bpta，并构建了其基因工程菌株及一系列突变体工程菌株，实现了该ω转氨酶基因bpta的异源表达，所产生的ω转氨酶菌株及其突变体菌株对一系列芳基烷基类底物展示了优良的催化活性。本发明还将上述ω转氨酶BPTA进行突变获得一系列ω转氨酶BPTA突变体，通过将该ω转氨酶BPTA突变体偶联不同的酶，应用于生物酶法不对称合成I型促肾上腺皮质激素释放因子受体拮抗剂(CRF-Ⅰ)的手性前体(S)-1-苯丙胺和其它手性胺类产品的生产中，具有经济环保、手性选择性高的特点，为转氨酶的工业应用提供了一个潜在的选择。

附图说明

图1是生物法合成手性胺过程中转氨酶的作用原理图；

图2是本发明纯化的ω转氨酶BPTA及其突变体的SDS-PAGE图：其中，M为蛋白Marker；L1：BPTA上清，L2:BPTA纯化；L3：M78F/W82A/I284F/T440Q上清，L4:M78F/W82A/I284F/T440Q纯化。

图3是本发明的ω转氨酶BPTA及其突变体不对称胺化还原1-苯丙酮生成(S)-1-苯丙胺的三种级联方式示意图；

图4是本发明的ω转氨酶BPTA及其突变体不对称胺化还原1-苯丙酮生成(S)-1-苯丙胺的反应进程曲线。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

实施例1：来源于瘤状伯克霍尔德菌的ω转氨酶基因bpta的扩增

本发明的ω转氨酶基因bpta来源于瘤状伯克霍尔德菌(Burkholderia phymatumSTM815)，本发明的ω转氨酶BPTA属于Ⅰ型PLP依赖型酶，编码该ω转氨酶BPTA的ω转氨酶基因bpta的核苷酸序列如SEQ ID No：1所示，大小为1437bp。

采用上海生工生物革兰氏阴性细菌基因组DNA小提试剂盒，并严格按照说明书上的操作对瘤状伯克霍尔德菌进行DNA样品纯化，得到瘤状伯克霍尔德菌(Burkholderiaphymatum STM815)的全基因组。

根据序列分析结果设计扩增ω转氨酶基因bpta的引物：

bptaF:5'-ggaattccatatgagtttcaggacagaagaaatcgc-3'

bptaR:5'-cccaagcttacgcaagcccgagttgttgt-3'

以上述获得的瘤状伯克霍尔德菌的全基因组为模板，采用上面设计的引物进行PCR扩增，得到ω转氨酶基因bpta。

PCR扩增体系如下(50μL)：2×Taq Plus Master PCR Mix 25μL，引物2μL，模板2μL，加ddH2O补足至25μL。PCR扩增条件：94℃5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃3min，30个循环；72℃5min。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳验证大小以及胶回收纯化。具体步骤按照FAVORGEN DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒，回收的基因片段和pET-28a质粒37℃下进行双酶切。回收酶切片段并于16℃连接过夜，将连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，均匀涂布在卡那霉素抗性平板上，37℃倒置培养16h，挑取单菌落验证为阳性克隆后经LB培养基培养后提取质粒，获得ω转氨酶基因bpta与质粒pET-28a的重组质粒bpta-pET-28a。

实施例2：BPTA_W82A，BPTA_W82A/M78F，BPTA_W82A/I284F，BPTA_W82A/T440Q，BPTA_{M78F/W82A/I284F/T440Q}突变株的构建

本发明中所使用到的含有突变型ω转氨酶基因bpta-M78F/W82A/I284F/T440Q的重组质粒是通过迭代方式构建的：首先是以重组质粒bpta-pET-28a为模板，下述引物对①为引物，得到重组质粒bpta-W82A-pET-28a；然后，以重组质粒bpta-W82A-pET-28a为模板，下述引物对②为引物，得到重组质粒bpta-W82A/M78F-pET-28a；再以重组质粒bpta-W82A/M78F-pET-28a为模板，下述引物对③为引物，得到重组质粒bpta-M78F/W82A/I284F-pET-28a；最后以重组质粒bpta-M78F/W82A/I284F-pET-28a为模板，下述引物对④为引物，得到重组质粒bpta-M78F/W82A/I284F/T440Q-pET-28a。

利用安捷伦在线引物设计网站(http://www.agilent.com)中的

程序设计引物：

①W82A F:5'-ccgacgttcacacacgccaatcccgccatgcc-3'

①W82A R:5'-ggcatggcgggattggcgtgtgtgaacgtcgg-3'

②W82A/M78F F:5'-cacacgccaatcccgcgaagccatcgatgatcttg-3'

②W82A/M78F R:5'-caagatcatcgatggcttcgcgggattggcgtgtg-3'

③I284F F:5'-ccaaacccgccgaacacttcgtcggcg-3'

③I284F R:5'-cgccgacgaagtgttcggcgggtttgg-3'

④T440Q F:5'-tccggtcgccctgtgcgcgcatgatcagattgc-3'

④T440Q R:5'-gcaatctgatcatgcgcgcacagggcgaccgga-3'

PCR扩增体系如下(50μL)：

Max Buffer 25μL，dNTP Mix 1μL，引物2μL，模板2μL，

Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL，加ddH2O补足至50μL。PCR扩增条件：95℃3min；95℃15sec，55℃20sec，72℃6min，35个循环；72℃10min。PCR产物直接转入DH5α感受态细胞，均匀涂布在卡那霉素抗性平板上，37℃倒置培养16h，挑取单菌落验证为阳性克隆后经LB培养基培养后提取质粒，获得转氨酶BPTA突变体BPTA_{M78F/W82A/I284F/T440Q}重组质粒。

同理，通过对上述引物进行选择以及变换PCR扩增顺序，还可获得其他转氨酶BPTA突变体BPTA_W82A，BPTA_W82A/M78F，BPTA_W82A/I284F，BPTA_W82A/T440Q的核苷酸序列。采用相同方法，即可依次获得转氨酶BPTA突变体BPTA_W82A，BPTA_W82A/M78F，BPTA_W82A/I284F，BPTA_W82A/T440Q重组质粒。

实施例3：含有转氨酶基因bpta及其突变型基因的重组基因工程菌株的构建

将大肠杆菌BL21(DE3)接种于LB培养基，按照本领域常规方法制备BL21感受态细胞。

将上述实施例2获得的重组质粒转入大肠杆菌BL21感受态细胞，均匀涂布在卡那霉素抗性平板上，37℃倒置培养16h，挑取单菌落验证为阳性克隆后经LB培养基培养获得重组基因工程菌株。

实施例4：转氨酶BPTA及其突变体蛋白的表达和纯化

4.1将上述构建的重组基因工程菌株接种于含LB(+100μg/mL)培养基的试管中，37℃摇床培养12h。

4.2以1％的接种量接种到新鲜的液体LB(+100μg/mL)培养基中，200转/分的转速下37℃摇至OD₆₀₀＝0.6，加IPTG至100μl/mL，20℃诱导20h。

4.3将培养基在4℃、8000rpm/min离心5min，收集菌体。将菌体用20mM含0.1mM PLP的Tris-HCL(pH 8.0)重悬，于低温水浴中超声破碎，将破碎后的粗酶液8000rpm离心10min后，吸取上清用Ni-NTA Superflow Cartridge脱盐，浓缩，获得目的蛋白，即转氨酶BPTA及其突变体蛋白。

4.4对获得的目的蛋白进行SDS-PAGE，结果如图2所示，重组转氨酶BPTA及其突变体BPTA_{M78F/W82A/I284F/T440Q}蛋白在大肠杆菌中表达，在TPI-150洗脱条件下纯化后为单一条带。

该转氨酶BPTA氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，共478个氨基酸，其理论分子量为52.6kDa。

实施例5：野生型ω转氨酶BPTA对芳基烷基类底物活性的分析

本实施例的目的是检测根据上述实施例4所获得的野生型ω转氨酶BPTA对不同芳基烷基类大分子底物酮的还原活性。检测的反应体系(200μl)为：100mM含0.1mM PLP的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)，50mM底物酮和250mM氨基供体L-丙氨酸，2μM纯蛋白(即重组转氨酶BPTA)，2％DMSO。在250rpm，30℃条件下反应6小时，随后加入1mL的甲醇终止反应。在210nm波长下进行HPLC检测(ZORBAX SB-AQ柱，4.6×250mm×5μm，流动相:48％甲醇:52％水(0.1％TFA)，流速1mL/min，柱温37℃，进样量20μL)。由表1结果可以看出该ω转氨酶BPTA对芳基烷基类底物酮的还原活性较高，特别是对4-苯基-2-丁酮，4-甲基苯乙酮，4-甲氧基-苯乙酮，苯氧基丙酮的还原活性均较高，这是绝大多数天然转氨酶所不具备的催化特性，特别是针对小取代基不超过一个甲基的芳基烷基类底物活性非常高。其中针对苯氧基丙酮的催化活性最高，是针对苯乙酮催化活性的6.89倍。

表1转氨酶BPTA对芳基烷基酮底物活性检测结果

实施例6：转氨酶BPTA及其突变体对目标底物1-苯丙酮的活性分析

本实施例的目的是检测根据上述实施例4所获得的ω转氨酶BPTA及其突变体BPTA_W82A，BPTA_W82A/M78F，BPTA_W82A/I284F，BPTA_W82A/T440Q，BPTA_{M78F/W82A/I284F/T440Q}对底物1-苯丙酮的胺化还原活性变化。检测的反应体系(200μl)为：100mM含0.1mM PLP的Tris-HCl缓冲溶液(pH 8.0)，50mM底物1-苯丙酮和250mM氨基供体L-丙氨酸，2μM纯蛋白(即重组转氨酶BPTA及其突变体)，2％DMSO。250rpm，30℃下反应6小时后，加入1mL的甲醇终止反应。在210nm波长下进行HPLC检测(ZORBAX SB-AQ柱，4.6×250mm×5μm，流动相:40％甲醇:60％水(0.1％TFA)，流速1mL/min，柱温37℃，进样量20μL，底物1-苯丙酮出峰时间12min，产物1-苯丙胺出峰时间4.2min)，测定结果如表2所示。以野生型的活力作为参照，可以看出，最终的突变体BPTA_{M78F/W82A/I284F/T440Q}相比野生型其活性增加的幅度非常大，由0.0564μM min^-1增加到5.8622μM min^-1，其对目标底物1-苯丙酮的还原活性提高了104倍。

表2转氨酶BPTA及其突变体对1-苯丙酮活性变化

编号	突变体	反应速率(μM min<sup>-1</sup>)	倍数
				1	WT	0.0564	1
2	BPTA<sub>W82A</sub>	0.1747	3.1
				3	BPTA<sub>W82A/M78F</sub>	1.1687	20.7
4	BPTA<sub>W82A/I284F</sub>	0.4948	8.8
				5	BPTA<sub>W82A/T440Q</sub>	0.2961	5.3
6	BPTA<sub>M78F/W82A/I284F/T440Q</sub>	5.8622	104

实施例7：转氨酶BPTA及其突变体不对称催化生成(S)-1-苯丙胺

将上述实施例3获得的转氨酶BPTA及其突变体重组基因工程菌株培养所得湿菌体进行冷冻干燥，以冻干菌粉作为催化剂。按照以下三种级联方式进行酶法不对称合成目标产物(S)-1-苯丙胺(参见图3)：ⅰ)100mM pH 8.0Tris-HCl、BPTA及其突变体菌株冻干菌粉10g/L、丙酮酸脱羧酶(PDC)10g/L、100mM 1-苯丙酮、500mM L-丙氨酸、5％v/v DMSO、1mMPLP；ⅱ)100mM pH 8.0Tris-HCl、BPTA及其突变体菌株冻干菌粉10g/L、乳酸脱氢酶(LDH)5g/L、葡萄糖脱氢酶(GDH)5g/L、100mM 1-苯丙酮、500mM L-丙氨酸、5％v/v DMSO、1mM PLP、0.25mM NAD+、葡萄糖250g/L；ⅲ)100mM pH 8.0Tris-HCl、BPTA及其突变体菌株冻干菌粉10g/L、氨基酸脱氢酶(AADH)5g/L、葡萄糖脱氢酶(GDH)5g/L、100mM 1-苯丙酮、500mM L-丙氨酸、5％v/v DMSO、1mM PLP、0.25mM NAD+、葡萄糖250g/L、甲酸铵250mM。30℃水浴锅中，250rpm搅拌，反应时间48小时。反应结束后，先将反应液调酸至pH为1，反应液用乙酸乙酯萃取，舍去萃取相，后将反应液调碱至pH为13，取样品用五倍体积的乙酸乙酯萃取两次加无水硫酸钠干燥过夜，后溶于异丙醇中，利用高效液相色谱(CROWNPAK CR(+)column，4.6×150mm×5μm(Daicel Co.,Japan)，流动相：HClO₄(pH 1.5)/甲醇＝90:10v/v，1mL/min，UV220nm)。反应结束后，对映体过量值：e.e.(％)＝(S-R)/(S+R)×100％，其中S、R分别为两种对映体含量，测得产物e.e.值>99.9％。产率(C)＝(产物量/底物量)×100％。反应液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取相，14000rpm/min离心10min，取有机相40℃减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到淡黄色油状的液体为(S)-1-苯丙胺粗品。反应进程曲线如图4所示，48小时转化率，野生型三种级联方式都很低，最高的也仅为1.8％，是偶联丙酮酸脱羧酶的的级联方式。多种ω转氨酶突变体则相对野生型ω转氨酶BPTA的转化率高很多。其中，四个位点同时突变获得的突变体BPTA_{M78F/W82A/I284F/T440Q}相比于野生型ω转氨酶以及其他ω转氨酶突变体而言，其转化效率提升了很多，最高为偶联丙酮酸脱羧酶的级联方式，转化率为94.4％，产率为86％，而偶联乳酸脱氢酶和氨基酸脱氢酶的次之，转化率分别为88％和63％。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东理工大学

<120> 一种ω转氨酶及其突变体、重组质粒、基因工程菌及其应用

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1437

<212> DNA

<213> 瘤状伯克霍尔德菌(Burkholderia phymatum STM815)

<400> 1

atgagtttca ggacagaaga aatcgcttac gcgcaacccg cccggccggc cgcgacggca 60

agcacatcgc aacagcaacg cagcaccgcg gaatatcgcg cgctcgacgc cgcgcatcac 120

attcacccgt tctccgacat gggcgcgctg aacagcgcgg gcagtcgcgt gatcgtcaag 180

gcagaaggcg tgtatctgtg ggactccgat ggcaacaaga tcatcgatgg catggcggga 240

ttgtggtgtg tgaacgtcgg ctatgggcgc aaggaactgg cggacgctgc gtatcagcaa 300

ttgcgggaac tgcccttcta caacacgttc ttcaaaacca cgcacccgcc cgtgatcgaa 360

ctgtcggcat tgctcgccga agtgacgccc gcaccgttca atcacttctt ctattgcaac 420

agcgggtccg aaggcaacga cacggtactg cgcatcgtcc atcaatactg ggcgacgcag 480

agcaagaagc tgaagaagtt cgtcatctcg cgcaagaacg gctatcacgg ttcgacgatt 540

gcaggcggca cgctgggcgg catgggttat atgcacgagc agatgccgtc gcaggtcgag 600

cacatcgtgc atatcgatca gccttactgg ttcggcgaag gcggcgacat gacgccggaa 660

gaattcggcc tcgcgcgagc acgccagctc gaagcggaga ttctcgaact cggcgccgag 720

aacgtcgccg catttatcgg tgagcctttc cagggtgcgg gtggcgtgat cttcccgcct 780

tccacttact ggccggagat ccagcgcatt tgccgcaagt acgacgtgct gctggtcgcc 840

gacgaagtga tcggcgggtt tggccgcacg ggcgaatggt tcgcgcatca gcatttcggc 900

ttcgagccgg atctgatcac gatggcgaaa ggcctgacga gcggctatat cccgatgggc 960

gccgtcggcc tgcatgaccg catcgcgaag gcgatcatcg aaaacggcga gttcaatcac 1020

ggcctcacct attcgggcca tcccgttgcc gctgccgtcg ccgtcgcgaa cctgaagctc 1080

ttgcgcgacg agaagattgt cgagcgcgtg aagaacgaaa cgggcccgta tttccagcag 1140

tccctgcgcg aagcgttcgc gagccaaccc atcgtcggtg aagtagcggg cacgggtctc 1200

gtcgcgggca tccagctcgc cgagaacccg aagacgcgca aacgctttga aaacggcggc 1260

gacgtcggca cgatctgccg cgacttctgc ttcaacggca atctgatcat gcgcgcaacg 1320

ggcgaccgga tgctgctctc gccgccgctc gtcgttacga agagcgagat cgacgagatc 1380

gtttcgaagg cgaaaaaggc catcgacgca accgcacaac aactcgggct tgcgtaa 1437

<210> 2

<211> 478

<212> PRT

<213> 瘤状伯克霍尔德菌(Burkholderia phymatum STM815)

<400> 2

Met Ser Phe Arg Thr Glu Glu Ile Ala Tyr Ala Gln Pro Ala Arg Pro

1 5 10 15

Ala Ala Thr Ala Ser Thr Ser Gln Gln Gln Arg Ser Thr Ala Glu Tyr

20 25 30

Arg Ala Leu Asp Ala Ala His His Ile His Pro Phe Ser Asp Met Gly

35 40 45

Ala Leu Asn Ser Ala Gly Ser Arg Val Ile Val Lys Ala Glu Gly Val

50 55 60

Tyr Leu Trp Asp Ser Asp Gly Asn Lys Ile Ile Asp Gly Met Ala Gly

65 70 75 80

Leu Trp Cys Val Asn Val Gly Tyr Gly Arg Lys Glu Leu Ala Asp Ala

85 90 95

Ala Tyr Gln Gln Leu Arg Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Thr Phe Phe Lys

100 105 110

Thr Thr His Pro Pro Val Ile Glu Leu Ser Ala Leu Leu Ala Glu Val

115 120 125

Thr Pro Ala Pro Phe Asn His Phe Phe Tyr Cys Asn Ser Gly Ser Glu

130 135 140

Gly Asn Asp Thr Val Leu Arg Ile Val His Gln Tyr Trp Ala Thr Gln

145 150 155 160

Ser Lys Lys Leu Lys Lys Phe Val Ile Ser Arg Lys Asn Gly Tyr His

165 170 175

Gly Ser Thr Ile Ala Gly Gly Thr Leu Gly Gly Met Gly Tyr Met His

180 185 190

Glu Gln Met Pro Ser Gln Val Glu His Ile Val His Ile Asp Gln Pro

195 200 205

Tyr Trp Phe Gly Glu Gly Gly Asp Met Thr Pro Glu Glu Phe Gly Leu

210 215 220

Ala Arg Ala Arg Gln Leu Glu Ala Glu Ile Leu Glu Leu Gly Ala Glu

225 230 235 240

Asn Val Ala Ala Phe Ile Gly Glu Pro Phe Gln Gly Ala Gly Gly Val

245 250 255

Ile Phe Pro Pro Ser Thr Tyr Trp Pro Glu Ile Gln Arg Ile Cys Arg

260 265 270

Lys Tyr Asp Val Leu Leu Val Ala Asp Glu Val Ile Gly Gly Phe Gly

275 280 285

Arg Thr Gly Glu Trp Phe Ala His Gln His Phe Gly Phe Glu Pro Asp

290 295 300

Leu Ile Thr Met Ala Lys Gly Leu Thr Ser Gly Tyr Ile Pro Met Gly

305 310 315 320

Ala Val Gly Leu His Asp Arg Ile Ala Lys Ala Ile Ile Glu Asn Gly

325 330 335

Glu Phe Asn His Gly Leu Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala

340 345 350

Val Ala Val Ala Asn Leu Lys Leu Leu Arg Asp Glu Lys Ile Val Glu

355 360 365

Arg Val Lys Asn Glu Thr Gly Pro Tyr Phe Gln Gln Ser Leu Arg Glu

370 375 380

Ala Phe Ala Ser Gln Pro Ile Val Gly Glu Val Ala Gly Thr Gly Leu

385 390 395 400

Val Ala Gly Ile Gln Leu Ala Glu Asn Pro Lys Thr Arg Lys Arg Phe

405 410 415

Glu Asn Gly Gly Asp Val Gly Thr Ile Cys Arg Asp Phe Cys Phe Asn

420 425 430

Gly Asn Leu Ile Met Arg Ala Thr Gly Asp Arg Met Leu Leu Ser Pro

435 440 445

Pro Leu Val Val Thr Lys Ser Glu Ile Asp Glu Ile Val Ser Lys Ala

450 455 460

Lys Lys Ala Ile Asp Ala Thr Ala Gln Gln Leu Gly Leu Ala

465 470 475

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggaattccat atgagtttca ggacagaaga aatcgc 36

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccaagctta cgcaagcccg agttgttgt 29

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ccgacgttca cacacgccaa tcccgccatg cc 32

<210> 6

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggcatggcgg gattggcgtg tgtgaacgtc gg 32

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cacacgccaa tcccgcgaag ccatcgatga tcttg 35

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

caagatcatc gatggcttcg cgggattggc gtgtg 35

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccaaacccgc cgaacacttc gtcggcg 27

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cgccgacgaa gtgttcggcg ggtttgg 27

<210> 11

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

tccggtcgcc ctgtgcgcgc atgatcagat tgc 33

<210> 12

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcaatctgat catgcgcgca cagggcgacc gga 33

Claims

1.一种ω转氨酶突变体，其特征在于，所述ω转氨酶突变体由氨基酸序列如SEQ IDNo：2所示的ω转氨酶的氨基酸序列发生突变得到，所述ω转氨酶突变体包括：BPTA_W82A，BPTA_W82A/M78F，BPTA_W82A/I284F，BPTA_W82A/T440Q，BPTA_{M78F/W82A/I284F/T440Q}中的任意一种。

2.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒由根据权利要求1所述的ω转氨酶突变体的编码序列与表达载体质粒连接构建而成。

3.一种ω转氨酶基因工程菌，其特征在于，所述ω转氨酶基因工程菌表达如权利要求1所述的ω转氨酶突变体。

4.一种如权利要求1所述的ω转氨酶突变体在合成手性胺类产品中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，如权利要求1所述的ω转氨酶突变体被用于催化1-苯丙酮生成（S）-1-苯丙胺。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括：将如权利要求1所述的ω转氨酶突变体作为催化剂，在以下三种级联反应体系中进行催化反应：

ⅰ）100 mM pH 8.0Tris-HCl、ω转氨酶突变体菌株冻干菌粉10 g/L、丙酮酸脱羧酶（PDC）10 g/L、100mM 1-苯丙酮、500~1000 mM L-丙氨酸、5%~15% v/v DMSO、0.5~1 mMPLP；

ⅱ）100 mM pH 8.0Tris-HCl、ω转氨酶突变体菌株冻干菌粉10 g/L、乳酸脱氢酶（LDH）5g/L、葡萄糖脱氢酶（GDH）5g/L、100mM 1-苯丙酮、500 ~1000 mM L-丙氨酸、5%~15% v/vDMSO、0.5~1 mMPLP、0.25~0.5mMNAD⁺、葡萄糖150~250g/L；

ⅲ）100 mM pH 8.0Tris-HCl、ω转氨酶突变体菌株冻干菌粉10 g/L、氨基酸脱氢酶（AADH）5g/L、葡萄糖脱氢酶（GDH）5g/L、100mM 1-苯丙酮、500~1000 mM L-丙氨酸、5%~15%v/v DMSO、0.5~1 mMPLP、0.25~0.5mMNAD⁺、葡萄糖150~250g/L、甲酸铵150~250mM；

其中，上述三种级联反应体系都是在30~37℃条件下进行反应，反应结束后，先将反应液调酸至pH为1~1.5，反应液用乙酸乙酯萃取，舍去萃取相，后将反应液调碱至pH为13~13.5，收集萃取相，离心，取有机相减压蒸馏回收乙酸乙酯，得到淡黄色油状液体即为（S）-1-苯丙胺粗品。