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CN112481165A - 沼泽红假单胞菌p-3及其筛选方法与用途 - Google Patents

沼泽红假单胞菌p-3及其筛选方法与用途 Download PDF

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CN112481165A CN202011395487.XA CN202011395487A CN112481165A CN 112481165 A CN112481165 A CN 112481165A CN 202011395487 A CN202011395487 A CN 202011395487A CN 112481165 A CN112481165 A CN 112481165A
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ammonia nitrogen
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Abstract

本发明公开了一种沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)P‑3，其保藏号为CCTCC NO:M 2020808。该菌株是采用双层平板涂布法和划线法，分离纯化光合细菌，以副溶血弧菌、创伤弧菌、鳗弧菌为指示菌，采用牛津杯法测定海洋光合细菌菌株的抑菌作用，采用盐酸萘乙二胺分光光度法和靛酚蓝分光光度法测定不同菌株降解亚硝态氮和氨氮的作用，筛选得到。菌株P‑3具有抗弧菌并高效降解亚硝态氮和氨氮复合功能，对弧菌具有较强的抑制作用，且对鳗弧菌的作用最强，同时具有一定的降解亚硝态氮和氨氮作用。菌株P‑3在含有50mg/L氨氮和亚硝态氮培养基中培养4d，降解率分别为89.68％和94.98％，具有广泛的应用前景。

Description

沼泽红假单胞菌P-3及其筛选方法与用途
技术领域
本发明涉及一种菌株，特别是一种沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)P-3。本发明还涉及该菌株的筛选方法与用途。
背景技术
弧菌普遍存在于养殖水域，是水产养殖的主要病原菌之一。近年来随着水产养殖品种的增加和养殖规模的扩大，高密度养殖使水域的调节能力降低，弧菌病害和氨氮过量对水产养殖的负面影响越来越大，水产养殖过程中弧菌病防治和水体污染治理的研究越来越受重视。
目前主要采用化学、物理手段，但物理和化学手段会造成水体二次污染，导致病原菌的抗药性，打破水域生态平衡，生物手段弥补了化学手段的不足，这种生态友好类的治理手段越来越受关注，生产上需要更多的微生物制剂用于水产病害和水污染治理。
光合细菌(Photosynthetic Bacteria，简称PSB)是在厌氧条件下以光为能源，以二氧化碳或有机物为碳源，进行不放氧光合作用的原核生物。目前，所知的光合细菌可分为着色杆菌科、外硫红螺菌科、紫色非硫细菌、绿色硫细菌、多细胞丝状绿细菌、螺旋杆菌科、含细菌叶绿素的专性好氧菌等7大类群，其中在水产养殖方面应用最多的为紫色非硫细菌。
光合细菌利用水中有机物为营养与病原微生物争夺营养，同时自身的繁殖在水中形成优势菌群又占据了病原微生物生存空间，控制病原微生物繁殖，抑制弧菌等致病菌的大量繁殖，减少养殖动物病害的发生，而且还能提高养殖动物的免疫力，使其体形更大，营养更丰富，光合细菌广泛分布于淡水、海水、极地或温泉，以及高盐、高有机质含量等不同的生态环境中，可以针对下层低氧或缺氧环境，有效去除水体中的氨、亚硝酸盐、硫化氢等有害物质，起到净化水质、修复水体环境的作用，且不会造成额外的氧气消耗。因此，光合细菌已广泛用于水产养殖弧菌病害的防治和水污染治理。
分离筛选对弧菌具有抑制作用同时对具有降解氨氮和亚硝态氮作用的优良光合细菌，为水产养殖病害的生物防治和养殖水污染治理提供优良菌株具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)P-3，该菌株为对弧菌具有抑制作用同时对具有降解氨氮和亚硝态氮作用的优良光合细菌。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供了沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)P-3的筛选方法。
本发明所要解决的又一个技术问题是提供了沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)P-3的用途。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)P-3，其特点是：其保藏号为CCTCC NO:M2020653。
本发明所涉及的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)P-3菌株，已于2020年11月30日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，其保藏号为：CCTCC NO:M2020808，电话：027)8768 2319传真:(027)8788 3833E-mail:cctcc@whu.edu.cn地址：武汉，武汉大学；邮编：430072。
本发明还公开了沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)P-3的筛选方法，其步骤如下：
(1)品的采集与富集
采集海水样品、海泥样品；取5mL样品于25mL富集培养基中，置于50mL螺口离心管中，再加5mL无菌液体石蜡，30℃，2000lux光照条件下富集培养，至培养物出现不同颜色。取1mL培养物接种于新的富集培养基中继续培养，重复3-4次，得到深色培养液；
(2)海洋光合细菌的分离纯化
采用双层平板涂布法和双层平板划线法；取不同的样品富集液，进行梯度稀释，分别取不同样品10-4、10-5、10-6稀释浓度的稀释液0.2ml涂布于光合细菌分离培养基平板上，用一层融化后冷却至45℃左右的分离培养基覆盖，静置凝固后，30℃光照条件下培养4d；挑取不同颜色菌落至新的分离培养基的平板上进行三区划线，进一步纯化，至在显微镜下观察菌体形态一致；分离纯化得到了橙红色的P-1菌株，红色的P-2菌株和深红色P-3菌株共3个光和细菌的；
(3)海洋光合细菌对弧菌的抑制作用测定
分离得到的光合细菌菌株接种于装有25mL LB液体培养基的50mL离心管内，加入5mL灭菌石蜡，在30℃、光照强度2000xl下培养4d，菌液用无菌液体培养基调整OD660nm相等且OD660nm≧1.5；
采用牛津杯法对弧菌的抑菌作用测定：将在2216E培养基斜面上培养24h的供试三种弧菌用无菌生理盐水洗下，制备成浓度为107个细胞/mL的菌悬液，取0.1mL菌悬液涂布在2216E培养基平板上；在距离培养皿边缘1.5cm处的含菌平板四周均匀放置牛津杯，每个牛津杯中注入200μL光合细菌不同菌株菌悬液，以等量的无菌培养基为对照，28℃恒温培养48h，观察测定抑菌圈直径；每个菌株3个重复；筛选得到选取对3种弧菌均有抑制作用的菌株P-3，菌株P-3对鳗弧菌的抑菌圈平均直径为4.25±0.45mm；三种弧菌为副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和创伤弧菌(Vibriovulnificus)；
(4)不同光合细菌菌株降解氨氮作用的测定
将OD660nm≧1.5的光合细菌菌悬液按10％的接种量接入装有25mL液体氨氮降解培养基的50mL离心管中，加入5mL灭菌石蜡，每个菌株3个平行，在30℃、光照强度2000xl下静置培养4d；发酵液于4℃、5000r/min条件下离心20min，取上清液，采用靛酚蓝分光光度法测定不同菌株上清液的OD637，根据标准曲线计算不同菌株发酵液中的氨氮浓度，以未接种的培养基作为对照，计算不同菌株的氨氮降解率；菌株P-2的氨氮降解率93.39％；菌株P-3氨氮降解率为89.68％；
(5)不同光合细菌菌株降解亚硝态氮作用的测定
将OD660nm≧1.5的光合细菌菌悬液按10％的接种量接入装有25mL液体亚硝态氮降解培养基的50mL离心管中，加入5mL灭菌石蜡，每个菌株3个平行，在30℃、光照强度2000xl下静置培养4d；发酵液于4℃、5000r/min条件下离心20min，取样品上清液100μL，加入6mL的Griess试剂，室温下反应20min，测538nm的吸光值；根据标准曲线计算不同菌株发酵液中的亚硝态氮浓度，以未接种的培养基作为对照，计算不同菌株的亚硝态氮降解率；菌株P-3的亚硝态氮降解率为94.98％；
(6)菌株鉴定
菌株P-3菌落形态为红色圆球状，边缘整齐，表面低突；该菌为革兰氏阴性菌，细胞短杆状，大小为1.34-1.62×0.33-0.59μm，单根极生鞭毛；菌株P-3在光照厌氧条件下，培养液呈深红色；菌株P-3在麦芽糖、阿拉伯糖生化鉴定管颜色变为黄色，为阳性，葡萄糖管颜色无变化，尿素酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶实验呈阳性，苯丙氨酸、肌醇试验为阴性；柠檬酸钠作为唯一碳源培养4d，培养液颜色变为红色，为阳性；
菌株P-3细胞形态、生理生化特性与红假单胞菌属的形态和生理生化特性一致，初步认为菌株P-3为红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)；
对筛选得到的菌株P-3的16S rRNA基因序列与NCBI中的序列进行比对，菌株P-3的16S rRNA与沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)的相似性为99.31％，确认P-3菌株为沼泽红假单胞菌。
本发明所述的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)P-3的一种用途是：将沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)P-3菌株或者其发酵液用作降解氨氮与/或降解亚硝态氮的菌剂。可以用于水产养殖水的污染治理中降解氨氮与/或降解亚硝态氮。
本发明所述的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)P-3的另一种用途是：将沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)P-3菌株或者其发酵液用作抑菌剂，所抑的菌为副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)或创伤弧菌(Vibrio vulnificus)。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明从30个连云港和南通海域海水、海泥等样品中，分离到海洋光合细菌3株，其中本发明P-3菌株对3种弧菌弧菌均具有较强的抑制作用，同时高效降解氨氮和亚硝态氮。本发明分离筛选得到的菌株P-3在亚硝态氮和氨氮含量为50mg/L时，对氨氮和亚硝酸态氮的降解率的分别达89.68％和94.98％，同时对副溶血弧菌、鳗弧菌和创伤弧菌均具有较强的抑制作用，具有复合功能，为水产养殖病害的生物防治和养殖水污染治理提供优良菌株。
附图说明
图1为为富集筛选培养后的培养液图；
图2为菌株P-1形态特征观察图，其中：左为菌落特征图片；右为菌株形态图片；
图3为菌株P-2形态特征观察图，其中：左为菌落特征图片(15×)；右为菌株形态图片；
图4为不同光合细菌菌液对副溶血弧菌、鳗弧菌和创伤弧菌的抑菌效果图，其中：A为副溶血弧菌；B为鳗弧菌；C为创伤弧菌；
图5为氨氮标准曲线图；
图6为亚硝态氮标准曲线图；
图7为菌株P-3形态特征图，其中：“A”为菌落特征图片(25×)；“B”为菌株形态图；
图8为菌株P-3鞭毛染色；
图9为菌株P-3液体培养物图；
图10为基于P-3菌株的16SrRNA基因序列构建的系统发育树。
具体实施方式
以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1，沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)P-3菌株的筛选：
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1供试培养基
光合细菌富集培养基：NaCl 2g，MgSO4·7H2O 0.2g，NH4Cl 1g，KH2PO4 1.75g，CH3COONa 3g，酵母粉1g，蒸馏水1000ml，pH值7.0，灭菌后加入2g NaHCO3。
光合细菌分离培养基：光合细菌富集培养基添加1.7％琼脂。
光合细菌发酵培养基：LB培养基。
弧菌的培养及抑菌作用测定培养基：2216E培养基：蛋白胨5g、酵母膏1g、磷酸高铁0.01g，琼脂20g，陈海水1000mL，pH值8.0。
氨氮降解培养基：NaCl 2g，MgSO4·7H2O 0.2g，(NH4)2SO40.2358g，KH2PO4 1.75g，CH3COONa 3g，酵母粉1g，蒸馏水1000ml，pH值7.0，灭菌后加入2g NaHCO3。(氨氮浓度：50mg/L)
亚硝态氮降解培养基：NaCl 2g，MgSO4·7H2O 0.2g，NaNO2 0.2464g，KH2PO4 1.75g，CH3COONa 3g，酵母粉1g，蒸馏水1000ml，pH值7.0，灭菌后加入2g NaHCO3。(亚硝态氮浓度：50mg/L)
柠檬酸盐利用培养基：NaCl 2g，MgSO4·7H2O 0.2g，NH4Cl 1g，KH2PO4 1.75g，柠檬酸钠3g，蒸馏水1000ml，pH值7.0，灭菌后加入2g NaHCO3。
1.1.2病原菌
副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)由本实验室保藏提供。
1.1.3试剂
(1)溶液A的配制：称取0.3622g含2个结晶水的亚硝基铁氰化钠，溶于水并定容至25mL，配制成质量浓度为1.25％亚硝基铁氰化钠溶液，用棕色试剂瓶4℃保存。称取5.00g苯酚，溶于400mL水，加入2.0mL配制好的亚硝基铁氰化钠溶液，定容至500mL，为溶液A，用棕色试剂瓶4℃保存。
(2)溶液B的配制：称取2.50g NaOH、2.0g柠檬酸三钠和3.5mL NaClO溶于400mL水中，定容至500mL，为溶液B，4℃保存于棕色试剂瓶。
(3)对氨基苯磺酸溶液的配制：将5.0g对氨基苯磺酸溶解于50mL浓盐酸中，加水稀释至300mL，冷却后转移至500mL容量瓶中，加水至标线，摇匀。4℃保存于棕色试剂瓶。
(4)盐酸萘乙二胺溶液的配制：将0.5g盐酸萘乙二胺溶解于100mL水中，转移至500mL容量瓶中，加水定容至500ml，摇匀。4℃保存于棕色试剂瓶。
(5)Griess试剂
将盐酸萘乙二胺溶液和对氨基苯磺酸溶液2：1体积混合。
1.2样品的采集与富集
从连云港海域海州湾、车牛山岛、灌河入海口等区域采集海水样品20个，海泥样品4个，从南通市如东、启东地区海域采集海水样品4个，海泥样品2个。
取5mL样品于25mL富集培养基中，置于50mL螺口离心管中，再加5mL无菌液体石蜡，30℃，2000lux光照条件下富集培养，至培养物出现不同颜色。取1mL培养物接种于新的富集培养基中继续培养，重复3-4次，得到深色培养液。
1.3海洋光合细菌的分离纯化
采用双层平板涂布法和双层平板划线法。取不同的样品富集液，进行梯度稀释，分别取不同样品10-4、10-5、10-6稀释浓度的稀释液0.2ml涂布于光合细菌分离培养基平板上，用一层融化后冷却至45℃左右的分离培养基覆盖，静置凝固后，30℃光照条件下培养4d。挑取红色、紫色、棕色和绿色等不同颜色菌落至新的分离培养基的平板上进行三区划线，进一步纯化，至在显微镜下观察菌体形态一致。
1.4海洋光合细菌对弧菌的抑制作用测定
1.4.1光合细菌菌悬液的制备
分离得到的光合细菌菌株接种于装有25mL LB液体培养基的50mL离心管内，加入5mL灭菌石蜡，在30℃、光照强度2000xl下培养4d，菌液用无菌液体培养基调整OD660nm相等且OD660nm≧1.5。
1.4.2对弧菌的抑菌作用测定
采用牛津杯法。将在2216E培养基斜面上培养24h的供试三种弧菌用无菌生理盐水洗下，制备成浓度为107个细胞/mL的菌悬液，取0.1mL菌悬液涂布在2216E培养基平板上。在距离培养皿边缘1.5cm处的含菌平板四周均匀放置牛津杯，每个牛津杯中注入200μL光合细菌不同菌株菌悬液，以等量的无菌培养基为对照，28℃恒温培养48h，观察测定抑菌圈直径。每个菌株3个重复。
1.5不同光合细菌菌株降解氨氮作用的测定
1.5.1氨氮标准工作曲线的制作
采用靛酚蓝分光光度法测定溶液中氨氮含量。称取235.8mg(NH4)2SO4溶于水，定容至100mL，制成氨氮浓度为500mg/L的氨氮贮备溶液，取氨氮贮备溶液进行稀释，配制氨氮浓度分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50mg/L的氨氮标准溶液。取不同浓度的氨氮标准液100μL，分别加入溶液A和溶液B各5mL，充分混合后，放入37℃水浴显色20min，取出后冷却至室温，测定637nm吸光值。以氨氮浓度为横坐标，OD637为纵坐标，制作标准曲线，建立回归方程。
1.5.2氨氮降解率的测定
将光合细菌菌悬液(OD660nm≧1.5)按10％的接种量接入装有25mL液体氨氮降解培养基的50mL离心管中，加入5mL灭菌石蜡，每个菌株3个平行，在30℃、光照强度2000xl下静置培养4d。发酵液于4℃、5000r/min条件下离心20min，取上清液，采用靛酚蓝分光光度法测定不同菌株上清液的OD637，根据标准曲线计算不同菌株发酵液中的氨氮浓度，以未接种的培养基作为对照，计算不同菌株的氨氮降解率。
氨氮降解率/％＝[(对照氨氮浓度-处理氨氮浓度)/对照氨氮浓度]×100％
1.6不同光合细菌菌株降解亚硝态氮作用的测定
1.6.1亚硝态氮标准工作曲线的制作
采用盐酸萘乙二胺分光光度法(GB/T11889-1989)测定溶液中亚硝态氮含量。称取246.4mg亚硝酸钠(NaNO2)，溶于150mL水中，转移至1000mL容量瓶中，定容至1000ml，摇匀制成50mg/L亚硝态氮贮备溶液。取亚硝态氮贮备溶液稀释，制成浓度为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50mg/L的亚硝态氮标准溶液，取100μL标准液加入6mL的Griess试剂，室温下反应20min，测637nm的吸光值。以亚硝态氮浓度为横坐标，OD538为纵坐标，制作标准曲线，建立回归方程。
1.6.2亚硝态氮降解率的测定
将光合细菌菌悬液(OD660nm≧1.5)按10％的接种量接入装有25mL液体亚硝态氮降解培养基的50mL离心管中，加入5mL灭菌石蜡，每个菌株3个平行，在30℃、光照强度2000xl下静置培养4d。发酵液于4℃、5000r/min条件下离心20min，取样品上清液100μL，加入6mL的Griess试剂，室温下反应20min，测538nm的吸光值。根据标准曲线计算不同菌株发酵液中的亚硝态氮浓度，以未接种的培养基作为对照，计算不同菌株的亚硝态氮降解率。
亚硝态氮降解率/％＝[(对照亚硝态氮浓度-处理亚硝态氮浓度)/对照亚硝态氮浓度]×100％
1.7抑菌并高效降解氨氮和亚硝态氮光合细菌菌株的初步鉴定
1.7.1形态学观察
将筛选出的抑菌并高效降解氨氮和亚硝态氮光合细菌菌株接种于光合细菌分离培养基上，在30℃、光照强度2000xl下静置培养4d，通过解剖镜观察培养基上菌落形态及颜色，挑取单菌落，进行革兰氏染色和鞭毛染色，显微镜观察菌体大小、形态和染色结果。
1.7.2生理生化试验
挑取菌株3个单菌落至含2ml无菌水的离心管中，振荡均匀并制成0.5麦氏浊度的均一菌悬液，吸取50μL-100μL菌悬液接种至不同的生化管中，按照说明书于不同条件下培养，观察反应管的显色结果，将显色结果与《结果诠释表》比对，确定反应结果，以大肠杆菌为对照菌。
柠檬酸盐利用试验：将光合细菌菌悬液(OD660nm≧1.5)按10％的接种量接入装有25mL柠檬酸盐利用培养基的50mL离心管中，加入5mL灭菌石蜡，在30℃、光照强度2000xl下静置培养4d，观察培养基颜色变化，确认菌株是否生长。
根据形态观察和生理生化反应结果，对照《伯杰细菌鉴定手册》及《常见细菌系统鉴定手册》等文献对菌株进行初步鉴定。
1.7.316S rRNA序列分析：将光合细菌P-3菌株送至上海生工生物工程股份服务有限公司，测定菌株的16S rRNA序列。所得的基因序列拼接与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比对，采用MEGA7.0软件构建菌株16S rRNA基因序列系统发育树。
2结果与分析
2.1海洋光合细菌的富集
在光照厌氧条件下30个不同样品多次富集培养，有6个样品出现了颜色变化，分离自灌河入海口海泥的A为棕色，车牛山岛海水的B和南通如东海泥的C均为深红色，南通启东海水D和连云港高公岛表层海水E为红色，海州湾海水F为绿色。结果如图1所示。其他样品浑浊，未变色。
2.2海洋光合细菌的分离纯化
将富集的30个样品涂布于光合细菌平板上，从连云港高公岛海域海水分离纯化得到了橙红色的P-1菌株，从南通如东海泥中分离得到红色的P-2菌株，从连云港车牛山岛海域海水的深红色P-3菌株。3个菌株的形态特征见表1。符合光和细菌的特征。
表1分离得到的3个光合细菌菌株的形态特征
Figure BDA0002814550530000141
2.3光合细菌菌株对3种弧菌的抑制作用
结果如表2和图4所示，菌株P-3对3种弧菌均有抑制作用，其中菌株P-3对鳗弧菌的抑菌圈较明显，抑菌圈平均直径为4.25±0.45mm。菌株P-1、P-2在平板对峙试验中，牛津杯周围基本上没有出现抑菌圈，说明这2株菌对副溶血弧菌、鳗弧菌和创伤弧菌没有拮抗作用。
表2不同光合细菌菌株对弧菌的抗菌效果
Figure BDA0002814550530000151
注：-：无明显抑菌圈。
2.4具有抑菌作用的光合细菌菌株降解氨氮作用的测定
2.4.1氨氮标准曲线
以标准氨氮液浓度为横坐标、OD637为纵坐标，制作工作曲线。如图5所示，在设置的浓度范围内，随着氨氮浓度的增加OD637逐渐增大，呈正相关，计算回归方程，工作曲线方程为y＝0.0152x-0.0126，R2＝0.9939，线性相关性较好，可以用于菌株发酵液中氨氮浓度的测定。
2.4.2不同菌株降解氨氮作用的测定
将光合细菌菌液加入含50mg/L氨氮降解培养基中，光照厌氧条件下，30℃培养4d，测定发酵液的OD637，并通过回归方程计算氨态氮浓度，结果如表4所示，3株菌株降解氨氮能力较强，其中菌株P-2的降解率最高，达到93.39％。其次为菌株P-3降解率为89.68％。结果如表3所示。
表3 3株海洋光合细菌的氨氮降解率
Figure BDA0002814550530000161
2.5具有抑菌作用的光合细菌菌株降解亚硝酸盐作用的测定
2.5.1亚硝态氮标准曲线
以标准亚硝态氮浓度为横坐标、OD538为纵坐标，制作工作曲线。如图6所示，在设置的浓度范围内，随着亚硝态氮浓度的增加OD538逐渐增大，呈正相关，计算回归方程，工作曲线方程为y＝0.06x+0.0441，R2＝0.988，线性相关性较好，可以用于菌株发酵液中亚硝态氮浓度的测定。
2.5.2不同光合细菌菌株亚硝态氮降解作用的测定
将光合细菌菌液加入含50mg/L亚硝态氮降解培养基中，光照厌氧条件下，30℃培养4d，测定发酵液的OD538，并通过回归方程计算亚硝态氮浓度，结果如表4所示，3株菌株降解亚硝态氮能力较强，其中菌株P-3的降解率最高，为94.98％。结果如表4所示。
表4 3株海洋光合细菌的亚硝态氮降解率
Figure BDA0002814550530000171
2.6抑菌并高效降解氨氮和亚硝态氮光合细菌菌株的鉴定
根据不同菌株抑菌作用、氨氮和亚硝态氮降解作用结果，P-3菌株对三种弧菌的抑制作用以及对亚硝态氮的降解作用最强，同时对氨氮的降解率较高，作为高效抑菌降解氨氮和亚硝态氮的优良菌株进行初步鉴定。
2.6.1形态学观察
如图7所示，菌落形态为红色圆球状，边缘整齐，表面低突；该菌为革兰氏阴性菌，细胞短杆状，大小为1.34-1.62×0.33-0.59μm，单根极生鞭毛，结果见图8；菌株P-3在光照厌氧条件下，培养液呈深红色，见图9。
2.6.2生理生化特性
菌株P-3菌株在麦芽糖、阿拉伯糖生化鉴定管颜色变为黄色，为阳性，葡萄糖管颜色无变化，说明该菌具有分解阿拉伯糖和麦芽糖的能力，不能利用葡萄糖作为碳源；尿素酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶实验呈阳性，表明P-3能分解氨基酸使其脱羧生成胺；苯丙氨酸、肌醇试验为阴性；柠檬酸钠作为唯一碳源培养4d，培养液颜色变为红色，为阳性，表明菌株P-3可以利用柠檬酸盐。结果见表5。
表5菌株P-3生理生化试验结果
Figure BDA0002814550530000181
根据形态观察结果和生理生化试验，参照《伯杰细菌系统鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对菌株P-3进行初步鉴定。
在厌氧光照条件下培养物为深红色的光合细菌有红假单胞菌菌属、红螺菌属和红微菌属，红螺菌属菌体为螺旋状，不具有脱氮能力，生境为淡水环境；红微菌属菌体为卵圆形至柠檬状，依靠周生鞭毛运动，且不能利用柠檬酸盐为碳源；红假单胞菌属的菌体为球形或杆状，单根极生鞭毛运动，不能利用葡萄糖，可以利用柠檬酸盐且具有脱氮作用，生境为海水环境，菌株P-3细胞形态、生理生化特性等与红螺菌属和红微菌属不同，而与红假单胞菌属的形态和生理生化特性一致，初步认为菌株P-3为红假单胞菌(Rhodopseudomonassp.)。
表6红假单胞菌属菌株P-3鉴别特征
Figure BDA0002814550530000191
Figure BDA0002814550530000201
2.6.3 P-3菌株16S rRNA序列分析
将P-3的16S rRNA基因序列与NCBI中的序列进行比对，P-3菌株的16S rRNA与沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)(序列号为AB079634.1)的相似性为99.31％。选取同属内同源相似性较高的不同菌株的16S rRNA序列，采用Mega7.0软件构建系统发育树，P-3与登录号AB079634.1的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)亲缘关系最近，位于同一分支，结果见图10。结合形态学观察、生理生化实验结果，认为P-3菌株为沼泽红假单胞菌。
3结论与讨论
本发明从30个连云港和南通海域海水、海泥等样品中，分离到海洋光合细菌3株，P-3菌株对3种弧菌弧菌均具有较强的抑制作用，同时高效降解氨氮和亚硝态氮。本实验分离筛选得到的菌株P-3在亚硝态氮和氨氮含量为50mg/L时，对氨氮和亚硝酸态氮的降解率的分别达89.68％和94.98％，同时对副溶血弧菌、鳗弧菌和创伤弧菌均具有较强的抑制作用，具有复合功能，有关同时具有抑菌和降解氨氮及亚硝态氮作用的复合功能光合细菌研究较少。

Claims (5)

1.一种沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)P-3，其特征在于：其保藏号为CCTCC NO:M 2020808。
2.一种如权利要求1所述的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)P-3的筛选方法，其特征在于，其步骤如下：
(1)品的采集与富集
采集海水样品、海泥样品；取5mL样品于25mL富集培养基中，置于50mL螺口离心管中，再加5mL无菌液体石蜡，30℃，2000lux光照条件下富集培养，至培养物出现不同颜色。取1mL培养物接种于新的富集培养基中继续培养，重复3-4次，得到深色培养液；
(2)海洋光合细菌的分离纯化
采用双层平板涂布法和双层平板划线法；取不同的样品富集液，进行梯度稀释，分别取不同样品10-4、10-5、10-6稀释浓度的稀释液0.2ml涂布于光合细菌分离培养基平板上，用一层融化后冷却至45℃左右的分离培养基覆盖，静置凝固后，30℃光照条件下培养4d；挑取不同颜色菌落至新的分离培养基的平板上进行三区划线，进一步纯化，至在显微镜下观察菌体形态一致；分离纯化得到了橙红色的P-1菌株，红色的P-2菌株和深红色P-3菌株共3个光和细菌的；
(3)海洋光合细菌对弧菌的抑制作用测定
分离得到的光合细菌菌株接种于装有25mL LB液体培养基的50mL离心管内，加入5mL灭菌石蜡，在30℃、光照强度2000xl下培养4d，菌液用无菌液体培养基调整OD660nm相等且OD660nm≧1.5；
采用牛津杯法对弧菌的抑菌作用测定：将在2216E培养基斜面上培养24h的供试三种弧菌用无菌生理盐水洗下，制备成浓度为107个细胞/mL的菌悬液，取0.1mL菌悬液涂布在2216E培养基平板上；在距离培养皿边缘1.5cm处的含菌平板四周均匀放置牛津杯，每个牛津杯中注入200μL光合细菌不同菌株菌悬液，以等量的无菌培养基为对照，28℃恒温培养48h，观察测定抑菌圈直径；每个菌株3个重复；筛选得到选取对3种弧菌均有抑制作用的菌株P-3，菌株P-3对鳗弧菌的抑菌圈平均直径为4.25±0.45mm；三种弧菌为副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和创伤弧菌(Vibriovulnificus)；
(4)不同光合细菌菌株降解氨氮作用的测定
将OD660nm≧1.5的光合细菌菌悬液按10％的接种量接入装有25mL液体氨氮降解培养基的50mL离心管中，加入5mL灭菌石蜡，每个菌株3个平行，在30℃、光照强度2000xl下静置培养4d；发酵液于4℃、5000r/min条件下离心20min，取上清液，采用靛酚蓝分光光度法测定不同菌株上清液的OD637，根据标准曲线计算不同菌株发酵液中的氨氮浓度，以未接种的培养基作为对照，计算不同菌株的氨氮降解率；菌株P-2的氨氮降解率93.39％；菌株P-3氨氮降解率为89.68％；
(5)不同光合细菌菌株降解亚硝态氮作用的测定
将OD660nm≧1.5的光合细菌菌悬液按10％的接种量接入装有25mL液体亚硝态氮降解培养基的50mL离心管中，加入5mL灭菌石蜡，每个菌株3个平行，在30℃、光照强度2000xl下静置培养4d；发酵液于4℃、5000r/min条件下离心20min，取样品上清液100μL，加入6mL的Griess试剂，室温下反应20min，测538nm的吸光值；根据标准曲线计算不同菌株发酵液中的亚硝态氮浓度，以未接种的培养基作为对照，计算不同菌株的亚硝态氮降解率；菌株P-3的亚硝态氮降解率为94.98％；
(6)菌株鉴定
菌株P-3菌落形态为红色圆球状，边缘整齐，表面低突；该菌为革兰氏阴性菌，细胞短杆状，大小为1.34-1.62×0.33-0.59μm，单根极生鞭毛；菌株P-3在光照厌氧条件下，培养液呈深红色；菌株P-3在麦芽糖、阿拉伯糖生化鉴定管颜色变为黄色，为阳性，葡萄糖管颜色无变化，尿素酶、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶实验呈阳性，苯丙氨酸、肌醇试验为阴性；柠檬酸钠作为唯一碳源培养4d，培养液颜色变为红色，为阳性；
菌株P-3细胞形态、生理生化特性与红假单胞菌属的形态和生理生化特性一致，初步认为菌株P-3为红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)；
对筛选得到的菌株P-3的16S rRNA基因序列与NCBI中的序列进行比对，菌株P-3的16SrRNA与沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)的相似性为99.31％，确认P-3菌株为沼泽红假单胞菌。
3.如权利要求1所述的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)P-3的用途，其特征在于：所述的用途为将沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)P-3菌株或者其发酵液用作降解氨氮与/或降解亚硝态氮的菌剂。
4.据据权利要求3所述的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)P-3的用途，其特征在于：所述的用途为将沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)P-3株用于水产养殖水的污染治理中降解氨氮与/或降解亚硝态氮。
5.如权利要求1所述的沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)P-3的用途，其特征在于：所述的用途为将沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)P-3菌株或者其发酵液用作抑菌剂，所抑的菌为副溶血弧菌(Vibrio Parahemolyticus)、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)或创伤弧菌(Vibrio vulnificus)。
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