CN112458199A - 一种水稻耐盐基因skc1的snp分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水稻耐盐基因SKC1的SNP分子标记及其应用。所述SNP分子标记选自OS900205_K01、OS900206_K01、OS900207_K01的任一个，其中，OS900205_K01的多态性为C或G；OS900206_K01的多态性为T或C；OS900207_K01的多态性为A或G。利用所述分子标记，可快速、精准的检测水稻耐盐基因SKC1。本发明在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少气溶胶的污染以及EB等有毒物的使用，有利于SKC1基因高效、环保的应用于水稻商业化分子育种中。
Description
技术领域
本发明涉及水稻育种领域，具体涉及一种水稻耐盐基因SKC1的SNP分子标记及其应用。
背景技术
耐盐是作物一个重要的抗逆性状，它能够保证作物在盐碱地或者浇灌一定比例海水的条件下仍然能够正常生长。随着水资源日趋紧张，开发能够适应海水浇灌的“海水稻”已经成为一个水稻育种的热点方向。
目前从水稻发现多个耐盐相关的数量性状位点(quantitative trait locus，QTL)，但真正克隆的基因不多，SKC1就是其中之一。有研究报道水稻品种Nona Bokra含有的SKC1基因与其它能在高钾离子的环境下正常生长紧密相关。SKC1基因位于Nona Bokra的1号染色体上，能编码554个氨基酸并且最终形成60KD的蛋白质，将Nona Bokra的SKC1基因(启动子+编码区)导入不耐盐品种Zhonghua 11之后，转基因Zhonghua 11能在在高钾离子的环境下正常生长。通过一系列实验证明，SKC1基因主要通过调控水稻体内钾离子/钠离子的动态平衡，从而使作物能够适应高盐的生长环境。
由于对作物耐盐性状的测定比较复杂，需要有专门的条件和丰富的经验，因此该表型测定工作给育种工作者带来了很多不便。分子标记技术能够使育种工作者降低对表型选育的依赖，从而加快水稻耐盐品种的选育，因而受到了育种工作者的欢迎。目前文献中公布的SKC1分子标记大多为CAPs标记，需要进行酶切PCR产物、凝胶电泳检测和酶切产物分析，检测过程使用的核酸染料等试剂对环境及人体有危害，且自动化程度低检测通量小，有时会出现非特异扩增的情况，导致检测结果无法准备判断，很大程度上限制了检测效率。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种水稻耐盐基因SKC1的SNP分子标记。
本发明还提出用于检测上述SNP分子标记的引物组。
本发明还提出上述水稻耐盐基因SKC1的基因型的检测方法。
本发明还提出上述SNP分子标记或引物组的应用。
根据本发明的第一方面实施方式的SNP分子标记，所述SNP分子标记选自OS900205_K01、OS900206_K01、OS900207_K01的任一个，其中，OS900205_K01的多态性为C或G；OS900206_K01的多态性为T或C；OS900207_K01的多态性为A或G。
根据本发明的一些实施方式，所述SNP分子标记OS900205_K01的多态性位点位于Chr1.11462859(MSU7.0 position)；OS900206_K01的多态性位点位于Chr1.11462726(MSU7.0position)；OS900207_K01的多态性位点位于Chr1.11462124(MSU7.0 position)。
根据本发明第二方面实施方式的用于检测上述SNP分子标记的引物组，每个所述SNP分子标记的引物组独立地包括特异性引物和通用引物，其中，所述特异性引物序列包括Primer Allele X和Primer Allele Y。
根据本发明的一些实施方式，所述SNP分子标记OS900205_K01的特异性引物包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；SNP分子标记OS900206_K01的特异性引物包括如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；SNP分子标记OS900207_K01的特异性引物包括如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。
根据本发明的一些实施方式，优选地，所述特异性引物分别连接FAM和/或HEX荧光接头序列。
根据本发明的一些实施方式，所述引物组在水稻基因型检测中的应用。
根据本发明的第三方面实施方式的上述水稻耐盐基因SKC1的基因型的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
S1、从水稻叶片中提取基因组DNA；
S2、以步骤S1中提取的基因组DNA为模板，利用上述SNP分子标记的引物组，对OS900205_K01、OS900206_K01、OS900207_K01这三种SNP分子标记进行检测；
S3、若三组引物均只检测到引物Primer X所对应的碱基，判定水稻样品为纯合的耐盐SKC1基因型；若只检测到引物Primer Y所对应的碱基，判定测试的水稻样品为纯合的不耐盐skc1基因型；若三组引物同时检测到Primer X、Primer Y所对应的碱基，则判断待测水稻样品为杂合的耐盐SKC1基因型。
根据本发明的一些实施方式，优选地，所述步骤S1中，水稻叶片中提取基因组DNA采用简化CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵法)。
根据本发明的一些实施方式，优选地，所述步骤S2中，用KASP(竞争性等位基因特异性PCR)技术对SNP位点进行检测。
根据本发明的第四方面实施方式的上述SNP分子标记或引物组的应用，所述应用为所述SNP分子标记或引物组在水稻育种中的应用。
根据本发明的一些实施方式，所述应用为利用上述分子标记的检测方法对上述水稻耐盐基因SKC1的基因型进行检测，选择携带有SKC1基因的水稻样品进行后续育种。
根据本发明的一些实施方式，所述应用为提供一种检测SKC1基因SNP分子标记的试剂盒，所述试剂盒包括OS900205_K01、OS900206_K01和OS900207_K01这三种SNP分子标记的引物，其中，所述引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1～9所示。
根据本发明的一些实施方式，所述试剂盒用于水稻育种。
根据本发明的一些实施方式，所述应用为提供了一种基因芯片，所述基因芯片包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～9所示的引物。
根据本发明的一些实施方式，所述基因芯片应用于水稻的基因分型。
根据本发明实施方式的水稻耐盐基因SKC1的SNP分子标记，至少具有如下有益效果：通过对本发明的稻耐盐基因SKC1进行SNP分子标记，应用KASP技术反应对水稻材料SKC1基因进行检测，可在籼稻、粳稻等不同种质资源中快速、精准的检测水稻耐盐基因SKC1。本发明利用KASP技术对所开发的SNP标记进行基因分型，KASP技术流程中PCR体系构建和荧光信号检测等基本自动化，可实现96，384，1536孔板高通量检测，适用于大规模、高通量的SKC1基因鉴定和筛选。本发明在检测过程中不需要酶切、电泳及测序等繁琐的程序，减少PCR产物气溶胶的污染以及EB等有毒物的使用，同时可在分子标记辅助育种的早期进行前景选择和背景选择，提高背景回复率，减小育种群体的规模，加快育种进程，有利于SKC1基因高效、环保的应用于水稻商业化分子育种中。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为本发明实施例的分子标记开发流程图；
图2为本发明实施例的分子标记OS900205_K01的分型图；
图3为本发明实施例的分子标记OS900206_K01的分型图；
图4为本发明实施例的分子标记OS900207_K01的分型图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
本发明实施例为：水稻耐盐基因SKC1的SNP分子标记及其应用，该分子标记的设计过程，如图1所示，通过已克隆目标基因SKC1确定物理位置，提取SNP位点和侧翼序列，通过设计和合成标记的引物序列，再对标记进行筛选测试，具体如下：
1引物设计
根据文献信息，将供体Nona Bokra的SKC1基因序列(NCBI基因序列号：DQ148410)与不耐盐的材料的skc1等位基因的序列进行比对，发现它们的序列中有一系列的SNP位点，根据国际水稻所3000份水稻重测序数据，查看SNP位点的PIC值及周边50bp是否有其他SNP位点后，进行SNP位点侧翼序列提取，并利用在线引物设计网站BatchPrimer3(http://probes.pw.usda.gov/batchprimer3/)对其进行引物设计。每组标记有三条引物，在其中两条特异性引物5’端分别连接FAM和HEX荧光序列。引物委托Invitrogen公司合成。
表1：标记信息
2样品检测
DNA提取：从水稻叶片中提取基因组DNA，采用简化CTAB法。
KASP反应测试：KASP反应测试在LGC SNPline基因分型平台上进行。在微孔反应板中加入20ng DNA样品，烘干后加入KASP反应混合液，反应体系见表2。PCR扩增在水浴热循环仪中完成，Touchdown PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应，94℃变性20秒，65℃～57℃退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.8℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，57℃退火并延伸60秒，26个循环。反应完成后利用扫描仪Pherastar对KASP反应产物进行荧光数据读取，荧光扫描的结果会自动转化成图形，若样品扩增产物只检测到引物PrimerX对应荧光信号，则检测位点为CTA单倍型，判定测试的水稻样品为纯合的耐盐SKC1基因型；若只检测到引物PrimerY对应荧光信号，则检测位点为碱基GCG单倍型，判定测试的水稻样品为纯合的不耐盐skc1基因基因型；若同时检测到两种荧光信号则检测位点为杂合，判断待测水稻为杂合的耐盐SKC1基因型。
表2 KASP检测的反应体系
| 终浓度 | 体积(ul) | |
| 100UM Primer C | 0.42μM | 0.0125 |
| 100UM Primer X | 0.17μM | 0.0050 |
| 100UM Primer Y | 0.17μM | 0.0050 |
| 2x KASP Master Mix | 1x | 1.4792 |
| 超纯水 | 1.4983 | |
| 总体积 | 3 |
3标记分型数据
根据上述检测方法，利用SKC1的供体Nona Bokra与不耐盐对照水稻品种越光对设计的标记进行KASP反应验证，OS900205_K01、OS900206_K01和OS900207_K01标记都能正常分型，3个标记组合对SKC1的供体Nona Bokra检测结果为CTA单倍型，对照品种越光为GCG单倍型，证明了本发明对SKC1基因检测的准确性。
4自然群体验证
利用72份材料对SNP标记OS900205_K01、OS900206_K01、OS900207_K01进行自然群体验证。72份材料中只有Nona Bokra为已知的含有纯合SKC1基因的品种，其余71份水稻为用于海水稻研究的普通材料。标记在自然群体分型结果如表3所示，从表中可以看出，7份水稻材料检测出有利的CTA单倍型，为纯合的耐盐SKC1基因型，其中包括SKC1的供体nonabokra。OS900205_K01标记在自然群体分型结果如图2所示，OS900206_K01标记在自然群体分型结果如图3所示，OS900207_K01标记在自然群体分型结果如图4所示(图中红色为耐盐的纯合SKC1基因型，蓝色不耐盐的纯合skc1基因型，紫色为耐盐的杂合SKC1基因型)，从图中可以看出，SKC1基因未在检测的常见水稻育种中广泛应用，后续导入SKC1基因定向改良水稻基因，OS900205_K01、OS900206_K01、OS900207_K01可用于水稻SKC1基因的高效检测。
表3 SNP分子标记分型数据
本发明中使用的LGC SNPline基因分型平台与其配套试剂耗材均购于英国LGC公司。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 华智生物技术有限公司
<120> 一种水稻耐盐基因SKC1的SNP分子标记及其应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtagacgaa ggtgacgtcg ttgc 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtagacgaa ggtgacgtcg ttgg 24
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caaccttacc tgatgatgac gacca 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgagtagtag tgcaggtgca gccgt 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgagtagtag tgcaggtgca gccgc 25
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cgacgaggta gagctagggt tagg 24
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtcggcgcgc tcttcatggc a 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtcggcgcgc tcttcatggc g 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gacgacacgg tggagaggtc ga 22
Claims (10)
1.一种水稻耐盐基因SKC1的SNP分子标记，其特征在于：所述SNP分子标记选自OS900205_K01、OS900206_K01、OS900207_K01的任一个，其中，OS900205_K01的多态性为C或G；OS900206_K01的多态性为T或C；OS900207_K01的多态性为A或G。
2.如权利要求1所述的SNP分子标记，其特征在于：所述SNP分子标记OS900205_K01的多态性位点位于Chr1.11462859；OS900206_K01的多态性位点位于Chr1.11462726；OS900207_K01的多态性位点位于Chr1.11462124。
3.一种用于检测如权利要求1所述的SNP分子标记的引物组，其特征在于：所述引物组包括特异性引物和通用引物，其中，所述特异性引物包括Primer Allele X和PrimerAllele Y。
4.如权利要求3所述的引物组，其特征在于：所述SNP分子标记OS900205_K01的特异性引物包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；SNP分子标记OS900206_K01的特异性引物包括如SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；SNP分子标记OS900207_K01的特异性引物包括如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列，通用引物包括如SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。
5.如权利要求3～4任一所述引物组在水稻基因型检测中的应用。
6.一种水稻耐盐基因SKC1的基因型的检测方法，其特征在于：所述检测方法包括以下步骤：
S1、从水稻叶片中提取基因组DNA；
S2、以步骤S1中提取的基因组DNA为模板，利用如权利要求3～4任一所述引物组，对OS900205_K01、OS900206_K01、OS900207_K01进行检测；
S3、若三组引物均只检测到引物Primer X所对应的碱基，判定水稻样品为纯合的耐盐SKC1基因型；若只检测到引物Primer Y所对应的碱基，判定测试的水稻样品为纯合的不耐盐skc1基因型；若三组引物同时检测到Primer X、Primer Y所对应的碱基，则判断待测水稻样品为杂合的耐盐SKC1基因型。
7.如权利要求1或2所述SNP分子标记或如权利要求3或4所述引物组在水稻育种中的应用。
8.一种水稻育种方法，其特征在于：包括如下步骤：如权利要求6所述检测方法对水稻耐盐基因SKC1的基因型进行检测，选择携带有耐盐SKC1基因型的水稻样品进行后续育种。
9.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括OS900205_K01、OS900206_K01和OS900207_K01引物，其中，所述引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1～9所示。
10.一种基因芯片，其特征在于：所述基因芯片包括核苷酸序列如SEQ ID NO.1～9所示的引物。
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