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CN112391337B - 一种鸽嗉囊成纤维细胞的分离及原代培养方法 - Google Patents

一种鸽嗉囊成纤维细胞的分离及原代培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种鸽嗉囊成纤维细胞分离及原代培养方法，包含以下步骤：取胚胎期鸽嗉囊组织，清洗后，将嗉囊组织剪成1mm3大小，均匀平铺细胞培养皿底部，加入少量FBS，置于细胞培养箱中6～8h后取出，加入完全培养基，继续培养，之后每隔2～3d更换一次培养基，培养5～7d即得到汇合度80％～90％的原代细胞。传代时使用提前预热至37℃的PBS清洗原代细胞后，加入胰蛋白酶消化，待细胞在显微镜下皱缩变圆时，加入完全培养基，终止消化，使用移液枪轻轻吹打细胞，转移至15ml离心管中，离心。重新加入完全培养基重悬细胞，按照1:2比例传代培养，置于细胞培养箱中进行培养，定时更换培养基。本发明所述原代分离方法操作简单，获得的细胞量大、纯度高，能够后续稳定培养。

Description

一种鸽嗉囊成纤维细胞的分离及原代培养方法
技术领域
本发明涉及家禽嗉囊成纤维细胞离体培养技术领域，特别涉及一种鸽嗉囊成纤维细胞分离及原代培养方法。
背景技术
鸽嗉囊位于食管与肌胃之间的膨大部，具有湿润、贮存食物、提供免疫保护等功能，鸽嗉囊具有合成和分泌鸽乳能力。在孵化期，公鸽和母鸽嗉囊组织各细胞层开始大量增殖，为鸽乳的形成与积累提供保障。但目前的研究对于单种类细胞的分离及培养报道较少。鸽嗉囊成纤维细胞作为嗉囊组织的重要细胞群，据报道，成纤维细胞具有合成胶原纤维蛋白、粘连蛋白，以及分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维的能力，此外，成纤维细胞具有多向分化潜能，人类皮肤成纤维细胞经不同转录因子处理后，可转化为具有分化能力的多能干细胞，可转化为脂肪细胞、内皮细胞、软骨细胞、肌腱细胞以及神经细胞等。但鸽嗉囊成纤维细胞在孵化期快速增殖的机制、鸽乳生成过程中功能以及分化潜能尚不明确。因此，对嗉囊成纤维细胞进行分离及原代培养，建立嗉囊成纤维细胞培养的方法，用于各个领域实验研究显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种鸽原代嗉囊成纤维细胞分离与培养的新方法，以弥补鸽原代嗉囊成纤维细胞分离与培养方法的空白，为鸽嗉囊功能的研究与应用提供工具细胞。
为达到上述目的，本发明提供了一种鸽原代嗉囊成纤维细胞分离与培养的新方法，具体内容如下：
一方面，本发明提供了一种鸽嗉囊成纤维细胞分离方法，包括以下步骤：
无菌条件下取出胚胎期鸽的嗉囊组织，迅速放置含有10％三抗的PBS中；
用含有10％三抗的PBS清洗组织8～10次，去除周围结缔组织。
将组织剪成1mm3大小的组织块培养；
将组织块均匀平铺细胞培养皿底部，加入少量FBS，置于38℃，5％CO2培养箱中6～8h后取出，加入完全培养基；
转移至细胞培养箱中继续培养，之后每隔2～3d再更换一次培养基，培养5～7d即得到汇合度80％～90％的细胞。
另一方面，本研究还提供了一种鸽嗉囊成纤维细胞的传代培养方法，包括以下步骤：
接种步骤5所述汇合度80％～90％的细胞；
去除培养基，使用提前预热至37℃的PBS清洗细胞2次
加入含EDTA的0.25％胰蛋白酶消化1min，显微镜下观察到细胞皱缩变圆时，立即加入完全培养基，终止消化；
用手轻轻拍打细胞培养皿，再使用移液枪轻轻吹打细胞。
消化完成的细胞转移至15ml离心管中，离心；
重新加入完全培养基重悬细胞，按照1:2比例传代培养，根据细胞生长情况更换培养基；
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤1中所述胚胎期鸽的嗉囊组织为17日胚龄；
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤1、4中所述三抗包括青霉素、链霉素和两性霉素；
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤4中所述完全培养基为89％DMEM高糖培养基，10％胎牛血清(FBS)和1％三抗；
在以上技术方案的基础上，优选的，步骤10中所述离心转速为1000r/min,离心时间为5min。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明弥补了原代鸽嗉囊成纤维细胞分离，培养方法的空白。
本发明直接取嗉囊组织分离成纤维细胞，取材容易，操作简单，耗时短
本发明所提供的嗉囊素材来源的胚龄时间，组织发育完全，培养时不易污染
本发明方法分离细胞成功率高，稳定性强，得到的细胞数量多，形态好
本发明方法分离的细胞经过免疫荧光鉴定纯度达95％以上，细胞纯度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明分离培养方法培养5d的鸽嗉囊成纤维细胞显微镜图(100×)；
图2为本发明传代培养方法培养48h的鸽嗉囊成纤维细胞显微镜图(100×)；
图3为本发明分离培养方法得到的鸽嗉囊成纤维细胞Vimentin免疫荧光鉴定图(200×)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
下面实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用的试剂和原料均为公知技术，为本领域技术人员熟知的技术，而且在市场上很容易购得。下面实施例中描述的试剂和实验器具在使用前均经过灭菌处理。
取5个17日胚龄的鸽胚，雌雄皆可，用无菌剪刀从鸽蛋气室处剪开，取出鸽胚，麻醉后，转移至超净工作台内。
用无菌剪刀从鸽胚胸肌正中剪开皮肤，向颈部剖剪，注意动作缓慢(嗉囊组织易损伤，不便于分离)，取出嗉囊组织，放入无菌培养皿内，加入适量含10％青霉素/链霉素/两性霉素三抗的PBS溶液；用手术镊子剥离周围结缔组织，用含10％青霉素/链霉素/两性霉素三抗的PBS溶液冲洗组织6～8次，将肾脏转移至1.5mL EP管内，用眼科剪剪碎嗉囊组织，将组织剪至1mm3大小为止，加入500μL含FBS，用移液枪将组织转移至35mm细胞培养皿中，置于细胞培养箱中培养6～8h。
向所述细胞培养皿内加入2mL含有89％DMEM高糖培养基，10％胎牛血清(FBS)和1％三抗的完全培养基，置于细胞培养箱中继续培养。每2d更换一次完全培养基，培养5～7d细胞即生长至汇合度90％，即可进行传代培养，传代时用PBS清洗细胞1次，加入0.5mL0.25％胰蛋白酶，于显微镜下观察细胞，待细胞皱缩变圆，加入2mL完全培养基终止消化，获得细胞悬液，以1:2传代，获得传代细胞。
细胞鉴定：取所述传代细胞，弃掉培养基，使用PBS清洗3次，加入4％多聚甲醛固定20min，PBS清洗3次，用0.1％Triton X-100通透细胞5min，PBS清洗3次，每次3min，加入封闭液室温放置1h，吸出封闭液，加入400μl Vimentin(1:100稀释)4℃孵育过夜。PBS清洗4次，加入400μl鼠抗兔二抗(1:30稀释)室温孵育1h，PBS清洗5次，加入含有DAPI的抗荧光淬灭剂300μl，覆盖培养皿，避光放置5min，荧光显微镜下观察。进行Vimentin免疫荧光鉴定，结果显示Vimentin阳性率95％，即细胞纯度达95％。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种鸽嗉囊成纤维细胞的分离方法，所述方法包括：
(1)无菌条件下取出胚胎期鸽的嗉囊组织，迅速放置含有10％三抗的PBS中；其中三抗为：青霉素、链霉素、两性霉素；
(2)用含有10％三抗的PBS清洗组织8～10次，去除周围结缔组织；
(3)将组织剪成1mm3大小的组织块培养；
(4)将组织块均匀平铺细胞培养皿底部，加入少量FBS，置于38℃，5％CO2培养箱中6～8h后取出，加入完全培养基；所述完全培养基包含：89％DMEM高糖培养基，10％胎牛血清(FBS)和1％三抗；
(5)转移至细胞培养箱中继续培养，之后每隔2～3d再更换一次培养基，培养5～7d即得到汇合度80％～90％的贴壁细胞。
2.根据权利要求1所述的鸽嗉囊成纤维细胞的分离方法，其特征在于，所述胚胎期为17日胚龄。
3.一种鸽嗉囊成纤维细胞的传代培养方法，包括以下步骤：
(1)取权利要求1中步骤(5)中的汇合度80％～90％的贴壁细胞，显微镜观察后，可用于后续的传代培养；
(2)去除培养基，使用提前预处理PBS清洗细胞2次；
(3)加入适量预处理含EDTA的0.25％胰蛋白酶消化1min，显微镜下观察到细胞皱缩变圆时，立即加入完全培养基，终止消化；
(4)用手轻轻拍打细胞培养皿，再使用移液枪轻轻吹打细胞；
(5)消化完成的细胞转移至15ml离心管中，离心；
(6)重新加入完全培养基重悬细胞，按照1:2比例传代培养，根据细胞生长情况更换培养基。
4.根据权利要求3所述鸽嗉囊成纤维细胞的传代培养方法，其特征在于，步骤(2)中，PBS预处理具体步骤为：使用37℃金属浴预热PBS后，轻轻清洗细胞。
5.根据权利要求3所述鸽嗉囊成纤维细胞的传代培养方法，其特征在于，步骤(3)中，适量含EDTA的0.25％胰蛋白酶的量为刚刚没过培养皿底部。
6.根据权利要求3所述鸽嗉囊成纤维细胞的传代培养方法，其特征在于，步骤(3)中，预处理的含EDTA的0.25％胰蛋白酶预处理具体步骤为使用37℃金属浴预热含EDTA的0.25％胰蛋白酶后，再消化细胞。
7.根据权利要求3所述鸽嗉囊成纤维细胞的传代培养方法，其特征在于，步骤(3)中，消化1min时需在38℃，5％CO2培养箱中进行。
8.根据权利要求3所述鸽嗉囊成纤维细胞的传代培养方法，其特征在于，步骤(5)中，离心要求为1000r/min，离心5min。
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