CN112336747A - 纳米工程化神经母细胞瘤细胞的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种纳米工程化神经母细胞瘤细胞的构建方法。该方法主要利用药物负载技术和细胞膜展示技术，将神经母细胞瘤细胞内容物负载到锆基金属有机框架材料内，将神经母细胞瘤细胞膜装载到锆基金属有机框架材料表面上。该方法在破坏神经母细胞瘤细胞完整性，避免材料在体内成瘤的同时，使细胞膜和细胞内容物先后发挥作用，保持了神经母细胞瘤细胞的结构特性，并将细胞纳米化，提高生物相容性。该方法所构建出的纳米材料，在促进烧伤后伤口皮肤组织再生的同时，还能够促进毛囊再生，还原皮肤的原始结构，有望发展成为更有效治疗严重烧伤的新型生物材料。
Description
技术领域
本发明属于材料科学技术领域，提供了一种纳米工程化神经母细胞瘤细胞的构建方法。
背景技术
肿瘤细胞可以创造免疫微环境，包括肿瘤相关巨噬细胞，调节性T细胞等，促进损伤后再生。神经母细胞瘤细胞高表达声波刺猬，在皮肤中，声波刺猬是胚胎发育过程中毛囊形态发生以及调节成年卵泡生长和循环所必需的。声波刺猬促进Wnt激活的干细胞及其他具有分化潜能的细胞转化为真皮乳头，从而促进毛囊再生。但只有破坏肿瘤细胞的完整性，才能利用其再生特性，而不造成体内成瘤。
锆基金属有机框架(NU-801)具有热响应性，可以通过在其外部包裹聚多巴胺，显示出在NIR照射下内容物释放。
细胞膜包被的纳米颗粒是一类新型的仿生纳米系统，它将细胞膜的功能和合成纳米材料的功能灵活性结合在一起，可有效地进行药物输送并提供新颖的治疗方法。
利用NU-801将神经母细胞瘤的细胞膜与细胞质隔离开，既可以达到序列治疗作用，即先创造利于再生的免疫微环境，再NIR照射释放细胞内容物，促进皮肤和毛囊的再生，又可以避免肿瘤细胞的体内成瘤。该纳米材料还原了烧伤部位皮肤的原始结构，有望发展成为更有效治疗严重烧伤的新型生物材料。
发明内容
本发明目的在于提供一种纳米工程化神经母细胞瘤细胞的构建方法，具体是指一种促进烧伤后毛囊再生的纳米工程化神经母细胞瘤细胞的构建方法，通过药物负载技术和细胞膜展示技术还原细胞原始结构。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
利用药物负载技术和细胞膜展示技术，将神经母细胞瘤细胞内容物负载到NU-801内，将神经母细胞瘤细胞膜装载到NU-801表面，制备得到纳米工程化神经母细胞瘤细胞。
本发明提供的一种纳米工程化神经母细胞瘤细胞的构建方法，其特征在于：利用超声破碎法和差速离心法分离神经母细胞瘤细胞膜和细胞内容物，构建锆基金属有机框架NU-801，将NU-801浸泡在细胞内容物溶液中，离心纯化，用水洗涤，再利用多巴胺聚合过程将细胞膜及聚多巴胺覆盖在含细胞内容物的NU-801表面，离心纯化，得到纳米工程化神经母细胞瘤细胞。
作为优选方案，在NIR条件下，所述纳米工程化神经母细胞瘤细胞逐渐降解，释放细胞内容物。
进一步地，所述复合纳米材料的平均粒径为800nm～1000nm。
更进一步地，具体步骤如下：
1、分离神经母细胞细胞膜和细胞内容物：
将神经母细胞瘤细胞悬液收集到50ml离心管中，在冰上超声破碎细胞，超声器设置为：振幅35％，总时间20分钟，间隔时间5秒开3秒关，4℃4000rpm离心5分钟，取上清，4℃20000g离心30分钟，沉淀收集为细胞内容物，上清10℃25000rpm离心2小时，收集上清加入细胞内容物中，沉淀为细胞膜。
2、构建锆基金属有机框架NU-801：
将1,4-二溴苯(9.44g，40mmol)，丙烯酸乙酯(9mL，84.6mmol)，K2CO3(10.35g，75mmol)，Pd(OAc)2(0.561g，2.5mmol)和DMF(100mL)在250mL圆底烧瓶中混合。将混合物在130℃搅拌24小时。然后，将其用乙酸乙酯和水萃取几次。合并有机相并用无水MgSO4干燥，同时在减压下蒸馏有机溶剂。之后，将混合物进行柱色谱法(石油/乙酸乙酯4：1v/v)，获得白色粉末二乙基3,3'-(1,4-亚苯基)(2E，2'E)-二丙烯酸酯。产率：6g(64％)。将白色粉末(4g，14.6mmol)悬浮在THF(20mL)，H2O(50mL)和10m NaOH水溶液(100mL)的混合物中。将混合物搅拌并加热至回流12小时，然后在减压下除去THF。最后，通过使用稀HCl将溶液的pH值调节至3。过滤收集固体，用水洗涤，干燥，得到白色粉末H2PDA；
将有机接头H2PDA(45mg，0.21mmol)和ZrOCl2·8H2O(60mg，0.186mmol)的混合物溶解在作为主要溶剂的DMF(5mL)中，并加入甲酸(0.22mL)作为调节剂超声15分钟，盖上有螺口盖的小瓶(15mL)。将混合物70℃加热120小时。将产物用DMF和丙酮洗涤3次，并且在离心分离(10,000rpm，15min)之后通过倾析溶剂来收集产物。
3、细胞膜包裹金属有机框架(Intra@NU-801@pD-Mem)的制备：
将10mL含有制备的神经母细胞瘤细胞膜及10mg多巴胺盐酸盐的10mM Tris-HCL缓冲溶液(pH 8.5)与Intra@NU-801混合，在室温下剧烈搅拌1h，然后10000×g离心20分钟纯化，并用去离子水洗涤3次，以除去多余的细胞膜。
上述神经母细胞瘤细胞为鼠胚神经母细胞细胞系Neuro-2a，购于武汉大学保藏中心，CCTCC编号GDC0162。
本发明的优点及有益效果如下：
1、利用神经母细胞瘤细胞系作为基础材料，传代速度快，培养要求较低，且生物相容性高；
2、药物负载技术和细胞膜展示技术，所使用的设备简单、操作方便；
3、相比于神经母细胞瘤细胞本身，本材料可序列性使用神经母细胞瘤细胞膜和细胞内容物，先后利用相应功能，更有利于再生，且避免了体内成瘤。
附图说明
图1为实施例1中制备的Intra@NU-801@Mem扫描电镜图。
图2为实施例1中制备的Intra@NU-801@Mem透射电镜图。
图3为实施例1及对比例中制备的NU-801、Intra@NU-801、Intra@NU-801@pD-Mem的X射线衍射光谱图，图中从下到上依次为NU-801、Intra@NU-801、Intra@Au-NU-801@pD-Mem。
图4为实施例1及对比例中制备的NU-801、Intra@NU-801、Intra@Au-NU-801@pD-Mem的傅里叶变换红外光谱图，图中从下到上依次为NU-801、Intra@NU-801、Intra@Au-NU-801@pD-Mem。
图5为实施例1制备的NU-801、Intra@NU-801、Intra@Au-NU-801@pD-Mem的粒径分析图，图中从左到右依次NU-801、Intra@NU-801、Intra@Au-NU-801@pD-Mem。
图6为实施例1制备的NU-801、Intra@NU-801、Intra@Au-NU-801@pD-Mem的电位分析图，图中从左到右依次NU-801、Intra@NU-801、Intra@Au-NU-801@pD-Mem。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步地详细阐述。
实施例1
1、分离神经母细胞细胞膜和细胞内容物：
将神经母细胞瘤细胞悬液收集到50ml离心管中，在冰上超声破碎细胞，超声器设置为：振幅35％，总时间20分钟，间隔时间5秒开3秒关，4℃4000rpm离心5分钟，取上清，4℃20000g离心30分钟，沉淀收集为细胞内容物，上清10℃25000rpm离心2小时，收集上清加入细胞内容物中，沉淀为细胞膜。
2、构建锆基金属有机框架NU-801：
将1,4-二溴苯(9.44g，40mmol)，丙烯酸乙酯(9mL，84.6mmol)，K2CO3(10.35g，75mmol)，Pd(OAc)2(0.561g，2.5mmol)和DMF(100mL)在250mL圆底烧瓶中混合。将混合物在130℃搅拌24小时。然后，将其用乙酸乙酯和水萃取几次。合并有机相并用无水MgSO4干燥，同时在减压下蒸馏有机溶剂。之后，将混合物进行柱色谱法(石油/乙酸乙酯4：1v/v)，获得白色粉末二乙基3,3'-(1,4-亚苯基)(2E，2'E)-二丙烯酸酯。产率：6g(64％)。将白色粉末(4g，14.6mmol)悬浮在THF(20mL)，H2O(50mL)和10m NaOH水溶液(100mL)的混合物中。将混合物搅拌并加热至回流12小时，然后在减压下除去THF。最后，通过使用稀HCl将溶液的pH值调节至3。过滤收集固体，用水洗涤，干燥，得到白色粉末H2PDA；
将有机接头H2PDA(45mg，0.21mmol)和ZrOCl2·8H2O(60mg，0.186mmol)的混合物溶解在作为主要溶剂的DMF(5mL)中，并加入甲酸(0.22mL)作为调节剂超声15分钟，盖上有螺口盖的小瓶(15mL)。将混合物70℃加热120小时。将产物用DMF和丙酮洗涤3次，并且在离心分离(10,000rpm，15min)之后通过倾析溶剂来收集产物。
3、细胞膜包裹金属有机框架(Intra@NU-801@pD-Mem)的制备：
将10mL含有500μg制备的神经母细胞瘤细胞膜及10mg多巴胺盐酸盐的10mM Tris-HCL缓冲溶液(pH 8.5)与Intra@NU-801混合，在室温下剧烈搅拌1h，然后10000×g离心20分钟纯化，并用去离子水洗涤3次，以除去多余的细胞膜。
实施例2
1、分离神经母细胞细胞膜和细胞内容物：
将神经母细胞瘤细胞悬液收集到50ml离心管中，在冰上超声破碎细胞，超声器设置为：振幅35％，总时间20分钟，间隔时间5秒开3秒关，4℃4000rpm离心5分钟，取上清，4℃20000g离心30分钟，沉淀收集为细胞内容物，上清10℃25000rpm离心2小时，收集上清加入细胞内容物中，沉淀为细胞膜。
2、构建锆基金属有机框架NU-801：
将1,4-二溴苯(9.44g，40mmol)，丙烯酸乙酯(9mL，84.6mmol)，K2CO3(10.35g，75mmol)，Pd(OAc)2(0.561g，2.5mmol)和DMF(100mL)在250mL圆底烧瓶中混合。将混合物在130℃搅拌24小时。然后，将其用乙酸乙酯和水萃取几次。合并有机相并用无水MgSO4干燥，同时在减压下蒸馏有机溶剂。之后，将混合物进行柱色谱法(石油/乙酸乙酯4：1v/v)，获得白色粉末二乙基3,3'-(1,4-亚苯基)(2E，2'E)-二丙烯酸酯。产率：6g(64％)。将白色粉末(4g，14.6mmol)悬浮在THF(20mL)，H2O(50mL)和10m NaOH水溶液(100mL)的混合物中。将混合物搅拌并加热至回流12小时，然后在减压下除去THF。最后，通过使用稀HCl将溶液的pH值调节至3。过滤收集固体，用水洗涤，干燥，得到白色粉末H2PDA；
将有机接头H2PDA(45mg，0.21mmol)和ZrOCl2·8H2O(60mg，0.186mmol)的混合物溶解在作为主要溶剂的DMF(5mL)中，并加入甲酸(0.22mL)作为调节剂超声15分钟，盖上有螺口盖的小瓶(15mL)。将混合物70℃加热120小时。将产物用DMF和丙酮洗涤3次，并且在离心分离(10,000rpm，15min)之后通过倾析溶剂来收集产物。
3、细胞膜包裹金属有机框架(Intra@NU-801@pD-Mem)的制备：
将10mL含有1000μg制备的神经母细胞瘤细胞膜及10mg多巴胺盐酸盐的10mMTris-HCL缓冲溶液(pH 8.5)与Intra@NU-801混合，在室温下剧烈搅拌1h，然后10000×g离心20分钟纯化，并用去离子水洗涤3次，以除去多余的细胞膜。
实施例3
1、分离神经母细胞细胞膜和细胞内容物：
将神经母细胞瘤细胞悬液收集到50ml离心管中，在冰上超声破碎细胞，超声器设置为：振幅35％，总时间20分钟，间隔时间5秒开3秒关，4℃4000rpm离心5分钟，取上清，4℃20000g离心30分钟，沉淀收集为细胞内容物，上清10℃25000rpm离心2小时，收集上清加入细胞内容物中，沉淀为细胞膜。
2、构建锆基金属有机框架NU-801：
将1,4-二溴苯(9.44g，40mmol)，丙烯酸乙酯(9mL，84.6mmol)，K2CO3(10.35g，75mmol)，Pd(OAc)2(0.561g，2.5mmol)和DMF(100mL)在250mL圆底烧瓶中混合。将混合物在130℃搅拌24小时。然后，将其用乙酸乙酯和水萃取几次。合并有机相并用无水MgSO4干燥，同时在减压下蒸馏有机溶剂。之后，将混合物进行柱色谱法(石油/乙酸乙酯4：1v/v)，获得白色粉末二乙基3,3'-(1,4-亚苯基)(2E，2'E)-二丙烯酸酯。产率：6g(64％)。将白色粉末(4g，14.6mmol)悬浮在THF(20mL)，H2O(50mL)和10m NaOH水溶液(100mL)的混合物中。将混合物搅拌并加热至回流12小时，然后在减压下除去THF。最后，通过使用稀HCl将溶液的pH值调节至3。过滤收集固体，用水洗涤，干燥，得到白色粉末H2PDA；
将有机接头H2PDA(45mg，0.21mmol)和ZrOCl2·8H2O(60mg，0.186mmol)的混合物溶解在作为主要溶剂的DMF(5mL)中，并加入甲酸(0.22mL)作为调节剂超声15分钟，盖上有螺口盖的小瓶(15mL)。将混合物70℃加热120小时。将产物用DMF和丙酮洗涤3次，并且在离心分离(10,000rpm，15min)之后通过倾析溶剂来收集产物。
3、细胞膜包裹金属有机框架(Intra@NU-801@pD-Mem)的制备：
将10mL含有2000μg制备的神经母细胞瘤细胞膜及10mg多巴胺盐酸盐的10mMTris-HCL缓冲溶液(pH 8.5)与Intra@NU-801混合，在室温下剧烈搅拌1h，然后10000×g离心20分钟纯化，并用去离子水洗涤3次，以除去多余的细胞膜。
Claims (6)
1.一种纳米工程化神经母细胞瘤细胞的构建方法，其特征在于：利用超声破碎法和差速离心法分离神经母细胞瘤细胞膜和细胞内容物，构建锆基金属有机框架NU-801，将NU-801浸泡在细胞内容物溶液中，离心纯化，用水洗涤，再利用多巴胺聚合过程将细胞膜及聚多巴胺覆盖在含细胞内容物的NU-801表面，离心纯化，得到纳米工程化神经母细胞瘤细胞。
2.根据权利要求1所述纳米工程化神经母细胞瘤细胞的构建方法，其特征在于：在NIR条件下，所述纳米工程化神经母细胞瘤细胞逐渐降解，释放细胞内容物。
3.根据权利要求1或2所述纳米工程化神经母细胞瘤细胞的构建方法，其特征在于：该方法具体步骤如下：
S1：分离神经母细胞细胞膜和细胞内容物：
将神经母细胞瘤细胞悬液收集到50ml离心管中，在冰上超声破碎细胞，超声器设置为：振幅35％，总时间20分钟，间隔时间5秒开3秒关；采用差速离心法，在4℃4000rpm离心5分钟，取上清，4℃20000g离心30分钟，沉淀收集为细胞内容物，上清10℃25000rpm离心2小时，收集上清加入细胞内容物中，沉淀为细胞膜；
S2：构建锆基金属有机框架NU-801：
将1,4-二溴苯，丙烯酸乙酯，K2CO，Pd(OAc)2和DMF在250mL圆底烧瓶中混合；将混合物在130℃搅拌24小时；然后，将其用乙酸乙酯和水萃取几次；合并有机相并用无水MgSO4干燥，同时在减压下蒸馏有机溶剂；之后，将混合物进行柱色谱法，石油/乙酸乙酯4:1v/v，获得白色粉末二乙基3,3'-(1,4-亚苯基)(2E，2'E)-二丙烯酸酯；将白色粉末悬浮在THF、H2O和10mNaOH水溶液的混合物中；将混合物搅拌并加热至回流12小时，然后在减压下除去THF；最后，通过使用稀HCl将溶液的pH值调节至3；过滤收集固体，用水洗涤，干燥，得到白色粉末H2PDA；
将有机接头H2PDA和ZrOCl2·8H2O的混合物溶解在作为主要溶剂的DMF中，并加入甲酸作为调节剂超声15分钟，盖上有螺口盖的小瓶；将混合物70℃加热120小时；将产物用DMF和丙酮洗涤3次，并且在离心分离之后通过倾析溶剂来收集产物；
S3：NU-801包裹细胞内容物Intra@NU-801的制备：
将NU-801浸入15ml含细胞内容物的水溶液中12小时；通过离心从溶液中分离出Intra@NU-801，随后用水洗涤，然后保存在水中；
S4：细胞膜包裹金属有机框架Intra@NU-801@pD-Mem的制备：
将10mL含有制备的神经母细胞瘤细胞膜及10mg多巴胺盐酸盐的10mM Tris-HCL缓冲溶液(pH 8.5)与Intra@NU-801混合，在室温下剧烈搅拌1h，然后10000×g离心20分钟纯化，并用去离子水洗涤3次，以除去多余的细胞膜；Intra@NU-801@pD-Mem表面显示鼠胚神经母细胞瘤的膜蛋白。
4.根据权利要求1或2所述纳米工程化神经母细胞瘤细胞的构建方法，其特征在于：所述复合纳米材料的平均粒径为800nm～1000nm。
5.根据权利要求3所述纳米工程化神经母细胞瘤细胞的构建方法，其特征在于：所述复合纳米材料的平均粒径为800nm～1000nm。
6.根据权利要求1或2或5所述纳米工程化神经母细胞瘤细胞的构建方法，其特征在于：所述神经母细胞瘤细胞为鼠胚神经母细胞细胞系Neuro-2a，购于武汉大学保藏中心，CCTCC编号GDC0162。
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2020
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Also Published As
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|---|---|
| CN112336747B (zh) | 2022-07-05 |
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