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CN112316139A - 一种吲哚菁绿纳米药物及其制备方法 - Google Patents

一种吲哚菁绿纳米药物及其制备方法 Download PDF

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CN112316139A CN202011217918.3A CN202011217918A CN112316139A CN 112316139 A CN112316139 A CN 112316139A CN 202011217918 A CN202011217918 A CN 202011217918A CN 112316139 A CN112316139 A CN 112316139A
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Abstract

本发明提供一种吲哚菁绿纳米药物及其制备方法，属于生物医药领域。该吲哚菁绿纳米药物包括吲哚菁绿和改性树状大分子载体，吲哚菁绿包覆于改性树状大分子载体的内部空腔，改性树状大分子载体具有通式(I)结构。该纳米药物不仅具有优异的抗蛋白质吸附和高生物相容性的优点，还具有很好的光热抑瘤和近红外成像的效果。

Description

一种吲哚菁绿纳米药物及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种吲哚菁绿纳米药物及其制备方法。
背景技术
近年来，癌症已成为严重影响人类健康并威胁人类生命的主要疾病之一。大多数药物输送系统，例如脂质体、树状大分子和聚合胶束，被广泛用于癌症的治疗。由于聚酰胺-胺树状大分子独特的树枝状结构，精确的官能团数目，因此具有非常好的应用前景。作为稳定的单分子结构，树状大分子在生理环境中可以避免结构塌陷。此外，通过修饰靶向配体，树状大分子还可以实现药物的靶向递送。独特的树枝状结构和丰富的外围官能团，使得它能够将小的抗癌分子包裹在内腔或修饰于表面。然而，聚酰胺-胺树状大分子表面丰富的氨基与蛋白质和细胞膜相互作用，导致其表现出明显的细胞毒性。为了克服聚酰胺-胺树状大分子的缺点，通常在其表面修饰聚乙二醇(PEG)来降低其毒性并提高树状大分子的生物相容性。然而，研究表明PEG修饰的药物载体容易发生氧化损伤，并且长期使用机体容易产生PEG抗体。
吲哚菁绿(ICG)是经美国食品药品管理局和欧洲药品管理局批准的近红外造影剂，通常用于体内心血管和眼部成像。它的红外发射波长为820nm，并且对血液和组织的荧光(500-600nm)干扰较弱。此外，ICG在体外具有良好的光热作用和光动力作用。ICG具有出色的近红外光热效应和造影剂定位效应，近年来已被广泛用作光热材料。但是，研究发现ICG经静脉注射后会迅速与血浆白蛋白和球蛋白结合，并迅速从血液中清除。因此，为了降低ICG与蛋白质的相互作用，增加ICG在肿瘤部位的积累并减少副作用，ICG经常被负载到纳米药物载体中。
鉴于此，故提出本申请。
发明内容
本发明的目的在于提供一种吲哚菁绿纳米药物及其制备方法，该药物具有较好的生物相容性以及光热效果，并且有效降低了吲哚菁绿与蛋白质的相互作用，延长其血液循环时间，进而表现出良好的肿瘤抑制效果。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种吲哚菁绿纳米药物，所述药物包括吲哚菁绿和改性树状大分子载体，所述吲哚菁绿包覆于所述改性树状大分子载体的内部空腔，所述改性树状大分子载体具有通式(I)结构：
Figure BDA0002761055120000021
通式(I)中，
G5 PAMAM代表第五代聚酰胺-胺树状大分子；
R1和R2选自由侧链含有羧基的氨基酸残基和侧链含有氨基的氨基酸残基组成的群组，且R1和R2中含有的氨基与羧基比例为1:1；
X代表10-128；
Y代表3-10。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，通式(I)中，所述侧链含有羧基的氨基酸残基包括谷氨酸残基、天冬氨酸残基；所述侧链含有氨基的氨基酸残基包括赖氨酸残基、组氨酸残基、精氨酸残基、谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述改性树状大分子载体与所述吲哚菁绿的质量比为1：0.001-1。
另一方面，本发明还提供上述吲哚菁绿纳米药物的制备方法，其包括：
将所述G5 PAMAM与马来酸酐在二甲基亚砜中混合反应，在水中透析，得到表面含有双键的树状大分子G5M；
将所述树状大分子G5M与含巯基的两性离子多肽的溶液混合，排除溶解氧后于20-60℃水浴下密闭反应8-36h，在水中透析后，得到表面修饰两性离子多肽的树状大分子G5MR1R2(n)，其中n代表投料时所述树状大分子G5M与所述两性离子多肽的摩尔比；
将所述树状大分子G5MR1R2(n)与巯基乙胺混合，排除溶解氧后置于室温水浴下密闭反应8-48h，在水中透析后，得到表面修饰有双层两性离子材料的树状大分子G5MR1R2C(n)；
将所述G5MR1R2C(n)与吲哚菁绿按照质量比1:0.001-1混合，置于金属浴20-60℃、300-600转/分钟孵育10-24小时后，使用针孔过滤器过滤后，依次在甲醇-水溶液和纯水溶液中透析，得到所述吲哚菁绿纳米药物。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述树状大分子G5M与所述两性离子多肽的摩尔比为1:10-128。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述两性离子多肽具有通式(II)结构：
Figure BDA0002761055120000041
通式(II)中，
R1和R2选自由侧链含有羧基的氨基酸残基和侧链含有氨基的氨基酸残基组成的群组，且R1和R2中含有的氨基与羧基比例为1:1；
Y代表3～10。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，在制备表面含有双键的所述树状大分子G5M的步骤中，所述G5 PAMAM与所述马来酸酐的摩尔比为1:256～640。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述透析用的透析袋的截留分子量为8000-14000Da。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，在制备所述吲哚菁绿纳米药物的步骤中，透析时所述甲醇-水溶液中所述甲醇与水的体积比为0.2～5：1。
本发明的效果如下：
1、本发明设计的纳米药物具有双层两性离子材料，外层为两性离子多肽层，内层为伯氨基/羧基单层，内层的伯氨基和羧基分别来自于巯基乙胺和马来酸酐。双层两性离子材料在水溶液中通过静电水合作用可以形成致密的水合层，从而使纳米药物对正常细胞间的亲和力非常低。同时，其外层的两性离子材料能明显增大纳米药物的粒径，提高吲哚菁绿在体内的血液循环时间。
2、本发明在将吲哚菁绿负载到聚酰胺-胺树状大分子纳米药物载体的过程中，在聚酰胺-胺树状大分子表面修饰了双层两性离子材料，与仅修饰来自巯基乙胺和马来酸酐的内层伯氨基/羧基单层相比，其具有更强的亲水性，纳米药物的粒径更大，粒径在20-100nm内。仅修饰来自巯基乙胺和马来酸酐的内层伯氨基/羧基单层的纳米药物在小鼠体内半小时内基本经肾排出体外，而双层两性离子材料的纳米药物能明显改善此问题，延长纳米药物在体内的血液循环时间，并能借助EPR效应实现肿瘤靶向。
3、本发明采用的两性离子多肽的侧链中含有氨基和羧基，且氨基和羧基的比例为1:1。这种由氨基与羧基比例为1:1组成的两性离子多肽具有优异的抗蛋白质非特异性吸附性能，将其修饰到聚酰胺-胺树状大分子后可以降低其在正常组织处的毒性，使其具有较好的体内生物相容性。
4、本发明设计的纳米药物具有良好的光热效果以及近红外成像效果。实施例中合成的G5MEKC(n)-ICG(n＝20，70和128)的ICG载药量分别为6.6％，6.2％和5.8％。纳米药物的粒径在20-30nm，能够利用EPR效应富集于肿瘤组织。纳米药物对小鼠肿瘤的光热抑制率可达到78.2％，表现出良好的肿瘤抑制效果。
5、本发明设计的纳米药物具有优异的抗蛋白质非特异性性能和优秀的生物相容性，明显降低了未改性的第五代聚酰胺-胺树状大分子(G5 PAMAM)的生物毒性。药物浓度400μg/ml时，未改性的G5 PAMAM的细胞相对活性仅为7.5％，然而同等浓度下经改性后的G5MEKC(n)和G5MEKC(70)-ICG(未光照)的细胞相对活性均高于85％。
6、纳米药物在pH值为7.4时的表面电位趋于0mV，由此说明纳米药物在正常组织生理环境(pH＝7.4)时表现出两性离子的特征，即纳米药物表面羧基与氨基所带电荷量之比接近1：1，因而导致其表面电荷显示电中性。该状态下的纳米药物表面更容易与水分子发生水合作用从而使得纳米药物具有更加优异的抗蛋白质吸附性和生物相容性。
附图说明
图1为本发明实施例1获得的G5MEKC(n)(n＝20，70和128)的结构模拟图；
图2为本发明实施例1获得的G5MEKC(n)(n＝20，70和128)的核磁共振谱图；
图3为本发明实施例1获得的G5MEKC(n)和G5MEKC(n)-ICG(n＝20，70和128)和游离ICG的实物图；
图4为本发明实施例1获得的G5MEKC(n)和G5MEKC(n)-ICG(n＝20，70和128)的水动力学粒径分布图；
图5为本发明实施例1获得的G5MEKC(n)和G5MEKC(n)-ICG(n＝20，70和128)的表面电位图；
图6为本发明实施例1获得的纤维蛋白原、G5MEKC(n)-ICG、纤维蛋白原与G5MEKC(n)-ICG稳定性实验中的粒径分布图；
图7为本发明实施例1获得的纤维蛋白原、ICG、纤维蛋白原与ICG稳定性实验中的粒径分布图；
图8为本发明实施例1获得的G5 PAMAM、G5MEKC(n)和G5MEKC(n)-ICG(n＝20，70和128)的细胞相对活性图；
图9为本发明实施例1获得的G5MEKC(70)-ICG在激光照射条件下的细胞相对活性图；
图10为本发明实施例1获得的G5MEKC(70)-ICG在光热抑瘤实验中的小鼠体重变化图；
图11为本发明实施例1获得的G5MEKC(70)-ICG在光热抑瘤实验中的小鼠肿瘤体积变化图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供三种吲哚菁绿纳米药物，分别为G5MEKC(n)-ICG(n＝20，70和128)，其中在第五代聚酰胺-胺树状大分子(G5 PAMAM)表面修饰的两性离子多肽为(EK)3-C多肽，其具体结构如下：
Figure BDA0002761055120000071
(Glu-Lys)3-Cys多肽
其制备方法包括如下步骤：
(1)按G5 PAMAM与马来酸酐的摩尔比为1：256；8.0mg G5 PAMAM溶于1.5mL二甲基亚砜溶液中，6.9mg马来酸酐溶于2mL二甲基亚砜溶液中，将二者充分混合，室温搅拌反应24小时。之后用截留分子量为8000-14000Da的透析袋在2L水中透析6-8小时，得到表面含双键的第五代聚酰胺-胺树状大分子G5M水溶液；
(2)按G5M与(EK)3-C两性离子多肽摩尔比为1:20的比例；将上述得到的G5M水溶液通氮气30分钟排除溶解氧，4.9mg(EK)3-C多肽溶于500μL的pH值为6.0的磷酸盐缓冲溶液，将两者溶液充分混合后再次通入氮气排除溶解氧，密封置于40℃水浴条件搅拌反应24小时。之后用截留分子量为8000-14000Da的透析袋在2L水中透析4次每次6小时，得到表面修饰两性离子多肽的聚酰胺-胺树状大分子G5MEK(20)水溶液；
(3)上述得到的G5MEK(20)水溶液通氮气30分钟排除溶解氧，13.7mg巯基乙胺溶于500μL去离子水中，将两者溶液充分混合后再次通入氮气排除溶解氧，密封置于室温水浴条件搅拌反应24小时。之后用截留分子量为8000-14000Da的透析袋在2L水中透析4次每次6小时，得到两性离子多肽改性的第五代聚酰胺-胺树状大分子G5MEKC(20)；
(4)将G5MEKC(20)配置成2mg/mL水溶液，ICG配置成1mg/mL的二甲基亚砜溶液；按改性树状大分子材料与ICG的质量比为1：0.1的比例，取1mL G5MEKC(20)水溶液与0.2mLICG的二甲基亚砜溶液混合，置于金属浴40℃、600转/分钟反应12小时。之后采用0.45μm的过滤器过滤，用截留分子量为8000-14000Da的透析袋在0.5L水甲醇等体积混合液中透析24小时，之后在2L纯水中透析12h，得到两性离子多肽改性的第五代聚酰胺-胺树状大分子负载吲哚菁绿G5MEKC(20)-ICG。
重复步骤(1)、(2)、(3)和(4)，改变步骤(2)中(EK)3-C多肽的加入量。按G5M与(EK)3-C多肽摩尔比为1:70的比例，(EK)3-C加入17.4mg；按G5M与(EK)3-C多肽摩尔比为1:128的比例，(EK)3-C加入31.9mg。其余步骤均未发生改变，分别制备出G5MEKC(70)、G5MEKC(70)-ICG、G5MEKC(128)和G5MEKC(128)-ICG，其结构模拟图如图1所示。
对所制备的纳米胶束进行表征，如图2-7所示：
图2为G5MEKC(20)、G5MEKC(70)和G5MEKC(128)的核磁共振谱图，由图可以看出所属(EK)3-C多肽的特征峰以及G5 PAMAM的特征峰均能在谱图中找出，此外所属马来酸酐高化学位移处的特征峰完全消失，这些特征峰是5.8ppm(d,1H,NHCOCH＝CH)和6.2ppm(d,1H,NHCOCH＝CH)，表明G5M表面双键位置被完全反应。G5MEK7C(20)、G5MEK7C(70)和G5MEK7C(128)表面(EK)3-C的修饰量分别为12.0、20.4和38.3；它们表面巯基乙胺的修饰量分别为116.0、107.6和89.7。
图3为G5MEKC(20)、G5MEKC(70)、G5MEKC(128)、游离ICG、G5MEKC(20)-ICG、G5MEKC(70)-ICG和G5MEKC(70)-ICG的实物图，由图可以看出ICG能成功负载于G5MEKC中。G5MEK7C-ICG(20)、G5MEK7C-ICG(70)和G5MEK7C-ICG(128)的载药量分别为6.6％、6.2％和5.8％；G5MEK7C-ICG(20)、G5MEK7C-ICG(70)和G5MEK7C-ICG(128)的对ICG的包封率分别为70.1％、74.1％和83.3％。
图4为G5MEKC(20)、G5MEKC(70)、G5MEKC(128)、G5MEKC(20)-ICG、G5MEKC(70)-ICG和G5MEKC(70)-ICG的水动力学粒径分布图，可以看出未负载药物时G5MEKC(20)、G5MEKC(70)和G5MEKC(128)的水动力学平均粒径约10-15nm，负载药物后的G5MEKC(20)-ICG、G5MEKC(70)-ICG和G5MEKC(128)-ICG的水动力学粒径约20-30nm。
图5为G5MEKC(20)、G5MEKC(70)、G5MEKC(128)、G5MEKC(20)-ICG、G5MEKC(70)-ICG和G5MEKC(70)-ICG的表面电位图，可以看出未负载药物以及负载药物ICG后其表面电位仍旧趋于0mV。
图6为0.5mg/mL纤维蛋白原、0.2mg/mL G5MEKC(n)-ICG、0.5mg/mL纤维蛋白原与0.2mg/mL G5MEKC(n)-ICG混合，放置24h后的水动力学粒径分布图，可以看出它们三者的平均粒径分别为29.8、34.9和30.2nm。G5MEKC(n)-ICG与纤维蛋白原混合后其粒径并未发生明显变化，说明G5MEKC(n)-ICG具有较好的蛋白质稳定性。
图7为0.5mg/mL纤维蛋白原、0.2mg/mL ICG、0.5mg/mL纤维蛋白原与0.2mg/mL ICG混合，放置24h后的水动力学粒径分布图，可以看出ICG在溶解于PBS中的粒径为955.4nm，ICG在与纤维蛋白原混合后其粒径增加至5560nm。ICG与纤维蛋白原混合后其粒径明显增加，说明ICG本身具有较差的蛋白质稳定性。
实施例2
本实施例提供一种吲哚菁绿纳米药物G5MDKC(10)-ICG，其中在第五代聚酰胺-胺树状大分子(G5 PAMAM)表面修饰的两性离子多肽为(DK)6-C多肽，其具体结构如下：
Figure BDA0002761055120000101
(Asp-Lys)6-Cys多肽
其制备方法包括如下步骤：
(1)按G5 PAMAM与马来酸酐的摩尔比为1：640；8.0mg G5 PAMAM溶于1.5mL二甲基亚砜溶液中，17.3mg马来酸酐溶于2mL二甲基亚砜溶液中，将二者充分混合，室温搅拌反应24小时。之后用截留分子量为8000-14000Da的透析袋在2L水中透析8小时，得到表面含双键的第五代聚酰胺-胺树状大分子G5M水溶液；
(2)按G5M与(DK)6-C两性离子多肽摩尔比为1:10的比例；将上述得到的G5M水溶液通氮气30分钟排除溶解氧，4.4mg(DK)6-C多肽溶于500μL的pH值为6.5的磷酸盐缓冲溶液，将两者溶液充分混合后再次通入氮气排除溶解氧，密封置于20℃水浴条件搅拌反应8小时。之后用截留分子量为8000-14000Da的透析袋在2L水中透析4次每次6小时，得到表面修饰两性离子多肽的聚酰胺-胺树状大分子G5MDK(10)水溶液；
(3)上述得到的G5MDK(10)水溶液通氮气10分钟排除溶解氧，13.7mg巯基乙胺溶于500μL去离子水中，将两者溶液充分混合后再次通入氮气排除溶解氧，密封置于室温水浴条件搅拌反应8小时。之后用截留分子量为8000-14000Da的透析袋在2L水中透析4次每次6小时，得到两性离子多肽改性的第五代聚酰胺-胺树状大分子G5MDKC(10)；
(4)将G5MDKC(10)配置成1mg/mL水溶液，ICG配置成1mg/mL的二甲基亚砜溶液；按改性树状大分子材料与ICG的质量比为1：1的比例，取1mL G5MDKC(10)水溶液与1mL ICG的二甲基亚砜溶液混合，置于金属浴20℃、300转/分钟反应10小时。之后采用0.45μm的过滤器过滤，用截留分子量为8000-14000Da的透析袋在0.5L体积比为0.2:1的甲醇与水混合液中透析24小时，之后在2L纯水中透析12h，得到两性离子多肽改性的第五代聚酰胺-胺树状大分子负载吲哚菁绿G5MDKC(10)-ICG。
实施例3
本实施例提供一种吲哚菁绿纳米药物G5MDQC(20)-ICG，其中在改性第五代聚酰胺-胺树状大分子(G5 PAMAM)表面修饰的两性离子多肽为(DQ)10-C多肽，其具体结构如下：
Figure BDA0002761055120000111
(Asp-Gln)10-Cys多肽
其制备方法包括如下步骤：
(1)按G5 PAMAM与马来酸酐的摩尔比为1：384；8.0mg G5 PAMAM溶于1.5mL二甲基亚砜溶液中，10.4mg马来酸酐溶于2mL二甲基亚砜溶液中，将二者充分混合，室温搅拌反应24小时。之后用截留分子量为8000-14000Da的透析袋在2L水中透析6-8小时，得到表面含双键的第五代聚酰胺-胺树状大分子G5M水溶液；
(2)按G5M与(DQ)10-C两性离子多肽摩尔比为1:20的比例；将上述得到的G5M水溶液通氮气30分钟排除溶解氧，14.2mg(DQ)10-C多肽溶于500μL的pH值为6.5的磷酸盐缓冲溶液，将两者溶液充分混合后再次通入氮气排除溶解氧，密封置于60℃水浴条件搅拌反应36小时。之后用截留分子量为8000-14000Da的透析袋在2L水中透析4次每次6小时，得到表面修饰两性离子多肽的聚酰胺-胺树状大分子G5MDQ(20)水溶液；
(3)上述得到的G5MDQ(20)水溶液通氮气60分钟排除溶解氧，13.7mg巯基乙胺溶于500μL去离子水中，将两者溶液充分混合后再次通入氮气排除溶解氧，密封置于室温水浴条件搅拌反应48小时。之后用截留分子量为8000-14000Da的透析袋在2L水中透析4次每次6小时，得到两性离子多肽改性的第五代聚酰胺-胺树状大分子G5MDQC(20)；
(4)将G5MDQC(20)配置成3mg/mL水溶液，ICG配置成0.1mg/mL的二甲基亚砜溶液；按改性树状大分子材料与ICG的质量比为1：0.001的比例，取1mL G5MDQC(20)水溶液与30μLICG的二甲基亚砜溶液混合，置于金属浴60℃、400转/分钟反应24小时。之后采用0.45μm的过滤器过滤，用截留分子量为8000-14000Da的透析袋在0.5L体积比为5：1的甲醇与水混合液中透析24小时，之后在2L纯水中透析12h，得到两性离子多肽改性的第五代聚酰胺-胺树状大分子负载吲哚菁绿G5MDQC(20)-ICG。
下面以实施例1制备的G5MEKC(70)-ICG纳米药物为例，进行各项实验，以进一步说明该纳米胶束的性能。
实验例1MTT细胞相对活性试验
一、实验方法
通过MTT法评估游离G5 PAMAM、G5MEKC(n)和G5MEKC(n)-ICG对A549细胞的细胞毒性。将A549细胞接种在96孔板中，孵育24h后，除去培养基并向96孔板中分别加入浓度梯度为400、200、100、50、10和5μg/mL的含样品的培养基。孵育24小时后，加入100μL MTT溶液(0.5mg/mL)，并进一步孵育4小时。随后，弃去培养基，移除含样品的培养基，加入150μL二甲基亚砜，测量570nm处的吸光度以检测细胞相对活性。
此外，还通过MTT法评估游离ICG和G5MEKC(70)-ICG加光照对A549细胞的细胞毒性。将A549细胞接种在96孔板中，并孵育24小时。然后，除去培养基，并向96孔板中分别加入含有游离ICG或G5MEKC(70)-ICG的培养基。使用808nm激光以2W/cm2的功率照射实验组4分钟。孵育24小时后，加入100μL MTT溶液(0.5mg/mL)，并进一步温育4小时。随后，弃去培养基，加入150μL二甲基亚砜，测量570nm处的吸光度以检测细胞相对活性。
二、实验结果
MTT细胞相对活性试验如附图所示：
图8是MTT实验结果，图中可以看出G5 PAMAM在400μg/mL时细胞相对活性为7.2％，然而G5MEKC(n)和G5MEKC(n)-ICG的相对细胞活性均高于85％。第五代聚酰胺-胺树状大分子表面修饰两性离子材料后，其毒性显著降低。
图9是MTT实验结果，在功率为808nm 2W/cm2的条件下，激光照射时的细胞相对活性为100.4％，表明激光不会明显损伤细胞。当ICG浓度为25μg/mL时，G5MEKC(70)-ICG加激光组的细胞相对活性为11.2％，G5MEKC(70)-ICG在激光照射下具有很好的灭杀肿瘤细胞的作用；而没有激光的G5MEKC(70)-ICG的细胞相对活性为97.1％，而未经激光照射的G5MEKC(70)-ICG组对肿瘤细胞几乎没有毒性。
实验例2小鼠体内抑瘤实验
一、实验方法
实验采用昆明雌鼠(体重20-25g)接种宫颈癌细胞(U14)。皮下注射U14细胞对昆明雌鼠的右后肢进行荷瘤。荷瘤3天后，将种瘤的鼠随机分为5组，每组6只，即(a)生理盐水组；(b)生理盐水加激光组；(c)游离ICG加激光组；(d)G5MEKC-ICG(70)组；(e)G5MEKC-ICG(70)加激光组。以尾静脉注射的方式每隔2天对小鼠进行给药，给药量为2mg/kg(ICG质量/小鼠体重)，808nm激光照射功率为2W/cm2照射4min。实验过程中每2天记录小鼠的体重和肿瘤尺寸的变化。
二、实验结果
图10是制备的纳米药物注射小鼠体内14天体重的变化，图中可以看出实验组与空白组小鼠的体重增长趋势基本一致，所以该制备的纳米药物对小鼠体重基本上没有影响。
图11是制备的G5MEKC(70)-ICG纳米药物注射小鼠体内14天肿瘤体积的变化。生理盐水组小鼠肿瘤由45mm3长至691mm3，生理盐水加激光组小鼠肿瘤由54mm3长至581mm3，游离ICG加激光组小鼠肿瘤由36mm3长至296mm3，G5MEKC-ICG(70)不加激光组小鼠肿瘤由58mm3长至510mm3，G5MEKC-ICG(70)加激光组小鼠肿瘤由56mm3长至150mm3。游离ICG加激光组、G5MEKC-ICG(70)组和G5MEKC-ICG(70)加激光组的肿瘤抑制率分别为57.1％、26.3％和78.2％，G5MEKC-ICG(70)加激光组的肿瘤抑制率最高。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种吲哚菁绿纳米药物，其特征在于，所述药物包括吲哚菁绿和改性树状大分子载体，所述吲哚菁绿包覆于所述改性树状大分子载体的内部空腔，所述改性树状大分子载体具有通式(I)结构：
Figure FDA0002761055110000011
通式(I)中，
G5 PAMAM代表第五代聚酰胺-胺树状大分子；
R1和R2选自由侧链含有羧基的氨基酸残基和侧链含有氨基的氨基酸残基组成的群组，且R1和R2中含有的氨基与羧基比例为1:1；
X代表10-128；
Y代表3-10。
2.根据权利要求1所述的吲哚菁绿纳米药物，其特征在于，通式(I)中，所述侧链含有羧基的氨基酸残基包括谷氨酸残基、天冬氨酸残基；所述侧链含有氨基的氨基酸残基包括赖氨酸残基、组氨酸残基、精氨酸残基、谷氨酰胺残基和天冬酰胺残基。
3.根据权利要求1所述的吲哚菁绿纳米药物，其特征在于，所述改性树状大分子载体与所述吲哚菁绿的质量比为1：0.001-1。
4.一种根据权利要求1～3任一项所述的吲哚菁绿纳米药物的制备方法，其特征在于，其包括：
将所述G5 PAMAM与马来酸酐在二甲基亚砜中混合反应，在水中透析，得到表面含有双键的树状大分子G5M；
将所述树状大分子G5M与含巯基的两性离子多肽的溶液混合，排除溶解氧后于20-60℃水浴下密闭反应8-36h，在水中透析后，得到表面修饰两性离子多肽的树状大分子G5MR1R2(n)，其中n代表投料时所述树状大分子G5M与所述两性离子多肽的摩尔比；
将所述树状大分子G5MR1R2(n)与巯基乙胺混合，排除溶解氧后置于室温水浴下密闭反应8-48h，在水中透析后，得到表面修饰有双层两性离子材料的树状大分子G5MR1R2C(n)；
将所述G5MR1R2C(n)与吲哚菁绿按照质量比1:0.001-1混合，置于金属浴20-60℃、300-600转/分钟孵育10-24小时后，用针孔过滤器过滤后，依次在甲醇-水溶液和纯水溶液中透析，得到所述吲哚菁绿纳米药物。
5.根据权利要求4所述的吲哚菁绿纳米药物的制备方法，其特征在于，所述树状大分子G5M与所述两性离子多肽的摩尔比为1:10-128。
6.根据权利要求4所述的吲哚菁绿纳米药物的制备方法，其特征在于，所述两性离子多肽具有通式(II)结构：
Figure FDA0002761055110000021
通式(II)中，
R1和R2选自由侧链含有羧基的氨基酸残基和侧链含有氨基的氨基酸残基组成的群组，且R1和R2中含有的氨基与羧基比例为1:1；
Y代表3～10。
7.根据权利要求4所述的吲哚菁绿纳米药物的制备方法，其特征在于，在制备表面含有双键的所述树状大分子G5M的步骤中，所述G5 PAMAM与所述马来酸酐的摩尔比为1：256～640。
8.根据权利要求4所述的吲哚菁绿纳米药物的制备方法，其特征在于，所述透析用的透析袋的截留分子量为8000-14000Da。
9.根据权利要求4所述的吲哚菁绿纳米药物的制备方法，其特征在于，在制备所述吲哚菁绿纳米药物的步骤中，透析时所述甲醇-水溶液中所述甲醇与水的体积比为0.2～5：1。
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