CN112266399B - 一种淫羊藿提取物的高纯度分离提取方法 - Google Patents
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Abstract
一种淫羊藿提取物的高纯度分离提取方法：对淫羊藿粗粉采用80%乙醇浸提，过滤，得到粗品；将粗品用水溶解，过滤，过DM301大孔树脂吸附柱吸附；水洗脱吸附柱至无色，依次以20%、45%、60%乙醇洗脱吸附柱，分别收集对应浓度的乙醇洗脱液；对45%乙醇洗脱液、60%乙醇洗脱液分别进行浓缩；浓缩液调节pH=5，以乙酸乙酯进行萃取，弃除水相后浓缩；用热乙醇对萃取物进行重结晶，干燥分别得到淫羊藿苷及淫羊藿次苷II；对20%乙醇洗脱液进行浓缩，干燥后得到淫羊藿黄酮。本发明采用同一工艺同时分离淫羊藿苷和淫羊藿次苷II，其中淫羊藿苷纯度高于98%。
Description
技术领域
本发明涉及中医药提取技术领域，具体涉及一种淫羊藿的提取方法。
背景技术
淫羊藿药材为小檗科植物淫羊藿的干燥叶，现行药典收录的共有淫羊藿Epinedinbreviconru Maxim、箭叶淫羊藿Epimedium saittatum (Sieb.et Zucc. )Maxin、柔毛淫羊藿Epimediumpubescens Maxim和朝鲜淫羊藿Epimedium koreanum Makai四种。淫羊藿具有补肾阳、强筋骨、祛风湿之功效。
淫羊藿苷为其单体成分之一, 具有改善心血管系统、调节内分泌、增强免疫力、性激素样等作用，同时在抗肿瘤、抗肝毒等方面也有着积极的治疗作用。其分子式为C33H40O15，分子量676.65，淡黄色针晶（含水吡啶），熔点231℃~232℃，溶于水、乙醇、甲醇、乙酸乙酯，不溶于醚、苯、氯仿。
淫羊藿次苷II，是近年从淫羊藿中新开发的单体物质，其除同样具有和淫羊藿苷部分相同的药理作用(健骨、性激素样等)外，在改善血管内皮细胞功能方面尤优于淫羊藿苷，此外其还具有抑制脂质过氧化等抗氧化作用。目前制备高纯度淫羊藿单体的方法较少、工艺复杂且成本较高,多限于实验室小规模制备。优化淫羊藿单体的分离纯化工艺,实现其简便、高效的大规模生产,是深入研究淫羊藿的药理功能,提高淫羊藿药材有效利用度的基础。
现有的技术方案中，对于淫羊藿中有效成分的提取，通常采用大孔吸附树脂法或者重结晶法。
图1是大孔吸附树脂法的技术路线，大孔吸附树脂法具有吸附快、吸附容量大、吸附选择性好、解吸条件温和、洗脱率高、物化稳定性高、不受无机物存在的影响、再生简单、使用周期长、易于构成闭路循环、节省费用等优点，适宜工业化生产。大孔吸附树脂为吸附和筛选相结合的分离材料，在确定分离条件时，首先根据被分离化合物分子体积的大小选用适当的树脂孔径，其次要根据分子中是否含有酚羟基、羧基或碱性氮原子来确定树脂的型号和分离条件。常用的洗脱剂有水、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醇等。对非极性大孔树脂，洗脱剂极性越小，洗脱能力越强；对极性大孔树脂和极性较大的化合物，则用极性强的溶剂能更好地分离。
该方法存在如下不足：①只通过树脂柱的分离纯化，产品纯度较低；②提取物中含有其他有效成分，无法有效利用，原料利用率低。
图2是重结晶法所通用的技术路线：首先选用合适的溶剂，将混合物加热溶解，形成有效成分的饱和溶液，趁热过滤除去不溶的杂质，滤液低温放置或蒸去部分溶剂后再低温放置，使有效成分大部分析出结晶，由于初析出的结晶总会带一些杂质，因此需要通过反复结晶即所谓重结晶的方法，才能得到高纯度的晶体。结晶用溶剂的选择是最重要因素之一，一般要其对被结晶成分热时溶解度大、冷时溶解度小，对杂质或冷热时都溶解，或冷热时都不溶解，与被结晶成分不发生化学反应，沸点不宜太高。由于黄酮类化合物在冷或热甲醇、乙醇、丙酮以及水中溶解度的差异。因此，可以采用重结晶法进行分离。
重结晶法提取淫羊藿的缺点如下：①和大孔树脂法相似，只经过结晶法纯化，纯度较低，比大孔树脂法纯化度还要低；②成品中成分较多，淫羊藿苷的产率不高。
发明内容
针对淫羊藿中黄酮单体成分的提取，同时使用种大孔树脂分离淫羊藿苷和淫羊藿次苷II的工艺还未见报道。本申请结合相关文献，选用回流提取，大孔吸附树脂分离、纯化，有机溶剂的萃取和重结晶，实现了采用同种分离方法对淫羊藿苷和淫羊藿次苷II两种单体物质的分离，且两者纯度均在90%以上。该法极大的简化了实验流程，充分的利用了淫羊藿药材资源，大幅降低了成本，适合工业化生产。
本发明的目的在于：采用同一工艺同时分离淫羊藿苷和淫羊藿次苷II，其中淫羊藿苷纯度高于98%，同时对提取后的残渣充分利用，提高经济效应，拓展应用空间。本发明工艺原料利用率高，可大大节约生产成本。
本发明所采用的技术手段为：一种淫羊藿提取物的高纯度分离提取方法，包括如下步骤：
(1)对淫羊藿粗粉采用80%乙醇浸提，过滤，浓缩回收乙醇，得到淫羊藿提取物粗品；
(2)将淫羊藿提取物粗品用水溶解，过滤，上清液过DM301大孔树脂吸附柱吸附；
(3)水洗脱吸附柱至无色，依次以20%乙醇、45%乙醇、60%乙醇洗脱吸附柱，分别收集对应浓度的乙醇洗脱液；
(4)对45%乙醇洗脱液进行浓缩，回收乙醇；浓缩液调节pH=5，以乙酸乙酯进行萃取，弃除水相后浓缩回收乙酸乙酯，得到萃取物；用热乙醇对萃取物进行重结晶，干燥得到淫羊藿苷；
(5)对60%乙醇洗脱液进行浓缩，回收乙醇；浓缩液调节pH=5，以乙酸乙酯进行萃取，弃除水相后浓缩回收乙酸乙酯，得到萃取物；用热乙醇对萃取物进行重结晶，干燥得到淫羊藿次苷II；
(6)对20%乙醇洗脱液进行浓缩，回收乙醇，干燥后得到淫羊藿黄酮。
所述20%乙醇、45%乙醇、60%乙醇、80%乙醇为体积百分数是20%、45%、60%、80%的乙醇-水混合液。
进一步地，对淫羊藿粗粉采用80%乙醇浸提时，以料液比1:10在70℃浸提3次，每次浸提90min，过滤后合并滤液。
进一步地，淫羊藿提取物粗品按7.45g/L用水溶解，过滤除去不溶物，过DM301大孔树脂吸附柱，流速为3BV/h。
进一步地，对吸附柱洗脱时，先用水洗脱柱子至无色；再用20%的乙醇洗脱杂质；然后用45%的乙醇，以1.5BV/h的流速洗脱，洗脱剂用量4.5BV；最后用60%乙醇洗脱，1.5BV/h的流速洗脱剂用量4.5BV；分别收集20%乙醇洗脱液、45%乙醇洗脱液及60%乙醇洗脱液。
进一步地，对45%乙醇洗脱液处理时，首先减压浓缩洗脱液，用盐酸调节pH为5，用2倍体积的乙酸乙酯萃取2次，弃去水层，减压浓缩收集乙酸乙酯；用无水乙醇加热溶解萃取物，趁热过滤，放置结晶，待再无结晶体生成后抽滤；用无水乙醇对晶体再次重结晶后过滤，真空干燥可得淫羊藿苷纯品。
进一步地，对60%乙醇洗脱液处理时，首先减压浓缩洗脱液，用盐酸调节pH为5，用2倍体积的乙酸乙酯萃取2次，弃去水层，减压浓缩收集乙酸乙酯；用无水乙醇加热溶解萃取物，趁热过滤，放置结晶，待再无结晶体生成后抽滤；用无水乙醇对晶体再次重结晶后过滤，真空干燥可得淫羊藿次苷II纯品。
本发明的有益效果为：
①通过本工艺的提取纯化，可将淫羊藿苷的纯度提高到95%以上，接近98%。
②通过本工艺不仅的到了高纯度的淫羊藿苷，还分离出了和淫羊藿苷有相似功能效果的高纯度淫羊藿次苷II，其纯度也在98%以上，且纯度要比淫羊藿苷的高。
③整个工艺未用到有毒试剂，安全性高且绿色环保。
④本工艺还可顺带生产出淫羊藿的黄酮类物质，主要为朝藿定。
附图说明
图1为现有的大孔吸附树脂法工艺流程。
图2为现有的重结晶法工艺流程。
图3为本发明淫羊藿提取方法工艺流程。
图4为本发明过程中得到的残渣提取多糖的工艺流程。
图5为对比例中聚酰胺柱-萃取-重结晶法获取淫羊藿苷的工艺流程。
图6为对比例中水煎法提取淫羊藿总黄酮的工艺流程。
实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步阐述。
参见图3，图3为本发明高纯度化淫羊藿提取工艺的工艺流程图。
本发明所述方法首先取淫羊藿粗粉在80%乙醇中浸提3次，所得滤液浓缩得到浸膏，水洗后去除不溶物，取上清液继续处理，经DM301大孔树脂吸附柱后，水洗至无色，依次以20%乙醇、45%乙醇以及60%乙醇进行洗脱，其中20%乙醇洗脱液经处理得到淫羊藿黄酮，45%乙醇洗脱液经处理得到淫羊藿苷，60%乙醇洗脱液经处理得到淫羊藿次苷II。
实施例
（1）将干燥的淫羊藿全草粉碎成30目的粉粒备用；
（2）称取20g淫羊藿全草粉于回流装置中，按料液比1：10加入80%乙醇，在70℃条件下提取90min后过滤，提取3次，合并滤液。
（3）将滤液减压浓缩至无醇味得粗品，收集乙醇。
（4）将粗品用纯水溶解为浓度为7.45g/L的液体，过滤除去不溶物，过DM301大孔树脂吸附柱，流速为3BV/h。
（5）先用水洗脱柱子至无色，再用20%的乙醇洗脱杂质，然后用45%的乙醇，以1.5BV/h的流速洗脱，洗脱剂用量4.5BV，最后用60%乙醇洗脱，1.5BV/h的流速洗脱剂用量4.5BV，分别收集20%、45%及60%的乙醇洗脱液。
（6）将45%和60%的洗脱液分别减压浓缩至一定体积，用盐酸溶液调节pH为5左右，用2倍体积的乙酸乙酯萃取2次，弃去水层，减压浓缩收集乙酸乙酯。
（7）分别用无水乙醇加热溶解萃取物，趁热过滤，放置结晶，待再无结晶体生成后抽滤，再结晶一次后过滤得结晶体。
（8）将结晶体真空干燥可得相应的纯品。
（9）将20%乙醇洗脱液进行浓缩，干燥可得淫羊藿黄酮，主要成分有朝藿定。
实施例2-5
本例进一步讨论本发明分离提纯方法的优选工艺及理由，下列实施例参照实施例1实施，具体差别如表1所示：
表1 实施例1-5工艺及效果
结合图3工艺流程及实施例1-3的比较可知，对于DM301大孔树脂吸附柱洗脱工序，首先采用20%的乙醇进行洗脱，得到的淫羊藿总黄酮纯度、收率最高，是提取黄酮的最佳工艺。该乙醇浓度相对于其他浓度的乙醇可减少洗脱液用量、缩短工艺耗时；后续浓缩干燥回收乙醇时，所消耗的能耗也较低，乙醇损失相对较少。
18-22%的乙醇洗脱液洗脱过程中取少量洗脱液，以石油醚/乙酸乙酯为展开剂进行薄层（硅胶板）色谱分析，验证18-22%的乙醇洗脱液是否洗脱完全。洗脱完全后，继续采用42-48%的乙醇洗脱DM301大孔树脂吸附柱中的淫羊藿苷。结果显示45%的乙醇洗脱液是洗脱淫羊藿苷的最佳比例。当乙醇浓度较低时，洗脱液用量较大、洗脱时间较长，且产物中淫羊藿苷纯度、收率较低；当乙醇浓度较高时，淫羊藿苷纯度、收率略有降低，但容易在产品中引入淫羊藿次苷II。由于本发明工艺淫羊藿苷、淫羊藿次苷II采用相同工艺萃取重结晶，较高浓度乙醇洗脱淫羊藿苷时引入的淫羊藿次苷II将无法分离，导致纯度略有下降。
此后，仍以石油醚/乙酸乙酯为展开剂进行薄层（硅胶板）色谱分析，验证42-48%的乙醇洗脱液是否洗脱完全。洗脱完全后，采用58-63%的乙醇洗脱淫羊藿次苷II。结果显示，60-63%的乙醇洗脱液是洗脱淫羊藿次苷II的较佳比例。当乙醇浓度为58%时，淫羊藿次苷II收率不佳，说明该浓度对淫羊藿次苷II洗脱能力不强；63%乙醇产品洗脱得到的纯度接近60%乙醇，均大于98%，说明该浓度下对淫羊藿次苷II选择性较好。实施例3淫羊藿次苷II收率不及实施例1，可能是第二洗脱液中48%乙醇选择性不好，对淫羊藿次苷II有一定的洗脱能力，使得后续工艺淫羊藿次苷II收率下降。
实施例1优选工艺下主要提取物淫羊藿苷、淫羊藿次苷II、黄酮等的收率、纯度等均优于对照组（实施例2、3）。说明采用20%乙醇、45%乙醇、60%乙醇分批洗脱DM301大孔树脂，是取得淫羊藿提取物的最优工艺。
实施例4采用传统的甲醇对提取物进行重结晶，比较显示，乙醇法重结晶效果更好，仅需一次重结晶即可，减少了结晶次数，简化了工艺操作。采用甲醇对淫羊藿苷、淫羊藿次苷II进行一次重结晶，所得到的产品收率、纯度均不如无水乙醇一次重结晶，甲醇法需对产品多次重复重结晶才能达到理想效果。
实施例5萃取工艺未调节溶液pH，在萃取过程中淫羊藿苷、淫羊藿次苷II提取液均发生了乳化现象，乳化现象使有机相与水相形成了混合相，不利于两相分离，需考虑采用额外工艺使乳液破乳。即使破乳后，萃取过程中的乳化现象也引起了萃取效率的降低，最终表现为产品产率显著降低。
实施例6 利用残渣提取淫羊藿多糖
本发明淫羊藿提取工艺全程不涉及有毒试剂，安全性高且绿色环保。参照图4，本例提供淫羊藿药渣的进一步利用的方法，并评价所得到的淫羊藿多糖中毒害物残留。
（1）将提取过淫羊藿总黄酮的药渣干燥，粉碎备用；
（2）取一定量的药渣，按料液比为1：10加入水，在90℃条件下提取2次，每次30min；
（3）过滤，将滤液合并，再旋转蒸发仪上浓缩至一定体积；
（4）向浓缩液中加入无水乙醇至醇浓度为90%，搅匀，放置12h后过滤得沉淀；
（5）将沉淀用水溶解，搅匀放置4h,过滤，将滤液浓缩，再重复一次醇沉过程，得沉淀；
（6）将沉淀溶于水中，用Sevage法除尽蛋白，水层逆向流水透析24h,然后进入蒸馏水中透析36h;
（7）将透析袋内的水浓缩，冷冻干燥后可得淫羊藿多糖。
采用高效液相色谱法测定所得到的淫羊藿多糖，结果未检测到有机物溶剂残留。基于提取工艺分析，本发明由淫羊藿粗粉得到淫羊藿药渣的过程中未引入毒害物质，而淫羊藿多糖提取工艺目前国内外也已多有研究。将本例得到的多糖与水沉醇提法由淫羊藿粗粉直接提取的淫羊藿多糖分析比较，未发现显著差别。由于本发明采用乙醇对淫羊藿粗粉进行浸提，未引入毒害物质，也不会导致淫羊藿多糖流失，所得药渣可进一步处理得到淫羊藿多糖。本例显示本发明工艺得到的淫羊藿药渣同样绿色环保，经简单处理即可得到具有药用价值的淫羊藿多糖。
经检测，本例中药渣提取的淫羊藿多糖的部分清除自由基能力下降，但其体外抗氧化活性依旧很高，具有较高的医疗和保健价值。
对比例1
参照图5，目前较为成熟的淫羊藿提取工艺多采用聚酰胺柱-萃取-重结晶法提取淫羊藿苷。此方法主要是将淫羊藿提取液经过聚酰胺柱洗脱，然后用先用氯仿萃取，然后用乙酸乙酯进行萃取，最后用60%的乙醇进行纯结晶后得到产品。本例以聚酰胺柱-萃取-重结晶法作为对比例进行比较评价，该方法步骤如下：
（1）将干燥的淫羊藿全草粉碎成30目的粉粒备用；
（2）采用80%乙醇对淫羊藿全草粉进行浸提，料液比1：10，提取3次得到浸提液；
（3）浓缩浸提液得到浸膏，水溶后去除不溶物，以水溶液通过聚酰胺柱；
（4）采用50%乙醇对聚酰胺柱进行洗脱，得到洗脱液，浓缩得到浸膏；
（5）通过氯仿/乙酸乙酯混合溶剂对浸膏进行萃取，减压收集溶剂；
（6）用60%乙醇溶解萃取物，趁热过滤，静置结晶，抽滤后取滤饼部分干燥，得到产品。
经检验，该产品主要是淫羊藿苷，其纯度也超过90%。
下面以不同类型的层析柱应用于本例相同工艺中，比较各种层析柱提取淫羊藿苷。
表2 不同层析柱提取淫羊藿苷的选择性
| 层析柱 | 淫羊藿苷纯度 | 淫羊藿苷收率 |
| DM301大孔树脂 | 97.5% | 92.1% |
| PA03060聚酰胺树脂 | 90.7% | 82.3% |
| D1400大孔树脂 | 96.8% | 88.6% |
| HZ-841大孔树脂 | 93.4% | 85.1% |
| D101大孔树脂 | 96.2% | 88.2% |
对比例2
参照图6，传统工艺多采用水提法提取淫羊藿所含总黄酮，本对照组通过水来提取总黄酮，得到总黄酮浸提液。其后续总黄酮纯化工艺与实施例1相同，经相同方法进行纯化。
结果显示，采用水浸提淫羊藿粗粉可达到提取总黄酮的目的，难以获得对淫羊藿苷等提取物，且该方法产率较本低。
Claims (6)
1.一种淫羊藿提取物的高纯度分离提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
对淫羊藿粗粉采用80%乙醇浸提，过滤，浓缩回收乙醇，得到淫羊藿提取物粗品；
将淫羊藿提取物粗品用水溶解，过滤，上清液过DM301大孔树脂吸附柱吸附；
水洗脱吸附柱至无色，依次以20%乙醇、45%乙醇、60%乙醇洗脱吸附柱，分别收集对应浓度的乙醇洗脱液；
对45%乙醇洗脱液进行浓缩，回收乙醇；浓缩液调节pH=5，以乙酸乙酯进行萃取，弃除水相后浓缩回收乙酸乙酯，得到萃取物；用热乙醇对萃取物进行重结晶，干燥得到淫羊藿苷；
对60%乙醇洗脱液进行浓缩，回收乙醇；浓缩液调节pH=5，以乙酸乙酯进行萃取，弃除水相后浓缩回收乙酸乙酯，得到萃取物；用热乙醇对萃取物进行重结晶，干燥得到淫羊藿次苷II；
对20%乙醇洗脱液进行浓缩，回收乙醇，干燥后得到淫羊藿黄酮。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对淫羊藿粗粉采用80%乙醇浸提时，以料液比1:10在70℃浸提3次，每次浸提90min，过滤后合并滤液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，吸附柱吸附前，淫羊藿提取物粗品按7.45g/L用水溶解，过滤除去不溶物，过DM301大孔树脂吸附柱，流速为3BV/h。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对吸附柱洗脱时，先用水洗脱柱子至无色；再用20%的乙醇洗脱杂质；然后用45%的乙醇，以1.5BV/h的流速洗脱，洗脱剂用量4.5BV；最后用60%乙醇洗脱，1.5BV/h的流速洗脱剂用量4.5BV；分别收集20%乙醇洗脱液、45%乙醇洗脱液及60%乙醇洗脱液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对45%乙醇洗脱液处理时，首先减压浓缩洗脱液，用盐酸调节pH为5，用2倍体积的乙酸乙酯萃取2次，弃去水层，减压浓缩收集乙酸乙酯；用无水乙醇加热溶解萃取物，趁热过滤，放置结晶，待再无结晶体生成后抽滤；用无水乙醇对晶体再次重结晶后过滤，真空干燥可得淫羊藿苷纯品。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对60%乙醇洗脱液处理时，首先减压浓缩洗脱液，用盐酸调节pH为5，用2倍体积的乙酸乙酯萃取2次，弃去水层，减压浓缩收集乙酸乙酯；用无水乙醇加热溶解萃取物，趁热过滤，放置结晶，待再无结晶体生成后抽滤；用无水乙醇对晶体再次重结晶后过滤，真空干燥可得淫羊藿次苷II纯品。
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| GR01 | Patent grant | ||
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