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CN112237584B - 化合物预防和/或治疗冠状病毒感染所致疾病的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明发现去甲泽拉木醛和西地尼布能够有效地阻断RBD与ACE2蛋白的结合，从而可以用于预防和/或治疗冠状病毒感染所致的疾病。

Description

化合物预防和/或治疗冠状病毒感染所致疾病的用途
技术领域
本发明涉及药物化学领域，特别涉及靶向SARS-CoV-2RBD和/或人ACE2蛋白的小分子抑制剂。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)感染引起的2019新型冠状病毒疾病 (COVID-19)[1,2]。感染SARS-CoV-2可引起发热、干咳和呼吸困难等症状。与SARS 不同，COVID-19可能会转化为类似于流感一样的慢性疾病，并与人类长期共存。迄今为止，全世界确诊的COVID-19病例数已超过1630万，并呈持续上升趋势[3]。
目前科学家们已经获得了有关SARS-CoV-2的详细生物学信息[4-7]。S蛋白主要与宿主细胞上的膜受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合，促进病毒进入宿主细胞[8,9]。其中，S蛋白的受体结合域(RBD)直接参与了宿主受体的识别。该区域的氨基酸变异将导致感染特征等发生变化[10,11]。
疫苗是最有希望的治疗方法之一。抗病毒药物的开发是对抗COVID-19的另一个有效对策。然而目前尚未发现具有明确临床疗效的药物。SARS-CoV-2抑制剂的筛选现已全面展开，并已获得各种有前景的抑制剂[12-16]。
进入宿主细胞是病毒感染的第一步，因此阻止病毒进入宿主细胞是一种有效的抗病毒药物研发策略[17-18]。最近发表的靶向RBD和ACE2蛋白的虚拟筛选研究表明，天然产物如甘草酸、大黄素和橙皮苷可抑制SARS-CoV-2与ACE2的结合[19]。RBD和ACE2蛋白通过它们之间的接触面实现蛋白-蛋白相互作用(PPI)，缺乏清晰的空腔结构和活性中心。这对传统的筛选方法提出了挑战。
表面等离子体共振(SPR)技术是上世纪90年代开发的用于分析生物分子相互作用的通用型生物物理检测技术[20,21]。它无需标记蛋白，能够实时监测分子相互作用。SPR，不仅能够表征亲和力较强的蛋白蛋白相互作用，也可表征片段或低分子量化合物与蛋白之间较弱的相互作用。利用SPR技术进行筛选可同时获得化合物与蛋白作用的动力学以及亲和力信息。此外它也是发现PPI抑制剂的强大工具[22]。与基于酶活性的传统抑制剂筛选手段相比，SPR技术不依赖于任何酶反应过程。
发明内容
本发明以SARS-CoV-2的RBD蛋白和ACE2蛋白为靶标，应用SPR技术筛选包含960个化合物的数据库。通过建立筛选模型及清库、结合水平筛选和亲和力测定实验，获得了7个KD值小于100μM的作用于ACE2蛋白的化合物，6个作用于 RBD蛋白且KD值小于100μM的化合物。其中，通过SPR竞争实验获得了两个能有效阻断RBD和ACE2相互作用的化合物02B05(去甲泽拉木醛，CAS号为 107316-88-1)和03D12(西地尼布，CAS号为288383-20-0)，其化学结构分别如下：
Figure BDA0002644967240000021
根据本发明的一个方面，本发明涉及去甲泽拉木醛或西地尼布、或者其可药用盐、或者其或其可药用盐的溶剂化物、或者其或其可药用盐的水合物在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染所致疾病的药物中的应用。优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2。更优选地，所述疾病为新型冠状病毒疾病和/或其并发症。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及一种预防和/或治疗冠状病毒感染所致疾病的方法，其特征在于，给予有需要的对象治疗有效量的去甲泽拉木醛或西地尼布、或者其可药用盐、或者其或其可药用盐的溶剂化物、或者其或其可药用盐的水合物。优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2。更优选地，所述疾病为新型冠状病毒疾病和/或其并发症。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及一种消杀环境中冠状病毒的方法，其特征在于，施用去甲泽拉木醛或西地尼布、或者其盐、或者其或其盐的溶剂化物、或者其或其盐的水合物。优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及去甲泽拉木醛或西地尼布、或者其盐、或者其或其盐的溶剂化物、或者其或其盐的水合物用作SARS-CoV-2RBD 抑制剂的用途。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及去甲泽拉木醛或西地尼布、或者其盐、或者其或其盐的溶剂化物、或者其或其盐的水合物用作ACE2抑制剂的用途。
本领域技术人员可以理解，去甲泽拉木醛的盐或可药用盐例如与无机碱或有机碱形成的盐。无机碱包括但不限于碱金属例如钠、钾等，碱土金属例如钙、镁等，有机碱包括但不限于有机胺例如乙醇胺、三甲胺、叔丁胺、吡啶、甲基吡啶、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇等，碱性氨基酸例如精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等。西地尼布的盐或可药用盐例如与无机酸或有机酸形成的盐。无机酸例包括但不限于盐酸、硫酸、磷酸、氢溴酸、硝酸等，有机酸包括但不限于甲酸、乙酸、丙酸、戊酸、二乙基乙酸、三氟乙酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富马酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、葡糖酸、抗坏血酸、烟酸、异烟酸、苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、萘二磺酸等。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及一种药物组合物，含有去甲泽拉木醛或西地尼布、或者其可药用盐、或者其或其可药用盐的溶剂化物、或者其或其可药用盐的水合物。优选地，进一步含有可药用载体。优选地，所述药物组合物用于预防和/或治疗冠状病毒感染所致疾病。更优选地，所述冠状病毒为 SARS-CoV-2。更优选地，所述疾病为新型冠状病毒疾病和/或其并发症。
本领域技术人员可以理解，本发明的药物组合物可以制成本领域的各种常用制剂形式，例如静脉、口服、吸入、眼用、直肠给药等制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、丸剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、悬浮剂、气雾剂、注射剂、栓剂、滴眼液等等。
本领域技术人员可以理解，本发明的药物组合物中可以含有各种本领域常用的可药用载体。
本领域技术人员可以理解，可以根据体重、给药方式、个体对药物的反应、制剂类型、给药时间或间隔确定治疗有效量。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及一种消杀环境中冠状病毒的消毒剂，含有去甲泽拉木醛或西地尼布、或者其可药用盐、或者其或其可药用盐的溶剂化物、或者其或其可药用盐的水合物。
本发明发现去甲泽拉木醛或西地尼布能够与RBD、ACE2结合，并且能够有效阻断RBD和ACE2相互作用，从而能够预防和/或治疗冠状病毒感染所致的疾病。
附图说明
图1为实施例1中RBD-mFc与捕获的ACE2-His相互作用的表面等离子体共振传感图。
图2为实施例3中结合水平筛选所得苗头化合物的固定化ACE2的传感图。化合物数据显示为实线，空白对照数据显示为虚线。
图3为实施例3中结合水平筛选所得苗头化合物的固定化RBD的传感图。化合物数据显示为实线，空白对照数据显示为虚线。
图4为实施例3中结合水平筛选所得苗头化合物结合ACE2蛋白的传感图。
图5为实施例3中结合水平筛选所得苗头化合物结合RBD蛋白的传感图。
图6为实施例4中02B05与RBD-His结合的ITC实验。
图7为实施例5中02B05对ACE2-RBD的竞争性抑制。图中，由上至下化合物的浓度分别为0μM、31.25μM、62.5μM、125μM。
图8为实施例5中03D12对ACE2-RBD的竞争性抑制。图中，由上至下化合物的浓度分别为0μM、31.25μM、62.5μM、125μM。
图9为实施例5中RBD蛋白(6.25、12.5和25nM，从上至下第一条线)、125μM 02B05和RBD蛋白(6.25、12.5和25nM，从上至下第二条线)、125μM 02B05(从上至下第三条线)和运行缓冲液(从上至下第四条线)与ACE2蛋白结合的传感图叠加。
图10为实施例6中化合物02B05的细胞毒性及其对293T-hACE2细胞中假型 VSV病毒或SARS-CoV-2病毒转导的影响。图中，*，P<0.05；**，P<0.01，左右Y轴分别代表Luc活性和细胞活力的平均百分比。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
由960种临床前化合物组成的化合物库由Targetmol(美国)提供。SARS-CoV-2 S蛋白的RBD蛋白(mFc标签，cat no:40592-V05H)和人类ACE2蛋白(His标签，cat no:10108-H08H)购自Sino Biological(中国)，带有His标签的SARS-CoV-2RBD 蛋白由中国医学科学院药物研究所提供。HBS-N缓冲液、氨基偶联试剂盒、NTA 试剂盒、醋酸盐缓冲液、CM5芯片和NTA芯片均购自Cytiva(前瑞典GE医疗公司)。二甲基亚砜(DMSO)、吐温20和氢氧化钠购自Sigma-Aldrich(德国)。
表达人ACE2的293T衍生细胞系(293T-hACE2)购自中吉当康基因技术有限公司，在5％CO2培养箱中，于37℃下保存在添加有10％FBS(美国吉布科公司) 和抗生素(100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素)的DMEM(美国Invitrogen公司) 中。PrestoBlue细胞生存力试剂购自美国Invitrogen。水泡性口炎病毒(VSV)和 SARS-CoV-2假型病毒颗粒购自中吉当康基因技术有限公司(中国)。细胞裂解缓冲液和荧光素酶底物购自Promega(美国)。
实施例1蛋白-蛋白相互作用测试
使用Biacore S200仪器，利用NTA芯片，测定ACE2和RBD蛋白的蛋白-蛋白相互作用。运行缓冲液为HBS-T+缓冲液(10mM HEPES,150mM NaCl,0.05％ tween 20,pH 8.0,0.22μm微孔滤膜过滤)。配体为ACE2-His，浓度为10mg/mL，捕获时间为100秒。配制一系列浓度为3.13、6.25、12.5、25、50和100nM的 S-RBD-mFc溶液，使其流过捕获的ACE2-His表面，并记录获得的响应单位(RUs)。流速设定为30μL/min，结合时间120s，解离时间500s。350mM EDTA为再生溶液，再生时间60秒。
实验结果表明，不同循环的ACE2捕获量相对稳定(响应约为143RU，偏差不超过2RU)。此外，将相同浓度的RBD蛋白重复进样获得的传感图几乎重合，这表明捕获法具有较好的再现性和稳健性。使用这种稳健的相互作用方法，测量了ACE2-RBD相互作用(附图1)。测得的RBD最大响应信号为94.2RU。以上结果表明，两种蛋白在运行缓冲液中的活性保持良好。数据分析使用Biacore S200评估软件1.0版完成，经1:1数据拟合后，通过软件分析获得的亲和常数为0.37nM。
实施例2氨基偶联法SPR筛选模型的建立
通过氨基偶联法将RBD及ACE2蛋白固定在CM5芯片上。芯片首先与EDC和 NHS的混合物接触而被活化。然后将浓度为20μg/mL和16μg/mL的RBD和 ACE2-His蛋白分别溶解于醋酸钠溶液(分别为pH 5.0和pH 4.5)中，并流过芯片表面，最终分别固定在CM5芯片的Fc2和Fc4上。最后用乙醇胺封闭芯片。
经测，RBD蛋白的偶联量约为8500RUs，ACE2蛋白的偶联量约为9100RUs。将约20nM的ACE2或RBD流过固定有RBD或ACE2的芯片时，响应信号分别为 242RUs和319RUs。以上结果表明，两种靶标蛋白在固定后均能保持活性。
实施例3活性化合物筛选
化合物筛选的整个过程分为三个步骤：清库、结合水平筛选和亲和力测定。实验均采用Biacore T200或Biacore S200仪器，流速为30μL/min，数据采用Biacore T200/S200评估软件进行分析。使用HBS-T+缓冲液(10mM HEPES,150mM NaCl,0.05％tween 20,5％DMSO,pH 8.0,0.22μm微孔滤膜过滤)作为运行缓冲液。首先将化合物稀释至100μM，最终用5％DMSO的运行缓冲液稀释为25μM或 10μM。
基于溶解度的差异，将浓度为25μM或10μM的化合物流过芯片表面进行清库。通过清库，总共排除了13种高粘度化合物。然后对通过清库的化合物进行结合水平筛选，以便识别得到与靶标蛋白结合的化合物。
结合水平筛选时，化合物筛选浓度为10μM，结合和解离时间为60秒。在筛选过程中，运行缓冲液为阴性对照。根据GE Healthcare Laboratory指南，制备溶剂校正样品(8个点)。最终筛选获得了15个结合于RBD的化合物和15个结合于 ACE2的化合物。传感图如附图2和3所示。通过软件自动分析后，在结合水平筛选获得的苗头化合物中，8个结合ACE2的化合物(分别为01N12、02B05、02C19、 02D16、03D12、03E22、03I19和03P04)和5个结合RBD的化合物(分别为02B05、 02C15、02J06、03D12和03I14)被标记为慢解离化合物。
然后，对结合水平筛选所得苗头化合物进行亲和力测定，浓度范围为0.3125 至20μM。结合时间为60秒，解离时间为120秒。动力学和稳态亲和力的数据通过1:1结合模型获得。结果表明，有5个化合物(02B05，02C15，02J06，02M09， 03D12)对RBD显示出高结合亲和力，其KD值小于100mM。同时，这5种化合物也能与ACE2结合。进一步发现，它们对RBD或ACE2的亲和力基本相同，差值在一个数量级以内。此外，化合物02C19和02F14只能与ACE2存在强结合，这表明这些化合物对两种蛋白质具有高度特异性。亲和力值总结在下表1中。
表1不同化合物与ACE2以及RBD的亲和力测定结果
Figure 1
a动力学分析数据自动拟合为1:1结合模型
b稳态亲和力分析数据自动拟合为1:1结合模型
最后，利用动力学拟合模型，测量了上述化合物和ACE2和RBD的动力学常数。将浓度为0.31、0.63、1.25、2.5、5、10和20μM的化合物注入芯片表面。结合时间为60秒，解离时间为120秒。传感图如附图4和5所示。总的来说，化合物 02B05的解离速率常数最小，表明它具有最长的停留时间。一般来说，较长的停留时间与药效的大小和持续时间密切相关。上述研究结果表明，化合物02B05有望成为一种潜在的RBD-ACE2结合抑制剂。
实施例4应用iTC进行相关作用测定
将浓度为15μM的S-RBD-His置于iTC200(英国马尔文)样品池中。将化合物 02B05由2mM的储备溶液(溶解于DMSO)稀释至100μM(溶剂为运行缓冲液) 中。在25℃下以8的参考功率进行实验。最初注射0.2μL，然后注射15×2μL。通过将相同浓度的化合物注射到缓冲液中来测量化合物的稀释热。数据符合1:1的结合等温线。
结果如附图6所示，由iTC测量的亲和力是2.09μM，接近于实施例3中SPR测得的亲和力。这一结果表明化合物02B05可以在缓冲溶液中与S-RBD-His结合，进一步证明了SPR筛选方法的可靠性和准确性。
实施例5基于SPR的竞争分析
苗头化合物对RBD蛋白以及ACE2蛋白的抑制效应通过NTA芯片进行测定，运行缓冲液与亲和筛选实验缓冲液一致。ACE2-His捕获浓度为5μg/mL，捕获时间保持不变。分析溶液为溶解于运行缓冲液中且含有0～125μM(0,31.25,62.5, or 125μM)化合物的20nM RBD溶液。在结合时间为120s、解离时间为500s条件下将分析溶液注入流过ACE2-His。在分析之前，在室温下将RBD与化合物孵育一个小时。在单次进样分析时，分析物改为含有0至25nMRBD的125μM化合物溶液。
化合物02B05显示出最强的阻断作用，其次是03D12。响应信号和化合物浓度之间的关系如附图7和8所示。02B05和03D12以剂量依赖的方式显著降低了反应，而其他化合物(125μM)的竞争性抑制不明显。为了确定结果，我们比较了缓冲溶液、化合物溶液、RBD溶液、RBD溶液和化合物混合溶液单独流过ACE2蛋白表面时的响应。从附图9可以看出，当单独注射RBD溶液(6.25、12.5和25μM) 时，观察到明显的信号变化。然而，当将125μM化合物02B05和RBD(6.25、12.5 和25nM)混合后注射时，信号响应下降，并且传感图类似于通过单独分析化合物获得的传感图。这表明一旦化合物02B05与RBD结合，RBD与ACE2的结合就被阻断了。数据表明02B05能有效阻断ACE2-RBD相互作用。
实施例6假型慢病毒颗粒进入人类细胞和荧光素酶测定
为了研究化合物02B05是否抑制病毒进入宿主细胞，在化合物02B05存在的情况下，将293T-hACE2细胞用萤光素酶报告病毒感染，该病毒为表达 SARS-CoV-2刺突包膜蛋白或VSV G蛋白的假病毒。
首先，使用PrestoBlue细胞生存力试剂检测02B05在293T-hACE2细胞中的细胞毒性。将细胞接种到96孔板中，并用不同浓度的02B05处理。在37℃孵育24小时后，向每个孔中加入10μL的PrestoBlue(10×)，并与培养基充分混合。在37℃下再次孵育1小时后，使用560nm的激发波长和590nm的发射波长(Perkin Elmer, Waltham,MA,USA)读取荧光信号。结果表明，在293T-hACE2细胞中化合物 02B05的最大无毒浓度小于1μM。如附图10所示，02B05浓度为1.1μM时，大约 12％的细胞死亡。
在化合物02B05不存在或存在的情况下，用假型VSV病毒或SARS-CoV-2病毒感染接种在白壁和透明底部96孔板中的293T-hACE2。选择氯化铵作为阳性对照。在感染后24小时，用20μL/孔的细胞裂解缓冲液裂解细胞15分钟，然后加入 50μL/孔的荧光素酶底物。萤火虫荧光素酶活性通过PerkinElmer EnSpire仪器中的发光测定法测量。使用荧光素酶活性表征病毒的进入效率。结果见附图10，化合物02B05适度降低了VSV假病毒的感染，但显著抑制了SARS-CoV-2假病毒的感染。此外，0.37μM的化合物02B05大约抑制7％的SARS-CoV-2假病毒的转导，但对VSV假病毒的转导没有影响。这些结果反映了化合物02B05在非常低的浓度下对SARS-CoV-2假病毒的进入表现出抑制活性。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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Claims (5)

1.去甲泽拉木醛或西地尼布、或者其可药用盐在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染所致疾病的药物中的应用，所述冠状病毒为SARS-CoV-2。
2.如权利要求1所述的应用，所述疾病为新型冠状病毒疾病和/或其并发症。
3.如权利要求1或2所述的应用，去甲泽拉木醛或西地尼布、或者其可药用盐抑制ACE2。
4.一种消杀环境中冠状病毒的方法，其特征在于，施用去甲泽拉木醛或西地尼布、或者其盐，所述冠状病毒为SARS-CoV-2。
5.去甲泽拉木醛或西地尼布、或者其盐在制备SARS-CoV-2RBD抑制剂的用途。
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