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CN112195194A - 重组人促卵泡激素及其制备方法 - Google Patents

重组人促卵泡激素及其制备方法 Download PDF

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CN112195194A
CN112195194A CN202011192785.9A CN202011192785A CN112195194A CN 112195194 A CN112195194 A CN 112195194A CN 202011192785 A CN202011192785 A CN 202011192785A CN 112195194 A CN112195194 A CN 112195194A
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CN
China
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fsh
stimulating hormone
recombinant human
primer
ctp
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CN202011192785.9A
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高丽婷
杨仲璠
鲍朋
朱红雨
张龙章
许可
王丹丹
徐明波
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Beijing Sl Lisheng Medical Technology Co ltd
BEIJING SL PHARMACEUTICAL CO LTD
Beijing Shuanglu Biological Technology Co ltd
Original Assignee
Beijing Sl Lisheng Medical Technology Co ltd
BEIJING SL PHARMACEUTICAL CO LTD
Beijing Shuanglu Biological Technology Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种重组人促卵泡激素及其制备方法，其包括：将构建的含FSHα亚基的表达载体和含FSHβ亚基的表达载体联合转染到中国仓鼠卵巢细胞中，筛选出稳定表达的细胞株，纯化培养所述细胞株得到培养液，得到所述重组人促卵泡激素；其中，所述FSHβ亚基的C末端连接有CTP。本发明重组人促卵泡激素的制备方法分别从人胚肾293细胞基因组中克隆包括内含子的hFSHα和hFSHβ序列，经引物延伸方式将CTP序列连入β亚基末端，得到hFSHβ‑CTP，再将上述两个亚基序列转染到CHO‑S细胞，表达得到rhFSH‑CTP，表达得到的rhFSH‑CTP，在体内的半衰期更长，终末半衰期是重组FSH的2‑3倍，生物活性更高。

Description

重组人促卵泡激素及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种重组人促卵泡激素及其制备方法。
背景技术
FSH是一种异源二聚体糖蛋白，分子量约为31KD，由非共价结合的α亚基和β亚基组成，其中α亚基相对分子质量约14KD，由92个氨基酸残基组成，含2个N糖链、5个二硫键；β亚基相对分子质量约17KD，由111个氨基酸残基组成，含2个N糖链、6个二硫键。FSHα亚基和FSHβ亚基在转录后都经过糖基化，该蛋白质糖基化对其生物活性十分重要，是其发挥活性作用的关键。
长效重组人促卵泡激素是一种具有更长半衰期的促卵泡激素。该药物分子由两个亚基组成。其中α亚基与重组人促卵泡激素(rhFSH)的α亚基完全相同，由92个氨基酸组成，有2个N-连接的糖基化位点，含有5个二硫键；β亚基是由rhFSHβ亚基与人绒毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin，hCG)β亚基羧基末端肽(CTP)的28个氨基酸残基连接而成，成熟的β亚基含有139个氨基酸残基，有2个N-连接糖基化位点和4个O-连接的糖基化位点，含有6个二硫键。因此，该药物分子又称重组人促卵泡激素-CTP融合蛋白，简称rhFSH-CTP。传统纯化糖蛋白激素类蛋白的方法中，多用到广谱的亲和层析，比如蓝胶亲和层析，或使用反向层析、离子交换层析、分子排阻等多种方法组合。蓝胶亲和层析往往由于色素的脱落导致产品安全问题，反向层析会影响产品的活性，分子排阻耗时长，纯化效率低。
综上所述，利用DNA重组技术制备重组人促卵泡激素(rhFSH)已经出现，但是其制备的成本高，比尿源FSH产品更昂贵，稳定性差，生物活性低，纯化效果差的问题，亟待开发一种新的重组人促卵泡激素及其制备方法。
发明内容
为此，本发明提供一种重组人促卵泡激素及其制备方法，以解决现有技术中重组人促卵泡激素(rhFSH)纯化效果差、生物活性低的问题。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种重组人促卵泡激素的制备方法，所述方法包括：将构建的含FSHα亚基的表达载体和含FSHβ亚基的表达载体联合转染到中国仓鼠卵巢细胞中，筛选出稳定表达的细胞株，纯化培养所述细胞株培养液，得到所述重组人促卵泡激素；其中，所述FSHβ亚基的C末端连接有CTP。
优选地，所述FSHα亚基的编码区基因序列如SEQ ID NO：1所示，所述FSHβ亚基的C末端连接有CTP的编码区基因序列如SEQ ID NO：2所示。
优选地，所述含FSHα亚基的表达载体的构建过程为：
将FSHα亚基基因序列克隆至表达载体pcDNA3.1(+)，酶切所述pcDNA3.1质粒获得FSHα亚基基因，再将酶切后的所述FSHα亚基基因克隆至表达载体cDNA15.6，通过所述达载体cDNA15.6转染DH5α。
优选地，所述含FSHβ亚基的表达载体构建过程为：
以第一引物、第二引物和FSHβ亚基基因为模板PCR扩增，得到FSHβ亚基DNA片段；
以第一引物、第三引物和所述FSHβ亚基基因DNA片段为模板PCR扩增，得到FSHβ亚基DNA片段第一延长段；
以第一引物、第四引物和所述FSHβ亚基基因DNA片段延长段为模板PCR扩增，得到FSHβ亚基DNA片段第二延长段；
以第一引物、第五引物和所述FSHβ亚基DNA片段第二延长段为模板PCR扩增，得到C末端连接有CTP的FSHβ亚基基因；
将所述C末端连接有CTP的FSHβ亚基基因克隆至表达载pcDNA3.1(+)，酶切所述pcDNA3.1质粒获得FSHβ亚基基因，再将酶切后的所述FSHβ亚基基因克隆至表达载体cDNA15.6，通过所述达载体cDNA15.6转染DH5α；
其中，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述第三引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述第四引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述第五引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
优选地，所述联合转染过程包括：
将所述含FSHα亚基的表达载体和含FSHβ亚基的表达载体转化至大肠杆菌，得到具有FSHα亚基基因和FSHβ亚基基因的大肠杆菌，再将具有FSHα亚基基因和FSHβ亚基基因的大肠杆菌转染至CHO-S细胞。
优选地，所述纯化培养所述细胞株得到培养液过程包括：
将所述培养液的上清液经过亲和层析、疏水层析、混合模式层析、阳离子层析，将得到的层析液浓缩得到重组人促卵泡激素。
优选地，所述亲和层析柱的填料为针对FSH全分子的特异性CaptureSelect填料；
所述疏水层析柱的填料为Butyl-650M；
所述混合模式层析柱的填料为Capto Adhere；
所述阳离子交换层析柱的填料为CM Sepharose Fast Flow。
优选地，所述制备方法还包括：
在上样阳离子交换层析柱之前和过阳离子交换层析柱之后，采用截留分子量为10kD的超滤膜对所述层析液进行超滤浓缩。
优选地，所述超滤浓缩得到浓缩液的浓度为0.8～1.5mg/mL。
优选地，所述上清液的浊度＜10NTU。
本发明重组人促卵泡激素的制备方法分别从人胚肾293细胞基因组中克隆包括内含子的hFSHα和hFSHβ序列，经引物延伸方式将CTP序列连入β亚基末端，得到hFSHβ-CTP，再将上述两个亚基序列转染到CHO-S细胞，表达得到rhFSH-CTP，表达得到的rhFSH-CTP，在体内的半衰期更长，终末半衰期是重组FSH的2-3倍，生物活性更高。
本发明通过采用免疫亲和层析、疏水层析、混合模式层析、阳离子交换层析、超滤，对重组人促卵泡激素进行纯化。亲和层析采用特异性的结合完整FSH介质，高效率的捕获目标分子；疏水层析可以有效去除残留的解离亚基、氧化亚基，去除部分内毒素，进一步提高纯化蛋白的纯度；混合模式层析可以有效去除聚合体、残留DNA、HCP等杂质，可提高产品的安全性；阳离子交换层析可以去除糖基化不足的碱性rhFSH-CTP蛋白，有效提高产品的唾液酸含量；超滤方法的应用缩短工艺流程，且易于工业化生产，所采用的方法简便易行，获得的蛋白质量稳定，易于进行工业放大。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明提供的重组表达质粒pcDNA15.6-FSHα的图谱；
图2为本发明提供的重组表达质粒pcDNA15.6-FSHα酶切DNA片段电泳图，其中，M：Marker；1、2分别为2个重组表达质粒的酶切DNA片段；
图3为本发明提供的重组表达质粒pcDNA16.1-FSHβCTP的图谱；
图4为本发明提供的重组表达质粒pcDNA16.1-FSHβCTP酶切DNA片段电泳图，其中，M：Marker；1、2和3为3个重组表达质粒的酶切DN片段；
图5为本发明的纯化后的长效重组人促卵泡激素的SDS-PAGE电泳图，其中泳道1为rhFSH-CTP，泳道2为Marker；
图6为本发明4纯化后长效重组人促卵泡激素SEC-HPLC色谱图；
图7为本发明4纯化后长效重组人促卵泡激素平板等电聚焦电泳图，其中，泳道1为市售品原研药Elonva，泳道2为本发明纯化的rhFSH-CTP，泳道3为Marker；
图8为本发明纯化后长效重组人促卵泡激素杂质(解离亚基与聚合物)的SDS-PAGE电泳图，其中，泳道1为rhFSH-CTP聚合物供试品，泳道2为rhFSH-CTP聚合物对照品，泳道3为rhFSH-CTP解离亚基供试品，泳道4为rhFSH-CTP解离亚基对照品，泳道5为Marker；
图9为本发明4纯化后长效重组人促卵泡激素(rhFSH-CTP)液相肽图图谱与市售品原研药Elonva的对比谱图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、rhFSHα亚基基因表达载体的构建
本发明的FSHα亚基的编码区基因序列如SEQ ID NO：1所示，编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。本发明的FSHα亚基基因的扩增引物是在FSH-α亚基的基因两端引物上加上Nhe I和NotI酶切位点，设计的引物如表1所示。
表1
Figure BDA0002753240700000051
用上述引物I和引物II，以人293细胞基因组DNA为模板，扩增rhFSHα亚基基因，PCR扩增采用Pfu DNA聚合酶。
PCR扩增条件为：95℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃2min，共扩增30个循环，72℃延伸5min，扩增得到FSHα亚基基因的DNA片段，将扩增产物用1％琼脂糖凝胶回收，然后用NheI、Not I酶切FSHα亚基基因的DNA片段，用Nhe I、Not I酶切重组表质粒pcDNA3.1得到线性化的酶切质粒，酶切DNA片段经过琼脂糖凝胶回收后，与线性化的酶切质粒连接，得到重组表达质粒，命名为pcDNA3.1-rhFSHα，并测序鉴定，测序结果显示克隆序列与目标序列完全一致。
用Nhe I和Not I内切酶双酶切重组表达质粒pcDNA3.1-rhFSHα，1％琼脂糖凝胶回收FSHα亚基基因的DNA片段。同时，用Nhe I和Not I内切酶双酶切表达载体pcDNA15.6，1％琼脂糖凝胶回收酶切线性化的质粒DNA片段。用T4 DNA Ligase按照FSHα亚基的DNA片段与双酶切线性化质粒DNA片段比例为1:4的比例连接，16℃连接过夜后，将连接后的重组表达质粒转化至DH5α感受态细胞，酶切鉴定，如图1和图2所示，分别为重组表达质粒图谱及双酶切重组表达质粒的电泳图，将连接正确的质粒命名为pcDNA15.6-FSHα。
实施例2、rhFSHβ-CTP亚基基因表达载体的构建
本发明的FSHβ亚基的C末端连接有CTP的编码区基因序列如SEQ ID NO：2所示，编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。本发明的rhFSHβ-CTP亚基基因的两端引物上加上Nhe I、Xho I酶切位点，以rhFSHβ-CTP亚基基因设计引物序列，引物I至引物V的引物序列如表2所示。
表2
Figure BDA0002753240700000061
以FSHβ基因的DNA片段为模板，用引物I(SEQ ID NO：3)和引物II(SEQ ID NO：4)扩增，DNA聚合酶用TIANGEN公司的pfuDNA聚合酶。
PCR扩增条件是：95℃4min，94℃30s，60℃30s，72℃100s，扩增30个循环，72℃再延伸5min，得到FSHβ亚基DNA片段，回收FSHβ亚基DNA片段，再以FSHβ亚基DNA片段未模板，引物I(SEQ ID NO：3)和引物III(SEQ ID NO：5)为引物进行PCR扩增，得到FSHβ亚基DNA片段第一延长段，同样胶回收FSHβ亚基DNA片段第一延长段；
以FSHβ亚基DNA片段第一延长段为模板，引物I和引物IV(SEQ ID NO：6)为引物进行PCR扩增，得到FSHβ亚基DNA片段第二延长段，将扩增得到的产物回收；
以FSHβ亚基DNA片段第二延长段为模板，引物I和引物V(SEQ ID NO：7)为引物，进行PCR扩增得到FSHβ亚基DNA片段第三延长段，即为C末端连接有CTP的FSHβ亚基基因产物，即在FSHβ亚基的后面加上HCGβ序列末端28个氨基酸序列，即CTP，命名为FSHβ-CTP。
用Nhe I、Xho I双酶切PCR产物FSHβ亚基DNA片段第三延长段，然后与同样经NheI、Xho I双酶切的线性化质粒pcDNA3.1连接，得到重组表达载体，命名为pcDNA3.1-rhFSHβ-CTP并测序鉴定，测序结果显示克隆序列与设计序列完全一致。
用Nhe I和Xho I内切酶双酶切pcDNA3.1-FSHβ-CTP，1％琼脂糖凝胶回收酶切FSHβ-CTP DNA片段。同时，用Nhe I和Xho I内切酶双酶切线性化质粒pcDNA16.1，1％琼脂糖凝胶回收线性化的质粒片段。用T4 DNA Ligase按照FSHβ-CTP DNA片段与线性化质粒比例为1:4的比例连接，16℃连接过夜后，将连接后的重组表达质粒转化至DH5α感受态细胞，酶切鉴定正确的重组表达质粒，质粒图谱及双酶切鉴定图分别如图3和图4所示，命名为pcDNA16.1-FSHβ-CTP。
实施例3、细胞转染及高表达细胞株rhFSH-CTP的筛选
将重组表达载体pcDNA15.6-FSHα和pcDNA16.1-FSHβ-CTP转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化菌用含有氨苄霉素的LB液体筛选培养基复壮后扩大至100mL大量培养，37℃振荡培养过夜后，抽提纯化质粒，纯化后的质粒DNA调整浓度至1μg/μL，按照1:1的摩尔比混合重组表达质粒pcDNA15.6-FSHα与pcDNA16.1-FSHβ-CTP。
转染前1天，将宿主细胞CHO-S细胞按0.5×106cells/mL的接种密度传代至20mL新鲜培养基。电穿孔当天平行收集三组处于对数生长期的细胞，每组细胞个数为1×107个，离心去除培养基后，用PBS洗净细胞，离心弃上清，再将细胞重悬混匀于0.7mL PBS并加入电穿孔杯中，加入100μg pcDNA15.6-FSHα与pcDNA16.1-FSHβ-CTP的混合重组表达质粒并混匀，冰浴10分钟后放入电击槽中，用220V、200μS电击1次，电穿孔杯再次冰浴10分钟，至此电转染结束。
将转染好的三组CHO-S细胞分别加入10mL的非选择性CD-CHO培养基中37℃，5％CO2，75％湿度，100rpm摇床悬浮振荡培养。24h后，将培养基换成不含L-谷氨酰胺、含有25μM蛋氨酸砜亚胺(methionine sulfoximine,MSX)和500μg/mL G418的筛选培养基。
再过48h后，ELISA检测3组转染克隆库的培养上清中重组蛋白的含量，优选出表达最高的混合克隆库，将此混合克隆库通过有限稀释法筛选培养获得产量较高的单克隆细胞株，对其进行传代稳定性研究、批次补料培养，评估细胞株的生长情况、目标蛋白产量和关键质量属性，得到产量较高、纯度和质量较优的细胞株，为高表达细胞株rhFSH-CTP。
实施例4、重组人促卵泡激素的表达纯化
步骤一、培养本发明制备得到表达细胞株rhFSH-CTP
培养长效重组人促卵泡激素(rhFSH-CTP)表达细胞株rhFSH-CTP，收集细胞培养液。
步骤二、细胞培养液的澄清
采用默克密理博的Millistak+D0HC，X0HC进行二级深层过滤步骤1收集得到的细胞培养液，获得浊度＜10NTU的细胞培养上清液。
步骤三、细胞培养上清液亲和层析
将上述细胞培养上清液以150cm/h流速上样FSH亲和层析柱，用溶液A洗涤3～5个柱体积，然后，用溶液B洗涤3～5个柱体积，最后，用溶液C进行洗脱，收集洗脱峰，得到rhFSH-CTP亲和层析洗脱峰样品层析液。
FSH亲和层析填料为针对FSH全分子的特异性CaptureSelect产品，由ThermoFisher公司提供，FSH亲和层析的直径10cm，高度23cm，柱体积为1805mL。
其中，溶液A为20mM Tris-HCl+80mM NaCl；溶液B为20mM Tris-HCl+1M NaCl；溶液C为20mM Tris-HCl+2.0M MgCl2；上述溶液A、B、C的pH范围为pH 7.0～pH 7.5。
步骤四、亲和层析洗脱峰样品层析液的疏水层析
将疏水层析柱用溶液D平衡3～5个柱体积，将上述亲和层析洗脱样品调节电导率与溶液D一致，以100cm/h的速度上样至疏水层析柱，用溶液D洗涤3～5个柱体积。最后用溶液E进行洗脱，收集洗脱峰，为rhFSH-CTP的疏水层析液。疏水层析的填料为TOSOH公司的Butyl-650M。
其中，疏水层析柱的直径7.5cm，高度18cm，柱体积为795mL。溶液D为20mM Tris-HCl+3M NaCl；溶液E为20mM Tris-HCl+0.5M NaCl，溶液D、E的pH范围为pH 7.0～pH 7.5。
步骤五、疏水层析洗脱峰层析液的混合模式层析
将混合模式层析柱用溶液F平衡3～5个柱体积，将疏水层析洗脱样品稀释调节电导率与溶液F一致，以100cm/h的速度上样至混合模式层析柱，收集流穿液，溶液F平衡至上样前基线，与流穿液合并，为rhFSH-CTP的混合模式层析液。
其中，混合模式层析柱的直径7.5cm，高度15cm，柱体积为660mL，混合模式层析的填料为GE公司的Capto Adhere，溶液F为20mM Tris-HCl+0.3M NaCl，溶液F的pH范围为pH7.0～pH 7.5。
步骤六、混合模式层析洗脱层析液超滤浓缩
采用超滤的方法，将混合模式层析洗脱峰层析液浓缩至0.5mg/mL，并置换缓冲液为溶液G。超滤膜为PALL公司的Centramate产品，截留分子量为10kD，有效膜面积为0.1m2。其中，溶液G为20mM NaAc-HAc+0.01M NaCl，溶液G的pH范围为pH 5.5～pH 5.7。
步骤七、超滤浓缩液的阳离子交换层析
将阳离子交换层析柱用溶液G平衡3～5个柱体积，阳离子交换层析柱的直径5cm，高度为22cm，柱体积为430mL。将上述超滤浓缩液以100cm/h的速度上样至阳离子交换层析柱，收集流穿液，溶液G平衡至上样前基线，与流穿液合并。将收集的样品液立即调节pH至pH7.0±0.1，该样品液为rhFSH-CTP的阳离子交换层析液。其中，阳离子交换层析柱的填料为GE公司的CM Sepharose Fast Flow。
步骤八、阳离子交换层析液的超滤浓缩
采用超滤的方法将上述阳离子层析液浓缩至0.8～1.5mg/mL，并置换缓冲液为溶液H，得到纯化的长效重组人促卵泡激素(rhFSH-CTP)蛋白。
其中，超滤膜为PALL公司的Centramate产品，截留分子量为10kD；溶液H为8.375mg/mL二水合柠檬酸钠，溶液H的pH范围为pH 6.8～pH 7.5。
实施例5、纯化的长效重组人促卵泡激素(rhFSH-CTP)的鉴定
如图5所示，为本发明的纯化后长效重组人促卵泡激素(rhFSH-CTP)SDS-PAGE电泳图，其中，泳道1为本发明4纯化的rhFSH-CTP，泳道2为Marker，结果显示，纯度约100％。
如图6所示，为本发明4纯化的长效重组人促卵泡激素(rhFSH-CTP)SEC-HPLC色谱图，其中，纵坐标mAU为A214nm紫外吸收值，横坐标为时间，长效重组人促卵泡激素蛋白于7.319min出峰，纯度为99.904％。
如图7所示，为纯化的长效重组人促卵泡激素(rhFSH-CTP)平板等电聚焦电泳谱，其中，泳道1为市售品原研药Elonva，泳道2为本发明4纯化的rhFSH-CTP，泳道3为Marker，检测结果显示，本发明纯化得到的rhFSH-CTP等电点分布在3.50～6.55，主区带等电点分布在3.50～4.00，rhFSH-CTP与Elonva检测结果一致。
如图8所示，为纯化的长效重组人促卵泡激素(rhFSH-CTP)杂质(解离亚基与聚合物)检测SDS-PAGE电泳图，其中，泳道1为rhFSH-CTP聚合物供试品，泳道2为本发明4纯化的rhFSH-CTP聚合物对照品，泳道3为rhFSH-CTP解离亚基供试品，泳道4为本发明4纯化的rhFSH-CTP解离亚基对照品，泳道5为Marker，检测结果显示，聚合物含量＜7.5％，解离亚基含量＜2％。
如图9所示，为纯化后长效重组人促卵泡激素(rhFSH-CTP)液相肽图图谱与市售品原研药Elonva的对比谱图，检测结果显示，本发明纯化得到的rhFSH-CTP与Elonva的检测结果一致。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Figure BDA0002753240700000121
Figure BDA0002753240700000131
Figure BDA0002753240700000141
Figure BDA0002753240700000151
Figure BDA0002753240700000161
序列表
<110> 北京双鹭生物技术有限公司，北京双鹭药业股份有限公司，北京双鹭立生医药科技有限公司
<120> 重组人促卵泡激素及其制备方法
<130> GG19713058A
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 351
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
atggattact acagaaaata tgcagctatc tttctggtca cattgtcggt gtttctgcat 60
gttctccatt ccgctcctga tgtgcaggat tgcccagaat gcacgctaca ggaaaaccca 120
ttcttctccc agccgggtgc cccaatactt cagtgcatgg gctgctgctt ctctagagca 180
tatcccactc cactaaggtc caagaagacg atgttggtcc aaaagaacgt cacctcagag 240
tccacttgct gtgtagctaa atcatataac agggtcacag taatgggggg tttcaaagtg 300
gagaaccaca cggcgtgcca ctgcagtact tgttattatc acaaatctta a 351
<210> 2
<211> 474
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atgaagacac tccagttttt cttccttttc tgttgctgga aagcaatctg ctgcaatagc 60
tgtgagctga ccaacatcac cattgcaata gagaaagaag aatgtcgttt ctgcataagc 120
atcaacacca cttggtgtgc tggctactgc tacaccaggg atctggtgta taaggaccca 180
gccaggccca aaatccagaa aacatgtacc ttcaaggaac tggtatacga aacagtgaga 240
gtgcccggct gtgctcacca tgcagattcc ttgtatacat acccagtggc cacccagtgt 300
cactgtggca agtgtgacag cgacagcact gattgtactg tgcgaggcct ggggcccagc 360
tactgctcct ttggtgaaat gaaagaatcc tcttcctcaa aggcccctcc ccccagcctt 420
ccaagtccat cccgactccc ggggccctcg gacaccccga tcctcccaca ataa 474
<210> 3
<211> 56
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
atagctagcc cgccgaccat gaagacactc cagtttttct tccttttctg ttgctg 56
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ggaggggcct ttgaggaaga ggattctttc atttcaccaa aggagcagta gctgggcc 58
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ccgggagtcg ggggaatctt ggaaggctgg ggggaggggt ttccgaggaa gaggattc 58
<210> 6
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ttattgtggg aggatcgggg tgtccgaggg ccccgggagt cgggatggct taggaaggc 59
<210> 7
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gcctcgagtt attgtgggag gatcggggtg tagccggg 38
<210> 8
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
atagctagcg ccgccaccat gtagtactac agaaaatacg tagctatctt tctggtc 57
<210> 9
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
atagcggccg caattgattt gtgataacaa taagtactgc agtggcacg 49
<210> 10
<211> 92
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 10
Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro
1 5 10 15
Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys
20 25 30
Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu
35 40 45
Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser
50 55 60
Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr
65 70 75 80
Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser
85 90
<210> 11
<211> 138
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 11
Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu
1 5 10 15
Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys
20 25 30
Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln
35 40 45
Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro
50 55 60
Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr
65 70 75 80
Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val
85 90 95
Arg Gly Leu Gly Pro Ser Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu Ser Ser
100 105 110
Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro
115 120 125
Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
130 135

Claims (10)

1.一种重组人促卵泡激素的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
将构建的含FSHα亚基的表达载体和含FSHβ亚基的表达载体联合转染到中国仓鼠卵巢细胞中，筛选出稳定表达的细胞株，纯化培养所述细胞株培养液，得到所述重组人促卵泡激素；其中，所述FSHβ亚基的C末端连接有CTP。
2.如权利要求1所述的重组人促卵泡激素的制备方法，其特征在于，
所述FSHα亚基的编码区基因序列如SEQ ID NO：1所示，所述FSHβ亚基的C末端连接有CTP的编码区基因序列如SEQ ID NO：2所示。
3.如权利要求1所述的重组人促卵泡激素的制备方法，其特征在于，
所述含FSHα亚基的表达载体的构建过程为：
将FSHα亚基基因序列克隆至表达载体pcDNA3.1(+)，酶切所述pcDNA3.1质粒获得FSHα亚基基因，再将酶切后的所述FSHα亚基基因克隆至表达载体cDNA15.6，通过所述达载体cDNA15.6转染DH5α。
4.如权利要求1所述的重组人促卵泡激素的制备方法，其特征在于，
所述含FSHβ亚基的表达载体构建过程为：
以第一引物、第二引物和FSHβ亚基基因为模板PCR扩增，得到FSHβ亚基DNA片段；
以第一引物、第三引物和所述FSHβ亚基基因DNA片段为模板PCR扩增，得到FSHβ亚基DNA片段第一延长段；
以第一引物、第四引物和所述FSHβ亚基基因DNA片段延长段为模板PCR扩增，得到FSHβ亚基DNA片段第二延长段；
以第一引物、第五引物和所述FSHβ亚基DNA片段第二延长段为模板PCR扩增，得到C末端连接有CTP的FSHβ亚基基因；
将所述C末端连接有CTP的FSHβ亚基基因克隆至表达载pcDNA3.1(+)，酶切所述pcDNA3.1质粒获得FSHβ亚基基因，再将酶切后的所述FSHβ亚基基因克隆至表达载体cDNA15.6，通过所述达载体cDNA15.6转染DH5α；
其中，所述第一引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述第二引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述第三引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述第四引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；所述第五引物的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
5.如权利要求1所述的重组人促卵泡激素的制备方法，其特征在于，
所述联合转染过程包括：
将所述含FSHα亚基的表达载体和含FSHβ亚基的表达载体转化至大肠杆菌，得到具有FSHα亚基基因和FSHβ亚基基因的大肠杆菌，再将具有FSHα亚基基因和FSHβ亚基基因的大肠杆菌转染至CHO-S细胞。
6.如权利要求1所述的重组人促卵泡激素的制备方法，其特征在于，
所述纯化培养所述细胞株得到培养液过程包括：
将所述培养液的上清液经过亲和层析、疏水层析、混合模式层析、阳离子层析，将得到的层析液浓缩得到重组人促卵泡激素。
7.如权利要求6所述的重组人促卵泡激素的制备方法，其特征在于，
所述亲和层析柱的填料为针对FSH全分子的特异性CaptureSelect填料；
所述疏水层析柱的填料为Butyl-650M；
所述混合模式层析柱的填料为Capto Adhere；
所述阳离子交换层析柱的填料为CM Sepharose Fast Flow。
8.如权利要求6所述的重组人促卵泡激素的制备方法，其特征在于，
所述制备方法还包括：
在上样阳离子交换层析柱之前和过阳离子交换层析柱之后，采用截留分子量为10kD的超滤膜对所述层析液进行超滤浓缩。
9.如权利要求8所述的重组人促卵泡激素的制备方法，其特征在于，
所述超滤浓缩得到浓缩液的浓度为0.8～1.5mg/mL。
10.如权利要求6所述的重组人促卵泡激素的制备方法，其特征在于，
所述上清液的浊度＜10NTU。
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