CN112143701A - 基于rna定点编辑的抑制脉络膜新生血管形成的方法及试剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于RNA定点编辑的抑制脉络膜新生血管形成的方法及试剂。本发明中，构建了用于递送CasRx以及针对血管内皮生长因子A(Vegfa)的gRNA的腺相关病毒，实现利用CasRx以及gRNA靶向性抑制高效精确地敲低Vegfa mRNA并抑制致病性脉络膜新生血管(CNV)的形成和发展。本发明获得的病毒可以持续有效地实现Vegfa mRNA的下调，作用时间长，稳定性好。

Description

基于RNA定点编辑的抑制脉络膜新生血管形成的方法及试剂

技术领域

本发明属于基因改造技术领域，更具体地，本发明涉及基于RNA定点编辑技术的抑制脉络膜新生血管形成的方法及试剂。

背景技术

年龄相关性黄斑变性(Age-related macular degeneration，AMD)，以脉络膜新生血管形成(choroidal neovascularization，CNV)的发展为特征，是50岁以上成人视力恶化的主要原因。其临床表现上，视力可以为正常或严重下降，主诉常为阅读困难，需要增加光照强度来帮助阅读；眼底表现为玻璃疣、局灶性色素增生、斑片状脱色素灶、地图状萎缩等。

血管生成生长因子血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factorA，VEGFA)在其中起关键作用。使用人源化抗体的抗VEGFA治疗已被在临床上用于治疗AMD，通过定期注射抗体来维持治疗效果。但是，临床上也发现了此类抗体的缺陷，就是抗体易于在体内发生降解，导致有效作用的时间短，需要相对较为频繁地进行给药，例如视病情需要1至几个月给药一次。频繁给药一方面增加了就医成本，另一方面也使得患者的依从性下降，这称为限制此类药物广泛运用的瓶颈。

为了改变这一状况，人们也试图以VEGFA作为调控靶点，在基因水平或蛋白水平上加以调控，来开发更为理想的药物。但是，鉴于脉络膜新生血管形成发生于眼睛这一器官，极易于产生副作用或不确定的风险，药物的研究更为困难。

综上，本领域还需要进行进一步的开发和研究，以获得靶向于VEGFA或其编码基因的更为有效的药物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于CRISPR系统的RNA靶向工具能够高效特异的靶向VEGFA基因，实现抑制脉络膜新生血管形成，达到预防和治疗黄斑病变的目的。

在本发明的第一方面，提供一种靶向性抑制细胞内血管内皮生长因子A的方法，包括：以腺相关病毒递送CasRx以及针对血管内皮生长因子A的gRNA至细胞内，从而靶向性抑制细胞内血管内皮生长因子A。

在一个优选例中，CasRx的表达盒中，CasRx编码基因的两端，还包括核定位信号序列。

在另一优选例中，CasRx的表达盒中，以EFS、CMV、CAG、CBH或EF1a作为启动子，驱动CasRx的表达；较佳地，以EFS作为启动子。

在另一优选例中，CasRx的表达盒中，包括如下操作性连接的序列元件：启动子序列，核定位信号1序列，CasRx编码核酸序列，核定位信号2序列；较佳地，在启动子序列的5’端，还包括5’末端反向重复序列；较佳地，在核定位信号2序列的3’端，还包括PolyA序列。

在另一优选例中，针对血管内皮生长因子A的gRNA的表达盒中，以U6作为启动子，驱动gRNA的表达。

在另一优选例中，所述针对血管内皮生长因子A的gRNA的表达盒中，包括如下操作性连接的序列元件：U6启动子，针对血管内皮生长因子A的gRNA；较佳地，在所述gRNA的3’端，还包括3’末端反向重复序列。

在另一优选例中，所述的CasRx具有如SEQ ID NO:1中第1699～4596位核苷酸序列或其简并序列所编码的多肽序列(也包括其同功能的变体或片段)。

在另一优选例中，所述的针对血管内皮生长因子A的gRNA靶向于以下血管内皮生长因子A中SEQ ID NO:9(AGACCCTGGTGGACATCTTCCAGGAGTACC)或SEQ ID NO:10(CACATAGGAGAGATGAGCTTCCTACAGCAC)所示序列的区段。

在另一优选例中，CasRx的编码序列以及针对血管内皮生长因子A的gRNA被组装在一个腺相关病毒载体中。

在另一优选例中，腺相关病毒的载体包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的CasRx的表达盒中包括SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的gRNA的表达盒中包括SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列和/或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的靶向性抑制细胞内血管内皮生长因子A表达的方法为非治疗性的方法。

在本发明的另一方面，提供表达CasRx以及针对血管内皮生长因子A的gRNA的重组载体，所述重组载体为腺相关病毒载体，包括CasRx的表达盒和血管内皮生长因子A的gRNA的表达盒。

在一个优选例中，所述的CasRx的表达盒中，CasRx编码基因的两端，还包括核定位信号序列；和/或以EFS、CMV、CAG、CBH或EF1a作为启动子，驱动CasRx的表达；更佳地，该表达盒中包括如下操作性连接的序列元件：启动子序列，核定位信号1序列，CasRx编码核酸序列，核定位信号2序列；较佳地，在启动子序列的5’端，还包括5’末端反向重复序列；较佳地，在核定位信号2序列的3’端，还包括PolyA序列。

在另一优选例中，所述的针对血管内皮生长因子A的gRNA的表达盒中，以U6作为启动子，驱动gRNA的表达；更佳地，该表达盒中，包括如下操作性连接的序列元件：U6启动子，针对血管内皮生长因子A的gRNA；较佳地，在所述gRNA的3’端，还包括3’末端反向重复序列。

在另一优选例中，所述的CasRx具有如SEQ ID NO:1中第1699～4596位核苷酸序列或其简并序列所编码的多肽序列(也包括其同功能的变体或片段)。

在另一优选例中，所述的针对血管内皮生长因子A的gRNA靶向于血管内皮生长因子A中SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示序列的区段。

在另一优选例中，CasRx的编码序列以及针对血管内皮生长因子A的gRNA被组装在一个腺相关病毒载体中；更佳地，腺相关病毒的载体包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序。

在本发明的另一方面，提供前述任一所述的重组载体的用途，用于包装重组病毒，所述重组病毒为重组腺相关病毒。

在本发明的另一方面，提供一种重组病毒，所述病毒为腺相关病毒，其由所述的重组载体包装而成。

在一个优选例中，所述的重组病毒用于制备靶向性抑制细胞内血管内皮生长因子A的试剂。

在另一优选例中，所述的重组病毒用于制备抑制脉络膜新生血管形成的药物或组合物。

在另一优选例中，所述的重组病毒用于制备缓解或治疗黄斑变性(如年龄相关性黄斑变性)的药物或组合物。

在本发明的另一方面，提供一种试剂盒或药盒，包括：所述的重组的病毒或所述的重组载体。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、使用CasRx击倒Vegfa。

(a)目的位点的示意图。CasRx靶向位点在人和小鼠Vegfa基因中是保守的。

(b，c)AAV载体的瞬时转染可有效地敲低人293T(n＝6个重复，p<0.001，t＝6.396)细胞和小鼠N2a细胞中的Vegfa(n＝3个重复，p＝0.012，t＝4.389)。

(d)通过ELISA试验检测细胞中VEGFA蛋白质水平(n＝6个重复，p<0.001，t＝9.675)。

所有值均表示为平均值±s.e.m；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，非配对t检验。

图2、AAV介导的CasRx递送减少了AMD小鼠模型中CNV的面积。

(a)一体化AAV载体和实验程序的示意图。在激光烧伤前21天，将AAV-CasRx-Vegfa玻璃体内注射到一只眼中，并将PBS注射到另一只眼中作为对照。AAV感染后3周，在没有激光烧伤的情况下分析Vegfa mRNA的转录水平。在激光烧伤后3天通过ELISA定量VEGFA蛋白水平。在激光烧伤后7天测量CasRx和Vegfa mRNA水平jm以及CNV面积。

(b)AAV注射后21天没有激光烧伤的Vegfa mRNA水平(n＝6只小鼠，p＝0.002，t＝4.059)。

(c，d)激光烧伤后7天的CasRx和Vegfa mRNA水平(CasRx mRNA：n＝3只小鼠；VegfamRNA：n＝3只小鼠，p＝0.002，t＝7.583)。

(e)CNV诱导后3天的VEGFA蛋白水平(n＝5只小鼠，p＝0.019，t＝2.928)。

(f)激光烧伤后7天用PBS或AAV-CasRx-Vegfa注射的代表性CNV图像。CNV的面积用黄线表示。比例尺：200μm。

(g)CNV区域。数据点表示激光烧伤，并且在每只眼睛中总共诱发4次激光烧伤。(180mW，n＝6只小鼠，p＝0.004，t＝3.079；240mW，n＝4只小鼠，p＝0.002，t＝3.39)。

所有值均表示为平均值±s.e.m；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，非配对t检验。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，构建了用于递送CasRx以及针对血管内皮生长因子A(Vegfa)的gRNA的腺相关病毒，实现利用CasRx以及gRNA靶向性抑制高效精确地敲低VegfamRNA并抑制致病性脉络膜新生血管(CNV)的形成和发展。本发明获得的病毒可以持续有效地实现Vegfa mRNA的下调，作用时间长，稳定性好。

如本文所用，所述的“元件”是指一些对于蛋白的表达有用的一系列功能性的核酸序列，本发明中，所述的“元件”被系统地构建以形成一种表达构建体。所述的“元件”的序列可以是本发明中所提供的那些，也包括它们的变体，只要这些变体基本上保留了所述“元件”的功能，其通过插入或删除一些碱基(如1-50bp；较佳地1-30bp，更佳地1-20bp，更佳地1-10bp)，或进行随机或定点突变等来获得。

如本文所用，所述的“操作性连接”或“可操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的基因所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、目的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。

如本文所用，所述的“构建物(或称构建体)”指一种已经通过人为干预，使其含有按照自然界中不存在的序列所组合和排列的DNA片段的单链或者双链DNA分子。所述的“构建物”包括表达载体；或者，所述的“构建物”被包含在表达载体中、作为表达载体的一部分。

如本文所用，所述“gRNA靶点”是指本发明中感兴趣的Vegfa mRNA中适于进行基因编辑操作的目标区域。

本发明人致力于抑制脉络膜新生血管新生的研究，前期研究过程中，考虑过在AMD动物模型中，通过spCas9等编辑诱导永久性Vegfa基因破坏；但是，由于这种编辑针对的是DNA水平上的，无法避免永久性DNA修饰相关的风险，包括不需要的脱靶和靶向效应；并且，本发明人还发现Cas9难以包装进AAV病毒中，编辑效率不够理想。经过广泛而深入的研究后，本发明人改进了前期方案，利用AAV递送CasRx以及针对Vegfa的gRNA，可高效精确地敲低Vegfa mRNA并抑制致病性脉络膜新生血管(CNV)的形成和发展。本发明的技术方案与其它基因编辑技术方案的不同点之一在于，本发明针对Vegfa的mRNA来进行抑制，而并非针对于DNA或蛋白质，这就避免了永久性DNA修饰的相关风险。

腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)是一种不能自我复制的病毒，具有较低的免疫原性。但是AAV病毒载体装载容量是受限的，这限制了其使用。本领域中，能够以AAV病毒进行成功转染的实例相对并不多。

AAV载体是利用天然存在的腺相关病毒某些特性经过基因工程改造后产生的一种可供人工转基因的载体。在本发明的优选方式中，对AAV载体进行了优化构建。

本发明中，针对Vegfa基因，给出了适用于进行靶向性操作的gRNA靶点，可实现针对Vegfa的高效精确的靶向性抑制作用，没有脱靶效应以及其它不良副作用。

作为本发明的优选方式，提供了表达CasRx的表达盒，包括如下操作性连接的序列元件：启动子，核定位信号1序列，CasRx编码核酸序列，核定位信号2序列；较佳地，在启动子序列的5’端，还包括5’末端反向重复序列；较佳地，在核定位信号2序列的3’端，还包括PolyA序列。所述的启动子可以是CMV，CAG，CBH，EF1a，EFS等。在更为优选的方式中，所述的启动子为EFS启动子，本发明人发现，将其应用于本发明中，不仅序列短小而且驱动基因表达的活性很理想，还可以选择性驱动CasRx的表达。

作为本发明的优选方式，提供了表达针对Vegfa的gRNA的表达盒中，包括如下操作性连接的序列元件：启动子，针对血管内皮生长因子A的gRNA；较佳地，在所述gRNA的3’端，还包括3’末端反向重复序列。在优选的方式中，所述的启动子为U6启动子。

作为本发明的优选方式，以精简的SV40 PolyA接在表达框之后，可以保证将目的包装系统缩小到最小的范围，有效减小病毒的包装难度，提高AAV的包装效率。

作为本发明的优选方式，采用guide-1和guide-2串联的形式，能够有效提高编辑效率。

在本发明的优选实施例方式中，所述的表达CasRx的表达盒与了表达针对Vegfa的gRNA的表达盒被置于同一个AAV表达载体中，用于进行病毒的包装。本发明人的优化设计，克服了AAV包装容量低下的问题，成功地将两组表达盒有机地整合于一个表达载体中，有助于简化后续操作流程，给药方案简单易操作。

根据本发明中所提供的各个元件的信息，进行了适当的变化且仍然保留其原有功能的上述元件的变异体也包括在本发明中。例如，在严格条件下与本发明限定的序列杂交且具有相同功能的序列变异体。如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在70％以上、更佳地75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。例如，所述序列也可为这些所限定序列的互补序列。

本发明的各元件所指向的基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

所述的载体中上述元件的上游以及下游的位置，还可包括限制性的酶切位点，这样有利于各元件的有机连接。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于进行病毒的包装。

在本发明的具体实施例中，将包装好的表达CasRx、gRNA的AAV病毒进行动物模型眼睛玻璃体内注射，成功地在动物眼中减少CNV的面积，效果特别显著严重。

本发明还提供了本发明还提供了一种组合物(如药物组合物)，它含有有效量(如0.000001-50wt％；较佳的0.00001-20wt％；更佳的，0.0001-10wt％)的本发明包装获得的腺相关病毒，以及药学上可接受的载体。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的如本文所用。如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

通常，可将所述腺病毒配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。活性成分(腺病毒)的给药量是治疗有效量，这是熟练医师技能范围之内的。

在应用时，所述的腺相关病毒可全身性施用，或者局部施用。本发明中，优选地为局部施用，特别是玻璃体内注射。

本发明还提供了包含有所述表达CasRx的表达盒与了表达针对Vegfa的gRNA的表达盒的表达载体或由所述载体包装而成的病毒的试剂盒/药盒。

其它常用于进行病毒包装、转染、注射等的试剂也可被包含在所述的试剂盒/药盒中，以方便本领域技术人员使用。此外，所述试剂盒中还可包含有指导本领域技术人员操作的使用说明书。

本发明的技术方案，论证了RNA靶向CRISPR系统用于体内基因治疗的可实施性，为临床上VEGFA高表达导致的脉络膜新生血管形成、黄斑变性(如年龄相关性黄斑变性)提供了有效的、精确的新型治疗工具。

脉络膜新生血管形成目前治疗的方案是通过单克隆抗体或者抑制剂等方式进行治疗，具有持续时间短的特点。本发明中首次使用AAV来运载高效精确的RNA编辑工具来靶向VEGFA，达到治疗的效果能够数年之久。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

道德合规

动物的使用和护理符合中国科学院神经科学研究所生物医学研究伦理委员会的指导原则。

gRNA序列：

gRNA-1：5’-gtgctgtaggaagctctctctcctatgtg-3’；

gRNA-2：5’-ggtactcctggaagatgtccaccagggtct-3’。

质粒构建

(1)构建CasRx质粒

采用pcDNA3.1作为骨架质粒，在其中添加多克隆位点以及CAG启动子，获得pCAG-EGFP质粒，之后，在其中依次克隆入SV40NLS1、CasRx、SV40NLS2、P2A、GFP、WPRE、BGH PolyA元件，从而获得pCAG-SV40NLS1-CasRx-SV40NLS2-P2A-GFP-WPRE-PolyA质粒。序列通过密码子优化，通过上海华津生物有限公司进行基因合成。

各个元件的编码序列为：

SEQ ID NO:1中第1～1648位为pCAG启动子序列；

SV40NLS1：SEQ ID NO:1中第1669～1689位序列；

CasRx：SEQ ID NO:1中第1699～4596位序列；

SV40NLS2：SEQ ID NO:1中第4612～4632位序列；

P2A：SEQ ID NO:1中第4639～4695位序列；

GFP：SEQ ID NO:1中第4702～5421位序列；

WPRE：SEQ ID NO:1中第5433～6021位序列；

PolyA：SEQ ID NO:1中第6042～6249位序列。

pCAG-SV40NLS1-CasRx-SV40NLS2-P2A-GFP-WPRE-PolyA的核苷酸序列见SEQ IDNO:1。

(2)构建gRNA-1质粒

通过基因合成获得U6-gRNA质粒，该质粒中依次包括U6、DR1、guide1、DR2、CMV启动子(pCMV)、mCherry、WPRE、PolyA元件，从而获得U6-DR1-guide 1-DR2-pCMV-mCherry-WPRE-PolyA质粒。各个元件的编码序列为：

U6：SEQ ID NO:2中第1～241位序列；

DR1：SEQ ID NO:2中第257～282位序列；

guide 1：SEQ ID NO:2中第287～316位序列；

DR2：SEQ ID NO:2中第323～359位序列；

pCMV：SEQ ID NO:2中第365～872位序列；

mCherry：SEQ ID NO:2中第906～1616位序列；

WPRE：SEQ ID NO:2中第1617～2204位序列；

PolyA：SEQ ID NO:2中第2246～2471位序列。

U6-DR1-guide1-DR2-pCMV-mCherry-WPRE-PolyA的核苷酸序列见SEQ ID NO:2。其中，DR1、DR2用作引导CasRx靶向目的RNA。

(3)构建gRNA-2质粒

通过基因合成获得U6-gRNA质粒，该质粒中依次包括U6、DR1、guide2、DR2、CMV启动子(pCMV)、mCherry、WPRE、PolyA元件，从而获得U6-DR1-guide 2-DR2-pCMV-mCherry-WPRE-PolyA质粒。各个元件的编码序列为：

U6：SEQ ID NO:3中第1～241位序列；

DR1：SEQ ID NO:3中第257～282位序列；

guide 2：SEQ ID NO:3中第287～316位序列；

DR2：SEQ ID NO:3中第323～359位序列；

pCMV：SEQ ID NO:3中第365～872位序列；

mCherry：SEQ ID NO:3中第906～1616位序列；

WPRE：SEQ ID NO:3中第1617～2204位序列；

PolyA：SEQ ID NO:3中第2246～2471位序列。

U6-DR1-guide2-DR2-pCMV-mCherry-WPRE-PolyA质粒的核苷酸序列见SEQ ID NO:3。其中，DR1、DR2用作引导CasRx靶向目的RNA。

(4)构建U6-gRNA-pCMV-mCherry-PolyA质粒

从前述U6-DR1-guide2-DR2-pCMV-mCherry-WPRE-PolyA质粒中获取串联DR1-guide2-DR2的元件，插入到U6-DR1-guide1-DR2-pCMV-mCherry-WPRE-PolyA质粒的pCMV元件之前，获得U6-gRNA-pCMV-mCherry-PolyA质粒。

(5)构建AAV-CasRx-Vegfa质粒

利用购自Addgene公司的AAV质粒(#60231)，在其中依次克隆入ITR、EFS、SV40NLS1、CasRx、HA、SV40NLS2、SV40 PolyA、U6、DR1、guide1、DR2、guide2、DR3、ITR元件，从而获得ITR-EFS-SV40NLS1-CasRx-HA-SV40NLS2-SV40PolyA-U6-DR1-guide1-DR2-guide2-DR3-ITR质粒。各个元件的编码序列为：

ITR：SEQ ID NO:4中第1～130位序列；

EFS：SEQ ID NO:4中第143～398位序列；

SV40NLS1：SEQ ID NO:4中第414～434位序列；

CasRx：SEQ ID NO:4中第444～3341位序列；

HA：SEQ ID NO:4中第3351～3377位序列；

SV40NLS2：SEQ ID NO:4中第3378～3398位序列；

SV40 PolyA：SEQ ID NO:4中第3414～3548位序列；

U6：SEQ ID NO:4中第3555～3795位序列；

DR1：SEQ ID NO:4中第3805～3834位序列；

guide1：SEQ ID NO:4中第3835～3864位序列；

DR2：SEQ ID NO:4中第3865～3900位序列；

guide2：SEQ ID NO:4中第3901～3930位序列；

DR3：SEQ ID NO:4中第3931～3973位序列；

ITR：SEQ ID NO:4中第3998～4138位序列。

ITR-EFS-SV40NLS1-CasRx-HA-SV40NLS2-SV40PolyA-U6-DR1-guide1-DR2-guide2-DR3-ITR质粒的核苷酸序列见SEQ ID NO:4。

瞬时转染和qPCR

进行质粒瞬时转染。将293T和N2a细胞在含有10％胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养，并在37℃下用5％CO2维持。将细胞接种在6孔板中，并使用Lipofectamine 3000试剂(Thermo Fisher Scientific)用表达CasRx和gRNA的4μg/孔载体(CasRx：gRNA-1：gRNA-2＝2：1：1，参见补充序列)转染。

对照组仅用含有CasRx的2μg/孔载体转染。在转染后3天，使用流式细胞术分离GFP+mCherry+细胞(对照组的GFP+细胞)。首先使用Trizol(Ambion)纯化总RNA，然后转录成互补DNA(用于qPCR的HiScript Q RT SuperMix，Vazyme，Biotech)。通过SYBR绿色探针(AceQqPCR SYBR Green Master Mix，Vazyme，Biotech)追踪qPCR反应。

VEGFA qPCR引物：

正向：5’-GGTGGACATCTTCCAGGAGT-3’(SEQ ID NO:5)；

反向：5’-TGATCTGCATGGTAGATGTTG-3’(SEQ ID NO:6)。

CasRx qPCR引物：

正向：5’-CCCTGGTGTCCGGCTCTAA-3’(SEQ ID NO:7)；

反向：5’-GGACTCGCCGAAGTACCTCT-3’(SEQ ID NO:8)。

AAV生产和玻璃体内注射

通过使用聚乙烯亚胺(PEI)(50μg/ml)转染HEK293T细胞来包装AAV-CasRx-Vegfa(AAV-PHP.eb capsid)[Chan,K.Y.et al.Engineered AAVs for efficient noninvasivegene delivery to the central and peripheral nervous systems.Natureneuroscience 20,1172-1179,doi:10.1038/nn.4593(2017)]。在三次转染后3-7天收获，纯化和浓缩病毒。将6-8周龄的小鼠(C57BL/6)麻醉用于玻璃体内注射。在Olympus显微镜(Olympus，Tokyo，Japan)下使用带有34G针的Hamilton注射器玻璃体内注射AAV-CasRx-Vegfa(在1μl中7.5×10⁹个病毒基因组)或PBS玻璃体内注射。排除具有视网膜出血的小鼠。

激光诱导的CNV模型和CNV染色

在AAV注射后2-3周，将小鼠用于激光烧伤，诱导CNV模型[Gong,Y.etal.Optimization of an Image-Guided Laser-Induced Choroidal NeovascularizationModel in Mice.Plos One 10,doi:ARTN e013264310.1371/journal.pone.0132643(2015)]。简言之，将小鼠麻醉并用扩张滴眼剂扩张瞳孔以扩大瞳孔大小。使用NOVUSSpectra(LUMENIS)进行激光光凝固。本发明中使用的激光参数为：532nm波长，70ms曝光时间，180mW或240mW功率和50μm光斑尺寸。诱导了在视盘周围的4次激光烧伤(用于ELISA的30次激光烧伤)。在研究中排除了玻璃体出血的小鼠。激光诱导3天后，用盐水灌注小鼠，解离RPE复合物用于ELISA分析(激光烧伤后7天进行qPCR)。激光烧伤后7天进行CNV分析。用PFA灌注小鼠，然后用PFA固定眼睛2小时。从眼睛中取出视网膜，并且仅用同工凝集素-B4(IB4，10μg/ml，I21413，Life Technologies)将RPE/脉络膜/巩膜复合物染色过夜。将RPE复合物平放并用共聚焦显微镜(VS120 Olympus)观察。仅包括具有成功的AAV-CasRx-Vegfa感染的眼睛用于定量。在获得CNV图像后，从RPE复合物中提取DNA，通过qPCR评估CasRx的拷贝数。CNV的区域由盲人观察者使用ImageJ软件量化。

ELISA

收集RPE复合物用于ELISA。为了进行VEGFA ELISA，在AAV注射后3周，在每只眼睛中诱导30次激光烧伤。诱导后3天将眼睛摘出，将RPE复合物从视网膜上解离并用RPA裂解。根据标准方案，使用Quantikine ELISA试剂盒(MMV00，R&D SYSTEMS)测定VEGFA蛋白水平。

统计分析

所有值均以平均值±s.e.m表示。统计显著性(p<0.05)由未配对的双尾学生t检验确定。

实施例1、靶向性下调VEGFA位点及效果

经过选择及试验，鉴定了适用于本发明的靶向性操作的CasRx靶向位点。并且，该靶向位点在人和小鼠Vegfa基因中保守的CasRx靶向位点。本发明人分别设计了针对这两个位点的两种指导RNA(guide RNA，gRNA)(图1a)，实现有效的Vegfa mRNA敲低。

以人293T细胞和小鼠N2a细胞来研究本发明的靶向性操作的有效性。首先进行mRNA水平的考察，将前述构建的pCAG-SV40NLS1-CasRx-SV40NLS2-P2A-GFP-WPRE-PolyA质粒和U6-gRNA-pCMV-mCherry-PolyA质粒进行共转瞬时共转染到人293T细胞或小鼠N2a细胞中。

结果，本发明人发现，与用对照载体转染的细胞相比，瞬时转染表达CasRx和gRNA的载体导致培养的人293T细胞(36+/-4％，sem)和小鼠N2a细胞(31+/-9％，sem)中VegfamRNA水平显著降低(图1b，c)。

进行蛋白水平的考察，结果显示，在小鼠N2a细胞中VEGFA蛋白水平也显著降低(图1d)。

实施例2、腺相关病毒(AAV)介导的CasRx递送减少CNV的面积

为了研究CasRx在正常小鼠视网膜中的敲低效率，本发明人在小鼠眼睛的玻璃体内注射编码CasRx的AAV和靶向Vegfa的双gRNA阵列(称为AAV-CasRx-Vegfa)，并观测其对CNV面积的影响作用。AAV-CasRx-Vegfa重组质粒的构建示意图如图2a中左图所示、注射以及检测的操作流程如图2a中右图所示。

注射后3周，分离脉络膜-视网膜色素上皮(RPE)组织复合物用于qPCR分析(图2a)。本发明人发现，与注射PBS的对侧眼相比，治疗眼中的Vegfa转录物被有效抑制(图2b)。

本发明人接下来通过激光照射在两只眼睛中诱导CNV来创建AMD小鼠。为了研究mRNA敲低方法治疗AMD的潜在用途，本发明人将AAV-CasRx-Vegfa注射到小鼠的一只眼中，将另一只眼中的PBS注射作为对照(图2a)。3周后在两只眼睛中进行CNV的诱导。激光烧伤后，本发明人证实AAV-CasRx-Vegfa成功感染(图2c)。此外，本发明人发现注射AAV的眼睛中Vegfa mRNA和VEGFA蛋白的水平显著低于注射对侧PBS的眼睛中的那些(mRNA，22.7+/-1.8％sem，p＝0.002；蛋白质，68.2+/-8.7％，sem，p＝0.019；非配对t-检验)(图2d-e)。因此，玻璃体内注射Vegfa mRNA靶向AAV对于注射的眼中的VEGFA表达是有效的。

通过在激光治疗后7天量化CNV面积来评估该CasRx方法的治疗效果。本发明人的结果显示，与注射PBS的对照眼相比，Vegfa靶向AAV显著降低了两种不同激光照射水平的CNV面积。在激光参数为180mW功率情况下，CasRx组为PBS组CNV面积的66+/-7.8％，sem，n＝6只小鼠，p＝0.004；在激光参数为240mW功率的情况下，CasRx组仅为PBS组CNV面积的36.5+/-6.9％，sem，n＝4只小鼠，p＝0.002(非配对t-检验)。

同时，本发明人针对转染的动物模型进行阶段性观测，未观测到脱靶效应导致的副作用以及其它可见的副作用。

总之，本发明人的结果表明，AAV介导的CasRx递送可以高效精确地敲低VegfamRNA并抑制AMD小鼠模型中的致病性CNV发展，支持RNA靶向CRISPR系统可用于治疗目的的观点。CasRx适合于在单个AAV载体中包含多个gRNA用于体内递送。

AAV提供的CasRx具有对单次注射长达2年的蛋白质表达持续矫正效果的潜力。这就使得与mRNA编辑相关的风险会显著地低于DNA编辑的风险，因为存在大量的转录本，其中许多可能维持正常的功能。

因此，CasRx敲低方法可以补充现有的治疗策略，例如单克隆抗体，反义寡核苷酸和DNA核酸酶编辑。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 基于RNA定点编辑的抑制脉络膜新生血管形成的方法及试剂

<130> 193861

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6249

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(6249)

<223> CasRx 质粒pCAG-SV40 NLS-CasRx-SV40 NLS-P2A-GFP-WPRE-PolyA

<400> 1

ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc 60

aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 120

ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 180

gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 240

cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt 300

cgaggtgagc cccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc cacccccaat 360

tttgtattta tttatttttt aattattttg tgcagcgatg ggggcggggg gggggggggg 420

gcgcgcgcca ggcggggcgg ggcggggcga ggggcggggc ggggcgaggc ggagaggtgc 480

ggcggcagcc aatcagagcg gcgcgctccg aaagtttcct tttatggcga ggcggcggcg 540

gcggcggccc tataaaaagc gaagcgcgcg gcgggcgggg agtcgctgcg acgctgcctt 600

cgccccgtgc cccgctccgc cgccgcctcg cgccgcccgc cccggctctg actgaccgcg 660

ttactcccac aggtgagcgg gcgggacggc ccttctcctc cgggctgtaa ttagcgcttg 720

gtttaatgac ggcttgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa gccttgaggg gctccgggag 780

ggccctttgt gcggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg tgtgtgtgtg cgtggggagc 840

gccgcgtgcg gctccgcgct gcccggcggc tgtgagcgct gcgggcgcgg cgcggggctt 900

tgtgcgctcc gcagtgtgcg cgaggggagc gcggccgggg gcggtgcccc gcggtgcggg 960

gggggctgcg aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt gcgtgggggg gtgagcaggg 1020

ggtgtgggcg cgtcggtcgg gctgcaaccc cccctgcacc cccctccccg agttgctgag 1080

cacggcccgg cttcgggtgc ggggctccgt acggggcgtg gcgcggggct cgccgtgccg 1140

ggcggggggt ggcggcaggt gggggtgccg ggcggggcgg ggccgcctcg ggccggggag 1200

ggctcggggg aggggcgcgg cggcccccgg agcgccggcg gctgtcgagg cgcggcgagc 1260

cgcagccatt gccttttatg gtaatcgtgc gagagggcgc agggacttcc tttgtcccaa 1320

atctgtgcgg agccgaaatc tgggaggcgc cgccgcaccc cctctagcgg gcgcggggcg 1380

aagcggtgcg gcgccggcag gaaggaaatg ggcggggagg gccttcgtgc gtcgccgcgc 1440

cgccgtcccc ttctccctct ccagcctcgg ggctgtccgc ggggggacgg ctgccttcgg 1500

gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga ccggcggctc tagagcctct 1560

gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt gctggttatt 1620

gtgctgtctc atcattttgg caaagaattg gaattcgccg ccaccatgcc taaaaagaaa 1680

agaaaggtgg gttctggtat cgagaagaag aagagcttcg ccaagggcat gggagtgaag 1740

agcaccctgg tgtccggctc taaggtgtac atgaccacat ttgctgaggg aagcgacgcc 1800

aggctggaga agatcgtgga gggcgatagc atcagatccg tgaacgaggg agaggctttc 1860

agcgccgaga tggctgacaa gaacgctggc tacaagatcg gaaacgccaa gttttcccac 1920

ccaaagggct acgccgtggt ggctaacaac ccactgtaca ccggaccagt gcagcaggac 1980

atgctgggac tgaaggagac actggagaag aggtacttcg gcgagtccgc cgacggaaac 2040

gataacatct gcatccaggt catccacaac atcctggata tcgagaagat cctggctgag 2100

tacatcacaa acgccgctta cgccgtgaac aacatctccg gcctggacaa ggatatcatc 2160

ggcttcggaa agttttctac cgtgtacaca tacgacgagt tcaaggatcc agagcaccac 2220

cgggccgctt ttaacaacaa cgacaagctg atcaacgcca tcaaggctca gtacgacgag 2280

ttcgataact ttctggataa ccccaggctg ggctacttcg gacaggcttt cttttctaag 2340

gagggcagaa actacatcat caactacgga aacgagtgtt acgacatcct ggccctgctg 2400

agcggactga ggcactgggt ggtgcacaac aacgaggagg agtctcggat cagccgcacc 2460

tggctgtaca acctggacaa gaacctggat aacgagtaca tctccacact gaactacctg 2520

tacgacagga tcaccaacga gctgacaaac agcttctcca agaactctgc cgctaacgtg 2580

aactacatcg ctgagaccct gggcatcaac ccagctgagt tcgctgagca gtacttcaga 2640

ttttccatca tgaaggagca gaagaacctg ggcttcaaca tcacaaagct gagagaagtg 2700

atgctggaca gaaaggatat gtccgagatc aggaagaacc acaaggtgtt cgattctatc 2760

agaaccaagg tgtacacaat gatggacttt gtgatctaca ggtactacat cgaggaggat 2820

gccaaggtgg ccgctgccaa caagagcctg cccgacaacg agaagtctct gagcgagaag 2880

gatatcttcg tgatcaacct gagaggctcc tttaacgacg atcagaagga cgctctgtac 2940

tacgatgagg ccaacaggat ctggagaaag ctggagaaca tcatgcacaa catcaaggag 3000

ttccggggaa acaagacccg cgagtacaag aagaaggacg ctccaaggct gcctaggatc 3060

ctgcctgctg gaagggacgt gagcgccttc agcaagctga tgtacgccct gacaatgttt 3120

ctggacggaa aggagatcaa cgatctgctg accacactga tcaacaagtt cgacaacatc 3180

cagtcttttc tgaaagtgat gcctctgatc ggcgtgaacg ctaagttcgt ggaggagtac 3240

gccttcttta aggacagcgc caagatcgct gatgagctgc ggctgatcaa gtcctttgcc 3300

aggatgggag agccaatcgc tgacgctagg agagctatgt acatcgatgc catccggatc 3360

ctgggaacca acctgtctta cgacgagctg aaggctctgg ccgacacctt cagcctggat 3420

gagaacggca acaagctgaa gaagggcaag cacggaatgc gcaacttcat catcaacaac 3480

gtgatcagca acaagcggtt tcactacctg atcagatacg gcgacccagc tcacctgcac 3540

gagatcgcta agaacgaggc cgtggtgaag ttcgtgctgg gacggatcgc cgatatccag 3600

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aaggataagg gaaagtccgt gtctgagaag gtggacgctc tgaccaagat catcacaggc 3720

atgaactacg accagttcga taagaagaga tctgtgatcg aggacaccgg aagggagaac 3780

gccgagagag agaagtttaa gaagatcatc agcctgtacc tgacagtgat ctaccacatc 3840

ctgaagaaca tcgtgaacat caacgctaga tacgtgatcg gcttccactg cgtggagcgc 3900

gatgcccagc tgtacaagga gaagggatac gacatcaacc tgaagaagct ggaggagaag 3960

ggctttagct ccgtgaccaa gctgtgcgct ggaatcgacg agacagcccc cgacaagagg 4020

aaggatgtgg agaaggagat ggccgagaga gctaaggaga gcatcgactc cctggagtct 4080

gctaacccta agctgtacgc caactacatc aagtactccg atgagaagaa ggccgaggag 4140

ttcaccaggc agatcaacag agagaaggcc aagaccgctc tgaacgccta cctgaggaac 4200

acaaagtgga acgtgatcat ccgggaggac ctgctgcgca tcgataacaa gacctgtaca 4260

ctgttccgga acaaggctgt gcacctggag gtggctcgct acgtgcacgc ctacatcaac 4320

gacatcgccg aggtgaactc ctactttcag ctgtaccact acatcatgca gaggatcatc 4380

atgaacgaga gatacgagaa gtctagcggc aaggtgtctg agtacttcga cgccgtgaac 4440

gatgagaaga agtacaacga tagactgctg aagctgctgt gcgtgccttt cggatactgt 4500

atcccacggt ttaagaacct gagcatcgag gccctgttcg accgcaacga ggctgccaag 4560

tttgataagg agaagaagaa ggtgagcggc aactccggtt ctggtctcga gcccaagaag 4620

aagaggaaag tcctcgaggc tactaacttc agcctgctga agcaggctgg agacgtggag 4680

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tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct 6000

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tgctgggga 6249

<210> 2

<211> 2471

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2471)

<223> gRNA-1 质粒U6-DR-guide 1-DR-pCMV-mCherry-WPRE-PolyA

<400> 2

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg caagtaaacc cctaccaact ggtcggggtt tgaaacggta ctcctggaag 300

atgtccacca gggtctcaag taaaccccta ccaactggtc ggggtttgaa actttttttg 360

tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc 420

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ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca ccaatgggcg tggatagcgg tttgactcac 720

ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc 780

aacgggactt tccaaaatgt cgtaataacc ccgccccgtt gacgcaaatg ggcggtaggc 840

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cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg cgtctccgcc 2160

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ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa 2340

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gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg 2460

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<210> 3

<211> 2471

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2471)

<223> gRNA-2 质粒U6-DR-guide 2-DR-pCMV-mCherry-WPRE-PolyA

<400> 3

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

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atgtccacca gggtctcaag taaaccccta ccaactggtc ggggtttgaa actttttttg 360

tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc 420

cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac 480

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tgccaagtcc gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc 600

agtacatgac cttacgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 660

ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca ccaatgggcg tggatagcgg tttgactcac 720

ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc 780

aacgggactt tccaaaatgt cgtaataacc ccgccccgtt gacgcaaatg ggcggtaggc 840

gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag gtcgtttagt gaaccgtcag atcacgcgtg 900

ccaccatggt gagcaagggc gaggaggata acatggccat catcaaggag ttcatgcgct 960

tcaaggtgca catggagggc tccgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg 1020

agggccgccc ctacgagggc acccagaccg ccaagctgaa ggtgaccaag ggtggccccc 1080

tgcccttcgc ctgggacatc ctgtcccctc agttcatgta cggctccaag gcctacgtga 1140

agcaccccgc cgacatcccc gactacttga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg 1200

agcgcgtgat gaacttcgag gacggcggcg tggtgaccgt gacccaggac tcctccctgc 1260

aggacggcga gttcatctac aaggtgaagc tgcgcggcac caacttcccc tccgacggcc 1320

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acggcgccct gaagggcgag atcaagcaga ggctgaagct gaaggacggc ggccactacg 1440

acgctgaggt caagaccacc tacaaggcca agaagcccgt gcagctgccc ggcgcctaca 1500

acgtcaacat caagttggac atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggaacagt 1560

acgaacgcgc cgagggccgc cactccaccg gcggcatgga cgagctgtac aagtaaaatc 1620

aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat gttgctcctt 1680

ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg 1740

ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag gagttgtggc 1800

ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc cccactggtt 1860

ggggcattgc caccacctgt cagctccttt ccgggacttt cgctttcccc ctccctattg 1920

ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct cggctgttgg 1980

gcactgacaa ttccgtggtg ttgtcgggga agctgacgtc ctttccatgg ctgctcgcct 2040

gtgttgccac ctggattctg cgcgggacgt ccttctgcta cgtcccttcg gccctcaatc 2100

cagcggacct tccttcccgc ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg cgtctccgcc 2160

ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt ggccgcctcc ccgccaccgg ttaggggccc 2220

gtttaaaccc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc 2280

ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa 2340

aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg 2400

gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg 2460

ggctctatgg c 2471

<210> 4

<211> 4138

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(4138)

<223> AAV-CasRx-Vegfa质粒ITR-EFS-SV40 NLS-CasRx-HA-SV40 NLS-SV40 PolyA-U6-DR-guide1-DR-guide 2-DR-ITR

<400> 4

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct gcggcctcta gataggtctt gaaaggagtg ggaattggct ccggtgcccg 180

tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt ccccgagaag ttggggggag gggtcggcaa 240

ttgatccggt gcctagagaa ggtggcgcgg ggtaaactgg gaaagtgatg tcgtgtactg 300

gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga accgtatata agtgcagtag tcgccgtgaa 360

cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag aacacaggac cggtgccacc atgcctaaaa 420

agaaaagaaa ggtgggttct ggtatcgaga agaagaagag cttcgccaag ggcatgggag 480

tgaagagcac cctggtgtcc ggctctaagg tgtacatgac cacatttgct gagggaagcg 540

acgccaggct ggagaagatc gtggagggcg atagcatcag atccgtgaac gagggagagg 600

ctttcagcgc cgagatggct gacaagaacg ctggctacaa gatcggaaac gccaagtttt 660

cccacccaaa gggctacgcc gtggtggcta acaacccact gtacaccgga ccagtgcagc 720

aggacatgct gggactgaag gagacactgg agaagaggta cttcggcgag tccgccgacg 780

gaaacgataa catctgcatc caggtcatcc acaacatcct ggatatcgag aagatcctgg 840

ctgagtacat cacaaacgcc gcttacgccg tgaacaacat ctccggcctg gacaaggata 900

tcatcggctt cggaaagttt tctaccgtgt acacatacga cgagttcaag gatccagagc 960

accaccgggc cgcttttaac aacaacgaca agctgatcaa cgccatcaag gctcagtacg 1020

acgagttcga taactttctg gataacccca ggctgggcta cttcggacag gctttctttt 1080

ctaaggaggg cagaaactac atcatcaact acggaaacga gtgttacgac atcctggccc 1140

tgctgagcgg actgaggcac tgggtggtgc acaacaacga ggaggagtct cggatcagcc 1200

gcacctggct gtacaacctg gacaagaacc tggataacga gtacatctcc acactgaact 1260

acctgtacga caggatcacc aacgagctga caaacagctt ctccaagaac tctgccgcta 1320

acgtgaacta catcgctgag accctgggca tcaacccagc tgagttcgct gagcagtact 1380

tcagattttc catcatgaag gagcagaaga acctgggctt caacatcaca aagctgagag 1440

aagtgatgct ggacagaaag gatatgtccg agatcaggaa gaaccacaag gtgttcgatt 1500

ctatcagaac caaggtgtac acaatgatgg actttgtgat ctacaggtac tacatcgagg 1560

aggatgccaa ggtggccgct gccaacaaga gcctgcccga caacgagaag tctctgagcg 1620

agaaggatat cttcgtgatc aacctgagag gctcctttaa cgacgatcag aaggacgctc 1680

tgtactacga tgaggccaac aggatctgga gaaagctgga gaacatcatg cacaacatca 1740

aggagttccg gggaaacaag acccgcgagt acaagaagaa ggacgctcca aggctgccta 1800

ggatcctgcc tgctggaagg gacgtgagcg ccttcagcaa gctgatgtac gccctgacaa 1860

tgtttctgga cggaaaggag atcaacgatc tgctgaccac actgatcaac aagttcgaca 1920

acatccagtc ttttctgaaa gtgatgcctc tgatcggcgt gaacgctaag ttcgtggagg 1980

agtacgcctt ctttaaggac agcgccaaga tcgctgatga gctgcggctg atcaagtcct 2040

ttgccaggat gggagagcca atcgctgacg ctaggagagc tatgtacatc gatgccatcc 2100

ggatcctggg aaccaacctg tcttacgacg agctgaaggc tctggccgac accttcagcc 2160

tggatgagaa cggcaacaag ctgaagaagg gcaagcacgg aatgcgcaac ttcatcatca 2220

acaacgtgat cagcaacaag cggtttcact acctgatcag atacggcgac ccagctcacc 2280

tgcacgagat cgctaagaac gaggccgtgg tgaagttcgt gctgggacgg atcgccgata 2340

tccagaagaa gcagggccag aacggaaaga accagatcga ccgctactac gagacctgca 2400

tcggcaagga taagggaaag tccgtgtctg agaaggtgga cgctctgacc aagatcatca 2460

caggcatgaa ctacgaccag ttcgataaga agagatctgt gatcgaggac accggaaggg 2520

agaacgccga gagagagaag tttaagaaga tcatcagcct gtacctgaca gtgatctacc 2580

acatcctgaa gaacatcgtg aacatcaacg ctagatacgt gatcggcttc cactgcgtgg 2640

agcgcgatgc ccagctgtac aaggagaagg gatacgacat caacctgaag aagctggagg 2700

agaagggctt tagctccgtg accaagctgt gcgctggaat cgacgagaca gcccccgaca 2760

agaggaagga tgtggagaag gagatggccg agagagctaa ggagagcatc gactccctgg 2820

agtctgctaa ccctaagctg tacgccaact acatcaagta ctccgatgag aagaaggccg 2880

aggagttcac caggcagatc aacagagaga aggccaagac cgctctgaac gcctacctga 2940

ggaacacaaa gtggaacgtg atcatccggg aggacctgct gcgcatcgat aacaagacct 3000

gtacactgtt ccggaacaag gctgtgcacc tggaggtggc tcgctacgtg cacgcctaca 3060

tcaacgacat cgccgaggtg aactcctact ttcagctgta ccactacatc atgcagagga 3120

tcatcatgaa cgagagatac gagaagtcta gcggcaaggt gtctgagtac ttcgacgccg 3180

tgaacgatga gaagaagtac aacgatagac tgctgaagct gctgtgcgtg cctttcggat 3240

actgtatccc acggtttaag aacctgagca tcgaggccct gttcgaccgc aacgaggctg 3300

ccaagtttga taaggagaag aagaaggtga gcggcaactc cggttctggt tacccatacg 3360

acgtaccaga ttacgctccc aagaagaagc gcaaggtggg ataaagatcc taaaacttgt 3420

ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag 3480

catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg 3540

tctggatcgc ggccgagggc ctatttccca tgattccttc atatttgcat atacgataca 3600

aggctgttag agagataatt ggaattaatt tgactgtaaa cacaaagata ttagtacaaa 3660

atacgtgacg tagaaagtaa taatttcttg ggtagtttgc agttttaaaa ttatgtttta 3720

aaatggacta tcatatgctt accgtaactt gaaagtattt cgatttcttg gctttatata 3780

tcttgtggaa aggacgaaac accgaacccc taccaactgg tcggggtttg aaacggtact 3840

cctggaagat gtccaccagg gtctcaagta aacccctacc aactggtcgg ggtttgaaac 3900

gtgctgtagg aagctcatct ctcctatgtg caagtaaacc cctaccaact ggtcggggtt 3960

tgaaactttt tttgaattct gatgcggtgg cggccgcagg aacccctagt gatggagttg 4020

gccactccct ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga 4080

cgcccgggct ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagctg cctgcagg 4138

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

ggtggacatc ttccaggagt 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

tgatctgcat ggtagatgtt g 21

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

ccctggtgtc cggctctaa 19

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 8

ggactcgccg aagtacctct 20

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 多核苷酸(Nucletide)

<400> 9

agaccctggt ggacatcttc caggagtacc 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 多核苷酸(Nucletide)

<400> 10

cacataggag agatgagctt cctacagcac 30

Claims (16)

1.一种靶向性抑制细胞内血管内皮生长因子A的方法，其特征在于，包括：以腺相关病毒递送CasRx以及针对血管内皮生长因子A的gRNA至细胞内，从而靶向性抑制细胞内血管内皮生长因子A。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，CasRx的表达盒中，CasRx编码基因的两端，还包括核定位信号序列；或

CasRx的表达盒中，以EFS、CMV、CAG、CBH或EF1a作为启动子，驱动CasRx的表达；较佳地，以EFS作为启动子。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，包括如下操作性连接的序列元件：启动子序列，核定位信号1序列，CasRx编码核酸序列，核定位信号2序列；较佳地，在启动子序列的5’端，还包括5’末端反向重复序列；较佳地，在核定位信号2序列的3’端，还包括PolyA序列。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，针对血管内皮生长因子A的gRNA的表达盒中，以U6作为启动子，驱动gRNA的表达。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述针对血管内皮生长因子A的gRNA的表达盒中，包括如下操作性连接的序列元件：U6启动子，针对血管内皮生长因子A的gRNA；较佳地，在所述gRNA的3’端，还包括3’末端反向重复序列。

6.如权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，所述的CasRx具有如SEQ ID NO:1中第1699～4596位核苷酸序列或其简并序列所编码的多肽序列。

7.如权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，所述的针对血管内皮生长因子A的gRNA靶向于以下血管内皮生长因子A中SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示序列的区段。

8.如权利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，CasRx的编码序列以及针对血管内皮生长因子A的gRNA被组装在一个腺相关病毒载体中；较佳地，腺相关病毒的载体包含SEQ IDNO:4所示的核苷酸序列。

9.表达CasRx以及针对血管内皮生长因子A的gRNA的重组载体，其特征在于，所述重组载体为腺相关病毒载体，包括CasRx的表达盒和血管内皮生长因子A的gRNA的表达盒。

10.如权利要求9所述的重组载体，其特征在于，所述的CasRx的表达盒中，CasRx编码基因的两端，还包括核定位信号序列；和/或以EFS、CMV、CAG、CBH或EF1a作为启动子，驱动CasRx的表达；更佳地，该表达盒中包括如下操作性连接的序列元件：启动子序列，核定位信号1序列，CasRx编码核酸序列，核定位信号2序列；较佳地，在启动子序列的5’端，还包括5’末端反向重复序列；较佳地，在核定位信号2序列的3’端，还包括PolyA序列。

11.如权利要求9所述的重组载体，其特征在于，所述的针对血管内皮生长因子A的gRNA的表达盒中，以U6作为启动子，驱动gRNA的表达；更佳地，该表达盒中，包括如下操作性连接的序列元件：U6启动子，针对血管内皮生长因子A的gRNA；较佳地，在所述gRNA的3’端，还包括3’末端反向重复序列。

12.如权利要求9～11任一所述的重组载体，其特征在于，所述的CasRx具有如SEQ IDNO:1中第1699～4596位核苷酸序列或其简并序列所编码的多肽序列；或

所述的针对血管内皮生长因子A的gRNA靶向于血管内皮生长因子A中SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示序列的区段；或

CasRx的编码序列以及针对血管内皮生长因子A的gRNA被组装在一个腺相关病毒载体中；更佳地，腺相关病毒的载体包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序。

13.权利要求9～12任一所述的重组载体的用途，用于包装重组病毒，所述重组病毒为重组腺相关病毒。

14.一种重组病毒，其特征在于，所述病毒为腺相关病毒，其由权利要求9～12任一所述的重组载体包装而成。

15.权利要求14所述的重组病毒的用途，用于：

制备靶向性抑制细胞内血管内皮生长因子A的试剂；和/或

制备抑制脉络膜新生血管形成的药物或组合物；和/或

制备缓解或治疗黄斑变性的药物或组合物。

16.一种试剂盒或药盒，其特征在于，所述的试剂盒或药盒中包括：权利要求14所述的重组的病毒；或9～12任一所述的重组载体。

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