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CN112135907A - 具有内含体逃逸能力的肽核酸复合物及其用途 - Google Patents

具有内含体逃逸能力的肽核酸复合物及其用途 Download PDF

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CN112135907A CN201980028888.0A CN201980028888A CN112135907A CN 112135907 A CN112135907 A CN 112135907A CN 201980028888 A CN201980028888 A CN 201980028888A CN 112135907 A CN112135907 A CN 112135907A
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李同仁
姜宥先
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Haiyang Pharmaceutical Co ltd
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Abstract

本发明涉及一种可将生物活性核酸引入细胞中的具有新型结构的核酸复合物，包含其的用于治疗或诊断疾病的组合物，以及使用其调节靶标基因表达的方法，更具体而言，涉及一种包含用于促进内含体逃逸的材料且其中生物活性核酸与载体肽核酸彼此互补结合的核酸复合物，包含其的用于治疗或诊断疾病的组合物，使用其调节靶标基因表达的组合物，以及使用其调节靶标基因表达的方法。根据本发明的结构式(1)的核酸复合物，其包含生物活性核酸和载体肽核酸，可增加生物活性核酸的稳定性，减少生物活性核酸的损失如因自聚集所致的沉淀，增加生物活性核酸的细胞内递送效率，并且调节靶标基因的表达。

Description

具有内含体逃逸能力的肽核酸复合物及其用途
技术领域
本发明涉及一种可将生物活性核酸引入细胞中的具有新型结构的核酸复合物，一种包含其的用于治疗或诊断疾病的组合物，以及一种使用其调节靶标基因表达的方法，更具体地，涉及一种包含用于促进内含体逃逸的材料并且其中的生物活性核酸核酸和载体肽核酸彼此互补结合的核酸复合物，一种包含其的用于治疗或诊断疾病的组合物，一种用于使用其调节靶标基因表达的组合物，以及一种使用其调节靶标基因表达的方法。
背景技术
常规上，新药的探索是基于通过计算机研究筛选出各种化合物，并且大多数被筛选的化合物都靶向蛋白质。
与传统药物不同，核酸药物抑制靶标特异性信使RNA(mRNA)的表达，因此有可能解决无法用靶向蛋白质的常规药物治疗疾病的研究领域的问题(Kole R.等人，NatureRev.Drug Discov.2012；11；125-140.，Wilson C.等人，Curr.Opin.Chem.Bio.2006；10：607-614.)。
尽管基于寡核酸的基因表达调节具有极好的效果和许多用途，在基于核酸的治疗试剂的开发中仍有许多障碍需要克服。例如，寡核酸可被核酸酶等破坏，并且由于寡核酸的电性(电荷)和尺寸，这些寡核酸不可能通过被动扩散穿过细胞膜。为克服这些问题，不断努力通过修饰核酸以确保生物稳定性。修饰的人工核酸，使提高其对靶标核酸的亲和力而不会损失生物活性变成可能。
肽核酸(PNA)，一类经修饰的人工核酸，是在其中引入了(2-氨基乙基)-甘氨酸肽骨架的人工核酸，并且具有与RNA和DNA强力结合的特性，其各自具有与之互补的核苷酸序列。具体地，所述肽核酸对核酸酶有抵抗力，并且具有高生物稳定性，已进行了基于各种寡核酸的治疗试剂的研究。然而，所述肽核酸具有难以导入细胞的缺点，因为其是电中性的(Joergensen M.等人，Oligonucleotides 2011，21；29-37)。
由于核酸作为药物的性能和优点，已经进行了使用核酸的各种临床试验。尽管基于核酸的治疗试剂的应用不断增加，但是使用载体以导入细胞内极其受限。例如，已经使用一种策略(方法)进行了临床试验，该策略通过使用纳米颗粒、阳离子脂质体和聚合纳米颗粒将基于寡核苷酸的药物递送到细胞或组织中。然而，大多数这些临床试验不包括递送系统，并且主要依靠通过肠胃外施用途径直接引入核酸，包括肌内注射、眼内施用、皮下注射等。
此外，寡核酸的细胞膜通透性非常低，具体地DNA或RNA是带负电荷的。出于此原因，这些寡核酸不能穿过细胞膜的疏水性磷脂双层，因此很难通过简单扩散将其递送到细胞中。诸如逆转录病毒或AAV(腺相关病毒)的病毒载体的使用使之有可能将寡核酸导入到细胞中，但是会有例如计划外的免疫活性和致癌基因的可能重组之类的风险(Couto L.B.等人，Curr.Opin.Pharmacol.2010，5；534-542.)。
出于此原因，基于具有低细胞毒性和低免疫活性的非病毒寡核酸的核酸载体的开发越来越重要。因此，已开发了使用阳离子脂质、脂质体、稳定核酸脂质颗粒(SNALP)、聚合物和细胞渗透肽的核酸导入技术(Zhi D.等人，Bioconjug.Chem.2013，24；487-519.，Buyens K.等人，J.Control Release，2012，158；362-70.，ROSSI，J.J.等人，GeneTher.2006，13：583-584.，Yousefi A.等人，J.Control Release，2013，170；209-18.，Trabulo S.等人，Curr.Pharm.Des.2013，19；2895-923.)。
这些核酸递送技术具有通过直接结合的功能性部分，包括复合物形成步骤，并且存在于脂质体结构的内含体逃逸效率、体内毒性等相关的问题。因此，需要改进寡核酸导入功能并克服与生产过程和副作用相关的问题。
同时，生物活性核酸通常通过受体介导的内吞作用形成被称为内含体的细胞器进入细胞。为有效表达生物活性核酸和治疗，内含体中的生物活性核酸应能够从内含体逃逸并移动到细胞核或在细胞质中发挥其功能。因此，从内含体逃逸到细胞质的过程，即“内含体逃逸”是必不可少的(D.W.Pack，A.S.Hoffman，S.Pun，P.S.Stayton，“Designanddevelopment of polymers for gene delivery,”Nat.Rev.Drug.Discov.，4，581-593，2005)。
对此，本发明人发现，包含与经修饰以大体上带正电荷的载体肽核酸互补结合的生物活性核酸的核酸复合物具有令人惊讶地提高的细胞通透性，并且使用该核酸复合物可非常高效调节靶标基因的表达。基于此发现，本发明人提交了针对具有低细胞毒性、允许生物活性核酸渗透入细胞中的能力以及提高的调节基因表达的能力的新型结构的专利申请(PCT/KR2017/008636)。
此后，本发明人继续进行研究，结果发现当将用于促进内含体逃逸的材料与上述结构结合时，包含于该结构中的所述生物活性核酸的细胞内活性显著增加，从而完成了本发明。
在该背景技术部分中公开的上述信息仅用于增强对本发明背景的理解。因此，其可能不包含形成在本发明所述领域中已知的常规技术。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种核酸复合物，其中包含用于促进内含体逃逸的材料的生物活性核酸和经修饰以大体上带正电荷的载体肽核酸彼此互补结合，以及一种包含该核酸复合物的用于诊断或治疗疾病的组合物。
本发明的另一目的是提供一种包含该核酸复合物的用于调节靶标基因表达的组合物和一种使用该核酸复合物调节靶标基因表达的方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种核酸复合物，其包含具有以下结构式(1)的结构：
结构式(1)
[mA≡mC(+)]
其中，
A代表具有能够与靶标基因结合的序列或靶标基因序列的生物活性核酸；
C代表能够与所述生物活性核酸结合的载体肽核酸；
‘≡’代表所述生物活性核酸与所述载体肽核酸之间的互补结合；
‘m’代表用于促进所述生物活性核酸和所述载体肽核酸的内含体逃逸的材料；
A代表的所述生物活性核酸大体上带负电荷或为中性的；
C(+)表示所述载体肽核酸大体上带正电荷；以及
所述载体肽核酸包含一个或多个经修饰的肽核酸单体，以使得载体肽核酸大体上带正电荷。
本发明还提供了一种包含结构式(1)的核酸复合物的用于诊断疾病的组合物，以及包含结构式(1)的核酸复合物的用于预防或治疗疾病的组合物。
本发明还提供了一种用于预防或治疗疾病的方法，包括施用结构式(1)的核酸复合物的步骤。
本发明还提供了结构式(1)的核酸复合物用于预防或治疗疾病的用途。
本发明还提供了结构式(1)的核酸复合物在制备用于预防或治疗疾病的药物中的用途。
本发明还提供了一种包含结构式(1)的核酸复合物的用于调节靶标基因表达的方法以及一种用于调节靶标基因表达的方法。
附图说明
图1a-1e显示了使用包含VEGF特异性生物活性肽核酸的结构式(1)的核酸复合物在渗透到人子宫癌细胞系中之后被释放到细胞质中的证实结果，并且显示了分析人乳腺癌细胞系和肺癌细胞系的细胞活力变化、抑制VEGF及其下游蛋白表达以及诱导细胞凋亡的结果。
(a)HeLa中的核酸复合物的细胞通透性和内含体逃逸的变化；
(b)MDA-MB-231细胞的细胞活力变化；
(c)A549细胞的细胞活力的变化；
(d)VEGF及其下游蛋白表达的变化；以及
(e)分析由VEGF抑制诱导的细胞凋亡。
图2a-2g显示了包含VEGF特异性生物活性肽核酸的结构式(1)的核酸复合物在移植有人乳腺癌细胞系的小鼠中的肿瘤生长抑制作用的评估结果。
(a)体内动物试验设计；
(b)小鼠体重的变化；
(c)肿瘤体积的变化；
(d)肿瘤重量的变化；
(e)肿瘤外观的变化；
(f)肝毒性标志物的变化；
(g)VEGF及其下游蛋白表达的变化。
图3显示了包含PD-L1特异性生物活性肽核酸的结构式(1)的核酸复合物在移植有人乳腺癌细胞系的小鼠中的肿瘤生长抑制作用的评价结果。
图4显示了使用包含雄激素受体特异性生物活性肽核酸的结构式(1)的核酸复合物抑制雄激素受体及其下游蛋白在人前列腺癌细胞系中的表达的证实结果。
(A)当使用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13)和各载体肽核酸(SEQ ID NO：16-SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：24-SEQ ID NO：27)的复合物；
(B)当使用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：15)和各载体肽核酸(SEQ ID NO：20-SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：28-SEQ ID NO：31)的复合物。
图5a至5c显示了使用包含凝集素特异性生物活性肽核酸的结构式(1)的核酸复合物改变人前列腺癌的细胞活力并抑制凝集素相关蛋白的表达的证实结果。
(a)当使用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33)和各载体肽核酸(SEQ ID NO：36-SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：44-SEQ ID NO：47)的复合物，PC-3细胞的细胞活力变化；
(b)当使用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35)和各载体肽核酸(SEQ ID NO：40-SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：48-SEQ ID NO：51)的复合物，PC-3细胞的细胞活力变化；
(c)凝集素及相关蛋白表达的变化；
(1)当使用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33)和各载体肽核酸(SEQ ID NO：36-SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：44-SEQ ID NO：47)的复合物；
(2)当使用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35)和各载体肽核酸(SEQ ID NO：36-SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：44-SEQ ID NO：47)的复合物。
图6a-6f显示了使用包含VEGF特异性生物活性肽核酸的结构式(1)的核酸复合物改变人视网膜色素上皮细胞系的细胞活力，抑制VEGF及其下游蛋白的表达，和通过玻璃体内注射和眼内施用抑制小鼠视网膜中的血管生成的证实结果。
(a)ARPE-19细胞的细胞活力变化；
(b)VEGF及其下游蛋白表达的变化；
(c)当玻璃体内注射包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO：2)和载体肽核酸(SEQ IDNO：8)的复合物1周后，分析小鼠视网膜的血管生成；
(d)和(e)当玻璃体内注射包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO：2)和载体肽核酸(SEQID NO：6或SEQ ID NO：8)的复合物，分析小鼠视网膜血管生成；
(f)当通过眼部施用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO：2)和载体肽核酸(SEQ IDNO：8)的复合物，分析小鼠视网膜中的血管生成。
图7显示了使用包含PDE4B特异性生物活性肽核酸的结构式(1)的核酸复合物抑制人呼吸道上皮细胞和人肺癌细胞系中PDE4B和炎症相关蛋白的表达的证实结果。
(A)当使用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：55)和各载体肽核酸(SEQ ID NO：56-SEQ ID NO：63)的复合物，分析NCI-H292中PDE4B和炎症蛋白表达；
(B)当使用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：55)和各载体肽核酸(SEQ ID NO：56-SEQ ID NO：63)的复合物，分析A549中PDE4B和炎症蛋白的表达。
图8a-8f显示了使用包含TLR2特异性生物活性肽核酸的结构式(1)的核酸复合物表现出与特应性相关的TLR2的表达的结果。
(a)当使用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：65)和各载体肽核酸(SEQ ID NO：67-SEQ ID ID：71))的复合物，HaCaT的细胞活力的变化；
(b)当使用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：65)和各载体肽核酸(SEQ ID NO：67-SEQ ID NO：71)d复合物，HaCaT中TLR2及其下游基因蛋白的表达的抑制；
(c)当使用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO：65)和各载体肽核酸(SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：70)的复合物，动物模型中特应性皮炎表型的变化；
(d)动物模型的血清中IgE和TARC浓度的变化；
(e)经H&E染色的动物模型的特应性表型的变化；
(f)经免疫染色的动物模型的炎症标志物的变化。
图9a和9b显示了使用包含Smad3特异性生物活性肽核酸的结构式(1)的核酸复合物抑制与皮肤再生有关的Smad3表达的证实结果。
(a)当使用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO：73)和各载体肽核酸(SEQ ID NO：75或SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：78)的复合物，HaCaT中的创伤愈合测定；
(b)当使用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73)和各载体肽核酸(SEQ ID NO：74-SEQ ID ID：78)的复合物，Smad3的蛋白质表达的抑制。
图10a和10b显示了使用包含TIEG1特异性生物活性肽核酸的结构式(1)的核酸复合物抑制与瘢痕疙瘩相关的TIEG1表达的证实结果。
(a)当使用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：80)和各载体肽核酸(SEQ ID NO：81-SEQ ID NO：84)的复合物，KEL-FIB细胞的细胞活力变化；
(b)当使用包含生物活性肽核酸(SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：80)和各载体肽核酸(SEQ ID NO：81-SEQ ID NO:84)的复合物，KEL-FIB中TIEG1基因及其下游的表达变化。
具体实施方式
除非另有定义，否则本说明书中使用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的技术人员通常理解的相同含义。通常，本说明书中使用的术语是本领域公知的和通常使用的。
在本发明的一个实施例中，已发现使用其中包含促进内含体逃逸的物质的生物活性核酸与载体肽核酸彼此互补结合的复合物，可以增加生物活性核酸的细胞内递送效率和易于调节靶标基因的表达。
因此，在一个方面，本发明涉及一种核酸复合物，其具有以下结构式(1)的结构：
结构式(1)
[mA≡mC(+)]
其中,
A代表具有能够与靶标基因结合的序列或靶标基因序列的生物活性核酸；
C代表能够与所述生物活性核酸结合的载体肽核酸；
‘≡’代表所述生物活性核酸与所述载体肽核酸之间的互补结合；
‘m’代表用于促进所述生物活性核酸和所述载体肽核酸内含体逃逸的材料；
A代表的所述生物活性核酸大体上带负电荷或为中性；
C(+)表示所述载体肽核酸大体上带正电荷；以及
所述载体肽核酸包含一个或多个经修饰的肽核酸单体，以使得所述载体肽核酸大体上带正电荷。
在本发明中，“生物活性核酸”是指具有能够与表达减少的靶标基因结合的互补序列，特别是能够与靶标基因的mRNA结合的互补序列或者包含促进所表达的靶标基因的表达的序列的核酸。具体地，其是指参与基因表达调节，例如抑制或促进目的基因的表达的核酸。所述生物活性核酸可为具有与表达减少或增加的靶标基因互补的序列的核酸，或者可为具有与如pre-mRNA、miRNA、mRNA等的单链RNA序列互补的序列的核酸。
具体地，本发明中的"生物活性核酸"可在体内或体外与靶标基因或包含其的核苷酸序列结合，由此激活或抑制靶标基因的特征功能(例如，转录物表达或蛋白质表达)或调节pre-mRNA的剪接(例如，外显子跳读)。在这里，所述核苷酸序列可为基因调节序列、或基因编码序列、或者剪接调节序列。所述基因调节序列可选自启动子、转录增强子、5’非翻译区、3’非翻译区、病毒包装序列和选择标记。所述基因编码序列可为外显子或内含子，且所述基因编码序列可位于距离基因的转录起始位点10、5、3或1kb、或500、300或200bp之内。例如，所述基因编码序列可位于所述起始位点的上游或下游。此外，所述剪接调节序列可包含与以下相关的序列：外显子跳读、隐蔽剪接、伪剪接位点激活、内含子保留、或选择性剪接异常调节。
在本发明中，"载体肽核酸"是指其碱基与所述生物活性核酸部分或全部互补结合由此赋予功能性的核酸。可用于本发明中的载体肽核酸不仅包括肽核酸(PNA)，还包括与其相似的修饰核酸。肽核酸是优选的，但不限于此。
在本发明中，用于促进内含体逃逸的材料可与各所述生物活性核酸和所述载体肽核酸的5’端或3’端结合。优选地可使用其中用于促进内含体逃逸的材料可与各所述生物活性核酸和所述载体肽核酸肽核酸的5’端结合的形式。
所述用于促进内含体逃逸的材料通过共价键连接到所述生物活性核酸和所述载体肽核酸，但不限于此。
在本发明中，“用于促进内含体逃逸的材料”可通过增加内含体中的渗透压或使内含体膜失稳来促进生物活性核酸的内含体逃逸。这表示该材料帮助生物活性核酸更有效和快速地移动到细胞核或细胞质以遇见和作用于靶标基因(D.W.Pack，A.S.Hoffman，S.Pun，P.S.Stayton，“Design and development of polymers for gene delivery，”Nat.Rev.Drug.Discov.，4，581-593(2005)).
用于促进内含体逃逸的材料可经由接头与生物活性核酸或载体肽核酸的5’端或3’端，但不限于此。
在本发明中，所述促进内含体逃逸的材料可选自下组中的任一个或多个：肽、脂质纳米颗粒、核酸复合物纳米颗粒、聚合物纳米球、无机纳米颗粒、基于阳离子脂质的纳米颗粒、阳离子聚合物和pH敏感性聚合物。
在本发明的一个优选实施例中，所述肽可选自下组：GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(SEQ ID NO：85)、GLFDIIKKIAESF(SEQ ID NO:86)和组氨酸(10)。
在本发明的一个优选实施例中，所述脂质纳米颗粒可选自下组：脂质、磷脂、棕榈酸鲸蜡酯、泊洛沙姆18、吐温85、三硬脂酸甘油酯和吐温80；
所述核酸复合物纳米颗粒可为聚(酰胺基胺)或聚乙烯亚胺(PEI)；
所述聚合物纳米球可选自下组：聚己内酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚丙交酯、聚乙交酯、聚(d,l-丙交酯)、壳聚糖和PLGA-聚乙二醇；以及
所述无机纳米颗粒可选自下组：Fe2O3 Fe3O4、WO3和WO2.9。
在本发明中，所述基于阳离子脂质的纳米颗粒可选自下组：1-(氨基乙基)亚氨基二[N-(油酰基半胱氨酰基-1-氨基-乙基)丙酰胺]、PTA的N-烷基化衍生物和3,5-双十二烷氧基苯甲脒。
在本发明中的另一个以下实施例中，阳离子聚合物可选自下组：乙烯吡咯烷酮-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸共聚物二乙基硫酸盐、聚异丁烯和聚(N-乙烯咔唑)；以及
所述pH敏感性聚合物可选自下组：多元酸、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)和水解聚丙烯酰胺。
在本发明中，每个所述生物活性核酸和所述载体肽核酸可包含2-50个，优选5-30个，更优选10-25个，最优选15-17个核酸单体。
而且，所述生物活性核酸可由天然核酸碱基和/或修饰的核酸单体构成。
在本发明中，生物活性核酸可选自下组：DNA、RNA和修饰的核酸，即PNA(肽核酸)、PMO(磷二酰胺吗啉代寡核苷酸)、LNA(锁核酸)、GNA(二醇核酸)、TNA(苏阿糖核酸)、反义寡核苷酸、适配子、siRNA(小干扰RNA)、shRNA(短发夹RNA)、核糖酶和DNA酶。优选地，所述生物活性核酸可选自下组：DNA、RNA和修饰的核酸，即PNA、PMO、LNA、GNA和TNA，但不限于此。
在本发明中，当所述生物活性核酸中所用的单体为PNA时，所述生物活性核酸指代生物活性肽核酸，当使用另一种单体时，所述生物活性核酸也以相同方式指代。
在本发明中，所述载体肽核酸可具有与所述生物活性核酸部分或完全互补的核苷酸序列。具体地，所述载体肽核酸可包含一个或多个通用碱基，并且所述载体肽核酸也可完全由通用碱基构成。
在本发明中，所述生物活性核酸和所述载体肽核酸可还包含选自下组中的一个或多个官能团：磷酸二酯、2’O-甲基、2’甲氧基-乙基氨基磷酸酯、氨基磷酸甲酯和硫逐磷酸酯。
在本发明中，所述核酸复合物的每个生物活性核酸和载体肽核酸可为大体上带正电荷的(阳离子)、带负电荷(阴离子)或中性的。
在表达电荷时使用的术语“大体上”不表示个别碱基的电性，而是表示当从外部看时生物活性核酸或载体肽核酸的总体电性。例如，如果所述生物活性核酸中带负电荷的单体的数量更多时，尽管所述生物活性核酸中的一些单体带正电荷，但当“大体上”观察电性时，所述生物活性核酸为带负电荷的。如果所述载体肽核酸中带正电荷的碱基和/或骨架的数量更多时，即使所述载体肽核酸中的一些碱基和/或骨架带负电荷的，但当“大体上”观察电性时，所述载体肽核酸为带正电荷的。
在此方面，根据本发明的具有结构式(I)的结构的核酸复合物可为大体上带正电荷的。在结构式(I)的核酸复合物中，优选地，当大体上观察电性时，所述生物活性核酸为带负电荷或中性的，并且当大体上观察电性时，所述载体肽核酸为带正电荷的。然而，本发明不限于此。
每个所述生物活性核酸和所述载体肽核酸的电性可使用修饰的肽核酸单体。修饰的肽核酸单体，当为带正电荷的载体肽核酸时，可包含选自下组的任一个或多个带正电荷氨基酸：赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)、组氨酸(His，H)、二氨基丁酸(DAB)、鸟氨酸(Orn)和氨基酸类似物。此外，当为带负电荷的载体肽核酸时，所述修饰的肽核酸单体可包含谷氨酸(Glu，E)，一种带负电荷的氨基酸，或者带负电荷的氨基酸类似物。
在本发明中，所述载体肽核酸可包含一个或多个γ-或α-骨架经修饰的肽核酸单体以使其大体上带正电荷。
所述γ-或α-骨架经修饰的肽核酸单体在其骨架中可包含选自下组的一个或多个带正电荷的氨基酸：赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)、组氨酸(His，H)、二氨基丁酸(DAB)、鸟氨酸(Orn)和氨基酸类似物，以使其为正电性的。
在本发明中，除了骨架修饰之外，可使用核酸碱基修饰的肽核酸单体进行肽核酸单体修饰以赋予电荷。优选地，所述载体肽核酸在其核碱基中可包含胺、三唑或咪唑部分以使其为电正性的，或者在其碱基中可包含羧酸以使其为电负性的。
在本发明中，所述载体肽核酸的所述经修饰的核酸单体在骨架或核碱基中还可包含负电荷，但所述经修饰的肽核酸单体所含的带正电荷的单体的数量优选大于带负电荷的单体的数量，以使载体肽核酸大体上为带正电荷的。
优选地，根据本发明的结构式(1)的核酸复合物可为大体上带正电荷的。
在根据本发明的结构式(1)的核酸复合物中，选自下组中的至少一种物质可结合到所述生物活性核酸和/或载体肽核酸：疏水性部分、亲水性部分、靶标抗原特异性抗体、适配子和荧光/冷光标记。优选地，选自下组中的一个或多个物质可结合到所述载体肽核酸：疏水性部分、亲水性部分、靶标抗原特异性抗体、适配子和用于成像的荧光/冷光标记。
在本发明中，通过单个共价键或接头介导的共价键选自下组中的至少一种物质可与所述生物活性核酸和/或所述载体肽核酸的结合：疏水性部分、亲水性部分、靶标抗原特异性抗体、适配子、猝灭子、荧光标记和冷光标记，但不限于此(参见表1)。优选地，结合到所述核酸载体的与细胞渗透、溶解度、稳定性、递送和成像相关的物质(例如，疏水性部分等)的存在与调节靶标基因表达的所述生物活性核酸无关。
在本发明中，所述生物活性核酸与所述载体肽核酸的互补结合大部分可归类为逆平行结合和平行结合。所述互补结合设置为使得在存在靶向所述生物活性核酸的序列，即与所述生物活性核酸互补的序列时，释放所述生物活性核酸。
逆平行结合和平行结合是根据DNA-DNA或DNA-PNA结合的5’-方向性和3’-方向性来确定的。逆平行结合是通用的DNA-DNA或DNA-PNA结合方法。以根据本发明的结构式(1)的核酸复合物为例，逆平行结合表示以5’至3’方向的所述生物活性核酸与以3’至5’方向的所述载体肽核酸彼此结合。平行结合显示了在一定程度上低于逆平行结合的结合亲和性，并且表示生物活性核酸与载体肽核酸以5’至3’方向或3’至5’方向彼此结合。
在根据本发明的结构式(1)的核酸复合物中，所述生物活性核酸和载体肽核酸之间的结合亲和性可优选低于所述生物活性核酸和生物活性核酸所靶向的基因、特别是靶标基因的mRNA之间的结合亲和性。所述结合亲和性通过熔融温度(Tm)测定。
使所述生物活性核酸与载体肽核酸之间的结合亲和性(熔融温度(Tm))低于所述生物活性核酸与生物活性核酸所靶向的基因、特别是靶标基因的mRNA之间的结合亲和性的方法的一个具体示例，所述生物活性核酸和载体肽核酸可通过平行结合或部分特异性结合而彼此结合，但本发明不限于此。
作为另一个示例，所述载体肽核酸可具有选自下组中至少一个肽核碱基：接头、通用碱基和不与生物活性核酸的相应碱基互补的肽核碱基，但本发明不限于此(参见表1)。
本发明中所用的通用碱基可选自下组中的一个或多个：肌苷PNA、吲哚PNA、硝基吲哚PNA和脱碱基PNA，其是无选择性地结合天然碱基(包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶)的碱基，并且其结合亲和性低于互补结合亲和性。优选地，肌苷PNA可用作通用碱基。
[表1]生物活性核酸和载体肽核酸之间结合的实施例
Figure BDA0002747136060000101
Figure BDA0002747136060000111
在上表1中，N代表核碱基(ATGC)；*代表不与反义核酸序列互补的序列；$代表通用碱基；＝代表接头；5’-和3’-表示核酸(碱基)的方向性。
本发明提供了结合核酸的结合形式与电性以调节核酸复合物的功能，可通过核酸的结合形式和电性的结合来控制粒径和作用时间，并且可增加细胞通透性、溶解度和特异性。
在本发明中，可通过控制载体肽核酸与生物活性肽核酸之间的结合亲和性来控制所述生物活性肽核酸在靶标基因存在下结合到所述靶标序列的时间点(所述生物活性核酸与所述靶标序列的链置换时间，以及所述生物活性核酸的靶标特异性释放和结合的时间)。
在根据本发明的结构式(1)的核酸复合物中，可通过复合物的非特异性结合的载体肽核酸的非特异性碱基、是否存在通用碱基和接头以及碱基的数量和位置来控制所述生物活性核酸与靶标序列的链置换时间，以及所述生物活性核酸的靶标特异性释放和结合的时间。此外，这些还可通过在复合物中互补结合的平行或逆平行结合的这些条件的结合来控制。
在本发明中，所述结构式(1)的核酸复合物的粒径可为5nm-300nm，优选10nm-80nm，最优选15nm-70nm。
在本发明中，可通过生物活性核酸和载体肽核酸之间的电荷平衡来控制所述核酸复合物的粒径。具体地，当载体肽核酸的正电荷增加时，粒径变小，但如果载体肽核酸的正电荷超过一定水平，粒径会变大。此外，通过生物活性核酸和载体肽核酸之间的适当电荷平衡来确定核酸复合物的粒径，依赖于所述复合物的生物活性肽核酸的电荷，其是确定粒径的另一个因素。
根据本发明的载体肽核酸的正电荷数量是1-7个(指包含1-7个带正电荷的单体)，优选2-5个，最优选2-3个，生物活性核酸的电荷平衡的净电荷是0-5个负电荷，优选0-3。
在本发明中，所述结构式(1)的核酸复合物可通过在合适条件下的生物活性核酸和载体肽核酸之间的杂交来制备。
如本文所用，术语"杂交"表示互补的单链核酸形成了双链核酸。所述杂交可在两条核酸链完美互补(完美匹配)时发生，或者可在存在一些错配残基时发生。所述杂交所必需的互补性程度可取决于杂交条件而不同，特别是可通过结合温度控制。
在本发明中，报告子和能够猝灭报告子荧光的猝灭子可结合到所述生物活性核酸或载体肽核酸的两端。报告子可选自下组中的一个或多个：FAM(6-羧基荧光素)、TexasRed、HEX(2’,4’,5’,7’-四氯-6-羧基-4,7-二氯荧光素)和Cy5。优选地，使用Cy5。所述猝灭子可选自下组中的一个或多个：TAMRA(6-羧基四甲基-若丹明)、BHQ1、BHQ2和Dabcyl，但不限于此。
另一方面，本发明涉及一种用于诊断疾病的组合物，其包含具有结构式(1)的结构的核酸复合物。
另一方面，本发明涉及一种用于预防或治疗疾病的组合物其包含具有结构式(1)的结构的核酸复合物。
另一方面，本发明涉及一种用于预防或治疗疾病的方法，其包括向需要预防或治疗的患者施用具有结构式(1)的结构的核酸复合物。
另一方面，本发明涉及具有结构式(1)的结构的核酸复合物用于预防或治疗疾病的用途。
另一方面，本发明涉及具有结构式(1)的结构的核酸复合物在制备用于预防或治疗疾病的药物中的用途。
如本文所用，术语“靶标基因”是指被激活、抑制或标记的核酸序列(核苷酸序列)，其与术语“靶标核酸”没有区别并且可与其互换使用。
如果包含靶标基因的靶标核酸(核苷酸序列)在体外或体内接触(结合)所述复合物，则所述生物活性核酸从所述载体肽核酸分离，并显示生物活性。
在本发明中，可使用具有结构式(1)的结构的核酸复合物诊断、预防或治疗的疾病，可根据所述核酸复合物中的生物活性核酸所结合的靶标基因来确定。优选地，所述疾病是癌症或肿瘤，但不限于此。
在本发明中，术语“用于治疗的组合物”可与“药物组合物"互换使用，该组合物包括作为活性成分的本发明的核酸复合物，其包含生物活性核酸和结合到所述生物活性核酸的载体生物活性核酸。
根据标准药物实践，根据本发明的用于治疗的组合物可为口服或肠胃外剂型。除了活性成分之外，该制剂可包含添加剂，例如药理学可接受的载体、赋形剂、补充剂或稀释剂。
术语“生理学可接受”是指不废除所述化合物的生物活性和性质。
术语“载体”被定义为促进复合物加入细胞或组织中的化合物。例如，二甲亚砜(DMSO)是一种常用于促进许多有机化合物渗透到生物体的细胞或组织中的载体。
术语“稀释剂”不仅定义为稳定靶标化合物的生物活性形式的化合物，还是在其溶解的水中稀释的化合物。在相关领域中，使用溶解在缓冲溶液中的盐作为稀释剂。常用的缓冲溶液是磷酸缓冲盐溶液，其模拟人体内的盐浓度。由于缓冲盐能在低浓度下控制溶液的pH，化合物的生物活性很少因缓冲稀释剂而改变。
可给人类患者施用本文所用的包含所述复合物的化合物本身，或者在其与其他活性成分混合的药物组合物中施用作为组合疗法，或者与合适的载体或赋形剂中混合施用。
适合用于本发明中的药物组合物包括其中有效成分含量能达到预期目的的组合物。更具体地，治疗有效量表示有效预防、稳定、减轻或缓解疾病的症状或延长所治疗的受试者的生存的化合物的量。确定治疗有效量完全在本领域技术人员的能力范围内，尤其是参考本文所提供的详细公开内容时。
如本文所用，术语“预防(preventing或prevention)”是指通过施用(或应用)包含所述复合物或其药学可接受的盐的药物组合物而显示出抗癌活性和抑制癌症生长或延缓癌症发展的所有行动。如本文所用，术语“治疗(treating或treatment)”是指通过施用(或应用)包含所述复合物或其药学上可接受的盐的药物组合物来减轻或完全治愈癌症的所有动作。
在本发明中，可使用包含本发明的核酸复合物的组合物预防或治疗的疾病包括但不限于肿瘤或癌症、炎性疾病、年龄相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、罕见重病、心血管疾病、代谢疾病和皮肤疾病。
在本发明中，可使用包含本发明的核酸复合物的组合物治疗的疾病，可通过所述核酸复合物中含有的所述生物活性核酸所结合的靶标基因来确定。用于癌症治疗的所述生物活性核酸所结合的靶标基因的示例包括VEGF、雄激素受体、凝集素、TGFβR2、ERBB3、ABCB1、PD-L1等。炎性疾病的靶标基因是DE4B或Pellino-1，罕见重病的靶标基因是SMN2、ApoB-100、ICAM-1、ApoCIII、TTR、HTT、GHr、SOD1、ANGPTL3、PKK、miR-21、TMPRSS6、FMR1或连接蛋白26。靶向心血管疾病的基因是因子XI、Apo(a)、ApoCIII或AGT，代谢疾病的靶标基因是GCGR、ANGPTL3、miR-103/107或DGAT2。皮肤疾病的靶标基因是IFI16、TLR6或TIEG1，但基因的示例不限于此。
在本发明中，可通过已知方法将用于治疗的组合物单独或与如下所述的药学上可接受的载体或赋形剂一起配制成肠胃外或口服剂型。此类制剂的具体示例包括口服制剂，例如注射剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、片剂、糖浆剂或外用制剂。
优选地，包含核酸复合物的治疗组合物可以肠胃外剂型制备和使用。合适的肠胃外剂型的示例包括但不限于适于皮下注射、静脉内注射、肌肉注射或胸腔内注射的溶液或冻干制剂。
在本发明中，包含核酸复合物的组合物可以透皮施用(皮肤递送)。所述透皮递送制剂可以选自下组：水溶液、乳膏和软膏，但不限于此，并且可以使用现有技术中已知的用于皮肤递送的所有类型的制剂。
为配制肠胃外急性的用于治疗的组合物，该组合物包含本发明的核酸复合物，并且还可以包含选自下组中的一种：生理盐水、无菌水、林格氏溶液、缓冲盐水、右旋糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇，及其中两种或更多种组合。如果必要，所述组合物可包含其他常规添加剂，例如抗氧化剂、缓冲剂和抑菌剂。此外，还可添加稀释剂、分散剂、表面活性剂、粘合剂和润滑剂到待制成可注射制剂(例如水溶液、悬浮液或乳液)的组合物中。特别地，所述组合物优选以冻干制剂的形式提供。为制备冻干制剂，可以使用本发明所属技术领域中已知的常规方法，并且还可以添加冻干稳定剂。此外，组合物可以优选地根据疾病或组分通过本领域已知的合适方法或通过Remington’s Pharmaceutical Science，Mack PublishingCompany，Easton PA中公开的方法来制备。
另外，可以将用于治疗的本发明的组合物配制成口服剂型，包括粉剂、片剂、胶囊、液体剂、注射剂、软膏和糖浆。在这种情况下，可以向组合物中添加一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在本发明中，包含核酸复合物的组合物可为用于预防或治疗癌症的组合物。可通过该组合物治疗的肿瘤和癌症没有具体限定，并且包括实体癌症和血液癌症。优选地，癌症乳腺癌、前列腺癌或肺癌。
优选地，根据本发明的用于癌症治疗的核酸复合物中所含的生物活性核酸的靶标基因可为，例如，选自下组的任何一个或多个：VEGF、PD-L1、雄激素受体、凝集素、TGFβR2、ERBB3、ABCB1、和PDE4B，但不限于此。
在本发明中，包含具有结构式(1)的结构的核酸复合物的用于预防或治疗癌症的组合物包含SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3中任一所示的VEGF特异性生物活性肽核酸、或SEQID NO：10所示的PD-L1特异性生物活性肽核酸，以及与其互补的载体肽核酸。所述载体肽核酸可优选地具有SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：9中的任一序列(VEGF)或SEQ ID NO：11的序列(PD-L1)，并且所述序列的一部分也可由通用碱基取代。
在本发明中，包含具有结构式(1)的结构的核酸复合物的用于预防或治疗癌症的组合物包含SEQ ID NO：12-SEQ ID NO：15中任一所示的雄激素受体特异性生物活性肽核酸；以及与其互补的载体肽核酸。所述载体肽核酸可优选地具有SEQ ID NO：16-SEQ ID NO：31中的任一序列，并且所述序列的一部分也可由通用碱基取代。
在本发明中，包含具有结构式(1)的结构的核酸复合物的用于预防或治疗癌症的组合物包含SEQ ID NO：32-SEQ ID NO：35中任一所示的凝集素特异性生物活性肽核酸；以及与其互补的载体肽核酸。所述载体肽核酸可优选地具有SEQ ID NO：36-SEQ ID NO：51中的任一序列，并且所述序列的一部分也可由通用碱基取代。
在本发明中，包含具有结构式(1)的结构的核酸复合物的组合物可为用于预防或治疗年龄相关的黄斑变性或糖尿病性视网膜病变的组合物。根据本发明的用于预防或治疗年龄相关的黄斑变性或糖尿病性视网膜病变的核酸复合物中所含的生物活性核酸的靶标基因可为例如VEGF，但不限于此。
用于预防或治疗年龄相关的黄斑变性或糖尿病性视网膜病变的组合物包含SEQID NO：1-SEQ ID NO：3中任一所示的VEGF特异性生物活性肽核酸；以及与其互补的载体肽核酸。所述载体肽核酸可优选地具有SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：9中的任一序列，并且所述序列的一部分也可由通用碱基取代。
用于预防或治疗年龄相关的黄斑变性或糖尿病性视网膜病变的组合物可具有选自以下的任何一种制剂：水溶液、注射液、眼部溶液和滴眼液。
在本发明中，包含核酸复合物的组合物可为用于预防或治疗慢性阻塞性肺病(COPD)的组合物。所述核酸复合物中含有的生物活性核酸所结合的靶标基因可为PDE4B，但不限于此。
用于预防或治疗COPD的组合物包含SEQ ID NO：52-SEQ ID NO：55中任一所示的PDE4B特异性生物活性肽核酸；以及与其互补的载体肽核酸。所述载体肽核酸可优选地具有SEQ ID NO：56-SEQ ID NO：63中的任一序列，并且所述序列的一部分也可由通用碱基取代。
在本发明中，包含核酸复合物的组合物可为用于预防或治疗皮肤疾病的组合物。核酸复合物中所含的生物活性核酸所结合的靶标基因可为例如选自下组的任何一个或多个：TLR2、Smad3、IFI16和TIEG1，但不限于此。所述皮肤疾病的示例包括但不限于，银屑病、色素淀积相关的皮肤疾病、特异性皮炎、皮肤损伤和瘢痕疙瘩。
优选地，本发明提供了一种用于治疗特异性皮炎的组合物。用于治疗特异性皮炎的组合物包含SEQ ID NO：64或SEQ ID NO：65所示的TLR2特异性生物活性肽核酸；以及与其互补的载体肽核酸。所述载体肽核酸可优选地具有SEQ ID NO：66-SEQ ID NO：71中的任一序列，并且所述序列的一部分也可由通用碱基取代。
本发明还提供了一种用于治疗皮肤损伤组合物。用于治疗皮肤损伤的组合物用于包括皮肤创伤愈合的皮肤再生，但不限于此。根据本发明的用于治疗皮肤损伤的组合物包括SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73所代表的序列的Smad3特异性生物活性肽核酸；和与其互补的载体肽核酸。所述载体肽核酸可优选具有SEQ ID NO：74-SEQ ID NO：78中的任一序列，并且所述序列的一部分还可用通用碱基取代。
本发明还提供了一种用于治疗瘢痕疙瘩的组合物。根据本发明的用于治疗瘢痕疙瘩的组合物包括具有SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：80所代表的TIEG1特异性生物活性肽核酸；和与其互补的载体肽核酸。所述载体肽核酸可优选具有SEQ ID NO：81-SEQ ID NO：84中的任一序列，并且所述序列的一部分还可用通用碱基取代。
用于预防或治疗皮肤疾病的组合物可以制备成水溶液、凝胶、糊剂、乳液或软膏的剂型，但不限于此。
在本发明中，包含核酸复合物的组合物可为用于预防或治疗炎性疾病的组合物。所述核酸复合物中含有的生物活性核酸所结合的靶标基因可为PDE4B或Pellino-1，但不限于此。
在本发明中，包含核酸复合物的组合物可为用于预防或治疗罕见重病的组合物。所述核酸复合物中含有的生物活性核酸所结合的靶标基因可为例如SMN2、ApoB-100、ICAM-1、ApoCIII、TTR、HTT、GHr、SOD1、ANGPTL3、PKK、miR-21、TMPRSS6或连接蛋白26，但不限于此。
优选地，根据本发明的罕见重病可为听力丧失，并且所述核酸复合物中含有的生物活性核酸所结合的靶标基因可为连接蛋白26。
在本发明中，所述核酸复合物可经由载体如脂质体施用(或应用)。所述脂质体可帮助复合物靶向特定组织如淋巴组织，或者特异性地靶向感染细胞，还可帮助增加包含该复合物的组合物的半衰期。所述脂质体的实施例包括乳液、泡沫、胶束、不溶性单层、液晶、磷脂分散体、片状层等。在这些制剂中，递送的复合物为脂质体的一部分、单独存在或者与其结合的分子例如淋巴细胞中普遍存在的受体(例如结合CD45抗原的抗体)或其他治疗性组合物联合。这样，用本发明的所需复合物填充或修饰的脂质体，可被引至淋巴细胞的位置。
用于本发明中的脂质体由形成标准囊泡的脂质形成，其通常包括中性和带负电荷的磷脂和固醇，例如胆固醇。脂质的选择大体上通过考虑例如血流中的脂质体大小、脂质体的酸不稳定性和稳定性来引导。许多方法可用于制备脂质体。例如，可使用以下文献方法中公开的方法[Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.，9：467，1980和U.S.Pat.No.4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369]。
另一方面，本发明提供了一种通过对受试者施用(或应用)复合物或包含其的组合物来治疗和抑制(或减轻)疾病的方法。
可使用本发明的复合物治疗的疾病可根据所用的生物活性核酸的特性来确定，并且没有具体限制。
可使用本发明的复合物治疗的疾病包括但不限于，癌症、异常血管生长相关的疾病如黄斑变性、皮肤疾病、炎性疾病、自体免疫疾病等。
包含根据本发明的复合物的组合物可以药学上有效的量施用(或应用)到皮肤以治疗癌症或抑制(或减轻)癌症症状。本发明药物组合物的剂量/应用量可取决于多种因素，例如色素淀积相关的皮肤疾病的种类、患者的年龄和体重、症状的特性和程度、现有治疗方法的种类、治疗频率、施用(应用)的模式和途径等，并且可由相关领域技术人员容易地确定。本发明的组合物可与药理学或生理学成分共同施用，或者可顺序施用(应用)。此外，本发明的组合物可与其他常规治疗试剂组合施用(应用)和与常规治疗试剂顺序或同时施用(应用)。所述施用(应用)可为单剂量施用(应用)或多剂量施用(应用)。
在本发明中，术语"受试者"是指患有能通过施用(应用)本发明的复合物减轻、抑制或治疗的状况或疾病、或具有发展为所述状况或疾病的风险的哺乳动物。优选地，其是指人类。
此外，本发明化合物对人体的剂量(应用量)可取决于以下而变：患者年龄、体重和性别、施用(应用)模式、患者的健康情况和疾病的严重程度。基于重70kg的成年人患者，所用剂量通常为0.001-1,000mg/天，优选0.01-500mg/天。根据医生或药剂师的判断，所用剂量可为以预定的时间间隔每天施用(应用)一次或数次。
对于本发明方法中所用任何化合物或包含其的混合物，所述治疗有效量最初可由细胞培养物测定法来估算。例如，可根据在细胞培养物中测定的剂量，在动物模型中配制以得到包含IC50(半数最大抑制浓度)或EC50(半数最大有效浓度)在内的循环血浆浓度范围的剂量。该信息可用于更精确地确定人体内的可用剂量。
本文所述复合物或包含该复合物的混合物的毒性和治疗功效可通过标准药用程序在细胞培养物或实验动物中测定，例如，通过测定LD50(50％种群致死的剂量)和ED50(50％种群有治疗活性的剂量)。治疗和毒性作用之间的剂量比为治疗指数，其可表示为比率ED50(或IC50)/LD50。优选显示出最大治疗指数的化合物。从这些细胞培养物测定得到的数据可用于配制用于人的剂量范围。这些化合物的剂量优选在包括几乎没有或没有毒性的ED50(或IC50)的循环浓度范围内。
在另一方面，本发明涉及一种用于诊断癌症或肿瘤的试剂盒，所述试剂盒包含所述复合物。
在本发明中，用于诊断癌症或肿瘤的样品可来源于包括人在内的哺乳动物的特定组织或器官。所述组织的代表性示例包括结缔组织、肌肉或神经组织。所述器官的代表性示例包括眼睛、脑、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心脏、淋巴结、骨骼、软骨、胰腺、肾脏、胆囊、胃、小肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统、腺体和内部血管。
所述样品包括来源于生物来源的任何细胞、组织或液体或可通过本发明完善分析的任何其他介质。所述样品还包括从制备用于供人和/或动物消耗的食物中获得的。此外，所述待分析的样品包括体液样品，其包括但不限于血液、血清、血浆、淋巴液、乳液、尿液、粪便、眼部液体、唾液、精液、脑提取物(例如，磨碎的脑)、脊髓液以及阑尾、脾和扁桃腺组织提取物。
本发明的试剂盒可任选地包括进行靶标核酸扩增反应(例如PCR反应)所需的试剂，例如缓冲液、DNA聚合酶辅因子和脱氧核糖核苷酸-5-三磷酸。任选地，所述试剂盒还可包括抑制多种聚核苷酸分子活性的抗体、逆转录酶、缓冲液和试剂以及DNA聚合酶。此外，在试剂盒中，特定反应中所用的试剂的最优量可由获取了本文所述公开内容的本领域技术人员可以容易地确定。通常，本发明的试剂盒可制成单独包装或装有上述成分的隔室。
在本发明中，所述载体肽核酸可与生物活性核酸形成互补氢键并将所述生物活性核酸递送到细胞中，并且所述生物活性核酸可与靶标基因结合并调节所述靶标基因的表达。
因此，另一方面，本发明涉及一种用于调节靶标基因表达的组合物，其包含具有结构式(1)的结构的核酸复合物。
另一方面，本发明涉及一种使用具有结构式(1)的结构的核酸复合物调节靶标基因表达的方法。
在本发明中，所述调节靶标基因表达的方法可包括以下步骤：(a)通过使包含用于促进内含体逃逸的材料的生物活性核酸与载体肽核酸结合形成复合物；以及(b)通过将所述复合物与靶标细胞接触而将该复合物引入靶标细胞中。
在本发明中，所述靶标细胞可为上述的癌症或肿瘤细胞，但不限于此。在本发明中，在步骤(b)中将所述复合物引入到细胞中并移动之后，所述生物活性核酸与具有与其互补的序列的靶标核酸结合，并可与所述载体肽核酸分离，且所述生物活性核酸可与靶标基因结合，从而调节靶标基因的表达。
根据本发明，在不存在靶标核酸(靶标序列)的情况下，所述复合物的生物活性核酸和载体肽核酸保持二者之间的互补结合，然而在存在与生物活性核酸的核苷酸序列互补的靶标核酸的情况下，所述生物活性核酸通过“生物活性核酸与靶标序列的链置换”和“靶向特异性释放和结合”而与载体肽核酸分离并与靶标核酸结合。根据载体肽核酸的核苷酸序列与靶标序列的核苷酸序列之间的互补性，可通过控制生物活性核酸的核碱基质之间的氢键强度来控制所述释放和结合的时间。
因此，根据本发明的一个优选实施方式，所述靶标特异性释放和结合可通过以下方式实现：i)构建“单核苷酸多态性(SNP)”或“短于生物活性核酸的序列”作为具有部分特异性序列的载体肽核酸结构；ii)用通用碱基替换一部分载体肽核酸序列；或iii)用接头替换一部分载体肽核酸序列；或iv)提供与生物活性核酸平行结合的载体肽核酸结构，使得载体肽核酸与生物活性核酸之间的结合亲和力低于靶核酸与生物活性核酸之间的结合亲和力。这些方法可以两种以上组合使用，优选使用平行结合法。
用于本发明的通用碱基可为选自下组的一种或多种：肌苷PNA、吲哚PNA、硝基吲哚PNA和脱碱基PNA，其是无选择性地结合天然碱基(包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)的碱基，并且其结合亲和性低于互补结合亲和性。优选地，肌苷PNA可用作通用碱基。
优点在于，可以通过控制生物活性核酸与载体肽核酸之间的结合亲和力，来控制生物活性核酸与载体肽核酸之间的分离时间、以及生物活性核酸与生物活性核酸所靶向的基因之间的结合时间。
在本发明中，使用具有结构式[A≡C(+)]的结构的核酸复合物来验证具有结构式(1)的结构的核酸复合物的功效，该结构式不包含用于促进内含体逃逸的材料(参见PCT/KR2017/008636)。
根据本发明的载体肽核酸(即，经修饰的载体肽核酸)克服了由常规的未修饰的裸PNA的自聚集性质引起的沉淀问题，并且可以增加细胞通透性、溶解性和细胞内扩散作用。
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。对本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施例仅用于说明本发明，本发明的范围不受这些实施例所限。
实施例1.通过使用具有结构式(1)的结构的新型复合物抑制人乳腺癌细胞和肺癌细胞中血管内皮生长因子来检验抗癌药理学作用
众所周知，血管内皮生长因子(VEGF)在多种类型的癌症细胞中高表达，诱导癌细胞中的细胞和血管增殖。因此，对这种新型复合物进行了检验以确定它是否可以通过抑制VEGF表现出抗癌药理学作用。
血管内皮生长因子(VEGF)参与血管和淋巴管稳态的发展和维持，并且还对神经元产生重要影响。已知这种VEGF是肿瘤和眼睛中与疾病相关的血管生成的重要介质。在癌症的大多数研究对象中，VEGF mRNA均被肿瘤过表达(Berkman等人,J Clin Invest.,91:153-159(1993))。癌症需要新的毛细血管作为营养供应和废物排放的通道以供其生长，为此目的，癌症细胞和癌性间质细胞不断分泌VEGF，分泌的VEGF通过组织扩散并刺激血管内皮细胞迁移(Ferrara.N.等人,Nat Rev Cancer,2:795-803,(2002))。与正常形成的毛细血管相比，由癌症细胞诱导的新脉管系统的特征在于不完整，因为它们独立于周围细胞。尽管VEGF与受体VEGFR1、2和3结合，但VEGF递送导致内皮细胞增殖、迁移和通透性的信号是通过VEGFR2进行的(Zeng H.等人,J Biol.Chem.,276:26969-26976(2001))。因此，通过使用靶向VEGF的药物控制血管生成，可以治疗与血管生成相关的癌症细胞和疾病的增殖。
实施例1-1.细胞培养
人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)，人肺癌细胞(A549)和人子宫癌细胞(HeLa)得自ATCC(American Type Culture Collection，USA)在包含10％(v/v)胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基(伊格尔改良培养基，Welgene，韩国)中在37℃和5％(v/v)CO2下培养。
实施例1-2.核酸复合物的细胞内导入、细胞通透性和内含体逃逸变化的分析
通过如下方式制备用于抑制血管内皮生长因子的新型复合物：制备具有与血管内皮生长必需基因VEGF mRNA互补的序列(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3)的生物活性肽核酸，制备与包含用于促进内含体逃逸的材料的生物活性核酸互补的载体肽核酸(SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：9)，然后使各生物活性肽核酸与各载体肽核酸等量杂交(参见表2)。处理其中生物活性肽核酸和载体肽核酸彼此结合的复合物的方法如PCT/KR2017/008636中所述。
[表2]用于抑制VEGF活性的生物活性核酸和载体肽核酸的序列
Figure BDA0002747136060000201
将实施例1-1中培养的细胞以5×103细胞/孔的密度接种到8孔板中，用所述复合物处理，然后培养24、48、72和96小时。各培养时间之后，使用吖啶橙染色分析核酸复合物的细胞渗透性和内含体逃逸的变化。
下表3中显示了该实施例中使用的核酸复合物。
[表3]用于分析内含体逃逸的核酸复合物
名称 核酸复合物
原始的PNA 1 SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4
原始的PNA 2 SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：9
经修饰的PNA 1 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6
经修饰的PNA 2 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8
如图1a所示，证实了在人子宫癌细胞中，包含内含体逃逸部分的核酸复合物比不包含内含体逃逸部分的核酸复合物更快地释放到细胞质中。
实施例1-3.分析人乳腺癌细胞和肺癌细胞中的细胞活力
为了分析新型复合物抑制血管内皮生长因子的程度，将实施例1-1中培养的细胞以6×103细胞/孔的密度接种到96孔板中，用复合物处理，然后培养24、48、72和96小时。在各培养时间后，在PCT/KR2017/008636中公开的实验条件下分析细胞活力。
下表4中显示了该实施例中使用的核酸复合物。
[表4]用于分析乳腺癌细胞和肺癌细胞的细胞活力的核酸复合物
核酸复合物
原始的 SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4
PNA 1 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4
PNA 2 SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4
PNA 3 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5
PNA 4 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6
PNA 5 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7
PNA 6 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8
结果，如图1b和1c所示，在人乳腺癌细胞和肺癌细胞中证实了所述新型复合物通过抑制血管内皮生长因子而抑制了细胞的细胞活力。
实施例1-4.通过蛋白质印迹法分析基因表达
为了分析新型复合物抑制血管内皮生长因子的程度，将实施例1-1中培养的细胞以1×105细胞/孔的密度接种到6孔板中，用复合物处理，然后培养24、48、72和96小时。在各培养时间之后，在PCT/KR2017/008636中公开的条件下，使用抗VEGF抗体(SantaCruzBiotech.，USA)和抗p-Akt1(Cell Signaling，USA)来分析蛋白质表达。
下表5中显示了该实施例中使用的核酸复合物。
[表5]用于分析VEGF和p-Akt1基因表达的核酸复合物
名称 核酸复合物
PNA 1 SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4
PNA 2 SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：9
PNA 3 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6
PNA 4 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8
如图1d所示，证实了血管内皮生长因子(VEGF)及其下游基因p-Akt1的蛋白表达被抑制。
实施例1-5.通过流式细胞术(荧光激活的细胞分选器；FACS)分析凋亡
为了分析使用该新型复合物抑制血管内皮生长因子诱导的凋亡，将实施例1-1中培养的细胞以每孔1x105细胞的密度接种到6孔板中，用所述复合物处理，培养72小时然后收获。接下来，将细胞充分悬浮在FITC膜联蛋白V细胞凋亡检测试剂盒(BD，USA)的500μL膜联蛋白V结合缓冲液中，并分别用5μL FITC膜联蛋白V和碘化丙啶染色溶液处理。然后，将细胞转移到试管中进行流式细胞术，然后通过FACS CantoII(BD，USA)进行分析。
该实施例中使用的核酸复合物示于下表6中。
[表6]用于分析抑制血管内皮生长因子所诱导的凋亡的核酸复合物
名称 核酸复合物
原始的PNA双链体 SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4
经修饰的PNA双链体 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6
经修饰的PNA双链体1 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6
经修饰的PNA双链体2 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8
结果，证实了对包含所述生物活性肽核酸和结合到其上的载体肽核酸并具有不同电荷和长度的复合物的分析，其显示出诱导了0.6-3.1％的细胞凋亡(图1e)。
实施例2：评估靶向血管内皮生长因子的生物活性肽核酸和载体肽核酸的候选复合物的抗癌功效
候选复合物分别包含如下表7所示的靶向VEGF的生物活性肽核酸和载体肽核酸，以分析各复合物是否通过抑制移植了人乳腺癌肿瘤细胞系和肿瘤细胞的动物模型中的靶标基因VEGF的表达来抑制肿瘤。另外，分析了以检查癌细胞的生长是否会受到包含所述生物活性肽核酸的新型复合物的治疗的抑制，所述新型复合物靶向在癌细胞表面表达的PD-L1，并持续诱导癌细胞的增殖。
[表7]在动物模型中分析抑制靶标基因表达诱导的肿瘤抑制作用的序列
Figure BDA0002747136060000231
实施例2-1.通过尾静脉施用含生物活性肽核酸和载体肽核酸的候选复合物评估 移植了人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的小鼠的抗癌功效
为了评估抗癌功效，培养人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)并将其调整为3×107细胞/ml的细胞浓度。将0.3ml(9×106细胞/小鼠)的细胞培养物皮下注射到每只特定的无病原体(SPF)BALB/C雌性裸鼠(Nara Biotech Co.，韩国)的右肩和胸壁之间的腋窝区域中。将包含生物活性肽核酸和载体肽核酸的各候选复合物样品1、2、3和4(1和2mg/kg)以及阴性对照(1和2mg/kg)以0.1ml的量每周两次(第0、3、7、10、14和17天)注入每只小鼠的尾静脉。对于所有动物，在注射开始时以及在测试期间即将施用之前，测量一般状况和体重。癌细胞移植后，使用游标卡尺对每只动物测量各肿瘤的三个方向(长x宽x高)，从每组平均肿瘤体积达到37.7mm3的时间点到21天共计10次，然后使用等式“长×宽×高/2”计算肿瘤体积。在开始施用21天后，通过肝素管从眼眶静脉收集血液，并以5000rpm离心5分钟，分离出上清液血浆并分配在小瓶中并在-70℃下保存。接下来，将小鼠用CO2气体安乐死，然后分离肿瘤并在化学天平中称重，并对肿瘤组织成像。
实施例2-2：移植人乳腺癌细胞的小鼠血液中肝毒性标记的分析(MDA-MB-231)
从用于抗癌功效评估的小鼠血液中分离血浆，并在丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)检测试剂盒(Biovision，USA)的检测溶液中以适当比例稀释，将20μL稀释液添加到各孔中。此外，还准备了有助于定量血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)数量的标准材料，并将其添加到各孔中。接下来，根据测定试剂盒中提供的方法制备反应溶液(包括测定溶液的酶/染料混合物)，并且将100μL反应溶液加入到各孔中并摇匀。接下来，通过分光光度计测量570nm处的OD。
实施例2-3.移植人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)的小鼠肿瘤组织中VEGF和下游基因 蛋白的表达分析
使用用于抗癌功效评估的小鼠的肿瘤组织，将各随机组的两个组织在100μl RIPA缓冲液中匀浆，并从中分离蛋白质，然后使用如下的抗体在PCT/KR2017/008636中公开的条件下分析蛋白质表达：抗VEGF抗体(SantaCruz Biotech.，USA)、抗VEGFR1抗体(CellSignaling，USA)、抗VEGFR2抗体(Cell Signaling，USA)、抗p-Akt1抗体(Cell Signaling，USA)、抗p-Akt1抗体(Cell Signaling，USA)、抗Bcl2抗体(SantaCruz Biotech.，USA)、抗凋亡抑制蛋白抗体(Cell Signaling，USA)和抗CyclinD 1抗体(SantaCruz Biotech.，USA)。在通过向移植有人乳腺癌细胞的小鼠的尾静脉中施用进行的动物实验中，与阴性对照组不同，在施用后第二天到最后一天的测试时间内，在所有样品施用组中，未观察到异常的一般情况和体重的统计学显著降低(图2b)。另外，在最后一天(第21天)的肿瘤体积的情况下，施用1mg/kg的样品1、2、3和4的组与施用1mg/kg阴性对照的组相比，肿瘤生长抑制率分别为18.4％(p<0.01),26.0％(p<0.001),17.5％(p<0.01)和23.9％(p<0.001)，并且施用2mg/kg的样品1、2、3和4的组与施用2mg/kg阴性对照的组相比，肿瘤生长抑制率分别为30.1％(p<0.001),41.4％(p<0.001),32.6％(p<0.001)和36.4％(p<0.001)。在最后一天的肿瘤的情况下，测量了在开始药物施用后第21天分离的MDA-MB-231肿瘤，结果可见施用1mg/kg的样品1、2、3和4的组与施用1mg/kg阴性对照的组相比，肿瘤重量减少分别为20.3％(p<0.01),28.6％(p<0.001),19.0％(p<0.01)和26.4％(p<0.001)，并且施用2mg/kg的样品1、2、3和4的组与施用2mg/kg阴性对照的组相比，肿瘤重量减少分别为33.3％(p<0.001),43.4％(p<0.001),35.2％(p<0.001)和38.9％(p<0.001)。最后，从抗癌功效评估中所用的小鼠收集血液，并分析血液中是否存在肝毒性标记。结果，在施用样品的所有组均未检测出特定的肝毒性标记(图2f)。此外，可确认在用新型复合物治疗的组中VEGF及其下游基因的表达被有效地抑制(图2g).。
实施例3：PD-L1在移植人乳腺癌细胞的小鼠肿瘤组织中的抑制作用(MDA-MB-231)
已知在多种类型的癌细胞表面表达的PD-L1与T细胞的PD-1结合并持续诱导癌细胞增殖，而免疫细胞不诱导凋亡。因此，将靶向PD-L1的新型复合物靶向移植有高表达PD-L1的人乳腺癌细胞的小鼠的肿瘤组织中，以分析其是否通过抑制PD-L1表现出抗癌作用。
[表8]抑制PD-L1活性的生物活性核酸和载体肽核酸的序列
Figure BDA0002747136060000251
实施例3-1.通过将包含生物活性肽核酸和载体肽核酸的候选复合物施用到移植 有人乳腺癌细胞的小鼠尾静脉中来分析PD-L1蛋白的表达(MDA-MB-231)
按照与实施例2-3相同的方法，从用于抗癌功效评估的小鼠的肿瘤组织中分离蛋白，并使用抗PD-L1抗体(Abcam，GB)分析蛋白表达。
实施例3-2.通过尾静脉施用含生物活性肽核酸和载体肽核酸的候选复合物到移 植了人乳腺癌细胞的小鼠体内评价组织中的抗癌功效(MDA-MB-231)
用与实施例2-1相同的方式对用于抗癌功效评估的小鼠肿瘤组织进行活检，并在4％福尔马林溶液中固定一天。将固定的组织包埋在石蜡中，切成5μm的切片，然后安装在载玻片上。将固定的组织在0.5％BSA溶液中封闭1小时，用针对PD-L1的第一抗体溶液处理，并孵育一天。接下来，除去第一抗体溶液，并用1X PBS洗涤剩余的材料，用第二抗体溶液处理，在室温下孵育2小时，然后通过DAB过滤进行分析。
该实施例中使用的核酸复合物示于下表9中。
[表9]用于评估乳腺癌细胞的抗癌功效的核酸复合物
Figure BDA0002747136060000261
结果，如图3所示，可以证实，在用所述核酸复合物处理的小鼠的肿瘤组织中，蛋白质表达降低并且PD-L1的表达被抑制。
实施例4：通过使用新型复合物抑制人前列腺癌细胞中的雄激素受体来评估抗癌作用
已知前列腺的正常发育和保存取决于雄激素通过雄激素受体(AR)的作用，并且通过调节雄激素受体来维持平衡，因为雄激素诱导凋亡或被新细胞替代。然而，已知当存在睾丸激素或DHT(修饰的睾丸激素)时，雄激素受体的表达增加，导致失去平衡，进而引起癌症。进行了实验以通过抑制DHT诱导的前列腺癌细胞中雄激素受体的表达来确认新型核酸复合物是否在人前列腺癌中表现出抗癌作用。
实施例4-1.细胞培养
人前列腺癌细胞(LNCap)得自ATCC(美国模式培养物保藏所，USA)，在包含10％(v/v)胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640(ATCC)(Roswell ParkMemorial Institute，ATCC，USA)中在37℃和5％(v/v)CO2下培养。
实施例4-2.包含生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物的细胞内引入
通过以下方法产生抑制雄激素受体的新型复合物：制备具有与雄激素受体mRNA(前列腺细胞生长和平衡的必需基因)互补的序列(SEQ ID NO：12-SEQ ID NO：15)的生物活性肽核酸，制备具有与包含促进内含体逃逸的材料的生物活性肽核酸互补的载体肽核酸(SEQ ID NO：16-SEQ ID NO：31)，然后将各生物活性肽核酸与各载体肽核酸等量杂交(参见表10)。处理其中生物活性肽核酸和载体肽核酸彼此结合的复合物的方法如PCT/KR2017/008636中所述。
[表10]用于抑制雄激素受体活性的生物活性核酸和载体肽核酸的序列
Figure BDA0002747136060000271
Figure BDA0002747136060000281
实施例4-3.通过蛋白质印迹法分析基因表达
为了分析该新型复合物抑制雄激素受体的程度，将实施例4-1中培养的细胞以1×105细胞/孔的密度接种到6孔板中，并用DHT(修饰的睾丸激素)处理以增加雄激素受体的表达。4小时后，用所述复合物处理细胞，然后培养72、96、120、144和168小时。在各培养时间后，在PCT/KR2017/008636中公开的条件下，使用抗雄激素受体抗体(Cell Signaling，USA)和抗p-Akt1(Cell Signaling，USA)分析蛋白质表达。
该实施例中使用的核酸复合物示于下表11中。
[表11]用于分析雄激素受体和p-Akt1基因表达的核酸复合物
Figure BDA0002747136060000282
Figure BDA0002747136060000291
结果，由图4可知，DHT增加了雄激素受体的蛋白质表达，并且下游基因p-Akt1被抑制。
实施例5：通过使用新型复合物抑制人前列腺癌细胞中的凝集素评估抗癌作用
凝集素，也称为载脂蛋白J，是存在于体液中的异二聚体糖蛋白。众所周知，到目前为止，凝集素在几乎所有类型的细胞中都能诱导和表达，并参与各种正常的生物学过程，例如精子成熟、脂质转运、组织重构、细胞膜回收、细胞-细胞或细胞-基质相互作用和凋亡。已经报道了凝集素与人类各种恶性肿瘤的发生和发展有关的潜在致癌能力，并且已知凝集素通过抑制调节细胞凋亡的Bax的表达来刺激癌细胞的生长，并且还与癌细胞的抗性有关。进行实验以检查该新型复合物是否通过抑制人前列腺癌细胞中凝集素的过表达来显示抗癌作用。
实施例5-1.细胞培养
从ATCC(美国模式培养物保藏所，USA)获得的前列腺癌细胞(PC-3)在含有10％(v/v)胎牛血清、100单位/毫升的青霉素和100微克/毫升的链霉素的F12K培养基(Kaighn'sHam of F-12培养基，Gibco，USA)中在37℃和5％(v/v)的CO2下培养。
实施例5-2.包含生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物的细胞内引入
通过如下方式制备移植凝集素的新型复合物：制备具有与血管内皮生长必需基因VEGF mRNA互补的序列(SEQ ID NO：32-SEQ ID NO：35)的生物活性肽核酸，制备与包含促进内含体逃逸的生物活性肽核酸互补的载体肽核酸(SEQ ID NO：36-SEQ ID NO：51)，然后使各生物活性肽核酸与各载体肽核酸等量杂交(参见表12)。处理其中生物活性肽核酸和载体肽核酸彼此结合的复合物的方法如PCT/KR2017/008636中所述。
[表12]抑制凝集素活性的生物活性核酸和载体肽核酸序列
Figure BDA0002747136060000292
Figure BDA0002747136060000301
Figure BDA0002747136060000311
实施例5-3.分析人前列腺癌细胞的细胞活力
为了分析新型复合物抑制血管内皮生长因子的程度，将实施例5-1中培养的细胞以6×103细胞/孔的密度接种到96孔板中，用复合物处理，然后培养24、48、72、96和120小时。在各培养时间后，在PCT/KR2017/008636中公开的实验条件下分析细胞活力。
下表13中显示了该实施例中使用的核酸复合物。
[表13]用于分析前列腺癌细胞的细胞活力的核酸复合物
Figure BDA0002747136060000312
Figure BDA0002747136060000321
结果，如图5a和5b所示，在人前列腺癌细胞中证实了该新型复合物通过抑制凝集素降低了细胞活力。
实施例5-4.通过蛋白质印迹法分析基因表达
为了分析新型复合物抑制凝集素的程度，将实施例5-1中培养的细胞以1x105细胞/孔的密度接种到6孔板中，用复合物处理，然后培养24、48、72、96和120小时。在各培养时间之后，在PCT/KR2017/008636中公开的条件下，使用抗凝集素(Abcam，GB)和抗Bax(SantaCruz Biotech.，USA)分析蛋白质表达。
下表14中显示了该实施例中使用的核酸复合物。
[表14]用于分析凝集素和Bax基因的表达的核酸复合物
No. 核酸复合物
1 SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：36
2 SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：37
3 SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：38
4 SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：39
5 SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：44
6 SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：45
7 SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：46
8 SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：47
11 SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：40
12 SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：41
13 SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：42
14 SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：43
15 SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：48
16 SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：49
17 SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：50
18 SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：51
结果，如图5c所示，证实了所述抗凋亡和癌诱导基因凝集素和调节基因Bax的蛋白表达被抑制。
实施例6：检测使用新型复合物人视网膜色素上皮细胞中血管内皮生长因子的抑制作用
使用针对被认为导致黄斑中与年龄相关的黄斑变性的血管内皮生长因子VEGF的新型复合物，以检验以该复合物处理人视网膜色素上皮细胞是否会抑制血管生成。
实施例6-1.细胞培养
人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)得自ATCC(美国模式培养物保藏所，USA)在包含10％(v/v)胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM-F12培养基(改良伊格尔培养基/营养混合物F-12,Gibco,USA)在37℃和5％(v/v)CO2下培养。
实施例6-2.含生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物的细胞内引入
通过以下方式制备移植血管内皮生长因子的新型复合物：制备具有与血管内皮生长必需基因VEGF mRNA互补的序列(SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：3)的生物活性肽核酸，并制备与包含用于促进内含体逃逸的材料的生物活性肽核酸互补的载体肽核酸(SEQ ID NO：4-SEQ ID NO：9)，然后使各生物活性肽核酸与各载体肽核酸等量杂交(参见表2)。处理其中生物活性肽核酸和载体肽核酸彼此结合的复合物的方法如PCT/KR2017/008636中所述。
实施例6-3.人视网膜色素上皮细胞的细胞活力分析
为了分析新型复合物抑制血管内皮生长因子的程度，将实施例6-1中培养的细胞以6×103细胞/孔的密度接种到96孔板中，用所述复合物处理，然后培养24、48、72、96和120小时。在各培养时间后，在PCT/KR2017/008636中公开的实验条件下分析细胞活力。
下表15中显示了该实施例中使用的核酸复合物。
[表15]用于分析视网膜色素上皮细胞的细胞活力的核酸复合物
名称 核酸复合物
原始的 SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4
PNA 1 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4
PNA 2 SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4
PNA 3 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5
PNA 4 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6
PNA 5 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7
PNA 6 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8
结果，如图6a所示，在人视网膜色素上皮细胞中证实了该新型复合物通过抑制血管内皮生长因子而抑制了细胞活力。
实施例6-4.通过蛋白质印迹法分析基因表达
为分析新型复合物抑制血管内皮生长因子的程度，将实施例6-1中培养的细胞以1×105细胞/孔的密度接种到6孔板中，用所述复合物处理，然后培养24、48、72、96和120小时。在各培养时间之后，使用抗VEGF抗体(SantaCruz Biotech.，USA)和抗p-Akt1(CellSignaling，USA)分析蛋白质表达。使用上表15中的核酸复合物。如图1所示。如图6b所示，证实了血管内皮生长因子(VEGF)及其下游基因p-Akt1的蛋白表达被抑制。
实施例6-5.分析玻璃体内注射对小鼠视网膜血管生成的抑制作用
为了检查该新型复合物抑制小鼠视网膜中血管内皮生长因子的程度，向玻璃体内注射了30μg/kg的新型复合物，对来自孕鼠(Nara Biotech Co.，韩国)的P0和P16新生小鼠进行了玻璃体内注射，一周后，与阴性对照组进行比较。在从小鼠分离视网膜之前，将250mg/ml的FITC-葡聚糖(Sigma，USA)注射到眼后，然后分离视网膜并用荧光显微镜进行分析。
下表16中显示了该实施例中使用的核酸复合物。
[表16]核酸复合物分析视网膜血管新生的抑制作用
名称 核酸复合物
PNA双链体 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8
经修饰的PNA双链体1 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6
经修饰的PNA双链体2 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8
结果，如图6c、6d和6e所示，可以证实该新型复合物通过抑制血管内皮生长因子有效地抑制了小鼠视网膜中的血管生成。
实施例6-6.分析用滴眼液抑制小鼠视网膜血管生成
为了检查该新型复合物抑制小鼠视网膜中血管内皮生长因子的程度，对来自孕鼠(Nara Biotech Co.，韩国)的P4新生小鼠用30μg/kg新型复合物作为滴眼剂处理5天每天一次，然后与阴性对照组进行比较。在从小鼠分离视网膜之前，将250mg/ml的FITC-葡聚糖(Sigma，USA)注射到眼后，然后分离视网膜并用荧光显微镜进行分析。
使用修饰的PNA双链体作为新型复合物，其是由SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8表示的核酸复合物。参见图6f，可以证实使用新型复合物作为滴眼剂通过抑制血管内皮生长因子有效地抑制了小鼠视网膜中的血管生成。
实施例7：使用新型复合物检测人呼吸道上皮细胞和肺癌细胞中PDE4B的抑制作用
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是指由于气道的慢性炎症和实质破坏而导致肺功能下降的疾病。该病主要发生在有吸烟史的中年和老年人中，也发生在患有慢性炎症的人中。这种疾病被称为重要疾病，会因呼吸困难而在日常生活中导致身体残疾或功能障碍，并伴有诸如抑郁和焦虑之类的精神问题，并增加住院率和死亡人数。PDE4抑制剂曾用于治疗COPD，但目前尚未使用，因为它伴随有副作用。近年来，已知抑制PDE4B(PDE4家族的成员)通过抑制cAMP的降解表现出抗炎作用。因此，进行了实验以检查该新型复合物通过抑制PDE4B表现出对COPD的治疗作用。
实施例7-1.细胞培养
从ATCC(美国模式培养物保藏所，USA)获得的人呼吸道上皮细胞(NCI-H292)分别在各种包含10％(v/v)胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640(ATCC)(洛斯维·帕克纪念研究所,ATCC,USA)和F12K培养基(Kaighn's改良Ham's F-12培养基,Gibco,USA)中在37℃和5％(v/v)的二氧化碳下培养。
实施例7-2.包含生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物的细胞内引入
通过如下方式制备移植PDE4B的新型化合物：制备具有与PDE4B mRNA(其与cAMP(一种重要的炎症诱导剂)的降解有关)互补的序列(SEQ ID NO：52-SEQ ID NO：55)的生物活性肽核酸，制备与包含促进内含体逃逸的材料的生物活性肽核酸互补的载体肽核酸(SEQID NO：56-SEQ ID NO：63)，然后将各生物活性肽核酸与各载体肽核酸等量杂交(请参见表17)。处理其中生物活性肽核酸和载体肽核酸彼此结合的复合物的方法如PCT/KR2017/008636中所述。
[表17]抑制PDE4B活性的生物活性核酸和载体肽核酸的序列
Figure BDA0002747136060000351
Figure BDA0002747136060000361
实施例7-3蛋白质印迹法分析基因表达
为了分析新型复合物抑制PDE4B的程度，将实施例7-1中培养的细胞以1×105细胞/孔的密度接种到6孔板中，并用复合物处理。4小时后，通过用CSE(Sigma，USA)处理人呼吸道上皮细胞并用LPS(Sigma，USA)处理人肺癌细胞来制备发病模型，并培养72、96和120小时。在各培养时间后，在PCT/KR2017/008636中公开的条件下使用抗PDE4B抗体(Abcam，GB)，抗IL-6抗体(Cell Signaling，USA)和抗TNF-α抗体(SantaCruz Biotech.，USA)分析蛋白质表达。。
下表18中显示了该实施例中使用的核酸复合物。
[表18]用于抑制PDE4B表达的核酸复合物
No. 核酸复合物
1 SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：56
2 SEQ ID NO：52和SEQ ID NO：57
3 SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：58
4 SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：59
5 SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：60
6 SEQ ID NO：53和SEQ ID NO：61
7 SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：62
8 SEQ ID NO：55和SEQ ID NO：63
结果，如图7所示，证实了该新型复合物抑制了因CSE和LPS而增加的PDE4B蛋白表达，和IL-6和TNF-α蛋白表达，其是COPD中代表性的炎症标志物。
实施例8：使用新型复合物检测特应性皮炎中TLR2的抑制作用
为了分析核酸复合物对特应性皮炎的治疗效果，将TLR2(Toll样受体2)用作靶基因。TLR2是当过敏原或细菌穿透皮肤时表达的基因。TLR2在特应性皮炎患者中过表达，并且由于皮肤中炎性细胞因子引起的炎症增加而加剧了特应性皮炎。因此，TLR2被认为是特应性皮炎的重要靶标。
实施例8-1：细胞培养
从CLS(德国CLS细胞系服务)获得的人角质细胞(HaCaT)在含有10％(v/v)胎牛血清、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基(改良伊格尔培养基，韩国Welgene)中在37℃和5％(v/v)的CO2下培养。为了制备模拟特应性皮炎的细胞模型，将细胞用5ng/mL室内尘螨提取物和5μM DNCB(2-二硝基氯苯)处理，并孵育一天。
实施例8-2含生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物的细胞内引入
通过如下方式制备抑制TLR2的新型复合物：制备具有与TLR2 mRNA互补的序列(SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65)的生物活性肽核酸，制备与包含有助于内含体逃逸的材料的生物活性肽核酸互补的载体肽核酸(SEQ ID NO：66-SEQ ID NO：71)，然后将各生物活性肽核酸与各载体肽核酸等量杂交(参见表19)。处理其中生物活性肽核酸和载体肽核酸彼此结合的复合物的方法如PCT/KR2017/008636中所述。
[表19]抑制TLR2活性的生物活性核酸和载体肽核酸的序列
Figure BDA0002747136060000371
Figure BDA0002747136060000381
实施例8-3：人角质细胞中细胞活力的变化
为了分析新型复合物抑制TLR2的程度，将实施例8-1中培养的细胞以6×103细胞/孔的密度接种到96孔板中，用所述复合物处理，然后培养24、48和72小时。在各培养时间后，在PCT/KR2017/008636中公开的实验条件下分析细胞活力。
结果，在图8a中，证实了在人角质细胞中，该新型复合物通过抑制TLR2降低了细胞活力。
实施例8-4：通过蛋白质印迹分析法分析基因表达
为了分析新型复合物抑制TLR2的程度，将实施例8-1中培养的细胞以1x105细胞/孔的密度接种到6孔板中，用所述复合物处理，然后培养24、48和72小时。在各培养时间后，使用抗TLR2抗体(SantaCruz Biotech.，USA)，抗p-NF-kB(Cell Signaling，USA)，抗MyD88(Cell Signaling，USA)和抗TARC在PCT/KR2017/008636中公开的条件下分析蛋白质表达。
下表20中显示了该实施例中使用的核酸复合物。
[表20]用于TLR2抑制分析的核酸复合物
No. 核酸复合物
1 SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：65
2 SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：66
3 SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：67
4 SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：69
5 SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：70
6 SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：71
结果，如图8b所示，证实了用核酸复合物处理抑制了TLR2和下游基因的表达。
实施例8-5：在使用屋尘螨提取物和DNCB制备的特应性皮炎诱导的动物模型中对 特应性皮炎表型的作用分析
通过刮除NC/Nga小鼠的背部并每周两次施用100mg的AD乳膏(房尘螨提取物乳膏，Biostir，日本)，共3周来制备由房尘螨引起的特应性皮炎的动物模型。另外，通过剃光Balb/C小鼠的背部并每周两次施用50μM DNCB，共3周来制备由病房综合症诱导的具有特应性皮炎的动物模型。各动物模型每周共用核酸复合物的乳膏制剂处理3次，并进行成像，然后通过Image J测量背部毛发的生长程度。
下表21中显示了该实施例中使用的核酸复合物。
[表21]核酸复合物用于特应性皮炎表型分析
名称 核酸复合物
PNA 1 SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：67
PNA 2 SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：70
结果，证实了在用新型核酸复合物治疗的组中降低了特应性皮炎表型(图8c)。
实施例8-6：血清中IgE和TARC浓度的变化分析
在实施例8-5的条件下进行的动物实验的最后一天，通过眼眶静脉收集小鼠血液，在室温下静置2小时或更长时间，然后在14,000rpm下离心15分钟，然后收集血清。使用IgEELISA试剂盒(KOMABIOTECH Inc.，韩国)和TARC ELISA试剂盒(R&D系统，USA)中提供的实验方法测量收集的血清中IgE和TARC的浓度。
使用了上表21所示的核酸复合物。结果，可以证实，与诱导异位性皮炎的对照组不同，用新型核酸复合物治疗的组中的IgE和TARC的浓度降低至与阴性对照组相似的水平(图5。8d)。
实施例8-7：通过H&E染色分析特应性诱导动物模型的表型
在实施例8-5的条件下进行的动物实验的最后一天，对小鼠的耳朵组织进行活检并在4％福尔马林溶液中固定一天。将固定的组织包埋在石蜡中，切成5μm，并安装在载玻片上。用苏木精：伊红染色溶液将固定的组织染色预定时间，用1X PBS洗涤，然后用显微镜分析。
使用了上表21所示的核酸复合物。结果，可以证实，与源自牛皮癣的对照组相比，用新型核酸复合物处理的组中降低了表皮的异常生长(图8e)。
实施例8-8：通过免疫染色分析特应性诱导的动物模型的组织中的炎症标记
在实施例8-5的条件下进行的动物实验的最后一天，对小鼠背部组织进行活检并在4％福尔马林溶液中固定一天。将固定的组织包埋在石蜡中，切成5μm，并安装在载玻片上。将固定的组织在0.5％BSA溶液中封闭1小时，用针对CD3的第一抗体溶液处理，并孵育一天。接下来，除去第一抗体溶液，并用1X PBS洗涤剩余的材料，用第二抗体溶液处理，在室温下孵育2小时，然后通过DAB过滤进行分析。
使用了上表21所示的核酸复合物。结果，与特应性诱导的对照组相比，在用新型核酸复合物治疗的组中减少了组织中的炎性标记物CD3(图8f)。
实施例9：使用新型复合物检测Smad3在皮肤再生中的抑制作用
为了分析核酸复合物的皮肤再生效果，将Smad3用作靶基因。Smad3是一种在受伤的皮肤中过度表达的蛋白质，被认为是皮肤再生的重要目标。
实施例9-1：细胞培养
从CLS(德国CLS细胞系服务，德国)获得的人角质形成细胞(HaCaT)在含有10％(v/v)胎牛血清，100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基(改良伊格尔培养基，韩国Welgene)中在37℃和5％(v/v)的CO2下培养。
实施例9-2含生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物的细胞内引入
通过如下方式制备抑制Smad3的新型复合物：制备具有与Smad3 mRNA(其在受伤部位中过表达)互补的序列(SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73)的生物活性肽核酸，制备与包含有助于内含体逃逸的材料的生物活性肽核酸互补的载体肽核酸(SEQ ID NO：74-SEQ IDNO：78)，然后使各生物活性肽核酸与各载体肽核酸等量杂交(参见表22)。处理其中生物活性肽核酸和载体肽核酸彼此结合的复合物的方法如PCT/KR2017/008636中所述。
[表22]用于抑制Smad3活性的生物活性核酸和载体肽核酸的序列
Figure BDA0002747136060000401
实施例9-3：通过伤口愈合分析法分析细胞迁移
为了分析新型复合物抑制Smad3的程度，将实施例9-1中培养的细胞以1×104细胞/孔的密度接种到24孔板中，并用所述复合物处理，然后培养24和48小时。在各培养时间之后，分析复合物对人角质形成细胞的人工受伤部分中细胞迁移的影响。
下表23中显示了该实施例中使用的核酸复合物。
[表23]用于分析角质形成细胞中细胞迁移的核酸复合物
名称 核酸复合物
PNA 1 SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：75
PNA 2 SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：77
PNA 3 SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：78
结果，如图9a所示，证实了新型复合物增加了细胞迁移。
实施例9-4：通过蛋白质印迹分析法分析基因表达
为了分析新型复合物抑制Smad3的程度，将实施例9-1中培养的细胞以1x105细胞/孔的密度播种到6孔板中，用所述复合物处理，然后培养24、48和72小时。在各培养时间之后，在PCT/KR2017/008636中公开的条件下，使用抗p-smad3抗体(Cell Signaling，USA)分析蛋白质表达。
下表24中显示了该实施例中使用的核酸复合物。
[表24]用于分析Smad3抑制作用的核酸复合物
No. 核酸复合物
1 SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：74
2 SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：75
3 SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：76
4 SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：77
5 SEQ ID NO：73和SEQ ID NO：78
6 SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：74
7 SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：75
8 SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：76
9 SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：77
10 SEQ ID NO：72和SEQ ID NO：78
结果，如图9b所示，可以证实该新型复合物降低了人角质形成细胞中smad3的表达。
实施例10：使用新型复合物检测瘢痕疙瘩中TIEG1的抑制作用
为了分析新型核酸复合物对瘢痕疙瘩的治疗效果，将TIEG1用作靶蛋白。TIEG1是一种在瘢痕疙瘩患者皮肤组织中过度表达的蛋白质，被认为是瘢痕疙瘩治疗中的重要靶标。
实施例10-1：细胞培养
人瘢痕疙瘩成纤维细胞(KEL FIB)在包含10％(v/v)胎牛血清，100单位/毫升青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基中在37℃和5％(v/v)的CO2下培养。
实施例10-2.包含生物活性肽核酸和载体肽核酸的复合物的细胞内引入
通过如下方式制备抑制TIEG1的新型复合物：制备具有与TIEG1 mRNA(其在瘢痕疙瘩部位过表达)互补的序列(SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：80)，制备与包含用于促进内含体逃逸的材料的生物活性肽核酸互补的载体肽核酸(SEQ ID NO：NO：81-SEQ ID NO：84)，然后使各生物活性肽核酸与各载体肽核酸等量杂交(参见表25)。处理其中生物活性肽核酸和载体肽核酸彼此结合的复合物的方法如PCT/KR2017/008636中所述。
[表25]用于抑制TIEG1的生物活性核酸和载体肽核酸的序列
Figure BDA0002747136060000421
实施例10-3：人瘢痕疙瘩成纤维细胞中细胞活力的分析
为了分析新型复合物抑制TIEG1的程度，将实施例10-1中培养的细胞以6×103细胞/孔的密度接种到96孔板中，并用所述复合物处理，然后培养24、48、72和96小时。在各培养时间后，在PCT/KR2017/008636中公开的实验条件下分析细胞活力。
使用了SEQ ID NO：79和SEQ ID NO:81-84中任一所示的核酸复合物(反义PNA)，SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：81-84中任一所示的核酸复合物(修饰的反义PNA)。结果，如图10a所示，在人瘢痕疙瘩成纤维细胞中证实了该新型复合物通过抑制TIEG1降低了细胞活力。
实施例10-4：通过蛋白质印迹分析法分析基因表达
为了分析新型复合物抑制TIEG1的程度，将实施例10-1中培养的细胞以1x105细胞/孔的密度接种到6孔板中，用所述复合物处理，然后培养24、48和72小时。在各培养时间之后，在PCT/KR2017/008636公开的条件下，使用抗TIEG1抗体(SantaCruz Biotech.，USA)，抗p-smad2(Cell Signaling，USA)和抗smad7(SantaCruz Biotech，USA)来分析蛋白质表达。
下表26中显示了该实施例中使用的核酸复合物。
[表26]用于TIEG1抑制分析的核酸复合物
No. 核酸复合物
1 SEQ ID NO：79和SEQ ID NO：81
2 SEQ ID NO：79和SEQ ID NO：82
3 SEQ ID NO：79和SEQ ID NO：83
4 SEQ ID NO：79和SEQ ID NO：84
5 SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：81
6 SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：82
7 SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：83
8 SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：84
结果，如图10b所示，可以证实该新型复合物减少并增加了人成纤维细胞中TIEG1和下游基因的表达。
工业适用性
包含生物活性核酸和载体肽核酸的根据本发明的结构式(1)的核酸复合物可以增加生物活性核酸的稳定性，减少生物活性核酸的损失，例如由自聚集引起的沉淀，增加了生物活性核酸的细胞内递送效率，并易于调节靶基因的表达。
特别地，由于根据本发明的核酸复合物中的生物活性核酸与载体肽核酸之间的结合仅在生物活性核酸靶向的靶基因存在下才被分离，因此生物活性核酸具有高选择性和高选择性。与仅将生物活性核酸进行细胞内导入相比，对靶基因的特异性更高。另外，由于可以通过生物活性核酸和载体肽核酸之间的各种结构组合来调节结合亲和力来产生复合物，所以可以控制生物活性核酸在细胞内或细胞外起作用的时间点。
另外，由于核酸复合物包含促进内含体逃逸的材料，因此通过内吞作用进入细胞的核酸复合物可以有效地在细胞质中表现出活性。
尽管已经参考特定特征详细描述了本发明，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，该描述仅是其优选实施例，并且不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求及其等同物来限定。
序列表
<110> 海阳制药股份有限公司
<120> 具有内含体逃逸能力的肽核酸复合物及其用途
<130> PP-B2087
<150> KR 10-2018-0015750
<151> 2018-02-08
<160> 86
<170> KoPatentIn 3.0
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<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 61
aggtgtagtt tcgtga 16
<210> 62
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 62
agtgc 5
<210> 63
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 63
aggtgtagtt tcgtga 16
<210> 64
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 64
atgtaggtga tcctgtt 17
<210> 65
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 65
atgtaggtga tcctgtt 17
<210> 66
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 66
aacag 5
<210> 67
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 67
aacag 5
<210> 68
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 68
gacaa 5
<210> 69
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 69
tacatccact aggacaa 17
<210> 70
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 70
tacaggatca cctacat 17
<210> 71
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 71
tacatccact aggacaa 17
<210> 72
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 72
tgtcaagcca ctgca 15
<210> 73
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 73
tgtcaagcca ctgca 15
<210> 74
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 74
tgcag 5
<210> 75
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 75
tgcag 5
<210> 76
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 76
acagttcggt gacgt 15
<210> 77
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 77
tgcagtggct tgaca 15
<210> 78
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 78
acagttcggt gacgt 15
<210> 79
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 79
gcttctacag cttca 15
<210> 80
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 80
gcttctacag cttca 15
<210> 81
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 81
tgaag 5
<210> 82
<211> 5
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 82
tgaag 5
<210> 83
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 83
tgaagctgta gaagc 15
<210> 84
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> PNA
<400> 84
tgaagctgta gaagc 15
<210> 85
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 肽
<400> 85
Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln
20 25
<210> 86
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 肽
<400> 86
Gly Leu Phe Asp Ile Ile Lys Lys Ile Ala Glu Ser Phe
1 5 10

Claims (36)

1.一种核酸复合物具有以下结构式(1)的结构:
结构式(1)
[mA≡mC(+)]
其中，
A代表具有能够与靶标基因结合的序列或靶标基因序列的生物活性核酸；
C代表能够与所述生物活性核酸结合的载体肽核酸；
‘≡’代表所述生物活性核酸与所述载体肽核酸之间的互补结合；
‘m’代表用于促进所述生物活性核酸和所述载体肽核酸的内含体逃逸的材料；
A代表的所述生物活性核酸为大体上带负电荷或中性；
C(+)表示所述载体肽核酸为大体上带正电荷；以及
所述载体肽核酸包含一个或多个经修饰的肽核酸单体，以使得所述载体肽核酸大体上带正电荷。
2.如权利要求1所述的核酸复合物，其中所述用于促进内含体逃逸的材料结合到每个所述生物活性核酸和所述载体肽核酸的5’端和/或3’端。
3.如权利要求2所述的核酸复合物，其中所述用于促进内含体逃逸的材料为选自下组中的一个或多个：肽、脂质纳米颗粒、核酸复合物纳米颗粒、聚合物纳米球、无机纳米颗粒、基于阳离子脂质的纳米颗粒、阳离子聚合物、和pH敏感性聚合物。
4.如权利要求3所述的核酸复合物，其中
所述肽选自下组：GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(SEQ ID NO:85)、GLFDIIKKIAESF(SEQID NO:86)、和组氨酸(10)，
所述脂质纳米颗粒选自下组：脂质、磷脂、棕榈酸鲸蜡酯、泊洛沙姆18、吐温85、三硬脂酸甘油酯、和吐温80，
所述核酸复合物纳米颗粒是聚(酰胺基酰胺)或聚乙烯亚胺(PEI)，
所述聚合物纳米球选自下组：聚己内酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚丙交酯、聚乙交酯、聚(d,l-丙交酯)、壳聚糖、和PLGA-聚乙二醇，
所述无机纳米颗粒选自下组：Fe2O3 Fe3O4、WO3、和WO2.9，
所述基于阳离子脂质的纳米颗粒选自下组：1-(氨基乙基)亚氨基二[N-(油酰基半胱氨酰基-1-氨基-乙基)丙酰胺]、PTA的N-烷基化衍生物、和3,5-双十二烷氧基苯甲脒，
所述阳离子聚合物选自下组：乙烯吡咯烷酮-N,N-二甲基氨基乙基甲基丙烯酸二乙基磷酸盐、聚异丁烯、和聚(N-乙烯咔唑)，和
所述pH敏感性聚合物选自下组：多元酸、聚(甲基丙烯酸)、和水解的聚丙烯酰胺。
5.如权利要求1所述的核酸复合物，其中每个所述生物活性核酸和所述载体肽核酸包含2-50个核酸单体。
6.如权利要求1所述的核酸复合物，其中所述生物活性核酸选自下组：DNA、RNA、LNA、PNA、和经修饰的核酸。
7.如权利要求1所述的核酸复合物，其中所述载体肽核酸由与所述生物活性核酸部分或完全互补的核苷酸序列构成。
8.如权利要求7所述的核酸复合物，其中所述由与所述生物活性核酸部分或完全互补的核苷酸序列构成的载体肽核酸包含一个或多个通用碱基。
9.如权利要求1所述的核酸复合物，其为大体上带正电荷的。
10.如权利要求1所述的核酸复合物，其中所述载体肽核酸包含一个或多个γ-或α-骨架经修饰的肽核酸单体以使得其大体上带正电荷。
11.如权利要求10所述的核酸复合物，其中所述γ-或α-骨架经修饰的肽核酸单体在其骨架中包含选自下组中的一个或多个带正电荷的氨基酸：赖氨酸、精氨酸、组氨酸、二氨基丁酸、鸟氨酸、和氨基酸类似物，以使其为电正性的。
12.如权利要求10所述的核酸复合物，其中所述的γ-或α-骨架经修饰的肽核酸单体在其骨架中包含谷氨酸或天冬氨酸或带负电荷的氨基酸的氨基酸类似物。
13.如权利要求10所述的核酸复合物，其中所述肽核酸单体所含的具有带正电荷的氨基酸的单体的数量多于具有带负电荷的氨基酸的单体的数量，由此使得载体肽核酸大体上带正电荷。
14.如权利要求1所述的核酸复合物，其中选自下组的至少一种物质结合到所述生物活性核酸和/或所述载体肽核酸：疏水性部分、亲水性部分、靶标抗原特异性抗体、适配子、猝灭子、荧光标记、和冷光标记。
15.如权利要求1所述的核酸复合物，其中选自下组的至少一种物质通过单共价键或接头介导的共价键以实现与所述生物活性核酸和/或所述载体肽核酸的结合：疏水性部分、亲水性部分、靶标抗原特异性抗体、适配子、猝灭子、荧光标记、和冷光标记，其。
16.如权利要求1所述的核酸复合物，其中根据每个核酸的5’-方向性和3’-方向性，所述生物活性核酸与所述载体肽核酸之间的结合为平行结合或逆平行结合。
17.如权利要求1所述的核酸复合物，其中所述生物活性核酸与所述载体肽核酸之间的结合亲和性低于所述生物活性核酸与所述生物活性核酸所靶向的基因之间的结合亲和性。
18.如权利要求17所述的核酸复合物，其中所述生物活性核酸与所述的载体肽核酸之间的结合为平行结合或部分特异性结合。
19.如权利要求17所述的核酸复合物，其中所述载体肽核酸具有选自下组中的至少一种肽核碱基：接头、通用碱基、和具有不与所述生物活性核酸的相应碱基互补的碱基的肽核碱基。
20.如权利要求19所述的核酸复合物，其中所述通用碱基是选自下组中的任一个或多个：肌苷PNA、吲哚PNA、硝基吲哚PNA、和脱碱基PNA，其是与包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶的天然碱基非选择性地结合的碱基，并且与互补结合亲和性相比具有较低的结合亲和性。
21.如权利要求17所述的核酸复合物，其中通过控制所述生物活性核酸与所述载体肽核酸之间的结合亲和性，来控制所述生物活性核酸与所述载体肽核酸之间的分离时间或者所述生物活性核酸与所述生物活性核酸靶向的基因之间的结合时间。
22.如权利要求1所述的核酸复合物，其中所述核酸复合物的粒径为5nm-300nm。
23.如权利要求22所述的核酸复合物，其中通过控制所述核酸复合物的电荷平衡，来控制该核酸复合物的粒径。
24.一种用于诊断疾病的组合物，包括如权利要求1-23中任一项所述的核酸复合物。
25.一种用于预防或治疗疾病的组合物，包括如权利要求1-23中任一项所述的核酸复合物。
26.如权利要求25所述的组合物，其中所述疾病为癌症、炎性疾病、年龄相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、慢性阻塞性肺病(COPD)、罕见重病、心血管疾病、代谢疾病、或皮肤疾病。
27.如权利要求26所述的组合物，其中所述核酸复合物中所含的所述生物活性核酸所结合的靶标基因是选自下组中的一个或多个：VEGF、PD-L1、雄激素受体、凝集素、TGFβR2、ERBB3、ABCB1和PDE4B，且所述疾病是癌症。
28.如权利要求27所述的组合物，其中所述癌症是乳腺癌、前列腺癌、或肺癌。
29.如权利要求26所述的组合物，其中所述核酸复合物中所含的所述生物活性核酸所结合的靶标基因是VEGF，且所述疾病是年龄相关的黄斑变性或糖尿病性视网膜病变。
30.如权利要求26所述的组合物，其中所述核酸复合物中所含的所述生物活性核酸所结合的靶标基因是PDE4B，且所述疾病是慢性阻塞性肺病(COPD)。
31.如权利要求26所述的组合物，其中所述核酸复合物中所含的生物活性核酸所结合的靶标基因是选自下组中的任一个或多个：TLR2、Smad3，IFI16、TLR6和TIEG1，且所述疾病是皮肤疾病。
32.如权利要求31所述的组合物，其中所述皮肤疾病是银屑病、色素淀积相关的皮肤疾病、特应性皮炎、皮肤损伤、或瘢痕疙瘩。
33.如权利要求31所述的组合物，其具有选自下组的任何一种制剂：水溶液、乳膏、凝胶、糊剂、乳液、和软膏。
34.一种用于调节靶标基因表达的组合物，包括如权利要求1-23中任一项所述的核酸复合物。
35.一种使用如权利要求1-23中任一项所述的核酸复合物调节靶标基因表达的方法。
36.如权利要求35所述的方法，包括：
(a)通过将包含用于促进内含体逃逸的材料的生物活性核酸与载体肽核酸之间的结合形成复合物；和
(b)通过将所述复合物与细胞、细菌、真菌或寄生物接触，将该复合物引入生物体和细胞内。
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