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CN112119099A - 三特异性抗原结合蛋白 - Google Patents

三特异性抗原结合蛋白 Download PDF

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CN112119099A
CN112119099A CN201980016065.6A CN201980016065A CN112119099A CN 112119099 A CN112119099 A CN 112119099A CN 201980016065 A CN201980016065 A CN 201980016065A CN 112119099 A CN112119099 A CN 112119099A
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CN
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protein
antigen binding
cell
cells
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CN201980016065.6A
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莱昂纳多·博拉斯
多米尼克·埃舍尔
克里斯蒂安·瓦尔德马·温格·莱斯纳
法比安·沙伊费勒
托马斯·施莱尔
菲利普·罗伯特·瑞克雷
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Original Assignee
Cdr Biotechnology Co ltd
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Abstract

提供了包含以下的三特异性抗原结合蛋白：能够结合肿瘤细胞的细胞表面蛋白的第一结合结构域；能够结合该肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白的第二结合结构域；以及能够结合免疫细胞的细胞表面蛋白的第三结合结构域。提供了制备三特异性抗原结合蛋白的方法。

Description

三特异性抗原结合蛋白
技术领域
本披露涉及制备三特异性抗原结合蛋白的组合物和方法。
背景技术
双特异性T细胞衔接器通过CD3激活T细胞，并使它们与肿瘤表达的抗原交联，从而诱导免疫突触形成和肿瘤细胞裂解。双特异性T细胞衔接器已在患有液体肿瘤的患者中显示出治疗功效；但是，它们并不能使所有患者受益。抗肿瘤免疫受到PD-1/PD-L1途径介导的免疫抑制的限制，并且无法从现有的双特异性T细胞衔接器中获益的患者可能不会产生反应，因为其T细胞通过PD-1/PD-L1途径被无能化(anergized)。阻断免疫检查点分子(如PD-L1)的单克隆抗体的使用可能有助于增加使免疫系统转向对抗肿瘤的基线T细胞特异性免疫反应。但是，免疫检查点分子功能的破坏会导致患者的免疫耐受性(引起不受抑制的免疫反应)和免疫毒性的失衡。
肿瘤相关抗原(TAA)和癌细胞表面免疫检查点的双重靶向被认为可增强治疗功效、限制主要逃逸机制并增加肿瘤靶向选择性，从而导致全身毒性降低和治疗指数提高。然而，这些策略典型地依赖于对免疫检查点的降低的亲和力和对肿瘤相关抗原的高亲和力。这些策略无法解决与TAA在正常组织上的表达或细胞表面抗原脱落有关的问题，这些问题可能会形成“抗原沉默(antigensink)”，从而阻止治疗性抗体在体内到达预期的肿瘤细胞靶标(参见，例如Piccione等人mAbs[单克隆抗体]，7(5)：946-956，2015；Herrmann等人Blood[血液]，132(23)：2484-2494，2018)。
需要能够更加高效地将免疫细胞募集到肿瘤、、同时选择性地抑制肿瘤上的免疫检查点分子同时最大程度地减少患者的免疫耐受性和免疫毒性的失衡的多特异性抗体。
发明内容
本发明提供对肿瘤抗原和免疫细胞募集抗原具有特异性的三特异性抗原结合蛋白。
本发明涉及结合T细胞和通过CD3激活T细胞，结合肿瘤特异性抗原，并抑制免疫检查点途径的三特异性T细胞衔接器。为了防止免疫系统不加选择地攻击细胞，这些三特异性抗原结合蛋白以低亲和力结合免疫检查点，从而允许与细胞表面免疫检查点蛋白(像PD-L1)快速解离。与肿瘤相关抗原和免疫检查点蛋白PD-L1同时结合赋予亲合力，导致与肿瘤细胞上存在的抗原结合。这允许更好地区分具有和不具有主要存在于肿瘤细胞中的抗原的细胞。
此外，本发明评价了亲和力和亲合力在三特异性抗原结合蛋白促进生理条件下选择性肿瘤靶向的能力中的组合作用，该三特异性抗原结合蛋白由低亲和力的抗肿瘤相关抗原部分组成，与一系列亲和力调节的PD-L1变体配对。
此外，本发明描述了使本发明的三特异性抗原结合蛋白能够高效地产生和发展的多功能重组抗原结合蛋白形式。这些多功能抗原结合蛋白形式利用Fab片段的重链(Fd片段)和轻链(L)的高效异源二聚化特性形成支架，在该支架上通过另外的结合剂引入另外的功能，其中这些结合剂包括但不限于scFv和单结构域抗原结合蛋白。
在本发明的一个方面，提供了三特异性抗原结合蛋白，该三特异性抗原结合蛋白包含：a)能够结合肿瘤细胞的细胞表面蛋白的第一结合结构域；b)能够结合该肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白的第二结合结构域；以及c)能够与免疫细胞的细胞表面蛋白结合的第三结合结构域，其中该第一结合结构域以降低的亲和力与肿瘤细胞的细胞表面蛋白结合，从而抑制与非肿瘤细胞或可溶形式的细胞表面蛋白的结合。
在本发明的一个方面，提供了三特异性抗原结合蛋白，该三特异性抗原结合蛋白包含：a)能够结合肿瘤细胞的细胞表面蛋白的第一结合结构域；b)能够结合该肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白的第二结合结构域；以及c)能够与免疫细胞的细胞表面蛋白结合的第三结合结构域，其中该第一和第二结合结构域以降低的亲和力结合靶抗原，从而抑制与非肿瘤细胞的结合。
在某些实施例中，该肿瘤细胞的细胞表面蛋白选自由BCMA、CD19、CD20、CD33、CD123、CEA、LMP1、LMP2、PSMA、FAP和HER2组成的组。
在某些实施例中，该第一结合结构域结合肿瘤细胞上的BCMA。
在某些实施例中，该肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白选自由CD40、CD47、CD80、CD86、GAL9、PD-L1和PD-L2组成的组。
在某些实施例中，该第二结合结构域结合肿瘤细胞上的PD-L1。
在某些实施例中，该第三结合结构域结合免疫细胞上的CD3、TCRα、TCRβ、CD16、NKG2D、CD89、CD64或CD32a。
在某些实施例中，该第三结合结构域结合免疫细胞上的CD3。
在某些实施例中，该第一结合结构域亲和力在约1nM至约100nM之间。
在某些实施例中，该第二结合结构域亲和力在约1nM至约100nM之间。
在某些实施例中，该第一结合结构域亲和力在约10nM至约80nM之间。
在某些实施例中，该第二结合结构域亲和力在约10nM至约80nM之间。
在某些实施例中，该第一和第二结合结构域结合同一细胞上的靶抗原以增加结合亲合力。
在某些实施例中，该第一结合结构域包括对肿瘤细胞的细胞表面蛋白的低亲和力，以减少与健康细胞或可溶形式的细胞表面蛋白的交联。
在某些实施例中，该第二结合结构域包括对肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白的低亲和力，以减少与健康细胞的交联。
在某些实施例中，该第一和第二结合结构域各自包括对肿瘤细胞的靶抗原的低亲和力，其中相对于与健康细胞的交联，该三特异性抗原结合蛋白包括与肿瘤细胞的增强的交联。
1在某些实施例中，该第一和第二结合结构域结合同一细胞上的靶抗原以减少与健康组织的脱靶结合。
在某些实施例中，该第一、第二和第三结合结构域具有减少的脱靶结合。
在某些实施例中，肿瘤细胞的细胞表面蛋白在健康细胞上不存在或相对于肿瘤细胞表达有限。
在某些实施例中，该第二结合结构域对肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白具有低亲和力，从而减少对健康细胞的检查点抑制。
在某些实施例中，该第一、第二和第三结合结构域包括抗体。
在某些实施例中，该第一、第二和第三结合结构域包括scFv、sdAb或Fab片段。
在某些实施例中，该第二结合结构域是单价的。
在某些实施例中，该第三结合结构域是单价的。
在某些实施例中，该第一、第二和第三结合结构域通过一个或多个接头连接在一起。
在某些实施例中，该三特异性抗原结合蛋白具有约75kDa至约100kDa的分子量。
在某些实施例中，该三特异性抗原结合蛋白相对于分子量≤约60kDa的抗原结合蛋白具有增加的血清半衰期。
在本发明的一个方面，提供了三特异性抗原结合蛋白，该三特异性抗原结合蛋白包含：a)能够结合肿瘤细胞的细胞表面蛋白的第一结合结构域；b)能够结合该肿瘤细胞的表面上的PD-L1的第二结合结构域；以及c)能够与T细胞表面的CD3结合的第三结合结构域，其中该第一和第二结合结构域以降低的亲和力与肿瘤细胞的细胞表面蛋白和PD-L1结合，从而抑制与非肿瘤细胞的结合。
在某些实施例中，该肿瘤细胞的细胞表面蛋白选自由BCMA、CD19、CD20、CD33、CD123、CEA、LMP1、LMP2、PSMA、FAP和HER2组成的组。
在某些实施例中，该第一结合结构域结合肿瘤细胞上的BCMA。
在某些实施例中，该第一结合结构域亲和力在约1nM至约100nM之间。
在某些实施例中，该第二结合结构域亲和力在约1nM至约100nM之间。
在某些实施例中，该第一结合结构域亲和力在约10nM至约80nM之间。
在某些实施例中，该第二结合结构域亲和力在约1nM至约80nM之间。
在某些实施例中，该第一和第二结合结构域结合同一细胞上的靶抗原以增加结合亲合力。
在某些实施例中，该第一结合结构域包括对肿瘤细胞的细胞表面蛋白的低亲和力，以减少与健康细胞或可溶形式的细胞表面蛋白的交联。
在某些实施例中，该第二结合结构域包括对肿瘤细胞的表面上的PD-L1的低亲和力，以减少与健康细胞的交联。
在某些实施例中，该第一和第二结合结构域各自包括对肿瘤细胞的靶抗原的低亲和力，其中相对于与健康细胞的交联，该三特异性抗原结合蛋白包括与肿瘤细胞的增强的交联。
在某些实施例中，该第一和第二结合结构域结合同一细胞上的靶抗原以减少与健康组织的脱靶结合。
在某些实施例中，该第一、第二和第三结合结构域具有减少的脱靶结合。
在某些实施例中，肿瘤细胞的细胞表面蛋白在健康细胞上不存在或相对于肿瘤细胞表达有限。
在某些实施例中，该第二结合结构域对肿瘤细胞的表面上的PD-L1具有低亲和力，以减少对健康细胞的检查点抑制。
在某些实施例中，该第一、第二和第三结合结构域包括抗体。
在某些实施例中，该第一、第二和第三结合结构域包括scFv、sdAb或Fab片段。
在某些实施例中，该第二结合结构域是单价的。
在某些实施例中，该第三结合结构域是单价的。
在某些实施例中，该第一、第二和第三结合结构域通过一个或多个接头连接在一起。
在某些实施例中，该三特异性抗原结合蛋白具有约75kDa至约100kDa的分子量。
在某些实施例中，该三特异性抗原结合蛋白相对于分子量≤约60kDa的抗原结合蛋白具有增加的血清半衰期。
在本发明的一个方面，提供了三特异性抗原结合蛋白，该三特异性抗原结合蛋白包含：a)能够结合肿瘤细胞的细胞表面蛋白的第一抗体结合结构域；b)能够结合该肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白的第二抗体结合结构域；以及c)能够结合免疫细胞的细胞表面蛋白的第三抗体结合结构域。
在本发明的一个方面，提供了包含两条不同的链的三特异性抗原结合蛋白，其中：a)一条链包含与至少一个另外的结合结构域连接的Fab片段的至少一条重链(Fd片段)；并且b)另一条链包含与至少一个另外的结合结构域连接的Fab片段的至少一条轻链(L)，其中该Fab结构域任选地用作特异性异源二聚化支架，这些另外的结合结构域任选地与之连接，并且这些结合结构域具有不同的特异性。
在某些实施例中，这些另外的结合结构域是scFv或sdAb。
在某些实施例中，该三特异性结合蛋白包含：i)能够结合肿瘤细胞的细胞表面蛋白的第一结合结构域；ii)能够结合该肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白的第二结合结构域；以及iii)能够结合免疫细胞的细胞表面蛋白的第三结合结构域。
在某些实施例中，这些另外的结合结构域连接至Fab片段的重链或轻链的N末端或C末端。
在本发明的一个方面，提供了治疗受试者中癌症的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的三特异性抗原结合蛋白，其中该三特异性抗原结合蛋白包含：a)能够结合肿瘤细胞的细胞表面蛋白的第一结合结构域；b)能够结合该肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白的第二结合结构域；以及c)能够与免疫细胞的细胞表面蛋白结合的第三结合结构域，其中该第一和第二结合结构域以降低的亲和力结合靶抗原，从而抑制与非肿瘤细胞的结合。
在某些实施例中，该肿瘤细胞的细胞表面蛋白选自由BCMA、CD19、CD20、CD33、CD123、CEA、LMP1、LMP2、PSMA、FAP和HER2组成的组。
在某些实施例中，该第一结合结构域结合肿瘤细胞上的BCMA。
在某些实施例中，该肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白选自由CD40、CD47、CD80、CD86、GAL9、PD-L1和PD-L2组成的组。
在某些实施例中，该第二结合结构域结合肿瘤细胞上的PD-L1。
在某些实施例中，该第三结合结构域结合免疫细胞上的CD3、TCRα、TCRβ、CD16、NKG2D、CD89、CD64或CD32a。
在某些实施例中，该第三结合结构域结合免疫细胞上的CD3。
在某些实施例中，该癌症选自由多发性骨髓瘤、急性髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、黑色素瘤、EBV相关癌症以及B细胞淋巴瘤和白血病组成的组。
在本发明的一个方面，提供了鉴定能够与肿瘤细胞的细胞表面蛋白和/或肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白结合的抗原结合结构域的离体方法，该方法包括：a)从患有癌症的患者中分离肿瘤细胞；b)使这些肿瘤细胞与一组抗原结合结构域接触；c)确定这些抗原结合结构域与其靶抗原的结合亲和力；以及d)选择亲和力相对于对照抗原结合结构域较弱的抗原结合结构域。
在某些实施例中，该离体方法进一步包括步骤e)，其中将选择的抗原结合结构域掺入三特异性抗原结合蛋白中。
在本发明的一个方面，提供了鉴定能够与肿瘤细胞的细胞表面蛋白和肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白之一或两者结合的抗原结合结构域的离体方法，该方法包括：a)从患有癌症的患者中分离外周血单核细胞(PBMC)或骨髓浆细胞(PC)和自体骨髓浸润T细胞；b)使这些PBMC或PC与一组三特异性抗原结合蛋白接触，其中该三特异性抗原结合蛋白的第一结构域与T细胞上的CD3结合，并且该三特异性抗原结合蛋白的第二结构域与肿瘤细胞的细胞表面蛋白和/或肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白结合；c)通过测量三特异性抗原结合蛋白对免疫介导的癌细胞杀伤的一种或多种作用来确定癌细胞的药物杀伤；以及d)基于其诱导免疫介导的癌细胞杀伤的能力选择三特异性抗原结合蛋白。
在某些实施例中，三特异性抗原结合蛋白对免疫介导的癌细胞杀伤的作用包括乳酸脱氢酶(LDH)释放。
在某些实施例中，三特异性抗原结合蛋白对免疫介导的癌细胞杀伤的作用包括耗尽的靶癌细胞的数量。
附图说明
通过以下结合附图对说明性实施例的详细描述，将更全面地理解本发明的前述和其他特征和优势。本专利或申请文件包含至少一个彩色附图。应请求并且支付必要的费用后，具有彩色附图的本专利或专利申请披露的副本将由专利局提供。
图1示意性地描绘了本发明的三特异性抗原结合蛋白的可互换性质。
图2描绘了在细胞培养物中表达的八种不同的多特异性抗原结合构建体的分子量(kDa)、浓度(mg/mL)、纯度(％单体)和产量(mg/L表达培养物)。
图3描绘了通过分析尺寸排阻色谱法测量的在细胞培养物中表达的四种不同的多特异性抗原结合构建体的纯度。
图4A至图4C描绘了BCMA-PD-L1-CD3三特异性抗原结合蛋白与CD3(图4A)、BCMA(图4B)和PD-L1(图4C)的ELISA结合数据。
图5描绘了三特异性和双特异性抗体与BCMA-CD3同时结合的ELISA数据。
图6描绘了CDR1-005的CD3结合臂诱导T细胞激活的能力。对于与固定的抗CD3(在平板表面上)孵育48小时的CD3+ Jurkat T细胞进行了T细胞增殖的定量。在该孵育期之后，添加WST-1试剂，并且对形成的甲瓒染料定量长达5小时。
图7描绘了在衔接H929骨髓瘤细胞后，CDR1-007诱导了CD3+ Jurkat T细胞的剂量依赖性激活，但在不存在癌细胞(Jurkat T细胞+HEK293细胞)的情况下则没有。通过IL-2细胞因子的产生来测量T细胞激活，并且将植物血凝素(PHA)用作T细胞激活的一般阳性对照。
图8描绘了与双特异性CDR1-008串联scFv BCMA/CD3相比，在用三特异性CDR1-007处理后与H929骨髓瘤细胞共培养之后，从人外周血单核细胞(PBMC)分离的T细胞的激活增加。通过IL-2细胞因子的产生来测量T细胞激活。
图9A至图9B描绘了由三特异性CDR1-007和双特异性CDR1-008串联scFv BCMA/CD3(图9A)以及三特异性CDR1-007和双特异性CDR1-020 PD-L1/CD3(图9B)介导的H929骨髓瘤细胞的重定向T细胞杀伤的正面比较。H929骨髓瘤细胞的重定向T细胞杀伤通过乳糖脱氢酶(LDH)释放测定法确定。
图10A至图10B描绘了同时结合三特异性Fab-scFv分子的BCMA-PD-L1(图10A)或BCMA-CD3(图10B)的ELISA数据，其中在不同的位置评价了每个结合位点。
图11A至图11B描绘了同时结合具有替代性的三特异性形式和替代性的结合序列的BCMA-PD-L1(图11A)或BCMA-CD3(图11B)的ELISA数据。
图12A至图12B描绘了H929骨髓瘤细胞介导的三特异性Fab-scFv分子的重定向T细胞杀伤的比较，其中在不同位置(图12A))与替代性的三特异性形式和替代性的结合序列(图12B)评价每个结合位点。H929骨髓瘤细胞的重定向T细胞杀伤通过乳糖脱氢酶(LDH)释放测定法确定。
图13描绘了三特异性抗体的集合，这些三特异性抗体具有与固定的人PD-L1的广泛结合谱，如使用这些抗体的连续稀释液通过ELISA所测量的。
图14A-图14B描绘了由三特异性CDR1-007和CDR1-011(图14A)以及三特异性CDR1-007和CDR1-017(图14B)介导的H929骨髓瘤细胞的浓度依赖性杀伤的正面比较。所使用的效应细胞与靶细胞的比例为5∶1(T细胞∶H929细胞)。在将细胞与这些化合物一起孵育24小时之后，测量释放到细胞培养基中的LDH。
图15描绘了用于三特异性抗体的基于图像的离体测试的不同多发性骨髓瘤患者的骨髓样品中不同细胞群的百分比。
图16A至图16C描绘了对PD-L1具有不同亲和力的三特异性抗体避免交联T细胞和正常细胞的能力，如在来自多发性骨髓瘤患者的骨髓组织中离体评估的。使用来自新诊断的多发性骨髓瘤患者(图16A)、复发的多发性骨髓瘤患者(图16B)和多次复发的多发性骨髓瘤患者(图16C)的样品。
图17A至图17C描绘了与双特异性对照以及双特异性对照与抗PD-L1抗体的组合相比，三特异性CDR1-017激活来自新诊断(图17A)、复发(图17B)和多次复发的(图17C)多发性骨髓瘤患者的T细胞的能力。
图18描绘了通过差示扫描荧光测定(DSF)确定的三特异性分子的热稳定性。
图19A至图19C描绘了在37℃下高浓度的CDR1-007(图19A)、CDR1-011(图19B)、CDR1-017(图19C)的稳定性数据。
图20A至图20C描绘了三特异性和双特异性抗体在结合人CD3+ T细胞和癌细胞系H929细胞(图20A)、Raji细胞(图20B)和HCT116细胞(图20C)后诱导IL-2细胞因子产生的能力。
图21A至图21B示意性地描绘了各种三特异性和双特异性抗体(图21A)和相应的图例(图21B)。
图22描绘了三特异性CDR1-017将CD3+ T细胞重定向至靶细胞群进行CD138或CD269、CD319染色的能力。CDR1-017用实心框表示，双特异性对照CDR1-008用空心框表示。
具体实施方式
提供了三特异性抗原结合蛋白，这些三特异性抗原结合蛋白具有：i)能够结合肿瘤细胞的细胞表面蛋白的第一结合结构域；ii)能够结合该肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白的第二结合结构域；以及iii)能够结合免疫细胞的细胞表面蛋白的第三结合结构域。还提供了产生和筛选三特异性抗原结合蛋白的方法。还提供了用这些三特异性抗原结合蛋白治疗癌症或靶肿瘤细胞杀伤的方法。
在某些方面，本文所述的三特异性抗原结合蛋白对第一结合结构域所靶向的肿瘤细胞表面蛋白具有低亲和力，并且对第二结合结构域所靶向的肿瘤细胞表面免疫检查点蛋白具有低亲和力。低亲和力相互作用相对于肿瘤细胞或组织减少了这些三特异性抗原结合蛋白与健康组织的脱靶结合。
在某些方面，本文所述的三特异性抗原结合蛋白对第一结合结构域所靶向的肿瘤细胞表面蛋白和对第二结合结构域所靶向的肿瘤细胞表面免疫检查点蛋白具有增加的亲合力。当两种细胞表面蛋白都存在于同一细胞中时，亲合力就会增加。增加的亲合力相互作用减少了这些三特异性抗原结合蛋白与健康组织的脱靶结合，并确保了与靶肿瘤细胞的优先结合(参见，例如，Piccione等人mAbs[单克隆抗体]，7(5)：946-956，2015；Kloss等人Nature Biotechnology[自然生物技术]，31(1)：71-75，2013。)
本文所述的三特异性抗原结合蛋白被设计为本质上是模块化的。该三特异性抗原结合蛋白可以包含不变的核心区域，该核心区域包含能够结合肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白的第二结合结构域和能够结合免疫细胞的细胞表面蛋白的第三结合结构域。该核心双特异性抗原结合蛋白可以具有能够与肿瘤细胞的细胞表面蛋白结合的另外的第一结合结构域。在该核心区域保持不变的同时，该第一结合结构域可以根据要治疗的癌症类型或要靶向的肿瘤细胞而改变。在一个示例性的实施例中，该核心区域具有能够与肿瘤细胞表面上的PD-L1结合的第二结合结构域和能够与T细胞表面上的CD3结合的第三结合结构域。在一个示例性的实施例中，该模块化的第一结合结构域能够结合肿瘤细胞表面上的BCMA。
总体而言，与本文所描述的细胞与组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质与核酸化学和杂交学结合使用的命名法是本领域中众所周知并且常用的。除非另作指示，否则本文提供的方法和技术一般是根据本领域熟知的常规方法且如本说明书全篇所引用和论述的各种通用和更具体的参考文献中所描述来进行。酶促反应和纯化技术是根据制造商的说明，如本领域通常所实现或如本文中所描述进行的。与在此所描述的分析化学、合成有机化学以及医学化学和药物化学结合使用的命名法及其实验室程序和技术是本领域中众所周知并且常用的。使用标准技术来进行化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。
除非本文另作定义，否则本文使用的科技术语具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。在任何潜在歧义的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外在定义。除非上下文另外需要，否则单数术语应包括复数形式，并且复数术语应包括单数形式。除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。术语“包括”以及其他形式诸如“包含”和“含有”的使用不是限制性的。
为了使本发明更容易理解，首先定义了某些术语。
抗原结合蛋白
如本文所用，术语“抗体”或“抗原结合蛋白”是指与抗原或表位特异性结合或与之有免疫反应性的免疫球蛋白分子，并且包括多克隆抗体和单克隆抗体以及功能性抗体片段，包括但不限于片段抗原结合(Fab)片段、F(ab′)2片段、Fab′片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链可变片段(scFv)和单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。术语“抗体”包括免疫球蛋白的基因工程化或其他修饰形式，如细胞内抗体、肽抗体、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体、异源缀合抗体(例如双特异性抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、串联-scFv、串联三-scFv)等。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为包括其功能性抗体片段。
如本文所用，Fab片段是包含轻链片段(包含可变轻(VL)结构域)和轻链(CL)的恒定结构域，以及可变重(VH)结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)的抗体片段。
如本文所用，术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变区内的赋予抗原特异性和结合亲和力的氨基酸的非连续序列。一般来说，每个重链可变区中有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且每个轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。在本领域中已知“框架区”或“FR”是指重链和轻链的可变区的非CDR部分。一般来说，每个重链可变区有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，并且每个轻链可变区有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。
给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以容易地使用许多众所周知的方案中的任一种来确定，这些方案包括由以下文献描述的那些：Kabat等人(1991)，“Sequences ofProteins of Immunological Interest”[具有免疫学重要性的蛋白序列]，第5版，PublicHealth Service，National Institutes of Health[美国国立卫生研究院公共卫生事业部]，马里兰州贝塞斯达市(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273，927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]262：732-745(1996)，“Antibody-antigen interactions：Contact analysis and binding sitetopography，”[抗体-抗原相互作用：接触分析和结合位点图形]J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]262，732-745(“接触(Contact)”编号方案)；Lefranc M P等人，“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains，”[免疫球蛋白和T细胞受体可变结构域及Ig超家族V样结构域的IMGT唯一编号]Dev Comp Immunol[发育与比较免疫学]，2003年1月；27(1)：55-77(“IMGT”编号方案)；以及Honegger A和Pluckthun A，“Yet another numbering schemefor immunoglobulin variable domains：an automatic modeling and analysis tool，”[免疫球蛋白可变结构域的另一种编号方案：自动建模和分析工具]J MolBiol[分子生物学杂志]，2001年6月8；309(3)：657-70(AHo编号方案)。
给定CDR或FR的边界可能会因用于鉴定的方案而异。例如，Kabat方案基于结构比对，而Chothia方案则基于结构信息。Kabat和Chothia方案的编号均基于最常见的抗体区域序列长度，并通过插入字母(例如“30a”)进行插入，并且某些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“indel”)放置在不同的位置，从而产生不同的编号。接触方案基于复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案相似。
因此，除非另有说明，否则给定抗体或其区域(如其可变区)的“CDR”或“互补决定区”或个别特定的CDR(例如“CDR-H1、CDR-H2”)应理解为包含由任何已知方案定义的(或特定的)互补决定区。同样，除非另有说明，否则给定抗体或其区域(如其可变区)的“FR”或“框架区”或个别特定的FR(例如“FR-H1”、“FR-H2”)应理解为包含任何已知方案所定义的(或特定的)框架区。在某些情况下，指定用于鉴定特定CDR或FR的方案，如由Kabat、Chothia或接触方法定义的CDR。在其他情况下，给出了CDR或FR的特定氨基酸序列。
如本文所用，术语“亲和力”是指抗体的抗原结合位点和与其结合的表位之间相互作用的强度。如本领域技术人员容易理解的，抗体或抗原结合蛋白亲和力可以报告为以摩尔浓度(M)为单位的解离常数(KD)。许多抗体的KD值在10-6至10-9M范围内。高亲和力抗体具有10-9M(1纳摩尔，nM)和更低的KD值。例如，高亲和力抗体的KD值可以在约1nM至约0.01nM的范围内。高亲和力抗体可以具有约1nM、约0.9nM、约0.8nM、约0.7nM、约0.6nM、约0.5nM、约0.4nM、约0.3nM、约0.2nM或约0.1nM的KD值。非常高亲和力的抗体具有10-12M(1皮摩尔，pM)和更低的KD值。
低至中等亲和力抗体具有大于约10-9M(1纳摩尔，nM)的KD值。例如，低至中等亲和力抗体可以具有约1nM至约100nM的范围的KD值。低亲和力抗体可以具有约10nM至约100nM的范围的KD值。低亲和力抗体可以具有约10nM至约80nM的范围的KD值。低亲和力抗体可以具有约10nM、约15nM、约20nM、约25nM、约30nM、约35nM、约40nM、约45nM、约50nM、约55nM、约60nM、约65nM、约70nM、约75nM、约80nM、约85nM、约90nM、约95nM、约100nM或大于100nM的KD值。
本发明的抗原结合结构域对它们的靶抗原的结合亲和力可弱于约10-4M、约10-4M、约10-5M、约10-6M、约10-7M、约10-8M、约10-9M、约10-10M、约10-11M、约10-12M或约10-13M。
抗原结合结构域与特异性抗原决定簇结合的能力可以通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其他技术进行测量，例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人，Glyco J[糖缀合物杂志]17，323-329(2000))和传统的结合测定(Heeley，Endocr Res呐分泌研究]28，217-229(2002))。
如本文所用，术语“亲合力”是指抗体-抗原相互作用的总体强度。亲合力是个别非共价结合相互作用的多个亲和力的累积强度。随着同时结合相互作用的数量增加，总结合亲合力增加，从而导致更稳定的相互作用。
本发明的三特异性抗原结合蛋白可以包含一个或多个用于连接该三特异性抗原结合蛋白的结构域的接头。这些三特异性抗原结合蛋白可以包含两个柔性肽接头，这些柔性肽接头将Fab链与两个scFv共价连接。连接Fab链和scFv的接头可以由被认为是非免疫原性的甘氨酸-丝氨酸(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)组成。
接头的说明性实例包括甘氨酸聚合物(Gly)n；甘氨酸-丝氨酸聚合物(GlynSer)n，其中n是至少为1、2、3、4、5、6、7或8的整数；甘氨酸-丙氨酸聚合物；丙氨酸-丝氨酸聚合物；以及本领域已知的其他柔性接头。
甘氨酸和甘氨酸-丝氨酸聚合物相对非结构化，并且因此可能能够作为融合蛋白(如本文所述的三特异性抗原结合蛋白)的结构域之间的中性系链。甘氨酸比其他小侧链氨基酸可到达显著更多的phi-psi空间，并且比具有较长侧链的残基所受限制小得多(Scheraga，Rev.Computational Chem.[计算化学评述]1：1173-142(1992))。本领域技术人员将认识到，在特定实施例中，三特异性抗原结合蛋白的设计可以包括全部或部分为柔性的接头，使得该接头可以包括柔性接头伸展段以及一个或多个赋予较小的柔性以提供所需的结构伸展段。
然而，可以选择接头序列以类似于天然接头序列，例如，可以使用与人CH1和Cκ序列的起始端相对应的氨基酸伸展或与人IgG的铰链区下部相对应的氨基酸伸展。
连接scFv部分中VL和VH结构域的肽接头的设计是柔性接头，通常由小的、非极性或极性残基(如Gly、Ser和Thr)组成。连接scFv部分的可变结构域的特别示例性的接头是(Gly4Ser)4接头，其中4是示例性的基序重复数。
其他示例性接头包括但不限于以下氨基酸序列：GGG；DGGGS；TGEKP(Liu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]94：5525-5530(1997))；GGRR；(GGGGS)n，其中n＝1、2、3、4或5(Kim等人，Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]93：1156-1160(1996))；EGKSSGSGSESKVD(Chaudhary等人，Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]87：1066-1070(1990))；KESGSVSSEQLAQFRSLD(Bird等人，Scieuce[科学]242：423-426(1988))、GGRRGGGS；LRQRDGERP；LRQKDGGGSERP；以及GSTSGSGKPGSGEGSTKG(Cooper等人，Blood[血液]，101(4)：1637-1644(2003))。替代性地，可以使用能够对蛋白质和肽的3D结构进行建模的计算机程序或通过噬菌体展示方法来合理地设计柔性接头。
多特异性抗原结合形式
在本发明的一个实施例中，该三特异性抗原结合蛋白包含至少一个Fab结构域。该Fab结构域可以作为特异性异源二聚化支架，另外的结合结构域可以与之连接。Fab片段的重链(Fd片段)和轻链(L)的天然和高效的异源二聚化特性使该Fab片段成为理想的支架。另外的结合结构域可以是几种不同的形式，包括但不限于另一个Fab结构域、scFv或sdAb。
该Fab片段的每条链可以在N-或C-末端通过另外的结合结构域延伸。这些链可以在哺乳动物细胞中共表达，其中该宿主细胞结合免疫球蛋白(BiP)分子伴侣驱动重链-轻链异源二聚体(Fd：L)的形成。这些异源二聚体是稳定的，每种结合剂均保持其特定的亲和力。在产生这种三特异性抗原结合蛋白的示例性实施例中，至少一个上述结合位点是Fab片段，该片段也用作特异性异源二聚化支架。然后将剩下的两个结合位点随scFv或sdAb融合到不同的Fab链上，其中每条链都可以延伸，例如在C末端用另外的scFv或sdAb结构域延伸(参见，例如，Schoonjans等人J.Immunology[免疫学杂志]，165(12)：7050-7057，2000；Schoonjans等人Biomolecular Engineering[生物分子工程]，17：193-202，2001)。
已经描述了包含与肿瘤抗原和T细胞募集抗原(例如，CD3)具有结合特异性的两个Fab结构域的多特异性抗原结合蛋白(参见，例如，美国20150274845 A1)。
本发明的三特异性抗原结合蛋白支架的优势是大约75-100kDa的中等分子大小。博纳吐单抗(Blinatumomab)，一种双特异性T细胞衔接器(BiTE)，在复发的或难治性急性淋巴母细胞性白血病患者中已显示出优异的结果。由于博纳吐单抗分子小(60kDa)，其特征是血清半衰期较短，只有几个小时，因此需要连续输注(参见，美国7,112,324 B1)。与诸如博纳吐单抗等BiTE的较小的双特异性抗体相比，预期本发明的三特异性抗原结合蛋白具有显著更长的半衰期，并且因此，由于其有利的半衰期而无需连续输注。中等大小的分子可以避免肾脏清除，并提供足以改善肿瘤积累的半衰期。尽管与其他小的双特异性形式相比，本发明的三特异性抗原结合蛋白具有增加的血浆半衰期，但它们仍保留了肿瘤穿透能力。
使用Fab作为异源二聚化单元的另一个优势是Fab分子大量存在于血清中，并且因此当施用于受试者时可以是非免疫原性的。
示例性的双特异性和三特异性抗原结合蛋白序列在下表1中列出。这些序列对应于图2和图21A至图21B的抗原结合蛋白。
表1-双特异性和三特异性抗原结合结构域序列。
Figure BDA0002655202890000171
Figure BDA0002655202890000181
Figure BDA0002655202890000191
Figure BDA0002655202890000201
Figure BDA0002655202890000211
Figure BDA0002655202890000221
Figure BDA0002655202890000231
Figure BDA0002655202890000241
Figure BDA0002655202890000251
Figure BDA0002655202890000261
Figure BDA0002655202890000271
Figure BDA0002655202890000281
Figure BDA0002655202890000291
Figure BDA0002655202890000301
Figure BDA0002655202890000311
Figure BDA0002655202890000321
Figure BDA0002655202890000331
Figure BDA0002655202890000341
Figure BDA0002655202890000351
也可以使用另外的示例性三特异性形式。例如，可以使用三特异性T细胞激活构建体(TriTAC)形式。该TriTAC形式包含scFv、sdAb和Fab结构域的混合物，尽管在一个抗体分子中可能不会使用所有三个结构域。该TriTAC形式抗体可包含至少一个半衰期延长结构域，例如人血清白蛋白结合结构域。该TriTAC形式的实例和示例性TriTAC抗体在WO2016187594和WO 2018071777 A1(通过引用并入本文)中有进一步描述。
与肿瘤细胞的细胞表面蛋白的结合结构域
提供了具有第一结合结构域的三特异性抗原结合蛋白，该第一结合结构域能够与肿瘤细胞的细胞表面蛋白结合。这些三特异性抗原结合蛋白的第一结合结构域能够抑制细胞表面蛋白的活性，并且作为将免疫细胞特异性地募集到肿瘤细胞的手段。可以靶向的肿瘤细胞上的细胞表面蛋白的实例包括但不限于BCMA、CD19、CD20、CD33、CD123、CEA、LMP1、LMP2、PSMA、FAP和HER2。示例性的肿瘤细胞蛋白是BCMA。
具有与肿瘤细胞上的细胞表面蛋白的结合特异性的双特异性抗原结合蛋白的实例包括：美国20130273055 A1、美国9,150,664 B2、美国20150368351 A1、美国20170218077A1、Hipp等人(Leukemia[白血病]，31：1743-1751(2017))和Seckinger等人(Cancer Cell[癌细胞]，31(3)：396-410(2017))。
该三特异性抗原结合蛋白的第一结合结构域的结合亲和力可以是低的，以减少该三特异性抗原结合蛋白与非肿瘤或健康组织的脱靶结合。该第一结合结构域的结合亲和力可以在约1nM至约100nM的范围内。该第一结合结构域的结合亲和力可以在约1nM至约80nM的范围内。该第一结合结构域的结合亲和力可以在约10nM至约80nM的范围内。
下表2以及WO 2016094304和WO 2010104949中列举了BCMA抗原结合结构域序列，作为能够结合肿瘤细胞上的细胞表面蛋白的结合结构域的实例。这些序列可以以Fab、scFv或sdAb的形式用作该三特异性抗原结合蛋白的一部分。
表2-BCMA抗原结合结构域序列。
Figure BDA0002655202890000361
Figure BDA0002655202890000371
与肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白的结合结构域
提供了具有第二结合结构域的三特异性抗原结合蛋白，该第二结合结构域能够与肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白结合。这些三特异性抗原结合蛋白的第二结合结构域能够抑制细胞表面免疫检查点蛋白的活性，从而抑制要消除的靶肿瘤细胞的免疫抑制信号。可以靶向的肿瘤细胞上的细胞表面免疫检查点蛋白的实例包括但不限于CD40、CD47、CD80、CD86、GAL9、PD-L1和PD-L2。示例性的免疫检查点蛋白是PD-L1。
在一个示例性的实施例中，本发明的三特异性抗原结合蛋白结合肿瘤细胞的细胞表面上的PD-L1。程序性死亡受体1是抑制性受体，其在激活的T细胞上诱导并在耗竭的T细胞上表达。PD1-PD-L1相互作用可能至少部分地是免疫功能障碍的状态的原因，并且还与PD-L1水平升高而无法从博纳吐单抗疗法中受益的急性淋巴母细胞性白血病患者的BiTE功效降低有关(Krupka等人Leukemia[白血病]，30(2)：484-491(2016))。
该三特异性抗原结合蛋白的第二结合结构域被设计为以低亲和力结合细胞表面免疫检查点蛋白，以允许与靶标快速解离。通过这种方式，该三特异性抗原结合蛋白可以不与健康组织上的免疫检查点蛋白衔接，从而避免脱靶效应。
该三特异性抗原结合蛋白的第二结合结构域的结合亲和力可以在约1nM至约100nM的范围内。该第一结合结构域的结合亲和力可以在约1nM至约80nM的范围内。该第一结合结构域的结合亲和力可以在约10nM至约80nM的范围内。
对肿瘤细胞上的细胞表面免疫检查点蛋白具有结合特异性的双特异性抗原结合蛋白的实例包括：WO 2017106453 A1、WO 2017201281 A1和Horn等人Oncotarget[肿瘤标靶]，8：57964，2017。
PD-L1抗原结合结构域序列在下面的表3中以及在WO 2017147383和美国20130122014 A1中列出，作为可结合肿瘤细胞上的细胞表面免疫检查点蛋白的结合结构域的实例。这些序列可以以Fab或scFv的形式用作该三特异性抗原结合蛋白的一部分。
表3-PD-L1抗原结合结构域序列。
Figure BDA0002655202890000381
Figure BDA0002655202890000391
与免疫细胞的细胞表面蛋白的结合结构域
提供了具有第三结合结构域的三特异性抗原结合蛋白，所述第三结合结构域能够与免疫细胞的细胞表面蛋白结合。这些三特异性抗原结合蛋白的第三结合结构域能够将免疫细胞特异性地募集到要消除的靶肿瘤细胞。可以募集的免疫细胞的实例包括但不限于T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞。可用于募集免疫细胞的表面蛋白的实例包括但不限于CD3、TCRα、TCRβ、CD16、NKG2D、CD89、CD64和CD32a。免疫细胞的示例性细胞表面蛋白是CD3。
示例性的CD3抗原结合结构域在下面的表4中以及在WO 2016086196和WO2017201493(通过引用并入本文)中列出。
表4-CD3抗原结合结构域序列。
Figure BDA0002655202890000392
Figure BDA0002655202890000401
与肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白和与肿瘤细胞的细胞表面蛋白的结合亲和力 降低
三特异性抗原结合蛋白与靶肿瘤细胞的细胞表面蛋白(例如，BCMA)的结合亲和力降低，并且与靶肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白(例如PD-L1)的结合亲和力降低。每个结合结构域的个体结合亲和力使得该三特异性抗原结合蛋白可以具有减少的与非肿瘤或健康组织的脱靶结合。当靶肿瘤细胞同时表达靶免疫检查点蛋白和靶细胞表面蛋白时，在靶结合得到改善。这两个结构域的组合的结合亲合力使得该三特异性抗原结合蛋白应结合比健康组织更特异性地表达两种抗原的靶肿瘤。这些三特异性抗原结合蛋白不需要依赖于与靶肿瘤细胞的细胞表面蛋白的高亲和力结合来实现与靶肿瘤的生产性结合。举例来说，但绝不限于此，可以在肿瘤细胞表面上发现BCMA，并且是细胞表面抗原BCMA的可溶形式。BCMA在跨膜区域被γ-分泌酶切割，产生BCMA细胞外结构域(sBCMA)的可溶形式。sBCMA可作为配体APRIL的诱饵，并且这种细胞表面抗原BCMA的血清可溶形式可能导致抗体-抗原沉默。因此，高亲和力抗BCMA抗体可能比低亲和力抗体更易受sBCMA干扰(参见，例如，Tai等人Immunotherapy[免疫疗法]7(11)：1187-1199，2015和Sanchez等人Br J Haematol.[英国血液学杂志]158(6)；727738，2012)。通过延伸，靶肿瘤细胞上的其他细胞表面蛋白也可以在非肿瘤细胞的表面上表达。非肿瘤细胞上细胞表面蛋白的存在可以作为抗体-抗原沉默，从而减少可用于结合肿瘤细胞的抗体的量。因此，如果治疗性抗体(如本文披露的三特异性抗原结合蛋白)对细胞表面蛋白具有低或中等的结合亲和力，则这些抗体可能较不易受抗体-抗原沉默的影响。这种相同的原理也可适用于靶肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白。
抗原结合多肽的表达
在一个方面，提供了编码本文披露的结合多肽(例如，抗原结合蛋白)的多核苷酸。还提供了制备结合多肽的方法，包括表达这些多核苷酸。
典型地将编码本文披露的结合多肽的多核苷酸插入表达载体中，以引入宿主细胞中，这些宿主细胞可用于产生所需量的要求保护的抗体或其片段。因此，在某些方面，本发明提供了包含本文披露的多核苷酸的表达载体和包含这些载体和多核苷酸的宿主细胞。
术语“载体”或“表达载体”在本文中使用是指根据本发明用作运载体以引入和表达细胞中所需基因的载体。如本领域技术人员已知的，此类载体可以容易地选自由质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒组成的组。一般而言，与本发明相容的载体包含选择标记、适当的限制性位点以促进所需基因的克隆，以及进入真核或原核细胞和/或在其中复制的能力。
为了本发明的目的，可以使用许多表达载体系统。例如，一类载体利用衍生自诸如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(例如RSV、MMTV、MOMLV等)或SV40病毒等动物病毒的DNA元件。其他涉及具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统的使用。另外，可以通过引入一种或多种标记来选择已将DNA整合至其染色体中的细胞，该一种或多种标记允许选择经转染的宿主细胞。该标记可以提供对营养缺陷型宿主的原营养、杀生物剂抗性(例如抗生素)或对重金属如铜的抗性。选择性标记基因可以直接与待表达的DNA序列连接，或通过共转化引入同一细胞中。还可能需要另外的元件来最佳地合成mRNA。这些元件可包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。在一些实施例中，将克隆的可变区基因与如上所讨论合成的重链和轻链恒定区基因(例如人恒定区基因)一起插入表达载体中。
在其他实施例中，可以使用多顺反子构建体表达这些结合多肽。在此类表达系统中，可以从单个多顺反子构建体产生多种目的基因产物，如抗体的重链和轻链。这些系统有利地使用内部核糖体进入位点(IRES)以在真核宿主细胞中提供相对高水平的多肽。相容的IRES序列在美国专利号6,193,980中披露，出于所有目的，该专利通过引用以其全文并入本文。本领域技术人员将理解，此类表达系统可用于有效产生本申请中披露的全系列多肽。
更一般地，一旦制备了编码抗体或其片段的载体或DNA序列，就可以将该表达载体引入合适的宿主细胞中。也就是说，这些宿主细胞可以被转化。可以通过本领域技术人员熟知的各种技术来实现将质粒引入宿主细胞中。这些技术包括但不限于转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、与包膜DNA的细胞融合、显微注射和完整病毒感染。参见Ridgway，A.A.G.“Mammalian Expression Vectors”[哺乳动物表达载体]第24.2章，第470-472页Vectors[载体]，Rodriguez和Denhardt编(Butterworths[巴特沃思公司]，马萨诸塞州波士顿，1988)。可以通过电穿孔将质粒引入宿主。使转化的细胞在适于产生轻链和重链的条件下生长，并测定重链和/或轻链蛋白质的合成。示例性测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光激活细胞分选仪分析(FACS)、免疫组织化学等。
如本文所用，术语“转化”应在广义上用于指将DNA引入受体宿主细胞中，从而改变基因型并因此导致受体细胞的改变。
同样，“宿主细胞”是指已经使用载体转化的细胞，其中所述载体是使用重组DNA技术构建的并且编码至少一个异源基因。在描述用于从重组宿主分离多肽的过程时，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用以表示抗体来源，除非另有明确说明。换言之，从“细胞”中回收多肽可以意指从离心沉淀的全细胞，或从含有培养基和悬浮细胞二者的细胞培养物中回收。
在一个实施例中，用于抗体表达的宿主细胞系是哺乳动物来源的。本领域技术人员可以确定最适合在其中表达所需基因产物的特定宿主细胞系。示例性宿主细胞系包括但不限于DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢系，DHFR-)、HELA(人宫颈癌)、CV-1(猴肾系)、COS(具有SV40 T抗原的CV-1的衍生物)、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)、293(人肾)等。在一个实施例中，该细胞系提供由其表达的抗体的改变的糖基化例如非岩藻糖基化(例如，
Figure BDA0002655202890000431
(Crucell)或FUT8敲除CHO细胞系(
Figure BDA0002655202890000432
细胞)(Biowa，新泽西州普林斯顿))。宿主细胞系典型地可从商业服务机构，例如美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection)或披露的文献中获得。
体外生产允许放大以产生大量所需的多肽。在组织培养条件下用于哺乳动物细胞培养的技术是本领域已知的并且包括同质悬浮培养(例如在气升式反应器或连续搅拌反应器中)，或在琼脂糖上微珠或陶瓷盒上的固定化或截留细胞培养(例如在中空纤维、微胶囊中)。如果必要和/或需要的话，可以通过常规色谱方法，例如凝胶过滤、离子交换色谱法、在DEAE-纤维素上的色谱法和/或(免疫)亲和色谱法纯化多肽的溶液。
编码本发明的抗原结合蛋白的基因也可以表达非哺乳动物细胞，如细菌或酵母或植物细胞。在这一方面，应当理解，也可以转化多种单细胞非哺乳动物微生物如细菌；即那些能够在培养或发酵中生长的那些微生物。易于转化的细菌包括肠杆菌科成员，如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌属(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌属(Streptococcus)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。还应理解，当在细菌中表达时，这些蛋白质可以成为内含体的一部分。必须分离、纯化这些蛋白质，然后将其组装成功能性分子。
除原核生物外，还可以使用真核微生物。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通面包酵母是真核微生物中最常用的，尽管许多其他菌株是通常可获得的。对于在酵母属(Saccharomyces)中的表达，通常使用例如质粒YRp7(Stinchcomb等人，Nature[自然]，282：39(1979)；Kingsman等人，Gene[基因]，7：141(1979)；Tschemper等人，Gene，10：157(1980))。该质粒已经含有TRP1基因，该基因提供缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变菌株的选择标记，例如ATCC号44076或PEP4-1(Jones，Genetics[遗传学]，85：12(1977))。然后，trp1损伤的存在作为酵母宿主细胞基因组特征提供在没有色氨酸的情况下通过生长检测转化的有效环境。
抗原结合蛋白的施用方法
制备和施用向受试者抗原结合蛋白(例如本文披露的三特异性抗原结合蛋白)的方法是本领域技术人员熟知的或容易确定的。本披露的抗原结合蛋白的施用途径可以是口服、肠胃外、通过吸入或局部施用。本文所用的术语肠胃外包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道施用。尽管所有这些施用形式都清楚地考虑在本披露的范围内，但是用于注射的施用形式将是溶液，特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注。通常，合适的注射用药物组合物可以包含缓冲液(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)、表面活性剂(例如聚山梨酯)、任选地稳定剂(例如人白蛋白)等。但是，在与本文的教导相容的其他方法中，可以将修饰的抗体直接递送至不良细胞群的部位，从而增加患病组织的治疗剂暴露。
肠胃外施用的制剂包括无菌的水性或非水性溶液、悬浮液和乳液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油和可注射用有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水、醇/水溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲的介质。在本披露的组合物和方法中，药学上可接受的载体包括但不限于0.01-0.1M或0.05M的磷酸盐缓冲液或0.8％的生理盐水。其他常见的肠胃外运载体包括磷酸钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液、不挥发性油等。静脉内运载体包括但不限于流体和营养补充物、电解质补充物，如基于Ringer右旋糖的那些等。防腐剂和其他添加物也可以存在，如，例如抗微生物药、抗氧化剂、螯合剂、惰性气体等。更特别地，适于注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性时)或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。在此类情况下，该组合物必须是无菌的并且应当具有达到容易注射的程度的流动性。它在制造和储存条件下应该稳定并且还应该抗诸如细菌和真菌的微生物污染作用而保存。该载体可以是含有以下物质的溶剂或分散介质：例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等)，以及其适合的混合物。恰当的流动性可以(例如)通过使用包衣(如卵磷脂)来维持，在分散体的情况下通过维持所需的颗粒大小来维持，以及通过使用表面活性剂来维持。
防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂以及抗真菌剂例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来实现。等渗剂，例如糖、多元醇，如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠也可以包括在该组合物中。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来实现。
在任何情况下，可以通过将活性化合物(例如，修饰的结合多肽自身或与其他活性剂组合)以所需的量掺入适当的溶剂中，随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液，该溶剂根据需要具有本文列举的一种成分或多种成分的组合。通常，通过将活性化合物加入无菌运载体中来制备分散体，该无菌运载体包含基础分散介质以及来自以上列举的那些所需的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法典型地包括真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分加来自其先前经无菌过滤溶液的任何其他所需成分的粉末。将用于注射的制剂加工，填充至容器如安瓿、袋子、瓶子、注射器或小瓶中，并根据本领域已知的方法在无菌条件下密封。此外，这些制剂可以包装起来并以试剂盒的形式出售，如共同待审的U.S.S.N.09/259,337和U.S.S.N.09/259,338中所述，所述文献各自通过引用并入本文。此类制品可包括标签或包装说明书，指示相关组合物可用于治疗患有或易患自身免疫或肿瘤障碍的受试者。
用于治疗上述病症的本披露的组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，包括施用方式、靶标部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、施用的其他药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人类，但也可治疗包括转基因哺乳动物的非人哺乳动物。可以使用本领域技术人员已知的常规方法滴定治疗剂量以优化安全性和功效。
对于使用抗原结合蛋白的被动免疫接种，该剂量的范围可以是，例如，从约0.0001mg/kg至100mg/kg，并且更通常在0.01mg/kg至5mg/kg(例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg kg等)宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg的范围内，例如至少1mg/kg。在以上范围中的剂量中间值也旨在落入本披露的范围内。可以每天、每隔一天、每周或根据实验分析确定的任何其他时间表将此类剂量施用于受试者。示例性治疗需要以多个剂量经延长的时段(例如至少六个月的时段)施用。另外的示例性治疗方案需要每两周一次、或一个月一次或每3至6个月一次进行施用。示例性剂量时间表包括连续几天1-10mg/kg或15mg/kg、按每隔一天30mg/kg、或每周60mg/kg。在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或更多种抗原结合蛋白，在这种情况下，所施用的每种抗原结合蛋白的剂量落在所示范围内。
本文所述的抗原结合蛋白可以多次施用。单次剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。如通过测量患者体内修饰的结合多肽或抗原的血液水平所指示的，间隔也可以是不规则的。在一些方法中，调节剂量以达到1-1000μg/ml的血浆修饰抗原结合蛋白浓度，并且在一些方法中为25-300μg/ml。替代性地，可以按持续释放配制品施用抗原结合蛋白，在这种情况下，需要较低频率的施用。对于抗原结合蛋白，剂量和频率根据患者体内抗原结合蛋白的半衰期而不同。一般而言，人源化抗体显示出最长的半衰期，其次是嵌合抗体和非人类抗体。
施用的剂量和频率可根据治疗是预防性还是治疗性而不同。在预防性应用中，将含有本发明抗原结合蛋白或其混合物的组合物施用于尚未处于疾病状态的患者，以增强患者的抗性。将这种量定义为“预防性有效剂量”。在此用途中，精确的量再次取决于患者的健康状况和全身免疫力，但一般为每剂0.1至25mg，特别是每剂0.5至2.5mg。在较长的时间内以相对不频繁的间隔施用相对较低的剂量。一些患者终生继续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要以相对较短的间隔施用相对较高剂量(例如，每剂约1至400mg/kg抗体，对于放射免疫缀合物更常使用5至25mg的剂量，而对于细胞毒素药物修饰的抗体则使用更高的剂量)，直到疾病的进展减少或终止，或者直到患者显示出部分或完全的疾病症状改善。此后，可以对患者施用预防性方案。
本文所述的抗原结合蛋白可任选地与可有效治疗需要治疗(例如，预防性或治疗性治疗)的障碍或病症的其他药剂组合施用。本披露的90Y标记的修饰抗体的有效单次治疗剂量(即治疗有效量)为约5与约75mCi之间，如约10至约40mCi。131I修饰抗体的有效单次治疗非骨髓消融剂量的范围为约5与约70mCi之间，如约5与约40mCi之间。131I标记的抗体的有效单次治疗消融剂量(即可能需要自体骨髓移植)范围为约30与约600mCi之间，如约50与小于约500mCi之间。与嵌合抗体联用，由于与鼠抗体相比循环半衰期更长，因此对非骨髓消融剂量的131I标记嵌合抗体的有效单次治疗范围约为5与约40mCi之间，例如小于约30mCi。例如111In标签的成像标准典型地小于约5mCi。
尽管可以如紧接上文所描述施用这些抗原结合蛋白，但是必须强调的是，在其他实施例中，可以将抗原结合蛋白作为其他一线疗法施用于其他方面健康的患者。在此类实施例中，可以将这些抗原结合蛋白施用于具有正常或平均红骨髓储备的患者和/或施用于未接受过、也没有正在接受一种或多种其他疗法的患者。如本文所用，修饰抗体或其片段与辅助疗法联合或组合的施用是指所述疗法和所披露的抗体的顺序的、同时的、同延的、同步的、伴随的或同期的施用或应用。本领域技术人员将理解，该组合治疗方案的各个组成成分可以定时施用或应用以增强治疗的整体有效性。基于所选择的辅助疗法和本说明书的教导，技术人员(例如，经验丰富的肿瘤科医生)将能够容易地辨别有效的组合治疗方案，而无需进行过度的实验。
如前所讨论，本披露的抗原结合蛋白、其免疫反应性片段或其重组体可以以药学有效量施用，用于哺乳动物障碍的体内治疗。在这一方面，应当理解，将配制所披露的抗原结合蛋白以便于施用和促进活性剂的稳定性。
根据本披露的药物组合物典型地包含药学上可接受的、无毒的无菌载体，如生理盐水、无毒的缓冲液、防腐剂等。为了本申请的目的，与治疗剂缀合或未缀合的药学上有效量的修饰抗原结合蛋白、其免疫反应性片段或其重组体应被认为意指足以实现与抗原有效结合和实现效益(例如改善疾病或障碍的症状或检测物质或细胞)的量。就肿瘤细胞而言，修饰的结合多肽将典型地能够与赘生性或免疫反应性细胞上的所选免疫反应性抗原相互作用，并增加这些细胞的死亡。当然，本披露的药物组合物可以以单剂量或多剂量施用以提供药学有效量的修饰的结合多肽。
按照本披露的范围，可以根据上述治疗方法以足以产生治疗或预防作用的量向人或其他动物施用本披露的抗原结合蛋白。本披露的抗原结合蛋白可以以常规剂型施用于此类人或其他动物，该常规剂型是通过根据已知技术将本披露的抗体与常规的药学上可接受的载体或稀释剂组合而制备的。本领域技术人员将认识到，该药学上可接受的载体或稀释剂的形式和特性由与之组合的活性成分的量、施用的途径和其他熟知的变量决定。本领域技术人员将进一步理解，包含本披露中描述的一种或多种结合多肽的混合物可被证明是特别有效的。
本文定义的药物组合物的生物活性可以，例如，通过细胞毒性测定法确定，如以下实例中、WO 99/54440中或Schlereth等人(Cancer Immunol.Immunother.[癌症免疫学免疫疗法]20(2005)，1-12)所描述的。如本文所用，“功效”或“体内功效”是指使用例如标准化的NCI反应标准，本发明的药物组合物对治疗的反应。使用本发明的药物组合物治疗的成功或体内功效是指该组合物达到其预期目的的功效，即该组合物引起其所需作用(即病理细胞(例如肿瘤细胞)的耗尽)的能力。可以通过用于各个疾病实体的既定标准方法来监测体内功效，这些方法包括但不限于白细胞计数、差分法、荧光激活细胞分选、骨髓抽吸。另外，可以使用各种疾病特定的临床化学参数和其他既定标准方法。此外，可以使用计算机辅助断层摄影、X射线、核磁共振断层摄影(例如，用于基于美国国家癌症研究所标准的反应评估[Cheson B D，Horning S J，Coiffier B，Shipp M A，Fisher R I，Connors J M，Lister TA，Vose J，Grillo-Lopez A，Hagenbeek A，Cabanillas F，Klippensten D，Hiddemann W，Castellino R，Harris N L，Armitage J O，Carter W，Hoppe R，Canellos G P.Report ofan international workshop to standardize response criteria for non-Hodgkin′slymphomas.[非霍奇金淋巴瘤反应标准标准化国际工作组报告]NCI SponsoredInternational Working Group.[美国国家癌症研究所赞助的国际工作组]J Clin Oncol.[临床肿瘤学杂志]1999年4月；17(4)：1244])、正电子发射断层扫描、白细胞计数、差分法、荧光激活细胞分选、骨髓抽吸、淋巴结活检/组织学以及各种淋巴瘤特定的临床化学参数(例如乳酸脱氢酶)以及其他既定标准方法。
治疗癌症的方法
提供了使用本文所述的三特异性抗原结合蛋白在患有癌症的受试者中治疗癌症的方法。还提供了使用本文所述的三特异性抗原结合蛋白靶向和杀死肿瘤细胞的方法。
本发明的三特异性抗原结合蛋白的第一结合结构域特异性结合与肿瘤细胞缔合的细胞表面蛋白。在一个示例性的实施例中，该细胞表面肿瘤蛋白在健康细胞中不存在或相对于肿瘤细胞显著更少。本发明的三特异性抗原结合蛋白优先附着于携带这种肿瘤抗原的肿瘤细胞。与某些肿瘤细胞缔合的细胞表面蛋白的实例包括但不限于CD33(在AML(急性髓性白血病)细胞上高度表达的细胞表面蛋白)、CD20(在B细胞淋巴瘤和白血病上表达的细胞表面蛋白)、BCMA(在多发性骨髓瘤细胞上表达的细胞表面蛋白)、CD19(在ALL(急性淋巴母细胞性白血病)上表达的细胞表面蛋白)等。
对于本领域技术人员将显而易见的是，在不脱离本文披露的实施例的范围的情况下，可以使用适当的等价方案对本文所述的方法进行其他适当的修改和改编。现在已经详细描述了某些实施例，通过参考以下实例将更清楚地理解它们，这些实例仅出于说明的目的而被包括，并且不旨在具有限制性。
实例
实例1-示例性三特异性抗原结合蛋白的设计、表达和纯化
背景
开发三特异性抗原结合蛋白治疗剂的主要挑战是从结构多样的替代方案中选择分子形式，该分子形式可支持多种不同的生物学和药理特性，同时保持可开发性的理想属性。此类属性包括高热稳定性、高溶解度、低聚集倾向、低粘度、化学稳定性和高水平表达(克每升滴度)。
通过在单个宿主细胞中多条(三条)轻链和重链的共表达来生产三特异性抗原结合蛋白可能具有很高的挑战性，因为所需的三特异性抗原结合蛋白的产率低，并且难以去除紧密相关的错配污染物。在基于IgG的三特异性抗原结合蛋白中，这些重链形成同源二聚体以及所需的异源二聚体。另外，轻链会与非同源重链错配。结果，多条链的共表达会导致许多不需要的物质(除了所需的三特异性抗原结合蛋白之外)，并且因此导致产率低。
用于构建三特异性分子的抗体的选择
衍生自SP34和OKT3的两种不同的抗CD3抗体用作与CD3的结合臂，用于构建双特异性和三特异性分子。两种抗体均以其激活T细胞的能力为特征，并已用于生成可用于治疗癌症的治疗性双特异性抗体。
为了中和PD-1/PD-L1途径(一种肿瘤免疫逃避的主要机制)，选择抗PD-L1抗体KN035(Cell Discov.[细胞发现]2017；3：17004)和专利申请WO 2017147383的SEQ ID NO：9用于产生双特异性和三特异性抗体。在双特异性和三特异性分子的构建中，将小鼠抗体C11D5.3和单结构域抗体269A37346(描述于WO 2018028647中)用作靶向BCMA的实体。C11D5.3在包括浆细胞的B细胞的一个或多个亚群的表面上特异性结合BCMA以及可溶性受体，并且还高效结合在多发性骨髓瘤和浆细胞瘤上表达的BCMA(描述于WO 2016094304 A2中)。抗肿瘤相关抗原(TAA)的另外的抗体包括曲妥珠单抗(Trastuzumab)，一种抗HER2人源化单克隆抗体，用于治疗HER2阳性转移性乳腺癌(Cho等人Nature[自然]，421(6924)：756-760(2003))；和博纳吐单抗(Blinatumomab)，一种双特异性T细胞衔接器单克隆抗体，适用于治疗费城染色体阴性的复发的或难治性B细胞前体急性淋巴母细胞性白血病(ALL)。
三特异性分子和双特异性对照的组装
选择抗BCMA抗体C11D5.3、专利申请WO 2017147383的SEQ ID NO：9的抗PD-L1抗体和抗CD3抗体SP34来构建双特异性和三特异性抗体，将这些双特异性和三特异性抗体组装成两种不同的形式：1)包含通过单个蛋白链上的肽接头连接的两个scFv片段的串联scFv融合体；和2)与Fab的C-末端链的scFv融合体，其中这些scFv作为Fab部分的轻链或重链C-末端融合体组装。Fab形式具有很高的稳定性并且是有效的异源二聚化支架，用于生产重组双特异性和三特异性抗体衍生物(Schoonjans等人J Immunol.[免疫学杂志]2000年12月15；165(12)：7050-7)。下表5列出了作为串联scFv融合体或连接至Fab分子的C末端的scFv的结合部分的构建体和位置。
表5-抗体形式。
Figure BDA0002655202890000511
Fab-scFv三特异性分子中抗原结合位点的位置
为了研究抗原结合位点的位置是否会影响结合活性和/或将免疫细胞杀伤重新定向至肿瘤细胞的效率，构建了Fab-scFv融合体以探索3个可能位置的每个抗原结合位点：1)Fab；2)连接至Fab轻链的C末端的scFv；以及3)连接至Fab重链的C末端的scFv。下表6列出了在不同位置具有结合部分的构建体。
表6-抗体形式。
Figure BDA0002655202890000521
替代性的三特定形式的设计
为了研究其他抗体形式或不同抗原结合序列是否可以满足产生本发明的三特异性抗体的要求(例如，与生物学的效价匹配、与不同靶标的结合活性的保持、同时结合不同靶标和将免疫细胞与肿瘤细胞连接的能力)，使用不同的结合序列、不同的形式(例如，基于scFv、sdAb、Fab或Fc的)及其组合组装示例性三特异性分子。
对于基于Fab的构建体，将scFv或sdAb融合至Fab的C末端区域。对于基于Fc的构建体，将scFv作为N或C末端融合体组装至轻链的Fc区域或C末端区域。使用杵臼(knobs-into-holes，KIH)技术以促进Fc部分的异源二聚化，并避免链的错配，链的错配会阻止三特异性分子的正确形成。下表7列出了具有替代性三特异性形式的构建体。
表7-抗体形式。
Figure BDA0002655202890000531
表达
在特威斯特生物科学公司处构建了编码不同抗体链(即重链和轻链)的合成基因，并将其分别克隆到表达载体中，以在HEK 293 6E细胞中瞬时表达。使用常规质粒DNA纯化方法(例如Qiagen HiSpeed质粒大提试剂盒，目录号#12662)制备表达载体DNA。在HEK293-6E细胞中表达几种示例性三特异性抗原结合蛋白形式以评价每种特异性形式的产率和纯度。
这些三特异性抗原结合蛋白和双特异性抗原结合蛋白对照通过各自哺乳动物表达载体在HEK293-6E细胞中的瞬时共转染而表达，这些细胞使用聚乙烯亚胺(PEI 40kD线性)悬浮培养。将HEK293-6E细胞以1.7x106个细胞/mL接种在补充有2mM L谷氨酰胺的Freestyle F17培养基中。通过将DNA和PEI分别添加至50μL无补充物的培养基中，制备出每毫升最终产量的DNA。将两种级分混合、涡旋并静置15分钟，得到DNA∶PEI比为1∶2.5(1μgDNA/mL细胞)。将细胞和DNA/PEI混合物放在一起，然后转移到合适的容器中，该容器置于振荡装置(37℃，5％CO2，80％RH)中。24小时后，每毫升最终产量添加25μL的胰蛋白胨N1。
7天后，通过离心收集细胞并无菌过滤。通过亲和步骤纯化这些抗原结合蛋白。为了亲和纯化基于Fab的构建体，将上清液加载到用6CV PBS(pH7.4)平衡的蛋白CH柱(赛默飞世尔科技公司(Thermo FisherScientific)，#494320005)上。串联scFv使用CaptoL柱(通用电气医疗集团，#17547815)纯化。用相同的缓冲液进行洗涤步骤后，用100mM柠檬酸(pH3.0)逐步洗脱，从柱上洗脱抗原结合蛋白。立即用1M Tris缓冲液(pH 9.0)以1：10的比例中和具有所需抗原结合蛋白的级分，然后合并、透析并通过离心浓缩。
在对PBS缓冲液浓缩和透析后，通过SDS-PAGE和尺寸排阻HPLC评估纯化蛋白的含量和纯度。在HEK293-6E细胞中表达后，通过单个捕获步骤纯化蛋白质，并通过分析性尺寸排阻色谱法进行分析。
图2描绘了多种多功能蛋白质，这些蛋白质的特征在于以不同组合附接在一起的一个或几个scFv和/或Fab模块。scFv片段在其稳定性、表达水平和聚集倾向上表现出很大的可变性。因此，将分子001-004用作参考，因为它们源自具有良好生物物理特性的scFvs片段(J Biol Chem.[生物化学杂志]2010年3月19；285(12)：9054-9066)。结果表明，各种双特异性和三特异性形式在哺乳动物细胞中高水平表达，这些抗原结合蛋白大部分以单体形式存在，并且没有观察到这些蛋白的修剪或片段化(图3)。
实例2-三特异性分子和双特异性对照结合其靶标的能力
进行结合ELISA测定以确定示例性三特异性抗原结合蛋白是否结合至它们各自的靶标。评价三特异性抗体CDR1-007结合其抗原的能力。在ELISA中测试了CDR-007的至范围为4ng/mL至10μg/ml的最终浓度的连续稀释液，以与人PD-L1 His-标签(近岸蛋白，#C315)重组人BCMA Fc嵌合体的细胞外结构域(通过在HEK293-6E细胞中瞬时表达而在内部产生)和CD3εHis标签(近岸蛋白，#C578)结合，将它们各自包被在96孔板上。通过山羊抗κ-LC抗体HRP(赛默飞世尔科技公司，#A18853)检测三特异性抗体。图4A至图4C显示了CDR1-007的浓度依赖性结合，证实了该三特异性抗体结合三个靶标的能力。
另外，使用双重结合ELISA评估了三特异性和双特异性抗体同时结合BCMA和CD3的能力。简而言之，将抗体分子CDR1-005、CDR1-007和CDR1-008的连续稀释液添加到96孔ELISA板中，该板包被了重组人BCMA Fc嵌合体(在HEK293-6E中瞬时转染后表达)，随后与重组人CD3εHis标签蛋白(近岸蛋白，目录号C578)二级缔合。使用抗His抗体(艾博抗，目录号ab1187)检测与抗原对的同时结合。图5显示了双特异性和三特异性分子与BCMA和CD3的浓度依赖性结合。这些数据证实了双特异性和三特异性抗体以可比的方式同时结合了BCMA和CD3。
实例3-CD3结合臂诱导T细胞增殖的能力
人T淋巴细胞上的抗原受体分子在细胞表面与CD3(T3)分子复合体非共价缔合。用抗CD3单克隆抗体干扰这种复合体可能会诱导T细胞激活，但是这种能力取决于某些特性，如结合亲和力、表位、价、抗体形式等。
与亲本抗体相比，将融合蛋白中的不同抗原结合位点连接起来以产生双特异性抗体通常表现出对其靶抗原的亲和力降低。因此，在评估T细胞衔接器的CD3结合臂时应仔细考虑以确保功能性。评估CD3激动抗体激活T细胞能力的最常见方法之一是在体外刺激后测量T细胞增殖。
分析了本发明的CD3结合臂设计触发CD3+ JurkatT细胞的细胞增殖的能力。将抗体CDR1-005包被在96孔板表面上，至范围为0.01至1μg/mL的最终浓度。固定在平板表面的抗CD3促进了CD3在T细胞上的交联，并且从而比可溶性抗体具有更好的刺激性。在完全RPMI培养基中，将Jurkat T细胞白血病细胞系E6-1细胞调节至每毫升1x106个(活)细胞，将100μl这种细胞悬液吸移到固定有抗CD3的96孔板中(有和无抗体作为阴性对照)，并在37℃和5％CO2中孵育48小时。在该孵育期之后，将每孔10μl的WST-1细胞增殖试剂(罗氏公司，目录号5015944001)加入培养物中，并在37℃和5％CO2中孵育长达5小时。以450nm和620nm为参考波长，在长达5个小时的孵育中的几个时间点测量形成的甲瓒染料。
如图6所描绘，在5个小时的孵育后，甲瓒染料的形成达到了最大值，这表明在CDR1-005中受CD3结合臂刺激的Jurkat T细胞的增殖要比没有抗CD3刺激的JurkatT细胞的增殖更多，即使是在0.1μg/mL的最低浓度时。这证实了CD3结合臂设计诱导T细胞激活的适合性。
实例4-在人多发性骨髓瘤细胞存在或不存在下Jurkat T细胞的三特异性抗体介导的IL-2细胞因子产生
分析了三特异性抗体CDR1-007在衔接骨髓瘤癌细胞后诱导Jurkat T细胞中IL-2细胞因子产生的能力。在效应细胞与靶细胞比例为5∶1，且存在10、100或200nM CDR1-007的情况下，将JurkatE6-1 T细胞(效应细胞)与NCI-H929人多发性骨髓瘤细胞(靶细胞)或人类胚胎肾(HEK)293细胞共孵育。另外，将Jurkat E6-1T细胞与和不与1μg/mL植物血凝素(PHA)共孵育，用于作为阳性对照的T细胞非特异性刺激。
在37℃、5％CO2中孵育18小时后，将酶联板以1000xg离心10分钟，然后将上清液转移到新的96孔板上用于后续分析。根据制造商的说明，使用人IL-2ELISA试剂盒(赛默飞世尔科技公司，目录号88-7025)对人IL-2细胞因子进行定量。
如图7所示，三特异性抗体CDR1-007在衔接H929骨髓瘤细胞后强效诱导Jurkat T细胞产生IL-2细胞因子。当与HEK293细胞共孵育时，CDR1-007没有诱导Jurkat T细胞产生IL-2，这表明CDR1-007的活性在衔接癌细胞后触发。
实例5-三特异性和双特异性抗体在结合人CD3+ T细胞和H929多发性骨髓瘤细胞后诱导IL-2细胞因子产生的能力
将三特异性抗体CDR1-007与双特异性串联scFv BCMA-CD3(CDR1-008)进行正面比较，以了解在衔接骨髓瘤癌细胞后，在分离的人CD3+ T细胞中诱导IL-2细胞因子产生的能力。简而言之，根据制造商的说明，使用EasySep人T细胞分离试剂盒(干细胞公司(Stemcell)，目录号17911)从PBMC中分离人CD3+ T细胞。在浓度范围为1至100nM的抗体存在下，将1x105个分离的CD3+ T细胞(效应细胞)与NCI-H929人多发性骨髓瘤细胞(靶细胞)以5∶1的效应细胞与靶细胞比例共孵育。在37℃、5％CO2下孵育18小时后，如以上实例4所述处理酶联板。
如图8所描绘，三特异性抗体CDR1-007比双特异性CDR1-008更高效地诱导了分离的人T细胞的IL-2细胞因子的浓度依赖性产生。这些结果表明，与双特异性CDR1-008相比，三特异性抗体CDR1-007中PD-L1的另外的结合位点有助于更强效的T细胞激活。
实例6-H929骨髓瘤细胞的抗体介导的重定向T细胞细胞毒性(LDH释放测定)
将三特异性抗体CDR1-007与双特异性抗体BCMA/CD3(CDR1-008-图9A)和PD-L1/CD3(CDR1-020-图9B)就诱导T细胞介导的H929人多发性骨髓瘤细胞的凋亡的能力进行了正面比较。简而言之，如实例5中所述，在双特异性或三特异性抗体之一的存在下，将分离的人CD3+ T细胞和NCI-H929人多发性骨髓瘤细胞共孵育。为了精确比较，将所有抗体构建体调节至范围为8pM至200nM最终浓度的相同摩尔浓度。
在37℃、5％CO2下孵育24小时后，使用Pierce LDH细胞毒性测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司，目录号88954)测量人骨髓瘤细胞的T细胞介导的细胞毒性。为了归一化，通过用裂解缓冲液孵育在实验孔中使用的相同数量的H929细胞(20,000个细胞)来获得H929人多发性骨髓瘤细胞的最大杀伤(对应于LDH的100％释放)。最小裂解被定义为在无任何测试抗体的条件下H929细胞与CD3+ T细胞共孵育时释放的LDH。通过将归一化的LDH释放值相对于三特异性和双特异性抗体的浓度作曲线图，获得了由抗体介导的H929骨髓瘤细胞杀伤的浓度-反应曲线。通过使用Prism GraphPad软件将曲线拟合到4参数非线性回归S形曲线模型来计算EC50值。
如图9A和9B所描绘，三特异性抗体CDR1-007比其双特异性对应物CDR1-008和CDR1-020更强效地诱导了H929骨髓瘤细胞的裂解。这些结果表明，与仅靶向癌细胞抗原的双特异性构建体相比，靶向BCMA组合PD-L1阻断的协同作用可导致更强效和有效的T细胞介导的癌细胞杀伤。
实例7：其他三特异性分子
接下来研究前述实例中描述的三特异性CDR1-007的作用是否可转移至：1)三特异性Fab-scFv，其中在不同位置评价每个结合位点；2)替代性的抗体形式和/或不同的抗原结合序列。
使用双重结合ELISA测试三特异性抗体分子结合不同靶标的能力。简而言之，将三特异性分子(和CDR1-007对照)的至范围为0.01pM至10nM的最终浓度的连续稀释液添加到包被有重组人BCMA Fc嵌合体(在HEK293-6E中瞬时转染后表达)的96孔ELISA板中，随后与重组人CD3 ε His标签蛋白(近岸蛋白，目录号C578)或重组人PD-L1 His标签蛋白(在HEK293-6E中瞬时转染后表达)产生二级缔合。通过抗His抗体(艾博抗，目录号ab1187)检测与抗原对的同时结合。图10A和10B显示了三特异性分子与BCMA-PD-L1(图10A)和BCMA-CD3(图10B)的浓度依赖性结合，其中在Fab-scFv构建体中评价了每个结合位点的位置。图11A和11B显示了与BCMA-PD-L1(图11A)和BCMA-CD3(图11B)的浓度依赖性结合，其中评价了替代性的抗体形式和不同的抗原结合序列。这些数据证实了三特异性抗体保持与三个不同靶标的结合活性的能力。
接下来，评价不同的三特异性构建体诱导T细胞介导的H929人多发性骨髓瘤细胞杀伤的能力。如实例6所述，将最终浓度为100nM和2nM的三特异性抗体与分离的人CD3+ T细胞和NCI-H929人多发性骨髓瘤细胞进行孵育。发现大多数替代性的三特异性分子能够以可比的方式诱导T细胞介导的H929多发性骨髓瘤细胞的杀伤(图12A和12B)。
实例8-抗PD-L1抗体亲和力变体
上述实例表明，PD-L1信号的阻断可与三特异性抗体的抗BCMA(肿瘤抗原结合臂)和CD3结合臂协同作用，以强效消除肿瘤。尽管PD-L1在癌细胞上过表达，但其在许多正常组织中的表达可能会导致在靶、肿瘤外的毒性或产生可能使这些三特异性抗体的治疗功效最小化的抗原沉默。在本实例中，产生了以对PD-L1降低的亲和力共同靶向癌细胞上的PD-L1和BCMA的三特异性T细胞衔接器抗体。这些特征促进了三特异性抗体与肿瘤细胞的选择性结合。
简而言之，使用全自动蛋白质结构同源性建模服务器(网站：expasy.org/swissmod)生成了CDR1-007的PD-L1结合臂的分子模型，选择认为对结合很重要的CDR区域的溶剂暴露残基用于向丙氨酸的突变(M.-P.Lefranc，2002；网址：imgt.cines.fr，A.Honegger，2001；网址：unizh.ch/～antibody)。表8显示了在CDR1-007的CDR区域引入的丙氨酸突变作为降低PD-L1结合臂的亲和力的候选者。根据制造商的说明，使用10纳克的CDR1-007表达载体(作为模板)、1.5μl的10μmol突变引物和Q5定点诱变试剂盒(新英格兰生物实验室，目录号E0554S)产生丙氨酸突变。如实例1所述，将所得突变体在HEK293-6E细胞中共转染并培养以表达三特异性突变体。通过ELISA测试了抗体的至最终浓度范围为0.5ng/mL至50μg/ml的连续稀释度，以与包被在96孔板上的人PD-L1的细胞外结构域结合。
表8-在PD-L1结合臂的CDR区引入的丙氨酸突变。丙氨酸突变以粗体下划线显示。
Figure BDA0002655202890000591
Figure BDA0002655202890000601
如图13所描绘，三特异性突变体的浓度-反应曲线显示出与固定的PD-L1的不同结合曲线，表明了广泛的结合亲和力。三特异性分子CDR1-007、CDR1-011和CDR1-017被认为代表了高、中和低亲和力范围，并按照Friguet等人的描述进行选择以通过竞争ELISA进行溶液中的亲和力表征(J Immunol Methods.[免疫学方法杂志]1985年3月18日；77(2)：305-19)。首先，将固定浓度的三特异性抗体(Ab)和不同浓度的PD-L1抗原(Ag)的混合物孵育足够的时间以达到平衡。然后，使用PD-L1包被的板通过经典间接ELISA测量在平衡状态下仍不饱和的三特异性抗体(未与PD-L1抗原缔合)的浓度。孔中包被的抗原量和ELISA的孵育时间应确保在ELISA期间溶液中的平衡没有明显改变，从而避免了三特异性PD-L1复合体(X)的解离。使用以下等式通过斯卡查德图计算出Kd：
[x]/[Ag]＝([Ab]-[x])/Kd
表9-选择三特异性抗体的Kd值
Figure BDA0002655202890000602
(Ab)：固定浓度的三特异性抗体；(Ag)：PD-L1抗原浓度范围
为了证实亲和力测量，还使用KinExA 3200(Sapidyne仪器，美国)流式荧光计通过动力学排斥测定法
Figure BDA0002655202890000603
确定了三特异性构建体CDR1-007和CDR1-017的抗PD-L1结合臂的结合亲和力。设计研究以测量平衡状态下具有固定抗体浓度和不同浓度抗原PD-L1的样品中的游离抗体，并在含1mg/ml BSA的PBS(pH 7.4)中执行反应混合物。使用含有200pM的CDR1-007和PD-L1抗原的浓度为5nM至5pM(两倍连续稀释)的样品进行测量。对于三特异性CDR1-017，使用1nM的抗体和PD-L1抗原从100nM至100pM的两倍连续稀释液进行测量。使用KinExA Pro软件(版本4.2.10；Sapidyne仪器)将平衡滴定和动力学数据拟合到1：1可逆结合模型，以确定Kd。对于三特异性CDR1-007，Kd值预测在21.7至42pM的范围内，对于三特异性CDR1-017，Kd值预测在9.4至20.6nM的范围内。总体而言，通过KinExA得到的Kd测量值低于通过竞争ELISA由溶液中的亲和性表征确定的测量值以及通过SPR实验(本文未描述)获得的一些初步值。来自KinExA的亲和力数据验证了CDR1-017和CDR1-007(WT)之间对PD-L1的亲和力约1000倍的差异。
使用MicroScale Thermophoresis(MST)进一步确定了三特异性抗体CDR1-007对BCMA的亲和力。用荧光染料标记人BCMA，并保持2nM的恒定浓度。在pH 7.4、0.05％Tween-20、1％BSA的PBS中进行结合反应，样品中含有2nM荧光标记的BCMA和CDR1-007(最终浓度为500nM至15.3pM(两倍连续稀释))。在25℃，在Monolith NT.115 Pico上以5％LED功率和40％激光功率分析这些样品。三特异性抗体与BCMA之间的相互作用显示出大幅度(9至10个单位)和高信噪比(10.7至14.9)，表明数据质量最佳。在两次不同的测量中，BCMA结合臂的结合亲和力确定为8.5至9.9nM。没有检测到粘附或聚集效应。
实例9-由对PD-L1具有不同结合亲和力的三特异性抗体诱导的H929骨髓瘤细胞的重定向T细胞细胞毒性
比较了对PD-L1具有不同结合亲和力的三特异性抗体诱导T细胞介导的H929人多发性骨髓瘤细胞凋亡的能力。如实例5中所述，将最终浓度范围为8pM至200nM的三特异性抗体CDR1-007、CDR1-011和CDR1-017与分离的人CD3+ T细胞和NCI-H929人多发性骨髓瘤细胞进行孵育。如图14A和图14B所描绘，所有三特异性抗体均诱导H929骨髓瘤细胞的强效裂解，并且EC50值与对PD-L1的表观亲和力一致。
实例10-用三特异性抗原结合蛋白进行的离体测定
使用多发性骨髓瘤细胞系和PBMC或来自正常血液供体的纯化T细胞进行的体外测定存在一定的局限性，因为它们不能完全反映多发性骨髓瘤患者体内骨髓免疫抑制环境的复杂性和影响。因此，离体测定是使用来自多发性骨髓瘤患者的骨髓抽吸物进行的，与体外测定相比，它们能接近地模仿患者的情况。为此，从新诊断、复发和多次复发的多发性骨髓瘤患者中收集的骨髓抽吸物中制备新鲜获得的(未冷冻保存的)细胞。分析所得的单核细胞悬液，以通过流式细胞术确定标记物阳性细胞的百分比。然后在三特异性化合物和相关对照存在下，将单核细胞悬液置于384孔成像板中37℃下含10％FBS并补充5％CO2的RPMI培养基中。在长达72小时的孵育时间后，对培养物进行免疫荧光染色，随后使用自动显微镜平台进行成像，如Nat Chem Biol.[自然化学生物学]2017年6月；13(6)：681-690中所描述的。所有化合物均以四个浓度和五个技术重复进行测定。在基于图像的离体测试中评价的化合物是CDR1-007、CDR1-011和CDR1-017(分别对应于对PD-L1的高、中和低亲和力)；双特异性对照(CDR1-008)；双特异性抗体CDR1-008、抗PD-L1抑制剂阿维鲁单抗(Avelumab)(ExpertOpin.Biol.Ther.[生物疗法的专家意见]2017.17(4)：515-523)和PBS的组合作为阴性对照。
使用针对浆细胞的CD138、CD269或CD319，T细胞的CD3和单核细胞的CD14的荧光标记的抗体对骨髓样品中的不同细胞群进行分类。对每个患者样品进行的骨髓抽吸物的流式细胞术分析揭示，这些细胞群的百分比不同，并且骨髓样品的浆细胞百分比(从4％直到58％)与这些多发性骨髓瘤患者的疾病状态之间具有很强的一致性(图15)。
体外评估了对PD-L1具有不同亲和力的三特异性抗体避免与T细胞和正常细胞交联的能力。将包含患者样品和测试化合物的显像板孵育24小时，使用荧光标记的抗体和正常细胞基于DAPI染色衍生的核检测鉴定CD3+细胞(不对细胞外标记物CD3、CD138、CD269、CD319或CD14进行染色)。CD3+细胞与正常细胞的相互作用是基于相互作用评分评价的，如Nat.Chem.Biol.[自然化学生物学]2017年6月；13(6)：681-690中所描述的。在来自新诊断(图16A)、复发(图16B)和多次复发(图16C)的多发性骨髓瘤患者的样品中，观察到用CDR1-007和CDR1-011孵育的CD3+细胞与正常细胞之间的细胞间相互作用增加。重要的是，CDR1-017没有增加CD3+细胞与正常细胞的相互作用，这表明降低的PD-L1亲和力成功减少了三特异性CDR1-017与仅表达PD-L1的正常细胞的结合。
接下来，评价了CDR1-017三特异性抗体将CD3+ T细胞重定向至CD138、CD269或CD319染色的靶细胞群的能力。如图22所描绘，三特异性抗体CDR1-017(实心框)比双特异性抗体CDR1-008(空心框)更高效地增加了来自不同多发性骨髓瘤患者的样品中T细胞和浆细胞之间的相互作用。这些结果表明，与双特异性抗体CDR1-008相比，三特异性抗体CDR1-017中PD-L1的另外的结合位点有助于更高效的T细胞重定向。
在不同的读数中，通过在存在测试化合物的情况下定量CD3+群上的CD25表达强度来评估T细胞激活。图17A至图17C显示了来自新诊断、复发和多次复发患者的CDR1-017强效激活的T细胞，而不管细胞群的比例如何。实际上，CDR1-017显著超过了用BCMA/CD3双特异性抗体实现的T细胞激活水平，以及通过将抗PD-L1和BCMA/CD3双特异性抗体组合获得的T细胞激活水平。
该实验表明，CDR1-017高效地将T细胞重定向至癌细胞，并同时通过PD-1/PD-L1阻断来诱导T细胞的局部激活，同时避免了表达PD-L1的细胞产生的潜在“抗原沉默”。总的来说，这些结果建立了靶向CD3和PD-L1以及肿瘤抗原的三特异性抗体，这是将组合疗法的协同效益针对性地导向肿瘤细胞的可行策略。
实例11：热稳定性评估
使用两种方法进行本发明的抗体的热去折叠实验：1)常规差示扫描荧光测定(DSF)；和2)nanoDSF。简而言之，对于DSF实验，应用线性温度上升以去折叠蛋白质样品，并且基于荧光染料(
Figure BDA0002655202890000631
Orange)与疏水性斑块的相互作用检测蛋白质去折叠，其中这些疏水性斑块在加热后暴露于溶剂中。通过DSF进行热去折叠实验的代表性数据如图18所示。在25℃至98℃的温度梯度下，以3℃/分钟的加热速度，在10mM磷酸钠(pH 6.5)和150mM NaCl缓冲液中测量2至3μM的浓度范围的样品。CDR1-007、CDR1-011和CDR1-017表现出高稳定性，并在74℃下发生去折叠转变。对于nanoDSF实验，测量了1.6至5μM的浓度范围的七种三特异性抗体和两种Fab，并使用Prometheus NT.Plex(Nanotemper)以1℃/分钟的加热速度进行20℃-95℃的温度梯度处理。来自nanoDSF的Tm数据与μDSC数据的比较表明，在检测CDR1-007、CDR1-0011和CDR1-017发生单个去折叠事件的方法之间，存在良好的一致性。DSF中确定的更高的Tm归因于更快的扫描速率。
实例12：三特异性抗体的稳定性研究
为了评估三特异性抗体的寡聚化/片段化倾向，将CDR1-007、CDR1-011和CDR1-017在pH 6.5的配制缓冲液(10mM磷酸盐，140mM NaCl)中浓缩至10mg/mL，并在37℃下孵育2周。在孵育14天之前和之后使用尺寸排阻色谱对样品进行分析，以定量单体蛋白、聚集体和低分子量物质。在TSKgel Super SW2000色谱柱(东曹生命科学(TOSOH Bioscience))上通过HPLC从非单体物质中分离出单体。单体蛋白的百分比计算为单体峰的面积除以所有产物峰的总面积。
在37℃下孵育2周后，所有三特异性样品在非优化缓冲液中均显示出良好的稳定性。图19描绘了CDR1-007(图19A)、CDR1-011(图19B)和CDR1-017(图19C)的尺寸排阻色谱分析。大约7.8分钟(与预期的洗脱时间一致)后，将主峰分配给从色谱柱上洗脱的单体蛋白，并获得了单体峰与聚集体峰以及片段之间的良好分辨率。孵育前，这些三特异性蛋白质样品的单体含量对于CDR1-007和CDR1-011约为94％，对于CDR1-017约为92％。对于所有样品，在37℃下孵育2周后，样品在非优化缓冲液中的单体损失为约4％。将另外的峰分配给定义的分子量聚集体和低分子量物质。
实例13：在衔接癌细胞系后，具有对不同TAA的特异性的三特异性抗体激活T细胞的能力。
评价了三种与不同肿瘤相关抗原(TAA)结合的三特异性抗体在衔接相关癌细胞系后诱导分离的人CD3+细胞中IL-2细胞因子产生的能力。将对CD3、PD-L1和CD19具有特异性的抗体CDR1-061和对CD3、PD-L1和HER2具有特异性的抗体CDR1-08与各自的双特异性对照(CDR1-063和CDR1-083)正面比较根据IL-2产生所测量的它们激活T细胞的能力。还包括对BCMA具有特异性的三特异性抗体CDR1-007和双特异性对照CDR1-008作为参考。
简而言之，如实例4和5所描述，从PBMC分离人CD3+ T细胞，并将1×105个分离的CD3+ T细胞(效应细胞)与NCI-H929人多发性骨髓瘤细胞、B细胞淋巴瘤系Raji(
Figure BDA0002655202890000641
CCL-86TM)和人大肠癌细胞系HCT116(
Figure BDA0002655202890000642
CCL-247TM)以5∶1的效应细胞与靶细胞比例在0.1nM和2nM抗体浓度的存在下共孵育。图20显示了在存在不同三特异性抗体及其相应的双特异性对照的情况下与H929多发性骨髓瘤细胞(图20A)、Raji淋巴瘤细胞(图20B)和HCT116细胞(图20C)共培养的T细胞上清液中测量的IL-2。这些实验的结果表明，所有三种三特异性抗体均比双特异性对照更高效地诱导分离的人T细胞产生IL-2细胞因子。这表明该方法可以有效地用于几种恶性肿瘤中，以挽救PD-L1介导的人T细胞激活抑制。

Claims (67)

1.一种三特异性抗原结合蛋白，其包含：
a)能够结合肿瘤细胞的细胞表面蛋白的第一结合结构域；
b)能够结合该肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白的第二结合结构域；以及
c)能够结合免疫细胞的细胞表面蛋白的第三结合结构域，
其中该第一结合结构域以降低的亲和力与肿瘤细胞的细胞表面蛋白结合，从而抑制与非肿瘤细胞或可溶形式的该细胞表面蛋白的结合。
2.一种三特异性抗原结合蛋白，其包含：
a)能够结合肿瘤细胞的细胞表面蛋白的第一结合结构域；
b)能够结合该肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白的第二结合结构域；以及
c)能够结合免疫细胞的细胞表面蛋白的第三结合结构域，
其中该第一和第二结合结构域以降低的亲和力结合靶抗原，从而抑制与非肿瘤细胞的结合。
3.如权利要求1或2所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该肿瘤细胞的细胞表面蛋白选自由BCMA、CD19、CD20、CD33、CD123、CEA、LMP1、LMP2、PSMA、FAP和HER2组成的组。
4.如权利要求1-3中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第一结合结构域结合该肿瘤细胞上的BCMA。
5.如权利要求1-4中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白选自由CD40、CD47、CD80、CD86、GAL9、PD-L1和PD-L2组成的组。
6.如权利要求1-5中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第二结合结构域结合该肿瘤细胞上的PD-L1。
7.如权利要求1-6中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第三结合结构域结合该免疫细胞上的CD3、TCRα、TCRβ、CD16、NKG2D、CD89、CD64或CD32a。
8.如权利要求1-7中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第三结合结构域结合该免疫细胞上的CD3。
9.如权利要求1-8中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第一结合结构域亲和力在约1nM至约100nM之间。
10.如权利要求1-9中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第二结合结构域亲和力在约1nM至约100nM之间。
11.如权利要求1-10中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第一结合结构域亲和力在约10nM至约80nM之间。
12.如权利要求1-11中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第二结合结构域亲和力在约10nM至约80nM之间。
13.如权利要求1-12中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第一和第二结合结构域结合同一细胞上的靶抗原以增加结合亲合力。
14.如权利要求1-13中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第一结合结构域包括对该肿瘤细胞的细胞表面蛋白的低亲和力，以减少与健康细胞或可溶形式的该细胞表面蛋白的交联。
15.如权利要求1-14中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第二结合结构域包括对该肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白的低亲和力，以减少与健康细胞的交联。
16.如权利要求1-15中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第一和第二结合结构域各自包括对该肿瘤细胞的靶抗原的低亲和力，其中相对于与健康细胞的交联，该三特异性抗原结合蛋白包括与该肿瘤细胞的增强的交联。
17.如权利要求1-16中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第一和第二结合结构域结合同一细胞上的靶抗原以减少与健康组织的脱靶结合。
18.如权利要求1-17中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第一、第二和第三结合结构域具有减少的脱靶结合。
19.如权利要求1-18中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中肿瘤细胞的细胞表面蛋白在健康细胞上不存在或相对于肿瘤细胞表达有限。
20.如权利要求1-19中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第二结合结构域对该肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白具有低亲和力，从而减少对健康细胞的检查点抑制。
21.如权利要求1-20中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第一、第二和第三结合结构域包括抗体。
22.如权利要求1-21中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第一、第二和第三结合结构域包括scFv、sdAb或Fab片段。
23.如权利要求1-22中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第二结合结构域是单价的。
24.如权利要求1-23中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第三结合结构域是单价的。
25.如权利要求1-24中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第一、第二和第三结合结构域通过一个或多个接头连接在一起。
26.如权利要求1-25中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该三特异性抗原结合蛋白具有约75kDa至约100kDa的分子量。
27.如权利要求1-26中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该三特异性抗原结合蛋白相对于分子量≤约60kDa的抗原结合蛋白具有增加的血清半衰期。
28.一种三特异性抗原结合蛋白，其包含：
a)能够结合肿瘤细胞的细胞表面蛋白的第一结合结构域；
b)能够结合该肿瘤细胞的表面上的PD-L1的第二结合结构域；以及
c)能够结合T细胞表面上的CD3的第三结合结构域；
其中该第一和第二结合结构域以降低的亲和力与肿瘤细胞的细胞表面蛋白和PD-L1结合，从而抑制与非肿瘤细胞的结合。
29.如权利要求28所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该肿瘤细胞的细胞表面蛋白选自由BCMA、CD19、CD20、CD33、CD123、CEA、LMP1、LMP2、PSMA、FAP和HER2组成的组。
30.如权利要求29所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第一结合结构域结合该肿瘤细胞上的BCMA。
31.如权利要求28-30中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第一结合结构域亲和力在约1nM至约100nM之间。
32.如权利要求28-31中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第二结合结构域亲和力在约1nM至约100nM之间。
33.如权利要求28-32中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第一结合结构域亲和力在约10nM至约80nM之间。
34.如权利要求28-33中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第二结合结构域亲和力在约1nM至约80nM之间。
35.如权利要求28-34中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第一和第二结合结构域结合同一细胞上的靶抗原以增加结合亲合力。
36.如权利要求28-35中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第一结合结构域包括对该肿瘤细胞的细胞表面蛋白的低亲和力，以减少与健康细胞或可溶形式的该细胞表面蛋白的交联。
37.如权利要求28-36中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第二结合结构域包括对该肿瘤细胞的表面上的PD-L1的低亲和力，以减少与健康细胞的交联。
38.如权利要求28-37中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第一和第二结合结构域各自包括对该肿瘤细胞的靶抗原的低亲和力，其中相对于与健康细胞的交联，该三特异性抗原结合蛋白包括与该肿瘤细胞的增强的交联。
39.如权利要求28-38中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第一和第二结合结构域结合同一细胞上的靶抗原以减少与健康组织的脱靶结合。
40.如权利要求28-39中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第一、第二和第三结合结构域具有减少的脱靶结合。
41.如权利要求28-40中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中肿瘤细胞的细胞表面蛋白在健康细胞上不存在或相对于肿瘤细胞表达有限。
42.如权利要求28-41中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第二结合结构域对该肿瘤细胞的表面上的PD-L1具有低亲和力，以减少对健康细胞的检查点抑制。
43.如权利要求28-42中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第一、第二和第三结合结构域包括抗体。
44.如权利要求28-43中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第一、第二和第三结合结构域包括scFv、sdAb或Fab片段。
45.如权利要求28-44中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第二结合结构域是单价的。
46.如权利要求28-45中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第三结合结构域是单价的。
47.如权利要求28-46中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该第一、第二和第三结合结构域通过一个或多个接头连接在一起。
48.如权利要求28-47中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该三特异性抗原结合蛋白具有约75kDa至约100kDa的分子量。
49.如权利要求28-48中任一项所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该三特异性抗原结合蛋白相对于分子量≤约60kDa的抗原结合蛋白具有增加的血清半衰期。
50.一种三特异性抗原结合蛋白，其包含：
a)能够结合肿瘤细胞的细胞表面蛋白的第一抗体结合结构域；
b)能够结合该肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白的第二抗体结合结构域；以及
c)能够结合免疫细胞的细胞表面蛋白的第三抗体结合结构域。
51.一种包含两条不同的链的三特异性抗原结合蛋白，其中：
a)一条链包含与至少一个另外的结合结构域连接的Fab片段的至少一条重链(Fd片段)；并且
b)另一条链包含与至少一个另外的结合结构域连接的Fab片段的至少一条轻链(L)；
其中该Fab结构域任选地用作特异性异源二聚化支架，这些另外的结合结构域任选地与之连接，并且这些结合结构域具有不同的特异性。
52.如权利要求50所述的三特异性抗原结合蛋白，其中这些另外的结合结构域是scFv或sdAb。
53.如权利要求50所述的三特异性抗原结合蛋白，其中该三特异性结合蛋白包含：
i)能够结合肿瘤细胞的细胞表面蛋白的第一结合结构域；
ii)能够结合该肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白的第二结合结构域；以及
iii)能够结合免疫细胞的细胞表面蛋白的第三结合结构域。
54.如权利要求50所述的三特异性抗原结合蛋白，其中这些另外的结合结构域连接至该Fab片段的重链或轻链的N末端或C末端。
55.一种治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的三特异性抗原结合蛋白，其中该三特异性抗原结合蛋白包含：
a)能够结合肿瘤细胞的细胞表面蛋白的第一结合结构域；
b)能够结合该肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白的第二结合结构域；以及
c)能够结合免疫细胞的细胞表面蛋白的第三结合结构域，
其中该第一和第二结合结构域以降低的亲和力结合靶抗原，从而抑制与非肿瘤细胞的结合。
56.如权利要求55所述的方法，其中该肿瘤细胞的细胞表面蛋白选自由BCMA、CD19、CD20、CD33、CD123、CEA、LMP1、LMP2、PSMA、FAP和HER2组成的组。
57.如权利要求56所述的方法，其中该第一结合结构域结合该肿瘤细胞上的BCMA。
58.如权利要求55-57中任一项所述的方法，其中该肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白选自由CD40、CD47、CD80、CD86、GAL9、PD-L1和PD-L2组成的组。
59.如权利要求58所述的方法，其中该第二结合结构域结合该肿瘤细胞上的PD-L1。
60.如权利要求55-59中任一项所述的方法，其中该第三结合结构域结合该免疫细胞上的CD3、TCRα、TCRβ、CD16、NKG2D、CD89、CD64或CD32a。
61.如权利要求60所述的方法，其中该第三结合结构域结合该免疫细胞上的CD3。
62.如权利要求55-61中任一项所述的方法，其中该癌症选自由多发性骨髓瘤、急性髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、黑色素瘤、EBV相关癌症以及B细胞淋巴瘤和白血病组成的组。
63.一种鉴定能够与肿瘤细胞的细胞表面蛋白和/或肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白结合的抗原结合结构域的离体方法，该方法包括：
a)从患有癌症的患者中分离肿瘤细胞；
b)使这些肿瘤细胞与一组抗原结合结构域接触；
c)确定这些抗原结合结构域与其靶抗原的结合亲和力；以及
d)选择亲和力相对于对照抗原结合结构域较弱的抗原结合结构域。
64.如权利要求63所述的离体方法，该方法进一步包括步骤e)，其中将所选择的抗原结合结构域掺入三特异性抗原结合蛋白中。
65.一种鉴定能够与肿瘤细胞的细胞表面蛋白和肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白之一或两者结合的抗原结合结构域的离体方法，该方法包括：
a)从患有癌症的患者中分离外周血单核细胞(PBMC)或骨髓浆细胞(PC)和自体骨髓浸润T细胞；
b)使这些PBMC或PC与一组三特异性抗原结合蛋白接触，其中该三特异性抗原结合蛋白的第一结构域与T细胞上的CD3结合，并且该三特异性抗原结合蛋白的第二结构域与肿瘤细胞的细胞表面蛋白和/或肿瘤细胞的细胞表面免疫检查点蛋白结合；
c)通过测量三特异性抗原结合蛋白对免疫介导的癌细胞杀伤的一种或多种作用来确定癌细胞的药物杀伤；以及
d)基于这些三特异性抗原结合蛋白诱导免疫介导的癌细胞杀伤的能力对其进行选择。
66.如权利要求65所述的离体方法，其中三特异性抗原结合蛋白对免疫介导的癌细胞杀伤的作用包括乳酸脱氢酶(LDH)释放。
67.如权利要求65所述的离体方法，其中三特异性抗原结合蛋白对免疫介导的癌细胞杀伤的作用包括耗尽的靶癌细胞的数量。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114853897A (zh) * 2021-04-15 2022-08-05 北京大学深圳研究生院 抗cd19/cd22/cd3三特异性抗体及用途
WO2025026282A1 (en) * 2023-07-29 2025-02-06 Shanghai Kaijin Biotechnology, Ltd Modified type e multi-specific antibodies

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016187594A1 (en) 2015-05-21 2016-11-24 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific binding proteins and methods of use
CN106397592A (zh) * 2015-07-31 2017-02-15 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 针对程序性死亡配体(pd-l1)的单域抗体及其衍生蛋白
IL315737A (en) 2017-10-13 2024-11-01 Harpoon Therapeutics Inc B-cell maturation antigen-binding proteins
AU2018347582B2 (en) 2017-10-13 2025-08-28 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific proteins and methods of use
US12195544B2 (en) 2018-09-21 2025-01-14 Harpoon Therapeutics, Inc. EGFR binding proteins and methods of use
CA3114038A1 (en) 2018-09-25 2020-04-02 Harpoon Therapeutics, Inc. Dll3 binding proteins and methods of use
EP3816185A1 (en) * 2019-11-04 2021-05-05 Numab Therapeutics AG Multispecific antibody directed against pd-l1 and a tumor-associated antigen
WO2021089841A1 (en) * 2019-11-08 2021-05-14 Nanotemper Technologies Gmbh Characterization of particles in solution
JP7369297B2 (ja) 2019-12-17 2023-10-25 ファイザー・インク Ｃｄ４７、ｐｄ－ｌ１に特異的な抗体、およびその使用
US20230406955A1 (en) * 2020-10-22 2023-12-21 Janux Therapeutics, Inc. Antibodies targeting her2 and cd3 and uses thereof
EP4347636A4 (en) * 2021-06-03 2025-04-16 Harpoon Therapeutics, Inc. BCMA targeting trispecific proteins and methods of use
US20240425597A1 (en) * 2021-09-16 2024-12-26 Gt Biopharma, Inc. Pd-l1 targeting fusion proteins and methods of use thereof
CN114371282B (zh) * 2021-12-30 2025-07-11 上海药明生物技术有限公司 一种评估抗原沉默效应对抗体药效影响的方法及其应用
WO2025109119A1 (en) 2023-11-22 2025-05-30 Priothera Sas Methods of treatment with multispecific antigen-binding proteins in combination with s1p receptor modulators

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101802010A (zh) * 2007-07-10 2010-08-11 费里德瑞奇亚历山大大学 重组、单链、三价三特异性或双特异性抗体衍生物
WO2017124002A1 (en) * 2016-01-13 2017-07-20 Compass Therapeutics Llc Multispecific immunomodulatory antigen-binding constructs
US20170320967A1 (en) * 2016-04-13 2017-11-09 Sanofi Trispecific and/or trivalent binding proteins
CN107614522A (zh) * 2015-01-14 2018-01-19 指南针制药有限责任公司 多特异性免疫调节性抗原结合构建体

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9524973D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Lynxvale Ltd Viral vectors
ATE283364T1 (de) * 1998-01-23 2004-12-15 Vlaams Interuniv Inst Biotech Mehrzweck-antikörperderivate
ID27512A (id) 1998-04-21 2001-04-12 Microment Ges Fur Biomedizinis Polipeptid tetapan cd19xcd3 dan kegunaan-kegunaannya
CA3201163A1 (en) 2005-07-01 2007-01-11 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Human monoclonal antibodies to programmed death ligand 1 (pd-l1)
PL2406284T3 (pl) 2009-03-10 2017-09-29 Biogen Ma Inc. Przeciwciała anty-bcma
JP2014500879A (ja) 2010-11-16 2014-01-16 ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング Ｂｃｍａ発現に相関性を有する疾患を治療する因子及び方法
CN107903325B (zh) * 2011-05-16 2021-10-29 埃泰美德(香港)有限公司 多特异性fab融合蛋白及其使用方法
CN103889452B (zh) 2011-08-23 2017-11-03 罗切格利卡特公司 对t细胞活化性抗原和肿瘤抗原特异性的双特异性抗体及使用方法
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
ES2829499T3 (es) 2013-02-05 2021-06-01 Engmab Sarl Método para la selección de anticuerpos contra BCMA
KR102513870B1 (ko) * 2014-10-14 2023-03-23 노파르티스 아게 Pd-l1에 대한 항체 분자 및 그의 용도
EA037065B1 (ru) 2014-11-26 2021-02-01 Ксенкор, Инк. Гетеродимерные антитела, связывающие cd3 и cd38
CN107207598B (zh) 2014-12-12 2020-12-08 蓝鸟生物公司 Bcma嵌合抗原受体
WO2016187594A1 (en) 2015-05-21 2016-11-24 Harpoon Therapeutics, Inc. Trispecific binding proteins and methods of use
CN105384825B (zh) 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
EP3165536A1 (en) * 2015-11-09 2017-05-10 Ludwig-Maximilians-Universität München Trispecific molecule combining specific tumor targeting and local immune checkpoint inhibition
WO2017106453A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 University Of Maryland, Baltimore County A recombinant bi-specific polypeptide for coordinately activating tumor-reactive t-cells and neutralizing immune suppression
LT3411402T (lt) 2016-02-03 2022-01-25 Amgen Research (Munich) Gmbh Bcma ir cd3 bispecifinis t ląsteles sužadinantis antikūno konstruktas
CA3014067A1 (en) 2016-02-25 2017-08-31 Cell Medica Switzerland Ag Modified cells for immunotherapy
CN109153728A (zh) * 2016-03-21 2019-01-04 埃尔斯塔治疗公司 多特异性和多功能分子及其用途
US11414491B2 (en) 2016-05-18 2022-08-16 Mayo Foundation For Medical Education And Research Targeting PD-L1 on tumor cells
WO2017201493A1 (en) 2016-05-20 2017-11-23 Harpoon Therapeutics, Inc. Single chain variable fragment cd3 binding proteins
EP3252078A1 (en) * 2016-06-02 2017-12-06 F. Hoffmann-La Roche AG Type ii anti-cd20 antibody and anti-cd20/cd3 bispecific antibody for treatment of cancer
US20190225702A1 (en) 2016-10-14 2019-07-25 Harpoon Therapeutics, Inc. Innate immune cell trispecific binding proteins and methods of use
EA201990787A1 (ru) * 2016-11-02 2019-12-30 Энгмаб Сарл Биспецифичное антитело к всма и cd3 и иммунологическое лекарственное средство для комбинированного применения в лечении множественной миеломы
JP7356970B2 (ja) * 2017-06-25 2023-10-05 システィミューン， インク． 多重特異性抗体とその作製及び使用方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101802010A (zh) * 2007-07-10 2010-08-11 费里德瑞奇亚历山大大学 重组、单链、三价三特异性或双特异性抗体衍生物
CN107614522A (zh) * 2015-01-14 2018-01-19 指南针制药有限责任公司 多特异性免疫调节性抗原结合构建体
WO2017124002A1 (en) * 2016-01-13 2017-07-20 Compass Therapeutics Llc Multispecific immunomodulatory antigen-binding constructs
US20170320967A1 (en) * 2016-04-13 2017-11-09 Sanofi Trispecific and/or trivalent binding proteins

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUAN MA ET AL.: "HER2 as a Promising Target for Cytotoxicity T Cells in Human Melanoma Therapy", 《PLOS ONE》, vol. 8, no. 8, pages 1 - 11 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114853897A (zh) * 2021-04-15 2022-08-05 北京大学深圳研究生院 抗cd19/cd22/cd3三特异性抗体及用途
CN114853897B (zh) * 2021-04-15 2024-01-26 北京大学深圳研究生院 抗cd19/cd22/cd3三特异性抗体及用途
WO2025026282A1 (en) * 2023-07-29 2025-02-06 Shanghai Kaijin Biotechnology, Ltd Modified type e multi-specific antibodies

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