CN112105362A - 细胞因子释放综合征等的改善剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供针对细胞因子释放综合征、与自身免疫性疾病相关的副作用、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症或朗格汉斯细胞组织细胞增生症的药物。本发明提供包含下述化学式I表示的化合物或其药学上允许的盐的药物，并且所述药物针对选自细胞因子释放综合征、与自身免疫性疾病相关的副作用、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症和朗格汉斯细胞组织细胞增生症中的至少1种，

Description

细胞因子释放综合征等的改善剂

技术领域

本发明涉及预防、治疗或改善细胞因子释放综合征、与自身免疫性疾病相关的副作用、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症或朗格汉斯细胞组织细胞增生症的药剂。

背景技术

近年来，为了治疗癌症而尝试了被称为表达嵌合抗原受体(Chimeric antigenreceptor：CAR)的T细胞(CAR-T细胞)疗法、修饰T细胞受体(TCR)基因的T细胞(TCR-T细胞)疗法的治疗方法。此外，从体内发生的免疫系统的活化的观点出发，这种通过T细胞活化的癌症治疗与通过免疫检查点抑制剂进行的癌症治疗具有共通性。CAR-T细胞等细胞治疗方法是对从患者采集的T细胞实施表达具有靶标能力的CAR、特定TCR的基因修饰技术后，将其返回体内的自体T细胞治疗方法。表达CAR等的T细胞不仅杀死(杀伤活性(Killeractivity))包含表达靶标的癌症细胞的肿瘤细胞，而且通过反复暴露于抗原而高效地扩大功能性T细胞的增殖。此外，杀死的肿瘤细胞被破坏时游离的抗原通过被呈递至抗原呈递细胞而刺激内源性的T细胞并诱导活化。因此，CAR-T细胞一旦注入，就可在患者体内生长并增殖，促进免疫监视。

此外，免疫检查点抑制剂是通过与免疫检查点分子或其配体结合并阻碍免疫抑制信号的传达，来解除免疫检查点分子导致的癌症细胞识别T细胞的活化抑制的药剂。临床应用的主要免疫检查点抑制剂为抗细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T-lymphocyteassociated antigen，CTLA-4)抗体、抗程序性细胞死亡-1(Programmed cell death-1，PD-1)抗体、抗程序性死亡-1配体-1(Programmed death-1ligand-1，PD-L1)抗体等。

根据最近的研究进展可明确，被称为单核细胞、巨噬细胞的异常活化和该异常活化所伴随的组织损伤(MAS，也称为巨噬细胞活化综合征)、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(LCH)等的骨病变和皮肤病变或全身内脏器官病变，随着T细胞的活化而出现症状。

在CAR-T细胞疗法的情况下，产生被称为细胞因子释放综合征(Cytokine-releasesyndrome：CRS)的问题(CRS毒性)。CRS是伴随发热、低血压、缺氧、脑水肿、神经变性等的血中细胞因子水平显著增加的状态。

由于向癌症患者移入CAR-T细胞时必然产生CRS毒性，因此在扩大CAR-T细胞的适用或试行方面，CRS毒性的控制极其重要⁴⁾(非专利文献1)。

通过CAR-T细胞进行的血液癌症细胞、癌症组织的识别和破坏的机制是明确的，但是关于CRS毒性的机制还有许多不清楚的地方。与CAR-T细胞疗法同时获批的白细胞介素(IL)-6R抗体(托珠单抗(Tocilizumab))可将CRS毒性控制在允许的范围内，由此，表明IL-6过度产生导致的正常组织的炎症的损伤机制为CRS毒性机制⁵⁾(非专利文献2)。

同样，在免疫检查点抑制剂的情况下，随着被称为与自身免疫性疾病相关的副作用(irAEs)的免疫亢进，也报道有炎症性的免疫反应在皮肤、消化系统、内分泌系统、神经系统等全身所有内脏器官中表达(非专利文献10、11)。认为治疗的根本在于停药和给药类固醇，但是预防和治疗该irAEs的药物还处于开发过程中，正在进行包含现有药剂的各种研究。

以对给药托珠单抗呈现出耐药性的CRS毒性的患者的情况下IL-6途径以外的炎症性细胞因子类(TNF-α、IL-18、IL-1β、MCP-1等)的上升、在并发脑水肿的情况下抗体药物的不适应等作为背景，希望开发能够广泛适应CRS毒性的药剂、新型CAR基因。例如，从可通过对过度的CAR-T细胞的活化进行控制来控制CRS毒性的想法出发，尝试了通过BTK抑制剂对过度的CAR-T细胞活化进行抑制⁶⁾(非专利文献3)、尝试了通过将“药剂敏感性succide基因”导入CAR基因内来对过度的CAR-T细胞的活化进行控制⁷⁾(非专利文献4)等。

包含现在仍用于抑制CRS毒性的类固醇的这些候补药剂，主要着眼于CAR-T细胞功能的抑制，虽然是暂时的，但是存在结果导致CAR-T细胞带来的癌症消退效果被消除的重大风险。从严重的CRS毒性是致死性的方面出发，研究这些的适用被认为是不可避免的选择。

目前的CAR-T细胞疗法主要限于血癌，在实体癌的情况下未得到明确的奏效结果，因此，也在研究更强力的CAR基因、组合使用药物。也尝试了例如开发依赖于抗原刺激而使细胞因子信号活化的新型嵌合抗原受体⁸⁾(非专利文献5)、与作为免疫检查点抑制剂的PD-1/CTLA4抗体组合使用⁹⁾(非专利文献6)等进一步增强杀伤活性并达成长期持续的方法。

此外，认为移入的CAR-T细胞数的增加、抗癌药预处理带来的CAR-T细胞的癌症组织通路的改善等也是现实性的癌症消退效果增强的方法。

认为随着这样的CAR-T细胞疗法的改良，今后，可允许并发·必发的CRS毒性¹⁴⁾的适当控制进一步成为重要的问题。

可是，开发了被称为JTE-607的化合物((-)-乙基N-{3,5-二氯-2-羟基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯甲酰基}-L-苯丙氨酸)二盐酸盐(专利文献1)作为抑制炎症性细胞因子产生的候补药剂。

JTE-607是抑制炎症性细胞因子产生并对髓系细胞(Myeloid lineage cells)具有选择性的化合物，以全身性炎症反应综合征(Systemic inflammatory responsesyndrome：SIRS)患者为对象实施II期试验。发现在第I期后期试验中，JTE-607抑制脂多糖(LPS)负荷下的IL-6、IL-8等炎症性细胞因子产生，并且给药量依赖性地抑制C反应蛋白(C-reactive protein：CRP)上升。此外发现，之后在体外体系中，选择性地抑制急性骨髓性白血病(Acute Myeloid Leukemia：AML)细胞株的自我增值¹⁾(非专利文献7)。

报告了单核细胞/巨噬细胞的异常活化可能参与CAR-T细胞疗法中的CRS毒性、脑水肿发病^2),3)(非专利文献8、9)。然而，这只是根据临床上的细胞因子产生概况中，CRS毒性表达和IL-6等炎症性细胞因子产生是同期进行的、和托珠单抗带来的CRS毒性的改善效果而推定的“假说”。预期对该假说进行验证不仅可掌握CRS毒性的特征并且促进适当的药剂开发，而且与在对耐托珠单抗患者使用的类固醇(泼尼松龙：PSL)处方存在担忧的情况下不抑制(免疫抑制)CAR-T细胞并改善·预防CRS毒性的药物的研究开发相关。

就CAR-T细胞而言，将暂时在体外进行加工扩增的T细胞定位为“大量转移至体内并具有抗癌症作用的效应T细胞”。

该效应T细胞的过度增殖是内源性现象，例如可举出：给药免疫检查点抑制剂引起的“内源性抗癌症作用效应T细胞的过度扩增”、病毒感染·扩增时引起的“抗病毒性效应T细胞的过度扩增”。这些治疗和疾病发病时并发的irAEs、HLH和MAS中的巨噬细胞异常活化·细胞因子过度产生，可认为是与CAR-T细胞疗法中并发的CRS毒性共通的事件。事实上，研究了托珠单抗对irAEs的效果并报告了一定的效果(非专利文献12)。

在整理这些副作用和疾病的共通事件时，出现了效应T细胞的过度增殖和与之并发的巨噬细胞等的异常活化可能与各个细胞群相互关联·影响的假说。因此，认为CRS毒性的阐明和治疗方法开发，与对这些irAEs、HLH和MAS症状的新理解和适当的治疗药物的开发相关。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO97/08133(实施例2)

非专利文献

非专利文献1：Current concepts in the diagnosis and management ofcytokine release syndrome.Lee DW,Gardner R,Porter DL,Louis CU,Ahmed N,JensenM,Grupp SA,Mackall CL.Blood.2014Jul 10；124(2):188-95.

非专利文献2：Severe Cytokine-Release Syndrome after T Cell-RepletePeripheral Blood Haploidentical Donor Transplantation Is Associated with PoorSurvival and Anti-IL-6Therapy Is Safe and Well Tolerated.Abboud R,Keller J,Slade M,DiPersio JF,Westervelt P,Rettig MP,Meier S,Fehniger TA,Abboud CN,UyGL,Vij R,Trinkaus KM,Schroeder MA,Romee R.Biol Blood MarrowTransplant.2016Oct；22(10):1851-1860.

非专利文献3：Kinase inhibitor ibrutinib to prevent cytokine-releasesyndrome after anti-CD19 chimeric antigen receptor T cells for B-cellneoplasms.bRuella M,Kenderian SS,Shestova O,Klichinsky M,Melenhorst JJ,WasikMA,Lacey SF,June CH,Gill S.Leukemia.2017Jan；31(1):246-248.

非专利文献4：A new insight in chimeric antigen receptor-engineeredTcells for cancer immunotherapy.Zhang E,Xu H.J Hematol Oncol.2017Jan 3；10(1):1.

非专利文献5：A novel chimeric antigen receptor containing a JAK-STATsignaling domain mediates superior antitumor effects.Kagoya Y,Tanaka S,Guo T,Anczurowski M,Wang CH,Saso K,Butler MO,Minden MD,Hirano N.Nat Med.2018Mar；24(3):352-359.

非专利文献6：Immuno-oncologic Approaches:CAR-T Cells and Checkp ointInhibitors.Gay F,D'Agostino M,Giaccone L,Genuardi M,Festuccia M,Boccadoro M,Bruno B.Clin Lymphoma Myeloma Leuk.2017Aug；17(8):471-478.

非专利文献7：JTE-607,a multiple cytokine production inhibitor,induce sapoptosis accompanied by an increase in p21waf1/cip1 in acute myelogeno usleukemia cells.Tajima N,Fukui K,Uesato N,Maruhashi J,Yoshida T,Watanabe Y,Tojo A.Cancer Sci.2010Mar；101(3):774-81.

非专利文献8：CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediat edby macrophages and abated by IL-1blockade.Giavridis T,van der Steg en SJC,Eyquem J,Hamieh M,Piersigilli A,Sadelain M.Nat Med.2018J un；24(6):731-738.

非专利文献9：New drugs,new toxicities:severe side effects of moderntargeted and immunotherapy of cancer and their management.Kroschinsky F,Stolzel F,von Bonin S,Beutel G,Kochanek M,Kiehl M,Schellongowsk i P；IntensiveCare in Hematological and Oncological Patients(iCHOP)Colla borativeGroup.Crit Care.2017Apr 14；21(1):89.

非专利文献10：Toxicities of the anti-PD-1and anti-PD-L1 immune checkpoint antibodies.J.Naidoo,D.B.Page,B.T.Li,L.C.Connell,K.Schi ndler,M.E.Lacouture,M.A.Postow&J.D.Wolchok.Annals of Oncolo gy 26:2375-2391，2015

非专利文献11：Immune-Related Adverse Events Associated with Anti-P D-1/PD-L1 Treatment for Malignancies:A Meta-Analysis.Wang PF,Chen Y,Song SY,Wang TJ,Ji WJ,Li SW,Liu N,Yan CX.Front Pharmacol.2017Oct 18；8:730.

非专利文献12：Tocilizumab for the management of immune mediated adverse events secondary to PD-1blockade.Stroud CR,Hegde A,Cherry C,Naqash AR,Sharma N,Addepalli S,Cherukuri S,Parent T,Hardin J,Wal ker P.J Oncol PharmPract.2017Jan 1:1078155217745144.

发明内容

发明所解决的技术问题

在这样的情况下，期望开发在CRS、irAEs、HLH、MAS和LCH等的情况下改善这些疾病或症状的方法。

解决问题的技术手段

本发明人为了解决所述问题进行了深入研究，结果发现，JTE-607或其衍生物改善所述疾病或症状，从而完成了本发明。

即，本发明如下所述。

(1)一种药物，其包含下述化学式I表示的化合物或其药学上允许的盐，并且所述药物针对选自细胞因子释放综合征、与自身免疫性疾病相关的副作用、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症和朗格汉斯细胞组织细胞增生症中的至少1种，

[化学式1]

式中，R₁表示任选被取代的含氮非芳香族烷基或任选被取代的含氮杂环基，A表示单键、或任选被取代并且可以在链中具有一个或两个以上的双键或三键的碳原子数1～10的直链状或支链状亚烷基，R₂表示氧原子、或-CO-、-COO-、-OCO-或-O-CO-O-表示的基团，R₃相同或不同，表示氢原子、羟基、卤素原子或任选被取代并且直链状或支链状碳原子数1～20的烷基，其中，至少1个R₃不是氢原子，n表示1～4的整数，m表示0或1～6的整数，R₄表示任选被取代的碳原子数6～20的芳基、任选被取代的杂环基、任选被取代的碳原子数3～10的环烷基、任选被取代的碳原子数1～20的直链状或支链状烷基或任选被取代的碳原子数1～20的直链状或支链状烷氧基，R₅表示氧原子、或-CO-、-COO-、-OCO-或-O-CO-O-表示的基团，R₆表示氢原子、碳原子数1～20的直链状或支链状烷基、或任选被取代的碳原子数1～20的芳基。

(2)根据(1)所述的药物，其中，

含氮非芳香族杂环基为哌嗪基或哌啶基，A为碳原子数1～10的直链状亚烷基，R₂为氧原子，R₃相同或不同，为氢原子或卤素原子，其中，至少1个R₃不是氢原子，R₄为苯基，R₅表示-COO-表示的基团，R₆为碳原子数1～10的直链状烷基。

(3)根据(1)所述的药物，其中，

含氮非芳香族烷基为烷基氨基，A为碳原子数1～10的直链状亚烷基，R₂为氧原子，R₃相同或不同，为氢原子或卤素原子，其中，至少1个R₃不是氢原子，R₄为苯基，R₅表示-COO-表示的基团，R₆为碳原子数1～10的直链状烷基。

(4)根据(1)～(3)中任一项所述的药物，其中，

化学式I表示的化合物或其药学上允许的盐为化学式II表示的化合物或其药学上允许的盐，

[化学式2]

(5)根据(1)～(4)中任一项所述的药物，其中，

化学式I表示的化合物或其药学上允许的盐为化学式III表示的化合物或其药学上允许的盐，

[化学式3]

(6)根据(1)～(5)中任一项所述的药物，其中，

化学式I表示的化合物或其药学上允许的盐为化学式III表示的化合物的盐酸盐。

(7)化学式I表示的化合物或其药学上允许的盐为化学式IV表示的化合物，

[化学式4]

(8)根据(1)～(7)中任一项所述的药物，其中，

疾病或症状是：由免疫检查点抑制剂的使用引起的疾病或症状、由嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimeric antigen receptor t-cell immunotherapy)引起的疾病或症状、由修饰T细胞受体T细胞疗法(TCR-T疗法)引起的疾病或症状或由选自传染病、癌症和自身免疫性疾病中的至少1种疾病诱发的疾病或症状。

(9)根据(1)～(8)中任一项所述的药物，其对细胞因子的产生和巨噬细胞的活化中的至少一者进行抑制。

(10)根据(1)～(9)中任一项所述的药物，其中，

细胞因子为选自下述中的至少1种：肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-1RA、IL-2Rα、IL-10、IL-18、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、胰岛素生长因子(IGF)、干扰素(IFN)-γ、IFN-γ诱导蛋白10(IP-10)、单核细胞趋化因子(MCP)-1、血管内皮生长因子(VEGF)、骨桥蛋白(OPN)、NF-κB受体激活因子配体(R eceptor activator of NF-κB ligand，RANKL)、细胞因子受体gp130、游离型IL-1受体(sIL-1R)-1、sIL-1R-2、游离型IL-6受体(sIL-6R)、游离型晚期糖基化终产物受体(sRAGE)、游离型TNF受体(sTNFR)-1、sTNFR-2、IFN-γ诱导的单核因子(MIG)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1α和MIP-1β。

(11)根据(10)所述的药物，其中，

细胞因子细胞因子为选自TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、IFN-γ、M CP-1和OPN中的至少一种。

(12)根据(1)～(11)中任一项所述的药物，其用于预防或改善选自细胞因子释放综合征、与自身免疫性疾病相关的副作用、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症和朗格汉斯细胞组织细胞增生症中的至少1种。

(13)此外，本发明包含以下方案。

(13-1)一种药剂，其包含下述化学式I表示的化合物或其药学上允许的盐，所述药剂用于预防、治疗或改善选自细胞因子释放综合征、与自身免疫性疾病相关的副作用、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症和朗格汉斯细胞组织细胞增生症中的至少1种，

[化学式5]

式中，R₁表示任选被取代的含氮非芳香族烷基或任选被取代的含氮杂环基，A表示单键、或任选被取代并且可以在链中具有一个或两个以上的双键或三键的碳原子数1～10的直链状或支链状亚烷基，R₂表示氧原子、或-CO-、-COO-、-OCO-或-O-CO-O-表示的基团，R₃相同或不同，表示氢原子、羟基、卤素原子或任选被取代并且直链状或支链状碳原子数1～20的烷基，其中，至少1个R₃不是氢原子，n表示1～4的整数，m表示0或1～6的整数，R₄表示任选被取代的碳原子数6～20的芳基、任选被取代的杂环基、任选被取代的碳原子数3～10的环烷基、任选被取代的碳原子数1～20的直链状或支链状烷基或任选被取代的碳原子数1～20的直链状或支链状烷氧基，R₅表示氧原子、或-CO-、-COO-、-OCO-或-O-CO-O-表示的基团，R₆表示氢原子、碳原子数1～20的直链状或支链状烷基、或任选被取代的碳原子数1～20的芳基。

(13-2)一种方法，其预防、治疗或改善选自细胞因子释放综合征、与自身免疫性疾病相关的副作用、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症和朗格汉斯细胞组织细胞增生症中的至少1种，其中，

所述方法包含向哺乳动物给药所述化学式I(R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、m和n的定义与上述的相同)表示的化合物或其药学上允许的盐。

(13-3)一种用途，其是所述化学式I(R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、m和n的定义与上述的相同)表示的化合物或其药学上允许的盐的用途，其中，

所述用途用于制造预防、治疗或改善选自细胞因子释放综合征、与自身免疫性疾病相关的副作用、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症和朗格汉斯细胞组织细胞增生症中的至少1种的药物。

(13-4)一种化合物或其药学上允许的盐，其由所述化学式I(R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、m和n的定义与上述的相同)表示，所述化合物或其药学上允许的盐用于预防、治疗或改善选自细胞因子释放综合征、与自身免疫性疾病相关的副作用、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症和朗格汉斯细胞组织细胞增生症中的至少1种。

(14)在所述(13)所述的化学式I的一个方式中，含氮非芳香族杂环基为哌嗪基或哌啶基，A为碳原子数1～10的直链状亚烷基，R₂为氧原子，R₃相同或不同，为氢原子或卤素原子，其中，至少1个R₃不是氢原子，R₄为苯基，R₅表示-COO-表示的基团，R₆为碳原子数1～10的直链状烷基。

此外，在另一个方式中，含氮非芳香族烷基为烷基氨基，A为碳原子数1～10的直链状亚烷基，R₂为氧原子，R₃相同或不同，为氢原子或卤素原子，其中，至少1个R₃不是氢原子，R₄为苯基，R₅表示-COO-表示的基团，R₆为碳原子数1～10的直链状烷基。

在所述(13)所述的化学式I的另一个方式中，化学式I表示的化合物或其药学上允许的盐为化学式II表示的化合物或其药学上允许的盐，

[化学式6]

优选为化学式III表示的化合物或其药学上允许的盐，

[化学式7]

化学式I表示的化合物或其药学上允许的盐进一步优选为化学式III表示的化合物的盐酸盐。

在所述(13)所述的化学式I的另一个方式中，化学式I表示的化合物或其药学上允许的盐为化学式IV表示的化合物，

[化学式8]

(15)在所述(13)中，作为疾病或症状，包括由免疫检查点抑制剂的使用引起的疾病或症状、由嵌合抗原受体T细胞疗法引起的疾病或症状、由修饰T细胞受体T细胞疗法引起的疾病或症状、由选自传染病、癌症和自身免疫性疾病中的至少1种疾病诱发的疾病或症状，化学式I～IV表示的化合物或其药学上允许的盐对细胞因子的产生和巨噬细胞的活化中的至少一者进行抑制。此处，作为细胞因子，可举出选自TNF-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-1RA、IL-2Rα、IL-10、IL-18、GM-CSF、M-CSF、IGF、IFN-γ、IP-10、MCP-1、VEGF、OPN、RANKL、细胞因子受体gp130、sIL-1R-1、sIL-1R-2、sIL-6R、sRAGE、sTNFR-1、sTNFR-2、MIG、MIP-1α和MIP-1β中的至少一种，优选选自TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、IFN-γ、MCP-1和OPN中的至少一种。

发明效果

通过本发明，提供针对选自CRS、irAEs、HLH、MAS和LCH中的至少一种的药物。包含化学式I表示的化合物或其药学上允许的盐的药物，抑制炎症性细胞因子的释放并改善或预防这些症状，进而存在能够相对性地增强CAR-T细胞疗法、免疫检查点抑制剂的效果的可能性。

附图说明

[图1]是表示JTE-607和PSL对CD8⁺T细胞通过T细胞刺激珠而产生IFN-γ的作用的图。

[图2]是表示JTE-607和PSL对CD14⁺细胞通过LPS刺激而产生IL-6的作用的图。

[图3]是表示JTE-607和PSL对由CD8⁺T细胞产生IFN-γ和由CD14⁺细胞产生IL-6的作用的图。

[图4]是表示JTE-607和PSL对外周血单个核细胞(PBMC)通过LPS刺激而产生IL-6的作用的图。

[图5]是表示JTE-607和PSL对PBMC通过T细胞刺激珠和LPS刺激而产生IL-6和IFN-γ的作用的图。

[图6]是表示JTE-607和PSL对PBMC通过T细胞刺激珠和LPS刺激建立的CRS毒性评价体系的作用的图。

[图7]是表示JTE-607和PSL对CD4⁺T细胞缺陷型PBMC通过T细胞刺激珠和LPS刺激而产生IL-6和IFN-γ的作用的图。

[图8]是表示JTE-607和PSL对CD4⁺T细胞缺陷型PBMC通过T细胞刺激珠和LPS刺激建立的CRS毒性评价体系的作用的图。

[图9]是表示JTE-607和PSL对PBMC通过LPS刺激而产生MCP-1的作用的图。

[图10]是表示JTE-607和PSL对CD8⁺T细胞通过T细胞刺激珠而产生TNF-α的作用的图。

[图11]是表示JTE-607和PSL对CD14⁺细胞通过LPS刺激而产生TNF-α的作用的图。

[图12]是表示JTE-607和PSL对PBMC通过LPS刺激而产生TNF-α的作用的图。

[图13]是表示JTE-607、PSL和托珠单抗对PBMC通过LPS刺激而产生OPN的作用的图。

[图14]是表示JTE-607、PSL和托珠单抗对PBMC通过LPS刺激而产生IL-1β的作用的图。

[图15]是表示JTE-607、PSL和托珠单抗对经过LPS预处理的CD14⁺细胞通过ATP刺激而产生IL-18的作用的图。

[图16]是表示JTE-607、PSL和托珠单抗对巨噬细胞通过LPS刺激而产生VEGF的作用的图。

[图17]是表示CD14⁺细胞对CAR-T细胞的杀伤活性的作用的图。

[图18]是表示CD14⁺细胞对使用了CAR-T细胞的混合培养体系产生细胞因子的作用的图。

[图19]是表示JTE-607和PSL对CAR-T细胞的杀伤活性的作用的图。

[图20]是表示JTE-607和PSL对使用了CAR-T细胞的CRS毒性评价体系中产生IL-6和IFN-γ的作用的图。

[图21]是表示JTE-607、PSL和托珠单抗对使用了CAR-T细胞的CRS毒性评价体系中产生MCP-1的作用的图。

[图22]是表示JTE-607、PSL和托珠单抗对使用了CAR-T细胞的CRS毒性评价体系中产生IL-8的作用的图。

[图23]是表示JTE-607、PSL和托珠单抗对使用了CAR-T细胞的CRS毒性评价体系中产生TNF-α的作用的图。

[图24]是表示JTE-607、PSL和托珠单抗对使用了CAR-T细胞的CRS毒性评价体系中产生IL-1β的作用的图。

[图25]是表示JTE-607、PSL和托珠单抗对使用了CAR-T细胞的CRS毒性评价体系中产生IL-18的作用的图。

[图26]是表示本发明的化合物的作用机制的概要的图。

具体实施方式

以下，对本发明详细地进行说明。

1.概要

本发明涉及一种药物，其包含下述化学式I表示的化合物或其药学上允许的盐，所述药物针对选自细胞因子释放综合征(CRS)、与自身免疫性疾病相关的副作用(irAEs)、巨噬细胞活化综合征(MAS)、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症(HLH)和朗格汉斯细胞组织细胞增生症(LCH)中的至少一种，所述药物可用作预防或改善这些疾病或症状的药剂或包含各种添加物的药物组合物，

[化学式9]

在化学式I表示的化合物或其药学上允许的盐(也统称为“本发明的化合物”)中，本发明人构建再现CRS毒性的评价体系，并将该化合物(例如JTE-607)的作用与作为现有药物的PSL的作用进行比较研究，所述CRS毒性再现通过CD19-CAR-T细胞的靶细胞识别和共价键合有抗CD3抗体和抗CD28抗体的磁珠(T细胞刺激珠)进行的CD8⁺T细胞活化来进行。其结果，在PSL的情况下，对T细胞功能的抑制占优势(免疫抑制：CAR-T细胞功能、CD8⁺功能的抑制)，但是抑制IL-6等炎症性细胞因子产生的作用较弱，与之相对，在JTE-607的情况下，显示出用量依赖性地强烈抑制IL-6等炎症性细胞因子类的产生的特征，对CAR-T细胞、CD4⁺功能、CD8⁺功能的作用(伤害靶标癌症细胞的能力、产生IFN-γ的能力等)受到限制并且未观察到用量依赖性。此外，JTE-607不仅用量依赖性地抑制IL-6产生，而且抑制IL-18和骨桥蛋白(OPN)产生，在托珠单抗的情况下，未观察到抑制这些细胞因子产生的作用。

将本发明的化合物的作用机理示于图26。在图26中，当内源性效应T细胞过度反应时，伴随单核细胞/巨噬细胞活化而诱导一系列疾病或症状(图26，虚线部的下侧)。本发明的化合物可用于预防或改善(包含治疗)这些疾病或症状。

根据以上内容，本发明的化合物作为针对选自CRS、irAEs、HLH、MAS和LCH中的至少一种疾病或症状的药物，例如成为有效地改善·预防与CAR-T细胞疗法并发的CRS毒性的治疗工具。因此，本发明提供该疾病或症状的预防方法或改善或治疗方法，所述方法包含向具有选自CRS、irAEs、HLH、MAS和LCH中的至少一种疾病或症状的患者给药本发明的化合物或包含本发明的化合物的药物的工序。

此外，在与作为T细胞的潜在功能的增强药物的双特异性(Bi-specific)抗体、PD1/CTLA4抗体等免疫检查点抑制剂的给药并发的高细胞因子血症(Hypercytokinemia)样症状中，能够不对增强的T细胞功能产生显著影响而改善这些作为CRS样症状的irAEs。

此处，“预防”是指在易患所述疾病或症状，但是尚未诊断出患有所述疾病或症状患者中，抑制所述疾病或症状的发生。

“治疗”是指抑制所述疾病或症状，即，阻止、延迟或消除这些的进展。

“改善”是指缓解所述疾病或症状，即，引起所述疾病或症状的消退或症状进展的逆转。

2.化合物或其药学上允许的盐

在本发明中，用作针对选自CRS、irAEs、HLH、MAS和LCH中的至少一种疾病或症状的药物(例如预防、治疗或改善这些疾病的药剂)的有效成分的化合物是化学式I表示的化合物。在本发明的化合物中，化学式I表示化合物也称为“化合物(I)”。

[化学式10]

式中，R₁表示含氮非芳香族烷基或任选被取代的含氮杂环基。

A表示单键、或任选被取代并且链中可以具有一个或两个以上的双键或三键的碳原子数1～20的直链状或支链状亚烷基。A优选为碳原子数1～6的直链状亚烷基，进一步优选为亚乙基。

R₂表示氧原子、或-CO-、-COO-、-OCO-或-O-CO-O-表示的基团。

R₃相同或不同，表示氢原子、羟基、卤素原子或任选被取代并且直链状或支链状碳原子数1～20的烷基。但是，至少一个R₃不是氢原子。

n表示1～4的整数，优选为3，进一步优选其中的两个为卤素原子，另一个为羟基。

R₄表示任选被取代的碳原子数6～20的芳基、任选被取代的杂环基、任选被取代的碳原子数3～10的环烷基、任选被取代的碳原子数1～20的直链状或支链状烷基或任选被取代的碳原子数1～20的直链状或支链状烷氧基。m表示0或1～6的整数，优选为2。

R₅表示氧原子、或-CO-、-COO-、-OCO-或-O-CO-O-表示的基团，优选为-COO-表示的基团。

R₆表示氢原子、碳原子数1～20的直链状或支链状烷基、或任选被取代的碳原子数6～20的芳基，优选为碳原子数1～6的直链状烷基，进一步优选为乙基。

“含氮非芳香族烷基”是至少具有1个氮原子的碳原子数1～10的烷基，例如可举出甲基氨基。

“含氮非芳香族杂环基”是至少具有1个氮原子并且可以具有硫原子或氧原子的3～7元的非芳香族杂环基，这些可以与苯环缩合。具体而言，可举出：氮丙啶基(Aziridinyl)、噻唑烷酰基(Thiazetidineyl)、氮杂环丁烷基(Azetidi nyl)、吡咯烷基、吡咯啉基、咪唑烷基、咪唑啉基、吡唑烷基、吡唑啉基、吗啉基、吗啉代基、噁嗪基(Oxazinyl)、噻嗪基、哌嗪基、哌啶基(Piperidyl)、哌啶基(Piperidino)、二噁氮杂

基、硫氮杂

基、二氮杂

基、全氢化二氮杂

基、氮杂

基、全氢化氮杂

基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基等。优选为氮丙啶基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、吡唑烷基、吗啉基、吗啉代基、哌嗪基、哌啶基(Piperidyl)、哌啶基(piperidino)、全氢化氮杂

基，特别优选为哌嗪基、哌啶基(Piperidyl)。

“亚烷基”是指在直链或支链状链中可具有一个或两个以上的双键或三键的亚烷基，作为碳原子数1～20的直链状或支链状亚烷基，例如可举出：亚甲基、亚乙基、三亚甲基、四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基、七亚甲基、八亚甲基、九亚甲基、十亚甲基、二甲基亚甲基、二乙基亚甲基、亚丙基、甲基亚乙基、乙基亚乙基、丙基亚乙基、异丙基亚乙基、甲基五亚甲基、乙基六亚甲基、二甲基亚乙基、甲基三亚甲基、二甲基三亚甲基、亚乙烯基、亚丙烯基、亚丁烯基、亚丁二烯基、亚戊烯基、亚戊二烯基、亚己烯基、亚己二烯基、亚己三烯基、亚庚烯基、亚庚二烯基、亚庚三烯基、亚辛烯基、亚辛二烯基、亚辛三烯基、亚辛四烯基、亚丙炔基、亚丁炔基、亚戊炔基、甲基亚丙炔基等。

优选为亚甲基、亚乙基、三亚甲基、四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基、七亚甲基、八亚甲基、九亚甲基、十亚甲基、亚乙烯基、亚丙烯基、亚丁烯基、亚丁二烯基、亚戊烯基、亚戊二烯基、亚己烯基、亚己二烯基、亚己三烯基、亚庚烯基、亚庚二烯基、亚庚三烯基、亚辛烯基、亚辛二烯基、亚辛三烯基、亚辛四烯基、亚丙炔基、亚丁炔基、亚戊炔基等直链亚烷基，进一步优选为亚甲基、亚乙基、三亚甲基、四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基等碳原子数1～6个的直链亚烷基。

“烷基”是直链状、支链状或包含它们的组合的烷基，碳原子数为1～20个，优选碳原子数为1～10个或1～6个。

作为所述烷基，例如可举出：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、2-甲基丁基、新戊基、1-乙基丙基、正己基、异己基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基、正十三烷基、正十四烷基、正十五烷基、正十六烷基、正十七烷基、正十八烷基、正十九烷基、正二十烷基等。烷氧基为碳原子数1～20的烷氧基，烷氧基的烷基部分与以上所说明的烷基同样。

作为碳原子数6～20的芳基，例如可举出：苯基、1-萘基、2-萘基、茚基、联苯基、蒽基、菲基等。

杂环基是可以具有至少1个氮原子、硫原子或氧原子的3～7元的非芳香族杂环基，具体的取代基与“含氮非芳香族杂环基”中所说明的内容同样。

作为碳原子数3～10的环烷基，例如可举出：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基等。

在本说明书中，在说某个官能团“可以具有取代基”或“任选被取代”的情况下，除非特别说明，否则意味着存在该官能团在化学上可行的位置具有一个或两个以上的“取代基”的情况。官能团中存在的取代基的种类、取代基的个数和取代位置没有特别限定，在存在2个以上的取代基的情况下，它们可以相同，也可以不同。作为官能团中存在的“取代基”，例如可举出：烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、卤素原子、羰基、硫醇(Thioxo)基、硝基、亚硝基、氰基、异氰基、氰酸基、硫氰酸基、异氰酸基、异硫氰酸基、羟基、硫烷(Sulfanilic)基、羧基、硫烷基羰基、草酰氧(oxalo)基、meso-草酰氧基、硫代羧基、二硫代羧基、氨基甲酰基、硫代氨基甲酰基、磺基、氨磺酰基、亚磺(Sulfino)基、亚磺酰(Sulfinamoyl)基、Sulfeno基、Sulfenamoyl基、膦酰(P hosphono)基、羟基膦酰基、杂环基、杂环-氧基、烷基硫烷基、酰基、氨基、肼基、腙基、二氮烯基、脲基、硫脲基、胍基、脒基、叠氮基、亚氨基、羟基氨基、羟基亚氨基、氨基氧基、重氮基、脲亚氨基(Semicarbazino)、脲亚氨基(Semicarbazono)、脲羰基、乙内酰脲基(Hydantyl)、磷酰基(Phosphano)、Ph osphoroso基、磷酸(Phospho)基、氧硼基(Boryl)、甲硅烷基、甲锡烷基、Sela nyl基、氧代基等，但不限于此。

作为化合物(I)的盐，可举出与无机酸或有机酸形成的盐(酸加成盐)。

作为无机酸，例如可举出：盐酸、硫酸、磷酸、氢溴酸、硝酸等，作为有机酸，例如可举出草酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸、柠檬酸、乙酸、乳酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、苯甲酸、戊酸、丙二酸、烟酸、丙酸等。

本发明优选的酸加成盐是与盐酸形成的盐，进一步优选为二盐酸盐。

化合物(I)可基于不对称碳而具有一个或两个以上的立体异构体。本发明还包含该异构体及其混合物。此外，本发明化合物(I)或该化合物药学上允许的盐的水合物还包含与药理上允许的有机溶剂(例如，乙醇等)形成的溶剂合物以及前体药物。

“前体药物”是具有可化学性或代谢性分解的基团，在向生物体给药后，还原成原始化合物并且表现出本来的药效的本发明化合物的衍生物，其包括不依赖于共价键的复合体和盐。

作为化合物(I)的前体药物，可举出化合物(I)的羧基被乙基、新戊酰氧基甲基、1-(乙酰氧基)乙基、1-(乙氧基羰基氧基)乙基、1-(环己氧基羰基氧基)乙基、羧甲基、(5-甲基-2-氧代-1,3-二氧杂环戊烯-4-基)甲基、苯基、邻甲苯基等修饰了的化合物等。此外，可举出化合物(I)的羟基被乙酰基、丙酰基、异丁酰基、叔戊酰基、苯甲酰基、4-甲基苯甲酰基、二甲基氨基甲酰基、磺基修饰了的化合物等。

在本发明中，化合物(I)优选可举出为化学式III表示的(-)-乙基N-{3,5-二氯-2-羟基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯甲酰基}-L-苯丙氨酸(即，N-{3,5-二氯-2-羟基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯甲酰基}-L-苯丙氨酸乙酯)或其药理学上允许的盐，

[化学式11]

更优选本发明中使用的化合物为所述化学式II表示的化合物的酸加成盐(例如二盐酸盐)，进一步优选为化学式IV表示的化合物，

[化学式12]

该化学式IV表示的化合物为(-)-乙基N-{3,5-二氯-2-羟基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯甲酰基}-L-苯丙氨酸二盐酸盐(即，N-{3,5-二氯-2-羟基-4-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)乙氧基]苯甲酰基}-L-苯丙氨酸乙酯二盐酸盐)，别称为“JT E-607”。

本发明的化合物在动物(例如，大鼠、小鼠、兔、猪、猫、狗、牛、马、猴、人等哺乳动物)中对产生的各种炎症性细胞因子的产生进行抑制。

特别是，在本发明中，作为针对CRS、irAEs、HLH、MAS和LCH中的一种或多种疾病或症状的药物是有效的。

例如，在人的细胞因子释放综合征中，特别是在CAR-T细胞疗法中的C RS和脑水肿中是有效。因此，本发明的化合物可与CAR-T细胞疗法组合使用。“组合”是指将本发明的化合物与CAR-T细胞疗法并用，但是组合使用的时期没有特别限定，可以是CAR-T细胞疗法之前、CAR-T细胞疗法中和C AR-T细胞疗法后的任一时期。与CRS同样，对于irAEs、HLH、MAS和LC H，也可通过与这些疾病或症状的治疗中使用的药剂或治疗方法并用来使用本发明的化合物。

本发明的化合物可抑制细胞因子的产生、抑制巨噬细胞的活化或同时抑制细胞因子的产生和巨噬细胞的活化这两者。此处，“巨噬细胞的活化”是指各种细胞因子、细胞毒性蛋白酶、活性氧等的过度释放，进一步指调理作用(opsonization)、吞噬能力的增强等。

作为“细胞因子”，例如可举出：肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-1RA、IL-2Rα、IL-10、IL-18、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、胰岛素生长因子(IGF)、干扰素(IFN)-γ、IFN-γ诱导蛋白10(IP-10)、单核细胞趋化因子(MCP)-1、血管内皮生长因子(VEGF)、骨桥蛋白(OPN)、NF-κB受体激活因子配体(Receptor activator of NF-κB ligand、RANKL)、细胞因子受体gp130、游离型IL-1受体(sIL-1R)-1、sIL-1R-2、游离型IL-6受体(sIL-6R)、游离型晚期糖基化终产物受体(sRAGE)、游离型TNF受体(sTNFR)-1、sTNFR-2、IFN-γ诱导的单核因子(MIG)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1α、MIP-1β等。

irAEs是指主要因免疫检查点抑制剂的给药而使免疫整体被过度活化，从而攻击自身，发生各种自身免疫性疾病的症状。作为主要症状，在间质性肺疾病、大肠炎、甲状腺功能低下症、肝病、心脏病、垂体炎、糖尿病、肾功能受损、周围神经病、重症肌无力症等全身的所有内脏器官方面都有报告。

HLH是因细胞杀伤颗粒和与其释放有关的基因异常引起的疾病。特征在于高细胞因子血症所伴随的组织损伤和巨噬细胞的增殖等病理现象。与HLH相关的炎症性细胞因子，报告有IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α等。

MAS是指因巨噬细胞的异常活化引起的炎症性细胞因子的过度状态导致的致死性病状，所述巨噬细胞的异常活化伴随有外部因素(病毒、细菌、真菌等感染因子、药剂)、内部因素(自己细胞因凋亡/坏死而产生的破碎物等)、例如病毒反应性效应T细胞的增殖·活化。与MAS相关的炎症性细胞因子，报告有IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α等。HLH与MAS类似，HLH通过病理学性诊断来确定，而MAS通过生理学性诊断来确定。在任一病状中巨噬细胞的活化都是重点。

LCH¹³⁾是指朗格汉斯细胞在皮肤、骨·淋巴结等中异常增加的病状。已知除了朗格汉斯细胞之外，病部位还存在嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、破骨细胞样巨细胞等的炎症细胞浸润，它们相互激活，大量分泌以OPN、RANKL、IL-18、CC基序趋化因子2(CCL2)等为代表的炎症性细胞因子/趋化因子，造成组织破坏。

这些疾病或症状是由免疫检查点抑制剂的使用、嵌合抗原受体T细胞疗法、修饰T细胞受体T细胞疗法等引起的，或者由传染病、癌症和自身免疫性疾病中的任一项或它们的组合而诱发的。

免疫检查点抑制剂是通过与免疫检查点分子(在抑制针对自己的免疫响应的同时抑制过度的免疫反应的分子组)或其配体结合并抑制免疫抑制信号的传达，来解除免疫检查点分子引起的T细胞的活化抑制的药剂，例如可举出：抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体等。

CAR-T细胞疗法是对从患者采集的T细胞实施表达具有靶标能力的嵌合抗原受体(CAR)的基因修饰后将其返回体内这样的自体T细胞治疗方法。

修饰T细胞受体表达T(TCAR-T)细胞疗法是例如在体外将约束性地识别特定人类白细胞抗原(HLA)的癌症抗原表位的特定TCR基因转基因至效应T细胞中，进行扩增后给药至体内的疗法，是与CAR-T细胞疗法类似的细胞疗法。

作为所述(1)所述药物的优选方式，例举如下。

·针对选自由嵌合抗原受体T细胞疗法引起的细胞因子释放综合征、巨噬细胞活化综合征和噬血细胞性淋巴组织细胞增生症中的至少一种的药物。

·针对由嵌合抗原受体T细胞疗法引起的细胞因子释放综合征的药物。

·针对由嵌合抗原受体T细胞疗法引起的巨噬细胞活化综合征的药物。

·针对由嵌合抗原受体T细胞疗法引起的噬血细胞性淋巴组织细胞增生症的药物。

·用于与嵌合抗原受体T细胞疗法组合使用、包含化学式I表示的化合物或其药学上允许的盐、并且针对选自细胞因子释放综合征、巨噬细胞活化综合征和噬血细胞性淋巴组织细胞增生症中的至少一种的药物。

·针对选自由修饰T细胞受体T细胞疗法引起的细胞因子释放综合征、巨噬细胞活化综合征和噬血细胞性淋巴组织细胞增生症中的至少一种的药物。

·针对由修饰T细胞受体T细胞疗法引起的细胞因子释放综合征的药物。

·针对由修饰T细胞受体T细胞疗法引起的巨噬细胞活化综合征的药物。

·针对由修饰T细胞受体T细胞疗法引起的噬血细胞性淋巴组织细胞增生症的药物。

·用于与修饰T细胞受体T细胞疗法组合使用、包含化学式I表示的化合物或其药学上允许的盐、并且针对选自细胞因子释放综合征、巨噬细胞活化综合征和噬血细胞性淋巴组织细胞增生症中的至少一种的药物。

此处，作为“针对由嵌合抗原受体T细胞疗法引起的细胞因子释放综合征的药物”和“针对由修饰T细胞受体T细胞疗法引起的细胞因子释放综合征的药物”，优选为对选自TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IFN-γ和MCP-1中的至少一种细胞因子的产生进行抑制的药物，更优选为对多种细胞因子的产生进行抑制的药物。

·针对巨噬细胞活化综合征的药物。

此处，优选为对选自TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18、IFN-γ和MCP-1中的至少一种细胞因子的产生进行抑制的药物，更优选为对多种细胞因子的产生进行抑制的药物。

·针对噬血细胞性淋巴组织细胞增生症的药物。

此处，优选为对选自TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、IFN-γ和MCP-1中的至少一种细胞因子的产生进行抑制的药物，更优选为对多种细胞因子的产生进行抑制的药物。

·针对由免疫检查点抑制剂的使用引起的与自身免疫性疾病相关的副作用的药物。此处，优选为对选自TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18和IFN-γ中的至少一种细胞因子的产生进行抑制的药物，更优选为对多种细胞因子的产生进行抑制的药物。

·针对由自身免疫性疾病诱发的朗格汉斯细胞组织细胞增生症的药物。此处，优选为对选自IL-18、MCP-1和OPN中的至少一种细胞因子的产生进行抑制的药物，更优选为对多种细胞因子的产生进行抑制的药物。

·此外，作为“包含化学式I表示的化合物或其药学上允许的盐，并且针对选自细胞因子释放综合征、与自身免疫性疾病相关的副作用、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症和朗格汉斯细胞组织细胞增生症中的至少1种药物”，优选为对选自IL-18、MCP-1和OPN中的至少一种细胞因子的产生进行抑制的药物，更优选为对多种细胞因子的产生进行抑制的药物。

本发明的化合物可作为针对选自CRS、irAEs、HLH、MAS和LCH中的至少一种的药物(例如预防、治疗或改善剂)进行直接给药，但是在本发明的一个方式中，以药物组合物的形式给药。在用作含有本发明的化合物作为有效成分的药物组合物的情况下，该药物组合物通常可与药学上允许的添加剂、例如药学上允许的载体、赋形剂、稀释剂、填充剂、崩解剂、稳定剂、保存剂、缓冲剂、乳化剂、芳香剂、着色剂、甜味剂、增稠剂、调味剂、增溶剂和/或其它添加剂(例如，水、植物油、醇(例如乙醇或苯甲醇)、聚乙二醇、三乙酸甘油酯、明胶、乳糖、碳水化合物、硬脂酸镁、滑石粉、羊毛脂、白色凡士林等)混合，形成片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、栓剂、注射剂、滴眼剂、液剂、胶囊剂、锭剂、气雾剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂等剂形。

在口服给药的情况下，可以以细粉或颗粒的形式包含稀释剂、分散剂和/或表面活性剂，例如，可以存在于水中、糖浆中、干燥状态下的胶囊或分包中、可包含悬浮剂的非水性溶液或悬浮液中或可包含结合剂(Binder)和润滑剂的片剂中。甜味剂、调味剂、保存剂(例如，抗菌性保存剂)、悬浮剂、增稠剂和/或乳化剂也可以存在于药物组合物中。

在非口服给药的情况下，药物组合物为液剂或悬浮剂的剂形，可含有本发明的化合物(例如化合物(III))和纯化水。作为可包含于液剂或悬浮剂的成分，可举出：保存剂(例如，抗菌性保存剂)、缓冲剂、它们的溶液和混合物。药物组合物的成分可以发挥1种以上的功能。药物组合物可以冷冻干燥状态保存于一剂量或多剂量的容器中，例如放入密封的小瓶(Vial)和安瓿中，在使用前添加至灭菌的液态载体(例如，水、生理盐水)中即可。作为优选方式，将本发明的化合物(例如化合物(III)或该化合物药学上允许的盐)制成同时含有D-甘露醇的冷冻干燥制剂。就冷冻干燥制剂而言，优选在使用前用生理盐水进行稀释。

含有本发明的化合物的药物组合物可通过药物领域公知的方法来制备，例如，加纳罗(Gennaro)等，“雷明顿的制药科学”1990年，第18版，马克出版(Remington’sPharmaceutical Sciences,18th ed.,MackPublishing CO.,1990)，特别是第8章“药物制剂及其制造(P art 8:Pharmaceutical Preparation and their Manufacture)中记载的方法。该方法包含使本发明的化合物与药物组合物的其他成分缔合的工序。

本发明的药物可通过适当的方法给药，给药途径没有特别限定。例如可举出：口服、口腔内、鼻腔内、透皮吸收、注射、缓释、控释、离子导入(Iontophoresis)、超声波导入(Sonophoresis)。注射没有特别限定，可举出：静脉内(Intravenous)、肌肉内(Intramuscular)、皮下(Subcutaneous)、腹腔内(Intraper itoneal)、脊柱内(Intraspinal)、鞘内(Intrathecal)、脑室内(Intracerebroventricular)、动脉(Intraarterial)内、其它注射途径等非口服途径。在非口服给药的情况下，可将药物组合物制成液态或非液态的灭菌了的注射制剂，优选为静脉内注射制剂。

本发明的化合物的适当的给药量根据患者的类型、症状、给药途径、性别差异、体重等而变化。在成人的口服给药的情况下，例如，作为本发明的化合物(特别是化合物(III)或该化合物药学上允许的盐)的一天的用量，通常为约0.01～1000mg(例如，0.05～900mg，优选为0.1～100mg)。

在将本发明的化合物(特别是化合物(III)或该化合物药学上允许的盐)向成人进行静脉内给药的情况下，例如，作为一天的用量，通常为约0.01～100mg/kg(例如，约0.01～95mg/kg，优选为约0.01～50mg/kg)，可分一次或多次(例如，分为2、3、4、5、6、7、8、9、10次或10次以上)进行给药。或者，本发明的化合物(特别是化合物(III)或该化合物药学上允许的盐)可以在选择的时间(例如，数小时至一天或一天以上)内持续静脉内给药。持续给药的一天总给药量，通常与非持续静脉内给药所使用的一天给药量相同。

实施例

以下，参考实施例对本发明更具体地进行说明。但是，本发明的范围不限于这些实施例。

实施例1

1.方法

1.1材料

1.1.1细胞

冷冻保存的人PBMC(Cryopreserved Human PBMC)(PBMC)：BIOPREDIC

含有CD3/CD28信号序列的CD19-CAR-T细胞(CAR-T细胞)：由东京大学医科学研究所分子疗法领域提供

CD19表达K562细胞株(靶细胞)：东京大学医学科学研究所分子疗法领域提供

人单核细胞(Human Monocyte)(单核细胞):BIOPREDIC

Lenti-X293T细胞：Clontech

1.1.2试剂

RPMI1640培养基：Thermo fisher(Gibco)

胎牛血清(FBS)：Thermo fisher(Gibco)

D-PBS(-)：和光纯药工业

乙二胺四乙酸二氢二钠二水合物(EDTA)：纯正化学

牛血清白蛋白(BSA)：SIGMA

二甲基亚砜(DMSO)：SIGMA

青霉素-链霉素-谷氨酰胺：Thermo fisher

2-巯基乙醇：SIGMA

Trypan Blue Stain 0.4％(台盼蓝染色溶液)：Thermo fisher(Gibco)

1mol/L HEPES缓冲液：NACALAITESQUE

1mol/L氢氧化钠溶液：FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation

人CD4 MicroBeads：Miltenyi Biotec

人CD8 MicroBeads：Miltenyi Biotec

人CD14 MicroBeads：Miltenyi Biotec

MACS BSA储备液(MACS BSA Stock Solution)：Miltenyi Biotec

AutoMACS冲洗液(AutoMACS Rinsing Solution)：Miltenyi Biotec

Dynabeads Human T-Activator CD3/28(T细胞刺激珠)：Thermo fisher(Gi bco)

重组人巨噬细胞集落刺激因子(Recombinant Human M-CSF)：Pepro Tec h

重组人IFN-γ(Recombinant Human IFN-γ)：Pepro Tech

JTE-607二盐酸盐(JTE-607dihydrochloride)(记载为目录名)：TocrisCat.No.5185

泼尼松龙(PSL)：和光纯药工业Cat.No.165-11491

托珠单抗：absolute antibody Cat.No.L6529-1MG

大肠杆菌055:B55中的脂多糖(LPS)：SIGMA

腺苷5'-三磷酸二钠盐水合物(ATP)：SIGMA

人IFN-γDuoSet ELISA：R&D systems

人IL-6DuoSet ELISA：R&D systems

人CCL2/MCP-1DuoSet ELISA：R&D systems

人TNF-αDuoSet ELISA：R&D systems

人OPN DuoSet ELISA：R&D systems

人IL-1βDuoSet ELISA：R&D systems

人IL-18DuoSet ELISA：R&D systems

人VEGF DuoSet ELISA：R&D systems人IL-8DuoSet ELISA：R&D systems

DuoSet ELISA辅助试剂盒2(DuoSet ELISA Ancillary Reagent Kit 2)：R&Dsystems

HQPlex预混合分析试剂盒(HQPlex Premixed Analyte Kit)(多重检测)：Baybioscience

In-Fusion HD克隆试剂盒：TAKARABIO

1.1.3器材

MidiMACS分离器：Miltenyi Biotec

MidiMACS-LS色谱柱(分离柱)：Miltenyi Biotec

聚丙烯锥形管(管)：FALCON

细胞培养板(Tissue culture plate),96孔,平底低蒸发带盖(96孔板)：FALCON

1.1.4试液

10％FBS RPMI(培养基)：

将灭活FBS 50mL、青霉素-链霉素-谷氨酰胺5mL、0.1M 2-巯基乙醇250μL添加至RPMI1640，使总量为500mL。在4℃下保存，使用前，在恒温槽中加热至37℃并使用。

2mM EDTA,0.5％BSA-PBS(MACS缓冲液)：

将5％BSA溶液5mL和100mM EDTA溶液1mL添加至D-PBS(-)44mL中。制备后，在4℃下保存。

1.1.5机器

恒温槽：Thermal ROBO TR-1A，AS ONE

离心机：AX-320，TOMY

CO₂孵化器(Incubator)：MCO-170AICUVH，PANASONIC

酶标仪(Plate reader)：SPECTRAmax 384plus，Molecular Devices

FACSVerse^TM流式细胞仪(Flowcytometer)：Becton,Dickinson and Company

EnSpire 2300：PERKIN ELMER JAPAN

1.2方法

1.2.1JTE-607和PSL对CD8⁺T细胞通过T细胞刺激珠而产生IFN-γ的作用

在37℃恒温槽中将冷冻PBMC快速解冻，添加至装有培养基的试管中。进行离心分离(室温，300g，10分钟)，除去上清液后，悬浮于培养基中，将一部分与台盼蓝染色溶液混合，进行活细胞数的测定。将细胞悬浮液进行离心分离(室温，300g，10分钟)，除去上清液后，每1×10⁷个细胞添加MACS缓冲液80μL并悬浮后，进一步添加人CD8 MicroBeads 20μL。在冰上静置15分钟后，添加MACS缓冲液2mL，进行离心分离(室温，300g，10分钟)，除去上清液。

向其中添加MACS缓冲液500μL，将细胞悬浮后，使用分离柱分离CD8⁺细胞。向CD8⁺细胞的部分添加培养基，制成15mL并进行离心分离(室温，300g，10分钟)。除去上清液，悬浮于培养基1mL中，进行活细胞数的测定。将以成为1×10⁶cells/mL的方式添加有培养基的细胞悬浮液以100μL/well(1×10⁵cells/well)接种至96孔板，在CO₂孵化器内静置1～2小时。

以50μL/well添加0.12％DMSO溶液、JTE-607溶液(最终浓度10、30、100、300nM)或PSL溶液(最终浓度0.03、0.3、3、30μM)，并添加T细胞刺激珠10μL/well(相当于T细胞刺激珠原液2μL)和培养基40μL/well，在CO₂孵化器内培养三天，回收培养上清液。

对回收的培养上清液，使用人IFN-γDuoSet ELISA进行IFN-γ的定量。

1.2.2JTE-607和PSL对CD14⁺细胞通过LPS刺激而产生IL-6的作用

在37℃恒温槽中将冷冻PBMC快速解冻，添加至装有培养基的试管中。进行离心分离(室温，300g，10分钟)，除去上清液后，再次悬浮于培养基中，进行活细胞数的测定。将细胞悬浮液进行离心分离(室温，300g，10分钟)，除去上清液后，添加MACS缓冲液并悬浮后，进一步添加人CD14 MicroBeads。在冰上静置15分钟后，添加MACS缓冲液，进行离心分离(室温，300g，10分钟)，除去上清液。

向其中添加MACS缓冲液，将细胞悬浮后，使用分离柱分离CD14⁺细胞。向CD14⁺细胞的部分添加培养基，进行离心分离(室温，300g，10分钟)。除去上清液，悬浮于培养基1mL中，进行活细胞数的测定。添加培养基以制备2.4×10⁵或3×10⁵cells/mL细胞悬浮液，接种(2.4×10⁴cells/well)至96孔板，在CO₂孵化器内静置1～2小时。

添加0.12％DMSO溶液、JTE-607溶液(最终浓度10、30、100、300nM)或PSL溶液(最终浓度0.03、0.3、3、30μM)，进一步添加LPS溶液(最终浓度3ng/mL)，在CO₂孵化器内静置三天后，回收培养上清液。

对回收的培养上清液，使用人IL-6DuoSet ELISA进行IL-6的定量。

1.2.3JTE-607和PSL对PBMC通过LPS刺激而产生IL-6的作用

在37℃恒温槽中将冷冻PBMC快速解冻，添加至装有培养基的试管中。进行离心分离(室温，300g，10分钟)，除去上清液后，再次悬浮于培养基10mL中，进行活细胞数的测定。进行离心分离(室温，300g，10分钟)，除去上清液后，添加培养基以成为1×10⁶cells/mL，将细胞悬浮。以100μL/well(1×10⁵cells/well)将该细胞悬浮液接种至96孔板。以30μL/well添加0.12％DMSO溶液、JTE-607溶液(最终浓度10、30、100、300nM)或PSL溶液(最终浓度0.03、0.3、3、30μM)，以5μL/well添加LPS溶液(最终浓度3ng/mL)。在CO₂孵化器内培养三天，回收培养上清液。

对回收的培养上清液，使用人IL-6DuoSet ELISA进行IL-6的定量。

1.2.4JTE-607和PSL对PBMC通过T细胞刺激珠和LPS刺激建立的CRS毒性评价体系的作用

在37℃恒温槽中将冷冻PBMC快速解冻，添加至装有培养基的试管中。进行离心分离(室温，300g，10分钟)，除去上清液后，再次悬浮于培养基10mL中，进行活细胞数的测定。进行离心分离(室温，300g，10分钟)，除去上清液后，添加培养基以成为1×10⁶cells/mL，将细胞悬浮。以100μL/well(1×10⁵cells/well)将该细胞悬浮液接种至96孔板，在CO₂孵化器内静置1～2小时。

以50μL/well添加0.12％DMSO溶液、JTE-607溶液(最终浓度10、30、100、300nM)或PSL溶液(最终浓度0.03、0.3、3、30μM)，添加T细胞刺激珠10μL/well(相当于T细胞刺激珠原液2μL)和LPS溶液(最终浓度3ng/mL)40μL/well。在CO₂孵化器内培养三天，回收培养上清液。

对回收的培养上清液，使用人IFN-γDuoSet ELISA和人IL-6DuoSet ELISA进行IFN-γ和IL-6的定量。

1.2.5JTE-607和PSL对CD4⁺T细胞缺陷型PBMC通过T细胞刺激珠和LPS刺激建立的CRS毒性评价体系的作用

在37℃恒温槽中将冷冻人PBMC快速解冻，添加至装有培养基的试管中。进行离心分离(室温，300g，10分钟)，除去上清液后，再次悬浮于培养基10mL中，进行活细胞数的测定。将剩余的细胞悬浮液进行离心分离(室温，300g，10分钟)，除去上清液后，每1×10⁷个细胞添加MACS缓冲液80μL和人CD4 MicroBeads 20μL并悬浮。在冰上静置15分钟，添加MACS缓冲液2mL，进行离心分离(室温，300g，10分钟)，除去上清液。添加MACS缓冲液500μL，将细胞悬浮后，使用分离柱分离CD4^-细胞(CD4⁺细胞的通过部分)。向CD4^-细胞的部分添加培养基，制成15mL并进行离心分离(室温，300g，10分钟)，除去上清液后，再次悬浮于培养基1mL中，进行活细胞数的测定。将以成为1×10⁶cells/mL的方式添加有培养基的细胞悬浮液以100μL/well(1×10⁵cells/well)接种至96孔板，在CO₂孵化器内静置1～2小时。

以50μL/well添加0.12％DMSO溶液、JTE-607溶液(最终浓度10、30、100、300nM)或PSL溶液(最终浓度0.03、0.3、3、30μM)，以40μL/well添加T细胞刺激珠10μL/well(相当于T细胞刺激珠原液2μL)和LPS溶液(最终浓度3ng/mL)，在CO₂孵化器内培养三天，回收培养上清液。

对回收的培养上清液，使用人IFN-γDuoSet ELISA和人IL-6DuoSet ELISA进行IFN-γ和IL-6的定量。

1.2.6JTE-607和PSL对CD14⁺细胞通过LPS刺激而产生MCP-1的作用

在37℃恒温槽中将冷冻PBMC快速解冻，添加至装有培养基的试管中。进行离心分离(室温，300g，10分钟)，除去上清液后，再次悬浮于培养基中，进行活细胞数的测定。将细胞悬浮液进行离心分离(室温，300g，10分钟)，除去上清液后，添加MACS缓冲液并悬浮后，进一步添加人CD14 MicroBeads。在冰上静置15分钟后，添加MACS缓冲液，进行离心分离(室温，300g，10分钟)，除去上清液。

向其中添加MACS缓冲液，将细胞悬浮后，使用分离柱分离CD14⁺细胞。向CD14⁺细胞的部分添加培养基，进行离心分离(室温，300g，10分钟)。除去上清液，悬浮于培养基1mL中，进行活细胞数的测定。添加培养基以制备2.4×10⁵或3×10⁵cells/mL细胞悬浮液，接种(2.4×10⁴cells/well)至96孔板，在CO₂孵化器内静置1～2小时。

添加0.12％DMSO溶液、JTE-607溶液(最终浓度10、30、100、300nM)或PSL溶液(最终浓度0.03、0.3、3、30μM)，进一步添加LPS溶液(最终浓度3ng/mL)，在CO₂孵化器内静置三天后，回收培养上清液。

对回收的培养上清液，使用人CCL2/MCP-1DuoSet ELISA进行MCP-1的定量。

1.2.7JTE-607和PSL对CD8⁺T细胞通过T细胞刺激珠而产生TNF-α的作用

对1.2.1中回收的培养上清液，使用人TNF-αDuoSet ELISA进行TNF-α的定量。

1.2.8JTE-607和PSL对CD14⁺细胞通过LPS刺激而产生TNF-α的作用

对1.2.2中回收的培养上清液，使用人TNF-αDuoSet ELISA进行TNF-α的定量。

1.2.9JTE-607和PSL对PBMC通过LPS刺激而产生TNF-α的作用

对1.2.2中回收的培养上清液，使用人TNF-αDuoSet ELISA进行TNF-α的定量。

1.2.10JTE-607、PSL和托珠单抗对CD14⁺细胞通过LPS刺激而产生OPN的作用

在37℃恒温槽中将冷冻PBMC快速解冻，添加至装有培养基的试管中。进行离心分离(室温，300g，10分钟)，除去上清液后，再次悬浮于培养基中，进行活细胞数的测定。将细胞悬浮液进行离心分离(室温，300g，10分钟)，除去上清液后，添加MACS缓冲液并悬浮后，进一步添加人CD14 MicroBeads。在冰上静置15分钟后，添加MACS缓冲液，进行离心分离(室温，300g，10分钟)，除去上清液。向其中添加MACS缓冲液，将细胞悬浮后，使用分离柱分离CD14⁺细胞。向CD14⁺细胞的部分添加培养基，进行离心分离(室温，300g，10分钟)。除去上清液，悬浮于培养基1mL中，进行活细胞数的测定。添加培养基以制备2.4×10⁵或3×10⁵cells/mL细胞悬浮液，接种(2.4×10⁴cells/well)至96孔板，在CO₂孵化器内静置1～2小时。

添加0.12％DMSO溶液、JTE-607溶液(最终浓度10、30、100、300nM)、PSL溶液(最终浓度0.03、0.3、3、30μM)或托珠单抗(最终浓度10、100、1000ng/mL)，进一步添加LPS溶液(最终浓度500ng/mL)，在CO₂孵化器内静置三天后，回收培养上清液。

对回收的培养上清液，使用人OPN DuoSet ELISA进行OPN的定量。

1.2.11JTE-607、PSL和托珠单抗对CD14⁺细胞通过LPS刺激而产生IL-1β的作用

对1.2.10中回收的培养上清液，使用人IL-1βDuoSet ELISA进行IL-1β的定量。

1.2.12JTE-607、PSL和托珠单抗对由经过LPS预处理的CD14⁺细胞通过ATP刺激而产生IL-18的作用

在37℃恒温槽中将冷冻PBMC快速解冻，添加至装有培养基的试管中。进行离心分离(室温，300g，10分钟)，除去上清液后，再次悬浮于培养基中，进行活细胞数的测定。将细胞悬浮液进行离心分离(室温，300g，10分钟)，除去上清液后，添加MACS缓冲液并悬浮后，进一步添加人CD14 MicroBeads。在冰上静置15分钟后，添加MACS缓冲液，进行离心分离(室温，300g，10分钟)，除去上清液。

向其中添加MACS缓冲液，将细胞悬浮后，使用分离柱分离CD14⁺细胞。向CD14⁺细胞的部分添加培养基，进行离心分离(室温，300g，10分钟)。除去上清液，悬浮于培养基1mL中，进行活细胞数的测定。将添加培养基而制备的2×10⁶cells/mL细胞悬浮液接种(1×10⁵cells/well)至96孔板，在CO₂孵化器内静置1～2小时。将CD14⁺细胞(1×10⁵cells/well)接种至96孔平板，添加0.12％DMSO溶液、JTE-607溶液(最终浓度10、30、100、300nM)、PSL溶液(最终浓度0.03、0.3、3、30μM)或托珠单抗(最终浓度10、100、1000ng/mL)，在37℃下孵化(Incubate)30分钟。然后，在37℃下用LPS(最终浓度500ng/mL)刺激6小时，添加ATP溶液(最终浓度5mM)，进一步在CO₂孵化器内静置2小时，回收培养上清液。

对回收的培养上清液，使用人IL-18DuoSet ELISA进行IL-18的定量。

1.2.13JTE-607、PSL和托珠单抗对巨噬细胞通过LPS刺激而产生VEGF的作用

在37℃下，将CD14⁺细胞在装有20ng/mL M-CSF的RPMI培养基中培养5天，对巨噬细胞进行分化诱导(在此期间，每两天追加一次装有20ng/mLM-CSF的RPMI培养基)。以5×10⁵cells/mL将巨噬细胞接种至96孔板，添加JTE-607溶液(最终浓度10、30、100、300nM)、PSL溶液(最终浓度0.03、0.3、3、30μM)或托珠单抗(最终浓度10、100、1000ng/mL)，在添加后在37℃下孵化30分钟。然后，在仅RPMI培养基或在LPS(最终浓度100ng/mL)下在37℃下刺激三天，回收培养上清液。

对回收的培养上清液，使用人VEGF DuoSet ELISA进行VEGF的定量。

1.2.14CD14⁺细胞对CAR-T细胞的杀伤活性的作用

使用FMC63 scFv、CD28的铰链区(Hinge domain)、跨膜结构域(Transm embranedomain)、细胞质结构域和CD3-ζ细胞质结构域，基于Kochenderfer等人的方法¹⁵⁾进行抗CD19 CAR的构建。序列从GenBank(HM852952)入手，使用IDT密码子最优化工具(http://sg.igtdna.com/CodonOpt)除去FMC63内部的BamHI识别序列。化学合成优化得到的FMC63-28z序列，使用以下引物组(Primer set)通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。

5'-CGCTACCGTCGTCGAATTCGCCGCCACCATGCTTC-3'(SEQ ID NO.1)

5'-GAAGTTCGTGCTCCGGGATCCCGCGAGGGGGCAG-3'(SEQ ID NO.2)

使用In-Fusion HD克隆试剂盒，将PCR产物插入慢病毒(Lentivirus)质粒CSII-EF-MCS-2A-eGFP的多克隆位点(EcoRI和BamHI)，得到CSII-EF-FMC63-28z-2A-eGFP。慢病毒载体，通过将CSII-EF-FMC63-28z-2A-eGFP与包装质粒(Packaging plasmid)(pMDLg/p.RRE、pRSV-rev和pMD.G)共转染至Lenti-X293T细胞来制备。使制备的慢病毒载体感染使用抗CD3抗体、抗CD28抗体和IL-2刺激了的外周血单个核细胞，进行流式细胞分选(FACSsorting)来划分CD3阳性和eGFP阳性以获得CAR-T细胞。

基于Kochenderfer等的方法¹⁵⁾来合成人CD19的开放阅读框，通过使用以下引物的PCR进行扩增。

5'-ccggttcgaattcgccatATGCCACCTCCCGCCTC-3'(SEQ ID NO.3)

5'-cgatgttaactctagatcaCCTGGGTGCTCCAGGTGC-3'(SEQ ID NO.4)

使用In-Fusion HD克隆试剂盒，使用EcoRI和XbaI位点，将PCR产物插入慢病毒骨架质粒CSII-EF-MCS，得到CSII-EF-hCD19。此外，就萤火虫萤光素酶(fLuc)表达质粒而言，使用以下引物组将pmirGLO质粒(Promega公司)作为模板，通过PCR扩增fLuc cDNA。

5'-GAATTCGCCACCATGGAAGATGCCAA-3'(SEQ ID NO.5)

5'-GGATCCCACGGCGATCTTGCCGCC-3'(SEQ ID NO.6)

通过EcoRI和BamHI将PCR产物进行剪切后，插入CSII-EF-MCS-2A-eGFP的多克隆位点以得到CSII-EF-fLuc-2A-eGFP。慢病毒载体，通过将CSII-EF-hCD19或CSII-EF-fLuc-2A-eGFP与包装质粒(pMDLg/p.RRE、pRSV-rev和pMD.G)共转染至Lenti-X293T细胞来制备。使制备的慢病毒载体感染K562细胞，进行流式细胞分选来划分CD19和eGFP阳性以获得靶细胞。

将靶细胞(3×10³cells/well)接种至96孔板，在向其中添加CAR-T细胞并使得E/T比变为0、0.1、0.3、1、3和10而得的培养体系中，在添加或不添加CD14⁺细胞(1.5×10⁴cells/well)的条件下孵化三天。然后，使用EnSpire 2300并通过发光强度对萤光素酶活性进行检测。

1.2.15CD14⁺细胞对使用了CAR-T细胞的混合培养体系产生细胞因子的作用

将CAR-T细胞(5×10⁴cells/well)和靶细胞(1×10⁴cells/well)接种至96孔板，在添加或不添加CD14⁺细胞(1×10⁴cells/well)的条件下孵化。回收培养开始起0、4、24、48和72小时后的上清液，通过FACS的多重检测对上清液中的IFN-γ、TNF-α、MCP-1、IL-6和IL-4进行测定。

1.2.16JTE-607和PSL对CAR-T细胞的杀伤活性的作用

将CAR-T细胞(5×10⁴cells/well)、靶细胞(1×10⁴cells/well)和CD14⁺细胞(5×10⁴cells/well)接种至96孔板，添加JTE-607溶液(最终浓度0.1、1、10、100、1000nM)、PSL溶液(最终浓度0.1、1、10、100μM)并孵化两天。然后，使用EnSpire 2300通过发光强度对萤光素酶活性进行检测。

1.2.17JTE-607、PSL和托珠单抗对使用了CAR-T细胞的CRS毒性评价体系中的作用

将CAR-T细胞(1.5×10⁴cells/well)、靶细胞(3×10³cells/well)和单核细胞(1.5×10⁴cells/well)接种至96孔板，添加JTE-607溶液(最终浓度1、10、100、1000nM)、PSL溶液(最终浓度0.1、1、10、100μM)或托珠单抗溶液(最终浓度0.1、1、10、100μg/mL)并进行孵化。在培养开始起72小时后回收上清液，通过FACS的多重检测对上清液中的各种细胞因子进行测定。

1.3结果

1.3.1JTE-607和PSL对CD8⁺T细胞通过T细胞刺激珠而产生IFN-γ等的作用

对于通过T细胞刺激珠由CD8⁺T细胞产生IFN-γ，JTE-607未显示出显著的抑制作用(IC₅₀值＝>300nM)。另一方面，PSL以浓度依赖性的方式抑制该IFN-γ产生(IC₅₀值＝0.1494μM)。表明JTE-607对CD8⁺T细胞的直接作用较弱(图1、图3和表1)。

[表1]

表1 JTE-607和PSL对各种培养体系产生各细胞因子的抑制活性

1.3.2JTE-607和PSL对CD14⁺细胞通过LPS刺激而产生IL-6的作用

对JTE-607和PSL对由CD14+细胞产生IL-6的作用进行评价。JTE-607和PSL均显示出抑制活性，IC₅₀值为52.9nM、0.151μM。表明JTE-607如之前报告的那样显示出对髓系细胞产生作用(图2、图3和表1)。

1.3.3JTE-607和PSL对PBMC通过LPS刺激而产生IL-6的作用

对JTE-607和PSL对由PBMC产生IL-6的作用进行评价。JTE-607和PSL均显示出抑制活性，IC₅₀值为17.7nM、0.176μM(图4和表1)。

1.3.4JTE-607和PSL对PBMC通过T细胞刺激珠和LPS刺激建立的CRS毒性评价体系的作用

对JTE-607和PSL对通过T细胞刺激珠和LPS的共同刺激而由PBMC产生IL-6和IFN-γ的作用进行评价。JTE-607以浓度依赖性的方式对共同刺激引起的IL-6和IFN-γ产生进行抑制，就其IC₅₀值而言，IL-6为40.4nM，IFN-γ为50.1nM。此外，IL-6与IFN-γ的IC₅₀值的比(ratio)为0.81。另一方面，就PSL而言，对IFN-γ产生的抑制比对IL-6产生的抑制更强。表明JTE-607与强作用于T细胞功能的PSL不同(图5、图6和表1)。

1.3.5JTE-607和PSL对CD4⁺T细胞缺陷型PBMC通过T细胞刺激珠和LPS刺激建立的CRS毒性评价体系的作用

为了阐明T细胞刺激珠和LPS的共同刺激体系中的CD4⁺T细胞的参与，而使用从PBMC中除去了CD4⁺T细胞的CD4⁺T细胞缺陷型PBMC对JTE-607和PSL的作用进行评价。JTE-607以浓度依赖性的方式对共同刺激引起的IL-6和IFN-γ产生进行抑制，其IC₅₀值为相同程度(IL-6IC₅₀值＝42.2nM，IFN-γIC₅₀值＝80.9nM)。此外，IL-6与IFN-γ的IC₅₀值的比(ratio)为0.52，JTE-607显示出偏向于IL-6产生抑制作用的作用。另一方面，PSL以浓度依赖性的方式对IFN-γ产生进行抑制(IC₅₀值＝0.042μM)，但是IL-6产生没有被抑制(图7、图8和表1)。由于能够在使用了PBMC和CD4⁺T细胞缺陷型PBMC的研究中取得同样的结果，因此认为在T细胞刺激珠和LPS的共同刺激体系中CD4⁺T细胞的参与较低。

1.3.6JTE-607和PSL对CD14⁺细胞通过LPS刺激而产生MCP-1的作用

对JTE-607和PSL对由CD14⁺细胞产生MCP-1的作用进行评价。JTE-607和PSL均显示出抑制活性，IC₅₀值分别为21.3nM、6.598μM。揭示JTE-607通过MCP-1产生抑制而显示出较强的巨噬细胞活化抑制作用(图9和表1)。

1.3.7JTE-607和PSL对CD8⁺T细胞通过T细胞刺激珠而产生TNF-α的作用

对于通过T细胞刺激珠而由CD8⁺T细胞产生TNF-α，与PSL的抑制作用(IC₅₀值＝0.0348μM)相比，发现JTE-607的抑制作用(IC₅₀值＝231.4nM)较弱(图10和表1)。

1.3.8JTE-607和PSL对CD14⁺细胞通过LPS刺激而产生TNF-α的作用

对于通过LPS刺激而由CD14⁺细胞产生TNF-α，PSL的情况下观察到抑制作用(IC₅₀值＝0.0417μM)。另一方面，尽管JTE-607根据添加浓度而显示出抑制作用，但是无法计算IC₅₀值。通常已知，由CD14⁺细胞产生TNF-α是刺激后立即暂时性地上升。认为，就本次测定中使用的培养上清液而言，在IL-6这样逐渐增加的细胞因子的最佳评价条件下实施评价，由于TNF-α是产生量降低的条件下的评价，因此未观察到JTE-607的明确抑制(图11和表1)。

1.3.9JTE-607和PSL对PBMC通过LPS刺激而产生TNF-α的作用

JTE-607和PSL均显示出抑制活性，其IC₅₀值为30.7nM、0.073μM(图12和表1)。认为由于在各种细胞混在一起的PBMC中，通过相互刺激而观察到持续性的产生，因此JTE-607显示出抑制作用。

1.3.10JTE-607、PSL和托珠单抗对CD14⁺细胞通过LPS刺激而产生OPN的作用

对JTE-607、PSL和托珠单抗对由CD14⁺细胞产生OPN的作用进行评价。JTE-607显示出抑制活性，IC₅₀值为132.1nM。另一方面，在PSL和托珠单抗的情况下，未观察到OPN产生抑制作用(图13和表1)。揭示JTE-607通过OPN产生抑制来抑制LCH病变中出现的破骨细胞活化。

1.3.11JTE-607、PSL和托珠单抗对CD14⁺细胞通过LPS刺激而产生IL-1β的作用

JTE-607显示出IL-1β产生抑制活性，IC₅₀值为3.45nM。另一方面，在PSL和托珠单抗的情况下，未观察到IL-1β产生抑制作用(图14和表1)。揭示JTE-607具有与PSL和托珠单抗等现有药物不同的作用。

1.3.12JTE-607、PSL和托珠单抗对由经过LPS预处理的CD14⁺细胞通过ATP刺激而产生IL-18的作用

对JTE-607、PSL和托珠单抗对由经过LPS预处理的CD14⁺细胞产生IL-18产生的作用进行评价。JTE-607显示出抑制活性，IC₅₀值为2.40nM。另一方面，在PSL和托珠单抗的情况下，未观察到IL-18产生抑制作用(图15和表1)。揭示JTE-607通过抑制IL-18产生，来对以高IL-18产生为特征的疾病组的病状进行改善。IL-18与IL-6是独立地保持高产生的炎症性细胞因子，揭示JTE-607对给药托珠单抗中隐藏的炎症性病状的作用。

1.3.13JTE-607、PSL和托珠单抗对巨噬细胞通过LPS刺激而产生VEGF的作用

PSL对由巨噬细胞产生VEGF显示出较强的作用，由于即使在最低评价浓度的30nM中抑制率也为50％以上，因此无法计算IC₅₀值。另一方面，JTE-607观察到抑制倾向，但是其作用微弱。在托珠单抗中未观察到VEGF产生抑制作用(图16和表1)。

1.3.14以CAR-T细胞的癌症细胞识别为起点的CRS毒性的体外评价体系

为了对与CRS毒性有关的细胞因子游离进行检测，而将CAR-T细胞的靶细胞识别(杀伤活性)的培养体系与向其中添加有外周血CD14⁺细胞的培养体系进行比较。与不添加CD14⁺的培养相比，在存在CD14⁺细胞的培养的情况下对靶细胞的杀伤活性上升(图17)。

接下来，随时间推移对不添加和添加CD14⁺细胞的培养中的各种细胞因子产生进行定量。源自CAR-T细胞的细胞因子的IFN-γ产生没有显著差异。另一方面，IL-6、MCP-1产生观察到数倍至10倍以上的产生，认为结果反映CD14⁺细胞的活化状态明显(图18)。并且，IL-6和MCP-1被报告为对CRS毒性的重症化进行预测并判定的生物标志物¹⁶⁾。以上，认为3种细胞“CAR-T细胞、靶细胞和CD14⁺细胞”混合培养体系是可同时对CAR-T细胞疗法中的“靶标癌症细胞杀伤活性”和“CRS毒性”进行评价的体外培养体系。

1.3.15JTE-607和PSL对CAR-T细胞的杀伤活性的作用

PSL根据浓度显示出对CAR-T细胞的杀伤活性的抑制作用，但JTE-607没有产生影响(图19)。

1.3.16使用了CAR-T细胞的CRS毒性评价体系中JTE-607、PSL和托珠单抗作用

在杀伤活性评价中，实施对培养上清液中的各细胞因子的评价。对于IFN-γ产生，JTE-607和PSL观察到相同程度的抑制活性。对于IL-6产生，JTE-607的IC₅₀值为187.5nM。另一方面，PSL未显示抑制作用(图20和表2)。对于MCP-1产生，JTE-607显示出浓度依赖性的抑制作用，其IC₅₀值为37.6nM。此外，PSL的IC₅₀值为71.8μM。另一方面，托珠单抗未显示抑制作用(图21和表2)。对于IL-8产生，JTE-607显示出抑制作用，其IC₅₀值为153.8nM。另一方面，PSL和托珠单抗未显示抑制作用(图22和表2)。对于TNF-α和IL-1β，JTE-607显示出抑制作用，其IC₅₀值分别为413.1nM、358.9nM。另一方面，PSL和托珠单抗未显示抑制作用(图23、图24和表2)。在本次评价条件下，几乎没有观察到IL-18产生，没有进行评价(25和表2)。

[表2]

表2 JTE-607、PSL和托珠单抗对使用了CAR-T细胞的CRS毒性评价体系中产生各细胞因子的作用(IC₅₀值)

细胞因子	JTE-607	PSL	托珠单抗
				IL-6	187.5nM	＞10μM	-
IFN-γ	598.4nM	0.88μM	-
				MCP-1	37.6nM	71.8μM	＞100μg/mL
IL-8	153.8nM	＞100μM	＞100μg/mL
				TNF-α	413.1nM	＞100μM	＞100μg/mL
IL-1β	358.9nM	＞100μM	＞100μg/mL
				IL-18	(870.8nM)	(＞100μM)	(＞100μg/mL)

-：未实施

()：由于产生量较低，故为参考值

“内源性效应T细胞的过度活化所伴随的各种副作用·症状(irAEs、HLH、MAS等)发病的概念图”示于图26。

因免疫检查点抑制剂、病毒感染等而过度扩增的效应T细胞，与共存的组织驻留性巨噬细胞、抗原呈递细胞等相互影响，除了抗癌症作用·抗病毒作用之外，还引起与自身免疫性疾病相关的副作用等。泼尼松龙(PSL)带来的免疫抑制作用对这些副作用和症状进行改善，但同时也全面性地对抗癌症·抗病毒作用T效应子的功能进行抑制。

另一方面，托珠单抗用于对巨噬细胞活化引起的IL-6的过度产生进行抑制，预期轻减·改善与自身免疫性疾病相关的副作用。预期JTE-607对更广泛的巨噬细胞异常活化进行抑制，并且显示对效应T细胞的抑制是有限的。该图提示的背景发现示于T细胞反应(CD3+CD28刺激反应体系)与单核细胞·巨噬细胞反应(LPS等的刺激反应体系)的单独培养和新型的组合培养体系的结果。

由以上可知，图26中显示，JTE-607不会显著影响主要的效应T细胞功能，预期具有抑制巨噬细胞活化并且改善内脏器官损伤的效果。

参考文献

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序列表自由文本

SEQ ID NO.1～6：合成DNA

序列表

<110> TORII PHARMACEUTICAL CO., LTD.

<120> 细胞因子释放综合征等的改善剂

<130> G2137WO

<150> JP2018-223377

<151> 2018-11-29

<150> JP2019-165013

<151> 2019-09-11

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 1

cgctaccgtc gtcgaattcg ccgccaccat gcttc 35

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 2

gaagttcgtg ctccgggatc ccgcgagggg gcag 34

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 3

ccggttcgaa ttcgccatat gccacctccc gcctc 35

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 4

cgatgttaac tctagatcac ctgggtgctc caggtgc 37

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 5

gaattcgcca ccatggaaga tgccaa 26

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成DNA

<400> 6

ggatcccacg gcgatcttgc cgcc 24

Claims (12)

1.一种药物，其包含下述化学式I表示的化合物或其药学上允许的盐，并且所述药物针对选自细胞因子释放综合征、与自身免疫性疾病相关的副作用、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症和朗格汉斯细胞组织细胞增生症中的至少1种，

[化学式13]

式中，R₁表示任选被取代的含氮非芳香族烷基或任选被取代的含氮杂环基，A表示单键、或任选被取代并且可以在链中具有一个或两个以上的双键或三键的碳原子数1～10的直链状或支链状亚烷基，R₂表示氧原子、或-CO-、-COO-、-OCO-或-O-CO-O-表示的基团，R₃相同或不同，表示氢原子、羟基、卤素原子或任选被取代并且直链状或支链状碳原子数1～20的烷基，其中，至少1个R₃不是氢原子，n表示1～4的整数，m表示0或1～6的整数，R₄表示任选被取代的碳原子数6～20的芳基、任选被取代的杂环基、任选被取代的碳原子数3～10的环烷基、任选被取代的碳原子数1～20的直链状或支链状烷基或任选被取代的碳原子数1～20的直链状或支链状烷氧基，R₅表示氧原子、或-CO-、-COO-、-OCO-或-O-CO-O-表示的基团，R₆表示氢原子、碳原子数1～20的直链状或支链状烷基、或任选被取代的碳原子数1～20的芳基。

2.根据权利要求1所述的药物，其中，

含氮非芳香族杂环基为哌嗪基或哌啶基，A为碳原子数1～10的直链状亚烷基，R₂为氧原子，R₃相同或不同，为氢原子或卤素原子，其中，至少1个R₃不是氢原子，R₄为苯基，R₅表示-COO-表示的基团，R₆为碳原子数1～10的直链状烷基。

3.根据权利要求1所述的药物，其中，

含氮非芳香族烷基为烷基氨基，A为碳原子数1～10的直链状亚烷基，R₂为氧原子，R₃相同或不同，为氢原子或卤素原子，其中，至少1个R₃不是氢原子，R₄为苯基，R₅表示-COO-表示的基团，R₆为碳原子数1～10的直链状烷基。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的药物，其中，

化学式I表示的化合物或其药学上允许的盐为化学式II表示的化合物或其药学上允许的盐，

[化学式14]

5.根据权利要求1～4中任一项所述的药物，其中，

化学式I表示的化合物或其药学上允许的盐为化学式III表示的化合物或其药学上允许的盐，

[化学式15]

6.根据权利要求1～5中任一项所述的药物，其中，

化学式I表示的化合物或其药学上允许的盐为化学式III表示的化合物的盐酸盐。

7.根据(1)～(6)中任一项所述的药物，其中，

化学式I表示的化合物或其药学上允许的盐为化学式IV表示的化合物，

[化学式16]

8.根据权利要求1～7中任一项所述的药物，其中，

疾病或症状是：由免疫检查点抑制剂的使用引起的疾病或症状、由嵌合抗原受体T细胞疗法引起的疾病或症状、由修饰T细胞受体T细胞疗法引起的疾病或症状、或由选自传染病、癌症和自身免疫性疾病中的至少1种疾病诱发的疾病或症状。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的药物，其对细胞因子的产生和巨噬细胞的活化中的至少一者进行抑制。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的药物，其中，

细胞因子为选自下述中的至少一种：肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-1RA、IL-2Rα、IL-10、IL-18、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、胰岛素生长因子(IGF)、干扰素(IFN)-γ、IFN-γ诱导蛋白10(IP-10)、单核细胞趋化因子(MCP)-1、血管内皮生长因子(VEGF)、骨桥蛋白(OPN)、NF-κB受体激活因子配体(RANKL)、细胞因子受体gp130、游离型IL-1受体(sIL-1R)-1、sIL-1R-2、游离型IL-6受体(sIL-6R)、游离型晚期糖基化终产物受体(sRAGE)、游离型TNF受体(sTNFR)-1、sTNFR-2、IFN-γ诱导的单核因子(MIG)、巨噬细胞炎症蛋白(MIP)-1α和MIP-1β。

11.根据权利要求10所述的药物，其中，

细胞因子为选自TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、IFN-γ、MCP-1和OPN中的至少一种。

12.根据权利要求1～11中任一项所述的药物，其用于预防、治疗或改善选自细胞因子释放综合征、与自身免疫性疾病相关的副作用、巨噬细胞活化综合征、噬血细胞性淋巴组织细胞增生症和朗格汉斯细胞组织细胞增生症中的至少1种。

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