CN112033945B - 肿瘤转移相关中性粒细胞可视化检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肿瘤转移相关中性粒细胞可视化检测方法，具体包括以下步骤：1)准备新型肿瘤转移相关中性粒细胞；2)准备肿瘤细胞；3)准备可视化装置；4)准备流体；5)准备记录装置；6)寻找最佳视野；7)记录肿瘤转移相关中性粒细胞捕获循环肿瘤细胞。本发明利用实验室现有的设备即可模拟新型肿瘤转移相关中性粒细胞捕获肿瘤细胞的体内流体情况，进行可视化的检测，无需购买特殊购买高端贵重设备，能够在实验平台推广使用。

Description

肿瘤转移相关中性粒细胞可视化检测方法

技术领域

本发明涉及肿瘤转移检测实验领域，具体为一种肿瘤转移相关中性粒细胞捕获循环肿瘤细胞可视化检测方法。

背景技术

目前，发现人和小鼠中存在一群促进乳腺癌肺转移的新型肿瘤转移相关中性粒细胞，具有独特的功能表型，表现为CD45+CD11b+CD66b+CXCR4+CD62Llow(人)，及CD45+CD11b+Ly-6G+CXCR4+CD62Llow(鼠)。现有的肿瘤转移的可视化装置价格昂贵，且技术要求高，难以推广至各个实验平台。

发明内容

针对上述存在的技术不足，本发明的目的是提供一种肿瘤转移相关中性粒细胞可视化检测方法，其利用实验室现有的设备模拟新型肿瘤转移相关中性粒细胞捕获肿瘤细胞的体内流体情况，进行可视化的检测。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明提供肿瘤转移相关中性粒细胞可视化检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)准备新型肿瘤转移相关中性粒细胞：利用流式分选技术获取乳腺癌小鼠、患者外周血肿瘤转移相关中性粒细胞CD45+CD11b+Ly-6G+CXCR4+CD62Llow和CD45+CD11b+CD66b+CXCR4+CD62Llow，均匀铺在多聚赖氨酸预包被的12孔板孵育2小时，用多聚甲醛固定，并使用1μM橙色核酸染料对肿瘤转移相关中性粒细胞的细胞外捕获网结构进行染色10min，弃上清并用磷酸缓冲盐溶液洗涤；

2)准备肿瘤细胞：准备自发绿荧光蛋白的小鼠三阴性乳腺癌细胞、自发绿荧光蛋白的人三阴性乳腺癌细胞，调整浓度至1x10^5/mlx10ml,装于20ml注射器中，每10min震荡防止细胞沉降；

3)准备可视化装置：12孔板延孔板边缘，使用5ml注射器针头戳成30°倾斜孔道，使用输液器针头戳入孔道至平板底部并固定，另一端连接于装载好肿瘤细胞的注射器上；

4)准备流体：将装载好肿瘤细胞的注射器固定于输液微泵上，调整微泵速度为2ml/h，排空气泡后可使用；

5)准备记录装置：下载并安装录屏系统，待流体启动时开启；

6)寻找最佳视野：将平板置于荧光显微镜中，在明场寻找输液器针头附近视野，调整显微镜焦距，可观察到固定的新型肿瘤转移相关中性粒细胞；

7)记录肿瘤转移相关中性粒细胞捕获循环肿瘤细胞：显微镜调至明场，可视视野调整至电脑屏幕，启动微泵并开始录屏，记录微泵控制下流体中肿瘤细胞进入平板并被新型肿瘤转移相关中性粒细胞捕获的过程；记录结束后，调整显微镜，激发光为488nm，可观察到体系中被捕获的肿瘤细胞；激发光为594nm，可观察到体系中中性粒细胞形成的胞外捕获网结构。

本发明的有益效果在于:利用实验室现有的设备即可模拟新型肿瘤转移相关中性粒细胞捕获肿瘤细胞的体内流体情况，进行可视化的检测，无需购买特殊购买高端贵重设备，能够在实验平台推广使用。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明提供肿瘤转移相关中性粒细胞可视化检测方法，具体包括以下步骤：

1)准备新型肿瘤转移相关中性粒细胞：利用流式分选技术获取乳腺癌小鼠、患者外周血肿瘤转移相关中性粒细胞CD45+CD11b+Ly-6G+CXCR4+CD62Llow和CD45+CD11b+CD66b+CXCR4+CD62Llow，均匀铺在多聚赖氨酸预包被的12孔板孵育2小时，用多聚甲醛固定，并使用1μM橙色核酸染料(sytox orange)对肿瘤转移相关中性粒细胞的细胞外捕获网结构进行染色10min，弃上清并用磷酸缓冲盐溶液洗涤；

2)准备肿瘤细胞：准备自发绿荧光蛋白的小鼠三阴性乳腺癌细胞(GFP⁺4T1)、自发绿荧光蛋白的人三阴性乳腺癌细胞(GFP⁺MDA-MB-231)，调整浓度至1x10^5/mlx10ml,装于20ml注射器中，每10min震荡防止细胞沉降；

3)准备可视化装置：12孔板延孔板边缘，使用5ml注射器针头戳成30°倾斜孔道，使用输液器针头戳入孔道至平板底部并固定，另一端连接于装载好肿瘤细胞的注射器上；

4)准备流体：将装载好肿瘤细胞的注射器固定于输液微泵上，调整微泵速度为2ml/h，排空气泡后可使用；

5)准备记录装置：下载并安装录屏系统，待流体启动时开启；

6)寻找最佳视野：将平板置于荧光显微镜中，在明场寻找输液器针头附近视野，调整显微镜焦距，可观察到固定的新型肿瘤转移相关中性粒细胞；

7)记录肿瘤转移相关中性粒细胞捕获循环肿瘤细胞：显微镜调至明场，可视视野调整至电脑屏幕，启动微泵并开始录屏，记录微泵控制下流体中肿瘤细胞进入平板并被新型肿瘤转移相关中性粒细胞捕获的过程；记录结束后，调整显微镜，激发光为488nm，可观察到体系中被捕获的肿瘤细胞；激发光为594nm，可观察到体系中中性粒细胞形成的胞外捕获网结构。

本发明中的可视化检测方法利用实验室现有的设备即可模拟新型肿瘤转移相关中性粒细胞捕获肿瘤细胞的体内流体情况，进行可视化的检测，无需购买特殊购买高端贵重设备，能够在实验平台推广使用。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (1)

1.肿瘤转移相关中性粒细胞可视化检测方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)准备新型肿瘤转移相关中性粒细胞：利用流式分选技术获取乳腺癌小鼠、患者外周血肿瘤转移相关中性粒细胞CD45+CD11b+Ly-6G+CXCR4+CD62Llow和CD45+CD11b+CD66b+CXCR4+CD62Llow，均匀铺在多聚赖氨酸预包被的12孔板孵育2小时，用多聚甲醛固定，并使用1μM橙色核酸染料对肿瘤转移相关中性粒细胞的细胞外捕获网结构进行染色10min，弃上清并用磷酸缓冲盐溶液洗涤；

2)准备肿瘤细胞：准备自发绿荧光蛋白的小鼠三阴性乳腺癌细胞、自发绿荧光蛋白的人三阴性乳腺癌细胞，调整浓度至1x10^5/mlx10ml,装于20ml注射器中，每10min震荡防止细胞沉降；

3)准备可视化装置：12孔板延孔板边缘，使用5ml注射器针头戳成30°倾斜孔道，使用输液器针头戳入孔道至平板底部并固定，另一端连接于装载好肿瘤细胞的注射器上；

4)准备流体：将装载好肿瘤细胞的注射器固定于输液微泵上，调整微泵速度为2ml/h，排空气泡后可使用；

5)准备记录装置：下载并安装录屏系统，待流体启动时开启；

6)寻找最佳视野：将平板置于荧光显微镜中，在明场寻找输液器针头附近视野，调整显微镜焦距，可观察到固定的新型肿瘤转移相关中性粒细胞；

7)记录肿瘤转移相关中性粒细胞捕获循环肿瘤细胞：显微镜调至明场，可视视野调整至电脑屏幕，启动微泵并开始录屏，记录微泵控制下流体中肿瘤细胞进入平板并被新型肿瘤转移相关中性粒细胞捕获的过程；记录结束后，调整显微镜，激发光为488nm，可观察到体系中被捕获的肿瘤细胞；激发光为594nm，可观察到体系中中性粒细胞形成的胞外捕获网结构。