CN1120360C - 一种检测细胞试样的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种测定凝集反应的方法。该方法通过测定分开凝集细胞所需的外力大小来测量他们相互结合的紧密程度。当促使红细胞从大致双面凹的圆盘形变为球形时，红细胞能发生结合反应的有效表面逐渐减少。细胞球形化增加了抗原结合位点之间的空间，增大了发生结合反应所需的平均距离。当细胞变成球形时，细胞间适于结合反应的表面积减少，细胞失去结合力，因而细胞群得以分离。当细胞随着感应力发生变化时，通过记录细胞间感应力和细胞数量(或与之相关的数量)，凝集反应能够被探测、量化和监控。本发明通过引入合适的抗体，并测定是否有凝集反应发生，从而提供了一种简单有效的用于测定血型和交叉配血的测定方法。

Description

一种检测细胞试样的方法

                            发明背景

各种血细胞偶然自发地发生凝集反应，通常预示着严重的溶血疾病。这可能表明一种潜伏的恶性肿瘤的存在，例如非何杰金氏淋巴癌、何杰金氏疾病，急性淋巴细胞白血病、癌、胸腺癌和卵巢肿瘤。它发生在以下疾病中：血型不相溶，例如新生儿溶血病和血型不配的输血；突发性夜间血红蛋白尿和低丙种蛋白血症；某些胶原蛋白疾病，例如播散性狼疮红斑、类风湿关节炎、溃疡性结肠炎和肝炎；某些传染病，例如病毒性和胶原体肺炎、细胞肥大病毒症、结核病和传染性单核细胞增多症，以及对某些药物，例如L-多巴的毒性反应。这些疾病引起的内部或外部血管溶血造成至少10％的死亡率。红细胞凝集反应的鉴别有利于早期诊断和治疗反馈的监控。

传统上，凝集反应是通过视觉观察细胞群进行检测的。目前，自动细胞计数器已经取代了所有人工常规的血液学检测，但是，它们不能足够精确地检测凝集反应，因而无法避免人工检测。事实上，当一个产生不精确平均细胞体积和细胞数以及复式指标的大细胞从凝集细胞群衍生出来的时候，现有的自动细胞计数器就会错误地测量凝集细胞群。由商用血液学自动分析仪显示的异常高的平均细胞体积(MCV)或异常高的平均细胞血红蛋白浓度(MCHC)，使技术人员警觉到凝集反应出现的可能性。然而，这些指标并不能充分指示凝集反应的发生，因为它们不具有特异性，而且，凝集反应必须升到很高水平上述指标才能超过正常限度。红细胞破裂、淋巴细胞增加、高血糖和血红蛋白症，将导致MCHC升高，因而需要人工检测和进一步测试来确诊。

在通常进行血型检定和交叉配血来确定样品血型的传统实验室中，首先将一或两滴现有的商业上购得的血型抗体加入到纯净的全血里，或者更常见的是加入到3％-5％全血的生理盐水中悬浮液中；悬浮液在室温下培养几分钟，一般2或3分钟；接着，悬浮液在台面式离心机上以3000rmp离心30-45秒；然后悬浮液再轻轻地摇动几秒钟；对试管进行目测，看是否有凝集细胞的出现，然后再通过低倍显微镜来证实目测结果。交叉配血进行的方式相同，不过它是用受者血浆作为抗体代替商用抗体来证实是否有凝集反应发生。

                            发明概要

根据本发明，一种检测细胞试样凝集反应的方法包括下列步骤：诱导细胞改变它们至少一个特性以分开凝集细胞；检测细胞群所产生的变化。

优选的是，该特性的改变是细胞形状的改变；更优选的是，细胞试样须经受环境的改变，从而导致细胞变为球形。在一个优选实施例中，环境的改变是细胞赖以悬浮的液体介质渗透压度的改变，优选的是通过加入水而导致这种变化。

优选的是，检测细胞群的改变是让一或多等份细胞试样通过一个传感器，而该传感器用来对通过其的细胞计数。更优选的是，细胞试样被连续地加入到以下溶液中，即溶液渗透压度连续变化，以产生一系列连续的通过传感器的细胞等份。

优选的是，本发明方法进一步包括预处理细胞试样的步骤，以诱导或者至少试图诱导凝集反应。在本发明的一个优选实施例中，来自于一个源的未知抗原性细胞试样同来自于不同源的抗体混合。所述抗体可以是人造的，或者来自于全血、血浆或一般的血清。在进一步的步骤中，所谓的抗原-抗体混合物可以在不同的温度下，例如35-40℃，被测试以揭示热敏性凝集反应。也可以将细胞试样冷却到比较低的温度下进行测试。因此，本发明提供了一种新的测试方法，它能取代现有的血型检定和交叉配血技术。

本发明也能通过测量分开凝集细胞所需外力的大小来测定凝集细胞结合的紧密程度，而达到检测凝集反应的目的。这个特性取决于同补体系统相互作用的抗体。红细胞凝集反应是细胞表面抗原结合位点的类型和数目的函数，而该位点结合有互补的Gig抗体分子。凝集反应的强度是细胞表面结合位点接近程度的函数。把全血样放到一个典型的1∶10000的悬浮液中，并促使大致成两面凹的圆盘形细胞变成球形，而导致其能够结合的有效表面积减少了。细胞球形化增加了抗原结合位点之间的空间，并增大了结合反应发生所需的平均距离。当细胞变成球形时，细胞之间适于结合的表面积减少了，结果使细胞失去结合力而分开。当细胞随着诱导力发生变化时，通过记录诱导应力和细胞数目(或与之相关的数目)，凝集反应能够被检测、量化和监控。当使用本方法进行测试时，已发生凝集反应的细胞能够分开，因而以一种特有方式增加了细胞数目。在进一步的步骤中，细胞试样经受机械搅拌，这有利于促进正常形状的能够凝集的细胞发生凝集反应，同时也促进球形细胞分开。

                            附图简介

本发明的实施例将根据附图进行详细描述，其中：

图1是由在国际专利申请WO97/24601中详细描述的自动血细胞分析仪采集的有正常非凝集血细胞的病人的一组屏幕打印结果；

图2是有凝集血细胞的病人的一组类似的屏幕打印结果；以及

图3是血样与抗体混合以测定血型的试验的屏幕打印结果

                            详细描述

本发明的方法与申请人的在先国际专利申请WO97/24601、WO97/24598、WO97/24599描述的方法及装置连用是异常有用的，并且增进了以前国际专利申请所描述的测试方法的总的用途。

优选的方法包括对通过小孔的细胞进行计数。仪器配有注入盐水、细胞和稀释液的混合室，在这种情况下，在每一个渗透压度通过小孔的细胞数不发生变化。当只有两股液流——稀释液和事先已经引入了细胞的盐水悬浮液注入到混合室中时，通过小孔的细胞数固定在一个直接正比于渗透压度梯度的水平。因为悬浮在液体介质中血红细胞所处的环境渗透压度逐渐减少，以及本方法正常注入到混合室的细胞流逐渐减小，所以观测到的细胞数逐渐减少。

由国际专利申请WO97/24601所描述的仪器获得的一个正常病人的结果见图1。在图1、2和3中，在区域A的曲线代表红细胞数。只有当出现了其它的微粒，或者其受到了环境压力变化的刺激，细胞数—渗透压度(如图2中的区域A所示)预定直线才会出现偏差。

正如下面将要描述的，当细胞发生凝集反应或者迫使其发生凝集反应时，细胞计数将出现错误。于是，当细胞变为球形时，细胞计数随着每一个凝集体而增加，从而使该凝集体分开成各自组成部分的趋势与凝集反应的强度成反比。

大部分细胞球形化发生在P_max和P₀间的压力区间，其中，P_max是流入细胞的液流速率达到最大值的点，P₀是平衡点(见区域B)。如果出现凝集细胞群，他们将在相同的区间分开，导致计数的局部增加。而且，P₀出现的点指示凝集反应正在发生与否，这是因为如果细胞凝集发生反应，P₀出现的点则升高。我们相应的国际申请(参见代理号G14201WO)揭示了一种测量细胞碎片的方法。碎片和短线状的凝集细胞(DACs)能够根据大小加以分离。碎片较小，体积介于10-30fl，而DACs至少是其3倍大，一般为60-110fl。另外，在碎片存在时等渗压MCV是正常或减少，而随着凝集反应的发生MCV又升高了。由于MCV的正常范围很大，因此它能隐藏很多凝集反应。

试样老化以及应用机械、超声波或其它压力时，如果试样正在凝集，则使完整的细胞数增加，如果试样正在破裂，则完整的细胞数减少。降低环境渗透压度到P₀以下，对凝集细胞群没有进一步干扰影响，但是，业已发现细胞碎片的频率变化与渗透压度成反比。

图2显示的是一个有凝集血细胞病人的结果。在区域A清楚地显示在球形化过程中细胞数突然增加，而在区域B增加的球度指数(SI)以脂肪细胞的形式出现。SI还能从表(区域C)看出来。一个球的SI值为10而较扁的细胞有较高的SI值。在图2(非正常病人)SI值为10.24，而在图1(健康病人)相应的SI值为14.37。

在图2的区域D中，与图1相比较，显示由于凝集细胞群的原因，红细胞频率分布变化增加。频率分布的分析指示出判断细胞是否正在发生凝集反应。首先，通过标准偏差(SD)或变化系数(CV)测定的分布宽度随凝集反应而增加。其次，任何与正常分布的偏差都能被测定。偏离中心导致较扁曲线的出现，称为负峰度(negative kurtosis)，同时，指示出凝集反应的发生。比较图1和图2的区域D就能发现非正常病人的标准偏差是正常病人的大约2倍并且峰度为负值。

区域E的频率分布表示随着渗透压度增大细胞大小的分布。当压力增大时，细胞开始膨胀，导致细胞平均尺寸逐渐增加。在P₀点，细胞尺寸不再增加，继续加压时，细胞将排空其内容物而成为“空壳细胞”。

作为一个实施例，本发明的方法用在仪器上时，通过把抗体(例如使用一种或多种世面上能买到的用于血型检定的抗体，或者用受者血浆作为抗体源用于交叉配血)导入接下来能满足混合室中盐血悬浮液要求的喷水器中，而诱导和检测凝集反应，从而进行血型和细胞类型的自动识别。抗体和细胞表面抗原的相互作用产生的凝集反应，或者没有凝集反应的发生，都能通过计数在传感器小孔处被测定。这种方法不需要进行人工血型检定和交叉配血。

由国际专利申请WO97/24601描述的仪器产生的结果见图3。在这个实施例中，液流在仪器中加热至人体体温，约37℃，以模拟正常人体环境。凝集反应以下列方式进行识别：通常在P_max和P_min之间红细胞计数的增加；频率分布(在这个实施例中，等渗的、球形的、空壳和“用户”选择的频率分布来自不同的抽样瞬间，见区域E中的“H”)显示负峰度；测量标准偏差或变化系数的增加来确定的细胞群分布宽度的增加；通过球度指数的增加；能诱导0渗透率(P₀)的渗透压度的增加。任何变化，即使是很小的变化(与没有抗体的操纵行程相比是可测的)必须只归因于抗体。在这个特别的实施例中，第二个细胞群在图3的区域B和E中都是可见的，其指示凝集反应。

本发明对早期的凝集反应检测特别有用，因而也对溶血病早期检测和随后的治疗特别有用，它增加了识别潜伏病理疾病的可能性。根据使凝集体能分开的程度以及获得这种分开所需要的条件可定量细胞凝集反应的强度。当未凝集细胞的浓度已知时，在等渗压时计数上的任何减少都代表凝集反应。当细胞悬浮液处于球形化的梯度时，原始计数将在更高的渗透率被恢复并正比于凝集反应的强度。最后，本发明方法提供了一种通过诱导细胞凝集和随后使用本方法测试它们来自动鉴别血型和细胞类型的途径。

Claims (17)

1.一种检测细胞试样凝集反应的方法，包括以下步骤：诱导细胞改变它们至少一个特性以分开凝集细胞；检测细胞群所产生的变化。

2.根据权利要求1的方法，其特征还在于包括测定分开凝集细胞所需的力。

3.根据权利要求1或2的方法，其特征在于所述改变的特性是指细胞的形状。

4.根据权利要求1或2的方法，其特征在于所述细胞试样经受一种改变以导致细胞变成球形。

5.根据权利要求1或2的方法，其特征在于所述改变是细胞赖以悬浮的液体介质渗透压度的变化。

6.根据权利要求1或2的方法，其特征在于使一或多等份的细胞试样通过一个适于对通过其的细胞计数的传感器来测定细胞群中的变化。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述试样被连续地加入到其渗透压度连续变化的溶液中，以产生一系列连续的通过传感器的细胞等份。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于进一步包括对细胞试样进行预处理以诱导，或至少试图诱导凝集反应的发生。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述细胞试样来自于全血源。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述细胞试样用来自于不同源的抗体进行处理。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述细胞进行处理以便测定血型。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述细胞进行处理以便对试样进行交叉配血。

13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于来自不同源的抗体是人造的，或者来自于全血、血浆或血清。

14.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述细胞试样通过暴露于热中进行预处理。

15.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述试样被加热到35-40℃。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于所述试样被加热到37℃。

17.根据权利要求8所述的方法，其特征在于通过冷却所述细胞试样来进行预处理。